fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości
DESCRIPTION
Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości. Produkcja enzymów. Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego. Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
![Page 1: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/1.jpg)
Fermentacyjne technologiewytwarzania enzymów i białek
terapeutycznych wysokiej wartości
![Page 2: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/2.jpg)
Porównanie cech preparatów enzymatycznych o niskiej czystości, produkowanych w dużych ilościach i preparatów o wysokim stopniu oczyszczenia Enzymy do celów technologicznych, wytwarzane w dużych ilościach (bulk)
Enzymy wysokiej czystości
Niewielki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki masy Surowe preparaty, często poniżej 10% białka Obecność innych enzymów Preparaty otrzymane w wyniku suszenia rozpyłowego lub stężone roztwory Brak stabilizatorów Niewiele etapów oczyszczania Próbki dostępne nieodpłatnie Minimalne zamówienie 1-2 kg
Wysoki koszt jednostkowy, cena kalkulowana na jednostki aktywności enzymu Wysoka czystość, często powyżej 90% Inne enzymy nieobecne, lub ich obecność określona ilościowo Liofilizaty lub zawiesiny w roztworze siarczanu amonu Obecne stabilizatory Wiele etapów oczyszczania, w tym techniki chromatograficzne Brak takich próbek Szeroki zakres dostępnych ilości (poczynając od bardzo niewielkich)
Produkcja enzymów
![Page 3: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/3.jpg)
Warunki wytwarzania enzymu rekombinowanego
1. Producent bakteryjny– zwykle szczep E. coli zawierający plazmid kodujący enzym w wektorze z markerem oporności na antybiotyk i obszar induktorowy.
Fermentacja okresowa z zasilaniem. Wzrost początkowy w pożywce minimalnej (glukoza + ekstrakt drożdżowy + sole + antybiotyk). W fazie początkowej wzrostu dodawanie składników odżywczych w kontrolowany sposób. Źródło azotu – sole amonowe, mocznik. Po osiągnięciu fazy intensywnego wzrostu – dodanie induktora.
Proces trwający 24 – 48 h w temperaturze 24 – 28 C.Osiąga się do 50% ogólnej puli białek, z wydajnością 10 – 15 g/L
2. Alternatywni producenci – drożdże (S. cerevisiae, Pichia pastoris), grzyby – Aspergillus, Fusarium. Gen zintegrowany z chromosomalnym DNA + efektywny promotor. Pożywki z tanimi źródłami węgla i azotu. Fermentacja 4 – 8 dni. Enzymy często wydzielane poza komórkę, co obniża koszty izolacji.
![Page 4: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/4.jpg)
Schemat technologiczny wytwarzania enzymu
![Page 5: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/5.jpg)
Przykłady enzymów stosowanych w diagnostyce
Enzym Źródło (oryginalne) Stosowany do oznaczania----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Oksydaza cholesterolowa Nocardia erythropolis Cholesterol
lub Brevibacterium spp.Kreatynaza Pseudomonas spp. KreatynaKreatyninaza j.w. Kreatynina-galaktozydaza E. coli jony Na+, ELISAOksydaza glukozowa Aspergillus niger GlukozaDehydrogenaza Glc-6-P Leuconostoc mesenteroides Glukoza-glukozydaza S. cerevisiae aktywność -amylazyOksydaza glicerolo-3-P Aerococcus viridians TriacylogliceroleHeksokinaza S. cerevisiae GlukozaPeroksydaza Chrzan Enzym wskaźnikowy,
testy ELISAOksydaza pirogronianowa Pediococcus spp. Pirogronian, transami-
nazyOksydaza kwasu moczowego Arthrobacter protopharmiae Kwas moczowyUreaza Klebsiella aerogenes Mocznik
![Page 6: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/6.jpg)
Białka rekombinowane terapeutyczne
Białko Leczona choroba Rok zaakceptowania------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Insulina Cukrzyca 1982Ludzki hormon wzrostu Karzełkowatość 1985Interferon alfa Wirusowe zapalenie wątroby
niektóre nowotwory 1986Szczepionka przeciwko wiru-sowemu zap. wątroby typu B Zapobieganie WZW typu B 1986Aktywator plazminogenu Zawał serca, zator naczyniowy 1987Erytropoetyna Anemia związana z niewydolnoś-
cią nerek 1989Interferon gamma Chroniczna granulomatoza 1990Czynnik stymulujący granulocyty Neutropenia, stany po przesz-
czepach szpiku 1991Czynnik krzepliwości VIII Hemofilia A 1992Interferon beta Stwardnienie rozsiane 1993DNaza Zwłóknienie torbielowate 1994Glukocerebrozydaza Choroba Gauchera 1994Czynnik krzepliwości IX Choroba Christmasa 1997Interleukina-10 Zapobieganie trombocytopenii 1997
![Page 7: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/7.jpg)
Białka, które są glikoproteinami nie mogą być wytwarzanew komórkach bakteryjnych. Komórki grzybów wytwarzają glikoproteiny o innej budowie niż komórki ssacze.
![Page 8: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/8.jpg)
Pierwsze białko terapeutyczne wytwarzane przez zwierzę transgeniczne
Atryn, pierwszy lek pochodzący od zmodyfikowanego genetycznie zwierzęcia został dopuszczony do użytku w Europie przez Europejską Agencję do spraw Leków (EMEA) w roku 2006. Atryn jest uzyskiwany z mleka genetycznie zmodyfikowanych kóz, które mają gen kodujący antyrombinę – białko hamujące patologiczne krzepnięcie krwi. Niedobór antytrombiny – choroba o podłożu genetycznym (1 raz na 5 tys. osób).
Jedna koza może zastąpić 90 000 ludzkich dawców krwi.
![Page 9: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/9.jpg)
Naturacja białek z ciał inkluzyjnych
1. Liza komórek; 2. Wydzielenie ciał inkluzyjnych poprzez wirowanie; 3. Rozpuszczenie wroztworze 6-8 M mocznika (+ mieszania zredukowanego i utlenionego glutationu, w razie potrzeby); 4. Powolne usuwanie czynnika denaturującego – rozcieńczanie, dializa
Problem tworzeniaagregatów podczasfałdowania białek
![Page 10: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/10.jpg)
Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji
Insulina
Genentech, Eli Lilly1. Osobna ekspresja łańcuchów A i B w E. coli jako białek fuzyjnych
z syntazą tryptofanową i -galaktozydazą;2. Rozszczepienie bromocyjanem;3. Połączenie łańcuchów przez chemiczną reoksydację
NovonordiskEkspresja proinsuliny w E. coli, potem usunięcie enzymatyczne
![Page 11: Fermentacyjne technologie wytwarzania enzymów i białek terapeutycznych wysokiej wartości](https://reader035.vdocuments.site/reader035/viewer/2022062423/5681493d550346895db68aa7/html5/thumbnails/11.jpg)
Gensulin (BIOTON)
Konstrukcja genu: sekwencja kodująca Peptyd B-dipeptyd-Peptyd A-peptyd nośnikowy
Ekspresja w Escherichia coli Produkt: białko fuzyjne w ciałach inkluzyjnychEtapy izolacji wstępnej: rozbicie komórek, izolacja ciał inkluzyjnych, naturacjaPółprodukt: prekursor z mostkami disiarczkowymiObróbka: rozcięcie hydrolityczne – oddzielenie peptydu nośnikowego oraz przecięcie wiązania peptydowego pomiędzy dipeptydem a peptydem AOczyszczanie: chromatografia kolumnowaDalsza obróbka: usunięcie dipeptydu przy użyciu karboksypeptydazyProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości około 95%Dalsze oczyszczanie: HPLC, ekstrakcja, krystalizacjaProdukt: insulina identyczna z ludzką, o czystości ponad 99,9%
Białka terapeutyczne rekombinowane I generacji