farkli toxocara vĐtulorum antĐjenlerĐnĐn elde...
TRANSCRIPT
TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ
SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ
FARKLI TOXOCARA VĐTULORUM ANTĐJENLERĐNĐN
ELDE EDĐLMESĐ VE ENFEKSĐYONA SPESĐFĐK
ANTĐKORLARIN SAPTANMASI
Abdalla Fadlalla AZRUG
PARAZĐTOLOJĐ ANABĐLĐM DALI
DOKTORA TEZĐ
DANIŞMAN
Prof. Dr. Ayşe BURGU
2011- ANKARA
ii
Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü
Parazitoloji Anabilim Dalı
Helmintoloji Doktora Programı
çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma aşağıdaki jüri tarafından
Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir.
Tez Savunma Tarihi: 20 /05/ 2011
Prof.Dr.Ayşe BURGU Ankara Üniversitesi
Jüri Başkanı
Prof.Dr.Ahmet DOĞANAY Prof.Dr. Aykut ÖZKUL Ankara Üniversitesi Ankara Üniversitesi Raportör Prof.Dr.Hatice ÖGE Prof.Dr. Kader YILDIZ Ankara Üniversitesi Kırıkkale Üniversitesi
iii
ĐÇĐNDEKĐLER
Sayfa Đç Kapak……………………………..…............................ i Kabul ve Onay …………..…………………………………... ii Đçindekiler…………………………………………………….. iii Önsöz…………………………………………………………… v Şekiller…………………………………………………………. vii Çizelgeler………………………………………………………. viii
1. GĐRĐŞ ………..…………………………………………………
1
1.1. Geviş Getiren Hayvanlarda Bulunan Askarit Türleri.. 1 1.2. Toxocara vitulorum’un Sistematiği ve Sinonimleri……. 2 1.3. Toxocara vitulorum’un Yayılışı……………………………. 2 1.3.1. Dünyadaki Yayılışı………………………………………….. 2 1.3.2. Türkiye’deki Yayılışı………………………………………… 4 1.4. Toxocara vitulorum’un Morfolojisi……………………….. 6 1.5. Toxocara vitulorum’un Yerleşimi ve Beslenmesi……… 6 1.6. Toxocara vitulorum’un Biyoloji ve Epidemiyolojisi……. 7 1.7.
Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarında Klinik Belirtiler………………………………………………………...
10
1.8.
Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarının Patogenezi ve Patolojisi ……………………………………………………….
11
1.9. Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarının Teşhisi………… 12 1.9.1. Dışkı Muayenesi……………………………………………… 12 1.9.2. Süt ve Kolostrum Muayenesi……………………………… 14 1.9.3. Serolojik ve Diğer Muayeneler……………………………. 14 1.10.
Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarında Kontrol ve Tedavi…………………………………………………………..
20
1.11. Tezin Amacı…………………………………………………… 22 2. GEREÇ VE YÖNTEM………………………………………. 23 2.1. Saha Çalışmaları……………………………………………. 23 2.1.1. Dışkı Örneklerinin Alınması……………………………… 23 2.1.2.
Toxocara vitulorum ile Enfekte Hayvanlara Dışkı Temini için Yeniden Dönülmesi………………………….
23
2.1.3. Parazitlerin Toplanması……………………………………. 23 2.1.4. Kan Örneklerinin Alınması………………………………… 26 2.2. Laboratuar Çalışmaları…………………………………….. 27 2.2.1. Dışkı Muayeneleri…………………………………………… 27 2.2.1.1. Fulleborn Doymuş Tuzlu Su Flotasyon Yöntemi…….. 27 2.2.1.2. Modifiye McMaster Yöntemi ile Yumurta Sayımı…….. 27 2.2.2.
Toxocara vitulorum Yumurtalarının Toplanması ve Geliştirilmesi…………………………………………………..
27
2.2.2.1.
Enfekte Dışkılardan Yumurtaların Toplanması ve Geliştirilmesi…………………………………………………..
28
2.2.2.2.
Dişi Parazitlerden Yumurtaların Toplanması ve Geliştirilmesi…………………………………………………..
28
2.2.3. Kan Serumlarının Çıkarılması ve Saklanması………... 29
iv
ÖZGEÇMĐŞ……………………………………………………. 65
2.2.4. Antijenlerin Hazırlanması…………………………………. 29 2.2.4.1.
Olgun Toxocara vitulorum Perienterik Antijeni (Pe) Hazırlanması ve Protein Tayini ………………………….
29
2.2.4.2.
Toxocara vitulorum Larva Soluble Ekstrakt Antijeni (Ex) Hazırlanması ve Protein Tayini……………………..
30
2.2.5.
(Ex) ve (Pe) Antijenlerinin SDS-PAGE Yöntemi ile Protein Analizi………………………………………………...
31
2.2.6. Western Blot Uygulaması………………………………….. 32 3. BULGULAR……………………………………………………. 34 3.1.
Toxocara vitulorum’un Aranmasına Yönelik Dışkı Bakısı Bulguları………………………………………………
34
3.2.
Toxacara vitulorum Larva (Ex) Antijeni Hazırlanması ile Đlgili Yumurta/Larva Bulguları………………………..
36
3.3.
Toxocara vitulorum Olgun Perienterik (Pe) Antijeni Hazırlanması ile Đlgili Bulgular……………………………
39
3.4.
Toxocara vitulorum Soluble Larva Ekstrakt (Ex) ve Olgun Perienterik (Pe) Antijenlerinin SDS-PAGE ile Karakterizasyonu…………………………………………….
40 3.5.
Toxocara vitulorum (Ex) Antijenlerine Özgül Antikorların Đmmunoblotting ile Araştırılması ……….……………….
41
3.6.
Toxocara vitulorum (Pe) Antijenlerine Özgül Antikorların Đmmunoblotting ile Araştırılması …..…………………….
43
4. TARTIŞMA ……………………………………………………. 45 5. SONUÇ VE ÖNERĐLER …………………………………….. 52 ÖZET …………………………………………………………… 54 SUMMARY ……………………………………………………. 55 KAYNAKLAR …………………………………………………. 56
EKLER ………………………………………………………….
64
v
ÖNSÖZ
TÜĐK, Türkiye Đstatistik Kurumu Yıllığı, 2008 yılı için geviş getiren hayvan türü sayılarını; sığır 10 859 942, manda 86 297, koyun 23 974 591, kıl keçisi 5 432 393, tiftik keçisi 158 168 olarak kaydetmektedir (Anon, 2009). Hayvancılık sektörü içinde sığırcılık her zaman önemli paya sahip olmuşsa da 1980’li yıllarda 15 milyon dolayında olan sığır varlığımız giderek azalmış ve halen azalmaya devam etmektedir (Anon, 2001). 2008 yılında 1 736 107 sığırın kesimi yapılmış, 482.458 ton sığır eti elde edilmiştir. Sağılan inek sayısı 4 080 243, süt üretimi ise 12 243 000 ton olmuştur (Anon, 2009). Türkiye’de sığır başına elde edilen et ve süt miktarları istenilen düzeyde olmadığı gibi, nüfusumuzun giderek artması, ürünsel açığı arttırmaktadır. Halkımız yeterli düzeyde beslenmemekte, sağlıklı olmak, dengeli beslenmek için gerekli olan protein gibi temel besin maddelerini hem bu, hem de ekonomik nedenlerle karşılıyamamaktadır. Türkiye’de sığır başına verimliliğin düşük olmasında hayvanlarımızın çoğunluğunun düşük verimli ırklardan oluşmasının, örgütlenme eksikliğinin, bakım ve beslenme hatalarının ve hastalıkların rolü vardır (Anon, 2001). Hastalıklar arasında şap ve bazı epidemik hastalıkların hala net olarak çözümlenemediği, bruselloz ve tüberküloz gibi hastalıkların da hem hayvan hem de halk sağlığı yönünden önemlerini sürdürdüğü bilinmektedir. Sığırlarda görülen önemli paraziter hastalıklardan biri de toxocarosis’dir. Etken Toxocara vitulorum’un yaygınlığının belirlenmesi konusunda son yıllarda yapılan lokal çalışmalarda nispeten artma görülmekle beraber, Türkiye genelinde yayılış konusundaki bilgilerimiz sınırlıdır. Toxocara vitulorum 1-3 aylık buzağı ve malaklarda hastalık ve ölümlere yol açması nedeniyle hayvan sağlığı ve ekonomik açıdan önemli olmakta, hastalık sırasındaki tedavi uygulamaları ve yem israfı nedeni ile ekonomik boyutu artmaktadır. Öte taraftan T.vitulorum’un başlıca bulaşma yolunun sütle olması ve üç laktasyon dönemi larvaların sütle yavrulara bulaştırılabilmesi (Schnieder, 2006), müteakip enfeksiyonlara ve dolayısıyla çevre kontaminasyonlarına zemin hazırlamaktadır. Toxocara vitulorum enfeksiyonlarının zamanında saptanması ve en uygun zamanda tedavi edilmesi, sürüye katılacak yeni hayvanların bu parazit yönünden kontrolü veya enfekte hayvanların sürüden eliminasyonu sürü yönetiminde önemli olmaktadır. Öte taraftan yapılan deneysel çalışmalar T.vitulorum’un farelerdeki larva göçünün, Toxocara canis’inkine benzediğini göstermiş, bu nedenle insan viseral larva migrans olaylarındaki rolünün araştırılması gerektiğine dikkat çekilerek, halk sağlığı açısından önemli olabileceği kaydedilmiştir . Buna yönelik çalışmalarda ise iyi bir antijenin hazırlanması ve bunun uygun yöntemlere aplikasyonu veya moleküler yöntemlerin uygulamaya konulmasının hedeflenmesi gerektiği belirtilmiştir (Schnieder, 2006; Wickramasinghe ve ark., 2009). Bu araştırmada sığır askariti T.vitulorum’un Türkiye genelinde yayılışı konusunda yeni bilgilere ulaşılması, söz konusu etkenin teşhisinde kullanılabilecek antijenlerin hazırlanması, antijenlerin çalışabilirliğinin araştırılması ve dolayısıyla ileride sürü yönetiminde uygulanacak kontrol programlarının belirlenmesine yardımcı olunabilmesi amaçlanmıştır.
vi
Araştırma 2007-2011 yılları arasında Sudan Hükümeti burslusu olarak bulunduğum Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’nda yürütülmüştür. Bu nedenle Türkiye ve Sudan Hükümetlerine, çalışmayı proje (BAP 09B3338009) olarak destekleyen Ankara Üniversitesi Rektörlüğüne, Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsüne, Veteriner Fakültesine, Parazitoloji Anabilim Dalına, çalışmanın bazı bölümlerini yürüttüğüm Viroloji Anabilim Dalına, Tez Đzleme Komisyonundaki hocalarım Prof.Dr.Ayşe Burgu, Prof.Dr.Ahmet Doğanay ve Prof.Dr.Aykut Özkul’a teşekkür ederim. Ayrıca, materyal temini konusunda; Tarım Đşletmeleri Genel Müdürlüğü’ne (TĐGEM), Prof.Dr.Kader Yıldız, Doç.Dr.Esma Kozan, Doç.Dr.Alpaslan Yıldırım, Doç.Dr.Veysel Soydal Ataseven, Yrd. Doç. Dr.Ramazan Adanır, Yrd.Doç.Dr.Süleyman Aypak, Yrd.Doç.Dr.Hamza Avcıoğlu, Vet. Hek. Doğan Nuri Horel’e; larva sonikasyonu sırasında yardımcı olan Bilkent Üniversitesi Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji Bölümünden Doç.Dr.Rengül Atalay Çetin’e, laboratuar çalışmaları sırasında desteğini esirgemeyen Araş.Gör.Gökben Özbakış, Araş.Gör.Ceren Aştı’ya ve yazım aşamasındaki yardımları için Sekreter Ayla Gündoğdu’ya teşekkürü bir borç bilirim.
viii
ÇĐZELGELER
Çizelge 1.1. Toxocara vitulorum’un Türkiye’de bulunuş ve yayılışı ile ilgili başlıca kayıtlar ………………………………………….. 5 Çizelge 2.1. Türkiye genelinde dışkı örneği alınan iller ve dışkıların
alındığı hayvanların cinsiyet, ırk ve işletme özelliğine göre sayısal dağılımı ……........................................................... 25
Çizelge 2.2. Ankara civarında dışkı örneği alınan yerler, dışkıların alındığı hayvanların cinsiyet ve ırk özelliğine göre sayısal dağılımı ……..…………………………………………….. 26 Çizelge 3.1. Toxocara vitulorum’la enfekte buzağıların illere, cinsiyet ve ırka göre sayısal dağılımı ……………………….. 34 Çizelge 3.2. Enfekte buzağıların gram dışkı yumurta (epg)sayıları …….... 35
vii
ŞEKĐLLER
Şekil 2.1. Türkiye genelinde dışkı örneği alınan yerler ve örnek sayıları ………………………………………………………………… 24 Şekil 3.1. Toxocara vitulorum yumurtası ………………………………….. 35
Şekil 3.2. A-B Toxocara vitulorum yumurta kültürlerinde eş zamanlı olmayan gelişim ………………………………………… 36 Şekil 3.3. Oda sıcaklığında Toxocara vitulorum yumurtalarında gelişim ………………………………………………………………. 37 Şekil 3.4. Toxocara vitulorum yumurtalarından larva çıkışı ve
sonikasyon öncesi larvalar. A-B: Kabuğu soyulmuş yumurtalar (Yumurta deformasyonu okla gösterilmiştir). C1,C2,C3: Yumurtalardan larva çıkışı D: Kabuğu soyulmuş yumurtalar ve larvalar E-F: Larvalar G: Boşalan yumurta …………………………… 38
Şekil 3.5. Toxocara vitulorum larvası ………………………………………. 39 Şekil 3.6. Dişi ve erkek Toxocara vitulorum’lar …………………………… 39 Şekil 3.7. Toxocara vitulorum antijenlerinin SDS-PAGE analizi.
Hat 1. Geniş ölçülü protein marker (Fermentas, Litvanya); Hat 2. Perienterik (Pe) antijen profili; Hat 3. Ekstrakt (Ex) antijeni profili ………………………….. 41
Şekil 3.8. Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerine karşı negatif (A) ve pozitif sığır serumları (B) ile yapılan Western Blot
analizi A: Hat 1 marker, Hat 2-5 saha, Hat 6-8 fötal negatif serumlar B: Hat 1 marker, Hat 2-7 pozitif serumlar ………………………………………… 42
Şekil 3.9. Toxocara vitulorum (Pe) antijenlerine karşı negatif
(A) ve pozitif sığır serumları (B) ile yapılan Western Blot analizi A: Hat 1 marker, Hat 2-5 fötal, Hat 6-7 saha negatif serumlar B: Hat 1 marker, Hat 2-7 pozitif serumlar ………………………………………... 44
1
1. GĐRĐŞ
1.1. Geviş Getiren Hayvanlarda Bulunan Askarit Türleri
Manda, sığır, zebu gibi geviş getiren hayvanlarda ince bağırsaklarda
bulunan askarit türü Toxocara vitulorum’dur.Yaşlı hayvanlara oranla altı
aylığa kadar olan malak ve buzağılarda, malaklarda ise buzağılara oranla
T.vitulorum’a daha çok rastlanmaktadır (Chowdhury, 1994; Anderson,
2000; Schnieder, 2000; Schnieder, 2006; Taylor ve ark., 2007).
Toxocara vitulorum’un malaklarda buzağılara oranla daha letal
olduğu ve bunun “suş” farkı ile ilişkilendirilme durumunun detaylı olarak
araştırılması gerektiği kaydedilmiştir (Chowdhury, 1994).
Toxocara vitulorum’a koyun ve keçilerde çok daha seyrek
rastlanmaktadır (Schnieder, 2006; Taylor ve ark., 2007). Warren (1971),
koyun ve keçilerde T.vitulorum olgunlarına ve larvalarına rastlanmadığını
bildirirken, Chowdhury, (1994) ilgili literatürlere atfen Kerela, Hindistan ve
Sri Lanka’da keçilerde T.vitulorum’a rastlandığını, keçilerin deneysel olarak
bu parazitle enfekte edilebildiğini kaydetmiştir.
Domuz askariti Ascaris suum’un görüldüğü yerlerde sığır ve
koyunların da bu parazitle enfekte olabildiği bildirilmiştir (Schnieder, 2000;
Schnieder, 2006). Bangladeş’de 3 keçi ve 27 koyunda insan askariti Ascaris
lumbricoides yumurtalarına rastlandığı, Kaşmir vadisinde A.lumbricoides
için koyun/insan siklusunun varlığı, ilgili literatürlere bağlı olarak
Chowdhury (1994) tarafından bildirilmiştir. Farklı coğrafik bölgelerde insan,
koyun ve keçide kaydedilen Ascaris cins ve suşlarının hastalığın
epidemiyolojisi ve parazitin zoonotik potansiyeli açısından acilen açıklığa
kavuşturulması gerektiği vurgulanmıştır. Yukarıda değinildiği gibi alışılmış
dışı bazı kayıtlar olmakla birlikte geviş getiren hayvanlar için kesin ve
geçerli askarit türü T.vitulorum’dur (Kassai, 1999; Schnieder, 2000;
Schnieder, 2006; Taylor ve ark., 2007).
2
1.2. Toxocara vitulorum’un Sistematiği ve Sinonimleri
Toxocara vitulorum’un sistematikteki yeri aşağıda gösterilmiştir (Kassai,
1999).
Kök: Nemathelminthes
Sınıf: Nematoda
Takım: Ascaridida
Alttakım: Ascaridata
Üst aile: Ascaridoidea
Familya: Toxocaridae
Cins: Toxocara
Tür: Toxocara vitulorum (Goeze,1782)
Adanır (2004), Toxocara vitulorum (Goeze, 1782)’nin sinonimleri
olarak; Ascaris vitulorum Goeze, 1782- Lumbricus teres vituli Rudolphi, 1809
– Ascaris gigas vituli Rudolphi, 1809 – Ascaris vituli Neuman, 1883, Gemlin,
1709 – Neoascaris vitulorum Travassos, 1927’yi literatürlere bağlı olarak
bildirmektedir. Önceleri özefagus, dudak ve servikal kanat yapısındaki
küçük değişiklikler nedeniyle farklı bir cinste (Neoascaris) gösterilen sığır
askaritinin, daha baskın ortak özellikleri göz önüne alındığında Toxocara
cinsinde gösterilmesinin uygun olduğu kabul edilmiş, nitekim son yıllarda
yazılmış helmintoloji kitaplarında sığır askariti Toxocara vitulorum
(Goeze,1782) olarak geçmektedir (Kassai, 1999; Schnieder, 2000;
Schnieder, 2006; Taylor ve ark., 2007).
1.3. Toxocara vitulorum’un Yayılışı
1.3.1. Dünyadaki Yayılışı
Toxocara vitulorum kozmopolit yayılışa sahip bir parazittir. Genellikle
tropikal ve subtropikal bölgelerde, az gelişmiş veya gelişmekte olan
ülkelerde, 6 aydan daha küçük malak ve buzağılarda büyük sorun
oluşturmaktadır (Kassai, 1999; Adanır, 2004; Schnieder, 2006; Taylor ve
ark., 2007)
3
Toxocara vitulorum’un yayılışı Afrika ülkelerinden Kuzey Nijerya’da
zebu buzağılarında % 38,03 (Sackey ve ark., 2007), Tanzanya’da zebu ve
yerli sığırların 2 aylığa kadar olanlarında % 70-75, 1-1,5 aylıklarda % 45, 3
aylık ve daha büyüklerde % 10 (Kassuku ve ark., 1996), Mali’de buzağı ve
danalarda % 4 (Wymann ve ark., 2007), Mali, Bamako bölgesinde
buzağılarda 0-1 aylıklarda % 2,7 , 2-3 aylıklarda % 76, 5-6 aylıklarda %
0,9, (Wymann ve ark., 2008), Gambia’da yerli sığırlarda % 1’in altında
(Zinsstag ve ark., 2000), Gine, Fildişi kıyısında yerli sığırlarda % 12.3 ± 5.1
(Knopf ve ark., 2004) olarak kaydedilmiştir.
Toxocara vitulorum’un Asya kıtasında da iklim şartlarına bağlı
olarak birçok ülkede sorun olarak devam ettiği izlenmektedir. Nitekim
Güney Pakistan’da sığırlarda % 37.50, mandalarda % 63.83 (Raza ve ark.,
2007), Multan Bölgesinde sığırlarda gençlerde % 25-64, yaşlılarda % 8.19,
mandalarda gençlerde % 35.48, yaşlılarda % 4.34 (Raza ve ark., 2010)
kaydedildiği bildirilmiştir. Bangladeş’te buzağı ve danaların % 14’ünde
(Samad ve ark., 2004), Đran’ın Urmai Bölgesi’nde malaklarda % 15.8
(Tavassoli, 1999) yaygın olduğu kaydedilmiştir.
Kuzey Amerika kıtasından seyrek olarak T.vitulorum enfeksiyonu
bildirilmektedir Davila ve ark., (2010) Kuzey Florida’da 3 aylığa kadar
buzağılarda T. vitulorum prevalansını % 17.6, 3-4 aylıklarda % 0.4, 5-6
aylıklarda % 0.9 olarak kaydetmişler, 6 aylıktan büyük hayvanlarda
parazite rastlamadıklarını belirtmişlerdir.
Güney Amerika’da Brezilya’da yapılan bir çalışmada doğum sonrası
ilk haftada buzağılardaki T. vitulorum’a rastlanma oranının % 58, dört hafta
sonra % 100 olduğu Barbosa ve ark., (1992) tarafından kaydedilmiştir.
Braga ve ark., (2010) Güney Amerika ülkelerinde T.vitulorum
enfeksiyonunun % 5 ile % 50 endemik olduğunu, hayvancılık sektöründeki
farklı bakım sistemlerine göre bunun % 100’e varabildiğini ilgili literatürlere
atfen bildirmişler.
Avrupa’da ilgili literatürlere atfen Hollanda, Belçika, Yunanistan,
Almanya, Đngiltere gibi bazı ülkelerde seyrek de olsa T. vitulorum
4
enfeksiyonuna rastlandığı kaydedilmektedir (Kassai, 1999; Schnieder,
2000; Adanır, 2004; Schnieder, 2006; Jones ve ark., 2009). Borgsteede ve
ark., (2010), Hollanda’da Güney Fransa’dan ithal edilen buzağılarda T.
vitulorum’a rastlandığını ve bunun Hollanda’dan son yıllarda yapılan ender
kayıtlardan olduğunu yazmaktadır. Goossens ve ark., (2007) Belçika’da özel
sektörde bulunan Amerikan Bizon buzağılarında T. vitulorum yayılışının %
61 olduğunu ve enfekte buzağıların yaşlarının 23-73 gün arasında
değiştiğini, ölüm oranının ise % 4-9 olduğunu bildirmişlerdir. Mahieu ve
Naves (2008), Batı Fransa Guadelupe adasında buzağılardaki prevalansı %
0.77 olarak kaydetmişlerdir.
1.3.2. Türkiye’deki Yayılışı
Toxocara vitulorum’un Türkiye’de bulunuş ve yayılışı ile ilgili başlıca kayıtlar
Çizelge 1.1. de özet olarak verilmiştir. Bu çizelgenin incelenmesinde
görüleceği üzere, eski kaynaklarda (Oytun, 1961; Merdivenci, 1970) Türkiye
genelinde oran verilmeksizin T.vitulorum’ un buzağı, dana ve malaklarda
bulunduğu kaydedilmekte, ilk olarak Güralp ve ark., (1985) Türkiye
genelinde 17 değişik yerden topladıkları sığır dışkı bakılarında % 0.8
oranında parazite rastladıklarını bildirmektedirler. Gerek bu çizelgenin
incelenmesinden gerekse Öge ve Doğanay (1997)’ın derleme yayınından
Türkiye’ de mandalarda T.vitulorum’ un yayılış oranını belirten bir çalışma
olmadığı görülmektedir. Daha sonraki yıllarda Bursa, Samsun, Trakya
bölgesi, Kars, Konya, Kayseri, Ankara, Van, Erzurum, Hakkari gibi
Veteriner Fakültelerinin olduğu üniversite illerinde veya bu üniversitelere
bağlı yüksekokulların olduğu illerde konu üzerine eğilinmiş ve T.vitulorum’
un sığırlardaki yayılışı ile ilgili çalışmalar yapılmıştır. Yapılan bu
çalışmaların çoğunda T.vitulorum enfeksiyonunun cinsiyet, sığır ırkı, yaş,
yetiştiricilik koşulları (Halk eli / Kamu kuruluşu) veya çevre koşulları ile
olan ilişkileri irdelenmiştir. Bazı klasik parazitoloji kitaplarında (Kassai,
1999; Schnieder, 2006) T.vitulorum’a koyun ve keçilerde çok seyrek olarak
rastlandığı bildirilmesine karşın, koyunculuğun ön planda olduğu
Türkiye’de buna ilgili hiç kayıt yoktur.
5
Çizelge 1.1. Toxocara vitulorum’un Türkiye’de bulunuş ve yayılışı ile ilgili başlıca kayıtlar
Kaynak Yöre Yöntem /
Materyal
Bulunuş /Yayılış kaydı
Oytun (1961) Türkiye geneli - Memleketimizde dana ve malaklarda çok olduğu (oran verilmeden)
Merdivenci (1970) Yozgat ili Yerköy Çiftliğinde
Otopsi 18-26 günlük süt danalarının ince bağırsaklarında bulunduğu
Marmara Bölgesi Đstanbul, Tekirdağ Kırklareli
- Danalarda bulunduğu
Çorlu - Malaklarda bulunduğu Güralp ve ark., (1985)
Türkiye geneli Dışkı % 0.8
Toparlak ve ark., (1989)
Van Dışkı % 16
Günay (1990) Marmara Bölgesi Otopsi % 3.1 1 yaştan büyük % 8.3 1 yaştan küçük
Akyol (1993) Bursa Dışkı % 2.2 % 5.1 6 aylığa kadar
Süt % 0.7 Tiğin ve ark., (1993)
Đç Anadolu Bölgesi Dışkı % 0-2.7
Celep ve ark., (1994)
Samsun Dışkı % 0.63
Umur ve Gıcık (1995)
Kars Dışkı % 7.5 % 13 1 hafta-6 aylık % 0.6 2-5 yaş arası
Toparlak ve ark., (1996)
Trakya Dışkı % 4.3 6 aydan küçük
Arslan ve ark., (1997)
Kars Otopsi Toxocarosis’ten ölen bir buzağı otopsisinde 350 genç ve erişkin parazite rastlandığı
Aydenizöz ve ark., (1999)
Konya Dışkı % 0.62
Altınöz ve ark., (2000)
Konya Dışkı % 0.28 6 aydan küçük % 0.41 6 aydan büyük
Yıldırım ve ark., (2000)
Kayseri Dışkı % 0.5
Aydın ve ark., (2001)
Kars Dışkı % 9.9 2-30 günlük
Adanır (2004) Ankara Dışkı % 4.6 6 aydan küçük
Süt % 0.2
Aydın ve ark., (2006)
Hakkari Dışkı % 28.96 % 34.4 1-6 ay % 6.6 6 ay – 1 yaş % 3.3 1 yaş üzeri
Göz ve ark., (2006)
Van Dışkı % 17.7 8 aylığa kadar
Arslan ve ark., (2008)
Erzurum Dışkı % 1.1 3 aylığa kadar
Avcığlu ve Balkaya (2011b)
Erzurum Dışkı % 22.2 % 24 6 aylığa kadar % 10.6 6-12 ay arası
6
1.4. Toxocara vitulorum’un Morfolojisi
Sığırların en büyük intestinal nematodudur. Toxocara vitulorum erkekleri 6-
25 cm uzunluğunda, 3-5 mm genişliğinde; dişileri 8-30 cm uzunluğunda, 5-
6 mm genişliğinde, pembemsi renkte, kalın yapılı parazitlerdir. Kütiküla
diğer askaritlerinkine oranla daha ince yapıda olması nedeniyle saydamdır,
iç organları çıplak gözle fark etmek mümkündür (Taira ve Fujita, 1991;
Taylor ve ark., 2007). Ön uçta 3 dudak bulunur, bunların taban kısmı daha
geniş olup, uca doğru gittikçe daralır, üzerlerinde papil yoktur. Özefagus 3-
4,5 mm kadar uzundur, posteriorunda granüler bir ventrikulus taşır.
Erkeklerde kuyruk ucunda küçük bir sivrilme gözlenir ve bu kısımda 5 çift
kadar post-kloakal papil bulunur, anterior olan çift büyüktür. Pre-kloakal
papillerin sayısı ise değişmektedir. Erkeklerde gubernakulum yoktur,
spikülümler 0,95–1,25 mm uzunluğundadır. Dişilerde vulva, anterior uçtan
vücut uzunluğunun 1/7 - 1/9 kadar uzaklıkta yer alır (Taira ve Fujita,
1991; Anderson, 2000; Eckert ve ark., 2005; Schnieder, 2006; Taylor ve
ark., 2007).
Toxocara vitulorum ovipardır. Yumurtaları yuvarlağa yakın, bazen
ovalimsi yapıda, kalın kabuklu, üzeri ince pürüzlü ve 75-120 x 60-105 µm
büyüklüğündedir. Đç kısımda bulunan tek blastomer koyu kahve veya siyah
renktedir. Yumurta kabuğunun en dışında albümin tabakası, bunun
altında kitin ve en içte de lipit tabakası bulunur. Albumin tabakası ince
olup, birbirine yakın granüller içerir. Kitin tabakası, yumurta kabuğunun
en kalın bölümü olup, yumurta kabuğunda görülen çıkıntı ve girintilerin
esas kaynağıdır (Kassai, 1999; Anderson, 2000; Schnieder, 2006; Taylor ve
ark., 2007).
1.5. Toxocara vitulorum’un Yerleşimi ve Beslenmesi
Adanır (2004), ilgili literatüre bağlı olarak erişkin T. vitulorum’ların
çoğunlukla 6 aydan küçük, nadiren de 6 aydan büyük hayvanlarda
bulunduğunu ve ince bağırsaklarda yerleşen parazitlerin genellikle pH’nın
7
nötr olduğu kısımları, bazen de pH’nın alkali olduğu son kısımları tercih
ettiklerini kaydetmektedir.
Bağırsak mukozasına yapışmadan, lümende serbest olarak bulunan
ve bağırsak sıvısı ile beslenen parazitlerin, katı ancak küçük partikülleri de
özefagus emme hareketi ile ağız yoluyla aldığını, özellikle amino asidi, yağ
asidi gibi sindirilmeye hazır besinlerin öncelikli olduğunu ilgili literatüre
bağlı olarak Adanır (2004) bildirmektedir. Askaritlerin, büyük molekülleri
amilaz, lipaz, esteraz, proteaz ve peptidaz içeren sekresyonları ile
parçalayarak sindirdiği, glukoz, levuloz, sorboz, sukroz, maltoz gibi
karbonhidratları bağırsak içeriğinden seçerek aldığı ve dokularında glikojen
sentezinde kullandığı bildirilmektedir. Bu sentezin B grubu vitaminler
tarafından aktive edilmesi nedeniyle, askaritlerin vitaminleri de
konaklarından almak zorunda olduğu, konaktan çalınan karbonhidratlar
nedeniyle de son konaklarda önemli düzeyde hipoglisemi meydana geldiğini
Adanır (2004) ilgili literatüre atfen bildirmektedir.
1.6. Toxocara vitulorum’un Biyoloji ve Epidemiyolojisi
Dişi ve erkek T.vitulorum’ların bağırsak boşluğunda çiftleştikleri ve döl
verme yeteneği fazla olan dişi bir parazitin günlük yumurta kapasitesinin
8 x 106 olarak saptandığı veya ince bağırsak lümeninde bulunan dişi bir
parazitin yumurta üretiminin 3-8 milyon/gün olarak kaydedildiği
bildirilmektedir (Roberts, 1990a; Kaufmann, 1996; Schnieder, 2006).
Toxocara vitulorum yumurtaları doğa koşullarında oldukça
dayanıklıdır ve yumurtalar dış çevrede 2 yıl veya daha uzun süre canlı
kalabilir (Kassai, 1999; Schnieder, 2006). Tropikal ve subtropikal nemli
ülkelerde T. vitulorum yumurtalarının daha iyi gelişebildiği, rutubet, yeterli
ısı, oksijen, ormanlık ve yağışlı iklim bölgelerinin en uygun ortamlar olduğu
bildirilmektedir (Akyol, 1993; Schnieder, 2006; Goossens ve ark., 2007).
Dış çevrede dışkıdaki yumurtaların ısıya karşı canlı kalabilmeleri
dışkının kalınlığı ve nem düzeyine bağlıdır. Uygun şartlara sahip dış
8
ortamda yumurta içinde enfektif larva 15 gün veya biraz daha uzun sürede
gelişir (Akyol, 1993; Roberts, 1989a; Roberts, 1993; Umur ve Gıcık, 1995).
Kalın kabuklu T.vitulorum yumurtalarının lysol, creolin gibi
dezenfektanlarda 17-20 saatte öldüğü, ultraviyole ışınları, x ve γ
ışınlarının, Fusarium mantarının gelişmeyi engellediği ilgili literatürlere
atfen bildirilmiştir (Adanır, 2004). Braga ve ark., (2010) hematophagous
mantarlardan Pochonia chlamydosporia’ nın VC1, VC4, VC5 ve VC12
izolatlarını T.vitulorum yumurtaları ile % 2’ lik su-agarda tuttuğunda; bu
dört izolatın da günlere göre değişen şekilde yumurtaların kabuk
yapısındaki yozlaşmalardan, hifaların yumurta içindeki embriyoya
penatrasyonu sonu destrüksiyona kadar değişen negatif etkileri olduğunu
bildirmişlerdir. Braga ve ark., (2010) bu mantarın nematodların biyolojik
kontrolünde kullanılabilecek potansiyel bir ajan olduğuna işaret
etmişlerdir.
Toxocara vitulorum’un biyolojisi direktir. Yakın zamanlara kadar,
diğer askaritlerdeki gibi son konak için enfektif dönemin içinde L2 bulunan
yumurtalar olduğu kaydedilmiştir (Soulsby, 1986; Urquhart ve ark., 1987).
Ancak, elektronmikroskop çalışmalarında, yumurta içinde larvanın iki
gömlek değiştirdiği ve enfektif larvanın üçüncü dönem larva (L3) olduğu, 24-
280C da 11 günde, 18-200C da 30-40 günde geliştiği ilgili literatürlere atfen
bildirilmiştir (Kassai, 1999; Schnieder, 2006). Warren (1971), normal
koşullarda yumurtayı terk etmeyen larvanın dışarı çıkarılması
sağlandığında; larvanın belirgin bir ventriculusa sahip olduğunun
gözlendiğini ve uzunluğunun 345-398 µm ölçüldüğünü kaydetmiştir.
Đçerisinde enfektif larva (L3) taşıyan yumurtaların alınmasının her zaman
bağırsak enfeksiyonu ile sonlanmadığı, (L3)’lerin yaşa ve cinsiyete
bakmaksızın somatik göç yaparak, karaciğer, akciğer ve diğer organlarda
hipobiyoza girdiği, gebe hayvanlarda doğuma yakın dönemde larvaların
aktivitelerini yeniden kazanarak memeye geldiği ve doğum sonrasında yeni
doğan yavrulara sütle geçerek, 3-4 haftaya kadar enfekte edebildiği
kaydedilmektedir (Roberts ve ark., 1990; Kassai, 1999; Eckert ve ark.,
2005; Schnieder, 2006).
9
Doğum sonrası ilk 2 gün sütle çıkarılan larva sayısı çok fazla
olmakta, 9 uncu günden sonra azalmaktadır (Kassai, 1999; Schnieder,
2000; Schnieder, 2006; Taylor ve ark., 2007). Bu nedenle T.vitulorum
enfeksiyonlarında en önemli enfeksiyon yolu sütteki enfektif larvalar olup,
sütle larvaları alan buzağılarda, larvalar somatik göç geçirmeden ince
bağırsaklara yerleşmekte ve gelişmelerine devam etmektedir (Taylor ve ark.,
2007). Roberts (1993), doğumdan yaklaşık 8 gün önce karaciğer ve
akciğerdeki bazı larvaların meme bezlerine göç ettiğini, fakat bu göçü neyin
başlattığının tam bilinemediğini, konaktaki hormon düzeylerindeki
değişikliklerin ve immun reaksiyonların baskılanması gibi durumların, larva
gelişimine pozitif veya negatif etkileri olabildiğini bildirmiştir.
Roberts (1993), dişi hayvanlarda dokularda latent bekleyen
larvaların bir yılda yarı yarıya azaldığını, fakat bazı larvaların iki gebelik
boyunca enfeksiyonda etkili olabildiğini bildirmiştir. Schnieder (2006), ilgili
literatüre bağlı olarak enfekte bir ineğin üç laktasyon döneminden fazla,
larvaları sütle bulaştırabildiğini kaydetmektedir.
Prenatal enfeksiyonda, ineklerin çeşitli doku ve organlarına giderek
yerleşen T.vitulorum larvaları, gebeliğin 8.ayından itibaren aktive olarak
plesanta ve amnion sıvısına göç etmekte, enfekte olan fötuste larvalar mide
ve bağırsaklara gelmekte, doğumdan sonra da çok kısa sürede
olgunlaşmaktadır (Soulsby, 1986). Adanır (2004), ilgili literatürlere bağlı
olarak bazı araştırıcıların T.vitulorum’la doğal enfekte hayvanları inceleyerek
veya deneysel olarak yapılan enfeksiyon çalışmaları sonuçlarına göre
prenatal enfeksiyonun oluşmadığını, bunun tersine bazı araştırıcıların da
prenatal enfeksiyonların oluştuğunu kaydettiklerini bildirmektedir. Bu
konuda hala netlik kazanmamış bilgiler bulunmakla birlikte prenatal
enfeksiyonların mümkün olabileceğine işaret edilmektedir (Agyei, 1991;
Schnieder, 2006).
Aynı cinsten Toxocara canis ve T.mystax (T.cati)’ nin gelişmesinde
paratenik konakların yeri olmasına karşın, T.vitulorum’da olmadığı, ancak
T.vitulorum yumurtaları ile enfekte edilen farelerde enfeksiyondan sonra
geçen süreye bağlı olarak sindirim sistemi duvarı, periton boşluğu, genital
10
organlar, beyin, böbrek, akciğer, karaciğer ve karkasta larvalara rastlandığı,
farelerin yanı sıra T.vitulorum’la enfekte edilen tavşan, kobay, rat ve
civcivlerde benzer tarzda değişik vücut bölümlerinde larvalara rastlandığı,
T.vitulorum’un larvalarının da T.canis’e benzer bir göç geçirdiği bildirilmiştir
(Warren, 1971; Amerasinghe ve ark., 1992; Barriga ve Omar, 1992; Adanır,
2004).
Enfekte olan buzağıların dışkı ile çıkardığı yumurtaların sayısı
doğum sonrası 5.haftada en fazladır. Bu süre sonunda parazitler
kendiliğinden atılmaya başlar ve bu nedenle 3-4. aydan sonra dışkıda
yumurta çok azalır veya yumurtaya rastlanmaz (Roberts, 1990a; Anderson,
2000; Taylor ve ark., 2007). Toxocara vitulorum’da enfekte malaklarda
yumurtaların 11.günden itibaren çıkartılmaya başlandığı, 49.günde
enfeksiyonun pik yaptığı, 50-85.günlerde parazitlerin atıldığı kaydedilmiştir
(Neves ve ark., 2003; Mahieu ve Naves, 2008).
1.7. Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarında Klinik Belirtiler
Genellikle 6 aydan küçük olan buzağı, malak ve zebu yavrularının ince
bağırsaklarında bulunan ve en büyük nematod olan T.vitulorum’la enfekte
hayvanlarda klinik bulgular, doğum sonrası 10-15 gün içinde başlar ve 6
aya kadar devam eder (Roberts, 1993; Kassai, 1999; Adanır, 2004).
Enfeksiyonun şiddeti ve klinik belirtileri buzağının yaşı ve
incebağırsaklarda bulunan parazit sayısıyla ilgilidir. Soulsby (1986), buzağı
başına 70-500 parazitin klinik bulguların ortaya çıkması için yeterli
olduğunu kaydetmiştir. Dışkı yumurta sayısının 5000 olması hafif
enfeksiyonları, 5000-10000 olması orta enfeksiyonları, 10000 den fazla
olması ise ağır enfeksiyonları işaret etmektedir (Soulsby, 1986; Roberts,
1990a; Roberts, 1993; Adanır, 2004).
Bağırsakta bulunan parazitlerle ilgili emilim bozukluğundan ötürü
yağlı ve pis kokulu bir ishal, bazen konstipasyon, dehidrasyon, iştah
azalması, ateş yükselmesi, tüylerin karışık ve cansız görünümü,
11
meteorismus, solunum bozuklukları, nefesin bütirik asit veya asetonu
andırır şekilde kokması (sarımsak kokusu) başlıca klinik belirtiler olarak
kaydedilmektedir (Roberts, 1993; Adanır, 2004; Eckert ve ark., 2005;
Schnieder, 2006). Kassai (1999), klinik belirtiler arasında kaydedilen ve
parazitlerin metabolik ürünlerinin toksik etkisi ile ilişkilendiren kuvvetli
butirik asit veya aseton benzeri kokunun bazen mezbahalarda karkas
imhasına yol açabildiğini bildirmektedir.
Toxocara vitulorum ile enfekte hayvanların sağaltılmamaları
durumunda ishal, zayıflama, sancı ve bağırsak tıkanması sonucu ölümlerin
görülebileceği kaydedilmektedir (Soulsby, 1986; Arslan ve ark., 1997;
Schnieder , 2006). Kassuku ve ark., (1996) Tanzanya’da enfekte buzağılar
arasında ölüm oranını % 50 olarak bildirmiştir. Kuzeybatı Afrika’da Burkina
Faso’da paraziter enfeksiyonlardan ölen buzağılarda T.vitulorum
enfeksiyonunun payı % 62 olarak belirlenmiştir (Ganaba ve ark., 2002).
Kassai (1999), T.vitulorum’un karaciğer, akciğer, böbrek gibi bazı doku ve
organlarda göç eden enfektif veya inhibe larvalarının seyrek olarak fokal
enfeksiyonlara neden olduğunu ve genellikle asemptomatik seyrettiğini
bildirmiştir.
1.8. Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarının Patogenezi ve Patolojisi
Toxocara vitulorum’un da diğer askarit türleri gibi kan emmediği, ağız
yapıları ve hemolizin içermeyen sekresyonlarının bu tip beslenmeye uygun
olmadığı, ancak bazen kuvvetli dudakları ile mukozayı zedeleyerek
kanamaya neden olduğu ve bu sırada çok az kan emebildiği ilgili
kaynaklara bağlı olarak bildirilmiştir (Chowdhury, 1994; Adanır, 2004).
Histopatolojik olarak enfekte hayvanlarda ince bağırsak
mukozasında geniş ülserasyon alanları, kas katmanlarının incelmesi,
lenfosit ve granülosit infiltrasyonu kaydedilmiştir. Bağırsaklarda bulunan
parazitlerin yol açtığı değişiklikler sonu oluşan emilim bozukluğu pis
kokulu ishali başlatmaktadır (Roberts, 1993; Eckert ve ark., 2005;
Schnieder, 2006). Neves ve ark., (2003), T.vitulorum ile enfekte malaklarda
12
değişik bağırsak bölümlerinde mast hücrelerinde değişen oranlarda artış
görüldüğünü, aynı şekilde mukozada eozinofil sayısında artmalar
belirlendiğini, kan dolaşımında ise 2. ve 7. haftalara rastlayan bir artma
izlendiğini bildirmişlerdir. Erişkin parazitlerin bağırsak tıkanması, torsiyon,
perforasyon ve ölümlere neden olduğu bildirilmektedir (Arslan ve ark.,
1997; Taylor ve ark., 2007).
Enfektif yumurtaların alınmasından sonra, göç geçiren larvalardan
ötürü eozinofili, lenfositosis görülmekte, enfeksiyondan 10 gün sonra
karaciğer ve akciğerde küçük yangısal odaklar, hepatik ve pulmoner lenf
nodüllerinde ödem ve eozinofil infiltrasyonu dikkati çekmektedir (Roberts,
1993; Arslan ve ark., 1997).
Akyol (1993), ilgili yazarlara atfen askaritlerin toksik maddeleri ile
meydana gelen intoksikasyon lezyonlarının hemorajik ve hiperplasik
ödematöz bir özelliğe sahip olduğunu, iç organlarda kapiller ve venöz
ektazinin bunlara iştirak ettiğini bildirmiştir.
1.9. Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarının Teşhisi
Enfekte buzağıların kendiliğinden attığı veya ilaç kullanımı sonrası atılan
parazitlerin görülmesi ya da nekropsi de bağırsakta parazitlerin gözlenmesi
ile yapılan teşhis kesindir (Soulsby, 1986; Kassai, 1999). Ağır ve şiddetli
enfeksiyonlarda, enfekte buzağıların nefesinde fark edilen aseton, butirik
asit veya sarımsak kokusu T.vitulorum enfeksiyonunun teşhisinde yararlı
olacak çok önemli bir ipucudur (Kassai, 1999; Schnieder, 2006). Toxocara
vitulorum’un teşhisinde dışkı, süt ve kan (serum) veya parazit materyali
kullanılmaktadır (Kassai, 1999; Adanır, 2004;Souza ve ark., 2004; Starke-
Buzzetti ve Ferreira 2005; Schnieder, 2006; Wickramasinge ve ark., 2009).
1.9.1. Dışkı Muayenesi
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarının teşhisi çoğunlukla rutin dışkı
bakılarında karakteristik yumurtaların gözlenmesi ile olmaktadır. Orta
13
büyüklükte olarak değerlendirebilen T.vitulorum yumurtalarını
sedimentasyon yöntemleri ile saptamak mümkünse de daha pratik olması
açısından flotasyon yöntemleri tercih edilmektedir (Kassai, 1999; Adanır
2004; Schnieder, 2006). Bunun dışında pozitif bulunan dışkılarda gram
dışkı yumurta sayısının (epg = eggs per gram) belirlenmesi enfeksiyonun
şiddetinin tahmininde önem taşıyabilmektedir. Ancak, gram dışkı yumurta
sayısının enfeksiyonun şiddetli olmadığına işaret ettiği durumlarda; parazit
dişilerinin yumurta üretim dönemlerinin sonucu etkileyebileceği göz ardı
edilmemelidir. Ciddi enfeksiyonları belirtmek için gram dışkıdaki yumurta
sayısının 10000’den fazla olması gerektiği bildirilmiştir (Soulsby, 1986;
Roberts, 1989a; Adanır, 2004). Türkiye’de yapılan çalışmalarda enfekte
hayvanlardaki gram dışkı yumurta sayısı 2200-95200 (Güralp ve ark.,
1985), 100-64200 (Toparlak ve ark., 1989), 850-16200 (Umur ve Gıcık,
1995), 25-5800 (Toparlak ve ark., 1996), 2600-28200 (Arslan ve ark., 1997),
600-1000 (Altınöz ve ark., 2000), 25-25200 (Adanır, 2004), 850-13410
(Aydın ve ark., 2006), 50-66700 (Avcıoğlu ve Balkaya, 2011b) olarak
kaydedilmiştir.
Toxocara vitulorum enfeksiyonunun geri kalmış veya gelişmekte olan
ülkelerde, iyi bakım ve beslenme koşullarına sahip olmayan, antelmentik
uygulaması yapılmayan, her yaş grubu hayvanın bir arada tutulduğu
ahırlarda yaygın görüldüğü belirtilmiştir (Kassai, 1999; Hassan ve Abdel-
Aziz, 2010). Böyle ahırlarda buzağı veya malakların annelerinin yanında
tutulması, yavrunun yalanması, dışkı ile bulaşık altlıkların yemle birlikte
alınması, hatta bazen buzağıların düşürdüğü parazitlerin yenmesi dışkıda
yumurta görülmesine neden olacağından yanlış saptamalara yol açabilir.
Ayrıca, nematodlardan ileri gelen enfeksiyonlarda henüz yumurtlama
dönemine gelmemiş dişi parazitlerin oluşturduğu enfeksiyonlarda, ya da tek
cinsiyetten ileri gelen enfeksiyonlarda (döllenme olamayacağı için) dışkı
muayene sonuçları yanıltıcı olabilir (Soulsby, 1986; Roberts, 1990a; Kassai,
1999; Hassan ve Abdel Aziz, 2010).
14
1.9.2. Süt ve Kolostrum Muayenesi
Toxocara vitulorum’la enfekte hayvanlarda süt ve kolostrum muayeneleri
öncelikle enfektif larva (L3) aramak için yapılmaktadır. Sütte rastlanan larva
büyüklükleri; 1200 µm (Roberts, 1990b), 1254 ± 60 µm x 36 ± 6,7 µm
(Roberts , 1990b; Roberts ve ark., 1990), 0,75-1,47 µm (Anderson, 2000),
783 (694-871) µm x 32 (27-36) µm (Adanır, 2004) olarak kaydedilmiştir.
Adanır (2004), enfekte hayvanların sütle doğumdan 1 ay sonraya
kadar larva çıkardıklarını, larva çıkarılmasının doğum sonrası 2-22. günler
veya 2-18. günler olduğunu ilgili literatürlere atfen bildirmektedir.
Gautam ve ark., (1976) ve Banerjee ve ark., (1983) sırasıyla
Hindistan’da sütlerini inceledikleri mandaların % 10.8 inde, % 7.6 ’sında
T.vitulorum larvası bulduklarını bildirmişlerdir. Akyol (1993), incelediği 144
ineğe ait süt örneğinden 1’ inde (% 0,7) larva saptadığını bildirmiş, Adanır
(2004), 150 örnekten 1’ inde (% 0,2) larvalara rastlamıştır.
Süt veya kolostrum örneklerinin larva yönünden incelenmesinde
santrifüj tekniği ve sedimentin incelenmesi esas olup, membran filtrasyon
veya modifiye membran filtrasyon yöntemleri de kullanılmıştır (Akyol, 1993;
Adanır, 2004; Sackey ve ark., 2007).
Değişik T.vitulorum antijenleri ve değişik yöntemler kullanılarak
kolostrum ve süt örneklerinin serum gibi işlenmesi ile enfeksiyon
durumunun belirlenebildiği veya izlenebildiği de kaydedilmektedir (Bkz.
1.9.3) (Akhtar ve ark., 1993, Souza ve ark., 2004; Starke-Buzetti ve
Ferreira, 2005; Ferreira ve Starke-Buzetti 2005).
1.9.3. Serolojik ve Diğer Muayeneler
Toxocarosis’in teşhisinde serolojik yöntemlerden de yararlanılmaktadır.
Serolojik teşhiste kullanılan testlerin özgüllüğü özellikle kullanılan antijene
ve antijenin hazırlanma yöntemine büyük ölçüde bağlı olmaktadır. ELISA ve
15
diğer bir çok testin teşhiste kullanıldığı, pozitif yanıtların Western Blot (WB),
Polymerase Chain Reaction (PCR) gibi yöntemlerle konfirme edildiği
kaydedilmektedir (Banerjee ve ark., 1998; Starke-Buzetti ve ark., 2001;
Ferreira ve Starke-Buzetti, 2005; Starke-Buzetti ve Ferreira, 2005).
Akhtar ve ark., (1993) Pakistan’da 70 kolostrum örneğinde, IHA ile
kolostral immunoglobulinleri araştırdıkları çalışmalarında, sonikasyonla
hazırlanmış, antijen kullanıldığını, 1/4 - 1/32 titrede kolostrumda
antikorlara rastlandığını ve doğumdan sonraki ilk saatte antikorların en
yüksek düzeyde olduğunu, sonra 36 saate kadar azaldığını ve 48, 60, 72.
saatlerde sıfıra indiğini kaydetmişlerdir.
Rajapakse ve ark., (1994) T.vitulorum’la doğal enfekte mandaların
kolostrum ve serum immunoglobulinlerinin, T.vitulorum larvalarına invitro
ve farelerde invivo etkilerini araştırmışlardır. Fraksiyone edilerek veya
edilmeden, sulandırılmadan veya değişik volümlerde sulandırılarak, farelere
kuyruk venasından verilen kolostrumun, farelerde göç eden T.vitulorum
larva sayısını azalttığı gözlenmiştir. Kolostrumun Sephadex G-200
kromotografisi sonu IgG içeren fraksiyonunun, keza IgM’in enjekte edilmesi
ile farelerde pasif korunma sağlandığı kaydedilmiştir. Öte taraftan manda
serumu, kolostrumu veya fraksiyonları (Sephadex G-200 ve
diethylaminoethanol Sephadex) ile 6 saat inkubasyona bırakılan larvaların
aktivitelerinin invitro olarak da azaldığı ve böyle larvaların farelere
verilmesinde göç etme yeteneğinde de (Helmintsiz koyun kolostrumu veya
fötal buzağı serumu ile inkube edilenlere oranla) belirgin azalma gözlendiği
belirtilmiştir. Rajapakse ve ark., (1994) serum ve kolostrum IgG1
fraksiyonunun invitro olarak hem larvalar üzerine, hem de farelere
verildikten sonra göç eden larvalar üzerine inhibitör etki yaptığını ve bunun
IgG2 fraksiyonun etkisinden daha büyük olduğunu, IgM’in de larvaları
inhibe ettiğini belirtmişlerdir.
Banerjee ve ark., (1998) enfekte sığır ve mandalarda çeşitli testlerle
T.vitulorum’a karşı antikorların saptamasından çok, gebe hayvanlarda
inhibe larva bulunup bulunmadığının belirlenmesinin önemli olduğuna
dikkat çekerek; indirekt haemagglutination (IHA) ve countercurrent
16
immunoelectrophoresis (CIEP) testlerinin sensitivite ve spesifitelerini
araştırmışlardır. Gebeliklerinin son üç ayında olan inek ve mandalardan
alınan serum örnekleri ve embriyonlu yumurtalardan hazırlanan antijenin
kullanıldığı çalışmada, testlerin konfirmasyonu serum örnekleri alınan gebe
hayvanların 1-1,5 aylık buzağı ve malaklarının dışkı kontrolleri ile
yapılmıştır. Doğal T.vitulorum enfeksiyonunun teşhisinde sırasıyla manda
ve ineklerde CIEP’nın daha spesifik (% 91,8 ve % 92,6), ama daha az sensitif
(% 82,1 ve % 81,8), IHA’nın daha az spesifik (% 85,7-% 86,3) ancak daha
sensitif (% 85,7-86,3) olduğu kaydedilmiştir. Banerjee ve ark., (1998) her iki
testte gözlenen yalancı pozitif ve negatifliğin açıklamasının tam
yapılamadığını, ancak testlerin standardizasyonu ile inhibe larvalar
yönünden ineklerin önceden ayrılabileceğini ve en uygun zamanda
yapılacak tedavi ile T.vitulorum’un eradikasyonunun mümkün olabileceğini
kaydetmişlerdir.
Starke-Buzetti ve ark., (2001) T.vitulorum enfektif larvalarından
hazırlanan soluble ekstrakt antijeni (Ex) kullanarak, buzağı ve malaklarda
immun yanıtı araştırmışlar ve antikor düzeyini indirekt ELISA testi ile
belirlemişlerdir. Malakların doğumdan sonra 15 gün ara ile 180.güne
kadar, mandalardan da perinatal dönemde alınan serum örneklerinin
işlendiği çalışmada, malak serumlarında en düşük ve en yüksek antikor
titrelerine 1 günlük olanlarda, sırasıyla kolostrum emmeden önce ve sonra
rastlanmıştır. Bu, antikorların orijininin kolostrum olduğuna işaret etmekte
olup, doğumdan sonra antikor düzeyinin süt emen malaklarda 15.güne
kadar yüksek düzeyde kaldığı, 15-30.günlerde azaldığı ve 120.güne kadar
nispeten stabilitesini koruduğu kaydedilmiştir. Hayvanlardaki parazit
durumunun bağışıklık yanıtları ile karşılaştırıldığı çalışmada, T.vitulorum
yumurtalarına dışkıda 30-60.günlerde fazla rastlanmasının, pasif olarak
kazanılan antikorların enfeksiyona karşı koruma meydana getirmediğini
gösterdiğini; 30-45.günlerde dışkıda saptanan maksimum yumurta sayısı
ile serum antikor düzeyindeki azalmanın eş zamanlı olduğu, azalmış halde
ancak serum antikor düzeyinin stabil olduğu 60-120.günlerde olgun
parazitlerin bağırsaktan atıldığı ve T.vitulorum yumurtalarına artık
rastlanmadığı; bunun da rezistans gelişmesini işaret ettiğini
kaydetmişlerdir. Araştırıcılar, T.vitulorum enfeksiyonlarında antikorların
17
potansiyel ve fonksiyonel koruyucu rollerinin ve self-cure (kendi kendini
sağaltım) olaylarının daha fazla araştırılması gerektiğine dikkat
çekmişlerdir.
Starke-Buzetti ve Ferreira (2004), Brezilya’da yaptıkları çalışmada;
T.vitulorum larvalarının eksresyon ve sekresyon (ES) antijenlerinin SDS-
PAGE yöntemi ile protein yapılarını belirlemeyi ve Western Blot (WB)
yöntemi ile enfeksiyona spesifik olanlarını saptamayı amaçlamışlardır.
Araştırma sürecinde birbirini izleyen dışkı yoklamaları ile malaklardaki
parazit durumunu da izleyen araştırıcılar, SDS-PAGE yönteminde (ES)
antijeni ile sekiz protein bandı oluştuğunu bunların 190, 150, 110, 90, 64,
56, 48 ve 19 kDa’luk bantlar olduğunu bildirilmişlerdir. Bu bantların
çoğunluğu WB yönteminde T.vitulorum’la enfekte mandaların hem serum,
hem de kolostrumunda tanımlandığını özellikle 190, 150, 110 ve 90 kDa
gibi yüksek moleküler ağırlıklı bantların daha belirgin olduğunu
vurgulamışlardır. Malaklarda bu bantlara yumurta atılımının dışkıda pik
yaptığı dönemde rastlandığı gibi, parazitlerin dışkı ile vücuttan atıldığı
dönemde de rastlandığı, ancak parazitlerin atılmasından sonraki periyotta
(118 ile 210.günler), serumdaki antikorların hiçbir bantla reaksiyon
vermediği bildirilmiştir. Araştırıcılar, kolostrum emmiş ve enfeksiyonun
hemen başlangıcında olan bir günlük malak serumlarının da, manda serum
ve kolostrumlarında olduğu gibi aynı bantlarla reaksiyon verdiğini
kaydetmişlerdir.
Souza ve ark., (2004) T.vitulorum ile doğal enfekte manda ve
malaklardan alınan kolostrum ve serum örneklerinde; soluble ekstrakt (Ex),
eksresyon / sekresyon (ES) larva antijenleri ile perienterik sıvı (Pe) olgun
parazit antijeni kullanılarak ELISA yöntemi ile antikor düzeyini
araştırmışlardır. Serum örnekleri mandalardan doğumdan sonraki ilk 365
gün, kolostrum örnekleri ilk 60 gün, malak serum örnekleri de ilk 365 gün
alınmıştır. Gerek manda, gerekse malaklarda hem serum, hem de
kolostrum örneklerinin hepsinde hazırlanan üç çeşit antijene karşı ELISA
ile antikor belirlendiği bildirilmiştir. Manda serumlarında (Ex), (ES) ve (Pe)
antijenlere karşı en yüksek antikor titrelerinin perinatal periyotta olduğu,
doğumdan sonra 300.güne kadar yüksek düzeyini koruduğu kaydedilmiştir.
18
Araştırıcılar, bu üç antijene karşı kolostrum antikor konsantrasyonunun
doğum sonrası ilk gün en yüksek olduğunu ve 15 gün içinde belirgin düşüş
gösterdiğini bildirmişlerdir. Đmmun yanıtın takibinde, malaklardaki parazit
durumunun da izlendiği çalışmada, malaklarda pasif olarak kazanılan
antikorlar en yüksek konsantrasyonda doğumdan 24 saat sonra saptanmış
ve 45.güne kadar, rastlansal olarak T.vitulorum enfeksiyonunun pik yaptığı
döneme kadar bu yüksek düzeyi korumuştur. Malakların parazitleri atması
ile antikor düzeyindeki düşmenin eş zamanlı ve en düşük düzeyin 76-
150.günlerde olduğu kaydedilmiştir. Souza ve ark., (2004) olgun
parazitlerin varlığı ve larvaların stimülasyonu ile daha sonra malaklarda
aktif immunitenin geliştiğini, serumda antikorların hafifçe artarak 211-
365.günlere kadar aynı seyrettiğini bildirmişlerdir. Bütün antijenlere karşı
malak serumlarında antikor belirlenmekle birlikte, özellikle 90 gün sonra
anti-(Pe) antikor konsantrasyonunun anti-(Ex) ve anti-(ES) antikorlarından
daha yüksek olduğu bildirilmiştir. Malaklarda pasif veya aktif kazanılan
antikorların, parazitlerin atılmasında ve intestinal reenfeksiyonlara karşı
korumada önemli rolü bulunduğu kaydedilmiştir.
Starke-Buzetti ve Ferreira (2005), T.vitulorum larva soluble extract
(Ex) antijeninin SDS-PAGE yöntemi ile karakterizasyonunu yapmayı ve
T.vitulorum’la doğal enfekte manda serum ve kolostrumu kullanarak WB
yönteminde spesifik olanlarını saptamayı amaçlamışlardır. Malaklardaki
parazit durumunun da birbirini izleyen dışkı yoklamalarıyla takip edildiği
araştırmada, (Ex) antijeninin SDS-PAGE ile 11 protein bandı (11, 13, 16,
22, 25, 32, 43, 53, 68, 82 ve 96 kDa) oluşturduğu, WB yöntemiyle enfekte
hayvan gruplarında kolostrum ve serum ile nispeten yüksek moleküler
ağırlıklı 5 bant (43, 53, 68, 82 ve 96 kDa) saptandığı bildirilmiştir. Bu
fraksiyonlar içinde 53, 68, 82 ve 96 kDa lık bantlar malaklarda daha
belirgin ve kalıcı olmuş, enfeksiyonun başlangıcında, yumurta atılımının
pik yaptığı, parazitlerin atılmasından sonraki dönemlerde de gözlenmiştir.
Araştırıcılar, bir günlük kolostrum emmiş henüz enfeksiyonun başında olan
buzağı serumlarında da, manda kolostrum ve serumlarındaki aynı
bantların oluştuğunu kaydetmişlerdir.
19
Ferreira ve Starke-Buzetti (2005), olgun T.vitulorum’lardan
hazırlanan (Pe) antijen ile SDS-PAGE ve WB yöntemi uyguladıkları
çalışmalarında (Pe) antijende 9 protein bandı (11, 14, 31, 38, 58, 76, 88,
112 ve 116 kDa) belirlendiğini, mandaların hem serum hem de
kolostrumlarında aynı bantlara rastlandığını kaydetmişlerdir. Malaklarda
kolostrum emdikten 1 gün sonra ve T.vitulorum enfeksiyonunun
başlangıcında alınan serumlarda da (Pe) antijenin 9 bandı tanımlanmıştır.
Kolostrum emen malaklarda; dışkı ile yumurta atılımının pik yaptığı,
parazitlerin atıldığı ve atıldıktan sonraki dönemlerde serum Tv-Pe-Antikor
reaksiyonunun değerlendirilmesinde düşük moleküler ağırlığı olan protein
bantlarının (11-76 kDa) kaybolduğu, yüksek moleküler ağırlıklı bantların
(88, 112, 165 kDa) ise kaldığı bildirilmiştir.
Iddawela ve ark., (2007) Toxocara canis, T.vitulorum, Ascaris
lumbricoides ve Necator americanus larva (ES) antijenlerinin SDS-PAGE ve
takiben WB ile değerlendirildiğini, visceral larva migransın teşhisinde
Toxocara canis 57 kDa’luk spesifik antikor fraksiyonunun (TcES-57) double
sandwich ELISA’da diğer etkenlerle çapraz reaksiyon vermediği için,
insanlarda T.canis’ten ileri gelen visceral larva migrans olaylarının
teşhisinde ayrım konusunda yararlı olabileceğini bildirmişlerdir.
Hassan ve Abdel Aziz (2010), T.vitulorum larvalarından (L2)
hazırlanan somatik antijen ve (ES) antijenlerinin ve doğal enfekte malak
hiperimmun serumu kullanarak, immunolojik yönden bağlanma
aktivitelerinin ELISA ile araştırılmasında, (ES) antijeninin daha etkili
bulunduğunu ve malaklarda toxocarosis’in % 73.8 teşhis edilebildiğini
bildirmişlerdir. Araştırıcılar, TvL2ES antijeninin yapısal karakterizasyonu-
nun belirlenmesinde SDS-PAGE yöntemi ile molekül ağırlığı 5-135 kDa
arasında 8 bant saptandığını, doğal enfekte malak serumları ile immunblot
uygulandığında; bu antijene ait yalnızca 71, 51 ve 24 kDa’luk üç bantın
kullanılabilirliğini saptamışlardır. Aynı antijenin serbest aminoasitler
yönünden analizinde; 18 kadar aminoasit belirlendiği, bunlardan tirozin ve
aspartik asitin yüksek oranda bulunduğunu kaydetmişlerdir.
20
Starke-Buzetti ve ark., (1996), mandalarda T.vitulorum (ES)
antijeninin intradermal enjeksiyonunda, antijene karşı enjeksiyon yapılan
deri bölgesinde nodül oluşmasının pozitif antikor reaksiyonu olarak kabul
edildiğini, nodüllerin bazı hayvanlarda hızlı (30 dakikada) bazen daha yavaş
(72 saatte) oluştuğunu bildirmişler, bundan teşhiste yararlanılabileceğini
kaydetmişlerdir.
Serolojik çalışmaların parazitlerin teşhisindeki önemleri yadsınamaz
olmakla birlikte, son yıllarda yeni nesil moleküler tanı yöntemi olan PCR da
kullanıma girmiştir (Jones ve ark., 2009; Wickramasinghe ve ark., 2009).
Wickramasinghe ve ark., (2009) aynı cinsten birbirine çok benzeyen, halk
sağlığını da yakından ilgilendiren köpek ve mandaların önemli iki paraziti
olan T.canis ve T.vitulorum’un ayrımında; moleküler markerleri belirlemeyi,
filogenetik durumlarını ve Toxocara cinsindeki genetik çeşitliliği ortaya
koymayı amaçlamışlardır. Araştırıcılar, doğru seçilecek moleküler
markerlerin, Toxocara türleri ile ilgili moleküler epidemiyolojik
araştırmalarda yararlı olacağına dikkat çekmişlerdir.
1.10. Toxocara vitulorum Enfeksiyonlarında Kontrol ve Tedavi
Toxocara vitulorum ile enfeksiyonun görüldüğü bölgelerde yeni doğan
buzağılarda anne sütü ile alınan larvaların sorun oluşturmaması için
doğumdan 2 ve 4 hafta sonra antelmentik uygulanmasının, böyle yörelerde
gebe hayvanlarda da doğum öncesi larvalara karşı uygun antelmentikle
sağaltım yapılmasının enfeksiyonları azaltabileceği bildirilmiştir (Roberts,
1989b; Roberts, 1993; Kassai, 1999; Schnieder, 2006; Taylor ve ark., 2007).
Koruyucu önlemlerin uygulanması ile kapalı sığır besiciliğinde
enfeksiyonun 3 yıl içerisinde eradike edilebileceği, özellikle genç buzağıların
klinik ve parazitolojik yoklamalarının muntazam yapılmasının, ahırların
temizlik ve hijyeninde kurallara uyulmasının önem taşıdığı kaydedilmiştir
(Roberts, 1989a; Kassai, 1999; Schnieder, 2000).
21
Nematodların sağaltımında kullanılan pek çok ilaç T.vitulorum’a
karşı da etkilidir. Bunlar arasında piperazin, benzimidazol, probenzimi-
dazol, imidazothiazol, tetrahidropirimidin, makrosiklik lakton grubu ilaçlar
sayılabilir (Roberts, 1989b; Kassai, 1999; Eckert ve ark., 2005; Schnieder,
2006; Taylor ve ark., 2007).
Adanır (2004), ilgili literatürlere atfen piperazin tuzlarının (sitrat,
adipat, fosfat, tartarat, sülfat, hidroklorit) T.vitulorum olgun formlarına karşı
200-300 mg/kg dozda bir hafta arayla 2 kez uygulanmasının önerildiğini
kaydetmiştir. Kassai (1999), piperazin tuzlarının T.vitulorum
enfeksiyonlarında en etkili ve aktif özelliğe sahip ilaç grubu olduğunu
bildirmektedir.
Benzimidazol grubu ilaçlardan fenbendazol ve albendazol 75 mg/kg,
oksfendazol 4,5 mg/kg dozda önerilmekte probenzimidazollerden febantel’in
7,5 mg/kg dozda T.vitulorum’un tüm gelişme dönemlerine etkili olduğu
kaydedilmektedir (Kassai, 1999). Đmidathiazol grubundan levamizol’ ün 7,5
mg/kg dozda kullanılmasının önerildiği ve dokularda daha uzun süre
kalmasından ötürü T.vitulorum larva dönemlerine de oldukça etkili olduğu,
enfekte gebe ineklere gebeliğin 7. veya 8. ayında endişe olmaksızın
uygulanabildiği, 1 g levamizol’un bu ineklerden doğan buzağılarda
enfeksiyonu azalttığı kaydedilmiştir (Kassai, 1999; Schnieder, 2006).
Tetrahidropirimidin grubu içinde morantel tuzlarının antelmentik
etkisinin pyrantel’den daha fazla olduğu, T.vitulorum‘a 6-10 mg/kg dozda
etkidiğini ilgili literatürlere atfen Adanır (2004) bildirmektedir.
Makrosiklik lakton grubundan ivermektin’in 0,2-0,3 mg/kg dozda,
moksidektin, doramektin’in 0,2 mg/kg dozda T.vitulorum’un tüm gelişim
dönemlerine etkili bulunduğu kaydedilmiştir (Kassai, 1999; Schnieder,
2006). Avcıoğlu ve Balkaya (2011a), Erzurum’da T.vitulorum’la enfekte
buzağılara 0,5 mg/kg dozda eprinomectin uygulandığında etkisinin % 100
bulunduğunu kaydetmişlerdir.
22
1.11.Tezin Amacı
Tropikal ve subtropikal iklim bölgelerinde, az gelişmiş veya gelişmekte olan
ülkelerde, bu arada Türkiye’de zaman zaman ve genellikle 6 aylıktan küçük
buzağılarda problem olan T.vitulorum’la ilgili hazırlanan bu tezde; şimdiye
dek daha çok dışkı, süt ve kolostrum yoklamaları veya otopsi bulguları ile
Türkiye’de varlığı kaydedilen bu parazitin serolojik teşhis olasılığını ortaya
konmak amaçlanmıştır. Serolojik testlerde uygulamak için seçilen test,
şüphesiz önem taşımakla birlikte, hazırlanan antijenlerin de test
sonuçlarında etkili olduğu bilinen gerçektir. Bazı antijenlerin serolojik
tanıda üstünlük taşıdığı veya bazı koşullarda uygulandığında üstün olduğu
bilinmektedir. Bu çalışmada, biri larva, diğeri olgun parazite ait iki antijen
hazırlanması, bunların protein analizlerinin yapılması ve elde edilecek
negatif ve pozitif serumlarla bunlardan hangilerinin T.vitulorum tanısında
spesifik olduğunu belirlemek hedeflenmiştir. Son yıllarda bu konuyla ilgili
bazı ülkelerde çalışmalar yapılmaya başlanmış olmakla birlikte, bunların
çok sınırlı olması, bazı sonuçların örtüşmemesi, Türkiye’de ise bu parazitle
ilgili benzer hiçbir çalışmanın bulunmaması amaçlanan tez projesinin
alanında önemli ve Türkiye için orijinal olduğunu göstermektedir. Araştırma
sonuçlarının; T.vitulorum için ilaç verilmesi gereken hayvanların ayrımında,
ilaç verilme zamanını belirlemede, gereksiz ilaç kullanımını ve bunun sütle
atılmasını engellemede, işletmeye yeni hayvan kabulü sırasında potansiyel
enfekte hayvanların ayrımında, enfekte olan, sağaltılan veya kendiliğinden
parazitleri atan hayvanların kanlarındaki proteinlerin yorumlanabilmesin-
de, süt/kolostrum örneklerinin incelenmesinde; diğer Toxocara’larla
antijenik yakınlığı belirlenme veya insanlardaki visceral larva migrans
olaylarında T.vitulorum’un payını belirleme konularında yapılacak
çalışmalara, yararlı olacağı veya ilk basamağı teşkil edeceği
düşünülmektedir.
Öte taraftan, antijen hazırlanması amacıyla enfekte hayvanları
bulma, materyal temin etme sırasında T.vitulorum ‘un yayılışı ile ilgili yeni
bilgilere ulaşmak mümkün olacak, bilgilerimiz güncelleşecektir.
23
2. GEREÇ VE YÖNTEM
Bu araştırma sahada ve laboratuarda yürütüldü. Laboratuar çalışmalarında
gerekli materyaller (dışkı, kan, parazit) Ankara Üniversitesi Hayvan
Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 2009-44-202 sayılı kararı ile uygun
bulunarak sağlandı (Bkz.EKLER, Ek-1). Bunun için önce saha
çalışmalarına yoğunlaşıldı. Toxocara vitulorum’la enfekte hayvanlar arandı.
2.1. Saha Çalışmaları
2.1.1. Dışkı Örneklerinin Alınması
Sığır askariti T. vitulorum’ la enfekte hayvanları dışkı yoklamaları ile
belirleyebilmek için; halk elinden, özel ve resmi kurumlardan; yaşları 0-6
aylık; yerli, kültür ırkı ve melez; her iki cinsiyetten 2393 buzağıdan dışkı
toplandı. Şekil 2.1 de Türkiye genelinde dışkı örneği alınan yerler ve örnek
sayıları, Çizelge 2.1 de Türkiye genelinde, Çizelge 2.2 de Ankara civarında
dışkı örneği alınan yerler ve örnek özelliklerine göre sayısal dağılımlar
verilmiştir.
Doğrudan rektumdan 3-5 g dışkı lastik eldiven giyilerek alındı, ters
çevrildikten sonra üzerine gerekli protokol bilgilerini içeren etiketler
yapıştırıldı. Dışkı örnekleri izoterm termos veya köpük kutu içinde 24-36
saatte laboratuara ulaştırıldı.
2.1.2.Toxocara vitulorum ile Enfekte Hayvanlara Dışkı Temini için
Yeniden Dönülmesi
Saha çalışmaları sırasında T.vitulorum ile enfekte bulunan veya
laboratuarda dışkı bakıları sonucu enfekte olduğu belirlenen hayvanlara,
ilk kayıt bilgileriyle geri dönülerek, araştırmanın laboratuar çalışmaları
sırasında (antijen hazırlamasında) gerekli olacak T.vitulorum yumurtalarını
temin etmek için bunlardan yeniden aynı şekilde (Bkz. 2.1.1) dışkı alındı.
Bu hayvanlardan kan örnekleri de temin edildi (Bkz. 2.1.4)
2.1.3.Parazitlerin Toplanması
Laboratuarda dışkı bakıları sonucu enfekte olduğu saptanan hayvanlara
piperazine hexahydrate (Siropar şurup-Adeka) 100 mg/kg olacak tarzda
24
25
26
uygulandı ve buzağıların askaritleri dökmesi sağlandı veya kendiliğinden
atılan parazitler dışkıdan toplandı. Yıkanan parazitler cam kavanoz içinde,
izoterm termosla aynı gün laboratuara ulaştırıldı.
Çizelge 2.2. Ankara civarında dışkı örneği alınan yerler, dışkıların alındığı
hayvanların cinsiyet ve ırk özelliğine göre sayısal dağılımı
* Öğrenci tatbikatları için satın alınan veya muayene için kliniklere getirilen halka ait hayvanlar 2.1.4.Kan Örneklerinin Alınması
Sahada veya dışkı yoklama sonuçlarına göre enfekte olduğu belirlenen
buzağılardan ve negatif olduğu kesinleşen buzağılardan 21 G (0.80 mm) X
1-1/2 (38 mm)- Exel.Int marka iğne ile 8 ml’lik silikonlu tüplere (2 Serum
Sep.Clot.Activator- Vacuette) vena jugularis’ten kan alındı ve aynı gün
izoterm termos içinde laboratuara getirildi.
Materyal Alınan Yerler
Toplam Dışkı Sayısı
Dışkıların Sayısal Dağılımı
Cinsiyete Göre
Irka Göre
♂ ♀ Siyah
Alaca
Siyah Alaca melez
Yerli Kara
AÜ Veteriner Fakültesi Klinikleri * 12 6 6 12
Eskişehir yolu 11 5 6 11
Gölbaşı 10 4 6 10
Gölbaşı (Bezirhane köyü) 45 25 20 45
Temelli (Çokören köyü) 5 2 3 5
Sincan (Yenikent) 23 6 17 23
Kalecik 23 10 13 12 11
Çubuk (Akkuzular köyü) 15 11 4 15
Çubuk (Sünlü köyü) 14 8 6 14
Altındağ (Tatlar köyü) 17 9 8 17
Mamak (Kutludüğün köyü) 21 12 9 14 7
Güdül (Yeşilöz Güdül köyü) 15 3 12 15
Kalecik (Değirmenkaya köyü) 19 8 11 13 6
Akyurt 7 4 3 7
Kazan (Kılıçlar köyü) 11 6 5 11
Toplam 248 119 129 202 7 39
27
2.2. Laboratuar Çalışmaları
2.2.1. Dışkı Muayeneleri
2.2.1.1. Fulleborn Doymuş Tuzlu Su Flotasyon Yöntemi
Dışkıdan 3 g ayrılarak 50 ml alabilecek kapasitede düz kenarlı bir kaba
kondu. Üzerine doymuş tuzlu su (Özgül ağırlık 1,18-1,20) az miktarda
eklendi. Bir lamın kısa kenarı ile ezilerek karıştırıldı ve aynı büyüklükte
diğer bir kaba ince tel süzgeçten geçirilerek süzüldü. Süzüntü üzerine kap
üst kenarına 3-4 mm kalana kadar tekrar doymuş tuzlu su ilave edildi ve
18 mm’ lik iki lamel su yüzeyine yüzer durumda bırakıldı. Yirmi dakika
sonra, bu lamellere tutunan damla düşürülmeden kalın uçlu bir pensle lam
üzerine taşındı ve mikroskop altında incelendi (Kaya, 2003).
2.2.1.2. Modifiye McMaster Yöntemi ile Yumurta Sayımı
Flotasyon yönteminde pozitif bulunan dışkılarda (10x10 büyütmede bir
mikroskop sahasında 0-1 yumurta gözlenen dışkılar hariç) gram dışkıdaki
yumurta sayısını belirlemek için kullanıldı. Dışkıdan 3 g tartıldı, 42 ml su
ve 45 adet cam boncukla birlikte 120 ml’ lik cam şişeye yerleştirildi ve
kapağı kapatıldı. Çalkalanarak dışkının iyice parçalanması sağlandıktan
sonra, bir kaba 0,15 mm’ lik elekten geçirilerek süzüldü. Đyice
karıştırıldıktan sonra kaptaki süzüntüden puarlı pipet ile 15 ml’ lik
santrifüj tüpüne dolduruldu ve 1500 rpm de 2 dakika santrifüj edildi.
Takiben üstteki kısım atılarak, dipteki sediment üzerine doymuş tuzlu su
ilave edildi. Tüp ağzı parafilm ile kapatılıp, alt-üst hareketlerle çalkalanarak
homojen hale getirildi. Sonra, bu süspansiyondan puarlı pipet ile McMaster
lamının her biri 0,15 ml hacminde olan kameralarına dolduruldu. Beş
dakika beklenerek yumurtaların yüzmesi sağlandı. Mikroskop altında
McMaster lamının her iki kamerasında sayılan yumurta miktarı 50 ile
çarpılarak gram dışkı yumurta sayısı hesaplandı (Anon, 1971).
2.2.2. Toxocara vitulorum Yumurtalarının Toplanması ve Geliştirilmesi
28
2.2.2.1.Enfekte Dışkılardan Yumurtaların Toplanması ve Geliştirilmesi
Bunun için dışkılar büyük porsiyonlar halinde önce sedimentasyon yöntemi
ile hazırlandı. Bir kap içinde cam baget yardımı ve çeşme suyuyla iyice
karıştırılan (150-200 g) dışkı, tel süzgeçten geçirilerek, kaba partikülleri
uzaklaştırıldı ve süzüntü 1 lt’lik beherde toplandı. Yarım saat dinlenmeye
bırakıldı. Bu süre sonunda dipteki sediment kısmı oynatılmadan üstteki
sıvı kısım çekildi, yeniden su ilave edilerek tekrar beklendi. Bu işlem 5-6
kez yarımşar saat ara ile tekrarlanarak, ortamdan mümkün olduğunca
dışkının uzaklaştırılması sağlandı. Daha sonra santrifüj flotasyon yöntemi
uygulandı. Porsiyonlar halinde sediment kısmı 50 ml’ lik santrifüj tüplerine
aktarıldı, üzerine doymuş tuzlu su ilave edildi ve1500 rpm’ de 2 dakika
santrifüj edildi. Santrifüj sonrası tüpün üst kısmından bir öze yardımı ile
toplanan yumurtalar, distile su içeren behere aktarıldı. Dipteki sediment
her seferinde bagetle iyice karıştırılarak hiç yumurta görülmeyene kadar
santrifüj işlemi tekrarlandı. Beherde toplanan yumurtalar, üstteki 150 µm
ve alttaki 38 µm göz açıklığı olan eleklerden geçirilerek dışkı tamamen
uzaklaştırıldı. Daha sonra alt süzgeç üzerindeki yumurtalar distile su dolu
piset yardımı ile kenarda toplandı ve büyük petri kutusuna aktarıldı.
Mantarlaşmayı önlemek amacı ile birkaç damla sodyum hipoklorit
solusyonu (%1 lik) damlatıldı ve hemen kullanılmayacaksa buzdolabında
saklandı. Gerektiğinde PBS (Phosphate Buffered Saline 0,1 M, pH 7,5 )
içine alınıp oda ısısında gelişmeye bırakıldı. Gelişme sırasında yumurtalar
her gün fırçalanarak gerekli oksijen sağlandı, mantarlaşmayı önlemek
amacıyla sodyum hipoklorit solüsyonundan damlatıldı. Duruma göre PBS
eklendi veya değiştirildi. Gelişmeler, yumurta örnekleri lam lamel arasına
alınarak x 10 ve x 40 objektifte mikroskop altında izlendi.
2.2.2.2. Dişi Parazitlerden Yumurtaların Toplanması ve Geliştirilmesi
Steromikroskopta, az miktarda distile su içeren büyük petri kutusunda dişi
parazitlerin gelişmiş yumurtalarının bulunduğu uterus bölümü (diğer doku
kısımları ile karışmadan) disseke edilerek, başka bir petri içine alındı,
açılarak yumurtaların serbest kalması sağlandı. Đnce bir süzgeçten geçirilip,
29
bir beherde toplanan yumurtaların çökmesi sağlandı, birkaç kez distile su
ile yıkandı. Bu yumurtalar, enfekte dışkılardan toplanan yumurtalarda
olduğu gibi (Bkz: 2.2.2.1) saklandı, geliştirildi ve gelişmeleri izlendi.
2.2.3. Kan Serumlarının Çıkarılması ve Saklanması
Laboratuara getirilen kanlar soğutmalı santrifüjde (Hettichzentrifugen Micro
22R) 2000 rpm’ de 6 dakika santrifüj edilerek serumları çıkarıldı. Đleride
kullanılmak üzere 1,5 ml’ lik eppendorflara alınarak ve üstlerine gerekli
bilgiler kaydedilerek bir gece -200 C’de, sonra -800 C’de kullanılıncaya kadar
saklandı.
Bu çalışmada Western Blot uygulamasında (Bkz:2.2.6) (Ex) antijeni
için pozitif 6, negatif 7 (4 saha, 3 fötal) ; (Pe) antijeni için pozitif 6, negatif 6
(2 saha,4 fötal), serum kullanıldı. Fötal buzağı serumları Viroloji Anabilim
Dalı’ndan temin edildi.
2.2.4. Antijenlerin Hazırlanması
2.2.4.1. Toxocara vitulorum Larva Soluble Ekstrakt Antijeni (Ex) Hazırlanması ve Protein Tayini
Toxocara vitulorum larva soluble ekstrakt antijeni (Ex) hazırlanmasında
Souza ve ark., (2004)’ nın daha önce Starke-Buzetti ve ark., (2001)’ından
alarak, uyarladıkları yöntemden bazı modifikasyonlarla yararlanıldı.
Đçlerinde enfektif larva gelişen yumurtaları içeren süspansiyon 15 ml’ lik
santrifüj tüpüne konuldu, üzerine 15 ml olana kadar distile su ilave edildi
ve 220 C’de 1500 rpm’de 3 dakika santrifüj (Hettichzentrifugen micro 22 R)
edildi. Üstten 11 ml pipetör (Thermo Scientific FinnpipetteR) ile çekildi, geri
kalan sedimente eşit miktarda ticari sodyum hipoklorit (% 14 chlorine)
solüsyonu eklendi ve oda sıcaklığında 20 dakika beklenerek, yumurtaların
kabuğunun tamamen soyulması sağlandı. Bu süre sonunda üstteki sıvı
pipetör ile çekildi, 15 ml’ ye kadar PBS ile tamamlandı. Ortamdaki
sodyumhipokloridi tamamen uzaklaştırmak amacı ile 10 kez PBS
değiştirilerek 200 C’de 460 g’de 2’ şer dakika santrifüj edildi. Santrifüj
sonunda yumurta süspansiyonu 370 C lik su banyosunda alındı, 60 dakika
30
tutuldu. Bu süre içinde zaman zaman pastör pipeti ile hava verilerek
larvaların yumurtadan çıkması stimüle edildi. Daha sonra 200 C’de 460 g’
de 2 kez üstten PBS çekmek suretiyle 2’şer dakika santrifüje edildi.
Santrifüjden sonra 1,5 ml’ lik eppendorf tüpüne aktarıldı ve son kez aynı
şekilde santrifüj edildi. Tüpün darası düşülerek dipteki larva peletinin
ağırlığı hassas terazide belirlendi. +40 C’de ultrasonikatörden (Sonic
Vibrocell) geçirildi (3 kez 15 sn tutuldu, 45 sn bırakıldı). Ultrasonikasyon
sonrası larva solüsyonuna toplamda % 40 olacak şekilde proteaz inhibitörü
* (Intron PRO-PREPTM 17081) eklenerek, vortekslendi. Bir gece +40 C’de
bekletildi. Daha sonra önce 690 g’ de 10 dakika, takiben 100 C’de 3700 g’ de
30 dakika santrifüj (Sigma Laboratory Centrifuges 3K30) edildi.
Hazırlanan (Ex) antijeni 500 µl hacimlerde porsiyonlanarak -800 C’de
kullanılıncaya kadar saklandı.
Hazırlanan (Ex) antijenin protein miktarı spektrofotometrede ölçüldü.
(Picodrop µl Spectrophotometer release V 208- Cursor wavelenght 280, A
280 10 mm Path 7,5 mg/ml, 260/280, 1,03 yapıldı).
2.2.4.2. Olgun Toxocara vitulorum Perienterik Antijeni (Pe) Hazırlanması ve Protein Tayini
Perienterik antijen yapımında Ferreira ve Starke-Buzetti (2005)’ in
Amerasinghe ve ark., (1992)’den uyarladıkları prosedür bazı
modifikasyonlarla uygulandı.
Bunun için olgun erkek ve dişi T.vitulorum’ların posterior ucu
hipodermik iğne (BD U-100 1 ml) ile delindi ve perienterik sıvı çekilerek
steril 15 ml’ lik santrifüj tüplerine kondu. 460 g’ de 5 dakika santrifüj
edildi. Santrifüj sonrası üst kısım 0,2 µm göz açıklığı olan membran
filtreden (Nalgene) süzüldü. Sonra her 10 ml antijen solüsyonu için 1 ml
proteaz inhibitörü (Intron PRO-PREP TM 17081) ilave edildi.
------------------------------------------- *Proteaz inhibitörü: PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride), EDTA (ethylendiamine tetraacetic acid),Pepstatin A, Leupeptin, Aprotinin
31
Hazırlanan (Pe) antijen 500 µl hacimlerde porsiyonlandı ve -80º C’de
kullanılıncaya kadar saklandı.
Hazırlanan (Pe) antijenin protein tayini spektrofotometrede (Picodrop
µl Spectrophotometer release V 208 – Cursor wavelength 280, A 280 10 mm
Path 20,56 mg/ml, 260/280, 0,88) yapıldı.
2.2.5. (Ex) ve (Pe) Antijenlerinin SDS-PAGE Yöntemi ile Protein Analizi
SDS-PAGE yönteminin amacı, hazırlanan antijenlerin elektroforezlerini
yapmak ve proteinlerini molekül ağırlıklarına göre ayırmaktır.
Thermo Electron Corporation EC120 MINI Vertical Gel Elektroliz
tankının, temizlenerek hazırlanmış düzeneğine Resolving gel* dökülerek, 30
dakika polimerizasyon için beklendi. Daha sonra Stacking gel** döküldü,
tarakların yerleştirilmesinden sonra polimerizasyon için aynı süre beklendi
(% 5 stacking gel, % 12 resolving gel). Taraklar çıkarıldıktan sonra düzenek
ana tanka yerleştirildi, elektroforez tamponu 1xSDS Buffer*** eklendi.
(Ex) antijeni 1/1, 1/5, 1/10 oranlarında, (Pe) antijeni 1/5, 1/10,
1/20, 1/40 oranlarında distile su ile sulandırıldı. Denatürasyon amacıyla
aynı miktarda 2xloading buffer**** ile karıştırılarak 970 C’de kuru ısı
bloğunda 7 dakika bekletildi. Bu süre sonunda her iki antijen 20 µl, protein
standardı (SM – 1811 Fermantas, Range 10-250 kDa) ise 5 µl miktarında
jeldeki kuyucuklara yüklenerek, ortalama 60 mA de yürütüldü. Jellere
----------------------------------- * Resolving gel: 5.7 ml Resolving buffer (18.15 g Tris base, yaklaşık 80 ml distile suda eritilir pH 8.8 olacak şekilde 100 ml’ye tamamlanır, 3.3 ml % 30 Acrylamide (29.2 g acrylamide, 0.8 g NN-bis-methylene acrylamide, 70 ml distile suda eritilir. Toplam hacim 100 ml olacak şekilde filtre kağıdından geçirilir) 100 µl % 0.9 Amonyum Persulfate (900 µl distile su, 0,10 gr APS) 10 µl TEMED. ** Stacking gel: 2.03 ml Stacking buffer (6 g Tris base, yaklaşık 80 ml distile suda eritilir pH 6.8 olacak şekilde 100 ml’ye tamamlanır.) 600 µl % 30 Acrylamide, 30 µl % 0.9 APS, 4 µl TEMED. *** 1xSDS Buffer: 5xSDS buffer=9 g Tris, 43.2 gr Glisin, 3 g SDS toplam hacim 600 ml olacak şekilde distile su ile tamamlanır. 1’e 5 oranında sulandırılır.
**** 2x Loading Buffer: %2 SDS, %20 Gliserol, 20mM Tris-Cl (pH6.8), 2mM ethylene daimine tetraacetic acid (EDTA) 160 mM dithiothreitol, 0.1 mg/ml Bromphenol blue.
32
gümüş boyama yapıldı. Boyamada PAGE SĐLVERTM (K0681 – Fermantas)
tarafından önerilen prosedüre uyuldu. (Pe) antijende 1/5 sulandırmanın
(Ex) antijeninde ise 1/1 sulandırmanın Western Blot için uygun olduğu
belirlendi. Jeller Gel-logic 100 Imaging System ile görüntülendi.
2.2.6. Western Blot Uygulaması SDS-PAGE de belirlenen proteinlerden immunodominant olanlarını
saptamak amacı ile Western Immunoblot yöntemi uygulandı. Bu yöntem ve
yöntemin uygulanması sırasında kullanılan solüsyonlar Sambrook ve ark.,
(1989)’a göre hazırlandı. Proteinlerin nitroselüloz membrana aktarılıp
Immunoblot yönteminin uygulanabilmesi için; antijenlerin 2.2.5 de tarif
edildiği şekilde elektroforetik separasyonu yapıldıktan sonra proteinlerin
bulunduğu jel elektroforez tankından alınarak, filtre kağıtları ve nitroselüloz
membran ile semi dry transfer buffer’ da* 15 dakika bekletildi.
Western Blot cihazına (CBS Scientific Co, EBU-4000 model) (4 Filtre
kağıdı + Nitroseluloz membran + Jel + 4 Filtre kağıdı) yerleştirildi. 20 mA’ de
ve 50 dakika süreyle proteinlerin nitroselüloz membrana transferi sağlandı.
Spesifik olmayan bağlanmaları engellemek amacıyla membran % 3
süt tozu içeren 1xTBS** içerisinde 5 saat süreyle bloklandı ve yıkama
işlemine tabi tutuldu. Yıkama horizontal çalkalayıcıda 2 kez 3’er dakikalık
1xTBS*** ve 1 kez 7 dakikalık 1xTBS-Tween**** kullanılarak yapıldı.
Her membran 7 ml 1xTBS+Süt tozu karışımı ve 700 µl serum
(pozitif, negatif veya fötal serum)’ la 50 ml’lik falcon tüp içinde oda
sıcaklığında bir gece shakerde bekletildi. Daha sonra serumla işlenen
nitroselüloz membranlar, 2 kez 5’şer dakika 1 x TBS - Tween’de, 2 kez 5’er
dakika 1 x TBS de yıkandı.
---------------------------------------------- * Semi dry transfer buffer: 3.03 gr Tris, 14.4 g Glisin, 200 ml Methanol toplam hacim 1000 ml olacak şekilde distile su ile tamamlanır.
** 1 x TBS +Süt tozu: 3 gr Süt tozu + 100 ml 1 x TBS
***1 x TBS: NaCl 900 gr, Trisbase 96,8 gr, distile su 4 lt (10xTBS) 1x’ya sulandırılır. **** 1x TBS Tween: 100 ml x 1 TBS, 500 µl Tween – 20.
33
Nitroselüloz membranlar TBS içine titresi oranında sulandırılarak
konulan antibovine IgG (A8917-Sigma) konjugat ile (16 ml TBS, 5 µl
konjugat) bir saat oda sıcaklığında inkube edildi. Đnkubasyon sonrası 2 kez
5’er dakika 1 x TBS – Tween’de, 2 kez 5’er dakika 1 x TBS de tekrar yıkanan
nitroselüloz membranlarda reak-
siyonun görünebilir hale getirilmesi için 5 ml distile suda eritilerek
hazırlanan di-aminobenzidin (DAB)- UREA substrat tabletleri (D4293-
Sigma) kullanıldı.
Bantlar iyice belirginleştikten sonra reaksiyonun sonlandırılması
için çeşme suyu ile yıkama yapıldı. Filtre kağıdı ile kurutulan membranlar
protein standarttı, (SM-1811 Fermantas, Litvanya - Range 10-250 kDa) ile
hizalanarak değerlendirilmek üzere fotoğrafları çekildi.
34
3. BULGULAR
3.1. Toxocara vitulorum’un Aranmasına Yönelik Dışkı Bakısı Bulguları
Değişik 22 ilden; yaşları 0-6 aylık; halk elinden, özel ve resmi kurumlardan;
yerli, kültür ırkı ve melez; her iki cinsiyetten 2393 buzağıya ait dışkının
laboratuarda Fulleborn doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile kontrolünde
28 örnekte (% 1,17) Toxocara vitulorum yumurtalarına rastlandı. Yumurta
saptanan dışkı örneklerinin Ankara, Düzce ve Erzurum illerine ait
örnekler olduğu görüldü. Çizelge 3.1. de enfekte buzağılarla ilgili bilgiler
verilmiştir.
Çizelge 3.1. Toxocara vitulorum’la enfekte buzağıların illere, cinsiyet ve ırka göre sayısal dağılımı Enfekte buzağıların bulunduğu iller
Toplam il dışkı sayısı
Enfekte buzağı
Enfekte buzağıların sayısal dağılımı
sayısı
(%) si
Cinsiyete göre
Irka göre
♂
♀ Esmer Esmer
melez Siyah Alaca
Doğu Anadolu Kırmızısı
Ankara 248 6 2.41 3 3 - - 6 -
Düzce 20 2 10.00 - 2 - 2 - -
Erzurum 99 20 20.20 10 10 16 - - 4
Enfekte bulunan dışkıların ortak özelliği yaşları 0-6 aylık, hepsi halk
elindeki / özel işletmelerdeki buzağılara ait olmasıdır. Resmi kurumlara ait
buzağı dışkılarında ise enfeksiyona rastlanmadı.
Enfekte dışkıların hepsinin sıvı veya yumuşak kıvamlı olduğu
gözlendi. Rektumdan alınarak ters çevrilmiş lastik eldiven içinde
laboratuara getirilen dışkıların, hazırlanmak üzere açılmasında bazılarında
kuvvetli sarımsak kokusu dikkati çekti.
Fulleborn doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile hazırlanan buzağı
dışkılarında T.vitulorum yumurtaları hafif ovalimsi veya küresel formda,
renksiz kalın kabuklu, kabuk yüzü pütürüklü, hemen hemen yumurta
boşluğunu tam doldurur tarzda koyu renkli blastomer içerir şekilde
gözlendi. Mikroskopta T.vitulorum yumurtaları 90,5 (78,7-103,3)µm x 76,4
(68,8 – 89,5) µm boyutlarında ölçüldü (Şekil 3.1.).
35
Şekil 3.1. Toxocara vitulorum yumurtası
Fulleborn doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile hazırlanan ve
T.vitulorum yumurtalarına rastlanan dışkılardan; 10x10 büyütmede bir
mikroskop sahasında 0-1 yumurta gözlenen 12 dışkı hariç, gram dışkı
yumurta sayısı modifiye McMaster tekniği ile 5925 (2650-10250) olarak
belirlendi. Çizelge 3.2. de enfekte buzağıların gram dışkı yumurta sayıları
(epg) gösterilmiştir.
Çizelge 3.2. Enfekte buzağıların gram dışkı yumurta (epg) sayıları
Enfekte buzağıların bulunduğu iller
Enfekte buzağı sayısı
McMaster yöntemi uygulanan dışkı
sayısı *
Gram dışkı yumurta sayısı (epg)
ort. (min.-mak.)
Ankara
6
4
6075 (3050-9250)
Düzce
2
2
9850 (9450-10250)
Erzurum
20
10
5080 (2650-8550)
28 16 5925 (2650-10250)
*Flotasyon yönteminde 10x10 büyütmede bir mikroskop saha- sında 0-1 yumurta görülen dışkılarda sayım yapılmadı.
36
3.2. Toxocara vitulorum Larva Ekstrakt (Ex) Antijeni Hazırlanması ile
Đlgili Yumurta/Larva Bulguları
Gerek dışkıdan, gerekse parazitlerden elde edilen kullanılmak üzere
buzdolabında saklanan T.vitulorum yumurtaları, (Ex) antijeni hazırlanacağı
zaman PBS içeren büyük petri kutularında, oda sıcaklığında gelişmeye
alındı. Yumurta içinde larva gelişmesinin 17-40 günde olduğu gözlendi.
Aynı kültürde bile yumurtaların hepsinde larvaların eş zamanlı gelişmediği
(Şekil 3.2) her kültürde % 1-2 oranında normal görünümlü ama gelişmeyen
yumurtalara rastlandığı saptandı. Şekil 3.3. de oda sıcaklığında T.vitulorum
yumurtalarında gelişim plate olarak verilmiştir.
Şekil 3.2. A-B Toxocara vitulorum yumurta kültürlerinde eş zamanlı olmayan gelişim
Toxocara vitulorum yumurtalarından (Ex) antijeni hazırlanmasında;
gerekli işlemler sonrası su banyosunda tutulan kabuğu soyulmuş larvalı
yumurtalara zaman zaman hava verilerek larvaların çıkması stimüle
edildiğinde, 1 saat sonunda larvaların çoğunun yumurtayı terk ettiği ve
aktif oldukları gözlendi. Larva çıkışı sırasında büyüyen larvanın aktifliğine
ve zaten incelmiş olan yumurta kabuğuna bağlı olarak, deforme olmuş
yumurta formları saptandı. Şekil 3.4. de Toxocara vitulorum
yumurtalarından larva çıkışı ve larvalar plate olarak verilmiştir.
Yumurtadan çıkan T. vitulorum larvaları 448,4 (452,6-516,6) µm
boyda 20,1 (14,7-24,6) µm eninde ölçüldü (Şekil 3.5).
A B
37
Şekil 3.3. Oda sıcaklığında Toxocara vitulorum yumurtalarında gelişim
17.gün
1.gün
38
Şekil 3.4. Toxocara vitulorum yumurtalarından larva çıkışı ve sonikasyon
öncesi larvalar. A-B: Kabuğu soyulmuş yumurtalar (Yumurta deformasyonu okla gösterilmiştir.) C1,C2,C3: Yumurtalardan larva çıkışı D: Kabuğu soyulmuş yumurtalar ve larvalar E-F: Larvalar G: Boşalan yumurta
GF
E D
C3 C2 C1
39
Şekil 3.5. Toxocara vitulorum larvası
3.3. Toxocara vitulorum Olgun Perienterik (Pe) Antijeni Hazırlanması ile Đlgili Bulgular
Saha çalışmaları sırasında toplanan T.vitulorum erkekleri 11,0-17,0 cm
boyda 3,5-4,5 mm ende, dişileri 16,0-25,0 cm boyda, 4,5-5,0 mm ende
ölçüldü. Şekil 3.6 de dişi ve erkek T.vitulorum’ lar görülmektedir.
Şekil 3.6. Dişi ve erkek Toxocara vitulorum’lar
40
Laboratuar çalışmaları sırasında, (Pe) antijen hazırlamak için
perienterik sıvının çekilmesinde, daha büyük olması nedeniyle dişi
parazitler kullanıma daha uygun bulundu. Büyük parazitler T.vitulorum
yumurtalarının elde edilmesinde disseksiyon kolaylığı sağladığı gibi,
bunlardan daha fazla yumurta elde edilebildi.
3.4. Toxocara vitulorum Soluble Larva Ekstrakt (Ex) ve Olgun Perienterik (Pe) Antijenlerinin SDS-PAGE ile Karakterizasyonu
Hazırlanan antijenlerin protein miktarlarının spektrofotometre ile yapılan
ölçümlerinde; (Ex) antijeni için protein konsantrasyonu 7,5 mg/ml, (Pe)
antijen için 20,56 mg/ml olarak belirlendi.
Yapılan SDS-PAGE analizleri sonrasında genel bakıda (Ex)
antijenlerinin, perienterik (Pe) antijenlere oranla sayısal anlamda daha
çeşitlilik gösterdiği tespit edildi. Bireysel olarak yapılan değerlendirmelerde
(Ex) antjenlerinin elektroforetik separasyonu sonrasında; moleküler
ağırlıkları 14-150 kDa arasında değişen proteinler gözlenirken (Pe)
antijenlerinin elektroforetik separasyonu sonrasında büyüklükleri 12-141
kDa arasında değişen protein bantları elde edildi (Şekil 3.7).
41
Şekil 3.7. Toxocara vitulorum antijenlerinin SDS-PAGE analizi. Hat 1. Geniş ölçülü protein marker (Fermentas, Litvanya); Hat 2. Perienterik (Pe) antijen profili; Hat 3. Ekstrakt (Ex) antijeni profili.
3.5. Toxocara vitulorum (Ex) Antijenlerine Özgül Antikorların
Đmmunoblotting ile Araştırılması
Toxacara vitulorum (Ex) antijenlerinin nitroselüloz kağıda transfer
edilmesinden sonra negatif olduğu bilinen serum örnekleri (4 saha ve 3
fötal) ile yapılan immunoblotting analizi sonrasında hiçbir örnekte reaktif
bant tespit edilmedi (Şekil 3.8.A). Pozitif olarak çalışmaya dahil edilen 6
serum örneği ile yapılan immunoblotting uygulaması sonrasında ise 14, 35,
56, 63, 68 ve 94 kDa moleküler ağırlıktaki protein bantlarının immuno-
reaktif oldukları tespit edildi (Şekil 3.8.B). Özellikle 14 kDa ağırlıktaki
proteine ilgili bant 2 örnekte daha güçlü, 1 örnekte ise oldukça zayıf olarak
tespit edildi. Diğer tüm bantların reaktivite özellikleri identik olarak
kaydedildi.
42
Şekil 3.8. Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerine karşı negatif (A) ve pozitif sığır serumları (B) ile yapılan Western Blot analizi
A: Hat 1 marker, Hat 2-5 saha, Hat 6-8 fötal negatif serumlar B: Hat 1 marker, Hat 2-7 pozitif serumlar
A
B
43
3.6. Toxocara vitulorum (Pe) Antijenlerine Özgül Antikorların Đmmunoblotting ile Araştırılması
Toxacara vitulorum (Pe) antijeni ile yapılan immunoblotting çalışması
sonrasında negatif kontrol serumlarının (2 saha, 4 fötal) söz konusu
antijenlere reaktif olmadıkları gözlendi (Şekil 3.9.A). Pozitif serum örnekleri
(6 adet) ile yapılan immun boyamalar sonrasında ise tüm örneklerin 2 adet
protein (96 ve 110 kDa) ile benzer yoğunlukta reaktif oldukları tespit edildi
(Şekil 3.9.B).
44
Şekil 3.9. Toxocara vitulorum (Pe) antijenlerine karşı negatif (A) ve pozitif sığır serumları (B) ile yapılan Western Blot analizi
A: Hat 1 marker, Hat 2-5 fötal, Hat 6-7 saha negatif serumlar B: Hat 1 marker, Hat 2-7 pozitif serumlar
A
B
45
4. TARTIŞMA
Malak ve buzağılarda anemi, ishal, kilo kaybı ile seyreden bazen de
ölümlere yol açan T.vitulorum’un dünyanın geri kalmış ve gelişmekte olan
ülkelerinde hala sorun olmaya devam ettiği görülmektedir (Barbarosa ve
ark., 1992; Kassuku ve ark., 1996; Samed ve ark., 2004; Raza ve ark.,
2007; Sackey ve ark., 2007; Braga ve ark., 2010).
Türkiye’de T.vitulorum’un küçük geviş getiren hayvanlarda
bulunduğuna ilgili kayıt yoktur, mandalardaki yayılış oranı ise
bilinmemektedir. Sığırlarda daha çok dışkı yoklamalarına (Güralp ve ark.,
1985; Toparlak ve ark., 1989; Umur ve Gıcık, 1995; Toparlak ve ark., 1996;
Aydenizöz ve ark., 1999; Altınöz ve ark., 2000; Yıldırım ve ark., 2000; Aydın
ve ark., 2001; Göz ve ark., 2006; Arslan ve ark., 2008; Avcıoğlu ve Balkaya,
2011b), daha az süt ve kolostrum yoklamalarına (Akyol, 1993; Adanır,
2004) veya otopsi bulgularına dayanan (Merdivenci, 1970; Günay, 1990;
Arslan ve ark., 1997) kayıtlar bulunmaktadır.
Bu kayıtlar arasında Aydın ve ark., nın (2006) T.vitulorum için
Hakkari’de tüm yaş gruplarında % 28,96, 1-6 aylıklarda % 34,4 olarak
belirttikleri yayılış oranı Türkiye için bölgesel en yüksek kayıttır. Van’da 8
aylığa kadar olan buzağılardaki % 17,7 (Göz ve ark., 2006) Erzurum’da 6
aylığa kadar olanlarda % 24, genel % 22,2’lik yayılış oranları da çok
yüksektir (Avcıoğlu ve Balkaya, 2011b). Bu araştırmada yaşları 0-6 ay olan
2393 buzağıya ait dışkıların 28’inde (% 1,17) T.vitulorum yumurtalarına
rastlandı, yayılış oranı bu literatür sonuçlarına oranla düşük bulundu.
Türkiye genelinde T.vitulorum’un yayılışını belirlemeye yönelik tek
çalışma Güralp ve ark., (1985) tarafından yapılmış olup, 1150 dışkının
incelenmesinde 9’unda (% 0,8) yumurtalara rastlandığı bildirilmiştir.
Güralp ve ark., (1985), Türkiye geneli için saptadıkları % 0,8’ lik yayılış
oranının çok düşük olmasını dışkıların çoğunluğunun kamu
kuruluşlarındaki hayvanlardan alınmış olmasına bağlamışlar, ancak yaş
46
yelpazesinin de geniş tutulmuş olmasının (1-2 yaşa kadar), bu düşük
orandaki etki payını irdelememişlerdir.
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarına en çok 1-3 aylık buzağılarda
rastlandığı, 6 aylıktan büyük hayvanlarda rastlanma olasılığının azaldığı
veya hiç rastlanmadığı belirtilmektedir (Kassai, 1999; Anderson, 2000;
Davila ve ark., 2010). Bu araştırmada; her coğrafi bölgeye en az 1 il düşecek
şekilde rastgele örnekleme ile seçilen 22 ilden; değişik ırklardan; her iki
cinsiyetten; halk eli, özel ve resmi kurumlara ait hayvanlardan dışkı alındı.
Dışkı alınan hayvanlarda yaşın 0-6 ay olması tek ortak parametre olarak
belirlendi. Bunun amacı; T.vitulorum için işaret edilen yaş grubuna
yönelmek ve laboratuar çalışmaları için gerekli dışkı, kan ve parazit
materyalini biran önce sağlamaktı. Ancak, bu yaş grubundaki buzağılarda
% 1,17 saptanan yayılış oranı da beklenenden düşük bulundu. Bunda
Güralp ve ark., (1985)’nın belirttiği gibi bu araştırmada da toplanan
dışkıların çoğunun resmi kurumlardan alınmış olmasının, başka bir deyişle
halk elindeki hayvanlara oranla daha planlı ve programlı sığır yetiştiriciliği
yapılan bu gibi kurumlardan materyal sağlanmış olmasının rol oynadığı
düşünüldü. Daha önceki bazı kayıtlarda (Güralp ve ark., 1985; Umur ve
Gıcık, 1995; Arslan ve ark., 2008) resmi kurumlarda az da olsa enfeksiyona
rastlandığı bildirilmiş olup, bu araştırmada resmi kurumlara ait buzağıların
dışkısında T.vitulorum yumurtalarına hiç rastlanmamış olması Türkiye
sığırcılığı açısından sevindiricidir.
Bütün dünyada T. vitulorum enfeksiyonlarının kalabalık, nispeten
rutubetli, havalandırmasız, hem malak ve buzağıların, hem de her yaş
grubu hayvanın birlikte tutulduğu, bakım ve beslenme koşulları primitif
olan ahırlarda ve antelmentik uygulama programı bulunmayan
yetiştiriciliklerde sorun olduğu dikkati çekmektedir. Yetiştiricilik koşulları
ve parazitin galaktojen bulaşma özelliğinden dolayı yaş faktörü dışında T.
vitulorum enfeksiyonlarının ırk, cinsiyet ve diğer faktörlerle
ilişkilendirilmesinin çok doğru olmadığı, bir çok çalışmada sonuçların bu
faktörler yönünden istatistiksel değerlendirilmesi ile de ortaya konmuştur
(Güralp ve ark., 1985; Toparlak ve ark., 1989; Umur ve Gıcık, 1995; Adanır,
2004; Raza ve ark., 2010; Davila ve ark., 2010;Avcıoğlu ve Balkaya, 2011b).
47
Bu araştırmada, dışkı alınan buzağıların cinsiyet, ırk gibi özelliklerinin
kaydı bulunmakla beraber, gerek yukarıdaki literatürlerin ışığı
doğrultusunda, gerekse araştırmadaki örnekleme sistemi ve örnek
sayılarındaki büyük farklılıklar nedeniyle böyle bir değerlendirmeye
gidilmedi.
Bu araştırmada materyal alınan 22 ilden enfekte örneklere Ankara,
Düzce ve Erzurum’da rastlandı. Daha önce T. vitulorum yayılışı Ankara
yöresinde 6 aydan küçüklerde % 6,2, tüm yaş gruplarında % 4,6 (Adanır,
2004),Erzurum yöresinde 3 aylığa kadarlarda % 1,1 (Arslan ve ark., 2008),
6 aydan küçüklerde % 24, tüm yaş gruplarında % 22,2 (Avcıoğlu ve
Balkaya, 2011b) bildirilmiştir. Bu araştırmada, illere göre alınan dışkı
örneği sayılarında farklılıklar olması nedeniyle iller bazında veya aynı ile ait
kayıtlar arasında karşılaştırma yapılmaksızın yalnızca enfeksiyonun
bulunduğu illere ilgili kayıtlar aktarıldı.
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarında, kendiliğinden atılan
parazitlerin görülmesi, şiddetli enfeksiyonlarda parazitlerin metabolik
ürünlerinin toksik etkisi ile ilişkilendirilen buzağı nefesinde veya ahırda
fark edilen sarımsak kokusu teşhiste önem taşımaktadır (Kassai, 1999;
Schnieder, 2006). Bu araştırmada da ters çevrilmiş lastik eldiven içinde
laboratuara getirilen dışkıların bazılarının hazırlanmak üzere açılmasında
naylon içinde kapalı bulunmaya ve hazırlanana kadar geçen süreye bağlı
olarak kuvvetli sarımsak kokusu dikkati çekti.
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarının teşhisi çoğunlukla rutin dışkı
bakılarında karakteristik yumurtaların gözlenmesi ile olmakta, orta
büyüklükte olarak değerlendirilebilen T. vitulorum yumurtalarını görmek
için flotasyon yöntemleri daha çok tercih edilmektedir (Anon, 1971; Kassai,
1999; Hassan ve Abdel Aziz, 2011). Bu araştırmada Fulleborn doymuş tuzlu
su flotasyon yöntemi ile hazırlanan dışkılarda T. vitulorum yumurtaları 90,5
(78,7-103,3) µm x 76,4 (68,8-89,5) µm olarak literatüre (Taira ve Fujita,
1991; Kassai, 1999; Schnieder, 2006) uygun boyutlarda ve tanımda
gözlendi.
48
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarında buzağı yaşının ve ince
bağırsaklarda bulunan parazit sayısının enfeksiyonunun şiddeti açısından
önemli olduğu kaydedilmiştir (Soulsby, 1986). Enfeksiyonun şiddetinin
belirlenmesinde ise gram dışkı yumurta sayısının (epg) önem taşıdığı, ancak
dişi parazitlerin yumurta üretim durumunun göz ardı edilmemesi gerektiği
bildirilmiştir (Tavassoli, 1999; Avcıoğlu ve Balkaya, 2011b). Ciddi
enfeksiyonlar için gram dışkı yumurta sayısının 10 000 den fazla olması
gerekmektedir (Soulsby, 1986; Roberts, 1989a; Roberts, 1990a). Türkiye’de
enfekte hayvanlarda gram dışkı yumurta sayısının 25-95,200 arasında
değiştiği kaydedilmiştir (Güralp ve ark., 1985; Toparlak ve ark., 1989;
Akyol, 1993). Bu araştırmada 10 x 10 büyütmede bir mikroskop sahasında
0-1 yumurta gözlenen 12 dışkı hariç yapılan sayımlarda gram dışkı
yumurta sayısı 5925 (2650-10250) olarak belirlendi. Bu sonuçlar; araştırma
sırasında çok şiddetli T.vitulorum enfeksiyonlarına rastlanmadığı veya dışkı
örneklerinin çoğunun parazitlerin atılmağa başladığı ve yumurta sayısında
azalmanın olduğu dönemde alınmış olması ile ilişkilendirilebilir.
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarında üçüncü dönem larvanın (L3)
geliştiği yumurtaların son konak için enfektif olduğu, larva gelişiminin ise
ısıya bağlı olarak değişiklik gösterdiği ve 24-28oC da 11 günde, 18-20oC da
30-40 günde olduğu bildirilmiştir (Kassai, 1999; Schnieder, 2006). Bu
araştırmada oda sıcaklığında tutulan T.vitulorum yumurtalarında larva
gelişiminin 17-40 günde olduğu ve aynı kültürdeki yumurtalarda bile larva
gelişmesinin eş zamanlı olmadığı gözlendi.
Normal koşullarda yumurtayı terk etmeyen T.vitulorum larvasının,
yumurtadan çıkması sağlandığında 345-398 µm ölçüldüğü, belirgin bir
ventrikulusa sahip olduğu (Warren, 1971), selenium 75 ile işaretlenmiş
larvaların verildiği mandalarda karaciğer ve akciğerde 500-600 µm, meme
bezlerine ulaştıklarında 1200 µm uzunluğunda ölçüldükleri (Roberts,
1990b), sütteki larvaların 0,76-1-47 mm (Anderson, 2000), 783 (694-871)
µm x 32 (27-36) µm (Adanır, 2004) oldukları kaydedilmiştir. Bu araştırmada
T.vitulorum (Ex) antijeni hazırlanması sırasında bazı modifikasyonlarla
Souza ve ark., (2004)’nın daha önce Starke-Buzetti ve ark., (2001)’ından
alarak uyarladıkları yöntemden bazı küçük modifikasyonlarla yararlanıldı.
49
Yumurta kabukları soyuldu ve larvaların çıkması sağlandı. Çıkan larvalar
448,4 (452,6-516,6) µm boyda, 20,1 (14,7 x 24,6) µm ende ölçüldü.
Larvaların kolostrumdan bildirilen larvalara göre daha küçük, Warren’in
(1971) bildirdiğinden ise nispeten büyük oldukları gözlendi.
Perienterik antijen (Pe) hazırlanmasında kullanılan T.vitulorum
erkekleri 11,0-17,0 cm x 3,5-4,5 mm, dişileri 16,0-25,0 cm x 4,5-5,0 mm
boyutlarında ölçüldü, büyüklükleri nedeni ile dişi parazitler kullanıma daha
uygun bulundu. Parazit büyüklükleri literatürle (Taira ve Fujita, 1991;
Anderson, 2000; Eckert ve ark., 2005; Schnieder, 2006; Taylor ve ark.,
2007) uyumlu oldu.
Toxocara vitulorum’un teşhisinde dışkı yoklamalarının önceliğini
koruduğu görülmekle birlikte, dışkı yoklamalarına dayanan teşhislerde
yanılgı payları olabileceği, örneğin dışkısında yumurtaya rastlanan her
hayvanda gerçek bağırsak enfeksiyonu bulunmayacağı kaydedilmiştir.
Buzağı ve malakların annelerinin yanında tutulması nedeni ile yavrunun
yalanması, dışkı ile bulaşık altlıkların yemle birlikte alınması veya atılan
parazitlerin yenmesi yanılgılara yol açmaktadır. Ayrıca yumurta aşamasına
gelmeyen dişi parazitlerden veya döllenme olmayacağı için tek cinsiyetten
ileri gelen enfeksiyonların dışkı yoklamaları ile saptanamayacağı
kaydedilmiştir (Anon, 1971; Kassai, 1999; Hasan ve Abdel Aziz, 2010). Süt
ve kolostrum örneklerinde T.vitulorum larvalarının saptanması diğer bir
teşhis yöntemi olduğu larvaların sütle çıkarılma süresinin daha kısa ve
doğum sonrası ilk 2 gün en fazla, 9.günden sonra azalan sayılarda 1 aya
kadar uzadığı bildirilmiştir. Bu yöntem ile manda ve sığırların yavrularına
T.vitulorum’u sütle bulaştırma durumları ortaya konmaktadır (Kassai, 1999;
Adanır, 2004; Schnieder, 2006).
Toxocara vitulorum enfeksiyonlarında dışkı yoklamaları ile yapılan
teşhisin ancak yumurta üreten olgun parazitlerin varlığı ile mümkün
olduğu, gerek parazite ilgili yoğun hepatopulmoner larva göçü ile oluşan
patolojik değişikliklerin dışkı sonuçlarından önce belirlenmesinde, gerekse
gebe hayvanlarda inhibe larva bulunup bulunmadığının araştırılmasında,
50
çeşitli serolojik tekniklerden yararlanabileceği düşünülmüştür (Starke-
Buzetti ve ark., 1996; Banerjee ve ark., 1998; Hassan ve Abdel Aziz, 2010).
Klinik ve epidemiyolojik çalışmalarda immunodiagnostik yaklaşımın
önemli avantajlar taşıdığı ve bu konuda en önemli hususun iyi, spesifik
antijenlerin kullanılması olduğu belirtilmiştir. Toxocara vitulorum
olgunlarından; erkek (ES), dişi (ES), perienterik (Pe), ekstrakt (Ex),
larvalarından; (ES), somatik veya ekstrakt (Ex), yumurtalarından; larvalı
yumurta ve dışkıdan koproantijenler hazırlanarak çeşitli yöntemlerde
kullanılmıştır (Banerjee ve ark., 1998; Starke-Buzetti ve ark., 2001; Ferreira
ve Starke-Buzetti, 2001; Hassan ve Abdel Aziz, 2010).
Bu çalışmada biri larvaya ait (Ex), diğeri olgun parazite ait (Pe) olmak
üzere iki antijen hazırlandı, antijenlerin SDS-PAGE ile karakterizasyonu
yapıldı ve T.vitulorum’la enfekte olduğu dışkı yoklamaları ile saptanan
(pozitif) ve enfekte olmadığı belirlenen (negatif ve fötal) serumlarla WB
uygulanarak, immunoreaktif bantlar belirlendi.
Teşhise yönelik çalışmalarda testlerin özgüllüğünün kullanılan
antijenlere ve antijenin hazırlanma yöntemlerine bağlı olduğuna işaret
edilmektedir. Larva (ES) antijeninin; (Starke-Buzetti ve Ferreira, 2004;
Souza ve ark., 2004; Iddawela ve ark., 2007; Hassan ve Abdel Aziz, 2010),
larva ekstrakt (Ex) antijeninin; (Starke-Buzetti ve ark., 2001; Souza ve ark.,
2004; Starke-Buzetti ve Ferreira, 2005), olgun perienterik (Pe) antijeninin
(Souza ve ark., 2004; Ferreira ve Starke-Buzetti, 2005) farklı testlerde
başarılı olarak kullanıldıkları, hem serum hem de kolostrum
yoklamalarında aşağı yukarı aynı sonuçları verdikleri kaydedilmiştir. Bazı
araştırıcılar (Souza ve ark., 2004; Hassan ve Abdel Aziz, 2010) T.vitulorum
larva (ES) antijenin diğerlerine oranla biraz daha üstün olduğunu
belirtmişlerdir.
Toxocara vitulorum larva (Ex) antijeni kullanılarak manda ve
malaklara ait kolostrum ve serumların ELĐSA ile işlenmesinde Starke-
Buzetti ve ark., (2001), hayvanlardaki parazit durumunun da dışkı
yoklamaları ile takip edilmesiyle saptanan antikorların yorumlanabildiğini,
51
ELĐSA ile anti-Ex antikor reaksiyonunun, diğeri 2 antijenle de (anti-ES ve
anti-Pe) gözlendiğini kaydetmişlerdir.
Starke-Buzetti ve Ferreira (2005), larva (Ex) antijeninde SDS-PAGE
ile 11 polipeptit bantına (11, 13, 16, 22, 25, 32, 43, 53, 68, 82 ve 92 kDa)
rastlamışlar, bunlardan nispeten büyük moleküler ağırlıklı 5 bantı (43, 53,
68, 82, 92 kDa) hem serum hem de kolostrum örneklerinde WB ile
saptamışlardır.
Bu çalışmada hazırlanan larva (Ex) antijeninin SDS-PAGE ile
analizinde, hazırlanan diğer antijene (Pe) göre sayısal anlamda çeşitlilik
gözlendi ve moleküler ağırlıkları 14-150 kDa arasında değişen protein
bantları saptandı. (Ex) antijeninin nitroselüloz membrana transferinden
sonra negatif serumlarla (4 saha, 3 fötal) immunoblotting analizinde
hiçbirinde reaktif bant görülmedi. Pozitif serumlarla (6 adet) 14, 35, 56, 63,
68 ve 94 kDa’luk protein bantlarının immunoreaktif oldukları tespit edildi.
Bulunan bantlardan 68 kDa’nun Starke-Buzetti ve Ferreira (2005)
tarafından da bildirilmiş olduğu görüldü. Bulunan 56 kDa’luk bant ise larva
(ES) antijeni için Starke-Buzetti ve Ferreira, (2004) tarafından bildirilmiştir.
Ferreira ve Starke-Buzetti (2005), perienterik antijenle çalıştıklarında
SDS-PAGE’de 9 bant (11, 14, 31, 38, 58, 76, 88, 112 ve 165 kDa)
gözlediklerini, bunlar arasında 11, 88, 112 ve 165 kDa’luk olanların daha
belirgin oldukları, WB’la hem kolosturum, hem de serumda bu bantların
saptandığını kaydetmişlerdir.
Bu araştırmada, (Pe) antijenlerin elektroforetik separasyonu
sonrasında büyüklükleri 12-141 kDa arasında değişen protein bantları elde
edildi. Đmmunoblotting çalışması sonrası negatif kontrol serumlarının (2
saha, 4 fötal) söz konusu antijenlere reaktif olmadıkları, pozitif 6 örneğin ise
2 adet protein ile (96 ve 110 kDa) benzer yoğunlukta reaktif oldukları tespit
edildi. Bu bantlar Ferreira ve Starke Buzetti (2005)’in (Pe) antijen
kullanarak WB ile işlenen serum ve kolostrum örneklerinde bildirdiği reaktif
bantlardan hiçbiri ile uyumlu olmadı.
52
5. SONUÇ VE ÖNERĐLER
Geri kalmış ve gelişmekte olan ülkelerde, bu arada Türkiye’de genellikle 6
aylıktan küçük buzağılarda Toxocara vitulorum hala sorun olabilmektedir.
Türkiye’de şimdiye kadar T.vitulorum dışkı, kolostrum/süt ve otopsi
bulgularına dayanarak bildirilmiştir. Bu araştırmada immunodiagnostik
yaklaşımların klinik ve epidemiyolojik açıdan önemli avantajları dikkate
alınarak T.vitulorum’un serolojik diagnoz olasılığını ortaya koymak
amaçlandı.
Laboratuar çalışmaları için gerekli materyal (dışkı, parazit, kan)
temininde önce enfekte hayvanlar arandı. Bu amaçla halk elinden, özel ve
resmi kurumlardan; 0-6 aylık yaşta; yerli, kültür ırkı ve melez; her iki
cinsiyetten 239 buzağıdan alınan dışkılar kontrol edildi ve 28’inde (% 1,17)
T.vitulorum yumurtalarına rastlandı. Parazitin Türkiye genelindeki yayılışı
ile ilgili yeni bilgilere ulaşıldı.
Serodiagnoz amacıyla biri larvaya ait (Ex), diğeri olgun parazite ait
(Pe) olmak üzere iki antijen hazırlandı ve bunların SDS-PAGE ile
elektroforetik separasyonu yapıldı. (Ex) antijeninde 14-150 kDa, (Pe)
antijende 12-141 kDa, arasında moleküler ağırlıkları değişen proteinler
saptandı.
Pozitif ve negatif (saha ve fötal) olduğu bilinen serum örnekleri ile
yapılan immunoblotting analizinde; negatif hiçbir örnekte reaktif bant
gözlenmemesine karşın, (Ex) antijeni kullanıldığında 14, 35, 56, 63, 68 ve
94 kDa, (Pe) antijen kullanıldığında 96 ve 110 kDa molekül ağırlıklı bantlar
immunoreaktif olarak kaydedildi.
Alınan sonuçlar konuyla ilgili yapılacak çalışmalarda yararlı olacak
veya ilk basamağı teşkil edecektir. Özellikle gebe hayvanların inhibe larvalar
yönünden kontrolü veya karaciğer, akciğer göçü yapan T.vitulorum
larvalarından ileri gelen hastalıkların belirlenebilmesi ileride yapılacak
çalışmalarda hedef olarak seçilmelidir.
53
Bu çalışmada serolojik kontrol materyallerinin alınma dönemlerine
bağlı olarak örneklerde sorgulanan antikorların antijen bantlarına affinite /
immunoreaktivitelerin de değişkenlik arz edebileceği izlendi; bu nedenle
deneysel çalışmalarla serolojik tanı olasılıklarının detaylı bir şekilde
sorgulanması gerekliliği ortaya konuldu.
Türkiye’de parazitin mandalardaki yayılış oranının belirlenmesi;
koyun ve keçilerde ise bulunup bulunmadığı araştırılması önerilen diğer
önemli hususlardır.
54
ÖZET
Farklı Toxocara vitulorum Antijenlerinin Elde Edilmesi ve Enfeksiyona Spesifik Antikorların Saptanması Bu çalışmada, Türkiye’de şimdiye kadar dışkı, kolostrum/süt ve otopsi bakıları ile bildirilen ve hala bazı yörelerde buzağılarda sorun olabilen T. vitulorum’un serodiagnozu amaçlandı. Toxocara vitulorum’la doğal enfekte buzağı serumlarında, hazırlanan biri larva (Ex) diğeri olgun (Pe) antijenle humoral immun yanıt araştırıldı. Araştırmanın laboratuar çalışmalarında için gerekli materyallerin (dışkı, kan, parazit) sağlanması için önce saha çalışmalarına yoğunlaşıldı ve T. vitulorum ile enfekte hayvanlar arandı. Değişik 22 ilden; yaşları 0-6 aylık; halk elinden, özel ve resmi kurumlardan; yerli, kültür ırkı ve melez; her iki cinsiyetten 2393 buzağıya ait dışkı Fulleborn doymuş tuzlu su flotasyon yöntemi ile kontrol edildi. Yirmi sekiz örnekte (% 1,17) T. vitulorum yumurtalarına rastlandı. Ankara, Düzce ve Erzurum illerine ait dışkılarda enfeksiyona rastlandı, resmi kurumlara ait dışkıların hiç birinde yumurta görülmedi. McMaster tekniği ile gram dışkı yumurta sayısı en fazla 10 250 olarak belirlendi.
Toxocara vitulorum larva (Ex) antijeni hazırlanmasında; dışkıdan ve olgun parazitlerden elde edilen yumurtalar oda sıcaklığında gelişmeye bırakıldı. Larva gelişimi 17-40 günde tamamlandı. Yumurta kabuğu soyularak, dışarı çıkması sağlanan larvalar 448,4 (452,6-516,6) µm boyda 20,1 (14,7-24,6) µm ende ölçüldü. Toxocara vitulorum olgun (Pe) antijeni hazırlanmasında; kendiliğinden veya ilaç verilerek düşürülen erkek ve dişi parazitler kullanılarak, perienterik sıvı çekildi. Elde edilen larvalardan (Ex), perienterik sıvıdan (Pe) antijenleri seçilen yönteme uygun olarak hazırlandı. Spektrofotometre ile (Ex) antijeni için protein konsantrasyonu 7,5 mg/ml, (Pe) antijen için 20,56 mg/ml olarak belirlendi.
SDS-PAGE’le elektroforetik separasyonda (Ex) antijeninde moleküler ağırlıkları 14-150 kDa, (Pe) antijeninde ise 12-141 kDa arasında değişen protein bantları elde edildi.
Toxocara vitulorum (Ex) antijenlerinin negatif serumlarla (4 saha, 3 fötal) immunoblotting analizinde hiçbir örnekle reaktif bant saptanmazken, pozitif 6 serumda 14, 35, 56, 63, 68 ve 94 kDa molekül ağırlığındaki protein bantlarının immunoreaktif oldukları tespit edildi. 14 kDa’luk bant bazı örneklerde daha belirgin izlendi. (Pe) antijen ile yapılan immunoblotting çalışmasında negatif serumların (2 saha, 4 fötal) söz konusu antijenlere reaktif olmadıkları, pozitif 6 serumun ise tüm örneklerde 96 ve 110 kDa’luk 2 proteine benzer yoğunlukta reaktif oldukları tespit edildi.
Anahtar Kelimeler : Antijen, Buzağı, SDS-PAGE, Toxocara vitulorum, Western Blot.
55
SUMMARY
Recovery of Different Toxocara vitulorum Antigens and Detection of Specific Antibodies Toxocara vitulorum causes serious problems among calves in many parts of Turkey. All previous diagnostic approaches for T. vitulorum infections performed based on faeces, colostrum / milk and post-mortem examinations. The aim of this study is to prepare two kinds of antigens, larva extract (Ex) and perienteric (Pe) for serodiagnosis, besides the advantages of clinical and epidemiological aspects of the disease in its diagnosis. This study was initiated by an intensive field work that involved the collection of materials needed for laboratory examinations (faeces, blood and parasites). Faecal samples were collected from a total of 2393 calves of both sexes aged 0-6 months, settled in 22 provinces at public/private and state farms of different breeds. Then the faecal samples examined in the laboratory by Fulleborn Flotation Technique using saturated sodium chloride solution. Twenty eight calves were found positive with T. vitulorum (1,17%) by the presence of the eggs in their faeces. The infected calves were belonged to public/private farms at Ankara, Düzce and Erzurum provinces, while no infection was found in calves at the State farms. McMaster technique was performed to determine the parasite egg count per gram of faeces and the maximum (epg) was found as 10250. Toxocara vitulorum eggs were recovered from both infected faeces and the mature parasites for the purpose of larval (Ex) antigen preparation. The eggs were incubated at room temperature when the larval deveopment was completed within 17-40 days. The egg shells decorticated and the length and width of the obtained larvae was measured as 448,4 (452,6-516,6)µm and 20,1 (14,7-24,6)µm respectively. Toxocara vitulorum perienteric fluid was recovered from both male and female parasites that obtained by either the spontaneous explusion of the parasites or the parasites collected after adminstration of drug. Proper procedures used for preparation of (Ex) antigen from the recovered larvae and (Pe) antigen from the obtained perienteric fluid. Protein concentration of both antigens was measured by spectrophometer where it estimated as 7,5 mg/ml for (Ex) and 20,56 mg/ml for (Pe) antigen. Different protein bands of variable molecular weights which was estimated as 14-150 kDa for (Ex) and 12-141 kDa for (Pe) antigen recovered by SDS-PAGE electrophoretic separation. The negatif serum samples (4 field, 3 fetal) did not show any reaction bands with (Ex) antigen in the immunoblotting analysis, while the 6 positive serum samples showed protein bands within the range of 14, 35, 56, 63, 68 and 94 kDa molecular weights. 14kDa moleculer weight band was more prominent in some samples. Negative serum samples ( 2 field, 4 fetal) did not react with (Pe) antigen in the immunoblotting analysis, while all positive 6 serum samples showed protein bands to 96 and 110 kDa molecular weights with same reactivity.
Key words: Antigen, Calf, SDS-PAGE, Toxocara vitulorum, Western Blot.
56
KAYNAKLAR
ADANIR, R. (2004). Ankara yöresi sığırlarında Toxocara vitulorum’un prevalansı. Doktora Tezi, Ankara Üniv Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
AGYEĐ, A. D. (1991). Epidemiological observations on helminth infections of calves in southern Ghana. Trop Anim Hlth Prod., 23: 134-140.
AKHTAR, M., HAYAT, C.S., ASHFAQUE, M., AFAG, M., IQBAL, Z. (1993). Assaying of purified colostral immunoglobulins against Toxocara vitulorum as determined by indirect haemagglutination test. Pakistan J Agri Sci., 30: 362-364.
AKYOL, C. V. (1993). Epidemiology of Toxocara vitulorum in cattle around Bursa, Turkey. J Helminthol., 67: 73-77.
ALTINÖZ, F., GÖKÇEN, A., USLU, U. (2000). Konya yöresi sığırlarında Toxocara vitulorum’un yayılışı. Türkiye Parazitol Derg., 24: 405-407.
AMERASINGHE, P. H., RAJAPAKSE, R. P., LLOYD, S., FERNANDO, S.T. (1992). Antigen-induced protection against infection with Toxocara vitulorum larvae in mice. Parasitol Res., 78: 643-647.
ANDERSON, R. C. (2000). Nematode Parasites of Vertebrates. Their Development and Transmission. 3rd Ed. Wallingford: CABI Publishing. p.: 307-308.
ANON (1977). Manual of Veterinary Parasitological Laboratory Techniques. Ministry of Agriculture, Fisheries and Food. 2nd Ed. Technical Bulletin 18. London, Her Majesty’s Stationary Office, p.: 5-7.
ANON (2001). DPT VIII. Beş Yıllık Kalkınma Planı. Hayvancılık Özel Đhtisas Komisyonu Raporu. Erişim: [http://ekutup.dpt.gov.tr.] Erişim tarihi: 18.05.2011.
ANON (2009). TÜĐK, Türkiye Đstatistik Kurumu Yıllığı Ankara: Türkiye Đstatistik Kurumu Matbaası., s: 208-210.
ARSLAN, M.Ö., UMUR, Ş., ÖZCAN, K. (1997). Buzağılarda ölümcül Toxocara vitulorum olgusu. Türkiye Parazitol Derg., 21: 79-81.
57
ARSLAN, M.Ö., SARI, B., TAŞÇI, G.T., AKTAŞ, M.S. (2008). Erzurum yöresinde buzağılarda Toxocara vitulorum yaygınlığı. Kafkas Üniv Vet Fak Derg., 14: 37-40.
AVCIOGLU, H., BALKAYA, I. (2011a). Efficacy of eprinomectin against Toxocara vitulorum in calves. Trop Anim Hlth Prod., 43: 283-286.
AVCIOGLU, H., BALKAYA, I. (2011b). Prevalence of Toxocara vitulorum in calves in Erzurum, Turkey. Kafkas Univ Vet Fak Derg., (Article code: KVFD- 2010-3216).
AYDENIZÖZ, M., ALDEMĐR, O. S., GÜÇLÜ, F. (1999). Dışkı muayenesiyle sığırlarda tespit edilen parazitler ve yayılışları. Türkiye Parazitol Derg., 23: 83-88.
AYDIN, A., GÖZ, Y., YÜKSEK, N., AYAZ, E. (2006). Prevalence of Toxocara vitulorum in Hakkari, eastern region of Turkey. Bull Vet Inst Pulawy., 50: 51-54.
AYDIN, F., UMUR, Ş., GÖKÇE, G., GENÇ, O., GÜLER, M. A. (2001). Kars yöresindeki ishalli buzağılardan bakteriyel ve paraziter etkenlerin izolasyon ve identifikasyonu. Kafkas Univ Vet Fak Derg., 7: 7-14.
BANERJEE, D. P., BARMAN ROY, A. K., SANYAL, P. K. (1983). Public health significance of Neoascaris vitulorum larvae in buffalo milk samples. J Parasitol., 69: 1124.
BANERJEE, P.S., BHATIA, B.B., GARG, S.K. (1998). Comparative evaluation of IHA and CIEP in the diagnosis of Toxocara vitulorum in pregnant cows and buffaloes. Trop Anim Hlth Prod., 30: 253-256.
BARBOSA, M. A., BLASI, A. C., de OLĐVEĐRA, M. R., CORREA, F. M. (1992). Natural parasitism of buffaloes cows in Botucatu, SP, Brazil. III.Dynamics of gastro-intestinal parasitism in cows and their calves. Mem Inst Oswaldo Cruz., 87: 37-41.
BARRĐGA, O. O., OMAR, H. M. (1992). Immunity to Toxocara vitulorum repeated infections in rabbit model. Vet Immunol Immunopathol., 33: 249-260.
BORGSTEEDE, F. H. M., HOLZHAUER, M., HERDER, F. L., VELDHUIS-WOLTERBEEK, E. G., HEGEMAN, C. (2010). Toxocara vitulorum in suckling calves in the Netherlands. Res Vet Sci., doi: 10.1016/ j.rvsc. 2010.11.008.
58
BRAGA, F. R., FERREĐRA, S. R., ARAUJO, J. V., ARAUJO, J. M., SILVA, A. R., CARVALHO, R. O., CAMPOS, A. K., FREĐTAS, L. G. (2010). Predatory activity of Pochonia chlamydosporia fungus on Toxocara (syn. Neoascaris) vitulorum eggs. Trop Anim Hlth Prod., 43: 309-314.
CELEP, A., AÇICI, M., ÇETĐNDAĞ, M., GÜRBÜZ, Đ. (1994). Samsun yöresi sığırlarında paraziter epidemiyolojik çalışmalar. Etlik Vet Mikrobiol Derg., 6: 117-130.
CHOWDHURY, N. (1994). Helminthes of domesticated animals in Indian subcontinents. In: Helminthology. Ed.: N. Chowdhury, I. Tada. Delhi: Springer- Verlag, Narosa Publishing House, p.:73-120.
DAVĐLA, G., IRSĐK, M., GREĐNER, E.C. (2010). Toxocara vitulorum in beef calves in North Central Florida. Vet Parasitol., 168: 261-263.
ECKERT, J., FRĐEDHOFF, K. T., ZAHNER, H., DEPLAZES, P. (2005). Lehrbuch der Parasitologie für die Tiermedizin. Stuttgart: Enke Verlag, p.: 291-296.
FERREIRA, F. P., STARKE-BUZETTI, W. A. (2005). Detection of antibody to Toxocara vitulorum perienteric fluid antigens (Pe) in the colostrum and serum of buffalo calves and cows by Western Blotting. Vet Parasitol., 129: 119-124.
GANABA, R., BENGALY, Z., QUATTARA, L. (2002). Calf morbidity, mortality and parasite prevalences in the cotton zone of Burkina Faso. Prev Vet Med., 55: 209-216.
GAUTAM, O.P., MALĐK, P.D., SINGH, D.K. (1976). Neoascaris vitulorum larvae in
the colostrum / milk of buffaloes. Indian J Pub Hlth., 20: 183-184.
GOOSSENS, E., DORNY, P., VERVAECKE, H., RODEN, C., VERCAMMEN, F., VERCRUYSSE, J. (2007). Toxocara vitulorum in American bison (Bison bison) calves. Vet Rec., 160: 556-557.
GÖZ, Y., ALTUĞ, N., YÜKSEK, N., ÖZKAN, C. (2006). Parasites detected in neonatal and young calves with diarrhoea. Bull Vet Inst Pulawy, 50: 345-348.
GÜNAY, M. (1990). Marmara bölgesi sığırlarının gastro-intestinal nematodları üzerinde sistematik araştırma. Doktora Tezi, Đstanbul Üniv Sağlık Bilimleri Enstitüsü.
59
GÜRALP, N., TINAR, R., DOĞANAY, A., COŞKUN, Ş. (1985). Türkiye sığırlarında Toxocara vitulorum’un yayılışı. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 32: 280-287.
HASSAN, S.E., ABDEL AZĐZ, M.M. (2010). Detection of antibodies of excretory – secretory antigen of Toxocara vitulorum infective larvae in buffalo calves by ELISA. Global Veterinaria., 4: 97-102.
IDDAWELA, R. D., RAJAPAKSE, R. P., PERERA, N. A.N. D., AGATSUMA, T. (2007). Characterization of a Toxocara canis species-specific excretory-secretory antigen (TcES-57) and development of a double sandwich ELISA for diagnosis of visceral larva migrans. Korean J Parasitol., 45: 19-26.
JONES, J. R., MITCHELL, E. S. E., REDMAN, E., GILLEARD, J. S. (2009). Toxocara vitulorum infection in a cattle herd in the UK. Vet Rec., 164: 171-172.
KASSAI, T. (1999). Veterinary Helminthology. Oxford: Butterworth- Heinemann, p.: 102.
KASSUKU, A., MAKUNDĐ, A.F., KĐLALA, J. (1996). Toxocariasis in Creole calves at Uvina Ranch in Kigoma region of Tanzania. Tanzania Vet J., 16: 109-112.
KAUFMANN, J. (1996). Parasitic Infections of Domestic Animals. A Diagnostic
Manual. Basel: Birkähuser-Verlag, p.:49. KAYA, G. (2003). Parazitoloji Temel Đlkeler ve Laboratuar Teknikleri, Mustafa Kemal
Üniv Yayın No: 16, Veteriner Fak Yayın No1, Antakya: MKÜ Basımevi, s.: 146.
KNOPF, L., KOMOIN-OKA, C., BETSCHART, B., GOTTSTEIN, B., ZINSSTAG, J. (2004). Production and health parameters of N’Dama village cattle in relation to parasitism in the Guinea savannah of Cote d’Ivoire. Revue Élev Méd vét Pays trop., 57: 95-100.
MAHIEU, M., NAVES, M. (2008). Incidence of Toxocara vitulorum in Creole calves of Guadeloupe. Trop Anim Hlth Prod., 40: 243-248.
MERDĐVENCĐ, A. (1970). Türkiye Parazitleri ve Parazitolojik Yayınları. Đstanbul Üniv Cerrahpaşa Tıp Fak Yayın No1610/9. Đstanbul: Kutulmuş matbaası.
NEVES, M. F., STARKE-BUZETTI, W. A., CASTRO, A. M. M. G. (2003). Mast cell and eosinophils in the wall of the gut and eosinophils in the blood stream during Toxocara vitulorum infection of the water buffalo calves (Bubalus bubalis). Vet Parasitol., 113: 59-72.
60
OYTUN, H. Ş. (1961). Genel Parazitoloji ve Helmintoloji. Ankara Üniv Vet Fak Yayın No 55, Ders kitabı No: 26, 3. Baskı. Ankara: Ege matbaası.
ÖGE, S., DOĞANAY, A. (1997). Türkiye’de sığır ve mandalarda görülen hemintler. Türkiye Parazitol Derg., 21: 435-441.
RAJAPAKSE, R. P., LLOYD, S., FERNANDO, S. T. (1994). Toxocara vitulorum: maternal transfer of antibodies from buffalo cows (Bubalus bubalis) to calves and levels of infection with T. vitulorum in the calves. Res Vet Sci., 57: 81-87.
RAZA, M.A., IQBAL, Z., JABBAR, A., YASEEN, M. (2007). Point prevalence of gastrointestinal helminthiasis in ruminants in southern Punjab, Pakistan. J Helminthol., 81: 323-328.
RAZA, M.A., MURTAZA, S., BACHAYA, H.A., QAYYUM, A. ZAMAN, M.A. (2010). Point prevalence of Toxocara vitulorum in large ruminants slaughtered at Multan abattoir. Pakistan Vet J., 30: 242-244.
ROBERTS, J. A. (1989a). The extraparasitic life cycle of Toxocara vitulorum in the village environment of Sri Lanka. Vet Res Commun., 13: 377-388.
ROBERTS, J. A. (1989b). Toxocara vitulorum: treatments based on the duration of the infectivity of buffalo cows (Bubalus bubalis) for their calves. J Vet Pharmacol Ther., 12: 5-13.
ROBERTS, J. A. (1990a). The egg production of Toxocara vitulorum in Asian buffalo (Bubalus bubalis). Vet Parasitol., 37: 113-120.
ROBERTS, J. A. (1990b). The life cycle of Toxocara vitulorum in Asian buffalo (Bubalus bubalis). Int J Parasitol., 20: 833-840.
ROBERTS, J.A. (1993). Toxocara vitulorum in ruminants. Vet Bull, 63: 545-568.
ROBERTS, J.A., FERNANDO, S.T., SIVANATHAN, S. (1990). Toxocara vitulorum in the milk of buffalo (Bubalus bubalis) cows. Res Vet Sci., 49: 289-291.
SACKEY, A. K. B., OJONGMBOH, T. A., NEĐLS, J.S., SALE, U. (2007). The possible sources of Toxocara (Neoascaris) vitulorum infection in neonatal zebu calves in northern Nigeria. J Anim Vet Adv., 6: 1314-1316.
61
SAMAD, M.A., HOSSAĐN,K.M.M., ISLAM, M.A., SAHA, S. (2004). Concurrent infection of gastro-intestinal parasites and bacteria associated with diarrhoea in calves. Bangladesh J Vet Med., 2: 49-54.
SAMBROOK, J., FRITSH, E.F., MANNĐATĐS, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 15 Sections, NewYork: Cold Spring Harbor. p.:18.47-18.76.
SCHNĐEDER, T. (2000). Helminthosen des Wiederkäuer. Veterinar medizinische Parasitologie. Ed: M. Rommel, J. Eckert, E. Kutzer, W. Korting, T. Schnieder. 5. Auflage. Berlin: Parey, Buchverlag, p.: 192-295.
SCHNĐEDER, T. (2006). Helminthosen des Wiederkäuer. Veterinar medizinische Parasitologie. Ed.: T. Schnieder, 6. Auflage. Stuttgart: Parey MVS Medizinverlage, p.:166-234.
SOULSBY, E. J. L. (1986). Helminthes, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals.7th Ed., London: Baillere Tindall, p.: 142-158.
SOUZA, E.M., STARKE-BUZETTĐ, W.A., FERREĐRA, F. P., NEVES, M.F., MACHADO, R.Z. (2004). Humoral immune response of water buffalo monitered with three different antigens of Toxocara vitulorum. Vet Parasitol., 122: 67-78.
STARKE-BUZETTI, W. A., FERREIRA, F. P. (2004). Characterization of Excretory/Secretory antigen from Toxocara vitulorum larvae. Ann N Y Acad Sci., 1026: 210-218.
STARKE-BUZETTI , W.A., FERREIRA, F.P. (2005). Detection of IgG antibodies to Toxocara vitulorum soluble larval extract (Ex) by Western Blotting in the colostrum and serum of buffalo cows and calves. Brazilian J Vet Res Anim Sci., 42: 122-129.
STARKE-BUZETTĐ, W.A., MACHADO, R.Z., ZOCOLLER-SENO, M.C. (2001). An enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) for detection of antibodies against Toxocara vitulorum in water buffaloes. Vet Parasitol., 97: 55-64.
STARKE-BUZETTĐ, W. A., MACHADO, R. Z., BECHARA, G. H., ZOCOLLER, M. C. (1996). Skin hypersensitivity tests in buffaloes parazitized with Toxocara vitulorum. Vet Parasitol., 63: 283-290.
62
TAIRA, N., FUJITA, J. (1991). Morphological observation of Toxocara vitulorum found in Japanese calves. J Vet Med Sci., 53:409-413.
TAVASSOLI, M. (1999). Studies on Toxocara vitulorum infection of buffalo calves in Urmia, Iran. J Vet Parasitol., 13: 159-160.
TAYLOR, M. A., COOP, R. L., WALL, R. L. (2007). Veterinary Parasitology. 3rd Ed. London: Blackwell Publishing, p.: 65-66.
TĐĞĐN, Y., BURGU, A., DOĞANAY, A., ÖGE, H., ÖGE, S. (1993). Đç Anadolu bölgesinde sığır mide-bağırsak nematodları ve mevsimsel aktiviteleri. Turk J Vet Anim Sci., 17: 341-349.
TOPARLAK, M., DEĞER, S., YILMAZ, H. (1989). Van yöresi sığırlarında Toxocara (Neoascaris) vitulorum enfeksiyonun yayılışı. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 36: 404-412.
TOPARLAK, M., ARSLAN, M. Ö., GARGILI, A., TÜZER, E. (1996). Prevalence of Toxocarosis vitulorum in cattle in Thracia, Turkey. Turk J Vet Anim Sci., 20: 341-342.
UMUR, Ş., GICIK, Y. (1995). Kars yöresi sığırlarında Toxocara vitulorum’un yayılışı. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 42: 25-29.
URQUHART, G. M., ARMOUR, J., DUNCAN, J. L., DUNN, A. M., JENNINGS, F. W. (1996). Veterinary Parasitology. 2nd Ed., London: Blackwell Science Publishing, p.:72-73.
WARREN, E. G. (1971). Observations on the migration and development of Toxocara
vitulorum in natural and experimental hosts. Int J Parasitol., 1: 85-96.
WICKRAMASINGHE, S., YATAWARA, L., RAJAPAKSE, R.P.V.J., AGATSUMA, T. (2009). Toxocara canis and Toxocara vitulorum: molecular characterization, discrimination and phylogenetic analysis based on mitochondrial (ATP synthase subunit 6 and 12S) and nuclear ribosomal (ITS-2 and 28S) genes. Parasitol Res., 104: 1425-1430.
WYMANN, M. N., BONFOH, B., TRAORE, K., TEMBELY, ZĐNSSTAG, J. (2007). Species diversity and acquisition of gastrointestinal parasites in calves aged 0-13 months in periurban livestock production in Mali. Vet Parasitol., 143: 67-73.
63
WYMANN, M. N., BONFON, B., TRAORE, K., TEMBELY, S., JAKOB, Z. (2008). Gastrointestinal parasite egg excretion in young calves in periurban livestock production in Mali. Res Vet Sci., 84: 225-231.
YILDIRIM, A., KOZAN, E., KARA, M., ÖGE, H. (2000). Kayseri bölgesinde kapalı
sistemde yetiştirilen sığırlarda helmint enfeksiyonlarının durumu. Ankara Üniv Vet Fak Derg., 47: 333-337.
ZĐNSSTAG, J., ANKERS, P., NJĐE, M., ITTY, P., MONSAN, V., KAUFMANN, J.,
SMĐTH, T., PANDEY, V. S., PFĐSTER, K. (2000). Effect of strategic gastrointestinal nematode control on faecal egg count in traditional west American cattle. Vet Res., 31: 259-266.
64
EKLER
Ek-1
65
ÖZGEÇMĐŞ
I. Bireysel Bilgiler Adı : Abdalla Fadlalla Soyadı : AZRUG Doğum yeri ve tarihi : Darfur, Sudan, 17.11.1968 Uyruğu : Sudan Medeni durumu : Evli, 2 çocuk babası Đletişim adresi : : [email protected] Telefon : : 00249 9107 33 162 : 0505 841 52 44 II. Eğitim
• 2007- Ankara Üniv. Veteriner Fakültesi, Parazitoloji ABD Doktora öğrencisi
• Bahr El Gazal Univ. Veteriner Fakültesi, Parazitoloji Bölümü, Sudan (Vet Master) (2005) • Assuit Univ, Veteriner Fakültesi, Mısır (Veteriner Lisans)
(1995) • El Fashir Lisesi, Kuzey Darfur, Sudan, (1989) • El Malha Ortaokulu, Kuzey Darfur, Sudan, (1986) • Mariga Đlkokulu, Kuzey Darfur, Sudan, (1983)
Yabancı dili: - Đngilizce
- Türkçe Ana dili : - Arapça ve lokal 2 Afrika dili III. Ünvanları
• Veteriner Hekim (1995) • Uzman Veteriner (2005)
IV. Mesleki Deneyimi • Güney Darfur Devlet Veteriner Hastanesi, Sudan (1996-1998). • Maleit Mahallesi, Kuzey Darfur, Hayvancılık Şefi (1999-2000) • Fashir Veteriner Araştırma Laboratuarı, Darfur, Araştırıcı (2001-
2005) V. Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar
• Sudan Veteriner Hekimleri Genel Derneği • Kuzey Darfur Veteriner Hekimleri Derneği
66
VI. Bilimsel Đlgi Alanları
Yayınlar • AZRUG, A. F., BURGU, A. (2009). A review on camel parasitic
diseases situation in Turkey. 16. Ulusal Parazitoloji Kongresi, Adana 1-7 Kasım 2009, Program ve Özet Kitabı (Poster bildiri: 291).
• AZRUG, A. F., BURGU, A. (2011). Deve parazitlerine genel bakış ve Türkiye’deki durum. Türkiye Parazitol Derg., 35(1).
VII. Bilimsel Etkinlikleri
Tezler • Epidemiology of gastrointestinal helminth parasites of camels
(Camelus dromedarius) in North Darfur, Sudan (2005).Master Tezi. Bahr El Gazal Üniv. Veteriner Fak. , Hartum, Sudan
Seminerler • Deve parazitlerine genel bakış ve önemli helmint enfeksiyonları
(2007) • Gevişenlerde toxocarosis ve tanısı (2009) Proje • Farklı Toxocara vitulorum Antijenlerinin Elde Edilmesi ve
Enfeksiyona Spesifik Antikorların Saptanması. (BAP. 09B3338009) Katıldığı Konferans ve Kongreler • Sixteenth (16th) Conference of General Sudanese Veterinarian
Association, White Nile State, Kosti, Sudan (2005) • 16. Ulusal Parazitoloji Kongresi, Adana, Türkiye, 1-7 Kasım 2009.
VIII- Diğer Bilgiler Eğitim Programı Haricinde Aldığı Kurs ve Eğitim Seminerleri
• Artificial Insemination, Animal Production, Faculty of Veterinary Sciences, Nyla Univ, South Darfur, Sudan (1997).
• Epizootic – Rinderpest Disease Surveillance and Epidemiological Control, PACE, Headquarter, Friendship Hall, Khartoum, Sudan (2001).
• Statistics and Experimental Design, Animal Production Research Centre, ARRC, Koko, Khartoum, Sudan (2002)
• Reduction of Conflict in Sudan among Pastoralists and Farmers, UNDP Project, Federal Ministry of Animal Resources and Fisheries, Khartoum, Sudan, (2005).