farmakogenetikte kullan temel yöntemlertfd.org.tr/sites/all/themes/corporateclean/subweb/...zagaroz...

1

XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 1

Farmakogenetikte Kullanılan Temel Yöntemler

Dr. Melih Ö. Babaoğlu

Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Farmakoloji A.D.


Kültürelfaktörler

Çevresel etkiler

Hastalıkderecesi

Genetikfaktörler

İlaç yanıtındabireyler arasıdeğişkenlik

Fizyolojikdurum

İlaçetkileşmeleri

2



Genetik faktörler

İlaç yanıtındaki bireylerarasındaki değişkenliğin,

%20-40’ından

advers etkilerin yaklaşık%50’sinden sorumlu

3


Farmakogenetik

İlaç yanıtında bireyler arasındagözlenen farklılıkların oluşumunda

genetik faktörlerin katkısınıinceleyen bilim dalı


GenetikGenetikpolimorfizmpolimorfizm

FarmakokinetikFarmakokinetik FarmakodinamikFarmakodinamik••Taşıyıcı proteinlerTaşıyıcı proteinler••Plazma proteinleriPlazma proteinleri••MetabMetabolizmaolizma

••ReseptörlerReseptörler••İyon kanallarıİyon kanalları••Enzimler Enzimler

Farmakogenetik

4


Farmakogenomik

Daha geniş bir kavram

Birçok genetik faktörün ve genomik yapınınhastalık oluşumu ve ilaç yanıtı üzerindeki

etkilerini inceleyerek yeni ilaç hedeflerisaptama çalışmaları


İİnsan genomunsan genomu

22..900900..000000..000 000 baz çiftibaz çifti1010..000000..000 000 tek nükleotid tek nükleotid

polimorfizmipolimorfizmi300300..000 000 haplotiphaplotip1010..000 000 farmakogenetik ile farmakogenetik ile

ilişkiliilişkili

Tek nükleotid polimorfizmi (SNP)

5


EmilimYavaş Hızlı

İlaç-ilaç, ilaç-besinetkileşmeleri

Metabolizma•Yavaş•Hızlı•Çok hızlı

İlaç-ilaç, ilaç-besinetkileşmeleri

İlaç-ilaçetkileşmeleri

İlaç etki yeri(reseptörler)

•Tam•Yetersiz

Atılış(itrah)

•Yavaş•Hızlı


• Aile ve ikiz çalışmaları (dominant, resesif)

Farmakogenetik: Yöntemler

• Fenotipik polimorfizmi (> %1) saptamak için uygun bir belirteç ilaç ile popülasyondağılımı

• Genotip ve fenotip karşılaştırılması

• Klinik gözlem: ilaca verilen cevapta farklılık

•Genin ve mutasyonların belirlenmesi

6


Normal DNormal Dağılımağılım

Frek

ans

Frek

ans

AktiviteAktivite


Polimorfik DağılımPolimorfik Dağılım

Frek

ans

Frek

ans

Aktivite

7


Farmakogenetiğin amacı

Her bir hasta için en uygundozun uygulanması ve en uygun ilacın seçimi.


8


TPMT Genotip-Fenotip Korelasyonu

TPMT genotipleri

TPM

T a

ktiv

itesi


9


İlaç metabolizması- Fenotipik polimorfizm

Yavaş Metabolizör (YM)

Hızlı Metabolizör (HM)

(Çok Hızlı Metabolizör - ÇHM)


Debrizokin/metabolit oranı

Yavaş yıkanbireyler

Bir

e ysa

yısı

Şekil: Alvan G ve diğ. , Drug Metab Dispos 29: 580

Türkiye: % 4

Türkiye: %6

Çok hızlı yıkanbireyler

Kırılmanoktası

10


Diğer CYP polimorfizmleri

2D6 Yavaş metabolizör Kodein Ağrı kesici etkioluşmaması

2C9 Yavaş metabolizör Varfarin ↑ Kanama

2C19 Yavaş metabolizör Omeprazol Tedavininhızlanması

Diazepam ↑ Sedasyon


CYP enzimleri

Evans ve Relling, Science, 286, 487

*

**

Faz I

11


CYP2D6*1*2

alel

familya

alt-familya

enzim/gen

Faz I enzimleri

22

Polimeraz zincir reaksiyonuPCR

Genetik sinyalin amplifikasyonu

12


PCR- Amaç

Nükleik asitleri in vitro çoğaltma yöntemi

Kopyalama ile DNA amplifikasyonu

Genelde genom üzerindeki görece küçük bir bölgeyi (100-3000 baz çifti -bp-) milyonlarca kez çoğaltma

Sinyalin tanınmasını kolaylaştırma (sekanslama, nokta mutasyon analizi, v.b.)


PCR- Avantajları

Kısa zaman içinde (birkaç saat) milyonlarca kopya oluşması

Hücresiz ortam

13


PCR- Üç basamak

Denatürasyon: DNA’nın iki zincirinin birbirinden ayrılması

(94-95°C’de)


PCR- Üç basamak

Primer bağlanması (Annealing):Kısa komplementer nükleik asitlerin hedeflerini tanıması

•(55-65°C’de)

14


DNA polimerazın primerleri uzatması (uzama)

PCR- Üç basamak

•(70-75°C’de)


PCR

95°C, 5 dak72°C, 10 dak

15



16


Amplifikasyon


PCR bileşenleri

Tipik bir PCR tüpünün içeriği

Bileşen

Reaksiyon tüpündeki

(50 μl) konsantrasyon

5 μl 10X Taq buffer 1X

2-10 μl MgCl2 (25 mM stok çözelti) 1-5 mM

5 μl dNTP karışımı (her birinden 2 mM) 200 μM (her biri)

0.5-1.25 μl Primer 1 (20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM


0.25-0.50 μl Taq polimeraz 1.25-2.5 ünite

1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng)

Distile su (hacmi 50 μl’ye tamamlayacak miktar)

17


PCR bileşenleri

Bileşen Reaksiyon tüpündeki



Magnezyum içerebilir veya içermeyebilir


PCR bileşenleri




2-10 μl MgCl2

(25 mM stok çözelti) 1-5 mM

Magnezyum konsantrasyonu ürün kalitesini etkileyen en

önemli unsurlardan biri

18


PCR bileşenleri



5 μl dNTP karışımı

(her birinden 2 mM)

200 μM

(her biri)

Genelde dATP, dCTP, dGTP, dTTP karışımı olarak 10-25 mM

olarak sağlanır.


PCR bileşenleri

0.5-1.25 μl Primer 1

(20 μM stok çözelti)

0.2-0.5 μM

0.5-1.25 μl Primer 2

(20 μM stok çözelti) 0.2-0.5 μM

Liyofilize olarak hazırlanır (ticari), su veya TE tamponu ile çözülür

19


PCR bileşenleri


•Gliserollü tampon içinde sağlanır

•Kendi tamponu ile kullanılmalı


PCR bileşenleri

1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng) •Yoğun tuz ile çöktürme yöntemi klasik bir yöntem, ucuz, her kitapta

ve internet sitelerinde var

•Filtre kullanan kitler pahalı ama zamandan kazandırabilir, kalitede

biraz ödün veriliyor

20


PCR bileşenleri





2-10 μl MgCl2 (25 mM stok çözelti) 1-5 mM

5 μl dNTP karışımı (her birinden 2 mM) 200 μM (her biri)




1-4 μl genomik DNA (1-1000 ng)

Distile su (hacmi 50 μl’ye tamamlayacak miktar)

Karışımın üzerine bir damla mineral yağı


Kapağı ısıtmalı modeller veya mineral yağı kullanılması

21


PCR

DİKKAT!!Kontaminasyon (Çapraz kontaminasyon)

Negatif kontrol tüp konmalı

Önleme yolları (kitapçık)


İyi bir primerin özellikleri18-30 nükleotid uzunluğunda olmalı

Dört baz (A, C, G, T) olabildiğince eşit ve heterojen sırada olmalı

Peş peşe aynı bazın uzun tekrarlarından kaçınılmalı

Primerin kendi içinde komplementer bazlar içermemesine dikkat edilmelidir.

Primer çiftinin 3′-uçlarının birbirlerine komplementer olmamasına dikkat edilmeli (aksi halde primer-dimer oluşumu)

Primerin insan genomu üzerinde yalnızca tek bir bölgeyi tanıdığından emin olunması (BLAST)

22


TaqUcuz, yaygın kullanım, hızlı reaksiyon

Yanlış eşleşmeyi düzeltme (3′- 5′ekzonükleaz)aktivitesi yok

1/9000 oranında yanlış eşleştirme yapar.

Ancak PCRda nadiren bir sorun olur (yüzlerce kalıptan başlayan çoğalma). Toplam ürünün binde bir kaçı.

Tli / Pfu / Vent tama yakın doğruluk. Pahalı.


Genetik sinyalin görüntülenmesi

Agaroz jel elektroforeziDaha düşük rezolüsyon ama hazırlanması daha kolay (%0.8-6)%6’dan daha yoğun hazırlanması zor, ürünler arasındaki fark küçüldükçe ayrımları zorlaşır.

Poliakrilamid jel elektroforeziDaha yüksek rezolüsyonÇok yoğun hazırlanabilir (%>10)

23


Tampon çözeltilerTAE (tris-asetik asit-EDTA): Daha düşük tampon kapasitesi

TBE (tris- borik asit-EDTA): (kitapçık)

PCR ürünlerini görüntülemek


PCR ürünlerini görebilmek

DNA’yı görebilmek için flüoresan ışık yayan boyalar:Etidyum bromür

Çift zincirde bazlar arasına girerek sıkışırUV altında flüoresan ışık yayar

24


+-

V

DNA

küçükbüyük


Agaroz

25


Agaroz jel hazırlanması


% kaçlık?

örn:%2 = 2g/100 ml TBE

Agaroz

TBE¬

Flask for boiling∧

26


Jel tepsisiJel tarağı

Güç kaynağı

Tank Kapak

Elektroforez tankı


Jel tarakları

27


Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.


28


Kısa aralıklarla karıştırarak taşmasına izin vermeden yüksek ısıda kaynatılır

Agarozun eritilmesi


Jel üzerinde veya içinde hava kabarcığı olmamasına dikkat edilmeli

Jelin dökülmesi

29



30


30-45 dakika beklenir


31


TBE

Add enough electrophoresis buffer to cover the gel to a depth ofat least 1 mm. Make sure each well is filled with buffer.

Katot(negatif)

Anot(pozitif)

kuyucuklar

DNA


6X yükleme tamponu: • Bromofenol mavisi• Gliserol

PCR ürünlerinin yüklenmesi

6X yükleme tamponu kullanılır, boyalar jel yürümesini izlemeyi sağlar.

32



Örneklerin yüklenmesi

Pipet ucunu jelin içine batırmamaya dikkat edilmeli

33


Place the cover on the electrophoresis chamber, connecting the electrical leads. Connect the electrical leads to the power supply. Be sure the leads are attached correctly - DNA migrates toward the anode (red). When the power is turned on, bubbles should form on the electrodes in theelectrophoresis chamber.

Jelin yürütülmesi


wells

Bromofenol mavisi

Katot(-)

Anode(+)

Gel

Boyanın doğru yöne (!) yürüdüğüne dikkat etmeli

DNA(-)

34


100200300

1,650

1,000

500

850650

400

12,000 bp

5,000

2,000

-

+

elektroforez yönü


PCR ürününün gözlenmesi

***CAUTION! Ethidium bromide is a powerful mutagen and is moderately toxic. Gloves should be worn at all times.

• Etidyum bromür

35


Jelin boyanması

• Jelin 20-30 dakika EtBr içeren çözeltide tutulması•Birkaç defa yıkanması

70

UV transiluminatör ile gözlenmesi

36



100200300

1,6501,000

500

850650

400

5,000 bp2,000

PCR ürünü

1 2 3 4 5 6 7 8kuyucuklar

Primer dimerleri

37


Mutasyonun belirlenmesi

Dizi analizi (sekanslama)


SSCPHeteroduplex oluşumu...v.b.


38


Restriksiyon Enzimleriyle Kesme İşlemi (RFLP)

PratikUcuzTemel donanım yeterli



PCR ürününün kesimi

39


PCR ürününün kesimi


Endonükleaz kesimi – ABCB1 3435C>T

CT TT CC

%3’lük agaroz jel

nk

......GATC..

MboI

.......GATT...

197 bp158 bp

39 bp

m

Babaoglu et al., Clin Pharmacol Ther, 2005

40


Endonükleaz kesimi – ADH3

Babaoglu et al., Methods Find Exp Clin Pharmacol 2006


Endonükleaz kesimi – ABCB1 3435C>T

CT TT CC

%3’lük agaroz jel

nk

......GATC..

MboI

.......GATT...

197 bp158 bp

39 bp

m


41


Akut Antiemetik Etkinlik

0

20

40

60

80

100

Aku

t ant

iem

etik

etk

inlik

(%

)

CC CT TT CC CT TT CC CT TT

Tropisetron Ondansetron Granisetron

*



5-HT3 Antagonistlerinin Antiemetik Etkinliği

Sonuç:Granisetron ile tedavi edilen ABCB1

3435C>T homozigot hastalarda kemoterapiye bağlı daha az bulantı ve kusma görülüyor

42


Endonükleaz kesimi – BChE

Babaoglu et al., Eur J Clin Pharmacol (2004) 59: 875–877

PCR based endonuclease (Mae III) method (Jensen et. al. 1996).

Genotyping for BChE K-variant

222 bp

179 bp

126 bp

75 bp

222 bp

179 bp

126 bp

75 bp

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10


Endonükleaz kesimi – BChE

Babaoglu et al., Eur J Clin Pharmacol (2004) 59: 875–877

43


Neler gerekli?


Neler gerekli?

44


Neler gerekli?


Neler gerekli?

45



Neler gerekli?

46


Neler gerekli?


Neler gerekli?

47


Neler gerekli?


Neler gerekli?

48


SNP.CSHL.ORGSNP.CSHL.ORG

XIII. TFD Eğitim Sempozyumu Van 96Goodman Gilman 2006

49



Genetik bağlantı (linkage)

50



Amplichip CYP450TM

2003 İlk İlk P450 P450 mimikrodizinikrodizini

51



Kredi kartı

52


Teşekkür

Prof. Dr. Atila BozkurtDoç. Dr. Ümit Yaşar

Dr. E KarginovaDr A Schulte

TÜBİTAK HÜ Bilimsel Araştırmalar Birimi

COST B15 ve B25

farmakogenetikte kullan temel yöntemlertfd.org.tr/sites/all/themes/corporateclean/subweb/...zagaroz...

Documents