T.C.

HACETTEPE NVERSTES

SALIK BLMLER ENSTTS

RALOKSFENN BYOLOJK MATERYALDEN VE

FARMASTK PREPARATTAN ANALZ N GAZ

KROMATOGRAFS-KTLE SPEKTROMETRS

YNTEMNN GELTRLMES VE VALDE

EDLMES

Kim. Mnevver TANDOAN

Analitik Kimya Program

YKSEK LSANS TEZ

Ankara

2012

T.C.

HACETTEPE NVERSTES

SALIK BLMLER ENSTTS

RALOKSFENN BYOLOJK MATERYALDEN VE

FARMASTK PREPARATTAN ANALZ N GAZ

KROMATOGRAFS-KTLE SPEKTROMETRS

YNTEMNN GELTRLMES VE VALDE

EDLMES

Kim. Mnevver TANDOAN

Analitik Kimya Program

YKSEK LSANS TEZ

TEZ DANIMANI

Prof. Dr. Nuran zaltn

Ankara

2012

iv

iv

TEEKKR

Tez danmanm olarak bilgi ve deneyimleriyle bana yol gsteren, desteini

esirgemeyen Sayn Prof. Dr. Nuran zaltna,

Beni yksek lisans yapmam iin yreklendiren ve bu sre ierisinde her trl

yardm esirgemeyen sevgili hocam Prof. Dr. Nursabah E. Baya,

Teorik ve pratik derslerde verdikleri deerli bilgiler iin Analitik Kimya

Anabilim Dalnn saygdeer hocalarna,

almalarm srasnda verdii destek ve yardmlar iin Dr. Ebru Uaktrke

almalarm iin etken madde salayan Eli Lilly Companye,

Bu sre ierisinde beni her trl eken, destek ve yardmlarn esirgemeyen

Dr. Cafer akala,

Birlikte almaktan ok keyif aldm takm arkadalarm Sinan nol ve

Tuba Kaara,

Her trl destek ve yardmlar iin Doping Kontrol Merkezi alanlarna,

Hayatmda iyi ki var dediim dostlarma,

Bu gnlere gelmemi saladklar iin ALEME;

Sonsuz Teekkr

v

v

ZET

Tandoan, M., Raloksifenin Biyolojik Materyalden ve Farmastik Preparattan

Analizi iin Gaz Kromatografisi-Ktle Spektrometrisi Ynteminin

Gelitirilmesi ve Valide Edilmesi. Hacettepe niversitesi Salk Bilimleri

Enstits Analitik Kimya Program Yksek Lisans Tezi, Ankara, 2012.

Raloksifen, kadnlarda postmenopozal osteoporozun tedavisinde, erkeklerde doping

amacyla kullanlan selektif strojen reseptr modlatrleri (SERM) grubundan bir

ilatr. Raloksifenin insan idrarndan ve farmastik preparattan analizi iin yeni bir

gaz kromatografisi-ktle spektrometrisi (GC-MS) yntemi gelitirilmitir. Raloksifen

GC-MS analizinden nce silillenmitir. Tepkime koullar farkl trev reaktifleri,

tepkime scaklklar ve sresi gibi parametreler incelenerek optimize edilmitir.

Raloksifen, MSTFA/-merkaptoetanol/NH4I trevlendirme reaktifi kullanlarak 80

Cde 30 dkda etkin bir ekilde trevlendirilmitir. Metiltestosteron i standart (IS)

olarak seilmitir. Analiz seilmi iyon modunda (SIM) yaplmtr. Raloksifen iin

m/z 578, IS iin m/z 446 iyonlar nicel analiz amacyla seilmitir. Kromatografik

yntemi optimize etmek iin kromatografik parametreler (balang ve son frn

scaklklar, gaz ak hz) incelenmitir. Raloksifen idrardan karbonat tamponu (pH

9.0) ve metil tersiyer-butil eter kullanlarak ekstre edilmitir. Gelitirilen yntemin,

sistem uygunluk testleri, zgnlk, duyarllk, dorusallk, doruluk, kesinlik, geri

kazanm, kararllk, salamlk ve tutarllk parametreleri insan idrarndan ve

farmastik preparattan raloksifen analizi iin ayr ayr valide edilmitir. drardan

raloksifen tayini iin dorusallk aral 10-200 ng mL-1, alt tayin snr (LOQ) 10.0

ng mL-1

, gzlenebilme snr (LOD) 8.0 ng mL-1 olarak bulunmutur. Raloksifenin

farmastik preparattan analizi iin dorusallk aral 10-400 ng, LOQ 10.0 ng ve

LOD 5.0 ng bulunmutur. Validasyon sonular, yntemin duyarl, kesin, doru,

zgn, salam ve tutarl olduunu gstermitir. Gelitirilen ve valide edilen yntem

Raloksifen HCl ieren farmastik preparatn analizine baarl bir ekilde

uygulanmtr. Sonular kaynaklardaki bir yntemle karlatrlarak aralarnda

istatistiksel olarak anlaml bir fark bulunmamtr.

Anahtar Kelimeler: Raloksifen, Biyolojik Materyal, Farmastik preparat,

Validasyon, GC-MS

vi

vi

ABSTRACT

Tandoan, M., Development and Validation of Gas Chromatography-Mass

Spectrometry method for the Analysis of Raloxifene in Biological Material and

pharmaceutical preparation. Hacettepe University Institue of Health Sciences,

Master Thesis in Analytical Chemistry, Ankara, 2012. Raloxifene is selective

estrogen modulator (SERM) drug which is used in the treatment of postmenopausal

osteoporosis in women and used for doping in men. A new gas chromatography-

mass spectrometry (GC-MS) method was developed for the determination of

Raloxifene in human urine and pharmaceutical preparation. Raloxifene was silylated

prior to GC-MS analysis. Derivatization reaction was optimized to investigate

parameters such as different derivatization reagents, reaction temperatures and times.

It was efficiently derivatized using MSTFA/-mercaptoethanol/NH4I at 80 C for 30

min. Methyltestosterone was selected as internal Standard (IS). Analysis was

performed in selected ion monitoring (SIM) mode. The ions m/z 578 for raloxifene

and m/z 446 for IS were selected for quantitation. Chromatographic variables (initial

and final oven temperature, flow rate of gas) were investigated to optimize the

chromatographic method. Raloxifene was extracted from urine with carbonate buffer

(pH 9.0) and methyl ter-butyl ether. The developed method was validated in terms

of system suitability tests, specificity, sensitivity, linearity, accuracy, precision,

recovery, stability, robustness and ruggedness for analysis of Raloxifene in each

urine and pharmaceutical formulation. Linearity was established in the range of 10-

200 ng mL-1

, limit of quantification (LOQ) was 10.0 ng mL-1

and limit of detection

(LOD) was 8.0 ng mL-1

for urine. Linearity was found 10-400 ng, LOQ was 10.0 ng

and LOD was 5.0 ng for pharmaceutical analysis. Developed method was sensitive,

precise, accurate, specific, sensitive, rugged and robust due to the validation study

results. The developed and validated method was successfully applied to analysis of

the pharmaceutical preparation containing raloxifene HCl. The results were

compared to the method in literature and no significant difference was found

between them.

Keywords: Raloxifene, Biological Material, Pharmaceutical Preparation, Validation,

GC-MS

vii

vii

NDEKLER DZN

ONAY SAYFASI ......................................................................................................

TEEKKR ............................................................................................................... V

ZET .......................................................................................................................... V

ABSTRACT ............................................................................................................... V

NDEKLER DZN ............................................................................................ V

SMGELER VE KISALTMALAR ............................................................................ X

EKLLER DZN ................................................................................................. X

TABLOLAR DZN ................................................................................................ XV

1. GR VE AMA ................................................................................................... 1

2. GENEL BLGLER ................................................................................................. 3

2.1. Selektif strojen Reseptr Modlatrleri (SERM) ............................................ 3

2.2. Raloksifen HCl ................................................................................................... 4

2.3. Raloksifenin Analiz Yntemleri ......................................................................... 6

2.4. Spektroskopik Yntemler ................................................................................... 9

2.5. Kromatografik Yntemler ................................................................................ 10

2.5.1. Kromatografinin Dayand Temel Parametreler ........................................... 12

2.5.2. Kromatografinin Snflandrlmas ................................................................. 18

2.5.2.1. Ayrlma Mekanizmalarna Gre Snflandrma ......................................... 19

2.5.2.2. Uygulama Biimine Gre Snflandrma ................................................... 21

2.5.3. Gaz Kromatografisi (GC) ............................................................................... 22

2.5.3.1. Gaz-Kat Kromatografisi (GSC) ................................................................ 23

2.5.3.2. Gaz-Sv Kromatografisi (GLC) ................................................................ 23

2.6. Gaz Kromatografisi-Ktle Spektrometrisi (GC-MS) ....................................... 29

2.6.1. GC-MS Ara Balantlar ................................................................................ 31

viii

viii

2.6.2. yon Kayna .................................................................................................. 32

2.6.3. Ktle Analizr .............................................................................................. 33

2.6.4. Dedektr ......................................................................................................... 35

2.6.5. Vakum Sistemleri ........................................................................................... 36

2.6.6. GC- MS Sisteminin Ayarlanmas (Autotune) ................................................ 37

2.7. Trevlendirme Teknikleri ................................................................................. 40

2.8. rnek Hazrlama ............................................................................................... 42

2.8.1. Sv-Sv ekstraksiyonu .................................................................................. 42

2.8.2. Kat-Faz Ekstraksiyonu (SPE) ....................................................................... 43

2.9. Analitik Yntem Validasyonu .......................................................................... 43

2.9.1. Yntem Validasyonunun Deerlendirilmesinde Kullanlan Parametreler ..... 44

2.10. Kemometri ........................................................................................................ 49

2.10.1. Plackett-Burman Tasarm .............................................................................. 50

3. GERE VE YNTEMLER .................................................................................. 51

3.1. Kimyasal Maddeler ........................................................................................... 51

3.2. Cihazlar ............................................................................................................. 52

3.3. Cam ve Sarf Malzemeleri ................................................................................. 53

3.4. zeltiler .......................................................................................................... 53

3.4.1. Sentetik Preparatlarn Hazrlanmas ............................................................... 54

3.4.2. Farmastik Preparat zeltisinin Hazrlanmas ............................................. 54

3.4.3. UV-Spektrofotometrik Yntem in zeltiler .............................................. 55

3.5. Analiz Ynteminin Gelitirilmesi ..................................................................... 55

3.5.1. Trevlendirme Basamann Optimizasyonu ................................................. 55

3.5.2. Kromatografik Koullarn Optimizasyonu ..................................................... 56

3.5.3. Ekstraksiyon Basamann Optimizasyonu .................................................... 56

ix

ix

3.5.4. standart Seimi ........................................................................................... 56

3.5.5. Validasyon almalar iin rneklerin Hazrlanmas ................................... 56

3.5.6. Kalibrasyon Erilerinin Hazrlanmas ............................................................ 57

3.6. Analitik Yntem Validasyonu .......................................................................... 57

3.6.1. Sistem Uygunluk Testleri ............................................................................... 57

3.6.2. zgnlk ........................................................................................................ 58

3.6.3. Dorusallk ..................................................................................................... 59

3.6.4. Gzlenebilme ve Alt Tayin Snr .................................................................. 59

3.6.5. Doruluk ve Kesinlik ..................................................................................... 59

3.6.6. Geri Kazanm ................................................................................................. 60

3.6.7. Kararllk ........................................................................................................ 60

3.6.8. Salamlk ve Tutarllk ................................................................................... 61

3.7. UV/GB Spektrofotometrik Yntemle (Karlatrma Yntemi) Yaplan

almalar ......................................................................................................... 62

3.8. statistiksel Hesaplamalar ................................................................................. 62

4. BULGULAR ......................................................................................................... 63

4.1. Analiz Ynteminin Gelitirilmesi ..................................................................... 63

4.1.1. Trevlendirme Basamann Optimizasyonu ................................................. 63

4.1.2. Kromatografik Yntem Koullarnn Optimizasyonu .................................... 70

4.1.3. Ekstraksiyon Basamann Optimizasyonu .................................................... 72

4.1.4. Standart Seimi .......................................................................................... 73

4.2. Raloksifenin drardan Analizi in Yntem Validasyonu ................................ 75

4.2.1. Sistem Uygunluk Testleri ............................................................................... 75

4.2.2. zgnlk ........................................................................................................ 76

4.2.3. Kalibrasyon Erileri ve Dorusallk Aralklar ............................................. 79

x

x

4.2.4. Gzlenebilme ve Alt Tayin Snr .................................................................. 81

4.2.5. Doruluk ......................................................................................................... 81

4.2.6. Kesinlik .......................................................................................................... 81

4.2.7. Geri Kazanm ................................................................................................. 82

4.2.8. Kararllk ........................................................................................................ 83

4.2.9. Salamlk ve Tutarllk ................................................................................... 84

4.3. Raloksifenin Farmastik Preparattan Analizi in Yntem Validasyonu ........ 86

4.3.1. zgnlk ........................................................................................................ 86

4.3.2. Kalibrasyon Erileri ve Dorusallk Aralklar ............................................. 88

4.3.3. Gzlenebilme ve Alt Tayin Snr .................................................................. 90

4.3.4. Doruluk ......................................................................................................... 91

4.3.5. Kesinlik .......................................................................................................... 91

4.3.6. Geri kazanm .................................................................................................. 92

4.4. UV Spektrofotometrik (Karlatrma) Yntem Bulgular ............................... 92

4.5. Yntemin Farmastik Preparatlara Uygulanmas ............................................. 93

5. TARTIMA ........................................................................................................... 95

6. SONU VE NERLER .................................................................................... 102

KAYNAKLAR ........................................................................................................ 104

EKLER ..................................................................................................................... 111

ZGEM ............................................................................................................. 116

xi

xi

SMGELER ve KISALTMALAR

BH Bal hata

BMD Kemik mineral dansitometresi

BSS Bal standart sapma

BSTFA N,O bis(trimetilsilil) trifluoroasetamid

CEE Konjuge strojen

CI Kimyasal iyonlatrma

EI Elektron bombardman ile iyonizasyon

FDA Amerikan Gda ve la Dairesi

GC Gaz kromatografisi

H Kolon tabaka ykseklii

HMDS Hekzametildisilan

HPLC Yksek performansl sv kromatografisi

ICH Uluslararas Harmonizasyon Konferans

IS standart

K Dalm katsays

k Kapasite faktr

L Kolon dolgusunun uzunluu

LOD Gzlenebilme snr

LOQ Alt tayin snr

MS Ktle spektrometrisi

MSTFA N-metil-N-trimetilsilil trifloroasetamid

N Teorik tabaka says

PLOT Porz yzeyli ak borusal kolonlar

PSO Pik simetri oran

Rs Ayrclk

SCOT Destek kapl ak borusal kolonlar

SERM Selektif strojen reseptr modlatrleri

SFC Sperkritik akkan kromatografisi

SIM Seilmi iyon taramas

SPE Kat-faz Ekstraksiyonu

TIC Toplam iyon taramas

xii

xii

tm l hacim zaman

TMCS Trimetilklorosilan

TMS Trimetilsilil

TMSDEA Trimetilsilildietilamin

tR Alkonma zaman

U Ortalama dorusal hz

USP Amerikan Farmakopesi

V Ortalama g hz

UV/GB Ultraviyole/Grnr Blge

W Pik taban genilii

WADA Dnya Anti-Doping Ajans

WCOT Duvar kapl ak borusal kolonlar

Seicilik faktr

xiii

xiii

EKLLER DZN

ekil 2.1. Raloksifen HCln kimyasal yaps ............................................................. 4

ekil 2.2. Tek bileenli bir numune iin tipik bir kromatogram ................................ 13

ekil 2.3. Van Deemter erisi .................................................................................... 16

ekil 2.4. Gaz kromatografi sistemi ........................................................................... 23

ekil 2.5. GCde kullanlan tayc gazlara ait Van Deemter grafikleri ................... 24

ekil 2.6. WCOT, SCOT, PLOT, Dolgulu kolonlar .................................................. 27

ekil 2.7. Kuadropol GC-MS sisteminin ematik gsterilii ..................................... 30

ekil 2.8. Elektron bombardman ile iyonizasyon (EI) ............................................. 32

ekil 2.9. Kuadropol ktle analizr.......................................................................... 34

ekil 2.10. (a) Dizi dinot, (b) Devaml dinot elektron oaltc dedektrlerin ematik

gsterilii .......................................................................................................... 36

ekil 2.11. Analizde kullanlan GC-MS cihaznn autotune kts ........................... 39

ekil 4.1. Raloksifenin MTBSTFA ile silillenmesi sonucu elde edilen raloksifen-bis-

O-terbutildimetilsilile ait ktle spektrumu ...................................................... 65

ekil 4.2. Raloksifenin MSTFA ile silillenmesi sonucu elde edilen Raloksifen tris-O-

TMSye ait ktle spektrumu ............................................................................. 67

ekil 4.3. Sililleme reaktifleri ile farkl scaklk ve sreler uygulanarak elde edilen

Raloksifen-tris OTMS trevine ait alan ortalama-standart sapma grafikleri ... 69

ekil 4.4. GC-MS kromatografik koullarn karlatrma grafii ............................. 72

ekil 4.5. Raloksifenin farkl pHlarda metil tersiyer-butil eter ile ekstraksiyonunda

mutlak geri kazanm deerleri .......................................................................... 73

ekil 4.6. Metiltestosteronun (IS) silillenmesi sonucu elde edilen metiltestosteron

bis-OTMS ait ktle spektrumu ......................................................................... 74

ekil 4.7. Bo idrar (n=8) ve Raloksifen (10 ng mL-1) ile IS (10 ng mL-1) eklenmi

idrara ait kromatogramlar ve Farkl deriimlere ait (10, 80, 160 ng mL-1 )

raloksifen pikleri ............................................................................................... 77

xiv

xiv

ekil 4.8. Bo idrara ait Raloksifen iin (a,b,c) ve IS iin (d) iin seilmi iyon (SIM)

kromatogramlar ............................................................................................... 78

ekil 4.9. drardan Raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile elde edilen a)

Kalibrasyon erisi b) Dorusallk kontrol grafii ............................................ 79

ekil 4.10. Raloksifenin idrardan ekstraksiyonu sonucu a) mutlak ve b) bal geri

kazanm deerlerine ait grafikler ...................................................................... 83

ekil 4.11. (Raloksifen alan/IS alan) deeri iin standartlatrlm etkilerin normal

grafii ................................................................................................................ 86

ekil 4.12. Plasebo zeltisi (raloksifen = 10 ng) ve IS (50 ng) eklenmi sentetik

preparata ait kromatogramlar ............................................................................ 87

ekil 4.13. Raloksifenin GC-MS yntemiyle tayini iin kalibrasyon ve standart

ekleme erileri .................................................................................................. 88

ekil 4.14. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile elde

edilen a) Kalibrasyon erisi b) Dorusallk kontrol grafii.............................. 89

ekil 4.15. Raloksifenin 0.1 M NaOH zeltisi iindeki spektrumu ......................... 92

ekil 4.16. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin UV-GB spektrofotometrik

yntem ile elde edilen kalibrasyon erisi ......................................................... 93

xv

xv

TABLOLAR DZN

Tablo 2.1. Ktle spektrometresinin ayarlanmasnda kullanlan ktlelerin bal

okluklar ve izotop ktle oranlar .................................................................... 38

Tablo 2.2. Trevlendirme reaktifleri .......................................................................... 41

Tablo 2.3. Sv-sv ekstraksiyonu iin yaygn olarak kullanlan zcler .............. 43

Tablo 2.4. Validasyon iin incelenen parametreler .................................................... 44

Tablo 2.5. 11 faktre ait Plackett-Burman tasarm matriksi ...................................... 50

Tablo 3.1. Sistem uygunluk test kriterleri .................................................................. 58

Tablo 3.2. Salamlk ve tutarllk iin seilen parametreler ve parametrelere ait

seviyeler. ........................................................................................................... 62

Tablo 4.1. Raloksifen-bis-O-terbutildimetilsilile ait paralanma rnleri ............... 66

Tablo 4.2. Raloksifen tris-O-TMSye ait paralanma rnleri .................................. 68

Tablo 4.3. Gaz kromatografisi iin uygulanan scaklk programlar ......................... 70

Tablo 4.4. Denenen koullarda sistem uygunluk parametreleri ................................. 71

Tablo 4.5. eitli organik zclerin kullanlmasyla elde edilen % geri kazanm

deerleri (20 ng mL-1 Raloksifen HCl iin) ...................................................... 72

Tablo 4.6. Metiltestosteron bis-OTMSye ait paralanma rnleri ........................... 75

Tablo 4.7.Gelitirilen GC-MS yntemi iin sistem uygunluk parametreleri ............ 76

Tablo 4.8. drardan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile izilen kalibrasyon

erisinin zellikleri ........................................................................................... 80

Tablo 4.9. drardan raloksifenin tayini iin GC-MS yntemi ile izilen kalibrasyon

erisinin dorusallktan ayrl ve korelasyon katsaysnn nem kontrol ..... 80

Tablo 4.10. Raloksifenin GC-MS yntemi ile idrardan analizinden elde edilen gn ii

ve gnler aras doruluk ve kesinlik bulgular ................................................. 82

Tablo 4.11. Raloksifenin idrardan ekstraksiyonu sonucu hesaplanan mutlak ve bal

geri kazanm deerleri ...................................................................................... 83

xvi

xvi

Tablo 4.12. drarda raloksifenin kararllk sonular ................................................. 84

Tablo 4.13. drarda raloksifenin donma-erime dngs kararll ........................... 84

Tablo 4.14. Salamlk ve tutarllk deneyleri iin tasarm matriksi ve Raloksifen ile

IS iin elde edilen alan deerleri ...................................................................... 85

Tablo 4.15. Salamlk ve tutarllk iin elde edilen (Raloksifen alan/ IS alan)

deerlerine ait ANOVA test sonular .............................................................. 85

Tablo 4.16. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile izilen

kalibrasyon erisinin zellikleri ....................................................................... 90

Tablo 4.17. Farmastik preparattan raloksifen tayini iin GC-MS yntemi ile elde

edilen kalibrasyon erisinin dorusallktan ayrl ve korelasyon katsaysnn

nem kontrol ................................................................................................... 90

Tablo 4.18. Raloksifenin GC-MS yntemi ile farmastik preparat analizinde elde

edilen gn ii ve gnler aras doruluk ve kesinlik bulgular ........................... 91

Tablo 4.19. Raloksifenin farmastik preparatlardan GC-MS ve UV/GB

spektrofotometrik yntem ile analiz bulgular .................................................. 94

1

1

1. GR VE AMA

Selektif strojen reseptr modlatrleri (SERM) vcutta bulunan hedefleri

uyaran veya tepkisiz hale getiren sentetik non-steroid bir grup bileikten

olumaktadr (1). SERM strojen replasman tedavisinin istenmeyen etkilerini ortadan

kaldrmak ya da azaltmak amac ile kullanma sunulmutur. Meme ve

endometriumda negatif, kemik, kardiyovaskler sistem ve vajende pozitif etki

gsteren ideal hormon replasman tedavisi ilac olarak SERM kullanlabilir (2).

Raloksifen 1997 ylnda ABDde postmenopozal osteoporozun engellenmesi

ve tedavisi iin onaylanm bir ilatr (2). Bu ilacn alld dier alanlar ise

postmenopozal kadnda meme kanseri ve kardiyovaskler hastalk riskinin

azaltlmasdr. Raloksifen iskelet sistemi, lipid metabolizmas ve baz phtlama

faktrleri zerinde agonistik etki gsterirken, meme ve uterusta antagonistik etki

gstermektedir (3).

Raloksifen postmenopozal kadnlarda kemik kaybn engellemekte ve

vertebral krk oluumunu da azaltmaktadr (3, 4). Ancak konjuge strojenlerle

(CEE) karlatrldklarnda bu etki daha az belirgindir (5). Raloksifen gnlk

(60mg) kullanmnn kemik mineral younluu (BMD) zerine olan etkileri CEE nin

% 50-60 ' kadardr.

Randomize almalarda, kardiyovaskler riskin biyokimyasal iaretleyicileri

zerinde olumlu etkisi olduu gsterilmitir (serum total kolesterol ve LDL

seviyeleri azalmaktadr). Ancak HDL kolestrolde deiiklik olmamakla birlikte

trigliserid seviyeleri de artmamaktadr (6,7).

Raloksifen kullanm erkeklerde plazmadaki testosteron seviyesini anlaml bir

ekilde arttrr (8). Bu yzden Dnya Anti-Doping Ajansnn (WADA) belirledii

yasakl maddeler listesinde yer almaktadr (9).

Kaynaklarda raloksifen analizi ile ilgili olarak genellikle yksek performansl

sv kromatografisi (HPLC) (10-20), kapiler elektroforez (CE) (21) ve

spektrofotometri (22-25) yntemlerine rastlanmaktadr. Raloksifenin gaz

kromatografisi-ktle spektrometrisi yntemiyle analizine ait kaynak

bulunmamaktadr. Bu almada kaynaklardaki boluu doldurmak amacyla

raloksifenin insan biyolojik materyalinden (idrar) ve farmastik preparattan (tablet)

2

2

analizi iin gaz kromatografisi-ktle spektrometrisi (GC-MS) ynteminin

gelitirilmesi amalanmtr. Raloksifenin GC-MSde analizi iin trevlenmesi

gerektiine karar verilmi ve trevlendirmek amacyla eitli trev reaktifleri,

tepkime scakl ve sresi gibi parametrelerin incelenmesi uygun grlmtr.

Raloksifenin idrardan yksek oranda geri kazanlmas iin ekstraksiyon koullarnn

optimizasyonu planlanmtr. Gelitirilen yntemin validasyon parametreleri

(zgnlk, doruluk, kesinlik, geri kazanm, duyarllk, kararllk, salamlk,

tutarllk) idrardan ve farmastik preparattan raloksifen analizi iin ayr ayr

deerlendirilerek geerliliklerinin kantlanmas planlanmtr. Valide edilen yntemin

raloksifen HCl ieren farmastik preparatlarn analizine uygulanmas ve sonularn

kaynaklarda bulunan bir yntemle istatistiksel olarak karlatrlmas amalanmtr.

3

3

2. GENEL BLGLER

2.1. Selektif strojen Reseptr Modlatrleri (SERM)

strojen reseptr, hedef dokularnda (rn., uterus, vajina ve hipofiz bezi)

strojen etkisini balatan tetikleyicidir (26 ).

strojen eksiklii ateroskleroz, osteoporoz ve santral sinir sistemi

dejenerasyonu gibi birok patolojik olaya nclk etmektedir. strojen Replasman

Tedavisi kadnlarda menapoz sonrasnda kognitif fonksiyonlar srdrmek,

aterosklerozun oluumunu engellemek, vertebral krklar nlemek amacyla

kullanlmaya balanmtr (27). te yandan strojenin zellikle meme bezleri ve

uterusta tmr oluumunu ve geliimini arttrd bilinmektedir (27, 28). strojenin

bu istenmeyen etkilerini nlemek amacyla eitli teraptik alternatifler aranmaya

balanm ve 1960l yllarda strojenin yararl etkilerini beyin, kemik ve arterlerde

gsteren ve ayn zamanda strojen gibi meme ve endometriumda tmr oluumuna

neden olmayan yeni bir ila grubu retilmitir. Bu bileiklere dokuya zg

etkilerinden dolay selektif strojen reseptr modlatrleri (SERMs) ad verilmitir

(27). 1970li yllarda birinci nesil SERMlerden biri olan tamoksifen metastatik

meme kanserinin tedavisinde strojen antagonisti olarak kullanlmaya balanmtr.

Tamoksifenin antagonist olarak kullanmnn, strojenin kemiklerdeki mineral

younluunu arttrc etkisini de inhibe edecei dnlmtr. Yaplan almalar

sonucunda tamoksifenin, strojenin etkisini taklit ederek omurilikte kemik mineral

younluunu arttrd, fakat bunun yannda strojen gibi endometrium kanserine

neden olduu gzlenmitir. Buna bal olarak tamoksifenin dokuya zg strojen

agonisti / antagonisti olarak grev yapt saptanmtr (28). Tamoksifenden sonra

yine SERM snfna dahil olan, yapsnda benzotiyofen halkas bulunan kimyasal ad

[6-hidroksi-2-(4-hidroksifenil) benzotiyofen-3-il] [4-[2-(1-piperidinil) etoksi] fenil]

metanon olan yeni bir ila, raloksifen, kemik zerindeki strojen agonisti etkisinden

dolay 1997 ylnda Amerikan Gda ve la Dairesi (FDA) onayyla osteoporoz

tedavisinde kullanlmaya balanmtr (29-31). Raloksifen endometriumda kanser

oluumunu tetiklemeyen bir bileik olarak meme kanserinin nlenmesi amacyla

gvenle kullanlan bir ilatr. Raloksifenin ayrca sanlarda serum total kolesterol

dzeyini, postmenapozal kadnlarda da serum LDL dzeyini drd gsterilmi,

4

4

plazma homosistein deriimini azaltt ancak HDL zerinde herhangi bir etkisi

olmad saptanmtr (27).

Erkeklerde raloksifen kullanm ile ilgili yaplan aratrmalar sonucunda

kemik ykm belirtelerinde azalma, kandaki testosteron ve 17-estradiol

miktarlarnda bal olarak yksek art grlmtr (32).

2.2. Raloksifen HCl

Kimyasal ve Fiziksel zellikleri

Raloksifen HCl benzotiyofen snfndan 2. kuak bir SERMdir. Raloksifen [6-

hidroksi-2-(4-hidroksifenil) benzo[b]tien-3-il] [4-[2-(1-piperidinil) etoksi] fenil]

hidroklorr kimyasal yapsna ve C28H27NO4S HCl molekl formlne sahiptir (ekil

2.1). Kimyasal ad metanon-hidrokloriddir. Raloksifen (CAS numaras: 84449-90-1)

erime derecesi 143-147 oC olan ak sar renkli, kat bir maddedir. Suda ok az

znr.

ekil 2.1. Raloksifen HCln kimyasal yaps

Farmakodinamik zellikleri

Hcre ekirdeinde yerleik olan strojen reseptrlerine balanarak baz

dokularda strojen agonistik etki gsterirken, dierlerinde strojen aktivitesini inhibe

eder (antagonistik etki). Raloksifen lipid metabolizmas ve iskelet sistemi zerine

5

5

strojen benzeri, meme ve endometrium zerine ise antistrojenik etki

gstermektedir (33).

Gnmzde ve olarak adlandrlan iki ayr strojen reseptr olduu

bilinmektedir. strojenin ve SERMlerin farkl dokularda farkl reseptrleri uyararak

etki gsterdikleri dnlmektedir. Raloksifen bileiindeki antistrojenik etkiden

sorumlu esas blge alkilamino-etoksik yan zinciridir. Bu zincirde yer alan nitrojen,

spesifik olarak strojen reseptrndeki aspartat ile etkileime girmekte ve

antistrojenik etkinin sergilenmesini balatmaktadr (34, 35).

Tamoksifenin endometrial neoplazi riskinde yapm olduu art ile

raloksifen gndeme gelmitir. 1994de raloksifenin yumurtalklar alnm dii

sanlarda tamoksifenin sebep olduu endometrial proliferasyonu engelledii

gsterilmitir (36). 1994 ile 1997 yllar arasnda raloksifenin kemik kaybn

engelledii, serum kolesterol dzeylerini drd ve meme dokusunda gl bir

anti-proliferatif zellii olduu ve endometrial proliferasyonu engellediini tespit

eden birok alma yaplmtr (37, 38)

Farmakinetik zellikleri

Raloksifen lkemizde 60 mg tablet halinde piyasadadr, gda almndan

bamsz olarak gnn herhangi bir saatinde alnabilir. Raloksifen oral uygulamadan

sonra hzla emilir. Oral dozun yaklak % 60 emilmektedir. Yaygn presistemik

glukuronid konjugasyon sz konusudur. Raloksifenin mutlak biyoyararlanm %

2.0dir. Ortalama maksimum plazma deriimine ve biyoyararlanma ulama sresi

raloksifenin ve glukuronid metabolitlerinin sistemik ara dnmne ve kendisi ile

birlikte glukuronid metabolitlerinin enterohepatik sikluslarna baldr (20, 39).

Raloksifen vcutta geni dalm hacmine sahiptir ve dalm hacmi doza

baml deildir. Raloksifen (% 98-99 orannda) plazma proteinlerine gl bir

ekilde balanr (5).

Raloksifen, glukoronid konjugatlarna yaygn ilk gei metabolizmasna

urar: raloksifen-4glukoronid, raloksifen-6-glukoronid ve raloksifen-

6,4diglukoronid. Baka bir metabolit tespit edilmemitir. Raloksifen, raloksifen ve

glukoronid metabolitlerinin kombine deriimlerinin %1inden azn kapsamaktadr.

6

6

Raloksifen seviyeleri, enterohepatik geri dnm ile 27.7 saatlik plazma yarlanma

mr vererek salanmaktadr (5, 40).

Raloksifen dozunun ve glukoronid metabolitlerinin byk blm 5 gn

ierisinde esas olarak fees ile atlr. drarla atlan ksm %6s kadardr. % 0.2 kadar

ksm idrardan deimeden atlr (5).

Yan Etkileri

Klinik deneyimlerde dikkati eken iki nemli yan etki ate basmas ve bacak

adalelerinde kramplardr. Ate basmas sklkla tedavinin ilk 6 aynda

gzlenmektedir. FDA onay 60 mg/gn dozu iin geerlidir. 60 mg/gn dozda

raloksifen kullananlar ve plasebo alanlar arasnda, ate basmas nedeni ile tedaviye

son verilme oranlar asndan fark bulunmamtr (41). Delmas ve arkadalarnn

calmasnda da; raloksifen grubunda ate basmas, memelerde hassasiyet ve vajinal

kanama ikayetlerinde plasebo grubuna gore anlaml farkllk bildirilmemektedir

(42). Raloksifenin nemli yan etkisi venoz tromboemboli (Derin Ven Tronbozu,

Pulmoner Emboli veya Renal Ven Trombozu) riskinin artdr. Vaskler

tromboemboli insidans raloksifen grubunda 3.7/1000, plasebo grubunda ise 1,4/1000

olarak saptanmtr (43). Tromboemboli riskinin tedavi balangcndaki ilk 4 aylk

sure icerisinde daha yuksek olduu dikkati cekmitir.

2.3. Raloksifenin Analiz Yntemleri

Reddy ve di., (10) Raloksifenin farmastik dozaj formundan ters faz yksek

performansl sv kromatografisi ile tayini iin yntem gelitirmilerdir. Bu

almada UV dedektr kullanlmtr. Bu yntemde C18 kolon kullanlp, hareketli

faz olarak 1 mL dk-1

ak hznda asetonitril ve fosfat tampon karm (30:70) tercih

edilmitir. la iin alkonma zaman 10.609 dk bulunmutur. Raloksifen iin 0.5-200

g mL-1 deriim aralnda lineer cevap elde edilmitir.

Trontelj ve di.nin, (11) yapt almada ise, farmastik preparattan

raloksifen hidroklorrn, UV ve kulometrik detektrler kullanarak HPLC

yntemiyle tayini iin yntem gelitirilip valide edilmi, ilacn kalite kontrol

7

7

almalar yaplmtr. LOQ, kulometrik ve UV dedektrler iin srasyla 0.336 ve

0.610 mg L-1

olarak saptanmtr.

Wang ve di., (12) HPLC-UV ile raloksifen hidroklorr bileiminin tayini

iin yntem gelitirmilerdir. Bu yntemle raloksifen hidroklorrn nitel olarak

analizi yaplmtr. Hareketli faz olarak asetonitril: 0.01M sodyumdodeksilslfat

(55:45, pH:4.0) bileimi kullanlmtr.

Nandini ve di., (13) raloksifen hidroklorr iin HPLC-UV ile tayin ve

validasyon almalarnda hareketli faz olarak 1 mL dk-1 ak hznda asetonitril:su

(40:60) bileimi kullanmlardr. Raloksifen hidroklorr iin 250-750 g ml-1

deriim aralnda dorusal bir cevap elde edilmitir.

Pavithra ve di., (14) tabletten raloksifen hidroklorr analizi iin ters faz

HPLC metodu gelitirmilerdir. Bu yntemde hareketli faz olarak su:metanol

(50:50), ak hz 1 mL dk-1 olarak belirlemilerdir. Raloksifen HCl iin dorusal

cevap aral ise 10-60 mg mL-1dir.

Basavaiah ve di., (15) farmastik preparattan raloksifen HCl analizi iin

gradiyent HPLC-UV ile analizi iin yntem gelitirmilerdir. Dorusallk aral 50

600 g mL1 olarak saptanmtr. LOD deeri 0.04 g mL1 olarak verilmitir.

Yang ve di., (16) fare plazmasnda raloksifen tayini iin gelitirdikleri

HPLC-UV ynteminde rnekleri basit protein ktrmesiyle hazrlamlardr. Bu

ayrma iin C18 kolonu ve hareketli faz olarak asetonitril:amonyum asetat karm

kullanlmtr. Dorusallk aral 0.2-75.0 g mL-1 olarak verilmitir.

Trontelj ve di., (17) insan plazmasndan raloksifen ve metabolitleri iin sv

kromatografisi-tandem ktle spektrometrisinde (LC-MS-MS) yntem gelitirme ve

validasyonu almasnda, insan plazmasndan raloksifenin tayini ve validasyonu ile

beraber iki metabolitinin raloksifen-6-glukoronid (M1) ve raloksifen -4'-glukoronid

(M2) tayini de yaplmtr. Bu almada 0.5 mL plazmadan kat faz ekstraksiyonu

ile ayrma salanmtr. Dorusallk aral M1 iin 0.2-340 g L-1, M2 iin 1.60-

2.72 g L-1 ve raloksifen iin 0.088-60.00 g L-1 bulunmutur. LOD ise M1, M2 ve

raloksifen iin srasyla 8.0, 11.0 ve 6.0 ng L-1 verilmitir.

Zweigenbaum ve di., (18) insan plazmasndan selektif strojen

modlatrleri analizi iin LC-MS yntemi gelitirmilerdir. Gelitirilen metodla ayn

anda tamoxifen, raloxifene, 4-hydroxytamoxifen, nafoxidine, and idoxifene analizi

8

8

gerekletirilmitir. Raloksifen iin kalibrasyon araln 7-5100 ng/mL olarak ve

LOQ deerini 6ng/mL olarak saptamlardr.

Kumar ve di., (19) ise insan idrarndan raloksifen hidroklorrn LC-MS-

MS ile tayinini yapmlardr. Salkl insan idrarna raloksifen hidroklorr eklenip

kat faz ekstraksiyonu sonrasnda C18 kolon kullanlarak triple kuadrapol tandem

ktle spektrometresi ile tayini yaplmtr. Hareketli faz olarak amonyum asetat (pH

4.0)-asetonitril (60:40, h/h) karm kullanlmtr. Dorusallk aral 20-1000 ng

mL-1

olarak saptanmtr. LOQ deeri 20 ng mL-1 olarak verilmitir. Doruluk

deriim (50, 500 ve 850 ng mL-1) iin hesaplanm ve yzde bal hata % 0.84

bulunmutur.

Tina Trdan ve di., (20) gerek insan idrarndan raloksifen ve raloksifen-6-

-glukoronid (M1), raloksifen-4--glukoronid (M2), raloksifen-6,4-diglukoronid

(M3) tayinini LC-MS/MS yntemiyle yapmlardr. Raloksifenden, raloksifen

glokoronidi elde etmek amacyla Streptomyces mikroorganizmalarla biyolojik

dnmlerden faydalanmlardr. LC-MS/MS n ilemleri iin kat faz

ekstraksiyonu yapmlardr. Raloksifen iin LOQ deeri 1.01, M1 iin 1.95, M2 iin

2.83 ve M3 iin 4.69 nM olarak belirlenmitir. Yntemin doruluu bal hata %

8.8 bulurlarken, kesinlii tm maddeler iin bal standart sapma % 12 olarak

saptamlardr.

Perez-Ruiz ve di., (21) raloksifenin kapiler elektroforez kullanlarak miktar

tayini ve validasyonu almasnda farkl parametrelerin (tampon deriimi, pH ve

uygulanan voltaj) g zaman, pik simetrisi ve etkinlik zerindeki etkilerini

aratrmlardr. Bu almada, raloksifen iin dorusallk aral 0.12 - 36 g mL-1

olarak bulunmutur.

Annapurna ve di., (22) farmastik formulasyondan raloksifen HCl' n

spektrofotometrik tayini almasnda, raloksifen HCl bulk ve tablet formundan

yeni spektoskopik yntem gelitirilmilerdir. A yntemi bo zeltiye kar cevab

llen maksimum absorbansta 0.1 N NaOHde sar renkli kromojen oluumuna

dayanr. B yntemi, raloksifen ile demir klorr ve 1,10-fenotrolin ile krmz renkli

kromojen oluumuna dayanr. C yntemi ise demir klorr ve 2,2-bipiridil ile kmz

renkli kromojen oluumuna dayanr. Kromojenlerin maksimum absorbans verdii

9

9

dalga boyundaki cevaplar llmtr. LOQ deerleri A, B, C yntemleri iin

srasyla 5 g mL-1, 1 g mL-1, 2 g mL-1 olarak verilmitir.

Basavaiah ve di., (23) spektrofotometrik yntemle farmastik preparattan

raloksifen hidroklorr saptanmas ve validasyonu almasnda iki yntem

gelitirmilerdir. Bu yntemde raloksifen dolayl analizi, oksidimetrik reaktif olan

bromat-bromit karmnn kullanlmas ile gerekletirilmitir. Fazla bromr metilen

mavisi [Yntem A] ve rodamin B [Yntem B] boyalar kullanlarak analiz edilmitir.

Optimum koullarda yntem A'nn 0.5-5.0 g mL-1 ve yntem B nin 0.1-2.0 g mL-1

aralnda dorusal olduu bulunmutur. LOQ srayla 0.18 ve 0.13 g mL-1 olarak

bulunmutur.

Basavaiah ve di., (24) farmastik preperattan raloksifen analizi iin iki yeni

spektrofotometrik yntem gelitirip validasyonunu yapmlardr. lk metot asidik

ortamda raloksifenin permanganat ile reaksiyonu sonucunda kahverengi kromojen

gruplarnn 430 nm dalga boyunda verdii absorbans lmne dayanr. kincisi ise

raloksifenin H2SO4 ortamnda permanganatla 550 nm dalga boyunda verdii

absorbans lmne dayanr. Dorusallk aral ilk yntem iin 0.6-6.0 mg mL1,

ikinci yntem iin 1.5-15 mg mL1dir. LOQ ise ilk yntem iin 0.25 mg mL1, ikinci

yntem iin 1.67 mg mL1 olarak bulunmutur.

Dharuman ve di., (25) Raloksifen HCln farmastik preparattan ve bulk

rneklerden spektrofotometrik yntemle analizi iin iki yntem gelitirmilerdir.

Metod A ilacn FeCl3-demirsiyanad ile oksidasyonuna dayanr. Metod B ise fehling

zeltisi ile indirgenmesine dayanr. Gelitirilen yntem hem metot A hem de B iin

tablete uygulanmtr.

2.4. Spektroskopik Yntemler

Spektroskopi, eitli tipte nlarn madde ile etkileimini inceleyen bilim

daldr. Spektrokimyasal yntemler, organik ve inorganik bileiklerin nicel ve nitel

analizlerinde yaygn kullanmlarnn yan sra, molekl yaplarnn aydnlatlmasnda

da en sk bavurulan aralardr.

Spektroskopi, bir rnekteki atom, molekl veya iyonlarn, bir enerji

dzeyinden dierine geileri srasnda absorplanan ya da yaylan nn llmesi ve

10

10

yorumlanmasdr. Her atom, molekl veya iyonun n ile kendine zg ilikisi vardr

ve bunlarn dnme, titreim ve elektronik enerjilerindeki deiiklikler

spektroskopinin temelini oluturur.

Ik; atom ve molekller tarafndan absorbe edilebilir. Absorbe edilen enerji

kuantldr ve elektronlarn dk enerjili orbitallerden (temel hal) daha yksek

enerjili orbitallere (uyarlm hal) gemesine neden olur. Ama her enerji absorbe

edilemez; ancak iki enerji seviyesi arasndaki farka eit bir enerji absorbe edilebilir.

Molekler absorpsiyon spektroskopi b cm n yoluna sahip geirgen bir

kapta bulunan bir zeltinin geirgenliinin (T) veya absorbansnn (A) lmne

dayanr. Absorbans, absorpsiyon yapan analitin deriimi ile eitlikte belirtildii gibi

dorusal olarak deiir.

2.1

Verilen eitlik Beer yasasnn matematiksel gsterimidir. Eitlikte, n gc

(P, P0), molar absorptive (), absorpsiyon yapan numunenin deriimi (C, mol L-1

) ile

gsterilmitir.

Bu bantya gre A deeri Cye kar grafie geirilirse, eimi .b olan bir

doru elde edilir. Bylece n absorbe edilen ksm okunur ve 2.1 eitlii

kullanlarak analitin bilinmeyen deriimi bulunur (44).

2.5. Kromatografik Yntemler

Kromatografi, karmlarn ayrlmasnda kullanlan en nemli tekniklerden

biri olup, nitel ve nicel analize olanak salamaktadr. ok geni ve verimli bir alan

olan kromatografinin temeli, Rus bilim adam botaniki Michael Tswett tarafndan

atlmtr. Tswett yeil yapraklardan elde ettii zeltiyi toz haldeki kalsiyum

karbonat doldurulmu cam bir kolondan geirerek, zeltide bulunan klorofil,

ksantofil gibi renkli maddeleri kolonda ayrmay baarmtr. Sonuta elde ettii

renkli tabakalardan esinlenerek yapt ayrmaya kromatografi adn vermitir (44).

Genel olarak, ayrma ilemiyle bir madde, bulunduu ortamdan nicel olarak

baka bir ortama alnr. Maddenin nicel olarak alnmasnn yan sra maddenin saf

11

11

olarak da alnmas nemlidir. Bu koullar salayan ayrmalara seici ve spesifik

ayrma denir. Kromatografik yntemler seici ve spesifik ayrmay salar (45).

Kromatografi ilemi, bir karmdaki maddelerin biri sabit dieri hareketli faz

arasnda dalmas esasna dayanr. Devaml olarak temasta olan bu iki faz birbirleri

ile karmaz. Sabit faz, ya porz bir kat madde ya da kat bir destek maddesine

emdirilmi bir sv, hareketli faz ise sv, gaz veya sperkritik bir akkan olabilir.

Kromatografi sisteminde maddelerin hareketini salayan, bunlar srkleyen

hareketli fazdr. Hareketli faz bir kolon iinde, ya normal yerekimi kuvvetiyle veya

basnla kolondaki sabit faz iinden geirilir. Bu esnada hareketli fazda znm

halde bulunan maddelerle, sabit faz arasnda fiziksel ve kimyasal ekim kuvvetleri

devreye girer. Bu ekim kuvvetleri her madde iin ayrdr. Sabit faz tarafndan daha

fazla adsorbe edilen veya daha fazla zlen maddeler sistem ierisinde daha yava

ilerlerken, sabit fazda daha az znen maddeler daha hzl hareket ederler.

Kromatografi ilemi srasnda, madde molekllerinin, fazlardan biri ile

kovalent balanma durumu sz konusu deildir. Karmdaki bileenler, fazlardan

birinde daha uzun sre kalacak ekilde iki faz arasnda birok kez gei yaparlar (44,

45).

Kromatografide hareketli sv faz olarak, su dahil btn organik zcler ve

bu zclerin eitli oranlardaki karmlar kullanlabilir. Ayn zamanda gaz ve

sperkritik zcler de hareketli faz olarak kullanlabilir.

eitli kromatografik tekniklerde en ok kullanlan sabit fazlar; silika,

almina, kmr, florisil (magnezyum-silika karm), kalsiyum karbonat ve

kalsiyum oksit, magnezyum karbonat ve magnezyum oksit, kizelgurlar, diatome

topraklar, poliamitler, niasta, toz eker ve talkdr (44).

Kromatografi ileminden eitli amalar iin yararlanlmaktadr. Kimya,

biyokimya ve biyoloji alanndaki almalarda, organik ve anorganik karmlarn

ayrlmas, maddelerin nitel analizi ile saf olup olmadnn kontrol veya

saflatrlmas, ila endstrisinde hammadde ve imalat safhalar rnleri ile ilalarn

stabilite kontrol ilemlerinde kromatografi yaygn bir ekilde kullanlmaktadr (44,

45).

12

12

2.5.1. Kromatografinin Dayand Temel Parametreler

Alkonma (Retensiyon) Zaman

ekil 2.2de tek bir analit ieren numune iin tipik bir kromatogram

verilmitir. Numune enjeksiyonundan sonra gelen ilk pik iin, pik sresi l zaman

olarak adlandrlr ve tm ile gsterilir. l zaman, hareketli fazn ortalama g hzn

verir ve analit piklerinin tannmasnda nemli rol oynar. Numune iinde veya

hareketli fazda ou zaman kolonda tutulmayan bir tr olabilir. Yoksa bile dier

piklerin tannmasna yardmc olmak iin byle bir tr ortama katlabilir. ekilde sa

taraftaki pik bir analit trne aittir. Numunenin enjeksiyonu ile bu pikin dedektre

ulamas iin geen sreye alkonma (tutulma) zaman denir ve tR simgesiyle

gsterilir. Analitin kolon ierisinde hareketi esnasnda ortalama g hz V;

V= L / tR (2.2)

olarak verilir; L kolon dolgusunun uzunluudur. Benzer ekilde hareketli faz

molekllerinin ortalama dorusal hz , yle verilir;

= L / tm (2.3)

13

13

ekil 2.2. Tek bileenli bir numune iin tipik bir kromatogram

Analitin G Hz, Kapasite Faktr

Kapasite faktr, k, znen maddelerin kolonda g hzlarn tanmlamakta

yaygn olarak kullanlan nemli bir parametredir.

k = (tR tm) tm (2.4)

tR ve tm deerleri kromatogramlardan kolayca bulunur. Bir znen madde iin

kapasite faktr birden ok kk ise, ayrlma hzl gerekleir ve alkonma

zamannn doru olarak belirlenmesi zor olur. te yandan kapasite faktr 20-30 gibi

bir saydan daha byk olursa ayrlma zaman fazla uzun olur. deal bir ayrma da

kapasite faktr deerinin 1 ile 5 arasnda olmas gerekmektedir. Kapasite faktr

hareketli faz ve sabit faz bileimlerinin deitirilmesiyle ayarlanabilir. Her maddenin

kendine zg bir kapasite faktr deeri vardr.

Seicilik Faktr

Bir karmdaki analitlerin kapasite faktrlerinin oran seicilik veya ayrm

faktr olarak adlandrlr. Bir kolondaki analitlerin seicilik katsays; bir kolonun

14

14

sz konusu maddeleri ne kadar iyi ayracann bir lsdr. Bir karmda bulunan

A ve B maddeleri bir kolonda ayrlmaya allsn. Bu sistem iin seicilik faktr ,

u ekilde tanmlanr;

= KB / KA (2.5)

KA = Daha az kuvvetle tutunan veya daha hzl olarak kolondan elue edilen A

maddesi iin dalma katsays, KB = Daha kuvvetli tutunan B maddesi iin dalma

katsaysdr. Bu eitlik ile daima 1den byktr. Deneysel olarak bir

kromatogramdan y belirlemek iin aadaki eitlik kullanlmaktadr.

= [(tR)B - tm ] / [(tR)A- tm ] (2.6)

(tR)B = Kolonda daha kuvvetli tutunan bileiin alkonma zaman

(tR)A= Kolonda daha az kuvvetli tutunan bileiin alkonma zaman

Kolon Etkinlii (Verimlilii)

Baarl bir kromatografinin amac verimli bir ayrma ve dar bir

kromatografik bant elde etmektir. Kromatografik kolon etkinliinin nicel lmnde

birbiriyle bantl iki terim ska kullanlr:

1. Edeer teorik tabaka ykseklii, H, (Plate Height)

2. Teorik tabaka says, N, (Number of Theoretical Plate)

Bu iki terim arasndaki bant aadaki eitlikle verilir;

N= L / H (2.7)

Bir kolonda tabaka yksekliinin azalmas ve teorik tabaka saysnn

artmasyla kolon etkinlii artar. Hareketli ve sabit fazlarn bileimi, kolon dolgu

maddesinin tanecik bykl ve kolon apna bal olarak kolonun tipi kolon

verimliliini etkilemektedir. Kolon dolgu maddesinin tanecik ap kldke kolon

15

15

tabaka says artmakta bu da kolon verimliliini artrmaktadr. Martin ve Synge

kromatografik bir kolonun birok ayr fakat bitiik dar tabakalardan meydana

geldiini dnerek teorik bir almayla tabaka ykseklii ve teorik tabaka says

terimlerinin ortaya kna nclk etmilerdir. Her tabakada maddenin hareketli ve

sabit faz arasnda kurduu dengenin, yeniden meydana geldii kabul edilmitir.

Analitin kolon ierisinde hareketi, dengedeki hareketli fazn bir tabakadan dierine

geii olarak kabul edilmitir. Teorik tabaka says u ekilde hesaplanr;

veya

(2.8)

W : Pik taban genilii

W1/2 : Pik taban geniliinin yars

Teorik tabaka says N ve tabaka ykseklii H, kaynaklarda ve kromatografik

cihaz reticileri tarafndan, kolon performansnn bir lm olarak kullanlr.

Kromatografik kolon davranlarna matematiksel yaklam 1956 ylnda

Hollandal aratrmac Van Deemter tarafndan gelitirilmitir. Bu eitlik etkinlii

ortalama hareketli faz dorusal hznn () bir fonksiyonu olarak aklar (ekil 2.3).

Klasik Van Deemter eitlii Eitlik 2.9da tanmland gibidir.

H= A + B / + C (2.9)

H: Edeer teorik tabaka ykseklii

A: Eddy difzyon katsays

B: Boyuna difzyon katsays

C: Ktle transfer katsays

: Tayc gazn dorusal ak hz

16

16

ekil 2.3. Van Deemter erisi

A (Eddy difzyon katsays); molekl veya iyonlar dolgulu kolonda ilerlerken

farkl uzunluktaki yollar izlerler. Bu nedenle, ayn molekln farkl kolonda kal

sresi farkl olur. Kolon dolgusunun homojen olmas, bu etkiyi azaltr. Dolgu

kolonlarda bu terim geerlidir, klcal kolonlarda etkin deildir.

B (Boyuna difzyon katsays); molekller deriik blgelerden, seyreltik

blgelere g etme eilimindedirler. Bu g; hem ak ynnde, hem de zt ynde

olabilir. Pik geniliine etki eden, hareketli fazdaki difzyondur. Hareketli faz gaz

ise bu etki daha fazladr. Tayc gaz ak hz arttrlarak, bu etki en aza indirilebilir.

C (Ktle transfer katsays); maddenin sabit ve hareketli faza transfer hz,

kromatografi kolonunun etkinlii zerinde rol oynar. Ktle transferi terimi, sabit

fazda hareketli faz ak hznn artmas ile artar (44-46).

Ayrclk

Kromatografide asl ama, karm iindeki maddelerin birbirinden

ayrlmasdr. Ayrclk (Rs), bu hedefe ne derece yaklaldnn bir lsdr.

Temel olarak, kolonun iki analiti birbirinden ayrabilme yeteneinin nicel lsdr

ve eitlik 2.10 ile ifade edilir.

17

17

(2.10)

(tR)B, (tR)A : B ve A nn alkonma zamanlar

WA, WB : A ve B iin zemin pik genilikleri

Rs = 1.5 olmas halinde iki pik birbirinden tamamen ayrlm saylr. Nicel

analizler iin pikler arasndaki ayrcln 1.5den byk (Rs 1.5) olmas

nerilmektedir. Eitlik 2.11a gre ayrcl etkileyen faktr; seicilik (), tabaka

says (N) ve kapasite faktr (k)dr.

(2.11)

Eitlik 2.11e gre, seicilik arttka ayrcln da artmas beklenmektedir.

Seiciliin 1 olduu durumda iki madde arasnda ayrm gereklemez. Bu nedenle

kromatografik bir ayrmn olabilmesi iin seiciliin 1den byk olmas

gerekmektedir.

Kapasite faktrnn (k) = 0 olduu durumda ayrm yoktur, ayrca k deeri

arttka k/(k+1) 1e yaklar ve kapasite faktrndeki artn ayrcla etkisi

kalmaz. k deerini daha fazla arttrmak yalnzca alkonma zamann arttrr.

Optimum k deerleri 1-10 arasnda olmaldr.

Kolon Etkinliinin Optimizasyonu

Kromatografik almalarda deney koullar, bir karmn bileenlerini en

ksa srede net bir ekilde ayracak biimde optimize edilerek belirlenir.

Optimizasyon deneyleri: 1. Bant genilemesini azaltmak, 2. Bileiin bal g hzn

deitirmek amacyla yaplr.

Bant genilemesi ve dolaysyla kolon verimliliinin kayb, znen

bileenlerin kolon ierisinde gleri srasnda yer alan ok sayda ktle-aktarm

ilemlerinin belli hzlara sahip oluunun bir sonucudur. Bu hzlar etkileyen baz

deikenler denetlenebilir ve ayrmalar iyiletirmek iin kullanlabilir.

18

18

stenilen ayrmay salamak iin optimum koullar aratrlrken , k ve N

(veya H) gibi temel parametrelerin az ya da ok birbirinden bamsz olarak

ayarlanabilecei unutulmamaldr. Bylece ve k, en kolay scaklk ve hareketli

fazn ak hzndaki oynamalar ya da deiik bir kolon dolgusu kullanlarak

deitirilebilir. Herhangi bir almada, teorik tabaka says, kolon boyu, tabaka

ykseklii, hareketli fazn ak hz, dolgu maddesi tane bykl, hareketli fazn

viskozitesi ve sabit faz oluturan absorbe edilmi sv filmin kalnl gibi

parametreler deitirilerek iyi bir ayrm gerekletirilebilir.

2.5.2. Kromatografinin Snflandrlmas

1-Ayrlma mekanizmalarna gre

Adsorpsiyon kromatografisi

Dalma (partisyon) kromatografisi

yon deitirme kromatografisi

Jel Filtrasyon (molekler eleme) kromatografisi

yon ifti kromatografisi

Afinite kromatografisi

2- Uygulama biimine gre

Dzlemsel kromatografi

o Kat kromatografisi

o nce tabaka kromatografisi (TLC)

Kolon kromatografisi

o Yksek basnl sv kromatografisi

o Sper kritik akkan kromatografisi

o Gaz kromatografisi

3-Faz tiplerine gre

Sv kromatografisi

o Sv - kat kromatografisi

o Sv - sv kromatografisi

Gaz kromatografisi

o Gaz - kat kromatografisi

19

19

o Gaz - sv kromatografisi

2.5.2.1. Ayrlma Mekanizmalarna Gre Snflandrma

Adsorpsiyon Kromatografisi:

Hareketli faz, porz bir kat veya ok ince bir toz olan sabit fazn zerinden

geer. Ayrlacak maddelerin yrme hz, sabit faza kar ilgilerine yani adsorbe

edilme derecelerine baldr. Madde sabit faz tarafndan ne kadar kuvvetli adsorbe

ediliyorsa o kadar yava ilerler. Adsorpsiyon kromatografisi, kolay olmas yannda

etkili bir ayrma yntemidir. Bu yntemle izomerler, hidrokarbonlar, rasemler,

hormonlar ve antibiyotikler kolaylkla ayrlabilir.

Adsorpsiyon kromatografisi ynteminin dezavantajlar da vardr. Bunlar,

sabit fazn ayrlmas beklenen maddeleri paralamas ve aranan maddeler yerine

baka maddelerin bulunmas, sabit fazn ayrlan maddelerle kimyasal reaksiyon

vermesi ve uygun sabit faz ve zc bulunabilmesi iin bazen ok zaman

harcanmasdr (44,45).

Dalma Kromatografisi:

Sabit faz inert ve kat bir destek maddesi zerine kaplanm bir svdr. Sv

veya gaz olabilen hareketli faz, sabit faz ile kapl destek maddesinin zerinden geer.

Maddelerin, bu sistemdeki yrme hzlar, iki sv faz arasndaki bal

znrlklerine yani dalma katsaylarna baldr. Sabit fazda daha ok

znenler daha yava ilerlerken, hareketli fazda daha ok znenler daha hzl

ilerler.

yon Deitirme Kromatografisi:

Bu yntem, kat bir maddenin, yapsnda bulunan iyonlar, temasta bulunduu

zelti iindeki baka iyonlarla bir dengeye gre deitirmesi zelliine dayanr. Bu

amala kullanlan kat maddeler, zelti ortamnda hi znmeyen byk molekll

doal ve yapma maddelerdir. Bunlar inorganik ve organik diye ikiye ayrlr.

norganik olanlar yaklak bir asrdr kullanlan killer ve zeolitlerdir. Organik olanlar

1937den beri kullanlmaktadr. Hem inorganik hem de organik iyon deitiricilerde

20

20

temasta bulunduklar zeltideki iyonlarla deitirilebilecek pek ok sayda iyon

bulunur.

Sulu zeltide, ykl iyonlar ile iyon deitirici reine temas ettiklerinde,

iyon deitiricinin fonksiyonel gruplarnn ykleri ile iyonlarn ykleri arasnda bir

etkileme oluur. Sulu zeltideki iyonlar, sabit fazdaki ayn ykl iyonlarla yer

deitirerek, kolona balanrlar. Balanmayan iyonlar ise kolondan en nce karlar.

Bu yntemde reine tanecikleri sabit faz, geirilen zc ise hareketli faz

oluturmaktadr (44,45).

Jel Filtrasyon (Molekler Eleme) Kromatografisi:

Bu yntemde, maddeler molekl byklklerindeki farklla gre ayrlrlar.

As yapl polimer materyalde, maddeler molekl byklklerine bal olarak, as

yapya girme derecelerine gre birbirinden ayrlrlar. Kk molekller tanecikler

arasndaki boluklara girebildiklerinden ilerlemeleri gecikirken, byk molekller bu

boluklara giremez ve kolayca ilerlerler.

yon ifti Kromatografisi

Bu yntem, zellikle iyonlaabilen asidik veya bazik maddelerin

ayrlmasnda kullanlr. Hareketli faza ilave edilen iyon ifti reaktifi sabit faz

tarafndan adsorplanr ve iyonize olmu maddeler bu iyon iftleri ile iyonik

etkileime girerek birbirinden ayrlr (44, 45).

Afinite Kromatografisi:

Enzim, hormon vb. spesifik proteinlerin saflatrlmasnda kullanlr.

Kolonunun dolgu maddesine, (dekstran, poliakrilamid, selloz vb) spesifik protein

ile kompleks yapabilen bir ligand balanr. Ligand ile kompleks yapan spesifik

protein, kat destee balanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terk

ederler. Daha sonra, bal protein pH deiiklii veya ligand ilavesiyle kolondan ele

edilir.

21

21

2.5.2.2. Uygulama Biimine Gre Snflandrma

Dzlemsel Kromatografi

Kat Kromatografisi:

Bu yntemde zel retilmi kat (selloz) destek ve gzeneklerine yerleen

su ise sabit sv faz oluturur. Hareketli faz, bir yrtme tank ierisine

yerletirilmi uygun zcdr. Kat zerine uygulanan karm, bir yrtme tank

ierisinde, su ieren hareketli faz, kadn rnek uygulanan kenarndan kar kenarna

ulaana kadar beklenerek ayrlr. zc, kat zerinde kapiler etki ile ilerlerken

karmdaki maddeler zelliklerine gre ayrlma gsterir (44).

nce Tabaka Kromatografisi:

Bu yntemde, kromatografi ilemi cam, alminyum veya plastik bir yzey

zerine kaplanm bir adsorban tabakasnda gerekleir. Yrtme tankndaki

hareketli faz, adsorban tabakas zerinde aadan yukarya doru ilerler (45).

Adsorblayc tabaka seiminde ayrlmas beklenen maddelerin asidik veya bazik

karakterli olmas dikkate alnr. Genellikle asidik karakterli maddeler iin asidik

adsorblayclar (silikajel), bazik karakterli maddeler iin de, bazik adsorblayclar

(aluminyum oksit, talk gibi) tercih edilir (44).

yi bir adsorblaycda aranan balca zellikler yle sralanabilir;

Olduka ok miktarda madde adsorplayabilmeli,

zerinde adsorbe olmu madde baka zcler kullanlarak kolaylkla

geriye alnabilmeli,

Ayrlacak maddelerle ve zclerle kimyasal reaksiyona girmemeli,

Renklendirme ayralaryla reaksiyona girmemeli,

Yaps zcnn rahatlkla gemesine elverili olmal.

22

22

Kolon Kromatografisi

Yksek Performansl Sv Kromatografisi:

Yksek performansl sv kromatografisi, scakla hassas olan maddelere de

uygulanabilmesi nedeniyle yaygn olarak kullanlan yntemlerdendir. Ayrlacak

karm, sisteme bir enjektr yardmyla verilir ve sv hareketli faz ile kolondan

basn altnda geirilir. Numune bileenleri sabit veya hareketli faza olan ilgilerine

gre ayr ayr bandlara ayrlr. Bu bandlar kolon boyunca ilerler ve dedektrden

geer. Dedektr bir kaydediciye baldr ve kolondan kan her bileen, pikler

halinde kaydedilir. Piklerin k zaman alkonma zaman olarak tanmlanr.

Yntemin uygulanabildii balca bileikler ise nkleik asitler, terpenoitler,

pestisitler, antibiyotikler, steroitler, proteinler, aminoasitler, ilalar, hidrokarbonlar,

karbonhidratlar, metal organik bileikleri vb. dir.

Sperkritik Akkan Kromatografisi:

Sperkritik akkan kromatografi (SFC), gaz ve sv kromatografilerinin bir

hibridi saylr ve her iki yntemin stnlklerini birletirmektedir. SFC, geleneksel

sv ve gaz kromatografi yntemleri ile tayini mmkn olmayan bir grup bileiin

tayinini mmkn kld iin nemlidir. Bu bileikler arasnda uucu olmayan veya

gaz kromatografisi artlarnda termal bozunmaya urayan bileikler ve sv

kromatografide kullanlan spektroskopik veya elektrokimyasal dedektrlerle

belirlenmelerini mmkn klacak fonksiyonel gruplara sahip olmayan bileikler

saylabilir.

2.5.3. Gaz Kromatografisi (GC)

Gaz kromatografisinde, numune buharlatrlarak kolonun giriine enjekte

edilir. nert bir hareketli gaz faz ile elsyon yaplr. Dier kromatografik yntemlerin

aksine gaz faz analitin moleklleri ile etkilemez; gazn tek ilevi, analiti kolon

boyunca tamaktr (44-46) (ekil 2.4).

Gaz kromatografisi iki ekilde uygulanmaktadr;

Gaz-kat kromatografisi (GSC)

Gaz-sv kromatografisi (GLC)

23

23

ekil 2.4. Gaz kromatografi sistemi

2.5.3.1. Gaz-Kat Kromatografisi (GSC)

Kat sabit faz zerinde fiziksel adsorpsiyon sonucu analitlerin alkonmasn

temel alr. Gaz-kat kromatografisi iki nedenle snrl uygulama alan bulur bunlar;

polar molekllerin kalc denebilecek lde alkonma problemi ve adsorpsiyon

olaynn dorusal olmay nedeniyle kuyruklanmann ar oranda meydana

gelmesidir. Bu nedenlerle yntem kk mol ktleli molekllerin ayrlmasnn

dnda fazla bir uygulama alan bulamamtr.

2.5.3.2. Gaz-Sv Kromatografisi (GLC)

Analitin gaz halindeki hareketli faz ile bir katnn yzeyine tutturulmu sabit

sv faz arasnda dalm zerine kurulmutur (44).

24

24

Gaz Kromatografisi Sisteminin Ksmlar:

Tayc Gaz:

nert olmas gereken tayc gaz; genelde helyum, hidrojen ya da azottur.

ekil 2.5 incelendiinde, minimum teorik tabaka yksekliinde, en yksek

verimlilii N2 gaznn verdii; fakat N2 gaznn dorusal hznn artmasyla verimin

dt grlmektedir (46). H2 gaz geni dorusal hz aralna sahip olmakla

birlikte patlayc zellie sahip olmas nedeniyle pek kullanlmaz. N2ye gre daha

iyi hz aralna sahip olan He gaznn kullanm daha fazladr.

ekil 2.5. GCde kullanlan tayc gazlara ait Van Deemter grafikleri

Gaz seimi genelde kullanlan dedektr tipine baldr. Tayc tpne bal

elektronik basn kontrol (EPC) sistemleri, gstergeler ve ak sayalar bulunur.

Bunlara ek olarak, su ya da dier safszlklar gidermek iin gaz sisteminde ou

zaman molekler elek bulunur.

Ak hz kontrol, normal olarak gaz silindirine bal iki basamakl basn

reglatrleri ve kromatografiye bal ak reglatrleri ile yaplr. Genel olarak giri

basncnn sabit kalmas halinde ak hznn deimeyecei varsaylr. Modern ticari

kromatografiler ak hzn istenilen deerlere ayarlayabilen ve kontrol eden

elektronik cihazlarla donatlmtr.

25

25

Numune Enjeksiyon Sistemi:

Kolon verimi, numunenin uygun miktarda ve buhar halinde bir defada

verilmesini gerektirir. Yava enjeksiyon veya daha fazla miktarda numune verilmesi,

pik genilemesine ve dk ayrma gcne neden olur. Sv veya gaz numune

enjeksiyonunda, yaygn olarak kullanlan yntemlerden biri szdrmaz enjektrle

manuel enjeksiyondur. Enjeksiyon bir silikon lastik diyaframdan ya da bir septumdan

yaplr. Septumun hemen arkasnda kolon giri ucunda hzl buharlatrc bir blme

bulunur. Normal analitik amalar iin enjeksiyon hacmi 0,1-20 L arasnda olabilir.

Klcal kolonlarda daha kk hacimlerde (10-3 L) enjeksiyon yaplr. Bunun iin

kolon giriine bir blc yerletirilir. Blc, enjekte edilen numunenin bir ksmn

kolona verirken, kalan ksm da dar atar. Nicel analizlerde daha tekrarlanabilir

miktarlarda gaz veya sv numunelerinin cihaza verilebilmesi iin dner numune

vanalar kullanlr. Bu vanalarla, numune enjeksiyonundan kaynaklanan bal hatalar

%0.5-%2 civarna drlebilir. Ancak gnmzde otomatik enjeksiyon sistemleri

kullanlarak, enjeksiyondan kaynaklanan hatalar en aza indirilmitir. Numune

istenilen hacimde ve ok hzl verilir (44).

Kolonlar:

Enjeksiyonla verdiimiz bileenlerin birbirinden ayrld, nicel ve nitel

analizin yapld blmdr. Dolgulu ve klcal kolon olmak zere iki tip gaz

kromatografisi kolonu bulunmaktadr (ekil 2.6). Dolgulu kolonlar cam veya

metalden yaplm, i aplar 2-4 mm, uzunluklar 2-3 m olan kolonlardr. Bu

kolonlar ince bir sabit sv faz ile kaplanm, homojen ve ince taneli bir kat ile iyice

doldurulur. Teorik tabaka says klcal kolonlardan azdr. Klcal kolonlarda ise dolgu

materyali yerine sv fazn kendisi veya destek maddesi ile birlikte kolon i

eperlerine balanmtr. aplar 0.1-0.5 mm, uzunluklar 10-100 mdir. Klcal

kolonlarn kullanlmas ile dolgulu kolonlarn nemi azalmtr.

Eritilmi silika klcal kolonlarn gelitirilmesi ve ok eitli materyallerle i

eperlerinin kaplanabilmesi nedeniyle klcal kolonlarn kullanmlar hzla

artmaktadr. Bu kolonlarda sabit faz kolon duvarna mikrometrenin onda biri kadar

ince kalnlkta kaplanm sv filminden olumaktadr (46, 47).

26

26

Klcal kolonlar, trldr (ekil 2.6): Bunlar;

a) Duvar kapl ak borusal kolonlar (Wall-Coated Open Tubuler

Columns, WCOT): Sabit faz kat, viskoz sv veya zamk formunda polimerlerdir.

Klcal kolon eperine kaplanr. ap 0.005-0.53 mm, film kalnl 0.1-3 m'dir .

1979da WCOT kolonlar eritilmi silis ak borusal kolonlar (FSOT) olarak

adlandrlmtr. Bu kolonlar kuvars materyalinden yaplmtr. Daha esnektir ve

istenen ekil daha kolay verilebilir.

b). Porz yzeyli ak borusal kolonlar (Porous Layer Open Tubuler

Columns, PLOT): tabakas adsorban materyalle ile kapldr. Dezavantaj dk

etkinlie sahip olmas, tekrarlanabilir ve kararl olmamasdr.

c) Destek kapl ak borusal kolonlar (Support-Coated Open Tubuler

Columns, SCOT): Destek materyalle sv faz kaplanm ekilde klcal duvarna

yaptrlmtr. En nemli avantaj sabit faz kalnlnn daha geni aralkta

tutulabilmesidir.

27

27

ekil 2.6. WCOT, SCOT, PLOT, Dolgulu kolonlar

Gaz kromatografisi kolonlarnda 3 nemli zelliin bulunmas

gerekmektedir:

1. Sabit faz, olabildiince inert bir destek yzeyini tamamen kaplayan

tekdze kalnlktaki film tabakas ile oluturulmaldr.

2. Kolon film tabakasnn, yksek scaklklarda bozunma ve buharlamaya

kar ssal kararll olmaldr. Bu sabit faz molekllerini destek materyaline

kimyasal veya fiziksel olarak balayarak polimere benzeyen bir film tabakas

oluturarak gerekletirilir.

28

28

3. Geri dnmsz olarak numune bileenlerinin adsorpsiyonuna neden olan

ve metalik elementleri, zgn bileenlerin bozunmas iin katalitik ksmlar olarak

rol oynayan aktif blgelerin olmamas gerekmektedir.

Eer kolon, scaklk snrlarnn zerinde uzun sre kalrsa ve WCOT

kolonlarda kolon duvarlarnda yumuak, tekdze bir sv kaplamas baarlamazsa

aktif blgeler ortaya kacaktr. Polar ve apolar sabit faza sahip olan WCOT kolonlar

yksek verimlilie sahiptir.

Kolonlar saklanrken sv faza difze olabilecek oksijen veya dier kirlilikleri

engellemek iin ular uygun bir ekilde kapatlmaldr.

Dedektrler :

Gaz kromatografide kullanlan ideal dedektrler aadaki zelliklerde

olmaldr:

- Yeterli duyarllk nicel olarak tanmlanamaz. Genel olarak bugnn

dedektrlerinin duyarlklar 10-8-10-15 g madde s-1 arasnda deimektedir.

- yi bir kararllk ve tekrarlanabilirlik, geni bir dorusal alma aral,

400C ye kadar varan scaklk aral olmas istenir.

- Numuneyi paralamamaldr.

- Her trden analite benzer cevap alnmal veya belirli snf maddelere kar

tahmini kolay ve seici cevap verme zellii olmaldr.

Gaz Kromatografisinde kullanlan balca dedektrler unlardr:

Termal iletkenlik dedektr

Elektron yakalama dedektr

Alev iyonlama dedektr

Alev fotometri dedektr

Azot fosfor dedektr

Fotoiyonizasyon dedektr

Ktle seici detektr

29

29

Gelitirilen yntemde gaz kromatografisi sisteminde dedektr olarak ktle

seici dedektr kullanlmtr.

Ktle Seici Dedektr (MSD):

Ktle spektrometrisi gibi zel olarak retilen sistemler, gaz kromatografisiyle

birlikte dedektr olarak kullanlmaktadr. Ktle dedektr, gaz kromatografisinden

gelen rnekleri gaz halinde ykl ve hareketli iyonlarna dntrerek, bunlar

ktle/yk oranlarna gre ayrr ve elde edilen spektrum maddenin tehis ve tayinini

salar. Burada ykl bir paracn ktlesi m, yk de zdir. Bir maddeden m/z

oranlar birbirinden farkl birok parack meydana gelebilir. Cihaz, m/z deerleri

ayn olan tanecik demetleri iin birer pik izer. Oluan iyonlar paralanarak

paralanma rnlerini olutururlar. Paralanma rnleri ktle seici analizrden

geerken m/z oranlarna gre ayrlr, oaltlr, saylrlar ve bylece ilgili maddeye

ait ktle spektrumu oluturulur. Ktle spektrumlar, bal okluk ve m/z deerleri

arasnda izilen grafiklerdir. Ksmen basit bileiklerin spektrumlarnda bile, farkl

ykseklikte ok sayda pik grlr. Piklerin says; bileiin yapsna, iyonlama

potansiyeline ve kullanlan cihazn yapsna baldr (46).

2.6. Gaz Kromatografisi-Ktle Spektrometrisi (GC-MS)

Gaz kromatografisi ou zaman seici spektroskopik ve elektrokimyasal

tekniklerle balantl olarak kullanlr. Bylece kombine yntemler ad verilen bu

sistemler, kompleks karmlarn analizinde gl bir ara olarak tercih edilir (46).

Ktle spektrometresi uzun yllardan beri kullanlmakta olup ktle spektrumu

ilk kez 1898de Wien tarafndan elde edilmitir. 1905de ise Thompson kararl

izotoplarn bulunduunu gstermek iin yapm olduu deneyde farkl pozitif

iyonlarn ktle/yk (m/z) oranna gre farkl parabolik yrnge kat ettiini

gstermitir. Ktle spektrometresi, 1957 ylnda Holmes ve Morrel tarafndan, gaz

kromatografisi ile birletirilmitir. Ktle spektrometresinin gaz kromatografisi

dedektr olarak kullanlmasnn nedeni toplanacak bilgilerin okluudur. Btn

organik bileik snflarna ve tm organik bileiklerde ortak bir fiziksel zellik olan

ktleye cevap verebilmesi en byk zelliidir.

30

30

Ktle spektrometrisinde gaz fazndaki numune, yksek enerjili elektronlarla

arptktan sonra elektronlarn kaybederek pozitif veya negatif ykl eitli iyonlar

haline dnmektedir. Hzlandrlan bu iyonlar manyetik ve/veya elektrik alannda

saptrlmaktadr. yonlarn sapmas; ktlelerine, yklerine ve hzlarna baldr. Eer

yk, hz ve saptrc g sabit ise, sapma ar paracklarda az ve hafif paracklarda

ok olacaktr.

Ktle spektrometresi, evrensel, ktle baml ve ykc (paralayan) bir

dedektrdr. Ktle spektrometresi, tek bir cihaz olarak kullanld gibi, gaz ve

yksek basnl sv kromatografisi (HPLC) cihazlarna bal olarak da

kullanlmaktadr. Her numune iin sinyal verir. Numunenin deriiminden

bamszdr (46).

Ktle spektrometresi u ksmlardan oluur (ekil 2.7);

1. Ara balant

2. yon kayna

3. Ktle analizr

4. Dedektr

5. Vakum Sistemleri

ekil 2.7. Kuadropol GC-MS sisteminin ematik gsterilii

31

31

2.6.1. GC-MS Ara Balantlar

Gaz kromatografisi ile ktle spektrometresi arasndaki basn farkndan

dolay ara balantya gerek vardr. Gaz kromatografisi atmosfer basncnda, ktle

spektrometresi ise ok dk basnta (10-5-10-9 torr) almaktadr. Ktle

spektrometresindeki vakum koullarnn bozulmasn engellemek iin gaz

kromatografisinden gelen eluattan tayc gazn uzaklatrlmasn ve bileenlerin

ktle spektrometresi iyon kaynana iletilmesini salamak iin ara balant kullanlr.

Kullanlan ara balantlar unlardr;

a) Effusif ara balant: Bu balantnn alma prensibi tayc gaz ile

numunenin ktle farkllndan dolay ayrlmasna dayanr. Gaz kromatografisi

aknts vakum iine yerletirilmi porz cam tpn iine doru olur. Daha ok

dolgulu kolonlarda kullanlr.

b) Jet ayrclkl ara balant: Temeli numune ve tayc gazn gaz

kromatografisinden kp kk jet aklna doru gemesine dayanr. Geite

molekln hz artar ve iki aklktan geerek iyon kaynana gelir. Hafif tayc

gazlar vakum alannda dar pompalanr. Numunelerin inertlii iin jet ara balant

camdan yaplmtr ve geni aralktaki numune tiplerine uygundur. Hem dolgulu hem

de WCOT kolon ile kullanlabilir.

c) Geirgen zarl ara balant: Tayc gaz ve numunenin silikon zar

yzeyinden, zarn dier tarafnda bulunan iyon kayna vakum odasna doru

geiini salar. Organik molekller zar yzeyinde znr ve ktle

spektrometresinin vakum ksmna girer. Organik olmayan tayc gaz molekl

zlemez ve dar atlr. Dolgulu kolon kullanlan gaz kromatografisi cihaz

genelde organik madde analizlerinde tercih edilir.

d) Dorudan blmeli ara balant: Ak, ara balantda blnerek ktle

spektrometresinin pompalama kapasitesine uygun olmas salanr. Kolon sonunda

blnen ksm atmosfere atlr. Nicel analiz iin uygun deildir.

e) Ak blmeli ara balant: Kolon ucu ktle spektrometresine gaz

ayarlaycs ile balanr. Gaz ayarlayc ile istenen ak salanarak gazn fazlas dar

atlr. Klcal kolonlarla kullanlr.

32

32

f) Dorudan klcal kolon balantlar: 1-3 mL dak-1 gibi dk tayc gaz

ak hzlar sz konusu olduunda gerekli basn dmesi, ktle spektrometresinin

vakum sistemi ile salanabilir. Bu nedenle de dorudan bir ara balant kullanlabilir.

Bu durumda hem tayc gaz hem de numune, tayc gazn numune

molekllerinden daha byk hzda pompaland ktle spektrometresinin iyon

kaynana girerler. Yksek tayc gaz aklarndan dolay dolgulu kolona

uygulanmaz. almalarmzda bu sistem kullanlmtr.

2.6.2. yon Kayna

Molekllerin iyonlat blmdr. Bir molekl, atom veya iyondan bir

elektron uzaklamas olayna iyonlama denir. yonlatrma teknikleri; gaz, sv ve

kat gibi maddenin farkl fiziksel durumuna ve maddenin ssal kararllna bal

olarak seilir. Gazlar ve svlar iin elektron ve foton bombardmanl iyonlatrma;

katlar iin ise termal, lazer desorpsiyon, atom bombardman, elektrik boalm ve

alan desorpsiyon iyonlama uygundur. Gnmzde en ok kullanlan iyonlatrma

teknikleri elektron bombardman ile iyonizasyon ve kimyasal iyonizasyondur.

a) Elektron bombardman ile iyonizasyon (EI): EI ksaca analit

moleklnn enerjili elektronlarla bombardman edildii iyonlamadr (ekil 2.8).

ekil 2.8. Elektron bombardman ile iyonizasyon (EI)

33

33

Scak bir flamandan kan elektronlar blme boyunca odaklanr ve 70 eV'luk

bir potansiyele sahip bir elektrot tarafndan ekilir. Bylece her bir elektron 70

eV'luk bir enerji kazanr ve ortama giren numune ile arparak bir dizi paralanma

tepkimeleri oluur. Molekldeki balarn krlmas pozitif ve negatif iyonlarn

olumasn salar. ou organik molekl iin pozitif iyon oluumu enerji asndan

daha ok tercih edilir. Elektronun sahip olduu enerji balar krmak iin yeterli

enerjidir. 70 eV'luk enerjinin kullanlmas kararl, tekrarlanabilir ve molekle zg

ktle spektrum olumasn salar. Elektron bombardman ile oluan iyonlarn bal

byklkleri, iyonize edici elektronlarn enerjileri ve iyonizasyonun olutuu

scakla baldr. almamzda EI teknii kullanlmtr.

b) Kimyasal iyonlatrma (CI): Genellikle dz zincirli alkan, alken veya

alkoller gibi homolog bileikler EI ile kararl molekler iyonlara sahip pozitif

tanmlama yaplamayacak kadar kk bal bollua sahiptirler. CI'nn esas iyon-

molekl tepkimelerine dayanr. Yksek enerjili iyonlar arptklar molekle ya

proton aktarrlar ya da ondan hidrr ve elektron koparrlar. Kimyasal iyonlamal

ktle spektrometresinde (CI-MS), iyon kaynana reaktif gaz verilerek yksek basn

elde edilmektedir. Reaktif gaz numune moleklleri ile i etkileime girecek reaktif

iyonlarn oluturmak zere elektron demeti tarafndan iyonize edilmektedir.

Ortamdaki yksek basncn etkisiyle reaktif iyon ile numune i etkileime girer. EI'ya

gre enerji daha dktr.

2.6.3. Ktle Analizr

yon kaynandan kan iyonlama rnleri analizre ynlendirilir. Analizr,

m/z oranlarna gre maddelerin ayrmnn saland blmdr.

En ok kullanlan ktle analizrleri unlardr;

a) Manyetik sektrl ktle analizr: Manyetik sektr analizrlerinde

kalc mknatslar veya elektromknatslar kullanlr; bu mknatslar iyon kaynandan

gelen demete iyonlarn m/z oranlarna bal olarak 180, 90 veya 60 derecelik alarla

dairesel hareket yaptrrlar. Bu blgede i basn 10-7 torr civarndadr.

34

34

b) Uu zamanl ktle analizr: yonlar uu tp ad verilen tpn

iinden geerler ve bu srada hzlandrcnn etkisiyle eit momentuma sahip olurlar.

Bylece ktleleri birbirinden farkl olan iyonlarn hzlar da farkl olarak belirlenir.

c) Kuadropol ktle analizr: Kuadropol, eksenlere simetrik olarak

yerletirilmi, 4 adet zenginletirilmi altn ubuktan olumaktadr. Kuadropol ktle

analizrnn belirli bir ktle aralnda tarama yapmas ve ayrm iin radyo frekans

(RF) ve doru akm (DC) voltaj uygulanr. X eksenindeki ubuklara pozitif, y

eksenindeki ubuklara negatif gerilim uygulanarak iyonlaan rnek molekllerinin

ubuklar arasnda rezonansa gelmesi salanr. RF voltajnn bykl iyonlarn

ktlesini belirtir. DC voltajnn RF voltajna oran, ayrm belirtir.

Kuadropol ktle analizr, yksek duyarlla ve milisaniye aralklar ile hzl

tarama zelliine sahiptirler. Bu zellikler dar piklere sahip WCOT kolon taklm

gaz kromatografisi cihazlarna balamak iin ok uygundur ve altmz cihazda

kuadropol ktle analizr kullanlmtr. Kuadropol ktle analizr ematik olarak

ekil 2.9da gsterilmitir.

ekil 2.9. Kuadropol ktle analizr

Kuadropol analizrn en nemli zellii, tarama hznn byk olmas ve

taranan ktle aralnn magnetik sektrl ktle spektrometrelerine gre snrl

35

35

olmasdr. Kuadropol analizrnde, yksek ktlelerde bal okluk fazla deildir.

Filtre edilen ktlelerin farkl olabilmesi iin RF/DC oran sabit tutularak DC

potansiyeli deitirilir. Ktle taramas ya DC ve RF voltaj deitirilip oranlar sabit

tutularak ya da RF ve DC voltaj sabit tutulup frekans deitirilerek yaplmaktadr.

2.6.4. Dedektr

Ktle analizrlerinden geen iyonlar elektron oaltc dedektre ular.

Elektron oaltcda arpmadan dolay oluan akm, nce analog voltaja, sonra da

dijital sinyale dnr.

En ok kullanlan dedektrler dizi dinot elektron oaltc (ekil 2.10.a) ve

devaml dinot elektron oaltclardr (ekil 2.10.b). Bunlar sinyali 107 dzeyine

kadar artrabilirler. Bu da femtoamper gibi ok dk iyon akmlarnn

kaydedilmesini salar.

Ktle spektrometresinden milisaniye aralklarla gelen verilerin hzla

kaydedilmesi ve depolanmas gereklidir ki, bu bir bilgisayarla kolayca

salanabilmektedir. GC-MS sistemi, ara balant ve veri toplama basamaklarndaki

problemlerin zlmesinden sonra, daha yaygn kullanlmaya balanmtr.

Bunlardan baka aletin kalibrasyonun otomatik yaplp, sonularnn alnabilmesi,

analiz koullarnn kolayca girilmesi, aletin kontrolnn yaplp verilerin

alnabilmesi, analiz sonras veri deerlendirmelerinin yaplabilmesini bilgisayar

salamaktadr.

Ktle spektrometresi ile analizlerde 3 tip iyon tarama ekli vardr;

1. Toplam iyon taramas (TIC): Bir analiz srasnda ayrm yapmadan tm

iyonlarn istenilen atomik ktle birimlik (akb) aralnda taratlmas ile

gerekletirilir.

2. Seilmi iyon taramas (SIM): Aranlan bileik iin en karakteristik olan,

kararl ve bolluu fazla olan m/z deerleri seilip, taratlr. Seici iyon taramasnda

seilen iyonlarn tarama sresi (dwell time) analizci tarafndan seilir.

3. Tek iyon taramas: Tek iyon taratlr. ok hassastr, ancak kesin

tanmlama yaplamaz.

36

36

almamzda TIC alma konumunda okluu en fazla olan m/z deerleri

belirlenmi ve bunlardan 3 tane iyon seilerek SIM taramas ile analizler

gerekletirilmitir. En yksek cevab veren iyon zerinden ise nicel tayin

yaplmtr.

ekil 2.10. (a) Dizi dinot, (b) Devaml dinot elektron oaltc dedektrlerin ematik

gsterilii

2.6.5. Vakum Sistemleri

Ktle spektrometresi cihaz 10-5-10-9 torr dk basn altnda almaktadr.

Ktle spektrometresinde vakum sisteminin olmasn gerektiren nedenler yle

sralanabilir;

1. Flaman yksek basntaki oksijen altnda stlrsa ykseltgenip yanabilir.

37

37

2. Basn arttka ktledeki oaltc, kaynak ve analizrde yksek voltaj

krlmalar olabilir.

3. Ktle spektrometresinin iyon kaynanda bulunan gaz, spektral geri zemine

katlabilir (rn; su, azot ve oksijenden gelebilecek m/z: 18, 28 ve 32).

4. Ktle spektrometresinde dk basn salamann en nemli nedeni, analiz

edilen iyonlar arasndaki arpmay en aza indirmektir. nk, iyon srekli dier

molekller ve yzeyler ile arpyorsa, iyonlar belli bir yolda ynlendirmek iin

kullanlan gler yararsz olacaktr.

5. Yksek basn ile analizrn, iyon kaynann ve odaklarn kirlenmesi

artmaktadr.

6. Yksek basn ile spektrum almak ve yorumlamak zordur.

7. Basn artarken iyon kaynana doru olan elektron akm dzeltmeleri

zorlar.

8. Vakum sistemi analizrn ilemini gerekletirmesi iin gereken

molekler ortalama yolu salar.

Bu nedenlerden dolay ktle spektrometresi iin vakum sistemleri ok

nemlidir. Ktle spektrometresinde cihaz iindeki basnc 10-5 torr civarnda tutmak

iin deiik pompalar kullanlr. Bunlardan en ok kullanlan kaba, turbo molekler

ve difzyon pompalardr. almamzda difzyon ve kaba pompal MSD

kullanlmtr.

2.6.6. GC- MS Sisteminin Ayarlanmas (Autotune)

Analize balamadan nce ve periyodik aralklarla ktle spektrometresindeki

iyonlatrc, ktle analizr ve dedektr ksmlarnn, uuculuu yksek ve kararl

organik bileikler kullanlarak ayarlanmas gerekmektedir. Sistemde bu ilem

"autotune" denilen donanm kullanlarak yaplr. Ayarlama iin iyon kaynann

basnc 10-5 torr civarnda olmaldr. Standart olarak kullanlan bileik allan ktle

araln kapsamal ve pik iddeti yksek olmaldr. Uuculuu fazla ve kararl

organik maddelerden olmaldr. Kullanlan ayarlama maddesi iyon kaynana

verilerek ktleler ve izotoplar gzlenir.

Ayarlama bileii olarak almamzda kuadropol sistemlerinde standart

olarak en ok tercih edilen perflorotributilamin (PFTBA) kullanlm ve bu maddeye

38

38

zg 69, 219, 502 m/z pikleri temel alnmtr. Autotune sonucu Tablo 2.1de

tanmlanan kabul kriterlerine gre deerlendirilmitir. Kabul kriterleri salanmadan

analize balanmamtr. ekil 2.11de cihazn kabul edilebilir bir autotune kts

grlmektedir. (48)

Ayrca m/z=18 (su) ve 28 (hava) pikleri, m/z=69 pikinin %10'undan az

olmaldr. Fazla olduunda sistemde kaak olmas olasl vardr. m/z=502 pikinin

bal okluu azaldnda ise, iyon kaynann kirlendii sylenebilir.

Tablo 2.1. Ktle spektrometresinin ayarlanmasnda kullanlan ktlelerin bal

okluklar ve izotop ktle oranlar

Ktle Bal okluk (%) zotop Ktlesi zotop Oran (%)

69.0 100 70.0 0.5 1.6

219.0 > 35 220.0 3.2 5.4

502.0 > 1 503.0 7.9 12.3

39

39

ekil 2.11. Analizde kullanlan GC-MS cihaznn autotune kts

40

40

2.7. Trevlendirme Teknikleri

Ayrlacak karmn, sabit fazla etkilemesinden dolay, piklerde

kuyruklanma grlebilecei gibi, alkonma zamanlarnn uzam