SELECCIÓN Y MEJORAMIENTO DE SELECCIÓN Y MEJORAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL.MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL.

FERMENTACION DE PRODUCTOS INDUSTRIALESFERMENTACION DE PRODUCTOS INDUSTRIALES

ESTERILIZACIÓN A MEDIOS DE CULTIVO.

• Por destrucción total de microorganismos.• Por muerte o inactivación.• Por eliminación con métodos físicos.

DESARROLLO DE LA CINETICA DE CRECIMIENTO DE LOS CULTIVOS CONTINUOS Y DESCONTINUOS.

• Crecimiento microbiano• Estequiometria de crecimiento.• Cinetica de crecimiento de cultivo continuo y discontinuo• Metabolismo primario y secunadario-• Fermentacion Batch y Fed Batch• Cultivo sumergido y de superficie.• Aplicacion de sustratos.• Desarrollo de inoculos o escala industrial • Propagacion del cultivo• Celulas inmovilizadas.

La esterilización es un método de estabilización cuyo fundamento es provocar una elevación de la temperatura que provoca la destrucción de los agentes de deterioro, enzimas y especialmente, microorganismos como bacterias, hongos y levaduras. También destruye virus que son agentes infecciosos, aunque no deterioren el alimento. QUÍMICOS:

Mezcla de elementos que se funden a determinadas temperaturas o tiras de papel que cambian de color ( nos indican que la temperatura llegó a una determinado valor pero no nos indican si se llego a la presión de vapor sobresaturado y se cumplió el tiempo necesario para elciclo ).

BIOLÓGICOS:

Suspensión de microorganismos por ej. esporas de Bacillusstearothemopilus en tiras de papel impregnadas que se ponen sobre el objeto a esterilizar o recipientes cerrados ( ampollas ) que tienen un indicador como púrpura de bromocresol que vira al amarillo si el microorganismos es capaz de crecer. Se utilizan suspendiendo la ampolla en el centro del recipiente con el líquido a esterilizar, se realiza el ciclo y luego se cultiva la ampolla a ver si crece.

La muerte o inactivación significa la eliminación de microorganismos sin que exista necesariamente desintegración de las células. Se puede efectuar por:CALENTAMIENTO SECO O HÚMEDO:

Desnaturaliza las macromoléculas. Es más efectivo que el seco. Es más rápido y necesita menos intensidad.El calor húmedo, generalmente en forma de vapor bajo presión, es muy útil y de gran valor en la esterilización en el laboratorio, que se efectúa en autoclave, o en la industria cuando se esterilizan los medios de cultivo y los equipos de fermentación.POR RADIACIONES:

Se denominan también esterilización fría. Se usa con material sensible al calor, ya que no produce calentamiento del material. Puede ser:

Métodos físicos: Calor húmedo o autoclave, calor seco u horno Pasteur, irradiación ionizante gamma.

CALOR HÚMEDO O AUTOCLAVE

El autoclave es el método de elección en todo lo que pueda esterilizarse por ser termoresistente.

CALOR SECO: PUPINEL

•Elimina microorganismos por coagulación de las proteínas de éstos. •Su efectividad depende de la difusión del calor, la cantidad de calor disponible, y los niveles de pérdida de calor. •La buena acción microbicida del calor seco depende de que los elementos a esterilizar estén limpios, en presencia de materia orgánica, por ejemplo: aceite o grasa, el microorganismo es protegido de la acción del calor.

• Su uso se debe limitar a materiales no esterilizables en autoclave.

• Penetra lentamente en los materiales por lo cual se requiere largos períodos de exposición.

• Debido a las altas temperaturas para destruir microorganismos, es inapropiado para algunos materiales como líquidos, gomas y géneros. Por otra parte daña el material porque reduce el temple de acero.

• Se utiliza para aceites, vaselina, petróleos y polvos.

DESARROLLO DE LA CINÉTICA DE DESARROLLO DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTOS DE LOS CULTIVOS CRECIMIENTOS DE LOS CULTIVOS

CONTINUOSCONTINUOS

Es un incremento en el número de células o aumento de la masa microbiana. El crecimiento es un componente esencial de la función microbiana, ya que una célula individual tiene un periodo de vida determinado en la naturaleza y la especie se mantiene solamente como resultado del crecimiento continuo de la población celular.

Una bacteria es capaz de duplicarse así misma.

El crecimiento microbiano ocurre por fisión binaria,  es la división de una bacteria en dos células hijas.

Previniendo que no se produzca ningún caso de mutación las células hijas resultantes serán genéticamente idénticas a la célula original. De este modo tiene lugar la "duplicación local" de la población bacteriana.

Las bacterias se adaptan a las condiciones de crecimiento. Es el período en el que las bacterias individuales están madurando y no tienen aún la posibilidad de dividirse.

Es un período caracterizado por la duplicación celular. El número de nuevas bacterias que aparecen por unidad de tiempo es proporcional a la población actual. Si el crecimiento no se limita, la duplicación continuará a un ritmo constante, por lo tanto el número de células de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo.

La tasa de crecimiento disminuye como consecuencia del agotamiento de nutrientes y la acumulación de productos tóxicos. Esta fase se alcanza cuando las bacterias empiezan a agotar los recursos que están disponibles para ellas. 

Las bacterias se quedan sin nutrientes y mueren.

Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores físicos y químicos. Entre los

factores físicos tenemos la temperatura y el pH. Los factores químicos necesarios para el crecimiento bacterial son diversos elementos constitutivos de

las células.

TEMPERATURAEl patrón de crecimiento bacterial se ve profundamente influenciado por la temperatura. La temperatura a crecimiento óptimo permite el crecimiento más rápido de las bacterias durante un período de tiempo, usualmente entre 12 y 14 horas. La temperatura mínima de crecimiento es aquella temperatura menor a la cual la especie puede crecer. La Temperatura de crecimiento máximo es la temperatura mayor en la cual el crecimiento es posible.

pHEn la mayoría de las bacterias el crecimiento óptimo es entre 6.5 y 7.5. Muy pocas bacterias crecen a un pH menor de 4.0. Sin embargo,  las bacterias clasificadas como acidófilos son tolerantes a la acidez, un ejemplo es Thiobacillus thiodans que crece a un  pH óptimo de entre 2.0 a 3.5.

El crecimiento de cualquier sistema biologico se define como el incremento ordenado de ese sistema, lo cual implica un aumento de masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacion celular..El crecimiento se da de acuerdo a la los tipos de organismos.

Existen dos tipos de metodos para cuantificar el crecimiento microbiano•METODOS DIRECTOS:

-HEMACITOMETRO.Tambien conocido como placa de Petroff-Hausser o camara de Neubauer. Se utiliza para el conteo celular directo, en medios preferentemente claros y libres de particulas colorantes (soluciones de azul de metileno) son utilizados para distincguir celulas vivas de muertas. No se recomiendan para cultivos que forman agregados celulares. Este metodo se recomienda para organismos de diametros menores a 3 Um.

-CONTADOR DE PARTICULAS:Basado en la relativa alta resistencia electrica de las celulas.Los contadores comerciales usan dos electrodos y una solucion electrolitica, un electrodo se coloca en un tubo contenido un orificio; a continuacion se aplica vacio al tubo anterior, provocando que la solucion del electrolito conteniento las celulas sea absorbida a traves del orificio. Un potencial electrico se aplica atraves del orificio, la resistencia electrica aumenta y causa pulsos en el voltaje electrico. El numero de pulsaciones es una medida del numero de particulas se calcula considerando el volumen predeterminado de la muestra.

• METODOS INDIRECTOS:-CUENTA VIABLE EN PLACA:

El conteo de celulas viables se realiza en cajas petri con medio de cultivo adecuado y gelificado con agar, que son inoculadas con la muestra e incubadas. La palabra “viable” describe a un microorganismo capaz de reproducirse. Los resultados se espresan en unidades formadoras de colonas (UFC). Metodo util para bacterias y levaduras, pero no en hongos.

-RECUENTO SOBRE FILTROS. Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias).Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndosela concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro

• METODOS DIRECTOS: -PESO CELULAR.

Es un metodo que solamente se aplica a celulas de creciendo en un medio libre de solidos.Las muestras con la biomasa son centrifugadas o filtradas, lavadas con solucion buffer o agua y secadas a 80C por 24 horas.

-VOLUMEN DE EMPAQUE CELULAR.Permite la estimacion de la concentracion celular en medios de fermentacion

rapidamente; el medio es centrifugado en un tubo graduado bajo condiciones estandar y el volumen de celulas puede ser medido aproximadamente.

• METODOS INDIRECTOS: -DENSIDAD OPTICA.

Se basa en la absorcion de luz de celulas suspendidas en un medio de cultivo. Por lo que es necesario considerar los antecedentes de absorcion por componentes en el medio de cultivo; el medio de cultivo debe ser escencialmente libre de particulas. Una curva de calibracion es necesaria para relacionar la densidad optica contra el peso celular seco.

-MEDIDA DE CONSUMO DE NUTRIENTES O DE PRODUCCION DE ALGUN METABOLITO POR UNIDAD DE TIEMPO.

Consumo de oxigeno y consumo carbonico determinados por el respirometro de warbug

-NEFELOMETRIA..El numero de particulas en solucion puede determinarse a partir de

mediciones de la intensidad de la luz dispersada con la ayuda de un fototubo. La luz pasa a travez de una muestra del cultivo y n fototubo mide la luz dispersada por las celulas en la muestra. La intensidad de luz dispersada es proporcional a la concentracion celular.

• CONTINUO.El cultivo continuo es un cultivo balanceado mantenido por tiempo

indefinido por un sistema abierto de flujo que se compone de:

-una cámara de cultivo de volumen constante,a la que llega un suministro de nutrientes, y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo

exponencialmente.

• DISCONTINUO.Los cultivos discontinuos pueden considerarse

como un sistema cerrado, excepto para la aireación, que contiene un cantidad limitada de medio, en el que el inoculado pasa a través de un número de fases; un sistema cerrado es como una serie de procesos que no interactúa con un medioambiente especifico.

En el cultivo discontinuo, el inoculo se agrega al inicio del proceso de la fermentación así como continuamente en un periodo de tiempo determinado.

El uso de este tipo de medios de cultivos elimina los efectos de represión por las fuentes de carbono usados rápidamente, así como también reduce la viscosidad en el medio y los efectos tóxicos de los constituyentes

El metabolismo es el conjunto de procesos y reacciones químicas anabólicas (requieren energía) y catabólicas (liberan energía); por los cuales un microorganismo obtiene la energía y los nutrientes que necesita para vivir y reproducirse. 

Se producen en el curso de las reacciones metabólicas anabólicas o catabólicas que tiene lugar durante las fases decrecimiento y que contribuyen a la producción de biomasa o energía por las células. Se producen principalmente en la trofofase o fase de crecimiento.

Se producen por rutas anabólicas especializadas cuando no hay crecimiento

X

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

LOS SUSTRATOS:

En laboratorio están perfectamente definidos en cuanto a composición, pureza, etc.; mientras que a escala industrial esto no es posible por no ser económicamente viable, por lo que se utilizan generalmente residuos de otras industrias. Estos residuos han de cumplir los siguientes requisitos para poder ser usados como sustrato:

Su composición ha de ser lo suficientemente:

En ocasiones, lo que se hace es enriquecer los sustratos con especies químicas ricas en nitrógeno, como urea o nitrato amónico

SIEMBRASembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperaturaadecuada para el crecimiento.Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen: Que se efectúen asépticamente Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados Que se realicen solo los manipuleos indispensables Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a estudiar.

Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios.

Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Estemétodo se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.

Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su absorcióntotal por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.

Las fermentaciones industriales Se llevan a cabo en fermentadores o bioreactores. En estos fermentadores el sustratosustrato es convertido a un compuesto o metabolito con la ayuda de un microorganismo.

PROPAGACIÓN EL CULTIVOPROPAGACIÓN EL CULTIVO El microorganismo a ser utilizado en la fermentación debe ser cultivado y transferido a envases con mayor cantidad de medios para así obtener un gran número de microorganismos que será inoculada en los tanques de fermentación. El gran número de microorganismos se obtiene mediante sucesivas inoculaciones.

Dentro de la industria alimentaria, la inmovilización de microorganismos en soportes naturales o sintéticos proporciona estabilidad a las funciones celulares. Esta técnica permite alcanzar: