felix qui potuit rerum cognoscere causas lucrezio (de rerum natura)
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Felix qui potuit rerum cognoscere causasLucrezio (De rerum natura)
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Come si ottiene un aumento di flusso?
* In lievito nello switch tra fermentazione a respirazione (DeRisi, 1997)
* Nel seme durante la mobilizzazione delle riserve lipidiche (Rylott, 2001)
* Sintesi dei lipidi durante l’embriogenesi di Arabidopsis (O’Hara, 2002)
* Altri esempi (vedi Fell)
Esaminiamo alcuni esempi di aumenti di flusso in vivo
Aumentando S
Sottraendo P
Aumentando enzima
Aumentando attività
Causano aumenti locali che faticano a propagarsi lungo la via (dampening)
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Diauxic shift in yeast
Exploring the Metabolic and Genetic Control of Gene Expression on a Genomic Scale (DeRisi
et al., 1997)
Quali sono i geni che vengono attivati e quali vengono disattivati nella transizione da fermentazione a respirazione?
Microarray con tutti i geni di lievito ibridato con mRNA a vari tempi di crescita
Rosso = Aumento
Verde = Diminuzione
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Seguiamo i trascritti nel tempo
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Passando da fermentazione a respirazione cosa cambia nel
metabolismo?
PYK1
4.9 Variazione
Gene interessato
Rosso = Aumento
Verde = Diminuzione
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Molti geni sono regolati in modo simile
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Variazione coordinata di molti geni
E’ possibile classificare i geni in base alla regolazione: 6 classi
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Lipid mobilization in Arabidopsis
germinating seeds
Schematic representation of the pathways involved in storage lipid mobilization in oilseeds: 1, ACX; 2, multifuctional protein; 3, thiolase; 4, MS; 5, ICL; 6, PEPck.
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Northern analysis
(A) Stages of seedling development (B) Northern blot analysis of gene expression
from 0 to 8 days after imbibition
Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.
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Enzimi coinvolti
ACCMalonyl-CoA transacilasi
KAS III, II & IFAS - Acido grasso sintasi
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Lipid synthesis during embryogenesis
FAS Components Exhibit Constant mRNA Ratios
3-oxoacyl-ACP reductase (KR)biotin carboxylase (BC)acyl-ACP thioesterase (TE) enoyl-ACP reductase (ENR)acyl-carrier protein (ACP)
O'Hara, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:310-320
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Abbondanza relativa dei trascritti
It was demonstrated recently that mRNAs encoding the four subunits of heteromeric (ACCase) acetyl-CoA carboxylase accumulate at a constant molar ratio throughout silique development in Arabidopsis. The ratios were found to be CAC1:CAC2:CAC3:(accD-A & accD-B) = 0.14:1.0:0.17:0.06 (Ke et al., 2000)
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Via del triptofano in lievito
Solo la simultanea espressione di molti (tutti) i geni causa un ΔJ paragonabile al ΔEi (ΔJ ≃ CJ x ΔEi )
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• Lütke-Eversloh T, Stephanopoulos G. (2008) Combinatorial pathway analysis for improved L-tyrosine production in Escherichia coli: identification of enzymatic bottlenecks by systematic gene overexpression. Metab Eng. 10:69-77.
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Come fa la natura?Strategia multisito!
Molti altri esempi: Lipogenesi nei tessuti animali
Fotosintesi
Ciclo dell’urea
Gluconeogenesi
Sintesi degli steroidi
Operoni batterici, enzimi di fusione…
……u.s.w.
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Il “metodo universale”N
S
P
B
J1 = J2 + J3
J1
J2
J3
Per aumentare J3 di 5 volte, dovremo amplificare tutti gli enzimi che da S portano a P di 5 volte.
Questo comporta un consumo di addizionale di S. Se vogliamo mantenere intatta [S], occorre aumentare J1 fino al valore di (J2 +5J3)
J1'= (J2 + J3') = (J2 + 5J3)
Se J2 >> J3 allora si può trascurare di aumentare J1. In caso contrario si rischia di danneggiare J2
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J1 = J2 + J3 + J4 + J5
J’1 = (J2 + J3 + J4 + 5J5)
Il metabolismo è chiaramente più complesso, con tanti flussi diversi, presenza di cicli con cofattori (major obstacle)
Si può risalire da P verso N lungo le vie metaboliche fino a dove l’aumento di flusso può essere trascurato.
N
P
S1 B1
S3
S2 B2
B3
J1
J2
J5
J3
J4
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Se il metodo universale viene implementato in vivo, ci aspettiamo che:
Quando la quantità degli enzimi cambia in risposta a stimoli fisiologici o ambientali, la proporzione relativa rimane costante.
Il fattore di aumento dell’attività enzimatica corrisponda al fattore di aumento del flusso.
Il livello di cambiamento sia maggiore nel ramo metabolico interessato mentre i tratti a monte della ramificazione vadano incontro a cambiamenti di entità minore.
Oltre all’induzione degli enzimi interessati (maggior quantità) altri meccanismi di controllo possono essere adoperati in diversi siti.
Phenotype is flux!
Ma qualche volta phenotype is concentration
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Evidenze sperimentaliReguloni!
La concentrazione dei metaboliti varia molto meno del flusso
* Rate limiting step concept: more misguided than even MCA initially suggested
* Agire su un solo punto è poco efficace e potrebbe essere deleterio
Il metodo universale mantiene costanti le concentrazioni dei metaboliti [Si]
evita effetti negativi dovuti all’aumento o alla riduzione di [Si]
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ReferenzeReferenze ai lavori sugli aumenti naturali in vivo Vedi anche Fell ultimo cap
* DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. DeRisi JL, Iyer VR, Brown PO. (1997) Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science. 278:680-6.
* O'Hara P, Slabas AR, Fawcett T. (2002) Fatty acid and lipid biosynthetic genes are expressed at constant molar ratios but different absolute levels during embryogenesis. Plant Physiol. 129:310-20
* Rylott EL, Hooks MA, Graham IA. (2001) Co-ordinate regulation of genes involved in storage lipid mobilization in Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 29:283-7.
* Niederberger P, Prasad R, Miozzari G, Kacser H. (1992) A strategy for increasing an in vivo flux by genetic manipulations. The tryptophan system of yeast. Biochem J. 287:473-9.
* Zhao J, Last RL.(1996) Coordinate regulation of the tryptophan biosynthetic pathway and indolic phytoalexin accumulation in Arabidopsis. Plant Cell. 8:2235-44.
* Eastmond PJ, Rawsthorne S. (2000) Ccoordinate changes in carbon partitioning and plastidial metabolism during the development of oilseed rape embryos. Plant Physiol. 122:767-74
* Universal method: Kacser and Acerenza (1993) A universal method for achieving increases in metabolite production Eur J. of Biochemistry 216:361-367