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FERMENTACIÓN Y BIOPROCESAMIENTO DE
PROTEÍNAS CROMOGÉNICAS
Ref.ED-305
5 grupos de estudiantes
1. OBJETIVO DEL EXPERIMENTO
Este kit abarca prácticamente todas las etapas que tiene lugar en un la
obtención de un producto de interés mediante la biotecnología.
El bioprocesamiento es la producción y el aislamiento de los productos
deseados a partir de las células vivas. En esta introducción al
bioprocesamiento, los estudiantes utilizarán fermentadores a pequeña
escala para producir proteínas cromogénicas utilizando Escherichia coli. Los
extractos de proteínas se separarán mediante cromatografía en columna
para analizar el éxito del proceso de fermentación. Finalmente, las
soluciones de proteína se examinarán mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS para determinar la pureza de las proteínas
cromogénicas.
2. COMPONENTES para 5 grupos de estudiantes
COMPONENTES CONSERVACIÓN
BactoBeads ™ con plásmido púrpura A +4ºC
BactoBeads ™ con plásmido rosa B +4ºC
Medio de crecimiento LB C +4ºC
Ampicilina D +4ºC
IPTG E +4ºC
Tampón de extracción de proteínas F +4ºC
Tampón de Lavado G +4ºC
Tampón de Elución H +4ºC
Matriz de intercambio iónico I Temperature ambiente
Marcador de proteínas estándar J -20ºC
Solución glicerol 50% K -20ºC
Solución desnaturalizante de proteínas L -20ºC
Pipetas de transferencia
Pipetas de transferencia estériles
Micortubos de 1.5 y 2.0 ml
Tubos de centrifuga de 15 y 50 ml
Columnas de cromatografía
Papel de pH
Tampón de electroforesis tris-glicina-SDS
Método de tinción Protein InstaStain
Practice Gel Loading Solution
2.1 Material requerido y no suministrado
Micropipetas volumen variable 5-50 ul y 20-200 ul
Centrifuga de alta velocidad 10.000 x g
Cubeta de electroforesis en gel vertical y fuente de alimentación
Contenedor de residuos.
Placa de agitación y agitadores.
Termómetros.
Probetas.
Matraces Erlenmeyer.
Etanol al 70%.
Agua destilada.
Espectrofotómetro y cubetas.
Vortex.
Papel de aluminio.
Marcadores de laboratorio.
Baño de agua.
3 geles de poliacrilamida.
Ácido acético glacial
Metanol.
Bomba de aire (opcional)
Estufa incubadora con incubación (opcional)
Autoclave (opcional).
3. INTRODUCCIÓN
Durante más de 6000 años, el proceso de fermentación se ha utilizado para la
conservación de alimentos. Sin embargo, no fue hasta 1850 que los microbiólogos,
incluido Louis Pasteur, demostraron que los microorganismos eran los agentes
responsables de la fermentación. Desde entonces, los investigadores han descubierto
que la fermentación es el resultado de que estos microorganismos rompan los
enlaces químicos de las moléculas de azúcar y almidón para crear energía. Los
subproductos de este proceso (por ejemplo, ácido láctico, etanol y ácido acético)
producen alimentos básicos que incluyen yogurt, pan y vino.
Las tecnologías actuales han ampliado la utilidad de la fermentación, que ahora se
puede explotar para fabricar productos tan diversos como biocombustibles,
biofarmacéuticos y productos químicos finos. Hoy en día, los estudios sobre el
proceso de fermentación continúan produciendo nuevos y emocionantes avances. Por
ejemplo, los genetistas microbianos han identificado nuevas cepas de
microorganismos que crecen más rápido y generan una gran variedad de vitaminas o
antibióticos. La ingeniería genética y el ADN recombinante han permitido a los
científicos producir grandes cantidades de proteínas importantes, convirtiendo las
células en fábricas vivas. La insulina, que es una hormona utilizada para controlar la
diabetes, fue el primer medicamento para uso humano que se produjo mediante
ingeniería genética. Los medicamentos recombinantes, como los antibióticos, el
interferón y el factor VIII de coagulación sanguínea, han ayudado a salvar millones
de vidas y mejorado la calidad de vida de millones más.
En la actualidad, los productos de fermentación comercialmente relevantes
generalmente se clasifican en uno de cuatro grupos:
1. Metabolitos producidos naturalmente por las células microbianas:
a. Metabolitos primarios que se producen durante el crecimiento, desarrollo o
reproducción normales de un organismo: por ejemplo, etanol, ácido cítrico, lisina,
vitaminas, polisacáridos.
b. Metabolitos secundarios que son producidos por un organismo, pero que no son
necesarios para su crecimiento normal,desarrollo, o reproducción: por ejemplo,
producción de antibióticos.
c. Enzimas producidas naturalmente por las células microbianas: por ejemplo,
amilasa, proteasa, pectinasa, celulasa, lipasa, lactasa, estreptoquinasa.
2. Proteína recombinante expresada por células microbianas: por ejemplo, insulina,
interferón, factor VIII de coagulación, vacuna de la Hepatitis B.
3. Compuestos químicos modificados por microbios (bioconversión): por ejemplo,
biotransformación de esteroides.
4. Las propias células microbianas: por ejemplo, extractos de levadura de células
enteras, levadura de panadería, Lactobacillus, E. coli.
La demanda de estos productos ha fomentado el desarrollo de nuevas tecnologías
para la ingeniería genética, la fermentación y la purificación de biomoléculas.
ENTENDIENDO EL CRECIMIENTO MICROBIANO
La fermentación requiere condiciones de crecimiento que proporcionen a las células
oxígeno, agua, minerales esenciales y fuentes de carbono y nitrógeno. Debido a que
cada organismo tiene diferentes requisitos físicos y químicos para el crecimiento, la
formulación puede variar mucho dependiendo del organismo y el proceso. En una
fermentación natural, las condiciones de crecimiento son proporcionadas por la
fuente de alimento que se fermenta. Por el contrario, los científicos pueden fabricar
cuidadosamente los medios de crecimiento para optimizar las condiciones y
maximizar el rendimiento en un experimento de bioprocesamiento.
El crecimiento microbiano no ocurre inmediatamente después de la inoculación del
medio nutriente seleccionado. Un período posterior a la inoculación, llamado fase de
retardo, permite que las células se adapten al nuevo entorno al sintetizar los factores
necesarios para el crecimiento y la división celular. Una vez aclimatados a las
condiciones de crecimiento, los microbios entran en la fase logarítmica, el tiempo
durante el cual las células crecen y la división ocurre a un ritmo exponencial. Esta es
la etapa óptima para aplicaciones de bioprocesamiento, ya que la maquinaria
biológica dentro de las células está preparada para un rápido crecimiento y expresión
de proteínas. Finalmente, la tasa de crecimiento dentro de un cultivo disminuye
debido a la menor disponibilidad de nutrientes, y una mayor concentración de los
compuestos tóxicos hacen que algunas células mueran. Cuando la tasa de muerte
celular es igual a la tasa de crecimiento celular, el cultivo ha entrado en lo que se
conoce como fase estacionaria. El cultivo persistirá en fase estacionaria hasta que se
agoten los nutrientes o hasta que las toxinas en el cultivo produzcan lisis celular. En
este punto, las células entran en la fase de muerte y mueren a una velocidad
exponencial (Figura 1).
FERMENTADORES O BIOREACTORES
En la práctica, la fermentación requiere la cuidadosa selección de las condiciones de
cultivo para mantener las células en un estado favorable que permita la producción
del producto deseado. Las células se cultivan en un equipo conocido como
fermentador (o biorreactor), que está equipado con sensores que monotorizan
continuamente las condiciones ambientales durante el proceso de fermentación
(Figura 2). Esta información se usa para optimizar las condiciones de cultivo. Algunos
de los factores que los fermentadores pueden controlar incluyen la temperatura, los
niveles de oxígeno, el pH, los agentes antiespumantes y la velocidad de mezcla.
Los fermentadores se pueden usar para cultivar cultivos en escalas muy diferentes.
Si bien se pueden cultivar pequeños cultivos (1-10 litros), los fermentadores son
especialmente útiles para volúmenes de cultivo muy grandes (> 1.000 litros). Sin
embargo, no se puede iniciar una reacción de fermentación a gran escala en un
volumen tan grande. En cambio, se cultiva un cultivo "stock" muy pequeño (5-10 ml)
de células, que luego se usa para inocular un volumen algo mayor (200 a 1.000 ml)
de medio fresco. Cuando estos cultivos alcanzan el crecimiento de la fase
logarítmica, a su vez, se utilizan para inocular un volumen aún mayor (10 a 100
litros) en un fermentador de semillas. Como su nombre indica, el cultivo de semillas
se usa para "sembrar" -o servir como fuente inicial de células para-el cultivo final,
cultivado en un fermentador de producción (de 1,000 a 100,000 litros).
Existen tres tipos principales de sistemas de fermentación: por lotes, alimentados
por lotes o continuos (Figura 3). En la fermentación discontinua, el método más
básico, se inocula el medio de crecimiento estéril y se procede la fermentación sin
ninguna adición o eliminación del medio. Desafortunadamente, la fermentación
discontinua puede conducir a la acumulación de toxinas y al agotamiento de
nutrientes, lo que puede retrasar el crecimiento del cultivo. Para contrarrestar la
depleción de nutrientes, la fermentación discontinua se basa en la adición de medio
de crecimiento fresco en diferentes momentos; sin embargo, no se elimina ningún
medio de crecimiento hasta el final del proceso. Durante la fermentación continua, se
agrega medio de crecimiento fresco mientras se elimina el cultivo utilizado. Esta
reposición de nutrientes asegura que el cultivo permanezca en fase logarítmica, lo
que permite una producción máxima del producto.
Una vez que se completa la fermentación, las biomoléculas deseadas se deben
recolectar del cultivo. Esta práctica se conoce como bioprocesamiento. Algunas
veces, la molécula producto puede ser secretada directamente en el medio por las
células. Sin embargo, si la molécula se retiene intracelularmente, las mismas células
deben "romperse" o romperse para liberar la molécula de interés para la
recuperación. Una vez que el producto está disponible en el medio, se puede separar
fácilmente de las células o sus desechos mediante centrifugación o filtración. Cuando
se purifica, el producto puede finalmente utilizarse con fines comerciales y / o
industriales (resumidos en la Figura 4).
UTILIZACIÓN DE PROTEÍNAS “REPORTER” EN BIOTECNOLOGÍA
Las proteínas indicadoras fluorescentes se han convertido en una herramienta
esencial en Biología Molecular Y Celular. La mejor proteína fluorescente conocida es
la proteína fluorescente verde (o GFP), posee la capacidad de absorber la luz azul y
emitir luz verde en respuesta sin la necesidad de ningún substrato especial adicional,
productos genéticos, o cofactores. Las proteínas fluorescentes se han convertido en
una herramienta esencial en la biología celular y molecular. Usando estrategias de
clonación de ADN, las proteínas pueden "etiquetarse" con proteínas fluorescentes y
luego expresarse en las células. Estas etiquetas simplifican la purificación porque las
proteínas fluorescentes se pueden rastrear con luz UV.
Una de las aplicaciones más útiles de las proteínas fluorescentes es como
herramienta de visualización durante los estudios de microscopía fluorescente.
Usando ténicas de ingenierías genéticas los científicos han introducido la secuencia
de ADN en otros organismos, incluidos E.coli y el nematodo Caenorhabditis elegans.
Recientemente, los biólogos sintéticos han diseñado una variedad de proteínas que
se utilizarán en lugar de la GFP. En primer lugar, los científicos buscaron en una base
de datos de secuencias de ADN para identificar los genes que se predijo que
producirían proteínas coloreadas. Fragmentos de estos genes se vincularon para
crear pequeñas proteínas quiméricas (alrededor de 27 kilodaltons en masa). Estos
nuevos genes se clonaron en un plásmido y se transformaron en E. coli.
Curiosamente, además de una variedad de proteínas fluorescentes, los científicos
también descubrieron varios genes que producían células altamente pigmentadas.
Estas proteínas cromogénicas eran visibles a simple vista, lo que significa que no era
necesaria una fuente de luz ultravioleta o un microscopio de fluorescencia para la
visualización. Las proteínas cromogénicas ya se utilizan en biotecnología como
controles para la expresión de proteínas y como marcadores visuales para la
purificación de proteínas.
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN CÉLULAS MICROBIANAS
La fabricación de productos proteínicos en microbios es una aplicación
extremadamente importante de la ingeniería genética. Usando tecnología de ADN
recombinante, los científicos copian genes específicos y los insertan en un plásmido,
que es un fragmento de ADN extracromosómico pequeño que propagan las bacterias.
El gen puede luego transcribirse mediante ARN polimerasa y traducirse en proteína,
después de lo cual se recoge de las células.
Muchas veces, la expresión de nuestro gen de interés está bajo el control de un
promotor inducible. Estos promotores solo son activos en presencia de una molécula
particular, como arabinosa, tetraciclina o isopropil-ß-D-thiogalactopyrano-side
(IPTG). En este experimento, la cepa bacteriana del huésped utilizada para la
expresión de proteínas ha sido genéticamente modificada para contener el gen de
una ARN polimerasa especial (T7), que está bajo el control del promotor lac. En
circunstancias normales, una proteína llamada represor lac se une al promotor lac y
bloquea la transcripción de la proteína cromogénica. El represor Lac está inactivado
en presencia de IPTG, que permite la expresión de la polimerasa T7.
La ARN polimerasa T7 luego reconoce el promotor T7 en el plásmido, transcribiendo
selectivamente grandes cantidades de pChromoPink o pChromoPurple mRNA. El
ARNm se traduce para producir las proteínas cromogénicas rosas y púrpuras (Figura
5).
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
Después de expresar con éxito la proteína, el paso final de la mayoría de los
experimentos de bioprocesamiento implica la purificación. En este experimento, las
proteínas cromógenas se purificarán usando cromatografía de intercambio iónico.
Este proceso usa una matriz cargada permanentemente para unir débilmente las
moléculas objetivo. La mayoría de los compuestos biológicos tienen carga positiva o
negativa cuando se exponen a un pH en el rango de 2-10. El lisado celular crudo se
pasa sobre la matriz en una columna, permitiendo que cualquier molécula cargada
adecuadamente se una. Las proteínas y otras moléculas que no se unen son luego
eliminadas. Finalmente, las proteínas restantes se eluyen con un tampón iónico que
elimina las moléculas cargadas de la matriz.
En este experimento, los estudiantes explorarán la fermentación y el
bioprocesamiento de las proteínas cromogénicas y púrpuras. Las proteínas
cromogénicas se expresarán cultivando E. coli transformada en un fermentador de
pequeña escala. La producción de la proteína se inducirá utilizando IPTG, y las
condiciones de cultivo se controlarán para optimizar la producción de las proteínas.
Las células se recogerán del fermentador y las proteínas cromogénicas se aislarán y
purificarán usando cromatografía de intercambio iónico. Finalmente, se realizará
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) para determinar la pureza de
la proteína purificada.
4. DESCRIPCIÓN DEL EXPERIMENTO
El bioprocesamiento es la producción y el aislamiento de los productos
deseados a partir de las células vivas. En esta introducción al
bioprocesamiento, los estudiantes utilizarán fermentadores a pequeña
escala para producir proteínas cromogénicas utilizando Escherichia coli. Los
extractos de proteínas se separarán mediante cromatografía en columna
para analizar el éxito del proceso de fermentación. Finalmente, las
soluciones de proteína se examinarán mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS para determinar la pureza de las proteínas
cromogénicas.
ETAPAS EXPERIMENTALES
4.1 Precauciones
IMPORTANTE: Este experimento contiene antibióticos que se utilizan para
mantener los cultivos libres de contaminación. Los estudiantes que tienen
alergias a los antibióticos, incluida AMPICILLINA, no deben participar en
este experimento.
1. Llevar gafas y guantes de laboratorio mientras se trabaja.
2. NO PIPETEAR CON LA BOCA, utilizar los dispositivos adecuados.
3. Extremar las precauciones cuando se trabajan con equipos que utilizan
conjuntamente calor y mezcla de reactivos.
4. Lavarse las manos con jabón y agua después de haber trabajado en el laboratorio o
utilizado reactivos o materiales biológicos.
5. La bacteria E. coli utilizada en este experimento no se considera patógena.
Aunque rara vez se relaciona con alguna enfermedad en individuos sanos, es una
buena práctica seguir pautas simples de seguridad en el manejo y eliminación de
materiales contaminados con bacterias.
6. Deseche correctamente los materiales después de completar el experimento:
a) Limpie la mesa de laboratorio con una solución de lejía al 10% o un desinfectante
de laboratorio.
b) Todos los materiales, incluidas las pipetas, las pipetas de transferencia, asas de
siembra y los tubos, que entran en contacto con bacterias deben desinfectarse antes
de desecharlos en la basura. Desinfecte los materiales tan pronto como sea posible
después de su uso de una de las siguientes maneras:
CRECIMIENTO “OVERNIGHT” DEL CULTIVO
SEMILLA
AÑADIR EL CULTIVO DE SEMILLA AL FERMENTADOR
RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS Y MEDICIÓN DEL pH y DO
LISAR LAS MUESTRAS
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS CROMOGÉNICAS
ANÁLISIS DE RESULTADOS POR SDS-PAGE
Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
Recoja todos los materiales contaminados en una bolsa desechable autoclavable.
Selle la bolsa y colóquela en una bandeja metálica para evitar la posibilidad de que
se derrame medio líquido o agar en la cámara del esterilizador.
Remoje en solución de lejía al 10% durante toda la noche.
Sumerja los tubos abiertos y otros materiales contaminados en un recipiente que
contenga una solución de lejía al 10%. Remoje los materiales durante toda la noche
y luego deséchelos. Use guantes y gafas cuando trabaje con lejía.
4.2 Preparaciones Previas
MÓDULO 1. PRODUCCCIÓN PROTEÍNAS CROMOGÉNICAS Cada grupo recibe : 1 frasco Erlenmeyer de 500 ml; 4 pipetas de transferencia; 4
tubos de centrifuga de 15 ml y 1 tubo IPTG.
PREPARACIÓN FERMENTADORES
Cada grupo mantendrá un fermentador en un matraz. Recomendamos el uso de
frascos de 500 ml con 250 ml de medio, aunque pueden usarse matraces y
volúmenes más pequeños. Siempre asegúrese de que el matraz contenga espacio
adecuado para la aeración; recomendamos llenar los matraces a no más del 50% de
su capacidad.
ESTERILIZACIÓN MATERIAL DE LABORATORIO
El éxito de la fermentación depende en gran medida de mantener los cultivos de
bacterias libres de contaminación por microorganismos como levadura, hongos y
virus. Todos los materiales que entran en contacto con los fermentadores del matraz
deben ser estériles, y las manipulaciones no deben permitir ningún vínculo directo
entre los cultivos y los entornos no estériles.
Para evitar la contaminación, los matraces, cilindros graduados y barras de agitación
utilizadas en el experimento debe ser esterilizado. Se pueden utilizar muchas
técnicas diferentes para esterilizar el equipo. Consulte con los fabricantes para
garantizar el calor o la resistencia química antes de seleccionar el método.
Autoclave: Autoclave a 121 ° C durante 15 minutos. NOTA: La cinta indicadora de
autoclave debe usarse para garantizar que se hayan alcanzado las temperaturas
adecuadas.
Calor seco (cocción): coloque los componentes en un horno precalentado a 170 ° C y
hornee por 60 minutos. Retire con cuidado el equipo y cubra las aberturas con papel
de aluminio cuando aún esté caliente.
Limpieza con alcohol: Enjuague con etanol al 70%, asegurando la cobertura de todas
las superficies. Permita que el equipo se seque al aire antes de cubrir cualquier
abertura con papel de aluminio.
PREPARACIÓN DEL MEDIO DE CRECIMIENTO LB
El medio de crecimiento LB se puede preparar hasta 48 horas antes de comenzar el
experimento. El concentrado de LB Growth Media (Componente C) proporcionado en
este kit es estéril. Se puede comprar agua destilada o se puede hervir brevemente
agua del grifo para esterilizar antes de preparar los medios finales.
1. Siga la tabla para PREPARAR los medios que se necesitan para el experimento.
NOTA: Recomendamos 5 grupos con cultivos de 250 ml cada uno, pero se pueden
usar fermentadores más pequeños si es necesario. Los medios pueden mezclarse en
volúmenes individuales o como un gran volumen y luego dividirse en alícuotas.
2. DISPENSAR 250 ml de medio en 5 matraces estériles. Retenga el medio restante
para preparar cultivo semillas y para la medida de blancos en los
espectrofotómetros.
3. AGREGAR 0,6 ml de agua estéril al tubo de ampicilina (componente D). Invierta
para mezclar.
4. AGREGAR 0,1 ml de la solución de ampicilina a cada matraz de 250 ml de medio.
Agite para mezclar. Guarde la ampicilina restante a 4 ° C para la preparación de
cultivos de semillas.
Volumen final Agua destilada Medio crecimiento
concentrado LB (C)
375 ml 262, 5 ml 112, 5 ml
750 ml 525 ml 225 ml
1500 ml 1050 ml 450 ml
PREPARACIÓN DEL MEDIO SEMILLA
Este kit incluye bacterias que expresan proteínas cromogénicas rosadas o púrpuras.
Las dos proteínas no se separarán durante el experimento de cromatografía, por lo
que es importante que cada grupo seleccione una opción por adelantado.
1. ALIQUOTAR 125 ml de medio de crecimiento LB en dos matraces Erlenmeyer
estériles de 250 ml. GUARDE los medios restantes a 4 ° C para el Módulo IV.
2. AÑADIR 50 μl de ampicilina a los medios en cada matraz.
3. ETIQUETARcada matraz como "cultivo de semilla de proteína cromogénica
púrpura" o "cultivo semilla de proteína cromogénica rosada".
4. AÑADIR todo el contenido del vial BactoBeadsTM transformado con plásmidos de
color púrpura o rosado al matraz. Mezclar, asegurándose de que las bolitas se
disuelvan por completo. CUBRIR con papel de aluminio para prevenir la
contaminación.
5. INCUBAR los matraces durante la noche a 37 ° C en una incubadora con agitación.
NOTA: Sino se dispone de una incubadora con agitación, recomendamos agitar o
remover el cultivo a temperatura ambiente
6. ALIQUOTAR 25 ml del cultivo de siembra en tubos cónicos de 50 ml para cada
grupo de estudiantes.
5. PRÁCTICA
Marcar 4 pipetas de transferencia de la siguiente forma:
(-) Negativo
(+) Positivo
D1 Saliva Conductor 1
D2 Saliva Conductor 2
Nota: Todas las reacciones deben realizarse a temperatura ambiente. Los
componentes almacenados en la nevera deberían ser atemperados a
temperatura ambiente antes de realizar el experimento.
5.1 Módulo 1: Estudio de las desaparición del sustrato (almidón).
1. Colocar una pieza de la placa suministrada como se indica a continuación. Marcar
los 4 pocillos como se muestra en la figura y con el nombre o número del grupo de
trabajo.
(-) Negativo
(+) Positivo
D1 Saliva Conductor 1
D2 Saliva Conductor 2
Evitar las contaminaciones cruzadas utilizando una punta nueva si se usa
una micropipeta automática para cada muestra de saliva.
2. Usando una pipeta desechable diferente o una punta de pipeta para cada muestra,
agregue 4 gotas o 50 μl de cada muestra de saliva en el pocillo debidamente
etiquetado. Por ejemplo, la muestra Saliva Control negativo en el pocillo marcado
como (-).
Repetir el mismo proceso para el Saliva Control positivo (+), Saliva Conductor 1 (D1)
y Saliva Conductor 2 (D2).
3. Use una nueva pipeta para agregar 4 gotas o 50 μl de Solución de Almidón
(Componente E) en cada uno de los pocillos.
4. Use una nueva pipeta para agregar 1 gota o 10 μl de Solución de Yodo
(Componente F) en cada uno de los pocillos.
5. Registrar los cambios que se producen en cada pocillo.
5.2 Módulo 2: Estudio de la aparición del producto (maltosa).
1. Marcar 4 tubos test vacíos como sigue:
(-) Negativo
(+) Positivo
D1 Saliva Conductor 1
D2 Saliva Conductor 2
Evitar las contaminaciones cruzadas utilizando una punta nueva si se usa
una micropipeta automática para cada muestra de saliva.
2. Usando una pipeta de transferencia diferente o una punta de pipeta para cada
muestra, agregue 6 gotas o 100 μl de cada muestra de saliva en el pocillo
apropiadamente etiquetado. Por ejemplo, la muestra de Saliva Control negativo en el
pocillo marcado como (-).
Repetir el mismo proceso para el Saliva Control positivo (+), Saliva Conductor 1 (D1)
y Saliva Conductor 2 (D2).
3. Use una nueva pipeta de transferencia o punta de pipeta para agregar 6 gotas o
100 μl de Solución de Almidón a cada uno de los tubos de prueba. Mezclar bien el
tubo o pipeteando arriba y abajo (Si se dispone de vortex utilizarlo para agitar)
.Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos.
4. Añadir 200 μl Reactivo Color Ácido G a cada tubo. Mezclar bien el tubo o
pipeteando arriba y abajo. Incubar los tubos en agua hirviendo en un baño o vaso
durante 1 minuto. TENER PRECAUCIÓN.
5. Sacar los tubos del baño de agua y permitir que se enfríen a temperatura
ambiente.
6. Añadir 2 ml de agua destilada a cada tubo. Mezclar bien el tubo o pipeteando
arriba y abajo.
7. Registrar los cambios que se producen en cada pocillo.
6. RESULTADOS
REGISTRE SUS RESULTADOS EN DIAGRAMAS COMO LOS QUE SE PRESENTAN
ABAJO.
Módulo 1: Estudio de las desaparición del sustrato (almidón)
Según su observación, ¿qué color muestra cada pozo? ¿Y cuál de los dos conductores
concluirías que se habría quedado dormido? Explique.
El nivel de amilasa salival aumenta en humanos debido a la falta de sueño.
Normalmente, una solución de almidón adquiere un color marrón oscuro (o azul)
cuando se agrega yodo. Un color marrón oscuro indica la presencia de almidón al
final de la reacción (Caso del conductor 1). Por otro lado, si la amilasa actúa sobre el
almidón, la estructura compleja del almidón se destruye y la intensidad del marrón
oscuro (o azul) se desvanece. La hidrólisis completa del almidón está indicada por un
color amarillento cuando se combina con yodo (Caso del conductor 2).
Módulo 2: Estudio de la aparición del producto (maltosa)
Según su observación, ¿qué color muestra cada pozo? ¿Y cuál de los dos conductores
concluirías que se habría quedado dormido? Explique.