34

FAMILIAL HYPERPARATHYROID DISORDERS WITH EMPHASES ON PARAFIBROMIN AND MALIGNANCY

Alimov A., Villablanc A., Aarum S., Larsson C.*Address correspondence to: Catharina Larsson at Deparment of molecular medicine, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital-Solna, SE-171 76 Stockholm;

Catharina.Larsson@cmm.ki.se

Primary hyperparathyroidism (PHPT) is, after diabetes, the second most common endocrinopathy. Among women over 50 years of age the prevalence is as high as 1-2%. The disease occurs in both sporadic and familial forms, the familial being associated with syndromes such as multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN 1), familial hypocalciuric hypercalcemia (FHH), the hyperparathyroidism-jaw-tumor syndrome (HPT-JT), and familial isolated hyperparathyroidism (FIHP). Sporadic primary hyperparathyroidism has long been considered idiopathic since the etiology is large unknown. In addition to age and sex, external irradiation to the neck is also regarded as a significant risk factor. The malignant form, parathyroid cancer, is very uncommon. Genes for the familial forms of the disease have been located and identified through positional and candidate gene approaches including MEN1 in MEN 1 and a subset of FIHP, CASR in a subset of FIHP occurring as a variant of FHH, and HRPT2 in HPT-JT and a subset of FIHP.

The involvement of MEN 1 and HRPT2 through mutations in parathyroid tumors has been documented. Parathyroid adenomas show inactivation of the MEN1 gene in a large proportion of the cases, while elucidation of the mechanism of tumorigenesis remains an important challenge in the remaining cases. For the carcinomas a genetic progression of events is evident, as well as a difference in chromosomal imbalances and gene expression profiles as compared to adenomas. HRPT2 mutations occur frequently and are associated with loss of parafibromin expression in agreement with a tumor suppressor function. Moreover, constitutional HRPT2 mutations are recurrently seen in apparently isolated cases of parathyroid carcinoma. In contrast this gene is rarely involved in parathyroid adenomas, and the few mutated cases detected so far were pre selected for cystic alterations or lack of alterations at the MEN1 gene locus. Similarly, in the familial forms of PHPT, malignant parathyroid tumors are seen in HPT-JT patients, while in MEN 1 this almost never occurs. This difference in clinical spectra would imply that parathyroid tumor development initiated through MEN1 inactivation is a per se benign disease while tumorigenesis initiated from the HRPT2 gene is potentially malignant.

35

REVOLUTIONARY NEW STAIN AB HXE – DISCOVERY FOR FROZEN AND PERMANENT SECTIONS –

WHICH BRINGS UP AMPHOTERIC SUBSTANCES AS WELL AS ACIDOPHILIC AND BASOPHILIC ONES IN

CYTO- AND HISTOLOGICAL SECTIONS

Brusilovskiy A.I. Dr. Aib’s Private Histology (President - Arkadiy I.Brusilovskiy ,

Doctor of Medical Science, Professor in Biology), Los Angeles – Santa Monica, California, USA

I created a new stain for frozen and permanent sections – AB HxE. The main difference between traditional HxE and the new one is that I treat the specimen with EOSIN dye at first, then use HEMATOXYLIN as the secondary dye (US patent).

We now have THE NEW PHENOMENON IN HISTOLOGY: twin stain – phonotypes of cells – HxE and AB HxE. The new stain highlights the amphoteric, chemical substances of the cells, along with acidic and basic ones.

The new stain brings us into a NEW WORLD IN HISTOLOGY. Now we have twin worlds in Histology: – HxE and AB HxE. The new AB HxE staining method allows theoretical discoveries. It gives:

1. New possibilities to study embryonic or aging tissues;2. New possibilities to study changes in the cells during carcinogenesis:3. New ways to study the brain, especially changes related to Alzheimer

disease.

The new phenomenon in Histology will bring professional people to the new vision of:

• epithelium, specially a basement membrane;• connective tissues;• sections of bone marrow and lymph nodes;• brain and nervous tissue, neurons and glya;• muscular tissues and many-many more.

The new stain is fast (about 30 seconds), and easy to use, and very cost effective!

36

OVARIAN CARCINOMA: WHO ARE WE AFTEL?Davidson B., MD PhD

Department of Pathology, the Norwegian Radium Hospital, Montebello N-0310 Oslo, University of Oslo, Norway

Tel: 47-22934871, Fax: 47-22508554Email: ben.davidson@radiumhospitalet.no

BackgroundEpithelial ovarian carcinoma continues to claim more lives than any other

gynecologic malignancy [1]. Despite improved therapeutic chemotherapy protocols, the outcome of this disease remains poor and essentially unaltered at about 30% 5-year survival. In addition to late detection, this reflects several other key-problems in the understanding of this cancer.

Ovarian carcinoma spreads primarily to the serosal surface of the peritoneal cavity, accompanied by the accumulation of fluid in the peritoneal cavity in 65% of patients [2]. The presence of malignant cells in pleural effusion defines a stage IV disease and predicts extremely poor prognosis [3-4], whereas positive ascites can present in any FIGO stage. Despite the magnitude of the clinical problem related to effusions, the biological characteristics of ovarian carcinoma cells at this site have been poorly characterized at both the phenotypic and genotypic level. This reflects the fact that clinical cancer research is strongly biased towards studies of primary tumors rather than metastatic disease, despite the fact that the latter is the main factor responsible for cancer morbidity and mortality.

Work in recent years brought us to our current hypothesis regarding site-related expression in ovarian carcinoma, which centers on true tumor progression and/or differences in microenvironment. The central interaction of cancer cells in solid tissues is with peritumoral stromal cells of fibroblastic origin. In effusions, stromal and endothelial cells are substituted by mesothelial cells. These cells, though of mesenchymal origin, differ morphologically, phenotypically and genotypically from stromal cells of solid tissues. Whatever the underlying mechanism, the differences between carcinoma cells in primary tumors and effusions may have far-reaching therapeutic consequences, as we are probably dealing with two biologically distinct cell populations. Differently put, we are treating patients with metastatic disease based on data from primary tumors, despite the fact that expression patterns in effusions have entirely different biological and prognostic significance. As opposed to this difference, striking similarities are seen between ovarian carcinoma cells in pleural and peritoneal effusions, lending support to our hypothesis that the latter are of fully metastatic nature.

This talk will touch briefly on results from previous work [reviewed in 5,6] and focus on three recent projects- the role of phospholipase A2 (PLA2) in

37

ovarian carcinoma, and the role of proteomics and cDNA arrays in the analysis of ovarian carcinoma effusions.

1. PLA2Eicosanoids are products of the arachidonic acid (AA) cascade and have

been implicated in the pathogenesis of a variety of human diseases, including cancer [7,8]. Metabolites of arachidonic acid are required for both tumor cell invasion and metastasis [9]. Recent studies revealed a cancer-preventive role for non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), mediated through inhibition of cyclooxygenase (COX), the enzyme that converts AA to prostaglandins and thromboxanes [9,10].

Prior to its conversion into eicosanoids, AA must be hydrolyzed from phospholipids by a family of enzymes termed phospholipase A2 (PLA2). PLA2 enzymes that may participate in this process include cytosolic, high-molecular-mass PLA2 (Type IV PLA2, cPLA2; 85-110 kDa), several isotypes of secretory, low-molecular-mass PLA2(s) (sPLA2; 14-17 kDa) and calcium-independent PLA2 (Type VI PLA2). The phospholipase A2-activating protein (PLAP; 72-74 kDa) increases the activity of PLA2 .

The relevance of PLA2 to ovarian physiology is suggested by the importance of prostaglandin biosynthesis to follicle maturation and luteolysis [11,12]. In cell line models, PLA2 is required for activation of production of lysophosphatidic acid (LPA), a growth factor for ovarian carcinoma cells [13,14].

We analyzed the expression of these molecules and their transcriptional target MMP-2 in malignant effusions from patients diagnosed with advanced-stage ovarian carcinoma, and investigated their potential role as predictors of disease outcome. Data will be shown that document the following:

1. There is high expression of these molecules in ovarian cancer effusions.2. PLA2 isoforms are co-expressed with their receptor (sPLA2R) and their

transcriptional target enzyme MMP-2. 3. Lower expression of sPLA2-IIA and p-cPLA2 is seen in post-chemotherapy

effusions. 4. PLAP mRNA expression and FIGO stage predict worse overall survival

in univariate survival analysis, and are both predictors of poor survival in Cox multivariate analysis.

data supporting these findings will be additionally shown.

2. Proteomics-Signaling pathwaysDevelopment and validation of protein lysate microarrays has facilitated

study of signaling pathways in ovarian carcinoma [15] and other cancers [16,17]. Upregulation of the ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) proliferation pathway and of the AKT/phosphatidylinositol 3’ kinase (PI3K) pro-survival and invasion pathways has been shown in ovarian cancer [15, 18-20].

38

We recently analyzed 70 fresh frozen effusions from our cohort of ovarian cancer patients using protein lysate microarrays. Full clinical data were available for all patients, including precise dates and type of chemotherapy administered, clinical response and survival. The goal was to analyze this material for potential new markers of disease progression, chemotherapy response and survival. Initial results are promising.

Malignant effusions (>80% malignant cells) were distinguished from benign by higher expression of AKT, activated ERK, and activated CREB, total CREB, and JNK. Malignant pleural effusions and ascites could not be differentiated by signaling profiles. Analysis of signal protein co-expression identified survival, proliferation and metastasis, and injury pathway signal clusters. Patients with primary diagnosis specimens had significantly shorter overall survival than those with disease recurrence effusions. Cox proportional hazards model analysis revealed high p38 and pEGFR/EGFR ratio as jointly associated with poor survival in primary diagnosis cases. Phospho-JNK quantity was associated with worse outcome in patients with disease recurrence effusions.

These data show that proliferation, survival, and apoptosis signaling dysregulation can be identified in ovarian cancer effusion samples. Biochemical characterization of clinical effusions may provide either predictive and/or correlative information on patient outcome and may have a role in targeting therapy.

3. cDNA arraysWhile numerous studies have characterized primary ovarian tumors [21-30],

little information is available regarding expression patterns of metastatic sites of this cancer. To define sets of genes that distinguish primary and metastatic ovarian tumors, we used cDNA microarrays to characterize global gene expression patterns in 38 effusions (28 peritoneal, 10 pleural) and 8 corresponding primary ovarian tumors, and searched for associations between expression patterns and clinical parameters. We observed multidimensional variation in expression patterns among the cancers. Coordinate variation in expression of genes from two chromosomal regions, 8q and 19q, was seen in subsets of the cancers indicating possible amplifications in these regions. A set of 112 unique genes of known function was differentially expressed between primary tumors and effusions using supervised analysis. Relatively few differences were seen between effusions isolated from the pleural and peritoneal cavities or between effusions from patients diagnosed with stage III and stage IV cancers. A set of 84 unique genes was identified that distinguished high from lower grade ovarian cancers. The results were corroborated using immunocytochemistry, mRNA in situ hybridization, and immunoblotting. The extensive variation in expression patterns observed underscores the molecular heterogeneity of ovarian cancer, but suggests a similar molecular profile for ovarian carcinoma cells in serosal cavities.

39

References1. Jemal H, Murray T, Samuels A, Ghafoor A, Ward E, Thun M. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin 2003;53:5-26.2. Flam F, Einhorn N, Sjovall K. Symptomatology of ovarian cancer. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1988;27:53-7.3. Curtin JP, Malik R, Venkatraman ES, Barakat RR, Hoskins WJ. Stage IV ovarian cancer: impact of surgical debulking. Gynecol Oncol 1997;64:9-12.4. Bonnefoi H, A’Hern RP, Fisher C, Macfarlane V, Barton D, Blake P, et al. Natural history of stage IV epithelial ovarian cancer. J Clin Oncol 1999;17:765-75. 5. Davidson B, Risberg R, Reich R, Berner A. Effusion Cytology in Ovarian Cancer- New Molecular Methods as Aids to Diagnosis and Prognosis. Clin Lab Med 2003;23:729-754. 6. Davidson B. Malignant effusions: from diagnosis to biology (Review). Diagn Cytopathol 2004;31:246-254.7. Cuendet M, Pezzuto JM. The role of cyclooxygenase and lipoxygenase in cancer chemoprevention. Drug Metabol Drug Interact. 2000;17:109-157. 8. Honn KV, Bockman RS, Marnett LJ. Prostaglandins and cancer: a review of tumor initiation through tumor metastasis. Prostaglandins. 1981;21:833-864.9. Reich R, Martin GR. Identification of Arachidonic acid pathways required for the invasive and metastatic activity of malignant tumor cells. Prostaglandins. 1996;51:1-17.10. Attiga FA, Fernandez PM, Weeraratna AT, Manyak MJ, Patierno SR. Inhibitors of prostaglandin synthesis inhibit human prostate tumor cell invasiveness and reduce the release of matrix metalloproteinases. Cancer Res. 2000;60:4629-4637.11. Kol S, Ben-Shlomo I, Payne DW, Ando M, Rohan RM, Adashi EY. Glucocorticoids suppress basal (but not interleukin-1-supported) ovarian phospholipase A2 activity: evidence for glucocorticoid receptor mediated regulation. Mol Cell Endocrinol. 1998;137:117-125.12. Li J, Li M, Tsang BK. Regulation of cytosolic phospholipase A2 in hen granulosa cells by transforming growth factors at different stages of follicular development. Biol Reprod. 1997;57:929-935.13. Sengupta S, Xiao YJ, Xu Y. A novel laminin-induced LPA autocrine loop in the migration of ovarian cancer cells. FASEB J. 2003;17:1570-1572.14. Eder AM, Sasagawa T, Mao M, Aoki J, Mills GB. Constitutive and lysophosphatidic acid (LPA)-induced LPA production: role of phospholipase D and phospholipase A2. Clin Cancer Res. 2000;6:2482-2491.15. Wulfkuhle JD, Aquino JA, Calvert VS, Fishman DA, Coukos G, Liotta LA, Petricoin EF, 3rd. Signal pathway profiling of ovarian cancer from human tissue specimens using reverse-phase protein microarrays. Proteomics 2003;3:2085-2090.16. Nishizuka S, Charboneau L, Young L, Major S, Reinhold WC, Waltham M, Kouros- Mehr H, Bussey KJ, Lee JK, Espina V, Munson PJ, Petricoin E, 3rd, Liotta LA, Weinstein JN. Proteomic profiling of the NCI-60 cancer cell lines using new high- density reverse-phase lysate microarrays. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:14229-14234.17. Nishizuka S, Chen ST, Gwadry FG, Alexander J, Major SM, Scherf U, Reinhold WC, Waltham M, Charboneau L, Young L, Bussey KJ, Kim S, Lababidi S, Lee JK, Pittaluga S, Scudiero DA, Sausville EA, Munson PJ, Petricoin EF, 3rd, Liotta LA, Hewitt SM, Raffeld M, Weinstein JN. Diagnostic markers that distinguish colon and ovarian adenocarcinomas: identification by genomic, proteomic, and tissue array profiling. Cancer Res 2003;63:5243-5250.

40

18. Givant-Horwitz V, Davidson B, Lazarovici P, Schaefer E, Nesland JM, Trope CG, Reich R. Mitogen-activated protein kinases (MAPK) as predictors of clinical outcome in serous ovarian carcinoma in effusions. Gynecol Oncol 2003;91:160-172.19. Seidman R, Gitelman I, Sagi O, Horwitz SB, Wolfson M. The role of ERK 1/2 and p38 MAP-kinase pathways in taxol-induced apoptosis in human ovarian carcinoma cells. Exp Cell Res 2001;268:84-92.20. Altomare DA, Wang HQ, Skele KL, De Rienzo A, Klein-Szanto AJ, Godwin AK, Testa JR. AKT and mTOR phosphorylation is frequently detected in ovarian cancer and can be targeted to disrupt ovarian tumor cell growth. Oncogene 2004;23:5853-5857.21. Schwartz DR, Kardia SL, Shedden KA, Kuick R, Michailidis G, Taylor JM, Misek DE, Wu R, Zhai Y, Darrah DM, Reed H, Ellenson LH, Giordano TJ, Fearon ER, Hanash SM, Cho KR. Gene expression in ovarian cancer reflects both morphology and biological behavior, distinguishing clear cell from other poor- prognosis ovarian carcinomas. Cancer Res 2002;2: 6722-6726.22. Haviv I, Campbell IG. DNA microarrays for assessing ovarian cancer gene expression. Mol Cell Endocrinol 2002;191:121-126.23. Jazaeri, AA, Yee CJ, Sotiriou C, Brantley KR, Boyd J, Liu ET. Gene expression profiles of BRCA1-linked, BRCA2-linked, and sporadic ovarian cancers. J Natl Cancer Inst 2002;94: 990-1000.24. Bayani J, Brenton JD, Macgregor PF, Beheshti B, Albert M, Nallainathan D, Karaskova J, Rosen B, Murphy J, Laframboise S, Zanke B, Squire JA. Parallel analysis of sporadic primary ovarian carcinomas by spectral karyotyping, comparative genomic hybridization, and expression microarrays. Cancer Res 2002;62: 3466-3476.25. Shridhar V, Lee J, Pandita A, Iturria S, Avula R, Staub J, Morrissey M, Calhoun E, Sen A, Kalli K, Keeney G, Roche P, Cliby W, Lu K, Schmandt R, Mills GB, Bast RC, Jr., James CD, Couch FJ, Hartmann LC, Lillie J, Smith DI. Genetic Analysis of early- versus late-stage ovarian tumors. Cancer Res 2001;61:5895-5904.26. Schummer M, Ng WV, Bumgarner RE, Nelson PS, Schummer B, Bednarski DW, Hassell L, Baldwin RL, Karlan BY, Hood L. Comparative hybridization of an array of 21,500 ovarian cDNAs for the discovery of genes overexpressed in ovarian carcinomas. Gene 1999;238:375-385.27. Martoglio AM, Tom BD, Starkey M, Corps AN, Charnock-Jones DS, Smith SK. Changes in tumorigenesis- and angiogenesis-related gene transcript abundance profiles in ovarian cancer detected by tailored high density cDNA arrays. Mol Med 2000;6:750-765.28. Hough CD, Cho KR, Zonderman AB, Schwartz DR, Morin PJ. Coordinately up-regulated genes in ovarian cancer. Cancer Res 2001;61:3869-3876.29. Schaner ME, Ross DT, Ciaravino G, Sorlie T, Troyanskaya O, Diehn M, Wang YC, Duran GE, Sikic TL, Caldeira S, Skomedal H, Tu IP, Hernandez-Boussard T, Johnson SW, O’Dwyer PJ, Fero MJ, Kristensen GB, Borresen-Dale AL, Hastie T, Tibshirani R, Van De Rijn M, Teng NN, Longacre TA, Botstein D, Brown PO, Sikic BI. Gene expression patterns in ovarian carcinomas. Mol Biol Cell 2003;14: 4376-4386.30. Welsh JB, Zarrinkar PP, Sapinoso LM, Kern SG, Behling CA, Monk BJ, Lockhart DJ, Burger RA, Hampton GM. Analysis of gene expression profiles in normal and neoplastic ovarian tissue samples identifies candidate molecular markers of epithelial ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98:1176-1181.

41

BUILDING A BIO-PROLIFERATION PREVENTION AGENDA

J. Raphael Della RattaBio-Threat Reduction Project Manager

RANSACWashington, DC

This presentation will review the progress of multilateral efforts to secure pathogens and redirect biological expertise in Russia and the CIS, and to stimulate commercial opportunities. The presentation will also discuss the future of U.S.-Russian bio-proliferation prevention cooperation, and what is needed to ensure the agenda moves forward. Also, the presentation will argue for the need to develop a «Track II» dialogue between western and Russian/CIS bio-experts among the non-governmental community, to review the progress of government-funded programs, and to make proposals for new directions for collaborative work.

MERGING IMMUNOTHERAPY AND MOLECULAR DIAGNOSTICS IN THERAPY OF CANCER: TARGETING

K-RAS MUTATIONS AND TELOMERASE IN PANCREATIC CANCER BY THERAPETIC VACCINES

Gaudernack G.Section for Immunotherapy, Norwegian Radium Hospital, Oslo Norway

Molecular alteration in the structure or expression levels of key growth regulating genes offers new opportunities for advanced molecular diagnostics and patient individualized therapy. Mutations in the K-ras gene and expression of the reverse transcriptase subunit of human telomerase (hTERT) occur at a very high frequency in pancreatic cancer. The ras mutations are required for maintaining the malignant phenotype and by re-expressing hTERT, tumour cells escape cellular senescence to become immortal. This makes K-ras and hTERT uniquely attractive as target candidates for therapeutic pancreatic cancer vaccines. We have identified several epitopes in K-ras as well as in hTERT, and designed vaccines aimed at generating both CD4+ and CD8+ tumour-reactive T cells. A number of clinical studies have been performed to determine safety and immunogenicity of these peptide vaccines separately in patients with pancreatic cancer and to correlate immune responses with clinical responses observed in the patients. The majority of patients have been treated in a single centre and none of the patients received prior or concomitant chemotherapy. In all the protocols peptide(s) are injected intradermally over a period of 10 weeks, using GM-CSF (Leucomax) as

42

an adjuvant. Selected patients received booster vaccinations for extended periods. The vaccines have been tested at different dose levels. In these studies more than 500 ras vaccine injections and more than 500 hTERT vaccine injections (up to 18 injections in one patient) have been administered to 85 and 65 patients respectively. No serious adverse events related to the treatments were observed. Specific immune responses measured as DTH in vivo and T cell proliferation in vitro could be induced against both ras and hTERT in the majority of patients. CTLs specific for several epitopes and Th cells restricted by HLA-DR, -DP and -DQ were obtained from vaccinated patients. In general a strong correlation between immune responses and survival was observed in these studies. These results demonstrate that immunity to mutant K-ras and hTERT can be generated safely and effectively in patients and encourage a trial of a combination of the two vaccines in a randomized phase II study.

MODERN BIOSAFETY STANDARDS IN TUBERCULOSIS DIAGNOSTIC (CLINICAL) LABORATORIES . A REVIEW

1Heifets L.B., 2Richmond J.Y.1 – Professor and Director, Mycobacteriology Clinical Reference Laboratory,

National Jewish Medical and Research Center, Denver, Colorado, USA.2 – Director, Office of Health and Safety, Centers for Disease Control and

Prevention, Atlanta, Georgia, USA.

This presentation is based on personal experience of the authors and on Recommendations by the Centers for Disease Control and Prevention.* National tuberculosis control programs cannot be effective without appropriate laboratory services that provide definite diagnosis of tuberculosis and timely detection of patients with drug resistance. Manipulations with diagnostic specimens and pure cultures of M. tuberculosis in TB laboratories represent an inevitable hazard, especially when dealing with isolates from patients in areas with high prevalence of drug resistance. Non-compiance with modern biosafety standards in TB diagnostic laboratories may result in tuberculosis infection not only among laboratory employees, but also among patients and other individuals working or visiting in the building where the laboratory is located. Therefore, without proper implementation of biosafety standards future existence of TB laboratories will be jeopardized. Biosafety in microbiological laboratories is based on implementation of two types of containments (barriers). Primary containment is aimed at protecting laboratory personnel and the laboratory environment. Secondary containment is implemented to protect the external to laboratory environment (for example, individuals in the building where the laboratory is located). There are four levels of biosafety to be implemented in microbiology

43

laboratories depending on infectious agents and the type of manipulations to be done. Currently, biosafety level 3 (BL-3) is the most accepted standard for TB laboratories in the US. In addition to general safety rules and standard microbiological practices, the BL-3 standard includes: 1) special practices, including limited access to the laboratory, all work is conducted under biological safety cabinets (BSC), appropriate training of the personnel, implementation of procedures minimizing creation of aerosols, special decontamination and disposal system, etc., 2) safety equipment, including perodically certified BSC (preferably type IIA), aerosol-contained centrifuges, individual disposable protective gear, disposable glass- and plastic-ware, 3) special architectural design of the laboratory, including separation from the rest of the building, passage through double doors, ante-rooms separating operational rooms (sterile rooms) from the open-bench area, directional airflow sustained by negative pressure in sterile rooms, appropriate for decontamination design of walls, floors, and bench surfaces. Implementation of BL-3 standards should be a goal in all TB laboratories, but it is feasible and cost-effective only in large laboratories. In general, these types of laboratories also represent a precondition for high quality service and cost-effectiveness, but require centralized services system, a part of which is the need for shipment of diagnostic materials. A system for safe shipment of diagnostic specimens and pure M. tuberculosis cultures is already in place in the US. We believe that the US experience in TB laboratory practices may represent a source of information for Russia, which can be beneficial in combating the growing prevalence of drug resistance.

*) Jonathan Y. Richmond is one of authors of this CDC document

44

PUBLIC HEALTH PESPONSE TO BIOTERRORISM: LESSONS LEARNED FROM THE ANTHRAX ATTACKS OF 2001

Stephen A. Morse, M.S.P.H., Ph.D., Associate Director for Science Bioterrorism Preparedness and Response

Program National Center for Infectious DiseasesCenters for Disease Control and Prevention

Atlanta, Georgia 30333

There have been a number of incidents over the past few years that have focused attention on the growing threat of bioterrorism in the United States (U.S.). Although some authorities had initially felt that the threat of bioterrorism was exaggerated, the incident in which spores of Bacillus anthracis were disseminated through the U.S. mail made bioterrorism a reality and focused attention on national preparedness efforts. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) was designated by the Department of Health and Human Services to prepare the nation’s public health system to respond to a bioterrorism event. Beginning in 1999, CDC funded cooperative agreements with every state and several large municipalities that focused on preparedness efforts. Initially, five critical areas were emphasized: preparedness planning and readiness assessment; surveillance and epidemiology capacity; biologic laboratory capacity; chemical laboratory capacity; and health alert network and information technology. Based on lessons learned from the anthrax attacks in 2001, additional resources were provided for communicating health risks and health information dissemination and for education and training.

Bioterrorist attacks can occur as one of two scenarios, i.e., covert and overt. Because we currently lack the ability to conduct real-time monitoring (i.e., detect to warn) for the release of a biological agent, a covert release may go unnoticed, with those exposed leaving the area long before the act of terrorism becomes evident. Because of the incubation period, the first signs that a biological agent has been released may not become apparent until days or weeks later when individuals become ill and seek medical care. Thus, the «first responders» to a covert bioterrorism event will likely be the astute clinician, laboratorian, or public health worker who recognizes the index case or identifies the responsible agent. Because of their terrorism response training, traditional «first responders» (e.g., firefighters or law enforcement) are the most likely to respond to an overt release of a biological or, more likely, to a hoax. Thus, the initial recognition and response to bioterrorism, whether covert or overt, would be at the local level.

A comprehensive public health response to bioterrorism involved epidemiologic investigation, medical treatment and prophylaxis for affected persons, and the initiation of disease prevention activities. The success of these activities is dependent, to a large extent, upon a rapid and accurate identification of the threat agent, since there is only a small window of opportunity during which prophylaxis or other

45

control measures can be implemented. The Laboratory Response Network (LRN) was created in order to facilitate the rapid identification of the threat agent. It was established because the existing national laboratory infrastructure competent to deal with biological and chemical terrorism was extremely limited. The LRN was developed by the CDC in concert with the Association of Public Health Laboratories and with collaboration with the Federal Bureau of Investigation and the U.S. Army Medical Research Institute of Infectious Diseases. It builds on the existing interaction of nationwide public health laboratories, which participate in routine disease surveillance activities, and performs a dual function in that it has the ability to detect and respond to agents that occur naturally (e.g., SARS, monkey pox) as well as those that are intentionally released. LRN members operate as either sentinel or reference laboratories. Sentinel laboratories are, for the most part, hospital and other community clinical laboratories, since in the aftermath of a covert bioterrorism attack, patients will seek care at many widely dispersed hospitals where these laboratories exist. These laboratories participate in the LRN by using simple algorithms to rule out or refer the agents that they encounter in their routine work to nearby LRN reference laboratories. Reference laboratories use standard protocols and reagents for the rapid identification and confirmation of threat agents. There are currently 152 LRN reference laboratories in the U.S., Canada, Mexico, United Kingdom, Australia, Germany, and South Korea. There are also federal laboratories with biosafety level 4 facilities that can handle agents such as Ebola and Variola major, for which other laboratories have insufficient safety facilities or unvaccinated staff. The federal laboratories also identify agents in specimens that have been referred by LRN reference laboratories, identify recombinant organisms (e.g., chimeras) that may not be recognizable by conventional methods, and maintain extensive culture collections of critical agents against which the isolate(s) from an outbreak may be compared using molecular methods to determine its source. The LRN played a critical and successful role in the nation’s response to the bioterrorism-related anthrax incidents of 2001. Over an eight week period, LRN laboratories tested over 125,000 clinical specimens and environmental samples involving approximately 1 million assays.

46

BIOSECURITY AND BIOSAFETY IN THE UNITED STATES IN THE 21st CENTURY

Stephen A. Morse, M.S.P.H., Ph.D. Bioterrorism Preparedness and Response Program

Centers for Disease Control and Prevention Atlanta, Georgia 30333

The events of September 11, 2001 and the subsequent dissemination of spores of Bacillus anthracis through the United States postal system underscored the dangers to national and international security posed by terrorist attacks, especially those involving pathogenic microorganisms and toxins. Subsequent to these events, state-sponsored biological weapons programs and terrorists believed to have pursued biological weapons have attracted increased attention and concern. The general public has also developed an unprecedented fascination with, and fears of, the powers of biotechnology and bioterrorism. As a result, the conduct of bioscience research in the United States has changed in the aftermath of these events. Many different strategies are currently being applied to combat the proliferation and use of biological weapons. Some of these involve increasing research activities such as the development of rapid diagnostic tests, developing and stockpiling vaccines and antimicrobials, improving disease surveillance and detection, building public health capacities, and developing biosensor technologies. These activities are reactionary in nature and focus on improving the ability to detect and respond to a bioterrorist event after it has occurred. Preventive strategies are also being employed, often in response to laws passed by the U. S. Congress. One of the principal preventive strategies is called biosecurity. The microbiological community in the United States has not reached a consensus of a clear definition of the term “biosecurity” nor has universally accepted this concept. Nevertheless, biosecurity has become integrated into many biologic research activities in the U.S. Biosecurity has several purposes. First, it aims to stop proliferation before it starts by protecting dangerous pathogens and toxins against theft or malicious diversion from bioscience institutions. Provisions within the USA Patriot Act and the Public Health Security and Bioterrorism Response Act of 2002 specifically address this aspect of biosecurity and stress the role of biosafety. A biosafety program has become an integral part of a biosecurity system; both are now critical to the operation of a modern bioscience institution. Simply, biosafety programs aim to protect people from dangerous pathogens, while biosecurity aims to protect pathogens from dangerous people. Bioscience has been responsible for the development of medicines, vaccines and technologies needed to counter the threat of bioterrorism and naturally occurring diseases. However, many of the same tools, techniques, and knowledge that have beneficial uses could, if misapplied, be used to destroy human life and agriculture on a large scale. It is this recognition of dual use that other components of biosecurity attempt to address. Although biosecurity cannot in and of itself prevent biological weapon proliferation and bioterrorism, it is appropriate to take steps that reduce the probability that high-consequence pathogens and toxins will be stolen or that dual-use technology will be used to develop biological weapons. However, a balance between security and research must be achieved in order to protect critical assets as well as allow vital bioscience to advance.

47

THE NEED FOR CONTROL AND SECURITY TO PREVENT BIOTERRORISM

Roger RoffeySwedish Defence Research

Agency (FOI), Stockholm, SwedenE-mail roger.roffey@foi.se

Presented at, the Second International Conference on Molecular Medicine and Biosafety, in Moscow, 20-21 October, 2005.

AbstractDuring the 1990s the problems connected with proliferation of biological

weapons and risks with mass casualty bioterrorism has come to the forefront of attention and the dual-use character of materials and equipment, the small amounts of agents initially needed, relative ease to produce, and the dynamic nature of biotechnology, requires an effective strategy for control and oversight. The international community has tried to prevent the proliferation of biological weapons, related materials and know-how but with so far limited progress to which can be added the set back due to the collapse 2001 of the multilateral negotiations to strengthen the BTWC (Biological and Toxin Weapons Convention) with a control mechanism. The safe keeping and security of biological agents, biosecurity concerns the international community, governments, industries, laboratories as well as individuals. One way of limiting the ease of terrorists to acquire biological agents is to establish improved biosecurity measures at facilities and a national oversight system. It has been proposed to develop international biosecurity standards or a protocol that could include legal commitments, set of universal standards, and an oversight mechanism. It could further include emergency response plans in case of biosecurity breaches, mechanism for accounting and controlling pathogens and toxins when storing, using or transferring, registration/licensing of facilities and/or personnel working with dangerous pathogens, and physical security measures1 as well as methods for making tracing of agents used in bioterrorism attacks easier. It has also been pointed out the need to include in such a regime measures for transparency of national biodefence/bioterrorism prevention programs2. The regulations should include for example, a dedicated national authority, a list of dangerous pathogens and toxins listed according to biosecurity risk and list of facilities handling or storing such agents, a requirement

1Tucker, J., A strategy for international harmonization of biosecurity standards under SCR 1540, Presented at Workshop on U.N. Security Council Resolution 1540 as it pertains to biological weapons, Palais des Nations, Geneva, 3 December, 2004. 2Atlas, 2R. M. and J. Reppy, Globalizing biosecurity, ‘Biosecurity and bioterrorism: Biodefense strategy, practice, and science’, Vol. 3, No. 3, (2005), pp 51-60.

48

to implement physical security measures, actions taken to limit access to listed agents and penalties if regulations are not followed. It is essential to establish an effective and internationally accepted system for oversight that should include a national authority covering the biological area overseeing type of work, safety of workers, security of agents and toxins as well as sensitive know-how to prevent terrorists from acquiring agents or know-how. This authority should also oversee the international obligations and their implementation, biosafety and biosecurity recommendations and also international export and transport regulations etc. This authority should also be given the mandate to monitor documentation and perform visits to facilities to see that rules and regulations are enforced.

IntroductionDuring the last five years the perceived threat from BW and bioterrorism has

changed due to actual use and the enhanced risk of mass casualty trans-national terrorism with WMD ambitions. This has been shown by the terrorist attacks causing mass casualties in USA 2001 and Spain 2004, focusing international attention on the fight against terrorism. An analysis of potential threats up to 2020 has pointed to that most terrorists will continue to primarily use conventional methods, but a concern is that some groups might use biological agents and cause mass casualties, especially smaller well informed terror groups. Terrorist use of biological agents is likely and the range of options will grow3. Another factor is the rapid progress in biotechnology and its potential for misuse to create more efficient biological warfare agents that could be a driving force for promoting such programmes opening new possibilities for future potential military misuse4. According to Interpol ‘the evidence uncovered by law enforcement and concerns voiced at global, regional and national levels regarding the potential use of biological agents by terrorists to perpetrate a mass casualty attack demonstrate that we face a very real and present threat’5. According to Europol the threat of terrorist actions within the European Union (EU) is posed by a wide number of groups and organisations ranging from international Islamic extremist networks and large-scale Nationalist groups down to violent political extremist activists, generally carrying out acts of sabotage and criminal damage. Recent plans of terrorists to use BC-agents were stopped in UK, France and Italy indicating the

3National Intelligence Council, Mapping the Global Future, Report of the National Intelligence Council’s2020 Project, NIC-2004-13, December 2004, p. 95. 4Mapping The Global Future: Report Of The National Intelligence Council’s 2020 Project, available athttp://www.cia.gov/nic/NIC_2020_project.html 5Interpol Media Release, 01 March 2005,http://www.interpol.int/Public/ICPO/PressReleases/PR2005/PR200510.asp, (accessed March 8, 2005)

49

potential threat to Europe 6 7 8 9 10. To this can be added that Al-Qaeda’s stated intention to conduct an attack exceeding the destruction of 9/11 raises the possibility that planned attacks may involve unconventional weapons11. According to US intelligence over the next 15 years Al Qaeda will be replaced by even more decentralized Muslim militants who will depend on globalization to find recruits and stage attacks. The present Iraq conflict could provide recruitment for a new class of militants, who would disperse and gradually replace the previous al Qaeda members. It is stated in the report ‘our greatest concern is that these groups might acquire biological agents or less likely, a nuclear device, either of which could cause mass casualties’. The assessment was that the key factors behind terrorism show no signs of changing over the next 15 years. The potential groups could be less constraint and use of BC-agents could well be of interest. Trying to assess the threat from terrorist groups or other criminals is difficult. The risk of terrorists using biological or chemical agents might well have increased after the attack on the World Trade Center and Pentagon in USA on September 11th 2001. It should be mentioned that many disease causing agents are handled in hospitals and research institutes where there in many cases still are limited controls and security to prevent stealing. A smaller scale production of agents is in addition not too difficult. Agents can also be disseminated with simple technology but with low efficiency and not causing mass casualties. To carry out an attack that would cause mass deaths technical knowledge and special equipment will be required. There are a number of reasons for increased risk of bioterrorism:

- New breed of terrorists, using more lethal and non-discriminatory violence

- It has been demonstrated that terrorists can and will go as far as causing mass deaths.

- A barrier has been passed when live Anthrax bacteria has been used.- Lax control of NBC-related materials in the FSU

6Interview with Pierre Bosquet de Florian, Head of the Direction de surveillance du territoire (DST, France), L’Express, 27 November 2003. 7Group warns Europe of more terror attacks, The Associated Press, 2 July, 2004. 8British court charges 4 men as terrorists, arrests spread, The New York Times, Section A, p. 13, col. 6, 14 January 2002. 9Terrorist chemical threat ‘worse than suspected’, The Financial Times, 11 April, 2004. 10 Eric Coddy, Matthew Osborne, and Kimberly McCloud, »Chemical Terrorist Plot in Rome?» Research Story of the Week, Center for Nonproliferation Studies, MontereyInstitute of International Studies, accessed at [http://cns.miis.edu/pubs/week/020311.htm], on March 19, 2003. 11US DIA, Current and projected national security threats to the United States, Director, Defense Intelligence Agency, Lowell E. Jacoby, Statement for the record Senate Select Committee on Intelligence, 16 February, 2005.

50

- A range of terrorist groups had sought agents and some have probably managed to obtain some agents and materials.

- Required technology for production is readily available- Relative ease to acquire BW-agents- Preparations for a BW attack are difficult to detect beforehand- Slow progress in developing reliable detection systems that can be used

widely- Difficult to have appropriate countermeasures in place due to covert

attacks- Large media impact with BW which can cause panic in general public,

difficult information problem- Use of biological agents fits with the asymmetric warfare strategy of

terrorists- Trend towards no prior warning and mass casualty events- New targets and methods need to give the right terror effect

International developmentsThe terrorism threat is becoming a more global and network based threat

why active and enhanced international cooperation at all levels is a necessity for prevention and to enhance preparedness. The international community has tried to prevent the proliferation of biological weapons, related materials and know-how but with so far somewhat limited progress to which can be added the set back due to the collapse 2001 of the multilateral negotiations to strengthen the BTWC (Biological and Toxin Weapons Convention) with a control mechanism. Arms control and disarmament actions in the biological area have been found to be more difficult than for other WMD categories not least due to political but also for practical reasons. One factor being the ease of acquiring dual use materials and technologies as well as know-how for small scale production. In addition the extreme secrecy that has always surrounded work in the BW-area and the well known difficulties in identifying prohibited activities especially for non-state actors and technical challenges as well as political in being able to verify that materials or activities are not being used for hostile purposes. Threat assessment and intelligence is crucial in order to monitor the risks with BW and recently the inherent limitation of intelligence information in this area has again been clearly demonstrated in the case of Iraq. A consequence of this is that there is no exact knowledge of current state or non-state activities in the biological area or even of which agents are being worked on but only suspicions and knowledgeable assumptions.

The European Security Strategy entitled, ‘A secure Europe in a better world’ was adopted by the European Council in December 2003 which identifies the proliferation of weapons of mass destruction as a key and potentially the greatest threat for EU security12. The international treaty regimes and export

51

control arrangements have slowed the spread of WMD and delivery systems but there is now, a new and dangerous period that raises the possibility of a WMD arms race, especially in the Middle East. Advances in the biological sciences may increase the potency of biological weapons in the coming years; attacks with chemical and radiological materials are also a serious possibility. The spread of missile technology adds a further element of instability and could put Europe at increasing risk. The most frightening scenario is one in which terrorist groups acquire weapons of mass destruction and could inflict damages on a scale previously possible only for States. The «new threat» of outbreaks of communicable disease and the need for a comprehensive EU approach to it, was also identified in the security strategy.

Biological defence and anti-bioterrorism programmes will continue to play a crucial role in preventing bioterrorism. These programs must always try to demonstrate for the general public, their personnel participating and for outside observers that that they are purely defensive. There is though a danger, when like the US biodefence/bioterrorism prevention work has increased very much and now involves many US Departments and subcontractors at universities or in industry why federal control becomes more difficult13.

Biosecurity can be said to cover a broad range of measures to prevent and respond to possible deliberate release of biological agents due to theft or unauthorised acquisition of biological agents or materials by for example terrorists. It is connected with work at a facility or laboratory as well as transfer of agents. One essential part of a biosecurity system is a system of epidemiological surveillance that is effective, rapidly responds and covers from the local, regional to the national level in a country. This is important as it will enable at an early stage detect intentional releases of biological agents or unintentional leakages in addition to natural outbreaks of infectious diseases. Connected to this is the requirement for a capacity to rapidly identify any potential disease using rapid, reliable, standardised and internationally accepted diagnostic methods to be able to confirm any suspected cases of infectious disease outbreaks, breaches of biosecurity and to characterise the agent involved. Important is to have national legislation and regulations and that they cover relevant areas and is enforced.

Biosecurity concerns the international community, governments, industries, laboratories as well as individuals. For some time now the WHO (World Health Organisation) has together with other relevant international organisations initiated work on developing guidelines for biosecurity. Even if this work is not yet finished

12European Security Strategy, A secure Europe in a better world, Brussels, 12 December 2003, at URL http://ue.eu.int/ueDocs/cms_Data/docs/pressData/en/reports/78367.pdf 13Rosenberg, B. H., Defending against biodefence: The need for limits, The Acronym Institute, BWC Special Paper No. 1, January 2003, at URL http://www.acronym.org.uk/bwc/spec01.htm

52

there now exists a draft text of a definition. Facility or laboratory biosecurity as defined by the WHO14 refers to ‘managerial, administrative, technical and physical measures designed to prevent the loss, theft and/or misuse of valuable biological materials.’ Laboratory biosecurity is primarily achieved through ‘administrative and procedural requirements that clearly identify the threats to be addressed, the materials to be protected, the responsibilities of workers, and the measures that restrict access to these materials by unauthorized individuals’ An effective biosecurity programme should be based on risk management and should include many components, implemented in a graded manner to mitigate the identified risks. A well-designed biosecurity programme will include all of the following elements: risk assessment, physical security, personnel management, scientific oversight, dangerous pathogen/toxin control and accountability, transport security, and information security15. Biosecurity is facilitated by the establishment of a culture of responsibility and accountability among those who handle, use, store and oversee work with pathogens and other valuable biological materials. Laboratory biosecurity practices should be a logical extension of good laboratory biosafety procedures and good management practices. A fundamental benefit of laboratory biosecurity is the reduction of the risk that valuable biological materials may be lost, subject to unauthorized access, stolen or used inappropriately. Laboratory biosecurity and laboratory biosafety are both essential to good laboratory practice. The primary objective of both is to keep dangerous and valuable biological materials safe and secure inside the laboratory. Laboratory biosecurity relies, first and foremost, on sound laboratory biosafety practices. WHO defines ‘laboratory biosafety’ as the containment principles, technologies, and practices that are implemented to prevent unintentional exposure to pathogens or their accidental release as well as to keep pathogens within a limited space or area16.

It has been proposed to develop international biosecurity standards or a protocol that would prevent proliferators and terrorists from acquiring biological warfare agents and know-how as well as making tracing of agents used in bioterrorism attacks easier. This could include legal commitments, set of universal standards, and an oversight mechanism. It could further include emergency

14World Health Organization, Laboratory Biosafety Manual, third edition (revised) (2004), http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/who_cds_csr_lyo_20034/en/. 15Tucker, J., A strategy for international harmonization of biosecurity standards under SCR 1540, Presented at Workshop on U.N. Security Council Resolution 1540 as it pertains to biological weapons, Palais des Nations, Geneva, 3 December, 2004. 16Daoust-Maleval, I., A tool for biosecurity: Quality management, Inter Parliament Conference, Organized by the European Commission’s non-proliferation and disarmament co-operation initiative (NDCI), Strengthening the Global Partnership, International Consortium Meeting Strasbourg, 20-21 November, 2003, at URL http://www.sgpproject.org/events/2003_Nov_Strasbourg.html

53

response plans in case of biosecurity breaches, mechanism for accounting and controlling pathogens and toxins when storing, using or transferring, registration/licencing of facilities and/or personnel working with dangerous pathogens, and physical security measures17. Work is said to be in progress on a code to establish a global network on biosecurity18. It has also been pointed out the need to include in such a regime measures for transparency of national biodefence programs19.

The need for biosecurity has intensified with economic globalization, rapid improvements in communications, transport, trade, technological progress, and increased awareness of biodiversity. In the framework of the BTWC ‘new process’ biosecurity was one topic for discussion during the 2004 expert meeting in Geneva. Other groups like the G 7+ Global Health Security Action Group, the G 8 Global Partnership, the OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development), and the EU have all taken initiatives in this area.

In the report of the UN High Level Panel it is mentioned that the security of the most affluent State can be held hostage to the ability of the poorest State to contain an emerging disease. Every threat to international security today enlarges the risk of other threats. Improving global disease monitoring capabilities can be seen as a means of fighting new emerging infectious disease, defending against the threat of biological terrorism and building effective responsible states. That a high damage biological attack has not occurred is not a cause for complacency but a call for urgent prevention. The report further states that States Parties to the BTWC should without delay return to negotiations for a credible verification protocol. It further says that States Parties to the BTWC should also negotiate a new bio-security protocol to classify dangerous biological agents and establish binding international standards for the export of such agents. It calls attention to the overall deterioration of the global health system, which is ill-equipped to protect us against existing and emerging infectious diseases, and it highlights both the promise and the peril of advances in biotechnology20,21.

The OECD (the Organization for Economic Cooperation and Development) countries have systems in place to address biosafety and the systems employed by many also indirectly addressed the question of biosecurity22. An example of an initiative to secure dangerous pathogens, biological resource centres (BRC)

19Atlas, R. M. and J. Reppy, Globalizing biosecurity, ‘Biosecurity and bioterrorism: Biodefense strategy, practice, and science’, Vol. 3, No. 3, (2005), pp 51-60. 20United Nations Secretary-Generals forward in: A more secure world: Our shared responsibility, Report of the Secretary-General’s High-level Panel on Threats, Challenges and Change, 2004. 21UN report from the High level Panel on Threats, Challenges and Change, A/59/565, December 2004. 22OECD International futures programme (IFP), ‘Promoting Responsible Stewardship in the Biosciences: Avoiding Potential Abuse of Research and Resources’, Chairman’s Summary, Frascati, Italy, 17-19 September, 2004

54

is carried forward by OECD, a group of thirty-one advanced industrial countries (including the EU as one member). The aim is to establish a global network of BRCs and to harmonise national standards and regulations to ensure the availability of rare biological resources and permit free exchange of microbial cultures. To certify and enforce the agreed standards on a national basis, the OECD Task Force will set up an accreditation system. Each participating government will select a certifying agency, which will conduct periodic checks of biosafety and biosecurity at the participating BRCs. The BRC consist of service providers and repositories of the living cells, genomes of organism, and information relating to heredity and the functions of biological systems. BRCs contain collections of culturable organisms (e.g. micro-organisms, plant, animal and human cells), replicable parts of these (e.g. genomes, plasmids, viruses, cDNAs), viable but not yet culturable organisms, cells and tissues, as well as databases containing molecular, physiological and structural information relevant to these collections and related bioinformatics23.

The UN Security Council on April 28th 2004 adopted a resolution asking states to take steps to deny and punish terrorists seeking WMD and their means of delivery. States are requested to adopt and enforce ‘appropriate, effective’ laws and measures, such as export and border controls, to prevent non-state actors from acquiring and manufacturing WMD or related materials24. It is also mentioned that states should take cooperative actions to prevent illicit trafficking. States should adopt national rules and regulations where it has not been done25 26. Governments should report in 6 months to a Committee charged with reporting on its implementation to the UNSC. It is significant that the resolution was adopted under Article VII of the UN Charter, which recognizes punitive actions to preserve peace and security. It was also stated that none of the obligations set forth in this resolution shall be interpreted so as to conflict with or alter the rights and obligations to other arms control accords27.

Another example is making biological or toxin terrorism an international

23Definition based on the one adopted at the 1999 Tokyo Workshop on Biological Resource Centres, where the concept of BRCs as an outgrowth of conventional pre-genomics ex situ collections of biological materials was developed – and incorporating scientific developments since 1999. 24United Nations, Resolution 1540 adopted by the Security Council at its 4956th meeting, 28 April, 2004. 25UN Security Council unanimously passes resolution on WMD, measures designed to punish those who sell WMD components, technology, US State Department, News from the Washington File, 28 April, 2004. 26UN adopts resolution to keep weapons of mass destruction from terrorists, Associated Press 28 April 2004. 27Security Council Unanimously Adopts Resolution on Denying Terrorists WMD, Arms Control Today, May, 2004, p34.

55

crime which would clearly establish a powerful norm, would facilitate detection and interdiction as well as promoting international cooperation28. It would create international law obligations not only to adopt criminal laws but also to vigorously enforce them29. There is a draft that is based on seven model treaties that establish universal jurisdiction:30

In the Russian Federation the Ministry of Health and Social Development has prepared a Federal program on biosecurity and indicated that Russia needs to create an effective biosecurity system. Supporting chemical and biological security is one of the most important ways of strengthening the Russian Federation’s national security31. The president of the Russian Federation shall maintain overall supervision of the implementation of these fundamental principles. The program will cover such aspects as coordination of scientific research, creation of a system for early identification of dangerous pathogens, refurbishing scientific centres with new equipment, enhancing biosecurity and biosafety of facilities containing large quantities of dangerous pathogens, creation in collaboration with the customs service of a more effective system of control on the borders and on entire Russia’s territory, and providing new equipment to medical centres and epidemiology control centres32 33. A governmental commission on biological and chemical security has been set up under the leadership of the Minister for Health and Social Development. This commission is to include representation from all the security ministries, the ministries of science and education and agriculture at no less than deputy ministerial level34 35. From 2006 the Ministry of Health and Social Development with other Federal agencies should deliver an annual report on

28Kellman, B., Criminalization and control of WMD proliferation, the Security Council acts & template of national measures to prevent bio-crimes, Presented at Workshop on Security Council Resolution 1540 and biological weapons, Geneva, 3 December, 2004. 29Gilman, T. K., Search sentence, and (don’t) sell: combating the threat of biological weapons through inspections, criminalization, and restrictions on equipment, Journal of Transnational Law & Policy, Vol 12:2, p217-253, 2003. 30Draft Model Convention on the Prohibition and Prevention of Biological Terrorism, Terrorism and Political Violence, London, Vol 14, No 4, PP 163-208 31Unattributed article: «Fundamental Principles of State Policy on Chemical and Biological Security of the Russian Federation in the Period to 2010 and the Long Term» (FBIS Translated Text, FBIS-SOV-2004-0408), Moscow Rossiyskaya Gazeta in Russian 7 Apr 2004. 32Joby Warrick, «Russia Denies U.S. Access on Bioweapons,» The Washington Post, September 8, 2002 lxxvi G8 Action Plan on Nonproliferation. http://www.g8usa.gov/documents.htm 33http://www.informeco.ru/stat.php?stat=231 34Public Health Chief Onishchenko says Russian biosecurity ‘cause of concern’, Moscow Nezavisimaya Gazeta in Russian 15 October 2004, FBIS-SOV-2004-1015, 20 October, 2004. 35Russia sets up Commission to fight biological threat, Monnews, 14 February, 2005, at URL http://www.mosnews.com/news/2005/02/14/biodefence.shtml

56

progress to lower the negative effects of dangerous biological agents and chemical substances of natural or man-made origin on the population, biosphere and man-made installations, with proposals of perfecting the state system of biological and chemical security in the Russian Federation. Other involved ministries are Ministry of Defence, Ministry of Foreign Affairs, Ministry of Emergencies, Ministry of Natural Resources and Ministry of Industry and Energy36.

Codes of Practice that complement legislation and regulations may be produced by national authorities to set out how these should be implemented. There are a number of these common practices that should be promoted like Good Manufacturing Practice (GMP),37 38 39 Good Laboratory Practice (GLP)40 and Good Microbiological Technique (GMT)41. There is a need to intensify training and education concerning biosafety and biosecurity as well as promoting other codes of practice and code of conduct for scientists in Russia and NIS. The bottom-up approach directly involving the scientists is essential42. In many states the national regulations for pathogenic microorganisms and toxins require those engaged in working with such materials to be appropriately qualified and trained. An ethical review process might well make a positive contribution to security and oversight of pathogenic microorganisms and toxins43 44.

The science community voluntarily conforms to codes of conduct on issues

36Russian government tightens grip on country’s biological, chemical security, BBC/Itar Tass, 19 May, 2005, at URL http://www.sgpproject.org/Personal%20Use%20Only/RUCWBWSecurity.html 37European Commission, The rules governing medicinal products in the European Union, Volume 4, Good Manufacturing Practices, Medicinal products for human and veterinary use, 1998 Edition, Update of legal references in August 2004, at URL http://pharmacos.eudra.org/F2/eudralex/vol-4/pdfs-en/intr4en.pdf 38WHO, Quality assuarance of pharmaceuticals: A compendium of guidelines and related materials, Volume 2, Good Manufacturing Practices and inspections, at URL http://www.who.int/medicines/organization/qsm/activities/qualityassurance/gmp/gmpintro.html 39US department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, 21 CFR Parts 808, 812 and 820 Medical Devices; Current Good Manufacturing Practice (CGMP); Final Rule, Federal register No 52601, 7 October, 1996. 40OECD, Series on principles of Good Laboratory Practice and compliance monitoring, Number 1, ENV/MC/CHEM(98)17, 26 January, 1998, at URL http://www.oecd.org/document/63/0,2340,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html 41World Health Organization, Laboratory Biosafety Manual, Third Edition, 2004, at URL http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/en/Biosafety7.pdf 42Averre, D., K. N. Luongo and M. Martellini, Advancing bio threat reduction, findings from an international conference, Landau Network Centro-Volta and Russian American Nuclear Security Advisory Council, 2004. 43Pearson, G. and M. Dando, Maximizing the security and improving oversight of pathogenic microorganisms and toxins, Strengthening the Biological Weapons Convention, Briefing Paper, No 5, Department of Peace Studies, University of Bradford, July 2003. 44Graham S. Pearson, National Measures to Establish and Maintain the Security and

57

such as research ethics and professional conduct. Self-regulation has worked well in these and other areas. Initiatives are underway to apply a self-regulatory approach in the context of balancing scientific freedom and biosecurity. This approach has to be complemented by a regulatory framework45.

ConclusionsInternational biosecurity standards should be promoted and could be taken

up in the framework of the BTWC with active support of WHO, FAO and OIE. There is also a need for an effective national biosecurity system that will cover both national regulations and an oversight mechanism. The regulations should include for example: a dedicated national authority, a list of dangerous pathogens and toxins listed according to biosecurity risk and list of facilities handling or storing such agents, a requirement to implement physical security measures, measures taken to limit access to listed agents and penalties if regulations are not followed. One area of research and development to be promoted is developing rapid diagnostic methods and also methods also methods for tracing biological agents that might have been used for bioterrorist attacks. To enable government oversight also of non-governmental facilities for example, a register or licensing system of facilities and/or personnel handling or transporting listed agents, powers to be able to inspect facilities and possibility to review security measures implemented. Monitoring such an overview could be part of the task of a national authority responsible for the implementation of the BTWC.

It is essential to establish an effective and internationally accepted system for oversight of storage, work or transfer of dangerous pathogens or toxins. This authority should be a national authority concerning the biological area overseeing type of work, safety of workers, security of agents and toxins as well as of sensitive know-how to prevent terrorists from acquiring agents or know-how. This authority should also oversee or establish national lists with agents classified according to risk. This authority could also oversee the international obligations of implementation such as for the BTWC, UNSC resolution 1540, biosafety and biosecurity recommendations and also international export and transport regulations etc. This authority should also be given the mandate to monitor documentation and perform visits to facilities to see that rules and regulations are rigorously enforced. International exchanges and cooperation with similar authorities in other countries are important and should be promoted to so as to work towards international harmonised rules and regulations.

Oversight of Pathogenic Microorganisms and Toxins, University of Bradford, Department of Peace Studies, Briefing Paper No.4 (Second Series), April 2003. 45OECD, International futures programme (IFP), Promoting Responsible Stewardship in the Biosciences: Avoiding Potential Abuse of Research and Resources, Chairman’s Summary, Frascati, Italy, 17-19 September, 2004.

58

BIOSAFETY AND VBNC MICROORGANISMS

Mizunoe Y.Department of Bacteriology, Faculty of Medical Sciences, Kyushu University, Japan

A bacterium in the VBNC state is defined as a cell which can be demonstrated to be metabolically active, while beeing incapable of undergoing the sustained cellular division requied for growth in or on a medium normally supporting growth of the cell. Bacteria in VBNC state have been a major concern in public health risk assessment since many pathogenic bacteria have been shown to enter a VBNC state from which they escape detection and are able to resuscitate to the infectious state following, for example temperature upshift or animal passage. However, the existence of VBNC state is controversial since the biochemical parameters that define a cell as viable or dead have not been agreed upon. We have demonstrated the resuscitation of VBNC cells of several pathogens including V. parahaemolyticus, EHEC and Aeromonas hydrophila by inoculating onto an agar medium amended with catalase or nonenzyme peroxide-degrading compounds such as sodium pyruvate or ketoglutaric acid. We eliminated the incubation process after a temperature upshift of VBNC cell suspension in which regrowth might have occurred, so that the colonies emerging on the supplemented plates are regarded as a consequence of true resuscitation. It is proposed that a sudden transfer of injured or starved cells to nutrient-rich agar at temperatures optimal for enzyme activities initiates an imbalance in metabolism, inducing a near instantaneous production of superoxide and free radicals. In the absence of phenotypic adaptation, the cells are not equipped to detoxify reactive oxygen intermediates and, as a result, a proportion or all of these cells die. Our results indicate that an efficient protection against oxidative stress is of fundamental importance in improved recovery of nonculturable cells. Monitoring disease patterns using laboratory reports is a useful way of looking for major trends, but might be prone to major biases due to under-detection of nonculturable enteric pathogens by routine laboratory methods.

59

THE INTERPLAY OF GENETIC AND EPIGENETIC VARIATION IN GENE SILENCING DURING CANCER

INITIATION AND PROGRESSIONRonneberg J.A.1, Tost J. 2, Grenaker-Alnæs G.1, Sorlie T.1, Kristensen T. 3,

Gut I.2, Borresen-Dale A.-L.1, Kristensen V.N.1

1 – Department of Genetics, Institute of Cancer Research, the Norwegian Radium Hospital, Montebello 0310, Oslo

2 – Centre National de Genotypage, Batiment G2, 2 Rue Gaston Cremieux, CP 5721, 91057 Evry Cedex, France

3 – Department of Molecular Biosciences, University of Oslo, Norway

Cancer arises due to the accumulation of DNA modifications that give cells a selective growth advantage. DNA modifications such as promoter hyper- or hypomethylation may be associated with loss or gain of expression. The methylation status of a specific sequence or the pattern of methylation across the genome can be measured, and these sequences and analytical methods are being rapidly developed for molecular diagnostic applications. Mass spectrometry analysis and methylation specific real time PCR analysis, currently used in the lab, will be described. Detection of certain methylation events can be used for early detection of tumors, and analysis of patterns of methylation across the genome might provide information on disease subtype, aggressiveness, and treatment response. A number of studies have provided evidence that specific methylation changes can alter the response to different therapeutic agents in cancer. For example, the association of the methylation status of DNA repair genes such as MGMT and MLH1 illustrate the two main mechanisms of response to DNA damaging agents. Loss of methylation of MGMT, and the subsequent increase in gene expression, leads to a reduction in response to alkylating agents as a result of enhanced repair of drug-induced DNA damage. Conversely, the increase in methylation of MLH1 and its resulting loss of expression has been consistently observed in drug-resistant tumor cells. Other methylation-regulated genes that could serve as biomarkers in cancer therapy include drug transporters, genes involved in microtubule formation and stability, and genes related to oxidative response. Glutathione-S-Transferase P1 (GSTP1) is involved in thiol-mediated detoxification and breakdown of reactive oxygen species created by anticancer drug exposure. GSTP1 is also an inhibitor of c-Jun N-terminal kinase 1, a kinase involved in stress response, apoptosis and cellular proliferation. Our studies suggest that the GSTP1 promoter is effectively methylated leading to reduced mRNA expression in breast tumours. An association between promoter haplotype structures and different degree of methylation is observed. We propose that SNPs in haplotype structures or by themselves can affect de novo methylation of adjacent sequences by the removal or creation of transcription factors binding sites. These methylation markers have potential applications for disease prognosis, treatment response prediction, and the development of novel treatment strategies.

60

SMALL INTERFERING RNAs: A NOVEL TOOL FOR FUNCTIONAL GENOMICS AND TARGET VALIDATION

Sioud M.

RNA interference technology has provided researchers with an extremely powerful tool to understand and study gene functions. Importantly, it provides a powerful tool to decipher the exact roles of genes that are especially critical in the causation of numerous human diseases, including cancer. Using this technology, we have elucidated the potential functions of novel genes and validated the involvement of several candidate targets in tumour growth. In addition, we have addressed the roles of stroma cells in tumour growth and angiogenesis. The data highlight the potential of developing a new class of therapies targeting intracellular mediators that act at the tumour-host communication interface. Progress in designing appropriate siRNAs will be discussed as well.

CHARACTERISRIC ANALYSIS OF SUBCELLULAR COMPONENTS IN AEROMONAS HYDROPHILA

PATHOGENIC STRAINS

Tieying S., Chuanfu D., Hui G., Jinxian Y., Tianlong L.Biotechnology Center, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian,

China.

Abstract: Aeromonas hydrophila is a ubiquitous gram-negative rod-shaped bacterium which widely existe in food, drinking water, aquatic environments and fishes. These bacteria frequently cause disease among cultured and feral fishes and has been associated with a wide variety of human infections including dirralla, septicemia, meningitis, and wound infections. Aeromonas hydrophila has been recognized as a pathogen of zoonosis which serious threaten to aqualculture, foodsafety and human health.

Sixty nine strains of Aeromonas hydrophila have been isolated from eel, soft-shell turtle and other frashwater fishes in fujian,China. Seven antiserum stand for 7 different serotype have been prepared and used for classifying the bacteria. 40% of the bacteria strains belong to the 7 serotypes, and the other part of the bacteria unable be classify by those antisera.

The major membrane proteins (mOMP) from 19 strains of Aeromonas hydrophila and one strain of Aeromonas sobria were prepared by extracted with 1.2% N –lauroylsarcosinate and concentrating by ultracentrifuging, then analyzed by SDS—PAGE. The results showed that the mOMP from the 14 strains of

61

tested bacteria were divided into three mOMP groups base on the pattern of protein bands. Group I was comprised of 40 kD and 43 kD mOMP, Group Ⅱ was comprised of 40 kD and 50 kD mOMP,and Group Ⅱ was comprised of 40 kD, 46 kD and 50 kD mOMP. No significant relationship was observed between mOMP patterns and serotypes. Further analysis by immunobloting with rabbit antiserum revealed that all the mOMP from tested bacteria strains had strong positive reaction and the 40 kD mOMP existed in most Aeromonas strains. The 40 kD mOMP could be the major somatic antigen of A. hydrophila. When the above bacteria strains were treated with 0.2 mol/L glycine hydrochioride(pH4.0)， only few strains expressed abundant S-layer-like protein with a molecular weight about 52 KD.

Extracellular products ( ECP) of certain strains of Aeromonas hydrophila was investigated for there hemolysis activity and virose to mouse. The result indicated that the ECP from the bacteria were able lysis both rabbit and eel blood cell, the LD50 to mouse was 54mg. The hemolysis activity of crude purified ECP was 3.2×103HU•mg-1.

β-haemolysin gene was successfully cloned into pcDNA3.0. The DH5α transformed with the recombinant plasmid, which expressed native β-haemolysin, can be recognized by antiserum and lysis the rabbit blood cell invitro, The hemolysis activity of crude purified transformant’s ECP was 1.6×103HU•mg-1, but the gene production cannot lysis the eel blood cell. The result suggested that the ECP of Aeromonas hydrophila might contain another factor which could lead to the lysis of eel blood cell.

Gene express β-haemolysin has been used to prepare ISCOMs (immune stimulation complaxes) with qailA and Mage10. The eel immunized with ISCOMs induced satisfy protective rate. The protection rate was 75% after one injection with 40mg ISCOMs, and reached 100% after second immunization of same dose vaccine.

Key words: Aeromonas hydrophila, major membrane proteins(mOMP), β-haemolysin gene, transformant’s extracellular products ( ECP), ISCOMs.

62

APPLYING DIGITAL KARYOTYPING TO EXPLORE CANCER GENOME

T.-L.Wang, Ph.D.Departments of Gynecology and Oncology, Johns Hopkins University School of

Medicine, Baltimore, Maryland 21231

Chromosomal changes, including deletion of tumor suppressor genes and amplification of oncogenes, are hallmarks of neoplasia. Analysis of molecular genetic changes in cancer has historically led to identification of important genes that play a role in tumor initiation and progression. For example, characterization of amplified regions of breast cancer genome has revealed several important oncogenes including Her-2/neu and c-Myc. Studies of these alterations are critical to understand the molecular basis of cancer and to provide potential diagnostic/outcome markers and therapeutic targets for cancer patients. The rate-limiting step in discovering new tumor associated molecular genetic changes has been the lack of effective technologies for their discovery. The success in the launch of human genome database has accelerated cancer genome studies as it provides precise and detailed gene maps to facilitate the discovery of genes important in cancer. To reveal genome-wide DNA copy number alterations at high resolution, we have recently developed a method, named Digital Karyotyping, which permits comprehensive examination of cellular ONA content based on isolation and quantitative analysis of short fragments derived from genomic DNA.

We have used Digital Karyotyping to comprehensively examine genomic alterations in colorectal cancer metastases that were resistant to 5-fluorouracil (5-FU) and have identified thymidylate synthase (TYMS) gene amplification, Fluorescence in situ hybridization further identified TYMS amplification in 23% of thirty-one 5-FU treated cancers, whereas no amplification was observed in metastases of 58 patients that had not been treated with 5-FU. Furthermore, the median overall survival following metastectomy among patients with TYMS gene amplification was substantially shorter (329 days) than those without amplification (1021 days, Figure 1, P<0.01). These data suggest that genetic amplification of TYMS is a major mechanism of 5-FU resistance in vivo. Identification of this genetic lesion could be useful for management of colorectal cancer patients with recurrent disease.

The discovery of TYMS gene amplification in 5-FU-resistant tumors is an example that Digital Karyotyping could reveal novel DNA copy number alterations that were not demonstrated previously. Recently, our laboratory has applied Digital Karyotyping to explore ovarian carcinoma genome and the discovery of novel potential prognosis markers and therapeutic targets will be presented.

63

ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТОКСИЧНОСТИ И МЕСТНОРАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ РЕКТАЛЬНЫХ

СУППОЗИТОРИЕВ С ТАМЕРИТОМ

Абрамович Р.А.1, Дрожжина К.А.2, Абидов М.Т.3 1 – Российский университет дружбы народов

2 – ММА им. И.М. Сеченова 3 – НИИ Иммунопатологии РАЕН

Отечественный препарат Тамерит, обладающий противовоспалитель-ным, иммуномодулирующим и антиоксидантным действием разрешен для медицинского применения в лекарственной форме – порошок для инъекций.

Способность препарата обратимо ингибировать избыточную продук-цию гиперактивированными макрофагами провоспалительных факторов (ФНО, ИЛ-1, нитросоединений, активных форм кислорода и др.), опре-деляющих степень местных и общих воспалительных реакций, одновре-менно стимулируя фагоцитарную активность гранулоцитов, находящихся в очаге воспаления, а также антиоксидантное и иммунокоррегирующее действие в отношении клеточного и гуморального иммунитета является обоснованием целесообразности разработки новой лекарственной формы Тамерита – ректальные суппозитории.

Цель работы: Изучение острой и хронической токсичности, а также местнораздражающего действия ректальных суппозиториев с тамеритом.

Методы: Эксперименты выполнялись на белых беспородных крысах обоего пола. При изучении токсичности и местнораздражающего действия суппозиториев оценивалось функциональное состояние основных систем организма, биохимических и морфологических показателей крови, морфоло-гии и гистологии. Состав суппозиториев: тамерит (ВФС 42-3623-00) — 0,1 г, основа для суппозиториев твердый жир А. Степень токсичности лекформы оценивали по Hodge и Sterner, исходя из ЛД50 15 г/кг.

Результаты: Данные токсикометрии и некропсии позволяют отнести препарат Тамерит® в лекформе – суппозитории ректальные 0,1г к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ.

Выводы: Проведенные исследования токсичности показали, что пре-парат является малотоксичным при ректальном введении и обладает большой широтой терапевтического действия. Ректальные суппозитории с тамеритом не оказывают местнораздражающего действия.

64

ТЕРАПИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ КЛЕТОЧНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ АУТОЛОГИЧНЫХ МОНОНУКЛЕАРНЫХ

КЛЕТОК, АКТИВИРОВАННЫХ ЛИГАНДОМ ТОLL-like receptors (полиА:полиУ).

Аветисов С.Э., Каспаров А.А., Каспарова Е.А., Скрипкин К.М., Павлюк А.С.ГУ НИИ глазных болезней РАМН, Москва

Разработан метод клеточной терапии с использованием клеточных препаратов аутологичных мононуклеарных клеток периферической крови, активированных лигандом TOLL-like receptors, синтетическим аналогом siRNA, комплексом полиадениловой:полиуредиловой кислот (полиА:полиУ). Основу терапевтического эффекта клеточных препаратов состав-ляет высокий уровень продукции ими цитокинов. Метод локальной экс-пресс-аутоцитокинотерапии (ЛЭАЦКТ) отличается высокой клинической эффективностью в лечении больных с различными поражениями тканей переднего отдела глаза воспалительной, посттравматической, постопера-ционной и дистрофической природы. Проведенные исследования пока-зали, что полиА:полиУ стимулирует выработку ИФН-α,β и g, продукцию цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-8, подавляет индуцированный апоптоз мононуклеарных клеток (МНК). Активация МНК здоровых доноров и больных офтальмогерпесом полиА:полиУ, не стимулирует продукцию ИЛ-4 и ФНОα, но значимо усиливает синтез ИФНg. Эти данные дают основания предположить, что иммуноцитокиновая доминанта клеточных препаратов МНК, активированных полиA:полиУ формируется по типу Th1. Клеточные препараты МНК активированные полиA:полиУ обла-дают высоким ангиогенным потенциалом, что было подтверждено при исследовании их влияния на ангиогенез сосудов хорион-аллантоисной мембраны эмбриона цыпленка. Аналогичный эффект был зарегистрирован и при использовании клеточных препаратов нормальных фибробластов активированных полиА:полиУ.

Полученные нами результаты позволяют сделать вывод, что полиyA:полиуУ, синтетический аналог siRNA, лиганд TOLL-like receptors явля-ется перспективным инструментом для создания клеточных препаратов с заданной иммуноцитокиновой доминантой, обладающих антивирусными, противовоспалительными и регенерирующими свойствами, пригодных для терапевтического воздействия на процессы ангиогенеза и неоваску-ляризации.

65

СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА

Аксенова М.Г.1, Кириллов А.В.1, Новиков А.В.2, Бирюкова Е.А.2

1 – ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН, Москва

2 – «Артмедика», Москва

Как известно, симптомокомплекс, включающий инсулинорезистент-ность, гипертриглицеридемию, низкий уровень холестерина липопротеинов высокой плотности, повышенное артериальное давление и абдоминальное ожирение называют метаболическим синдромом (МС). Роль внешнесредо-вых факторов в широком распространении МС весьма значительна, однако в последнее десятилетие в изучении причин развития и механизмов форми-рования МС все большее значение приобретают молекулярно-генетические исследования. В 1962 г. J.V. Neel выдвинул предположение, что в процессе эволюции в популяции генетически закреплялось селективное преиму-щество, выгодное в условиях голода и больших физических нагрузок, что в новых условиях окружающей среды обернулось предрасположенностью значительной части населения к метаболическим нарушениям.

Первые публикации в связи с изучением предрасположенности к МС были посвящены исследованию генов, участвующих в регуляции углевод-ного обмена, позднее исследовали полиморфизм генов, участвующих в регуляции обмена липидов, а также генов, связанных с регуляцией общего уровня метаболизма, гормонов и рецепторов жировой ткани. Работы, в которых величина выборки была значительной, а результаты генотипирова-ния сопоставляли с различными антропометрическими, функциональными и биохимическими показателями, дали достаточно согласованные резуль-таты. Однако, данные о молекулярно-генетических предпосылках развития МС пока разрозненны и нуждаются в дополнительных доказательствах.

В работе исследованы полиморфные маркеры нескольких групп генов: гены, продукты которых участвуют в нейрогормональной регуляции обмена веществ, продукты которых регулируют углеводный обмен и продукты ко-торых участвуют в регуляции липидного обмена. Проведен сравнительный анализ собственных и литературных результатов молекулярно-генетических исследований предрасположенности к МС.

66

ИССЛЕДОВАНИЕ ЯВЛЕНИЯ ТУШЕНИЯ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ БАКТЕРИЙ

Александров М.Т., Зотова М.В., Бажанов Н.Н., Лабазанов А.А., Геворкгов Г.Л., Анисимова И.С.

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова, Москва

В своем исследовании мы решали задачу применения тушения флюо-ресценции для оценки антибактериальной эффективности медицинских препаратов. Нами использовался метод лазерно-флюоресцентной диагнос-тики (ЛФД). ЛФД – метод молекулярной биологии и медицины. Методами спектроскопии показано, что при барботировании 3% перекиси водорода происходит образование пероксинитрита, обладающего выраженным бак-терицидным эффектом. При оптимальных концентрациях пероксинитрита и перекиси водорода происходит тушение флюоресценции бактерий, ко-торое связано с их гибелью. Все исследования были подтверждены бакте-риологическим методом. На основании этих исследований был разработан новый антисептический раствор на основе использования 3% перекиси водорода, барботируемого оксидом азота.

При изменении рН среды наблюдали увеличение флюоресценции при щелочных значениях рН. При таких значениях происходит разрушение оболочек бактерий под действием щелочей и переход порфиринов из эндогенных в экзогенные, что приводит к увеличению интенсивности флюоресценции с последующем ее тушением кислородосодержащими продуктами исследуемого раствора.

Полученные результаты тушения флюоресценции объективно отражают процесс гибели бактерий и эффективность средств их антибактериальной обработки, что позволило разработать алгоритм метода диагностики жизне-деятельности бактерий на основе явления тушения их флюоресценции.

Для исследуемых штаммов бактерий и гнойного отделяемого раны показано, что бактерицидное действие разработанного антисептического раствора проявляется через 6 – 8 минут. Выявлено, что сроки его хранения составляют 20 – 25 суток.

Представленные исследования позволили разработать новое поколение антибактериальных препаратов на основе использования оксида азота и перекиси водорода, эффективность которых подтверждалась методами спектроскопии (поглощения и флюоресценции) и бактериологически.

Клиническая апробация подтвердила эффективность разработанного антисептического раствора.

67

ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ ЛАЗЕРНОЙ ФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ

Александров М.Т., Пашков Е.П., Хоменко В.А., Голованова М.Н., Бажанов Н.Н., Воробьев А.А., Зайцева Т.А.

Московская медицинская академия им. И.М. СеченоваЦНИИ туберкулеза АМН РФ

НПЦ «Спектролюкс»

Туберкулез одна из актуальнейших проблем инфекционной патологии РФ. В 2003 году уровень заболеваемости и смертности от туберкулеза со-ставили соответственно 83,2 и 21,9 на сто тысяч населения.

Предлагается метод, основанный на спектральном исследовании объ-ектов, возбуждаемых лазерным лучом с длиной волны 633 нм с помощью многоканального спекроанализатора «Спектролюкс». При взаимодействии лазерного излучения с биологическим объектом аппарат регистрирует индуцированную лазером флюоресценцию. С помощью программного продукта и программного обеспечения полученные данные обрабатыва-ются и отображаются на мониторе в виде спектра.

Процесс диагностики занимает минуты. Изучены спектры Mycobacterium tuberculosis в чистой культуре, а так же плазма более чем у 1000 пациен-тов. Последние представлены следующими группами: верифицированные больные – 282 человека, сотрудники учреждения – 137 человек, впервые поступившие – 590 человек.

Кроме этого исследовано 120 доноров, 43 больных с различными пе-реломами нетуберкулезной этиологии. Для оценки специфичности метода кроме лазерно-флюоресцентной диагностики (ЛФД) проводили ИФА и ПЦР исследование плазмы крови.

Для объективизации результатов введено понятие «диагностические поля» – совокупность ЛФД показателей для каждой группы пациентов: S1 – мощность обратно отраженного сигнала, S2 – мощность флюоресцен-ции, S2/S1 – нормированная мощность флюоресценции, S3 и S4 – мак-симумы флюоресценции на длинах волн 670 и 700 нм соответственно.

На основании полученных результатов предложена методика диагнос-тики туберкулеза по флюоресценции плазмы крови, которая наиболее эффективно для подтверждения диагноза заболевания, экспресс оценки эффективности лечения (мониторинг), быстрого выявления больных ту-беркулезом в группах риска (скрининг).

68

ПЕРСПЕКТИВЫ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ МОЗГА

Александрова М.А.1, Подгорный О.В.1, Марей М.В.2, Полтавцева Р.А.1, Кулаков В.И.2, Сухих Г.Т.2

1 – Институт биологии развития РАН 2 – Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН

Исследования в области клеточной терапии мозга возлагают большие надежды на применение нейральных стволовых клеток (НСК) – муль-типотентных предшественников нейронов и глии. Выделение и культи-вирование in vitro НСК позволяет работать с длительно сохраняемыми популяциями необходимых для трансплантации клеток.

НСК выделяли из эмбрионов и плодов человека и размножали в культуре ткани в присутствии митогенов. В этих условиях НСК делятся и формиру-ют свободно плавающие агрегаты-нейросферы. Иммуногистохимические исследования с применением широкого спектра антител показали что, наряду со стволовыми и прогениторными клетками, в нейросферах всегда присутствуют клетки, дифференцирующиеся по нейрональному и глиаль-ному типу. После трансплантации культивированных НСК в мозг взрослых крыс обнаружена миграция клеток по эпендимной выстилке желудочка, вдоль кровеносных сосудов, в коре и гиппокампе. Среди трансплантиро-ванных имелись: стволовые клетки, коммитированные, ранние нейробласты и клетки астроцитарного ряда. Отсутствие глиального барьера на границе трансплантатов и ткани мозга реципиента давало возможность росту во-локон трансплантированных клеток и их миграции. На модели гипокси-ческого повреждения мозга установлено, что НСК переживают не менее 30 сут. Клетки сохраняют мультипотентный статус, мигрируют в среде мозга с обширной дегенерацией нейронов и в значительной степени нормализуют когнитивные функции мозга реципиента. Вероятно, восстановление пове-дения животных опосредовано нейротрофическим влиянием НСК, которые оказывают мощное воздействие (за счет выделения коктейля ростовых факторов, цитокинов и др.), что стимулирует восстановительные процессы не только в отдельных дегенерирующих нейронах мозга реципиента, но и влияет на целостное поведение животного. Этот процесс происходит всегда при интрапаренхимальной имплантации, причем абсолютно независимо от дальнейшей интеграции и дифференцировки стволовых клеток. Сегодня мы не имеем экспериментальных доказательств, свидетельствующих о том, что трансплантированные НСК могут замещать утраченные нейронные ансам-бли мозга. Однако нейротрофический потенциал НСК, безусловно, может быть использован в целях клеточной терапии для стимуляции репаративных процессов в дегенерирующих клетках мозга.

69

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ «ПОЗДНИМ» ГИДРОНЕФРОЗОМ

Аляев Ю.Г., Григорян В.А., Иванов А.А., Еникеев М.Э., Каситериди И.Г., Чиненов Д.В.

Клиника урологии (директор – член-корреспондент РАМН, профессор Ю.Г. Аляев) Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова

Введение. Учитывая стремление в хирургии к органосохраняющим опе-рациям, важное значение приобретают вопросы обратимости хронических изменений органов. Необходимость сохранить по возможности большую часть функциональной паренхимы, которая еще может функционировать пусть даже в той или иной мере недостаточно, обусловлена вероятностью того или иного заболевания единственной почки. Последнее становится воз-можным благодаря достижениям молекулярной медицины – применению препаратов стволовых клеток, а также стимуляторов лейокопоэза.

Материалы и методы. Двум больным «поздним» гидронефрозом и одному уретерогидронефрозом на фоне уретероцеле с далеко зашедшими изменения-ми в почечной паренхиме в возрасте от 25 до 42 лет проведено предопераци-онное лечение граноцитом и биорегуляторами на фоне дренирования верхних мочевых путей (в 2-х наблюдениях выполнена нефростомия и в 1-ом – был установлен катетер-стент после рассечения уретероцеле). У всех пациентов установлено истончение паренхимы до 5 – 10 мм, резкое угнетение почеч-ного кровотока, выраженная дилатация чашечно-лоханочных систем (ЧЛС). Нефросцинтиграфия выявила резкое снижение накопительно-выделительной функции пораженной почки. Граноцит (рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) вводился внутривенно капельно, разведенный в 50 мл 0,9% натрия хлорида через день под контролем уровня лейкоцитов периферической крови. При лейкоцитозе более 50 тысяч в мкл введение препарата прекращалось. Длительность лечения составила от 9 до 15 суток. Побочных эффектов не отмечено.

Заключение. Контрольное обследование, проведенное через месяц, сви-детельствовало об удовлетворительном функциональном состоянии почки и верхних мочевых путей – увеличилась толщина паренхимы до 10 – 15 мм, зарегистрированная при УЗИ и мультиспиральной КТ. Функция почки по результатам нефросцинтиграфии достигала 30 – 40%. Данные антеградной пиелоуретерографии свидетельствовали о сокращении ЧЛС. Плотность мочи в пробе по Зимницкому составила 1003 – 1020 при сравнительной стабилизации диуреза. Больным гидронефрозом выполнены органосохра-няющие операции с хорошими функциональными результатами.

Выводы. Применение препаратов, направленных на восстановление паренхимы почки в сочетании с биорегуляторами в комплексном лечении этой категории больных позволяет выполнять органосохраняющие опе-рации при значительных (ранее считавшихся необратимыми) изменениях почечной паренхимы и верхних мочевых путей.

70

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПАТОГЕННЫХ ЛИСТЕРИЙ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО

ВРЕМЕНИ

Аляпкина Ю.С., Карпова Т.И., Ермолаева С.А.ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

Возбудитель тяжелого заболевания, листериоза, Listeria monocytogenes, и филогенетически близкая непатогенная бактерия Listeria innocua, являются частыми контаминантами пищевых продуктов. При анализе безопасности продуктов питания необходимо количественно выявлять присутствие пато-генных листерий. В ряде случаев, однако, желательным является определение непатогенных листерий как показателя эффективности предпринимаемых мер по дезинфекции и соблюдению санитарных норм. Выявление и видовая идентификация листерий используемыми в настоящее время бактериологи-ческими методами занимает до семи дней, что является недопустимо долгим сроком при анализе безопасности пищевых продуктов.

Целью данного исследования явилась разработка количественного метода экспресс-анализа, позволяющего выявлять присутствие лис-терий и определять среди них процентное содержание патогенных L. monocytogenes.

Для достижения поставленной цели был использован метод ПЦР в режиме реального времени (Real Time-PCR), позволяющий определять количество ДНК-матрицы в исследуемом образце на основании кинетики образования ПЦР-продукта. Для выявления Listeria spp. были исполь-зованы родоспецифические праймеры и олигонуклеотидный зонд типа TaqMan с флуоресцентным красителем R6G, специфичные к внутренней области гена prs, кодирующего фермент общего метаболизма фосфорибо-зилтрансферазу. Для специфического определения L. monocytogenes были использованы праймеры и TaqMan зонд с красителем FAM к гену actA, кодирующему видоспецифический фактор патогенности.

Были подобраны условия, позволяющие одновременно выявлять prs- и actA- фрагменты, проводя обе реакции в одном объеме. При проведении реакции на ДНК-матрице L. monocytogenes количественное определение prs- и actA-фрагментов давало коррелирующие величины. При использовании ДНК-матрицы L. innocua выявлялось наличие только родоспецифического prs-фрагмента. При использовании смешанной матрицы, включающей ДНК обоих видов, выявление prs-фрагмента позволяло количественно определить содержание суммарной ДНК в образце, а выявление actA-фрагмента – ко-личество ДНК L. monocytogenes. Разработанный метод позволял определять присутствие L. monocytogenes, когда ее ДНК составляла 1% от суммарной ДНК обоих видов. Чувствительность метода составила 20 фемтограмм.

71

ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ (VEGF) В ОПУХОЛИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ (РМЖ)Аманов Т.Т., Ермилова В.Д., Лякина Л.Т., Тулеуов А.Е.

Западно-Казахстанская государственная медицинская академия им. М.Оспанова, Актюбинск

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Доказано, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней новой сети кровеносных сосудов. При этом, наиболее значимым актива-тором неоангиогенеза считается VEGF. В отличие от всех других факторов, положительно стимулирующих неоангиогенез в опухоли, VEGF является активным митогеном только по отношению к эндотелиальным клеткам.

Цель настоящего исследования – анализ уровней экспрессии VEGF и Ki-67 в опухолях больных РМЖ и его роль в прогнозе заболевания.

Материалы и методы. С помощью иммуногистохимического метода изу-чена степень выраженности экспрессии VEGF и маркера пролиферативной активности (антигена Ki-67) в РМЖ двух групп больных: 1 группа – 8 боль-ных с ранним рецидивом заболевания и 2 группа – 12 больных, у которых в течение 5 лет рецедива РМЖ не выявлено. Иммуногистохимическое исследование проводили пероксидазно-антипероксидазным методом с применением антител к VEGF (антитела VEGF (C-1): sc-726; фирма «Santa Cruz Biotechnology, Inc.» США; рабочее разведение антител 1:100), к Ki 67 (антитела Ki-S5; фирма «DAKO», Дания; рабочее разведение антител 1:50). У всех больных диагноз подтвержден данными гистологического исследо-вания опухоли и до проведения иммуногистохимического исследования пациентки не получали специфического лечения.

Результаты. Наиболее высокие показатели экспрессии VEGF в цитоплазме опухолевых клеток обнаружены в РМЖ больных 1 группы, у которых рецидив РМЖ выявлен в течение первых трех лет от начала лечения, по сравнению со 2 группой пациенток с более благоприятным течением болезни. Так, медианы уровней экспрессии VEGF в опухолях 1 и 2 групп пациенток равнялись 3,1 и 1,4 баллов, соответственно (p<0,05). Подобные результаты отмечены и при анализе данных иммуногистохимического исследования индекса пролифера-тивной активности антигена Ki-67 (количественный метод, ядерная окраска) в опухолях больных РМЖ 1 и 2 групп. Показано, что медиана индекса Ki-67 была достоверно выше в РМЖ больных с неблагоприятным прогнозом – 1 группа пациенток (25,7) по сравнению со 2 группой (14,9) (p<0,05).

Заключение. Экспрессия ключевого активатора неоангиогенеза VEGF и индекса пролиферативной активности Ki-67 достоверно выше в РМЖ больных с неблагоприятным прогнозом заболевания. Обсуждается связь выше указанных показателей с основными клиническими и морфологи-ческими факторами прогноза РМЖ.

72

КОМПЬЮТЕРНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ

СЕРИЙНОЙ МИКРОСЪЕМКИ

Апокин А.Д.Центральный научно-исследовательский институт стоматологии, Москва

Цифровые методики регистрации результатов оптической микроскопии гистологических препаратов становятся более распространенными, повы-шая точность, эффективность и скорость работы патоморфологов.

С развитием цифровой фототехники разрешающая способность мат-риц для фотоаппаратов экспансивно растет и исчисляется мегапикселями (Мп). На сегодняшний день широкое распространение получили 5 Мп фотокамеры, а самые современные матрицы состоят более чем из 16 Мп. В то время как стандарты видео не так быстро эволюционируют и разре-шающая способность сенсоров для видео техники продолжает оставаться в пределах 1 Мп.

Наиболее часто используемый размер матриц в цифровых фотоаппаратах, которыми комплектуются современные оптические микроскопы зарубежных производителей от 3 до 5 Мп. Они позволяют получать фотоснимки с раз-решением до 3000*2000 пикселей. При использовании специализированных преобразователей видеосигнала с видеокамер которые составляют альтер-нативу цифровым фотоаппаратам возможно лишь получение изображения соответствующего видео стандарту PAL (756*480 пикселей).

Материалы и методы. Для преодоления описанных выше существенных ограничений в получении цифровых изображений высокого разрешения с помощью оптического микроскопа с видеокамерой, нами была разработана и опробована новая методика серийной фотосъёмки и получения ком-бинированных изображений путем обработки полученных фотоснимков формата PAL в растровом графическом редакторе Adobe Photoshop CS2.

Результаты и их краткое обсуждение. Наш выбор в данном случае обусловлен большим удобством использования данной программы и её различных модулей, а так же её широкое распространение в области работы с цифровыми изображениями как промышленного стандарта. И возможность пакетной обработки большого количества изображений по заранее составленному сценарию.

Заключение. Мы получаем изображения с видеокамеры и совмещаем их до размера 5000*8000 пикселей (~11 Мп), что исчерпывает практически любые потребности в качественном полиграфическом воспроизведении фотографий вплоть до плакатного размера и глубокого и обстоятельного изучения гистологических картин на больших увеличениях с широким полем зрения.

73

АПОПТОЗ ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРОДОНТА

Апокин А.Д.1, Коган Е.А.2, Григорьян А.С.1

1 – Центральный научно-исследовательский институт стоматологии, г. Москва

2 – Кафедра патологической анатомии ММА им. И.М, Сеченова, г. Москва

Фундаментальные аспекты патогенеза, хронических воспалительных заболеваний пародонта остаются актуальными в силу широкого распро-странения данной нозологии среди большинства возрастных групп насе-ления всех стран мира. Прогрессирование и исход заболевания во многом определяется процессами хронизации воспаления, гибелью клеток путём апоптоза, а так же дисрегенераторными изменениями эпителия.

Материалы и методы. Исследование выполнено на аутопсийном матери-але. Изучали образцы тканей десны 20 умерших с клиническими и морфо-логическими проявлениями хронического гингивита и пародонтита, а так же 10 -ти с возрастной анатомической нормой. Все полученные больные были разделены на три группы: гингивит, пародонтит и норма. Серийные парафиновые срезы окрашивались, гематоксилином и эозином, альциано-вым синим, по Ван Гизон, ставилась PAS-реакция. Был выполнен расчёт индекса гистологической активности воспаления (ИГА) и дисрегенерации для тканей десны по аналогии с ИГА хронического вирусного гепатита и хронического гастрита. Проводились имуногичстохимические реакции с использованием моноклональных антител Celular Apoptosis Susceptibility Protein (NCL-CAS), Ki67 Antigen Antibodies (NCL-Ki67-MM1), коллагену-IV. Ставились контрольные реакции. Результаты реакций оценивались путем подсчёта апоптозных телец и пролиферирующих клеток на 1000 клеток паренхимы и стромы в разных участках краевой десны.

Результаты и обсуждение. Полученные результаты показывают значи-тельное повышение ИГА в прикреплённой и краевой десне в группе с гистологическим диагнозом гингивит до 4 балов и в группе пародонтит более 7 балов. Максимально выраженная апоптоз и пролиферация эпите-лиальных клеток была обнаружена в слизистой оболочке десны в группе образцов с гингивитом и пародогтитом с высоким ИГА. Максимально выраженная апоптточеская активность обнаружена в очагах лейкоплакии, и дисплазии плоского эпителия у пациентов с пародонтитом.

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют об усилении апоптоза и пролиферации в тканях десны при хронизации воспаления, являющихся благоприятным фоном для развития дисрегенераторных из-менений эпителия в ведущих к возникновению рака.

74

РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ CYP1A1, EPHX1, GSTM1, GSTT1, GSTP1 В РАЗВИТИИ ХРОНИЧЕСКИХ

БРОНХИТОВ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ГЕНЕЗА

Ахмадишина Л.З.1, Корытина Г.Ф.1, Мингазова С.Р.3, Янбаева Д.Г.1, Викторова Т.В.2, Бакиров А.Б.3

1 – Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа2 – Башкирский Государственный Медицинский Университет,

кафедра биологии, Уфа3 – Институт медицины труда и экологии человека, Уфа

Важную роль в защите легких от токсичных продуктов, содержащихся в табачном дыме, атмосфере крупных промышленных городов и воздухе вредных производств, играют ферменты системы биотрансформации ксенобиотиков.

Целью исследования явилось проведение анализа полиморфизма генов CYP1A1, EPHX1, GSTM1, GSTT1, GSTP1 и оценка их роли в развитии профессионального хронического бронхита

Материалы и методы. В работе исследованы образцы ДНК 95 больных с профессиональным бронхитом из них 40 человек (42,11%) страдало пылевым бронхитом, 55 (57,89%) – токсическим бронхитом. Все больные проживают в Республике Башкортостан. Анализ проводили методом по-лимеразной цепной реакции (ПЦР).

Результаты. Показано, что генотип AG по гену CYP1A1 является фактором риска развития профессионально обусловленных хронических бронхитов (c2=6,35 р=0,01), что может быть связано с более агрессивным повреждением бронхолёгочных тканей у индивидов с повышенной актив-ностью цитохрома P4501A1.

В группе больных выявлено достоверное увеличение частоты генотипа GG по гену GSTP1 (c2=5,49 p=0,02). Высокая степень ассоциации GG ге-нотипа с хроническими бронхитами профессионального генеза (OR=4,62) указывает на то, что изменение активности глутатион S-трансферазы P1 вероятно связано с формированием патологических изменений органов респираторной системы, приводящих к развитию хронического бронхита.

Наибольшая ассоциация с развитием профессионального бронхита выявлена для сочетания генотипа AA гена CYP1A1 с генотипом GG гена GSTP1 (c2 =4,66 p=0,03; OR=4,21).

Вывод. Изучение полиморфных вариантов генов ферментов задейство-ванных в биотрансформации ксенобиотиков и выявление генетических маркеров повышенной чувствительности к изменяющимся внешнесре-довым условиям будет способствовать дальнейшему развитию модели формирования адаптации и генетической предрасположенности к профес-сиональным заболеваниям дыхательной системы при воздействии вредных факторов производственной и окружающей среды.

75

АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА PPARα В ПОПУЛЯЦИИ САНКТ-ПЕТЕРБУРГА

Ахметов И.И., Можайская И.А., Астратенкова И.В., Комкова А.И., Рогозкин В.А.

Санкт-Петербургский НИИ физической культуры

Ядерный рецептор, активируемый пролифераторами пероксисом α, является транскрипционным фактором, регулирующим экспрессию генов липидного и углеводного обмена. В гене PPARα, кодирующим этот рецеп-тор, обнаружен G/C полиморфизм 7 интрона, который ассоциирован с преобладанием метаболизма жирных кислот или углеводов (Flavell, 2002). Отмечено, что у носителей редкого аллеля С окисление жирных кислот в миокарде, скелетных мышцах и печени происходит менее эффективно, чем у GG гомозигот. Недостаток окисления жирных кислот у носителей аллеля С компенсируется повышенной утилизацией глюкозы. В ряде работ выяв-лена ассоциация аллеля С гена PPARα с гипертрофией левого желудочка при артериальной гипертензии и физических нагрузках, атеросклерозом сосудов, сахарным диабетом II типа и низкой эффективностью терапии гиполипидемическими препаратами (Jamshidi, 2002; Foucher, 2004; Flavell, 2005). Нами ранее было обнаружено у носителей аллеля С повышенное содержание мышечных волокон II типа, которые в качестве источника энергии используют преимущественно глюкозу и предрасполагают к ожирению и сахарному диабету II типа (Ахметов И., 2005). Кроме того, мы выявили низкую эффективность физических нагрузок в уменьшении жировой массы у носителей аллеля С (Яновский И., 2005).

Цель данного исследования заключалась в определении G/C полимор-физма 7 интрона гена PPARα в популяции Санкт-Петербурга для выделе-ния группы риска заболеваний метаболического профиля.

Нами были обследованы 724 коренных жителей Санкт-Петербурга (449 женщин и 275 мужчин, 24±6 лет). ДНК выделяли из эпителиальных клеток с помощью щелочной экстракции либо сорбентным способом. Генотипы по PPARα определяли с использованием метода ПДРФ.

Частота генотипов GG, GC и СС по PPARα в популяции Санкт-Петер-бурга составила 70,0%, 27,3% и 2,7%, соответственно. Полученные резуль-таты не отличались от данных, полученных в исследованиях британской и немецкой популяций. Различий в частоте аллеля С гена PPARα среди мужчин и женщин в популяции Санкт-Петербурга также обнаружено не было. Таким образом, 30% населения Санкт-Петербурга, являясь носите-лями аллеля С гена PPARα, входят в группу риска заболеваний липидного и углеводного обмена.

76

КОМПЛЕКСНЫЙ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ОБЛАСТИ AZF, ГЕНА CFTR И ДЛИНЫ

CAG-ПОВТОРА AR У ПАЦИЕНТОВ С МУЖСКИМ БЕСПЛОДИЕМ

Бабенко О.В.1, 2, Михайленко Д.С.1, 2, Кириллова Е.А.3, Никифорова О.К.3, Зарецкая Н.В.3, Курносова Т.Р.4, Залетаев Д.В.1, 2

1 – Научно-исследовательский институт молекулярной медицины при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

2 – Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук 3 – Клиника акушерства и гинекологии Московской медицинской академии

им. И.М. Сеченова,4 – Клинико-диагностическая лаборатория «ФертиЛаб»

Введение. Среди генетических причин мужского бесплодия в настоящее время активно исследуют микроделеции Y-хромосомы (области AZFa, b, с), мутации гена CFTR и аллели CAG-повтора гена AR. По данным различных авторов, олиго- и азооспермия могут быть ассоциированы с «длинными» аллелями CAG-повтора гена андрогенового рецептора (AR), обуславливаю-щих сниженную способность рецептора активировать гены-мишени.

Цель исследования. Изучение длины CAG-повтора AR при идиопати-ческом бесплодии у мужчин после исключения других молекулярно-гене-тических факторов, приводящих к мужскому бесплодию.

Материалы и методы. Исследовано 115 образцов ДНК неродствен-ных пациентов с мужским бесплодием. Контрольная группа включала 120 образцов ДНК доноров крови. Проанализированы микроделеции Y-хромосомы по 6 STS-маркерам, а также 5 наиболее частых мутаций CFTR. Аллели CAG-повтора определяли с помощью флуоресцентной ПЦР с детекцией на генетическом анализаторе ABI3100 (GeneMapper v.3.5., «Applied Biosystems»), логистический регрессионный анализ выполнен с использованием STATISTICA v.6.0.

Результаты и обсуждение. Делеции AZF обнаружены у 8 пациентов с олиго- и азооспермией, пациент с агенезией семявыводящих протоков имел CFTR генотип delF508/5Т. Мы исключили эти 9 случаев из первоначальной выборки и провели сравнительный анализ 106 пациентов с идиопатическим бесплодием и 120 образцов контроля по длине CAG-повтора AR. Показано, что аллели > 26(CAG) ассоциированы с двукратным увеличением относи-тельного риска развития идиопатического бесплодия в популяции Европейс-кой части России (Р > 0,01, α = 0,05). Коэффициенты в уравнении регрессии b0 и bх равны 0,362 (SD = 0,267) и 0,037 (SD = 0,012), соответственно.

Заключение. Аллели > 26(CAG) гена AR ассоциированы с увеличением от-носительного риска развития идиопатического бесплодия в рассматриваемой популяции и могут быть использованы в качестве маркеров предрасположен-ности в комплексной генетической диагностике при мужском бесплодии.

77

ГЕННАЯ И КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ НАСЛЕДСТВЕНЫХ И ВРОЖДЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЛОДА

Баранов В.С.ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Санкт-Петербург

Генная и клеточная терапия (ГКТ) – продукт стремительного раз-вития молекулярной биологии, биотехнологии, медицинской генетики, эмбриологии и цитологии. В докладе суммированы мировые данные о состоянии ГКТ. Рассмотрены ограничение, касающиеся генной терапии плода (ГТП), сформулированные Комитетом по биотехнологии НИЗ (США) в 1999 г., а также дополнения и изменения этого решения тем же комитетом в 2005, который, по сути, уже одобрил программу исследова-ний по ГТП с учетом ряда поправок ограничений. Отмечены несомнен-ные методические и клинические преимущества ГТП, которая позволяет начать привентивное лечение в досимптоматическую фазу заболевания, избежать иммунного ответа при введении чужеродных генетических конструкций (ГК) до развития иммунного ответа, достичь более высокой концентрации трансгена и его продукта в клетках и с большей вероят-ностью провести коррекцию генетического дефекта в стволовых клетках зародыша. Рассмотрены генетические болезни-кандидаты для ГТП, часть из которых уже находится на стадии клинических испытаний. Наиболее реальными кандидатами для ГТП сегодня являются иммунодефициты, гемоглобинопатии и болезни свертывания крови (гемофилии). Широко испытываются в экспериментах на лабораторных грызунах, а также на овцах, козах, обезьянах различные способы доставки генных конструкций путем различных вариантов инъекций (в/амниотически, в/трахеально, в/брюшинно, в/органно, в/м) , а также доставка генов с помощью генного «ружья» и даже ультразвука. При этом тестируется весь арсенал известных генных векторов как вирусной, так и невирусной природы. Целью подоб-ных экспериментов является не только досимптоматическая профилактика (лечение) того или иного врожденного или наследственного заболевания, но предупреждение возможных неблагоприятных последствий ГТ для плода . В этой связи изучается токсичность генных векторов, вероятность трансфекции первичных половых клеток, возникновения аномалий раз-вития, опасность онкологического эффекта, угроза отсутствия и резко ослабленный иммунный ответ на вирусы, использовавшиеся в качестве векторов ГК. Экспериментально доказано, что введенные в плод генные конструкции не включаются в половые клетки, которые уже достигли зачатки гонад плода ( у человека 7я н.б.).

Наряду с ГТ все возрастающее внимание специалистов привлекает и клеточная терапия плода (КТП). До недавнего времени КТП была

78

ограничена только в /у заменным переливанием крови с целью лечения гемолитической болезни, возникающей вследствие Rh-конфликта матери и плода. В качестве варианта КТП можно рассматривать и применяемое в программе ЭКО восстановление «качества» яйцеклеток путем микро-инъекций в ооцит реципиента взвеси митохондрий из яйцеклеток здо-ровых доноров. Массовая пролиферация клеток, активное перемещение клеточных слоев в процессах органогенеза, небольшие размеры плода (50 г на 13-й н.б.), незрелость иммунной системы (иммунологическая толерантность), высокое содержание эмбриональных стволовых клеток в образцах тканей доноров открывают широкие возможности для КТП. В настоящее время предпринято более 50 трансплантаций плоду человека с целью КТП по поводу различных заболеваний. Успешные результаты по-лучены при КТП в случае иммунодефицитов (SCID). Вместе с тем многие технические, методические и социальные вопросы КТП все еще остаются нерешенными. Обосновывается представление о том, что для каждого на-следственного и врожденного заболевания, диагностика которого возможна еще внутриутробно, до проявления патологических признаков, следует разрабатывать свои уникальные варианты ГТ и КТ, ориентированные на определенные стадии эмбрионального развития, способы доставки ГК, тип векторов, с учетом индивидуальных особенностей генома плода и типа мутаций гена-кандидата.

ТРАНСПОРТ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ В МОЗГ С ПОМОЩЬЮ ПОЛИ(БУТИЛ)ЦИАНОАКРИЛАТНЫХ

НАНОЧАСТИЦ

Басел А. Абдель Вахаб, Попова О.П., Иванов А.А., Петров В.Е., Аляутдин Р.Н.

Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова

Введение. Фактор роста нервов (ФРН) – высокомолекулярный пеп-тидный фактор, регулирующий жизнедеятельность периферических ганг-лионарных нейронов и холинергических нейронов центральной нервной системы. Одной из возможных сфер применения ФРН в клинической практике является болезнь Альцгеймера, при которой прогрессирующая деменция обусловлена деградацией холинергических нейронов ЦНС.

Однако, как и большинство других нейротрофических пептидов, ФРН крайне слабо проникает через гемато-энцефалический барьер. В связи с чем, для его доставки в головной мозг необходимо использование специ-альных транспортных систем поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА-НЧ).

79

Методы. Исследовали антиамнестическое действие ФРН в водном рас-творе и ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых полисорбатом-80 (ПС-80) на модели условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) в условиях острой амнезии, вызванной скополамином у крыс. Об эф-фективности исследуемых веществ судили по их влиянию на латентный период УРПИ.

Наряду с этим, определяли концентрацию ФРН в спинномозговой жидкости крыс после внутрибрюшинного введения ФРН в водном раство-ре и внутрибрюшинного введения ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80. Определение концентрации ФРН в ликворе проводили по методике ЕЫ8А (Епгуте ИпЪеа 1ттипо8огЪеп1; Аааау).

Результаты. Антиамнестическое действие ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 значительно превосходило действие ФРН в водном растворе (обе формы вводились внутрибрюшинно). Это прояв-лялось значительным (р <0,01) увеличением латентного периода УРПИ в группе, получавшей ФРН, сорбированный на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80 по сравнению с латентным периодом УРПИ группы крыс, получавших ФРН в водном растворе. Исследование концентрации ФРН в спинномоз-говой жидкости крыс показало, что после внутрибрюшинного введения ФРН, сорбированного на ПБЦА-НЧ, покрытых ПС-80, уровень ФРН в ликворе значительно возрастает (с 15,02 до 38,16 пг/мл; р <0,01). В то же время после внутрибрюшинного введения ФРН в водном растворе не от-мечено статистически достоверного повышения уровня ФРН в ликворе.

Выводы. Результаты проведенных исследований показывают, что ПБЦА-НЧ, покрытые ПС-80 представляют собой транспортную систему, обеспечивающую эффективную доставку ФРН в мозг, что может быть перспективным в терапии нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы.

80

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ОТДЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА B. ANTHRACIS

В ФОРМИРОВАНИИ ЗАЩИТНОГО ИММУНИТЕТА

Белова Е.В.1, Смолкина А.Е.1, Кравченко Т.Б.1, Захарова М.Ю.2, Шемякин И.Г.1

1 – Государственный научный центр прикладной микробиологии 2 – Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

Используемые в настоящее время сибиреязвенные вакцины созданы десятилетия назад и не отвечают современным требованиям. Разработку нового поколения вакцин необходимо проводить, опираясь на детальное исследование молекулярных характеристик и иммунологических свойств антигенов возбудителя сибирской язвы.

Целью данной работы являлось изучение иммуногенных свойств от-дельных структур ПА и выявление областей, содержащих детерминанты, индуцирующие образование нейтрализующих антител к токсину сибирской язвы.

Панель мышиных моноклональных антител (МАт) была получена с помо-щью гибридомной технологии. Отдельные домены протективного антигена получали путем клонирования в вектор pET-GST с последующей экспрессией в штамме E. coli BL21. Анализ нейтрализующей активности антител прово-дили на клеточной макрофагоподобной линии J774 в МТТ тесте.

В ходе работ были получены МАт к наиболее значимым структурам про-тективного антигена – III и IV доменам – и изучены их иммунологические свойства. Обнаружен необычный феномен, заключающийся в усилении действия сибиреязвенного токсина in vitro на мышиные макрофагоподобные клетки в присутствии МАт к III домену (1F2 и 1D6). Остальные проана-лизированные антитела (6G8, 6G7 и 1E10) эффективно нейтрализовали действие токсина и взаимодействует с IV доменом. В экспериментах in vivo на мышах МАт к IV домену (6G8, 6G7 и 1E10), введенные совместно с бактериальными клетками, также оказывали протективное действие, в то время как антитела к III домену (1F2) на сутки ускоряли гибель подопытных животных. Иммунизация мышей отдельно III и IV доменами с последующим заражением показало, что введение IV домена не оказывает выраженного протективного действия, а введение III – заметно увеличивает количество павших животных по сравнению с контрольной группой.

Таким образом, нами установлено, что антитела к различным доменам ПА могут оказывать как нейтрализующее, так и потенцирующее действие и что иммунизация животных только IV доменом не приводит к эффек-тивной защите. Полученные результаты являются веским аргументом в пользу разработки эпитопной вакцины.

81

КЛИНИЧЕСКИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРИИ В СИСТЕМЕ НАЦИОНАЛЬНОЙ

БИОБЕЗОПАСНОСТИ

Белокрысенко С.С.ГОУВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Клинические микробиологические лаборатории в России получают ли-цензии на право работы в микроорганизмами III – IV групп патогенности. Работа с микроорганизмами II – I групп патогенности не регламентируется. Техногенная вспышка сибирской язвы в Свердловске в 1979 году и серия террористических актов в США в 2001 году с применением «оружейного» препарата спор Bacillus anthracis изменили отношение к клиническим микробиологическим лабораториям, которые в определенных ситуациях оказываются первой лабораторной службой, способной обнаружить, оце-нить степень опасности и предложить специфические средства защиты от террористического акта. Заранее оценить возможность выделения из клинического материала эпидемически опасных видов микроорганизмов, потенциальных агентов биотеррора, можно только при определенных ус-ловиях. В любом случае окончательный диагноз и инфекционный агент определяются в микробиологическом исследовании. Быстрота получения результатов, безопасность сотрудников лаборатории будут зависеть от подготовленности специалистов и правильного поведения бактериологов и руководства лаборатории. Задача лаборатории в этом случае должна состоять в проведении ограниченного числа регламентированных тестов, позволяющих заподозрить выделенный микроорганизм как возможный агент террористического акта с его передачей в рефрентную лаборато-рию и в своевременном информировании заранее определенных служб местного здравоохранения и государственных органов, участвующих в ликвидации террористического акта. Большая вероятность попадания ма-териала, содержащего агенты биотеррористического акта, в клинические микробиологические лаборатории требует по новому рассмотреть профес-сиональную подготовку сотрудников, режим работы лабораторий, правила безопасности и средства защиты, перечень необходимого оборудования, сред и реагентов, необходимость средств экстренной связи с местными органами здравоохранения и референтными лабораториями. Необходима организация системы международного сотрудничества в области биобе-зопасности и противодействии биотерроризму в России.

82

МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ С ПОМОЩЬЮ sFAS

Белушкина Н.Н.1, Мохиль-Дейн А.Х.1, Петрова У.Н.2

1 – НИИ молекулярной медицины ММА им.И.М.Сеченова 2 – Детская клиническая городская больница №9 им. Г.Н. Сперанского

Введение. Нарушение механизма отрицательной селекции лимфоцитов, в частности, появление в крови больных аутоиммунными заболеваниями растворимой формы Fas (sFas) может играть важную роль в изменении регуляции апоптоза при помощи системы Fas/FasL. Выяснение роли sFas в регуляции апоптоза лимфоцитов у больных ситемной красной волчанкой (СКВ).

Материалы и методы. Определение концентрации sFas в плазме пе-риферической осуществляли методом иммуноферментного анализа с ис-пользованием моноклональных антител к sFas (клон 2F3, «Биоарсенал», Россия. Регистрация апоптоза клеток осуществлялась с помощью проточ-ной цитофлуориметрии после окрашивания ДНК йодистым пропидием в качестве флуорохрома и измерением процента гиподиплоидных клеток на проточном цитофлуориметре-сортировщике клеток EPICS-XL-2 («Beckman coulter», США).

Результаты и обсуждение. При sFas обнаружено увеличение концент-рации растворимого Fas у больных СКВ по сравнению с нормальными здоровыми донорами (1,62±0,29 и 1,38±0,06 нг/мл, соответственно). Первая стадия заболевания характеризовалась самым высоким уровнем sFas по сравнению с второй или третьей (1,81±0,10, 1,35±0,03, 1,26±0,02, соответственно). Снижение sFas при наиболее тяжелой степени активнос-ти СКВ можно объяснить несколькими причинами: при III активности была зарегистрирована повышенная экспрессия FasL на поверхности лимфоцитов, что приводит к взаимодействию sFas/FasL и к снижению концентрации sFas в плазме крови. Использование в наших экспериментах иммуноферментного анализа для определения уровня sFas регистрирует только свободный sFas: нефропатия, характерная для третьей стадии СКВ, может влиять на экскрецию белков маленького размера с мочой, снижая их уровень в плазме. Было обнаружено, что существует положительная корреляция (r =0,5) между содержанием sFas в плазме и процентом акти-вированных лимфоцитов.

Заключение. Можно предположить, что экспрессия Fas возрастает в момент активации лимфоцитов. Увеличение уровня sFas у больных СКВ при этом объясняется протеолитическим расщеплением трансмембранной формы Fas либо альтернативным сплайсингом. Это может являться меха-низмом, регулирующим функцию Fas-рецептора.

83

ПОИСК ГЕНОВ «ПРОЧНОСТИ» И «БРЕННОСТИ»: 2. РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНА РЕПАРАЦИ XRCC1 И НЕКОТОРЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНО СВЯЗАННЫХ С НИМ ГЕНОВ В РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИЙ, СОКРАЩАЮЩИХ

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИБелявская В.А.1, Сметанникова Н.А.1, Гервас П.А.5, Казначеев К.С.3,

Максимов В.Н.2.4, Логинова Н.В.2,3, Шабалин А.В.2,3, Чердынцева Н.В.5, Воевода М.И.2,3.4

1 – ГНЦ ВБ «Вектор» МЗ РФ, 2 – НИИ Терапии СО РАМН 3 – Новосибирская государственная медицинская академия

4 – Институт цитологии и генетики, 5 – НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН

Процессы репарации и апоптоза сбалансированно обеспечивают стабиль-ность генома, предотвращают накопление генетически измененных клеток и, как следствие, развитие онкопатологий – наиболее распространенных заболеваний, сокращающих продолжительность жизни у человека. Печальное лидерство среди них принадлежит неоплазиям, имеющим наряду с генети-ческой выраженную внешнесредовую составляющую (рак легкого, желудка, гемобластозы). XRCC1 (X-ray cross-complementing group I) участвует в репа-рации и, не обладая собственной ферментативной активностью, в качестве поддерживающего (scaffold) белка является необходимым компонентом BER- (base excision repair) комплекса (Thacker J.et al. 2003). Этот комплекс образу-ется при репарации ДНК в случае ее повреждения различными генотоксиче-сикими факторами (алкилирующими агентами, ионизирующей радиацией и др.) для устранения аддуктов и ошибочно спаренных оснований. Наблюдали значительное увеличение экспрессии гена в различных типах эпителиальных клетках под воздействием ионов тяжелых металлов (Welsh et al., 2001).Недавно было показано, что онкосупрессорная роль Р53 может быть обусловлена в том числе его участием в стимуляции при BER через контактное взаимодействие с белками комплекса и поврежденной ДНК (Zhou J. et al. 2001, Young Rok Seo et al. 2004).Таким образом, в одном из ключевых процессов репарации оба гена функционально связаны и их полиморфизмы в комбинации могут значительно влиять на индивидуальную восприимчивость к повреждающим ДНК агентам и развитию онкопатологий.

Целью настоящей работы было исследовать влияние полиморфизма гена XRCC1 изолированно и в комбинации с полиморфизмами генов Р53, его сигнал-передающего рецептора ССR5 и лиганда TNFα на продолжитель-ности жизни и предрасположенность к онкопатологиям, обусловленным экспозицией внешних генотоксических агентов.

Материалы и методы. Исследовалась геномная ДНК, выделенная из периферической крови: 1) онкологически здоровых долгожителей (n=86) возрасте 84-105 лет и подростков (n=148) в возрасте 14 – 17 лет; 2) боль-

84

ных раком легкого (РЛ) (n=122), желудка (аденокарциномы, РЖ) (n=41), детским острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) (n=17)средний возраст 4,5 года.Типирование генов XRCC1 (Arg399Gln) и Р53 (по трем полимор-физмам:: Arg72Pro в 4 экзоне, дупликация в 16 пар оснований (dup16) в 3 интроне, MspI-полиморфизм в 6 интроне); CCR5 (del32); TNFα (G 308A в промоторной области) проводили с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа со-гласно описанным ранее методикам.

Результаты. Распределение генотипов по полиморфизму гена XRCC1 у долгожителей было следующим: 33,5% Arg/Arg, 52,8% Arg/Gln, 13,5% Gln/Gln, и статистически значимо не отличалось от группы подростков. В группах больных с онкопатологиями наблюдали: 1) при РЛ – увеличение частоты гетерозигот в 1,94 (c2=5,07, р=0,0244) раза; 2) при РЖ – практи-чески 100% гетерозиготность за исключением одного больного (OR=35,7, 95%CI=18,32-38,39), при ОЛЛ, напротив, снижение частоты гетерозигот в 2,13 раза ( OR=3,36 95% СI=2,68-4,22).При анализе комбинаций поли-морфизмов (XRCC1 x p53) выявлено, что сочетание генотипов минорных аллелей (M) Gln/Gln x Pro/Pro, связанных со сниженной функциональной активностью белков, тем не менее является комбинацией «прочности», т.е. встречается у долгожителей в 8,83 раза чаще, чем у подростков (c2=5,53, p=0,0183).Эта же комбинация ассоциирована с риском заболеваемости при РЛ и ОЛЛ, так как по сравнению со здоровыми подростками встречается чаще в 2,08 (c2= 15,35, p=0,001) и 9,47 (c2=3,89, р=0,0486) раза соответствен-но. Конверсии ассоциативной связи полиморфизма Р53 с продолжитель-ностью жизни и онкопатологиями были ранее выявлены при проведении мета-анализа (Donehower et al. 2005). При расширении анализа комбинаций с включением полиморфизмов генов CCR5 и TNFα, а также гаплотипов по трем полиморфизмам гена Р53 были обнаружено, что 1) комбинация XRCC1 W/M х р53 (M/M ex 4 х W/M in 3 х in 6 W/M) позитивно ассоциирована с продолжительностью жизни (эффект «прочности»), поскольку встречается в 8,33 (c2= 5,53, p=0,0183) раз чаще у долгожителей по сравнению с под-ростками; 2) Среди детей с ОЛЛ были обнаружены 5 уникальных геноти-пических комбинаций, не встречающихся ни у долгожителей, ни у подрос-тков, в то время как у долгожителей уникальных комбинации отсутствуют; 3) гаплотип (W-W-M) у индивидуумов, гетерозиготных только по одному из трех полиморфных локусов Р53, ассоциирован с риском онкопатологий (в частности, для ОЛЛ (OR=6,8, 95%CI=1,95-7,8).

Изучены этногеографические вариации популяционного распределения полиморфизмов анализированных генов, роль этих полиморфизмов при заболе-ваниях различной этиологии (на основе мета-анализа литературных данных).

Обсуждаются выявленные эффекты возраст-ассоциированной связи минорных аллелей генов, участвующих в поддержании стабильности ге-нома, на развитие онкопатологий и продолжительность жизни.

85

ИЗУЧЕНИЕ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ТАМЕРИТА – ТАБЛЕТКИ,

ПОКРЫТЫЕ ОБОЛОЧКОЙ

Березовская И.В.1, Дрожжина К.А.2, Рымарцев В.И.1, Абидов А.Т.2, Спасский Ю.А.1, Зюзя Ю.Р.1, Волкова Л.И.1

1 – ОАО «ВНЦ БАВ», 2 – Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Расширение ассортимента лекарственных форм позволяет наибо-лее грамотно и безопасно проводить индивидуальную фармакотерапию конкретным препаратом. Данное положение является актуальным при разработке новой лекарственной формы – таблетки, покрытые кишеч-норастворимой оболочкой для приема внутрь, отечественного препарата Тамерит, обладающего противовоспалительным, антиоксидантным и иммуномодулирующим действием.

Цель: изучение общетоксического действия вышеуказанной лекформы Тамерита в остром и хроническом токсикологическом эксперименте с целью обоснования безопасности приема препарата внутрь.

Материалы и методы: Группы животных формировались методом слу-чайных чисел с использованием массы тела в качестве ведущего признака. Изучение острой токсичности таблеток тамерита проведено на рандомбред-ных белых мышах-самцах при в/брюшинном введении в дозах 3000, 5000 и 6000 мг/кг. Средние смертельные дозы (LD50) рассчитывали методом пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону. Хроническая токсичность изучена на рандомбредных белых крысах-самцах. Препарат вводили внутрижелудочно в течение 1 месяца в дозах 19,6 (терапевтическая) и 196 мг/кг, десятикратно превышающей терапевтическую дозу для крыс и в 70 раз – для человека в мг/кг.

Результаты: По результатам определения острой токсичности Тамерит относится к VІ классу токсичности – относительно безвредным веществам.

Тамерит в изученных дозах не вызывал достоверных изменений в интег-ральных показателях у подопытных животных (прирост массы тела, поведен-ческие реакции, потребление пищи, воды), клеточном составе и параметрах свертывания периферической крови, функции печени, уровня содержания холестерина в сыворотке крови, функционального состояния выделитель-ной, сердечно-сосудистой и нервной систем. Тамерит не оказывал мест-ного раздражающего действия на слизистую желудочно-кишечного тракта. Морфологическое и гистологическое исследование не выявили структурных нарушений в органах и тканях животных при изученных дозах.

Выводы: Токсикологическими исследованиями доказана безопасность применения Тамерита в таблетках, покрытых кишечнорастворимой обо-лочкой, для приема внутрь.

86

СИНДРОМ ПОТЕРИ ПЛОДА И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА МЕТИЛЕНТЕТРАГИДРОФОЛАТ РЕДУКТАЗЫ (MTHFR)

Беспалова О.Н.1, Васильева И.Ю.2, Малышева О.В.1,Иващенко Т.Э.1

1 – НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Санкт-Петербург2 – Медико-генетический городской центр, Санкт-Петербург

Синдром потери плода (СПП) – новый термин, появившейся в пос-леднее время и включающий в себя: один самопроизвольный выкидыш на сроке 8 и более недель; 2 и более самопроизвольных выкидышей до 8 недель эмбрионального развития; мертворождение; неонатальную смерть. Возникновение микротромбозов при беременности может быть причиной СПП. Фактором риска, резко увеличивающим вероятность развития тром-бозов, является гипергомоцистеинемия (ГГЦ). Одним из важных факторов, способствующих росту гомоцистеина в крови, является наследственная предрасположенность.

Целью работы явилось изучение особенностей аллельного полимор-физма гена MTHFR у пациенток с СПП и в группе контроля. Методом ПЦР-ПДРФ анализа исследованы частоты аллелей и генотипов С677Т полиморфизма гена MTHFR. Мы условно разделили пациенток с СПП на 2 группы: 1-ую группу составили 106 пациенток с привычными выки-дышами (ПВ) ранних сроков в анамнезе, во 2-ую группу вошли 29 жен-щин с одним выкидышем в анамнезе. Группу контроля (3-я) составили 40 женщин, имеющих в анамнезе одни или более нормальных родов и без самопроизвольных выкидышей.

При анализе гена MTHFR не выявлено достоверных различий в частотах аллеля Т в группе контроля (21,5%) и в группе пациенток с ПВ (29,4%), од-нако выявлено достоверное повышение частоты аллеля Т в группе женщин с одним выкидышем (33,1%, р<0,05). Среди пациенток с ПВ ранних сроков частота генотипов С677С (50,9%) была несколько ниже, чем в контроле (57,5%), тогда как у женщин с одним выкидышем гомозиготы С/С встре-чались достоверно реже (41,3%, р<0,05). Гетерозиготы С677Т выявлялись чаще у пациенток с одним выкидышем (55,2%), по сравнению с группой с ПВ и контролем (39,6% и 40%, соответственно, р<0,05). Относительный риск развития синдрома потери плода при наличии генотипа С677Т увели-чивается почти в 1,9 раза (OR=1,87; CI: 0,6-3,9). Интересно отметить, что гомозиготы по мутантному аллелю Т в 3 раза чаще идентифицировались в группе женщин с ПВ (9,5%), чем в группе контроля (2,5%) и в 2,5 раза чаще, чем в группе женщин с одним выкидышем (3,5%).

Таким образом, молекулярно-биологическое исследование особен-ностей аллельного полиморфизма гена MTHFR у пациенток с разными формами синдрома потери плода являются прогностическими значимыми для вынашивания беременности.

87

РАЗРАБОТКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СПОР СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

НА ОСНОВЕ ВЫСОКОСПЕЦИФИЧНЫХ АНТИТЕЛ

Бикетов С.Ф., Баранова Е.В., Баранов А.М., Ветчинин С.С., Рудницкий С.Ю., Штанников А.В.

Государственный научный центр прикладной микробиологии, п. Оболенск, Московская область

С помощью поэтапного селективного демаскирования специфических и инактивации неспецифических эпитопов, с использованием хаотропных агентов и детергентов и последующей жидкостной хроматографии, нам удалось выделить высокоиммуногенный споровый антиген из вакцинного штамма СТИ B.anthracis. Иммуноцитохимические и иммунохимические исследования, включая иммунноэлектронную микроскопию и Western-блот анализ, свидетельствуют о локализации данного антигена на внешней оболочке спор. По данным электрофоретического анализа, выделенный антиген является белком с молекулярной массой 94 кД. Редукция иммуно-реактивных свойств антигена при обработке перйодатом натрия указывает на углеводную природу иммуногенных эпитопов.

Выделенный антиген был использован для получения кроличьей ги-периммунной сыворотки, а также получения моноклональных антител и наработки асцитической жидкости на мышах. Очищенные кроличьи и мы-шиные иммуноглобулины тестировали на наличие перекрестных реакций более чем со 100 видами бактерий, как в споровой, так и в вегетативной формах. Не обнаружено перекрестных реакций ни с одним из исследован-ных видов бактерий. Выделенные иммуноглобулины имели спороспеци-фичность и не реагировали с вегетативными формами B.anthracis.

Полученные антитела были проверены в различных диагностических тестах, включая дот-иммуноблот анализ и латекс-агглютинацию. Пока-зана возможность совместного использования моноклональных антител и кроличьих иммуноглобулинов в формате «сэндвич» – ИФА. Нижний предел определения спор B.anthracis в дот-иммуноблот анализе и «сэн-двич» – ИФА составил 104 спор/мл, в реакции латекс-агглютинации – 105 спор/мл.

В настоящее время на основе полученных антител проводятся раз-работки современного диагностического экспресс-теста – проточной иммунохроматографии.

88

КОМБИНАТОРИКА ТРАДИЦИОННОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО И

ГЕНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ У БОЛЬНЫХ С ИНФЕКЦИОННО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ

ОСЛОЖНЕНИЯМИ ЦНС

Благовещенский С.В., Черепахина Н.Е., Пронина О.А., Шайхаев Г.О., Демкин В.Д., Качков И.А., Сучков С.В.

МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского, ММА им. И.М. Сеченова, ИОГЕН РАН, ИМГ РАН, Москва

Введение. Для эффективного клинического применения новейших ан-тимикробных и иммунотерапевтических средств в комплексном лечении больных с инфекционно-воспалительными заболеваниями ЦНС (ИВЗ ЦНС) необходимым условием является иммуногеномониторинг таких пациентов с использованием соответствующих комбинаций молекулярно-диагностических инструментов. Оптимальная конфигурация технологий в таком мониторинге – сочетание ПЦР-диагностики с традиционным микробиологическим культивированием и серологическим анализом ин-фекционных маркеров.

Ранее для ИВЗ ЦНС установлено наличие различных иммунологичес-ких синдромов: вторичного иммунодефицита (ВИД) и ВИД-ассоцииро-ванного аутоиммунного синдрома (ВИДАС). Цель работы: сравнительное исследование микробных пейзажей очагов воспаления и крови на наличие возбудителей бактериальной и смешанной природы.

Материалы и методы. Обследовано 69 больных с различными форма-ми ИВЗ ЦНС, включая абсцессы головного мозга (АГМ), оболочечные эмпиемы и менингоэнцефалиты. Кровь и содержимое очага воспаления исследовали на наличие бактериальной флоры, оппортунистических ин-фекций (внутриклеточных паразитов) и нейровирусов. В работе исполь-зованы традиционные методы микробиологического культивирования и современная технология ПЦР-диагностики с детекцией в агарозе. Серо-логическое тестирование крови на наличие антиинфекционных аутоАТ проводили методом ИФА.

Результаты. У больных с ВИД, в число которых вошли АГМ, наиболее тяжелые варианты оболочечных эмпием и острые формы менингоэнце-фалитов, выявлялись инфекционные возбудители бактериальной (в 94% случаев, в том числе, в составе микробных ассоциатов), паразитарной (в 2% случаев) и смешанной (в 4% случаев) природы. У больных с ВИДАС преобладающей флорой (88% случаев) являлись смешанные (бактериаль-но-паразитарные и бактериально-вирусные) инфекции, обуславливающие хронически-рецидивирующий характер заболевания с формированием

89

вторичных признаков аутоиммунного синдрома. Таким образом, одной из причин формирования синдрома ВИДАС может быть особый спектр возбудителей, с присутствием ряда нейровирусов и внутриклеточных па-разитов, обладающих свойствами антигенной мимикрии и способных про-воцировать при хронизации инфекции развитие аутоиммунного синдрома. Таким образом, у больных с ИВЗ ЦНС и признаками иммунопатологии целесообразно использовать современные методы иммуногенодиагности-ки. Это позволяет грамотно оценивать ВИД или ВИДАС и разрабатывать программы лечения с рациональным использованием антибактериальных, противовирусных и иммунокорригирующих препаратов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ПРЕПАРАТА ТАМЕРИТ ПРИ

ВНУТРИМЫШЕЧНОМ И ПЕРОРАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ

Бобров В.И.1, Дрожжина К.А. 2, Абидов А.Т.2, Птицина С.Н.1,Борисов М.М.1, Иванова И.К.1

1 – ОАО «ВНЦ БАВ», 2 – Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Препарат Тамерит оказывает противовоспалительное, антиоксидантное и иммуномодулирующее действие. Тамерит в лекформе – порошок для инъекций применяют при острых и хронических воспалительных заболе-ваниях желудочно-кишечного тракта, сопровождающихся интоксикацией и (или) диареей, в комплексной терапии острых и хронических вирусных гепатитов и ряде других заболеваний, сопровождающихся вторичным иммунодефицитом.

Доказанная эффективность препарата в клинической практике, а также улучшение качества жизни пациентов при длительном назначении Таме-рита предопределили разработку новой лекарственной формы – таблетки для приема внутрь.

Цель: Изучение биодоступности Тамерита в таблетках, покрытых ки-шечнорастворимой оболочкой, а также сравнительной биодоступности указанной лекформы с внутримышечным введением препарата.

Материалы и методы: Исследования выполнены на кроликах – самцах породы Шиншилла. Расчет фармакокинетических данных проводили по программе ASKID. Для определения фармакокинетических параметров использовали однокамерную модель с всасыванием первого порядка. Изучение фармакокинетики препарата проводили после однократного внутримышечного введения (в дозе 31 мг/кг) тамерита и перорального (95 мг/кг) введения кроликам таблеток тамерита, покрытых кишечно-рас-

90

творимой оболочкой. Определения концентрации тамерита в образцах осуществляли спектрофотометрическим методом при длине волны l=346 нм.

Результаты: Показано, что фармакокинетика тамерита при внутри-мышечном введении характеризуется быстрым увеличением концент-рации препарата в плазме, достижением максимальной концентрации (Сmax = 41,5 мкг/мл) в течение 17,9 минут и быстрым выведением его из кровеносного русла (период полувыведения (T1/2b) – 17,2 минуты. Установлено, что при пероральном введении таблеток тамерита кроли-кам в дозе 95 мг/кг создаются высокие концентрации препарата в крови (Сmax– 42,6 мкг/мл достигается через 2 часа) с последующим выведением его из кровеносного русла, период полувыведения (T1/2b) –2,6 часа.

Выводы: Доказана биодоступность тамерита в лекарственной форме – таблетки, покрытые кишечнорастворимой оболочкой. Расчет показателей относительной биодоступности двух лекформ: порошок для внутримы-шечного введения и таблеток для приема внутрь, свидетельствует о досто-верности соотношений количества препарата, поступившего в системный кровоток при применении его в указанных лекформах.

91

АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ КАК ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЖКТ

ЧЕЛОВЕКА

Богданова Е.А., Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., Брюхова М.В.Московская медицинская академия им.И.М.Сеченова, Москва.

Воспалительные и онкологические заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека отличаются широким распространением и сопро-вождаются выраженным снижением качества жизни. Это по праву позволяет отнести их к группе социально значимых. Одна из вероятных причин вос-палительных и онкологических заболеваний ЖКТ, обсуждаемая в последнее время, является колонизация биотопов организма пациента штаммами микро-бов с атипичными свойствами, в частности, с измененной адгезивностью.

Для уточнения проблемы проведено сравнительное изучение адгезивных свойств лактобактерий и эшерихий, выделенных из пристеночного муцина биоптатов толстой кишки, которые были полученных при эндоскопичес-ком исследовании 10 пациентов с воспалительными заболеваниями, 12 – с опухолями толстой кишки и 20 человек без визуально-морфологических проявлений поражения кишечной стенки.

Установлено, что в пристеночном муцине участков кишки с воспа-лением заметно повышается (на 39%, р<0,05) количество лактобактерий способных адгезироваться на гликокаликсе клеток кишки. Это явление сопровождается резким снижением количества ко-адгезирующихся и не-адгезирующихся штаммов (в 3,7-3,6 раза, р<0,001). Анализ адгезионной способности эшерихий показал, что, как и в случае с лактобактериями, при воспалении в пристеночном муцине существенно увеличивается ко-личество эшерихий, способных к адгезии к гликокаликсу клеток (на 37%, р<0,01), с одновременным снижением количества ко-адгезирующихся бактерий (в 3,0 раза, р<0,01). Очевидно, что воспаленная ткань создает предпосылки для накопления на слизистой высокоадгезивных штаммов к эпителиальному гликокаликсу и элиминации штаммов, обеспечивающих образование микробных агрегатов. В пристеночном муцине на участках кишки с опухолью по сравнению с нормой накапливается на 24 % больше свободных (неадгезирующихся) лактобактерий, а также уменьшается в 1,5 раза количество ко-адгезирующихся штаммов эшерихий.

Таким образом, наше исследование подтвердило возможность накопления в муцине слизистой толстой кишки при ее воспалительном или опухолевом поражении штаммов лактобактерий и эшерихий, отличающихся по своей способности к адгезии. Полученные данные указывают на целесообразность использования описанного явления в клинико-диагностической практике для повышения эффективности диагностики заболеваний ЖКТ человека.

92

ПРОГНОЗ ГЛОБАЛЬНОЙ ЭПИДЕМИИ ГРИППА A(H2N2)В РЕЗУЛЬТАТЕ РАССЫЛКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ПО

ЛАБОРАТОРИЯМ МИРА1Боев Б.В., 2Евстигнеев В.И., 2Щербаков Г.Я.

1 – ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 2 – Открытое акционерное общество «Биопрепарат», г. Москва

После того, как в начале 2005 года американские вирусологи по ошиб-ке разослали в 4 тыс. лаборатории штамм возбудителя гриппа А(H2N2) (России в числе адресатов не было), эпидемиологи вправе рассматривать сценарий появления эпидемии гриппа уже в ближайшее время. Впервые вирус А(H2N2) был выявлен на юге Китая в 1957 году и в течение 2-х лет стал причиной смерти нескольких миллионов человек на планете. Сегод-ня у большинства людей в возрасте до 40 лет нет защитного иммунитета против этого возбудителя. В случае возникновения эпидемии (пандемии!) могут пострадать десятки миллионов человек, т.к. штамм А(H2N2) отно-сится экспертами ВОЗ к разряду опасных патогенов.

Целью исследования было изучение последствий возможной эпидемии гриппа А(H2N2), которая может сформироваться при случайном «выносе» патогена из соответствующей научной лаборатории. В качестве объекта исследования была использована информация эпидемии гриппа А(H2N2) в 1957-1958 гг., а именно компьютерная модель (Барояна-Рвачева) эпидемии с характеристиками возбудителя А(H2N2) и оценки «коллективного» имму-нитета населения для 52 городов мира по состоянию на начало 2005 года. В результате вычислительных экспериментов с компьютерной моделью эпидемии гриппа А(H2N2) в сезон 2005 года получены оценки последствий глобального распространения гриппа с учетом «разноса» возбудителя по мировым транспортным сетям (данные по международным авиалиниям взяты из сети Интернет). Для сценария старта эпидемии гриппа А(H2N2) в Западной Европе (столица с интенсивным международным воздушным движением) были получены следующие оценки: 1) эпидемия в странах Европы продлится 220 дней c момента появления патогена; 2) всего на планете гриппом заболеет около 1 млрд. человек, а от осложнений гриппа погибнет не менее 5 млн. человек.

Вместе с тем, эксперты ВОЗ еще в декабре 2004 года высказали свое мнение о потенциальной величине ущерба следующей пандемии грип-па – пандемия нового вируса гриппа может затронуть от 20 до 50 % населения планеты.

93

ЦИРКУЛЯЦИЯ ДНК В ОРГАНИЗМЕ ОНКОБОЛЬНОГО: НЕИЗВЕСТНЫЕ АСПЕКТЫ ВЫВЕДЕНИЯ

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Бондарь Г.В., Кайряк О.В., Доценко О.И., Лунев О.Г.Кафедра онкологии Донецкого государственного университета

Донецкий областной противоопухолевый центрКафедра биофизики Донецкого национального университета

Исследователи, работающие над проблемой циркуляции нуклеиновых кислот в последнее время столкнулись с рядом парадоксов, суть которых сводится к ряду вопросов: почему в биологических жидкостях онкобольных регистрируются нуклеиновые кислоты опухолевой природы? Как осущесв-ляется утилизация свободной ДНК сыворотки крови?

Целью исследования явилось проверка возможности участия эритро-цитов в обмене нуклеиновых кислот и их утилизации.

Изучали взаимодействие различных структурных форм ДНК (нативной, однонитевой, сверхспирализованной) с мембраной эритроцитов. Исполь-зовали суспензию теней эритроцитов, с постоянным содержанием клеток 1,33×109 кл/л и переменной концентрацией ДНК спермы лосося. Концен-трация ДНК варьировала от 4 до 60 мкг/мл. Смесь инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, супернатант отделяли центрифуги-рованием. Количество связавшейся с тенями эритроцитов ДНК определяли по разности исходной и свободной ДНК спектрофотометрически.

Показана способность всех изучаемых форм ДНК связываться с мембраной эритроцитов. Установлено, что мембрана эритроцитов имеет два типа центров связывания для ДНК, отличающихся по аффинитету. Рассчитаны константы связывания и концентрация центров связыва-ния. Показано, что изотерма связывания для однонитевой ДНК имеет гиперболический характер, в то время как для нативной ДНК изотерма связывания имеет колоколообразный вид с максимумом связывания 25 мкг/мл, что указывает на кооперативный характер связывания. Изотер-ма связывания для сверхспирализованой ДНК также имеет вид гиперболы, однако насыщение наступает при более низких концентрациях. Ежедневно в организме человека погибает до 200*10 эритроцитов в клетках ретику-лоэндотелиальной системы. Продукты распада эритроцитов связываются с белками сыворотки, преобразуются в печени и выделяются с желчью. При онкопатологии, особенно при наличии отдаленных метастазов, у зна-чителоьной части больных наблюдаются анемии, следовательно, меньшее количество эритроцитов связывает свободную ДНК, что является вероят-ной причиной снижения скорости утилизации нуклеиновых кислот при опухолевом росте.

94

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ СЫВОРОТОЧНЫХ И КЛЕТОЧНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ МОНИТОРИНГА БОЛЬНЫХ

РАКОМ ЯИЧНИКОВ Бондарь Г.В., Лисовская Н.Ю., Кайряк О.В.Донецкий областной противоопухолевый центр

Проблема мониторинга опухолевого процесса в процессе химиотерапии (ХТ) является актуальной, поскольку изучение специфических маркеров опухоли позволяет правильно оценить эффективность и определить тактику лечения. Целью исследования явилась оценка диагностической информатив-ности показателей специфического клеточного иммунитета и сывороточного маркера СА 125 для мониторинга больных раком яичников. Обследовано 38 больных первичным раком яичников III-IV стадии (T2-3N0-1M0-1) и 7 больных рецидивным раком яичников в процессе комбинированного лечения. Произведен анализ 84 параллельных исследований уровня опухо-левого маркера Са 125 в сыворотке крови и индекса аффинности лейкоци-тов периферической крови к опухолевым экстрактам первичной опухоли в тесте подавления адгезии лейкоцитов на различных этапах лечения. До лечения в 94,73% случаев содержание онкопротеина СА 125 в сыворотке крови больных было повышено, среднее значение составило 220,7 МЕ/мл. На фоне эффективной ХТ частота выявления повышенного уровня СА 125 прогрессивно снижается и при обследовании больных после операции повышенный уровень СА 125 отмечен у 25% больных, среднее его значение уменьшается до 29,2 МЕ/мл, а у больных в ремиссии отмечены единичные случаи (10%) повышения уровня СА 125. Повышенный аффинитет лей-коцитов к опухолевым антигенам у больных раком яичников до лечения выявлен в 60,53% случаев при постановке теста на донорской сыворотке и в 65,79% – на аутосыворотке. Снижение аффинитета лейкоцитов к опухоле-вым антигенам, зарегистрированное перед 2-м курсом ХТ, сменяется ростом этого показателя перед 3-м курсом и только при обследовании больных перед 4-6-м курсами ХТ отмечается снижение изучаемого показателя ниже исходного значения. У больных в ремиссии положительные реакции в тесте отмечены в 30% и 60% случаев – на донорской и аутосыворотке соответс-твенно. Объяснить полученные данные можно принимая во внимание тот факт, что повышенное содержание опухолевых гликопротеидов в сыворотке ведет к снижению функциональной активности лейкоцитов периферической крови, проявляющих неадекватную реакцию при инкубации с опухолевыми экстрактами первичной опухоли. В то время как на фоне ХТ происходит снижение уровня СА 125 в сыворотке крови возрастает диагностическая ценность показателей клеточного иммунитета. Одновременная оценка клеточных и сывороточных маркеров позволяет получить более полную информацию об активности опухолевого процесса.

95

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ПОЛИГУАНИДИНОВ ДЛЯ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ

ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ

Борзенкова Т.Х.1, Доброхотский О.Н.1, Воинцева И.И.2, Скороходова О.Н.2, Губин С.В.3

1 – ПЧС в МСЧ № 164 ФМБА, Россия, Оболенск, 2 – ООО «ЭВИМА», Москва3 – Головной Центр СЭН ФМБА, Москва

В современном мире возникла проблема получения воды, безопасной для здоровья. Специалисты, объединенные Всемирной организацией здравоохранения, выработали единые нормы допустимого содержания в воде различных загрязняющих веществ. Микробиологические загрязнения среди прочих составляют подавляющее большинство.

В последние годы в России интенсивно разрабатываются дезинфекционные средства на основе нового класса полимерных биоцидных препаратов, пред-ставляющих собой высокомолекулярные соли полигексаметиленгуанидина (ПГМГ). Соли ПГМГ длительно хранятся, не теряя биоцидной активности, хорошо растворимы в воде, не имеют запаха, мало токсичны для человека и животных, не вызывают аллергию у людей, обесцвечивания тканей и коррозию оборудования. Полигуанидиновые препараты разрешены для использования в РФ в качестве дезинфекционных средств в лечебных учреждениях, в ветерина-рии, в пищевой отрасли, в сельском хозяйстве, а также для обеззараживания питьевой воды, воды плавательных бассейнов, сточных вод. Соли ПГМГ эффективны против большинства патогенных микроорганизмов: бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза, вирусов – гепатита B, ВИЧ, гриппа, герпеса, полиомиелита, грибов и водорослей.

В настоящее время не решена проблема защиты оборудования от биооб-растания и консервации питьевой воды. В воде происходит развитие микро-флоры, в том числе, патогенной, приводящее к биообрастанию поверхностей и делающее питьевую воду не пригодной для употребления. К оборудованию, нуждающемуся в защите от биообрастания, относятся емкости для хранения воды, конструкции водопровода и водоочистные устройства.

На основе полигуанидиновых препаратов, в настоящее время разработаны биоцидные химически сшитые композиции (полимерные пленки в виде лаков и красок), сочетающие биоцидные свойства полигуанидинов и водостой-кость. Дальнейшая разработка полимерных полигуанидиновых композиций, изучение их биоцидных свойств, позволят решить проблему долговременной обработки поверхностей объектов, контактирующих с питьевой водой.

Предварительные данные позволили установить антимикробную ак-тивность ПГМГ по отношению к возбудителям особо опасных инфек-ций – туляремии, сибирской язвы, сапа, чумы и легионеллеза.

96

Дезинфицирующее действие лакокрасочных покрытий на основе ПГМГ будет изучено в отношении возбудителей таких заболеваний, как сибирская язва, туляремия, мелиоидоз, легионеллез, так как события, последних лет позволяют предположить что вышеуказанные микроорганизмы могут быть использованы в актах биологического терроризма.

АНАЛИЗ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ЛЕЧЕНИИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ

ДОКАЗАТЕЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫБочков Н.П.

Российская академия медицинских наук, г. Москва

Интенсивные исследования в области клеточной биологии подтолкнули клиницистов к клиническим исследованиям применения стволовых клеток (СК) для лечения разных заболеваний. К настоящему времени можно ска-зать, что использование СК в лечебной практике – это реальность. Про-ведены сотни клинических протоколов по оценке эффективности лечения СК. Они показали в большинстве случаев положительные результаты. Ни в одном случае не получено осложнений, вызванных СК. Однако на самом деле практически все проведенные исследования являются пилотными. Ни одного протокола для лечения СК в литературе не описано. Принимая во внимание, что лечение СК является новым вариантом трансплантации, совершенно обязательно проведение метаанализа.

Проведенные до сих пор клинические исследования не соответствуют критериям доказательной медицины; в опубликованных работах приводят-ся лишь ограниченные сведения и нет возможности проводить метаана-лиз, а без него нельзя выбрать метод лечения (тип клеток, их количество, способ доставки в орган-мишень, повторность введения и т.д.).

Следующие основные принципы должны быть заложены в планирова-ние каждого клинического исследования по СК.

1. На исследование должно быть получено разрешение этического комитета, и от каждого пациента – информированное согласие.

2. До начала исследования обосновывается величина выборки, позво-ляющая провести сравнение эффектов в разных группах.

3. В клиническом протоколе заранее должны быть определены строгие критерии включения пациентов в группы обследуемых.

4. Заранее определяются наиболее информативные методы или сово-купность методов для верификации результатов лечения СК.

5. Исследование должно сопровождаться контрольной группой. Рет-роспективные или ранее накопленные данные в качестве контроля могут быть использованы лишь как дополнительные.

6. Исследование должно быть рандомизированным.Отсутствие четких представлений о механизмах действия СК не позво-

ляет широко внедрять лечение ими до результатов метаанализов.

97

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КУЛЬТУР ПРИ МОНИТОРИНГЕ СТРЕПТОКОККОВОЙ (ГРУППЫ А)

ИНФЕКЦИИБрико Н.И., Дмитриева Н.Ф., Ещина А.С., Ряпис Л.А., Тимофеев Ю.М.,

Кириллов М.Ю., Будилов А.В.Московская медицинская академия им.И.М.Сеченова, г.Москва

ЗАО «Лаборатория генно-инженерных систем ЛАГИС» Институт молекулярной биологии РАН, г.Москва

Стрептококки серологической группы А (СГА, Streptococcus pyogenes) представляют собой чрезвычайно изменчивую популяцию, насчитыва-ющую более ста типов, различающихся структурой N-концевой части молекулы М-белка, рассматриваемой как главный фактор вирулентности данного возбудителя. Известно, что некоторые М-типы обусловливают распространеие наиболее тяжелых форм стрептококковой группы А ин-фекции. Целью данной работы являлось определение частоты встречае-мости различных М-типов СГА, изолированных от больных на территории Москвы методом emm-типирования.

Культуры стрептококков относили к группе А на основании результатов реакции латекс-агглютинации (SlaidexStrepto Kit ABCDFG). После выде-ления ДНК накапливали концевой фрагмент emm-генов в амплификации с праймерами. Полученные ампликоны длиной 800-1000 пар нуклеотидов элюировали после электрофоретической очистки и вносили в реакцию циклического секвенирования с внутренним праймером. Ампликоны ана-лизировали на автоматическом секвенаторе фирмы «Applied Biosystems 373» с использованием флюоресцентно меченных терминаторов транскрипции. Анализ данных последовательности нуклеотидов для сравнения степени гомологии с опубликованными последовательностями Банка данных и определения emm-типа проводили с помощью программы BLAST2.

Среди многочисленных методов внутривидового типирования СГА осо-бое место занимает сиквенс-типирование определенных последовательнос-тей emm-гена, кодирующего один из важнейших факторов вирулентности S. pyogenes. Этот метод выгодно отличается от «классических» и других методов типирования по воспроизводимости и разрешающим возмож-ностям. В результате сиквенс-типирования выявлено доминирование 1, 31 и 74 emm-типов, которые составили 29,5% всех исследованных культур (77). Из потенциально наиболее вирулентных, нередко выделяемых при синдроме токсического шока и других тяжелых формах стрептококковой инфекции, нами зарегистрированы только СГА М1 типа. Представляется целесообразным использовать метод emm-типирования для слежения за циркуляцией эпидемически значимых вариантов СГА на глобальном, региональном и локальном уровне. Это позволит прогнозировать изме-нение эпидемической обстановки и предсказать появление инвазивных (генерализованных) форм инфекции.

98

ИНВАЗИВНАЯ СТРЕПТОКОККОВАЯ (ГРУППЫ А) ИНФЕКЦИЯ В МОСКВЕ

Брико Н.И., Пронский А.В., Малышев Н.А., Зайратьянц О.В. Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, г. Москва;

Клиническая инфекционная больница №1, г. Москва

В последние годы отмечено увеличение распространенности инвазив-ных форм инфекций (ИСИ), обусловленных Streptococcus pyogenes (син-дром токсического шока, некротический миозит и фасциит, первичный перитонит и др.). В России эти болезни регистрируются крайне редко, хотя, по мнению патологоанатомов они распространены довольно широко, но проходят под другими диагнозами.

Цель исследования: оценить распространенность инвазивных форм СГА инфекции в ЛПУ г. Москвы и разработать рекомендации по совершенство-ванию их выявления и профилактики. Анализу подвернуты 5957 историй болезни и протоколов патологоанатомических вскрытий лиц мужского и женского пола в возрасте от 25 до 85 лет в двух ГКБ г. Москвы. Выявление инвазивных форм инфекции осуществляли с использованием критериев, разработанных экспертами ЦКЗ (США). Лабораторное подтверждение осу-ществляли бактериологическим методом – культивирование бактерий из стерильных в норме сред организма на кровяном агаре и использованием сконструированной нами тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Выявлено 986 случаев (16,5% от общего числа проанализированных случаев) ИСИ. Из них – 200 (20,3%) подтвержденных (с выделением стрептококка группы А), и 786 (79,7%) – вероятных случаев ИСИ (при наличии клинических признаков заболевания без лабораторного под-тверждения). Из подтвержденных случаев инвазивных форм СГА инфек-ции чаще всего регистрировались: инфекционно – токсический шок с полиорганной недостаточностью (38%), сепсис (22%), пневмония (16%) и флегмона (12%). Летальность составила 50,7% (500 случаев). Отмечено нередкое расхождение клинических и патологоанатомических диагнозов. Наиболее часто фоновыми заболеваниями были: сахарный диабет 2-го типа (совпадение отмечалось в 24% случаев); хронический пиелонефрит (30% случаев); гипертоническая болезнь (36% случаев).

Инвазивные стрептококковые инфекции отличаются высокой скоро-течностью процессов и только в случаях экспресс-диагностики поддаются терапии. Наряду с противошоковой и антитоксической терапией перво-степенное значение имеет адекватная срочная антибиотикотерапия при условии сочетания массивных доз бензилпенициллина и клиндамицина. Высокой эффективностью обладают пептиды, полученные на основе су-перантигенов возбудителя (САГ) и способные блокировать взаимодействие

99

САГ с молекулами ГКГС 11 или ТКР. Полученные результаты свидетель-ствуют о широкой распространенности ИСИ в стационарах г. Москвы. Внедрение в широкую практику методов экспресс-идентификации СГА позволит осуществлять эффективную профилактику возникновения ин-вазивных форм инфекции и существенно снизить уровень летальности и инвалидизации больных.

ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ (VEGF) И sVCAM В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ

С ОПУХОЛЯМИ НАДПОЧЕЧНИКОВ

Бритвин Т.А., Казанцева И.А., Калинин А.П.МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва

Цель исследования: сравнительный анализ количественного содержания VEGF и sVCAM в сыворотке крови больных с опухолями надпочечников и у практически здоровых людей.

Материалы и методы: обследовали 52 больных (средний возраст – 51,1 года) с опухолями надпочечников: адренокортикальная аденома (34), ад-ренокортикальный рак (12) и феохромоцитома (6). Клинический диагноз у всех больных подтвержден данными гормональных исследований и результатами гистологического изучения надпочечников после адрена-лэктомии. Группу контроля составили 25 практически здоровых людей (средний возраст – 45,7 лет). Концентрацию VEGF в сыворотке крови больных до начала лечения и в контроле определяли иммуноферментным методом реактивами фирмы «R&D» (США), sVCAM – реактивами фирмы «Bender MedSystems» (Австрия).

Результаты: у больных опухолями надпочечников средний уровень VEGF (304,3+31,0 пг/мл; медиана – 258,5) был достоверно (р=0,002) выше, чем у практически здоровых людей (150,8±22,7 пг/мл; медиана – 126,4). Не обнаружено достоверных различий в показателях sVCAM у обследо-ванных больных (635,7+37,8 нг/мл, медиана – 598,5) и в контрольной группе (615,7±54,3 нг/мл; медиана – 562,1). Выявлена корреляция между уровнем VEGF в крови и возрастом больных (r=0,42; p=0,0001). Наиболее высокие показатели VEGF (474,4+87,9 пг/мл; медиана – 647,6) и sVCAM (688,2±87,7 нг/мл; медиана – 666,3) отмечены при раке коры надпочеч-ника. Показана тенденция к повышению уровня VEGF с увеличением стадии адренокортикального рака. Так, при I стадии (n=1) значение VEGF составило 180,7 пг/мл, при III (n=7) – 417,3±93,8 пг/мл (медиана – 438,7) и при IV (n=4) – 674,2±196,9 пг/мл (медиана – 729,5). У больных гор-монально-неактивным раком коры надпочечника средний уровень VEGF

100

(594,5±147,0 пг/мл; медиана – 571,9) выше, чем при раке с синдромом Ку-шинга (410,5±72,4 пг/мл; медиана – 460,1). При раке коры надпочечника с синдромом Кушинга отмечена корреляция между уровнем VEGF в крови и размером опухоли (r=0,72; p=0,2). Не обнаружено значимых различий в показателях sVCAM у больных адренокортикальным раком с учетом стадии заболевания и функциональной активности опухоли. У больных феохро-моцитомой средний уровень VEGF и sVCAM составил 319,8±105,4 пг/мл (медиана – 241,6) и 542,1±66,4 нг/мл (медиана – 565,5), соответственно. Выявлена корреляция между содержанием sVCAM и уровнем экскреции норадреналина (r=0,45; р=0,39) в данной группе. У больных аденомой коры надпочечника средний уровень VEGF составил 244,4±26,3 пг/мл (медиана – 226,0), sVCAM – 671,8±64,4 нг/мл (медиана – 582,0).

Заключение: представленные данные позволяют предполагать возмож-ное участие VEGF и sVCAM в патогенетических механизмах опухолей надпочечников.

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МИКРОБОВ И ЗАЩИТНЫХ ФАКТОРОВ МАКРООРГАНИЗМА

Быков А.С., Караулов А.В., Воробьев А.А., Быков С.А.Кафедра микробиологии с вирусологией и иммунологией

кафедра клинической иммунологии и аллергологии ММА им. И.М. Сеченова, г. Москва

При взаимодействии микробов с факторами защиты организма-хозяина происходит связывание белков крови, секретов барьерных тканей и клеток с различными, патоген-ассоциированными молекулами «образа» микро-бов (patogen-associated molecular patterns -РАМРs). РАМРs распознаются фагоцитами и дендритными клетками с помощью паттерн-распознающих рецепторов антигенпрезентирующих клеток (РRR – pattern recognition receptors), которые разделяют на следующие три группы.

1. Рецепторы передачи сигналов (Тоll-подобные рецепторы – ТLR), экспрессированные в основном на поверхности клеток, а часть субпопу-ляции (ТLR7, ТLR8, ТLR9 и в некоторых случаях ТLRЗ) – во внутрикле-точных компартментах. Через свои ТLR клетки более активно реагируют на РАМРs, продуцируя цитокины и антимикробные пептиды.

2. Эндоцитозные, мембранные РRR (рецептор для маннозы и рецеп-торы-мусорщики и др.) экспрессированные на поверхности фагоцитов и отвечающие за поглощение и транспорт веществ (рецептор для маннозы и рецепторы – мусорщики и др.).

3. Секретируемые РRR, связываясь с поверхностью микробов, облегча-ют их фагоцитоз. Ими являются молекулы иммуноглобулинов, альбумина,

101

комплемента, ЛПС-связывающего белка, С-реактивного белка, α2-мак-роглобулина, также маннозосвязывающий лектин, Clq и сурфактантные протеины легких (SР-А и SР-О) растворимые белки крови и поверхности слизистых оболочек, относящиеся к семейству коллектинов.

При электронной микроскопии ультратонких срезов бактерий, обра-ботанных сывороткой крови, (или очагов воспаления при атоническом дерматите, пиодермии) мы выявили отложение на поверхности бактерий компоненты 3-й группы РRR, условно названных иммуноглобулиновым покровом. Этот покров, окружающий бактерии, включал иммуноглобули-ны, альбумин, компоненты комплемента и другие гуморальные факторы организма (результаты электронной микроскопии, РИФ и др.). Имеются косвенные данные об участии в его образовании α2-макроглобулина и дру-гих белков, способных образовывать с цитокинами и иммуноглобулинами особые комплексы, поглощаемые клетками организма. Эти компоненты существенно изменяют иммунобиологические свойства бактерий, усиливая иммунное прилипание, «впитывая и складируя» многочисленные цитоки-ны, продуцируемые клетками воспалительного инфильтрата. Не исключе-но, что недавнее обнаружение инициации аллергенами окружающей среды иммунного ответа на эндогенные антигены (аутоаллергены) человека, связано с активацией антигенпрезентирующих клеток иммунными комп-лексами, которые расположены на бактериях в виде иммуноглобулинового покрова. То есть, возможно, развитие аутоиммунного процесса.

ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Васильев А.В., Воротеляк Е.А., Киселев И.В., Роговая О.С., Швецова Е.В., Терских В.В.

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

Одной из задач современной биомедицины является поиск и разработка технологий получения и использования стволовых клеток из доступных тканей, обладающих достаточной полипотентностью. Нами разрабатывают-ся методы восстановления структуры и функций различных тканей путем трансплантации эпидермальных стволовых клеток. Обоснованием такого подхода являются полученные экспериментальные данные о наличии в различных типах эпителия полипотентных клеток-предшественников и сохранение компартмента стволовых эпидермальных клеток в базальном слое эпидермиса при его культивировании.

Наши последние разработки позволяют с помощью особых культу-ральных приемов добиться обогащения популяции пересаживаемых ке-ратиноцитов стволовыми клетками. Разработан метод получения in vitro

102

субпопуляции на 80% обогащенной стволовыми эпителиальными клетками кожи. Метод позволяет разделить различные субпопуляции базальных клеток по их фенотипу и пролиферации во время регенерации и выделять субпопуляцию стволовых эпителиальных клеток кожи, синхронизируя ее в G0/G1. Изучается популяция кератиноцитов, способных к выбросу ядерного красителя Hoechst 33342. С использованием модели мечения эпи-дермальных клеток в составе тканевого эквивалента in vitro и последующим длительным культивированием удалось выявить редко делящиеся клетки, которые, таким образом, могут являться источником жизнеспособных кератиноцитов in vitro длительное время. Методом иммуногистохимии и с использованием конфокальной микроскопии показана экспрессия в эпидермисе человека маркеров, позволяющих предполагать возможную пластичность эпидермальных стволовых клеток. Впервые показана экс-прессия нестина в базальном слое культивированных кератиноцитов и в эпидермисе кожи человека in situ. Кроме этого, в нативном эпидермисе исследуется локализация клеток, несущих различные молекулярные мар-керы, что позволяет выяснить местоположение клеток с различной про-лиферативной активностью, степенью дифференцировки и рядом других признаков. Возможность сохранения стволовых эпидермальных клеток при культивировании открывает перспективы для их дальнейшего изуче-ния и обосновывает их применение в составе жизнеспособных тканевых эквивалентов для восстановления самых различных тканей.

103

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА МУТАЦИЙ ПРОТООНКОГЕНА RET ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ МЕДУЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Васильев Е.В.1, Румянцева У.2, Любченко Л.Н.3, Залетаев Д.В.1

1 – НИИ молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, г. Москва

2 – Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск 3 – Российский онкологический научный центр им. Блохина РАМН, г. Москва

Введение. Медуллярный рак щитовидной железы (МРЩЖ) составляет 5 – 10% всех злокачественных новообразований ЩЖ и происходит из парафолликулярных (кальцитонин секретирующих) C-клеток. У боль-шинства пациентов (70 – 80%) эта опухоль возникает спорадически, а в 20 – 30% случаев МРЩЖ является компонентом наследственного синдрома множественной эндокринной неоплазии (МЭН) 2-го типа. Генетической причиной всех трех подтипов синдрома МЭН-2 (МЭН-2А, МЭН-2Б и се-мейный МРЩЖ) являются герминальные мутации протоонкогена RET.

Цель исследования: изучение спектра герминальных нарушений прото-онкогена RET у пациентов с наследственной и спорадической формами МРЩЖ.

Материалы и методы. Проведено тестирование 10 – 16 экзонов гена RET на материале ДНК из крови 74 пациентов с МРЩЖ, а также 33 их ближай-ших родственников из 65 неродственных семей с использованием методов ПЦР, SSCP, рестриктазного анализа и прямого секвенирования.

Результаты и обсуждение. Обнаружено 11 различных мутаций гена RET у 35 больных из 26 неродственных семей. Преобладающим типом герми-нальных нарушений у российских больных являются миссенс-мутации внеклеточного цистеин-богатого домена RET (цистеиновые кодоны 634 и 620). Впервые описана мутация 1895_1907 delins4 в 11 экзоне и впер-вые в России выявлены редкие трансверсии G1891T (D631Y) и А2372T (Y791F). ДНК-диагностическое обследование 33 здоровых родственников позволило выявить наследуемые патологические мутации гена RET у 15 человек до начала клинической манифестации заболевания, что послужило основанием для проведения профилактической тиреоидэктомии в четырех случаях. У 18 обследованных родственников носительство мутации было исключено. Обоснована целесообразность молекулярно-генетического ск-рининга пациентов с очевидно спорадической формой МРЩЖ, поскольку герминальные мутации протоонкогена RET выявлены в 10 (из 47) случаях спорадического МРЩЖ.

Заключение. Молекулярно-генетический анализ протоонкогена RET становится ведущим методом предиктивной диагностики наследственных форм МРЩЖ.

104

НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ мет-ПЦРДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Васильева Е.Б., Ляшенко А.А., Барановский П.М., Винаров А.З., Северин Е.С.Кафедра биохимии, Кафедра урологии, Лаборатория биотехнологии НИИ

молекулярной медицины Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова, г.Москва

В настоящей работе предлагается разработка метода для проведения неинвазивной диагностики рака предстательной железы (РПЖ). На се-годняшний день традиционный тест на простат-специфический антиген (ПСА) по ряду причин не актуален. В этой связи очевидна необходимость поиска новых опухолевых маркеров. Так, было установлено, что гипер-метилирование СpG-областей промоторной области гена глутатион-S-трансферазы класса p-1 (GSTP1) происходит при РПЖ и отсутствует при аденоме. Это свойство метилирования ДНК можно использовать для диа-гностики РПЖ, в том числе и на ранних стадиях, посредством метилспе-цифической полимеразой цепной реакции (мет-ПЦР). Принцип данного метода состоит в том, что в ходе обработки выделенной от пациента ДНК метабисульфитом натрия, нормальный (неметилированный) цитозин пре-вращается в урацил, а метилированный цитозин не модифицируется, что устанавливается посредством использования двух разных пар праймеров. На основе данного метода нами разрабатываются подходы для неинва-зивной диагностики РПЖ.

105

ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ ПРОТИВОРАКОВОГО ПРЕПАРАТА, СОЗДАННОГО НА ОСНОВЕ МУТАНТНОГО

АДЕНОВИРУСА 5-ГО СЕРОТИПА

Вдовиченко Г.В., Петрищенко В.А., Сергеев А.А., Ким И.И., Фатюхина О.Е., Ишкина Л.Н., Святченко В.А., Сергеев А.Н.

ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская обл.

Наиболее типичными для злокачественных новообразований человека являются соматические мутации в гене р53 (tumor supressor gene). Более 50% всех злокачественных опухолей человека различной локализации яв-ляются дефектными по гену белка р53. Сконструированный в ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» с использованием методов олигонуклеотид-направленного мутагенеза мутантный вариант Adel2 аденовируса человека 5-го серотипа является дефектным по гену белка Е1В 55К (делеция фрагмента 2309-3427 н.) и избирательно размножается на р53-дефектных опухолевых клетках, вызывая их разрушение. Целью настоящих исследований явилось докли-ническое изучение кандидатного лечебного противоракового препарата «Канцеролизин», приготовленного на основе мутантного варианта Adel2 аденовируса человека 5-го серотипа.

В работе были использованы вирусологические, иммунологические и гистологические методы исследований.

Препарат «Канцеролизин» обладает высокой степенью репликативной активности для комплементарных клеток 293 и р53-дефектных опухолевых клеток (A431, SW480) и в тоже время имеет существенные ограничения по репликации в нормальных клетках человека. В экспериментах на лабора-торных животных (мыши, кролики, морские свинки) по доклиническому изучению препарата показана его безвредность и безопасность. При хране-нии препарата в условиях минус 20° С достоверное падение концентрации вируса в нем (примерно в 100 раз) происходит уже через 1 месяц, далее вирусный препарат сохраняет свою активность без существенных изме-нений в течение еще 5 месяцев хранения. При содержании препарата в условиях минус 40° С и минус 70° С не наблюдалось значимого снижения его активности в течение всего контрольного срока наблюдения (1 год).

Таким образом, препарат «Канцеролизин», приготовленный на основе мутантного аденовируса 5-го серотипа, успешно прошел доклинические испытания.

106

НОВООБРАЗОВАНИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ИНТЕРЛЕЙКИН-6 (ИЛ-6)

Вищипанова Н.Л., Ермилова В.Д., Блохин С.Н., Тагиева Т.Т., Лякина Л.Т.ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН,

г. Москва

Цель исследования – сравнительный анализ уровней ИЛ-6 в сыворотке крови практически здоровых женщин, больных раком (РМЖ) и доброка-чественными новообразованиями молочной железы (ДНМЖ).

Материал и методы. Концентрацию ИЛ-6 определяли в сыворотке кро-ви иммуноферментным методом реактивами фирмы «DSL» (США) у 50 больных РМЖ, 13 – ДНМЖ и у 15 здоровых женщин (группа контроля). ИЛ-6 определяли у всех пациенток до лечения. Рецепторы эстрогенов (РЭ) определяли в цитозольной фракции опухолей общепринятым радиолиган-дным методом, разработанным группой EORTC.

Результаты. Частота выявления ИЛ-6 в группе контроля составила 73%, у больных РМЖ и ДНМЖ - 100%. Уровни ИЛ-6 в группе конт-роля были более низкими, как по средним показателям, так и по ме-диане (1,56±0,23 пг/мл, медиана – 0,76), но достоверно не отличались от его значений при РМЖ (3,55±0,74 пг/мл, медиана – 2,17) и ДНПЖ (5,96±3,51 пг/мл, медиана – 2,70). Не выявлено зависимости между час-тотой обнаружения, уровнем ИЛ-6 и возрастом в контрольной группе. Анализ показателей ИЛ-6 в крови больных РМЖ в зависимости от воз-раста, показал отсутствие корреляционной связи между указанными па-раметрами. Однако при распространенном протоковом инфильтративном РМЖ выявлена отрицательная корреляционная связь между показателя-ми ИЛ-6 и возрастом больных. В группе больных ДНМЖ коэффициент корреляции между возрастом больных и уровнем ИЛ-6 составил r=–0,42, а анализ с учетом гистологического строения новообразования показал наличие отрицательной корреляционной связи в группе больных ДНМЖ (внутрипротоковая папиллома, фиброаденома) (r=–0,6) и при фиброзно-кистозной болезни (r=–0,5). Средние уровни ИЛ-6 были недостоверно выше при фиброаденомах и внутрипротоковых папилломах молочной железы – 7,69±5,05 пг/мл (1,78-48,08 пг/мл, медиана – 3,07), чем при фиброзно-кистозной болезни – 2,05±0,26 пг/мл (1,56-2,71 пг/мл, меди-ана – 1,97). У больных в постменопаузе уровни ИЛ-6 как при ДНМЖ, так и при РМЖ были ниже, чем у женщин в репродуктивном периоде. Корреляционный анализ показал отсутствие корреляционной связи между уровнями ИЛ-6 в сыворотке крови и РЭ в опухоли больных РМЖ.

Заключение. Обсуждается связь показателей ИЛ-6 в сыворотке крови больных РМЖ с клинико-морфологическими характеристиками заболе-вания и прогнозом.

107

БИОТЕХНОЛОГИЯ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ УГРОЗЫ

Волков В.Я., Кавызина Л.И., Кондрик Е.К.Государственный научный центр прикладной микробиологии, п. Оболенск,

Московская область

В связи с бурным развитием биотехнологии в последние три десяти-летия и выходом её на уровень важнейших научных, технических и эко-номических приоритетов XXI века в мире особенно остро обозначилась актуальная проблема предотвращения биологических угрооз и обеспече-ния биологической безопасности. По сути биобезопасность, под которой понимается защищенность человека и систем его жизнеобеспечения (животных, растений и окружающей среды) от возможного вредного воз-действия биологических объектов (природных и искусственно созданных или генетически модифицированных организмов), а также полученных из них продуктов и веществ различного назначения, является новым направ-лением науки, образования и национальной безопасности.

В современном мире биотехнология, являясь мощным фактором независимого развития государства, сохранения и улучшения здоровья населения и его жизнеобеспечения, одновременно становится одной из главных причин непреднамеренных и преднамеренных биологических уг-роз. Очень важно, чтобы польза от применения достижений современной биотехнологии превышала риск нанесения вреда человеку и окружающей природе не только сегодня, но и в отдалённой перспективе. Результаты современных биотехнологических разработок повышают опасность зара-жения людей, животных и растений патогенными микроорганизмами, а также преднамеренного повреждения технических устройств и сооружений, обработанных специально созданными биодеструкторами (бактериями, микроскопическими грибами). Наиболее вероятным проявлением таких биологических угроз является биотерроризм.

Новизна, сложность и масштабность разного рода задач, стоящих при решении проблем биологической безопасности, условно подразделяются на научно-технологические, медицинские, экологические, биополити-ческие и биоэтические, военные и юридические аспекты, конечная цель которых – создание государственной системы биологической безопасности Российской Федерации.

В работе проведен исторический анализ возникновения, развития и современного состояния рассматриваемой проблемы и осуществлён анализ биотехнологий в связи с биологическими угрозами.

108

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИШЕМИИ НИЖНИХ

КОНЕЧНОСТЕЙ

Гавриленко А.В., Тарантул В.З., Воронов Д.А., Гольдштейн Д.В., Народицкий Б.С., Фатхутдинов Т.А., Бочков Н.П.

Российский научный центр хирургии РАМН Институт молекулярной генетики РАН

НП Институт стволовой клетки и клеточных технологий

Одним из подходов к решению проблемы лечения хронической ишемии нижних конечностей являются генно-инженерные и клеточные технологии стимуляции ангиогенеза.

Цель работы – обоснование возможности использования генно-инже-нерных и клеточных технологий стимуляции ангиогенеза в комплексном лечении пациентов с хронической ишемией нижних конечностей и оценка предварительных клинических результатов

Созданы оригинальные самоэкспрессирующиеся генно-инженерные конструкции, содержащие ген ангиогенина. Испытания их биологической и ангиогенной активности проведены на куриных эмбрионах и моделях ишемии конечности крыс. В последующее клиническое исследование вош-ло 10 пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, в возрасте от 42 до 70 лет, с преимущественно «дистальными» формами поражения. Генно-инженерные комплексы вводились путем прямых внутримышечных инъекций в тибиальную группу мышц пораженной конечности. Эффектив-ность лечения оценивалась по клиническим критериям, а также с исполь-зованием биохимических, ультразвуковых и радиоизотопных методов.

Отдаленные результаты изучены у 8 пациентов в сроки от 6 до 22 ме-сяцев. У всех пациентов наблюдался положительный эффект: увеличение дистанции безболевой ходьбы, заживление имеющихся трофических де-фектов, увеличение лодыжечно-плечевого индекса давления, показателей транскутанного напряжения кислорода, а также увеличение перфузии мышц нижних конечностей. Сохранность конечностей в указанные сроки составила 100%.Побочных эффектов и признаков поражения внутренних органов за указанный период не выявлено.

Использование созданных генно-инженерных конструкций с геном ангиогенина улучшает результаты комплексного лечения больных с хронической ишемией нижних конечностей. Для оценки отдаленных эффектов методики необходимо продолжить наблюдения в течение более длительного периода.

Параллельно с указанным выше подходом, в клинике начаты работы по использованию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) для лечения

109

данной патологии. В настоящее время разработан развернутый клини-ческий протокол по использованию МСК у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей, предусматривающий внутриартериальное и внутримышечное введение аллогенных МСК у пациентов, преимущес-твенно со средними формами тяжести заболевания.

Предполагается, что использование генно-инженерных и клеточных технологий позволит значительно улучшить результаты лечения отдельных групп пациентов с хроническими ишемическими поражениями нижних конечностей.

МЕТОД ВИДОСПЕЦИФИЧНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОРТОПОКСВИРУСОВ, ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА,

НА ОСНОВЕ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Гаврилова Е.В., Щелкунов С.Н.ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор», Кольцово, Новосибирская область

Для выявления ортопоксвирусов в биологических образцах исполь-зуют морфологические, биологические, серологические и молекулярные методы. Разработанным нами молекулярным экспресс методом на основе мультиплексной полимеразной цепной реакции (МПЦР) можно опреде-лить наличие вирусной ДНК ортопоксвирусов в биологических образцах и дифференцирование таких патогенных для человека близкородственных видов, как вирус натуральной оспы, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров и вирус осповакцины (ВОВ). Диагностическую чувствительность теста оценивали на штамме ВОВ Л-ИВП и она составила 20 – 30 б.о.е. Спе-цифичность метода оценивали анализом 57 штаммов 6 различных видов ортопоксвирусов. Показана высокая диагностическая чувствительность и специфичность метода.

Работа поддержана ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритет-ным направлениям развития науки и техники» (проект БТ-КП.2/001).

110

ДВА ТИПА ОСМОРЕГУЛЯТОРНОГО ОТВЕТА НЕЙТРОФИЛОВ НА ГИПОТОНИЮ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

Галкин А.А., Демидова В.С., Карелин А.А.ГУ Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Москва

В данной работе мы изучали влияние бактериальной интоксикации на осморегуляцию нейтрофилов в гипотонической среде. В качестве модели бактериальной интоксикации мы выбрали пищевые токсикоинфекции вызванные сальмонеллами и сепсис у хирургических больных с гнойными ранами. В основу метода положен феномен изменения интенсивности рассеяния света адгезированными на стекле клетками в темном поле микроскопа при действии анизотонических растворов. Световой сигнал от монослоя нейтрофилов с микроскопа подавался на фотоумножитель, с него передавался на усилитель постоянного тока и далее на самописец.

Попадая в анизотонические условия клетки используют накопленную ионную асимметрию для выравнивания своего осмотического давления с внешней средой. При замене изотонического раствора Хенкса (300мосМ) на гипотонический раствор Хенкса (120 мосМ) нейтрофилы здоровых доноров в течение 7 – 8 минут набухают и принимают сферическую фор-му, интенсивность рассеянного клетками света возрастает, вслед за этим развивается фаза релаксации, длящаяся 25 – 30 минут, во время которой клетки выводят воду вместе с ионами К+ и соответствующими анионами, при этом светимость возвращается к исходному уровню.

Группу больных составляли пациенты 2-ой клинической инфекционной больницы г. Москвы с гастроинтестинальной формой сальмонеллеза на пике интоксикации в 1–2-е сутки от начала заболевания и пациенты 15 го-родской больницы с гнойными ранами и диагностированным сепсисом.

У больных, наряду с нормоподобными ответами, выявлены две патоло-гические формы реакции нейтрофилов на гипотонию, выражающиеся либо в полном отсутствии регуляторной фазы, либо в появлении трехфазной реакции изменения интенсивности светового сигнала. Обе формы осморе-гуляции всегда сопровождались угнетением подвижности нейтрофилов.

Полученные результаты дают основание предполагать существование, как минимум, двух патофизиологических механизмов действия бактери-альных токсинов на нейтрофилы, реализуемых через цитоскелет и ионные транспортеры.

111

РИСК РАСПРОСТРАНЕНИЯ ТРАНСМИССИВНЫХ ТРОПИЧЕСКИХ ЛИХОРАДОК В РОССИИ – НОВАЯ

БИОЛОГИЧЕСКАЯ УГРОЗА

Ганушкина Л.А., Маркович Н.Я., Рябова Т.Е., Юничева Ю.В., Сергиев В.П.ИМПиТМ им. Е.И.Марциновского ММА им. И.М.Сеченова

Сочинское противочумное отделениеГУ Причерноморская противочумная станция

Кафедра паразитологии, паразитарных и тропических болезней

Основная зона распространения желтой лихорадки и лихорадки де-нге – тропики. В прошлом эпидемии желтой лихорадки, сопровождавши-еся высокой летальностью, отмечались в Северной Америке (до 48° с.ш.) и Южной Европе (Испания, Франция, Италия). Исчезновение желтой лихорадки из стран умеренного климата было связано с целенаправленным уничтожением переносчика Ae. aegypti.

В 2001–2004 гг. в Центральном районе г. Сочи были выявлены самки комаров Aedes aegypti. Эти комары на Черноморском побережье Кавказа были обнаружены после продолжительного периода отсутствия. Новое появление Ae. aegypti может быть связано с завозом в порт г. Сочи или распространением с сопредельной территории Грузии, реальное положение в которой неизвестно.

В тропиках переносчиком желтой лихорадки и лихорадки денге помимо Ae. aegypti служат комары Ae.albopictus. Последний вид в настоящее время широко распространился по миру, завезен и укоренился в Северной Аме-рике и Европе. Эпидемическое значение Ae.albopictus, как переносчика тро-пических лихорадок идентично Ae. aegypti. Экология комаров Ae.albopictus близка к Ae. aegypti, но комары Ae.albopictus более холодоустойчивы, что увеличивает риск их укоренения на территории России. Состоялся ли уже завоз комаров Ae.albopictus в Россию не известно.

Появление Ae. aegypti на Черноморском побережье Кавказа и вероят-ность завоза Ae.albopictus, учитывая высокий эпидемический потенциал этих переносчиков, создает реальную угрозу распространения тропических лихорадок среди населения и отдыхающих в южных районах России в случае завоза возбудителей. Завозные случаи лихорадки денге в последние годы неоднократно выявлялись в странах Европы и России.

В связи с формированием новой биологической угрозы для России, необходимо проведение мониторинга за распространением комаров с иден-тификацией видов комаров и индикацией присутствия в них возбудителей болезней человека. Оптимальным для этих целей является применение молекулярно-диагностических методов.

112

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА РОССИЙСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Гвоздевский Н.А.1, Ажикина Т.Л.1, Ботвинник А.О.1, Евсюкова И.Ю.1, Фушан А.А.1, Шемякин И.Г.2, Свердлов Е.Д.1

1 – Институт Биоорганической Химии им академиков Шемякина и Овчинникова РАН, Москва, Россия

2 – ГНЦ Прикладной Микробиологии, Оболенск, Россия

Популяции микроорганизмов рода Mycobacterium характеризуются зна-чительной генетической вариабельностью. Цель нашей работы заключалась в идентификации геномных отличий между различными клиническими изолятами M. tuberculosis. Полученная информация может облегчить по-нимание биологических механизмов, обуславливающих функциональные отличия микобактерий, в том числе в вирулентности. Найденные геномные разницы могут также использоваться в качестве маркёров в генотипиро-вании и диагностике туберкулёза.

Полногеномное сравнение четырёх клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих на территории РФ, с лабораторным референс-штаммом H37Rv было проведено методом вычитающей гибридизации. Большинство найденных инсерций оказались характерными для всех российских изолятов. Исключение составили три гена, присутствующие только в геноме изолята 1540 и отсутствующие во всех остальных геномах. Эти гены вызывают осо-бый интерес в связи с тем, что изолят 1540 в лабораторном микробиологи-ческом тестировании на мышах проявляет повышенную вирулентность. Два гена из трёх кодируют мембранные белки, вероятно способные влиять на взаимодействие патогена с организмом хозяина и тем самым обуславливать усиление вирулентных свойств микобактерии.

Взяв за основу найденные нами геномные отличия изолятов М. tuberculosis, мы разработали новый диагностический подход, направленный на иденти-фикацию и генетическое типирование новых микобактериальных изолятов. Нами было проведено генотипирование более трёхсот клинических изолятов, циркулирующих на территории РФ, с целью изучения генетической струк-туры популяции. Было установлено, что вся популяция М. tuberculosis может быть поделена на группы с характерной комбинацией инсерций и делеций, затрагивающих локусы, найденные в результате вычитающей гибридизации. Продемонстрирована положительная корреляция результатов группирования с результатами других методов генотипирования, таких как сполиготипиро-вание и IS-RFLP-типирование. Таким образом, разработанный метод может использоваться для быстрой идентификации неизвестного микобактериаль-ного штамма и служить мощным дополнением к уже широко применяемым на практике подходам для изучения патогенной бактерии М. tuberculosis.

Работа поддержана грантами МНТЦ #22225/BTEP ID #38, N 2006.2003.4 (грант Президента РФ), РФ43.073.1.1.1509 (грант министерства промышленности, науки и технологий) и программой РАН «Физико-Химическая Биология».

113

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ НАНОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ РИФАМПИЦИНА НА

ОСНОВЕ ПОЛИМЕРОВ LACTEL®

Гельперина С.Э1,2., Шипуло Е.В.1, Ванчугова С.В.1, Максименко О.О.1,2, Будько А.П. 3

1 – Институт Молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова,2 – Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения3 – Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

В связи с угрожающим ростом заболеваемости туберкулезом актуальна задача повышения эффективности терапии данного заболевания. Одним из наиболее перспективных путей решения этой задачи, наряду с синтезом новых препаратов, может стать направленный транспорт лекарственных веществ в инфицированные органы/клетки с помощью систем доставки на основе наночастиц (НЧ).

Цель работы: 1) разработка методов получения наносомальных ле-карственных форм рифампицина (РИФ) на основе фармацевтических полимеров Lactel®; 2) исследование влияния состава НЧ на основе на кинетику высвобождения РИФ; 3) изучение биораспределения РИФ при в/в введении различных лекарственных форм.

Методы. НЧ с РИФ были получены методом эмульгирования под дав-лением с последующим удалением растворителя. В качестве полимерной основы НЧ были использованы сополимеры молочной и гликолевой кис-лот, в том числе – содержащие концевые карбоксильные группы: PLGA (75:25) и PLGA-COOH (50:50), в качестве стабилизатора – сывороточный альбумин либо поливиниловый спирт.

Кинетику высвобождения РИФ из НЧ оценивали по количеству свободного РИФ, выделившегося из НЧ в 25-ти кратный объем 0,1% аскорбиновой кислоты в PBS (pH 7,4; 37°С). Количество РИФ в образцах печени, селезенки, легких и крови мышей после их декапитации опреде-ляли методом ВЭЖХ.

Результаты. Показано, что использование полилактидов различной природы позволяет регулировать как степень включения РИФ в НЧ, так и профиль высвобождения РИФ из НЧ in vitro. Максимальное включе-ние и замедленное высвобождение РИФ достигается при использовании сополимера PLGA-COOH, что объясняется, по-видимому, более прочной связью РИФ с отрицательно заряженной полимерной матрицей. Изучение биораспределения показало, эта лекарственная форма также обеспечивает максимальное накопление РИФ в органах РЭС, которые являются очагами инфекции при туберкулезе.

Вывод: Применение НЧ обеспечивает оптимизацию биораспределения РИФ. Можно полагать, что эта лекарственная форма окажется более эф-фективной при лечении туберкулеза.

Работа выполнена при финансовой поддержке МНТЦ (проект № 2440)

114

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ТЕЛОМЕРАЗЫ В ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ

Глухов А.И.1, Ветшев П.С., Зимник О.В.2, Ипполитов Л.И., Жуликов Д.В.1 – Кафедра биохимии ММА им. И.М. Сеченова

2 – Московский НИИ медицинской экологии; Факультетская хирургическая клиника им. Н.Н. Бурденко

ММА им. И.М. Сеченова

Проблема дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований в эндокринной хирургии является в настоящее время достаточно актуальной. Частые затруднения при поста-новке точного диагноза по результатам морфологического исследования заставляет обратиться к другим методам, в частности, молекулярно-ге-нетическим. Одним из возможных онкомаркеров, которые могут быть использованы для исследования опухолей различных типов, является теломераза, обеспечивающая восстановление теломер хромосом и регули-рующая рост злокачественных клеток. Работы по изучению клинической ценности теломеразы как онкомаркера в опухолях эндокринных желез не-многочисленны, а результаты противоречивы. Целью нашей работы было исследование роли теломеразы в диагностике различных типов опухолей эндокринной системы. Нами было исследовано 12 клинических образцов тканей, среди которых: 4 опухолевых образования щитовидной железы (1 фолликулярный рак, 2 аденомы, 1 узловой аутоиммунный тиреоидит), 3 опухоли паращитовидных желез (3 аденомы), 5 опухолей надпочечников (2 аденомы коры надпочечников, 2 феохромоцитомы, 1 лимфосаркома). Все образцы были подвергнуты экстренному и плановому гистологичес-кому исследованию, а также исследованы методами TRAP (теломеразная активность, ТА) и обратной транскрипции и ПЦР (уровень экспрессии гена каталитической субъединицы теломеразы, hTERT). Данные экстрен-ного гистологического исследования совпадали с данными планового исследования, кроме случая фолликулярного рака, когда первично была диагностирована аденома. При молекулярном анализе ТА, а также вариан-ты экспрессии гена hTERT были обнаружены в образцах фолликулярного рака щитовидной железы, лимфосаркомы надпочечника, аутоиммунного тиреоидита (в случае которого ТА и экспрессия hTERT были обуслов-лены выраженной лимфоцитарной инфильтрацией ткани). В остальных образцах ТА и экспрессия hTERT отсутствовали, либо результаты носили неспецифический характер. Таким образом, полученные предварительные данные свидетельствуют о возможной ценности указанных методов при дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных опухолей эндокринной системы, включая сомнительные результаты гис-тологического исследования.

115

ОЦЕНКА ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КАЛИЯ В КЛОНОГЕННЫХ НЕЙРОСФЕРАХ ЧЕЛОВЕКА

Гольдштейн Д.В. 1,3, Ржанинова А.А.1, Погорелов А.Г.2

1 – НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий», г. Москва2 – ГУ Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,

г. Пущино3 – ЗАО «Реметэкс»

Введение. Внутриклеточная концентрация калия и натрия является результатом интегративной работы активного и пассивного транспорта. Изменение Na/K соотношения является показателем модификации со-стояния клетки.

Показано, что нейросферы не однородны по ультраструктурному строе-нию. Клетки, входящие в состав клона, не синхронизированы в развитии и демонстрируют все фазы клеточного цикла, митоз и апоптоз в зависимости от их пространственного расположения в нейросфере.

Цель работы. Определить содержание и распределение калия и натрия в клоногенных неиросферах.

Материалы и методы. Культуру нейральных стволовых клеток (ней-росфер) получали из абортивного материала по стандартной методике. Посредством электронно-зондового микроанализа на срезах лиофилизи-рованных и залитых в смолу нейросфер измеряли концентрацию калия и натрия в их структуре.

Результаты. Методом электронно-зондового микроанализа определе-на средняя концентрации калия и натрия для клоногенной нейросферы человека. Средняя концентрация элементов в нейросфере соответствует величине: 130±30 мМ для калия; и 100±10 мМ для натрия. Следует отме-тить высокую концентрацию натрия, что характерно для недифференци-рованной клетки. Показано, что калий в исследуемой структуре распре-делен неоднородно. Это наблюдение подтверждает литературные данные о гетерогенном морфологическом строении нейросфер.

Заключение. Электронно-зондовый микроанализ может быть предложен как эффективный метод оценки физиологического состояния клоногенных нейротрансплантатов по критерию концентраций основных цитоплазма-тических электролитов.

116

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ, СТАБИЛЬНО НЕСУЩИХ

ГЕН ЗЕЛЕНОГО БЕЛКА

Горностаева С.Н, Ржанинова А.А, Гольдшнейн Д.В.НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий», Москва

Неограниченные способности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) к дифференцировке в различные клеточные линии и значительный пролиферативный ресурс делают клетки этого типа чрезвычайно перспек-тивными для клеточной и, в том числе, генной терапии.

МСК, первоначально полученные из костного мозга, затем были описаны и для других источников, в том числе для печени эмбрионов. Получение стабильной трансфекции МСК без использования вирусных систем, делающее возможным клиническое применение трансгенных клеток, описано только для культур из костного мозгa.

Цель настоящей работы — отработка режимов электропорации и пос-ледующей и

селекции, оценка пролиферативной активности и фенотипа трансфе-цированных культур МСК из печени эмбриона человека.

Культуры МСК выделяли из эмбриональной печени (8-9 недель гес-тации) по протоколу, описанному для выделения колониеобразующих МСК из стромы костного мозга. Для трансфекции использовали плазмиду EGFP, несущую ген зеленого белка и ген неомицин фосфотрансферазы (neo(r)). Электропорацию 106 клеток с 10 мкг плазмидной ДНК проводили на приборе «Gene Pulser Xcell» (Bio-Rad). Для отбора трансфецированных клеток культуры инкубировали в стандартной ростовой среде с добавкой 300 мкг/мл G-418 до полной гибели контроля.

После электропорации при 160 V и 25 msec количество клеток, транзи-ентно экспрессирующих EGFP достигало 50-60%. Через 14 дней селекции с G-418 получена культура активно пролиферирующих клеток со стабильно интегрированной плазмидой.

Цитофлюориметрический анализ полученных культур показал, что доля клеток, экспрессирующих зеленый белок, составляла не менее 80%.

МСК из печени, стабильно трансфецированые плазмидной ДНК, ак-тивно пролиферировали, поддерживали свою способность к образованию колоний и недифференцированный фенотип.

117

ВОПРОСЫ ЭКСПЕРТИЗЫ БЕЗОПАСНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Гуськова Т.А.Институт биоорганической химии им. Акад. М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова (ИБХ) РАН, г.Москва

Экспертиза безопасности лекарственного средства является важнейшим элементом при решении вопроса о возможности проведения его клиничес-кого изучения или применения в медицинской практике. От тщательности проведения этой экспертизы зависит степень проявления нежелательных, в том числе токсических, эффектов при назначении препарата человеку. Практически каждое лекарственное средство представляет собой вещес-тво с высокой биологической активностью и способно в определенных дозах оказывать токсическое действие на организм. Поэтому фармако-логическая безопасность лекарственного средства определяется соотно-шением его эффективности и токсичности. При экспертизе материалов по оценке различных видов токсичности очень важно оценить не только объем исследований, определенный соответствующими документами, но и дозы препарата, вызывающие те или иные изменения в состоянии го-меостаза экспериментальных животных, характер выявленной патологии и степень ее обратимости. Затем необходимо сравнить величину этих доз с дозировками, указанными в протоколе клинического изучения или в инструкции для медицинского применения. На основании формулы оп-ределить расчетный курс безопасности применения препарата в клинике. Далее необходимо провести экспертизу протокола клинического изучения препарата с точки зрения безопасности лекарства, впервые назначаемого человеку. В протоколах клинических испытаний должны быть учтены показатели токсичности, установленные в доклинических исследованиях на животных в зависимости от фазы клинических испытаний. В прото-коле I-ой фазы клинических испытаний, проводящейся, как правило, на волонтерах должны быть использованы дозы препарата, обеспечивающие безопасность человека по данным изучения токсичности на животных. В протоколе II-ой фазы клинических испытаний должны быть отражены все токсические эффекты, выявленные у животных. Предусмотрена оценка функционального состояния всех органов и систем, в которых были от-мечены эти эффекты. Ограничено включение в исследование пациентов с патологией этих органов и систем, а в случае необходимости применения препарата у таких пациентов внимание врача должно быть обращено на возможность проявления соответствующих нежелательных эффектов и предложены методы борьбы с ними. В протоколе III-ей фазы клинических испытаний, кроме того, должны быть отражены нежелательные эффекты, выявленные при более ранних стадиях изучения.

118

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ КАК НЕОТЪЕМЛЕМАЯ ЧАСТЬ БИОЛОГИЧЕСКОЙ

БЕЗОПАСНОСТИ

Гуськова Т.А.Институт биоорганической химии им. Акад. М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова (ИБХ) РАН, Москва

Фармакологическая безопасность стала неотъемлемой частью биобезо-пасности. В результате успехов, достигнутых в развитии химии, биологии, молекулярной медицины и других смежных областях науки и техники, ежегодно в медицинскую практику внедряется огромное количество ле-карственных средств. По данным Федеральной Службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития в России в 2004 году было заре-гистрировано для медицинского применения более 12 тысяч лекарственных средств. Наряду с успехами в лечении различных заболеваний отмечается рост нежелательных, а часто токсических эффектов при использовании лекарственных средств. Так по данным литературы, в США вследствие развития нежелательных побочных реакций ежегодно госпитализируется от 3,5 до 8,8 млн. больных, и 100 – 200 тысяч больных погибает от осложне-ний, связанных с применением лекарств. Не лучше положение и в других странах. Например, расходы, связанные с госпитализацией пациентов, у которых возникли побочные реакции на лекарства, в Германии составляют 588 млн. долларов в год. К сожалению, в России подобные публикации отсутствуют. Основными причинами проявления токсических эффектов лекарственных средств являются острые отравления (умышленные и слу-чайные), неправильное применение препаратов, связанное со сходными названиями или внешним видом. Большое количество синонимов в на-звании одного и того же лекарственного средства приводит к тому, что пациент принимает один и тот же препарат в значительно завышенной дозе. Бесконтрольное использование препаратов, отпускаемых без рецеп-та, значительно повышает риск развития нежелательных явлений, вплоть до развития патологии, приводящей пациента к инвалидности. Большую проблему в отношении фармакологической безопасности составляет од-новременный прием нескольких лекарственных препаратов, поскольку токсикологическая совместимость их практически не изучается. Фикси-рованные комбинации действующих препаратов в одной лекарственной форме требуют тщательного токсикологического исследования перед назначением больному. Фармакологическая безопасность лекарственных средств, полученных с помощью биотехнологии, генной инженерии и других современных методов, нередко требует специальной оценки на стадии доклинических исследований, методологию которой необходимо разрабатывать.

119

ЭКСПРЕССИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРОГНОЗА И МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ ПРИ

РАКЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ

Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А.ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Развитие большинства злокачественных новообразований человека сопровождается нарушением нормальной экспрессии и функционирова-ния целого ряда молекулярных маркеров, определяющих биологическое поведение опухоли, в том числе такие основные проявления опухолевой прогрессии как инвазия и метастазирование.

Цель исследования – изучение особенностей экспрессии белковых марке-ров, влияющих на развитие отдаленных метастазов рака толстой кишки.

Материал и методы. Исследование выполнено иммуногистохимическим методом на парафиновых срезах ткани первичных опухолей (n=129) и мета-стазов в печени (n=92) с использованием антител к Е-кадхерину, b-катенину, CD44v6, nm 23 и c-erbB-2. Результаты. Экспрессия исследованных белковых маркеров наблюдалась на мембранах и/или в цитоплазме раковых клеток как первичных опухолей, так и части метастазов в печени. Снижение уровня Е-кадхерина, утрату поверхностной экспрессии или полное отсутствие белка выявляли чаще у больных раком толстой кишки при наличии отдаленных метастазов (64/84, 76%) и значительно реже – в контрольной группе па-циентов (14/45, 31%) (р=0,014). Экспрессия b-катенина характеризовалась не только мембранно-цитоплазматической, но и ядерной локализацией иммунореактивности и была достоверно выше у больных с метастазами в печени (70/84, 83%), чем без последних (15/45, 33%) (р=0,01). Кроме того, отмечалось увеличение частоты выявления и уровня экспрессии белков nm 23 и c-erbB-2 в опухолях, сопровождающихся развитием метастазов (р=0,023 и р=0,012 соответственно). Достоверной взаимосвязи экспрессии молекул CD44v6 в клетках рака толстой кишки с наличием или отсутствием у больных отдаленных метастазов обнаружено не было. Закономерности экспрессии бел-ковых маркеров, свойственные первичным опухолям, сохранялись в клетках метастазов в печени. Таким образом, в процессе развития отдаленных мета-стазов рака толстой кишки отмечается с одной стороны редукция экспрессии Е-кадхерина в клетках опухоли, с другой стороны аккумуляция b-катенина в цитоплазме раковых клеток и транслокация белка в ядро, а также увеличение уровня экспрессии белков nm 23 и c-erbB-2. Эти изменения являются фак-торами неблагоприятного прогноза при раке толстой кишки.

Заключение. Особенности экспрессии исследованных белковых маркеров могут служить дополнительными критериями злокачественности при оценке прогноза заболевания и необходимости назначения адъювантного лечения.

120

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРА РОСТА ГЕПАТОЦИТОВ НА ПЛАЗМАМЕМБРАННЫЙ СИНТЕЗ АТФ В КЛЕТКАХ

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ЛЁГКИХ ЧЕЛОВЕКА

Демидова В.С., Карелин А.А., Агибалова У.А., Куницын А.Г.1

ГУ Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Москва1 – Областная онкологическая больница, Балашиха, Московская обл.

Клетки рака легкого метастазируют на клинически ранних стадиях заболевания, поэтому углубление знаний о биологии опухолей является актуальным. Фактор роста гепатоцитов (HGF/SF), он же фактор метаста-зирования (Scatter Factor) – относится к полипептидным факторам роста, рецептор которого представляет собой Met-белок – продукт экспрессии гена met. При раке легкого отмечается гиперэкспрессия и амплификация гена met, что приводит к избыточной продукции белка Met, обладающего тирозинкиназной активностью.

Ранее (1979 г.) А.А. Карелин выдвинул и экспериментально подтвердил идею о том, что клетки отвечают на непосредственное взаимодействие полипептидных регуляторных молекул со своими специфическими рецеп-торами на плазматической мембране образованием АТФ, необходимым для развития дальнейших биохимических преобразований. Синтез АТФ наблюдали, когда изолированные из клеток-мишеней обогащённые плаз-матическими мембранами частицы (ОПМЧ) помещали в инкубационную среду, содержащую все компоненты аэробного фосфорилирования, и обра-батывали соответствующим фактором роста. Этот феномен мы наблюдали в целом ряде как нормальных, так и опухолевых клеток-мишеней. Однако до настоящего времени не было изучено влияние HGF/SF на плазмамем-бранный синтез АТФ.

Цель работы: Изучить влияние HGF/SF на плазмамембранный синтез АТФ в гистологически неизменённых тканях и в злокачественных ново-образованиях лёгких человека.

В работе использовали ОПМЧ, изолированные из клеток тканей легких, удаленных во время операции у пациентов с новообразованиями. Биопта-ты брали из зоны опухолевого роста и из гистологически неизмененных тканей. Количество АТФ определяли люциферин-люциферазным методом с использованием люминомера ЛБ-3ПАИ и програмно-аппаратного ком-плекса «КЛИМБИ» (Россия). Показано, что в результате взаимодействия HGF/SF со своим специфическим рецептором на поверхности плазмати-ческих мембран клеток легких человека синтезируется короткоживущая молекула АТФ, которая необходима для активации рецепторной тирозин-киназы при передаче регуляторного сигнала внутрь клетки. Этот процесс

121

происходит как в нормальных, так и в опухолевых клетках. Однако в опухолевых клетках синтез сигнального АТФ протекает значительно ак-тивнее (в три и более раза), т.к. опухолевые клетки используют HGF/SF для активации мотогенеза, основного процесса, в результате которого происходит метастазирование опухолей.

Вывод: для обеспечения фазы трансдукции регуляторного сигнала от HGF/SF внутрь клетки на плазматической мембране синтезируется мо-лекула посредник – сигнальный АТФ.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ ДОФАМИНОВОЙ И СЕРОТОНИНОВОЙ СИСТЕМ С ЛИЧНОСТНЫМИ ОСОБЕННОСТЯМИ ПОДРОСТКОВ

Демин А.А.1, Сотникова Е.Н.2, Аксенова М.Г.1

1 – Институт Экологии Человека и Гигиены Окружающей Среды им. А. Н. Сысина лаб. молекулярно-генетической диагностики

2 – Центр образования «Лукоморье» №1998

Актуальность проблемы психического здоровья детей и подростков, приводит к поиску новых комплексных решений в диагностики психо-логических отклонений, обуславливающих развитие социально значимых заболеваний. Одним из таких решений может стать молекулярно-генети-ческий метод диагностики.

Целью данного исследования является изучение полиморфизма генов нейротрансмитеров (серотонина и дофамина) с целью создания панели генетических маркеров при организации скрининга психолого-медицинс-ких аспектов здоровья подростков, что поможет в своевременном предуп-реждении социально обусловленных заболеваний (ранняя алкоголизация, наркомании), отклонение в поведении среди обучающихся.

В качестве кандидатных для изучения были выбраны полиморфные локус генов: DRD2 Taq1A, DAT 3’-UTR VNTR, DBH Taq1A 1021C>T, 5-HTR2A -1438A>G, 5-HT2C 1989G>C, 5HTTPLR VNTR. Темперамен-тно-личностные особенности оценивались с помощью теста-опросника Кеттела у подростков 8 – 10 классов.

По результатам исследования, проведенного на выборке из восьмидеся-ти учеников по генам DRD2 и DBH было установлено: DRD2 TaqI – час-тоты аллелей A1 – 43% A2 – 57%; усредненные профили для двух подгрупп учащихся (A1/A1+A1/A2) и (A2/A2) статистически достоверно различаются по фактору О («тревожность»). DBH TaqI - частоты генотипов гена А1/А1 – 18%, А1/А2 – 14%, А2/А2 – 58%; по факторам «А» (общительность), «В»(абстрактность мышления), «Q3»(самостоятельность) усредненные

122

профили двух подгрупп (A2/A2+A1/A2 и A1/A1) значимо различаются, отличия подгрупп по фактору «G» (социальная нормативность поведе-ния) имеют не только значимый количественный, но и качественный характер.

Результаты исследования двух генов дофаминовой системы в связи с лич-ностными особенностями учащихся 8 и 9 классов позволили выявить ассоци-ацию таких черт, как тревожность, общительность, нормативность поведения и некоторые особенности мышления с полиморфизмом генов рецептора дофамина второго типа (DRD2) и β-гидроксилазы дофамина (DBH).

ИЗМЕНЕНИЯ КОНФОРМАЦИИ g-ГЛОБУЛИНА В ПРИСУТСТВИИ КАТИОНОВ ЦИНКА

Денисова Е.А., Бабаева Е.Е., Медведева Д.А., Чекнев С.Б.НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Введение. Активное вовлечение цинка в обеспечение биологических и иммунных реакций, с учетом крайне низкого содержания свободных катионов в плазме, позволяет предполагать, что взаимодействие метал-ла с белками сыворотки может создавать ощутимый дефицит цинка в примембранном пространстве и изменять спектр клеточных реакций в локальном окружении.

Целью исследования являлось изучение конформационных изменений при взаимодействии человеческого сывороточного g-глобулина с катио-нами цинка и оценка способности белка связывать металл в условиях, приближенных к физиологическим.

Материалы и методы. Приготовленный на 0.15 М растворе NaCl пре-парат g-глобулина (Serva) инкубировали с хлоридом или сульфатом цинка (концентрации металла от 0,1 до 12,0 мкг/мл) в течение 1 час при 37° С. Связывание цинка с g-глобулином оценивали молекулярной ультрафиль-трацией на конусах CF-25 (Amicon) с определением количества свободного цинка в фильтрате по реакции с о-фенантролином. Для оценки конфор-мационных изменений g-глобулина использовали спектрофотометрию в ультрафиолете – применяли сканирующий спектрофотометр PU 8730 UV/VIS (Philips).

Результаты. Установлено, что содержание цинка, как и меди, в рас-творе определяет возможность развертывания молекулы g-глобулина во внемолекулярное пространство, за счет взаимодействия металла с боко-выми аминокислотными остатками, либо – компактизации глобулы, за счет встраивания катионов в сайты междоменной области. Оба эффекта обнаруживают насыщаемость белка металлом. При этом похоже, что цинк,

123

в отличие от меди, обладает сродством к внутренним компартментам молекулы белка, связывание металла которыми, по-видимому, способс-твует стабилизации остатков аминокислот с сульфгидрильными группами. Заполнение внешних и внутренних связей g-глобулина катионами цинка, как и в опытах с медью, происходит последовательно.

Заключение. Результаты работы свидетельствуют о наличии у молекулы g-глобулина внешних и внутренних сайтов связывания цинка, возмож-ности хелатирования металла в междоменную область и происходящей в этих условиях компактизации глобулы с формированием конформации, удерживающей катионы. Такое связывание металла существенно скажется на активности клеток, функции которых зависят от наличия в микроок-ружении катионов цинка.

АНТИАНГИОГЕННАЯ ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОТЕХНОЛОГИЙ

Дигтярь А.В.1, Луценко Е.В.2, Фельдман Н.Б.1, Кеселев С.М.1, Грицкова И.А.2, Луценко С.В.1, Северин С.Е.1

1 – Московский НИИ медицинской экологии 2 – Московская государственная академия тонкой химической технологии

им. М.В. Ломоносова, Москва

Антиангиогенная терапия злокачественных новообразований направ-лена на разрушение инфильтрирующей солидные опухоли кровеносной сети, что ведёт к деградации опухоли из-за недостатка оксигенации и нутриентов. Исследования последнего десятилетия показали, что наиболее перспективными эндогенными антиангиогенными соединениями являются белки ангиостатин (38 – 40 кДа) и эндостатин (20 кДа). Парентеральное введение этих белков мышам, имеющим различные солидные опухоли, в том числе человеческие, приводит к частичному или полному прекраще-нию опухолевого роста.

Цель работы: изучить возможность применения наночастиц ангиос-татина и эндостатина на основе поливинилпирролидона в качестве про-тивоопухолевых препаратов и сравнить эффективность антиангиогенной терапии с использованием нанопрепаратов и несвязанных форм белков.

Материалы и методы: ангиостатин получали из плазминогена человека путём его ограниченного протеолиза эластазой свиньи. Эндостатин полу-чали генно-инженерными методами, используя экспрессионный вектор, содержащий ген эндостатина человека, и штамм E. coli. Гомогенные пре-параты белков инкорпорировали в полимерный матрикс поливинилпирро-лидона. Полученные наноформы исследовали на наличие цитотоксической

124

активности (ЦТА) по отношению к клеточной линии нормального эндо-телия SVEC4-10 и противоопухолевого эффекта по отношению к мышам с привитой меланомой B16.

Результаты: ЦТА in vitro наноформы ангиостатина (IC50 = 1,4 мкМ) значительно превышала активность свободного белка (IC50 = 8,5 мкМ); разница между ЦТА свободной и наноформами эндостатина была не-значительна (IC50 = 0,78 и 0,67 мкМ, соответственно). При лечении мышей со злокачественными опухолями наноформа ангиостатина имела более выраженное терапевтическое действие по сравнению со свободным белком. В то же время терапевтический эффект свободной и наноформы эндостатина практически не различался (торможение роста опухоли в обеих группах одинаково).

Заключение: полученные данные показывают, что инкапсулирование антиангиогенных белков в полимерную матрицу не только не приводит к снижению биологической эффективности препаратов, но в случае ангиостатина и потенцирует её. Этот феномен может объясняться изме-нениями в лиганд-рецепторном взаимодействии ангиостатина со своими мембранными рецепторами на эндотелиоцитах. Следовательно, можно говорить о принципиально новой возможности повышения избиратель-ности, эффективности и безопасности действия ангиостатина и эндос-татина путём использования наночастиц на основе самых различных полимеров. Наноформы препаратов могут преодолевать физиологические барьеры, обеспечивать направленный транспорт терапевтических агентов к определённым клеткам или органеллам и пролонгировать их действие. Кроме того, наночастицы, содержащие противоопухолевые агенты, при внутривенном введении будут аккумулироваться клетками Купфера, что имеет важное значение в поиске терапевтических агентов в химиотерапии метастазов в печени.

125

ОБЕСПЕЧЕНИЕ БЕЗОПАСНОСТИ РАБОТ С ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ

В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Доброхотский Н.1, Борзенкова Т.Х.1, Губин С.В.2

1 – ПЧС в МСЧ № 164 ФМБА, Оболенск2 – Головной Центр СЭН ФМБА, Москва

Одним из актуальных разделов обеспечения национальной биологичес-кой безопасности является работа по предотвращению внутрилаборатор-ных заражений и попадания патогенных микроорганизмов в окружающую среду.

Большое значение для снижения биологической угрозы является фор-мирование нормативно-правовой базы.

Существующая база нормативных документов регламентирует требова-ния, обеспечивающие безопасность работ с микроорганизмами.

Обязательные требования при работе с патогенными биологическими агентами в лаборатории изложены в санитарных правилах:

n «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроор-ганизмов I - IV групп патогенности»

n «Безопасность работы с микроорганизмами I – II групп патогенности (опасности)»

n «Безопасность работы с микроорганизмами Ш – IV групп патоген-ности и гельминтами».

В данных документах изложены требования к организационным, сани-тарно-противоэпидемическим, профилактическим мероприятиям, направ-ленным на обеспечение личной и общественной безопасности и защиту окружающей среды при работе с патогенными микроорганизмами.

Необходимо отметить, что при медицинском обеспечении безопаснос-ти работ с патогенными микроорганизмами существует ряд нерешенных вопросов. В документах регламентирующих проведение медицинских осмотров не учитывается, что персонал, работающий с возбудителями инфекционных заболеваний, подлежит регулярной иммунизации. Не предусмотрен индивидуальный подход при решении вопроса о сроках и показаниях к ревакцинации. Не изучается влияние многократных вакци-наций на иммунный статус. Не установлены стандарты диагностических и профилактических мероприятий по каждой нозологической форме за-болеваний при выявлении больного или подозрительного на заболевание особо опасными инфекциями и контактных с ними.

Важную роль в обеспечении безопасности при работах с микроорга-низмами играет Государственный санитарно-эпидемиологический надзор Российской Федерации.

126

Госсанэпиднадзор выполняет свои функции в виде текущего и предуп-редительного санитарного надзора.

Выводы.1. В Российской Федерации создана государственная система обес-

печения биологической безопасности, основными элементами которой являются:

Нормативная база.Контролирующие органы.2. Ведущим звеном системы биологической безопасности является Гос-

санэпиднадзор, который играет основную роль в обеспечении безопасных условий труда при работе с микроорганизмами и в охране окружающей среды.

3. Необходимо разработать стандарты по диспансеризации персонала, работающего с патогенными биологическими агентами, и стандарты диа-гностических и профилактических мероприятий при выявлении больных особо опасными инфекциями и контактных с ними.

127

ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ НАРУШЕНИЕМ СИСТЕМЫ ПРОТЕИНА С

Егорова В.В., Амирасланов Ю.А., Аскеров Н.Г., Земляной А.Б.Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, г. Москва

Противосвёртывающая система протеина С синтезируется при участии витамина К в гепатоцитах и инактивирует тромбин на уровне эндотели-альных клеток (Esmon C.T. et al,1983; 1991). Сниженный уровень естест-венного антикоагулянта протеина С и компонентов его системы является фактором повышенного риска возникновения тромбозов (Miletich J.P., 1987; Pabinger J. et al, 1994). Наследственная форма дефицита протеина С выявляется как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии. Гомо-зиготные мутации обуславливают более ранее фенотипическое проявление заболевания. Гомозиготная недостаточность протеина С приводит к раз-витию фульминантной пурпуры у детей, которые погибают от тромбозов в первые дни жизни или внутриутробно (Marciniak E.et al, 1985).

Наличие гетерозиготных мутаций чаще обнаруживается в зрелом воз-расте, при этом дефицит содержания протеина С составляет 50% нормы (Mannuchi P.M. et al, 1990; Aiach M. et al, 1997).

Молекулярной основой для врождённого дефицита протеина С и проте-ина S является большая гетерогенность генов этих белков с широким спек-тром мутаций, имеющим различную пенетрантность и аллельные формы.

Некоторые варианты гетерозиготных мутаций системы протеина С являются фактором риска венозных тромбозов (Dahlbuch B., 1997). Пред-полагается, что наличие данной тромбофилии повышает риск венозных тромбозов в 10 раз.

Описана специфическая мутация в гене V-фактора (т.н. фактор V Лейдена), заключающаяся в замене аденина на гуанин в нуклеотидной позиции 1697. Это приводит к замене аминокислоты аргенина на глутамин в позиции 506 молекулы фактора V. Её следствием является уменьшение чувствительности фактора V к действию протеина С или «резистентность к протеину С». В европейской популяции мутация достигает по разным данным от 2 до 7% (Dahlbuch B., 1997).

В проведённых нами исследованиях у больных с гнойно-некроти-ческими формами диабетической стопы мы также встретились с данной патологией. У 65 обследованных больных эта патология проявилась в 6 слу-чаях, т.е. у 9,2% был положительный тест по определению резистентности фактора V к активированному протеину С. В исследовании использованы реактивы для оценки суммарной активности протеина С, разработанные в Гематологическом Научном Центре РАМН в НПО «РЕНАМ».

Вышесказанное свидетельствует о том, что мутация генов системы протеина С является одним из патогенетических факторов риска развития тромбозов в молодом возрасте и представляет собой перспективное направ-ление в диагностике и профилактике социально значимых заболеваний.

128

ОБРАТИМОСТЬ ИЗМЕНЕНИЙ НИЖНИХ МОЧЕВЫХ ПУТЕЙ У БОЛЬНЫХ ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ПОЧКИ

Еникеев М.Э., Григорян В.А., Кабак М.М., Чалый М.Е. Урол. клиника (дир.– член. корр РАМН, проф. Ю.Г. Аляев)

ММА им. И.М. Сеченова Отдел пересадки почки (зав.– д. м. н. М.М. Каабак) НЦХ РАМН

Актуальность. Нижние мочевые пути больных терминальной стадией ХПН претерпевают значительные изменения в результате длительной олиго-анурии и хронической уремии (Н.А. Лопаткин, 1988; Д.В. Перлин, 1994; X. Martin, 1999). В то же время, по мнению E.A. Tanagho (1974) и J.H. Ross (1994), несмотря на возникшие дистрофические изменения в стенке мочевого пузыря, последний восстанавливает свою функцию в скором времени после успешной трансплантации почки.

Материалы и методы. Обследовано 36 больных терминальной стадией ХПН в возрасте от 8 до 65 лет, подвергшихся пересадке почки. Длитель-ность олиго-анурии составила от месяца до 4 лет.

Результаты обследования. У обследованных больных при цистометрии были выявлены нарушения функции, протекающие преимущественно по гиперрефлекторному типу (нестабильность детрузора и выраженная гиперрефлексия мочевого пузыря); объем мочевого пузыря не превышал 100 –150 мл. При трансректальной везикодопплерографии установлено резкое снижение кровотока в области шейки и дна мочевого пузыря. Ар-териальные сосуды регистрировались фракционно, в связи с чем измерить спектральные характеристики кровотока технически не представлялось возможным. При морфологическом исследовании биоптатов стенки моче-вого пузыря, полученных во время пересадки почки, преобладали грубые атрофические изменения; у 27% пациентов отмечен липоматоз стромы.

После трансплантации почки функциональные показатели нижних мочевых путей, как правило, нормализовывались к 20 – 40 суткам: объем мочевого пузыря увеличивался до 200 – 250 мл; средняя скорость мочеис-пускания достигала 13 –15 мл. в сек. без остаточной мочи. Трансректальная везикодопплерография на 17 –25 сутки выявляла относительно равномерное распределение кровотока с возможностью его спектральной регистрации.

Заключение. Изменения нижних мочевых путей, возникающие у боль-ных с олиго-анурией на фоне терминальной ХПН, имеют тенденцию к быстрой регрессии после нормализации диуреза и восстановления самостоятельного мочеиспускания, что свидетельствует о значительных компенсаторных возможностях мочевого пузыря и уретры.

129

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕКАРСТВ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО ФЛУОРОИМММУНОАНАЛИЗА

Еремин С.А.Кафедра химической энзимологии, Химического факультета

МГУ им. М.В.Ломоносова

В аналитической химии биологически-активных веществ нашли широкое применение методы иммуноанализа, в основе которых лежит высокоспецифическая реакция антиген-антитело. В настоящее время иммунохимические методы доминируют при определении гормонов, наркотиков и лекарств. Основным направлением в совершенствовании методов иммуноанализа являются: 1) сокращение стадий анализа; 2) со-кращение времени проведения всех стадий определений; 3) уменьшение объема пробы образца и реагентов; 4) автоматизация проведения анализа; 5) удешевление всего метода.

Первоначальный скрининговый метод или мониторинг лекарств в молекулярной диагностике должен быть технически простым, недорогим и пригодным для рутинных анализов большого числа образцов. Этим требованиям в наилучшей степени отвечает метод поляризационного флуо-роиммуноанализа (ПФИА). Метод ПФИА основан на увеличении степени поляризации флуоресценции небольшой молекулы флуоресцеин-меченно-го антигена (трейсер) при его связывании со специфическими антителами. Если в исследуемом образце содержится немеченое соединение, то оно будет конкурировать за связывание с трейсером и сигнал поляризации флуоресценции будет уменьшаться. Для проведения анализа по методу ПФИА не требуются стадии разделения и промывки, в отличие от им-муноферментных методов анализа. Общее время определения вещества в одном или 20 образцах составляет 5 или 20 минут, соответственно.

Нами были синтезированы иммунореагенты и разработаны методики проведения ПФИА с использованием поликлональных и моноклональных антител для определения наркотиков (метамфетамин, эфедрин, фенобар-битал, амобарбитал), лекарств (гентамицина, хлорамфеникола, сульфа-метазина, сульфадиазина, салициловой кислоты, парацетамола) и других биологически-активных соединений. В докладе будут приведены данные по влиянию структуры используемых иммунореагентов на чувствительность и специфичность определения лекарств. Будут обсуждены возможные пути сотрудничества по применению методик ПФИА для молекулярной диагностики лекарств.

130

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНВАЗИИ КАК ОСНОВА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ

ПОДХОДОВ К АДРЕСНОЙ ДОСТАВКЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Ермолаева С.А.ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

Грам-положительная бактерия Listeria monocytogenes характеризуется способностью проникать внутрь и размножаться как в профессиональных, так и непрофессиональных фагоцитах. После завершения фагоцитоза L. monocytogenes разрушает фагосому и выходит в цитоплазму. В цитоплазме клеток-хозяев листерия функционально активна и секретирует белки, обес-печивающие ее внутриклеточное размножение. Эта способность листерий может быть использована для доставки рекомбинантных антигенов в цитоп-лазму антигенпрезентирующих клеток с целью получения Th1 иммунного ответа. В работах нашей лаборатории были исследованы условия, позволя-ющие добиться максимальной экспрессии рекомбинантных антигенов.

L.monocytogenes способна индуцировать собственный фагоцитоз раз-личными типами непрофессиональных фагоцитов, к которым относятся эпителиальные и эндотелиальные клетки, гепатоциты и спленоциты. Индукция фагоцитоза достигается благодаря взаимодействию ряда бак-териальных белков с клеточными рецепторами. Поверхностный белок интерналин индуцирует фагоцитоз листерий эпителиальными клетками, обладающими участвующим в межклеточной адгезии гликопротеином Е-кадгерином. Делеция гена, кодирующего интерналин, уменьшает инвазив-ность штамма листерий в такие клетки более чем в 80 раз. Однако наличие интерналина не обеспечивает инвазию в те клетки, которые не обладают Е-кадгерином. Так, интерналин индуцирует фагоцитоз латексных частиц в клетки, обладающие Е-кадгерином, но не N-кадгерином.

Другой поверхностный белок листерий, InlB, специфически взаимодейс-твует с рецептором фактора роста гепатоцитов Met. Рецептор Met находит-ся на поверхности гепатоцитов, а также широкого ряда эпителиальных и эндотелиальных клеток. Взаимодействие InlB с Met активирует Ras-MAP сигнальный каскад и PI-3 киназу, что приводит к локальным перестройкам цитоскелета и фагоцитозу бактерии или латексной частицы, на поверхнос-ти которой закреплен белок. Недавно нами было показано, что индукция фагоцитоза белком InlB усиливается более чем в 10 раз в присутствии in trans другого белка листерий, ActA. Таким образом, листериозные факторы инвазии, закрепленные на поверхности частиц, могут служить основой для разработки новых способов адресной доставки лекарственных и других веществ в определенные типы эукариотических клеток.

131

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ДНК-РНК ГИБРИДИЗАЦИИ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПАТОГЕНОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А., Григорьев А.М.ГУ НИИ питания РАМН, Москва

Изучена возможность применения твердофазного гибридизационного метода ДНК-рРНК анализа с наборами «LUMIProbe 24» (Франция) для оп-ределения в пищевых продуктах наиболее эпидемиологически значимых бак-териальных патогенов – бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes.

В задачи исследования входило: оценить эффективность и чувствитель-ность метода ДНК-РНК-гибридизации в сравнении со стандартным определе-нием по ГОСТ Р 51921-2002 и ГОСТ 30519-97; отработать условия подготовки проб, обеспечивающие необходимый уровень эффективности анализа для разных видов пищевых продуктов, в том числе содержащих технологическую заквасочную микрофлору; на основе тестирования банка штаммов бактерий родов Listeria и Salmonella изучить специфичность метода.

Результаты проведенных межлабораторных испытаний путем параллель-ного исследования контаминированных и неконтаминированных пищевых продуктов и тест-штаммов на базе двух испытательных центров позволили сделать следующие выводы:

1. Система «LUMIProbe 24 Salmonella» обладает высокой специфичнос-тью обнаружения представителей рода Salmonella (99,0%) и позволяет эф-фективно выявлять единичные (на уровне 10 КОЕ/г) бактерии при условии оптимизации способов подготовки проб и длительности культивирования в течение не менее 48 часов. Метод гетерогенного твердофазного ДНК-РНК гибридизационного анализа с использованием наборов «LUMIProbe 24 Salmonella» может применяться для экспрессного выявления бактерий рода Salmonella в пищевых продуктах и в объектах окружающей среды.

2. При исследовании пищевых продуктов и смывов на наличие патогенных L. monocytogenes метод ДНК-рРНК гибридизации с тест-наборами «LUMIProbe 24 Listeria monocytogenes» может быть использован для видовой идентифика-ции листерий, выделенных после этапа культивирования на дифференциаль-но – диагностических средах, в качестве подтверждающего теста.

Порог чувствительности испытанного формата метода ДНК-РНК гибри-дизации для L. monocytogenes составляет не менее 1х105 – 5х105 клеток/см3; данный вариант анализа путем прямого определения возбудителя после селективного обогащения проб при режимах пробоподготовки, реко-мендованных изготовителем, в настоящее время не позволяет выявлять L. monocytogenes при низких уровнях исходной контаминации.

По результатам работы разработаны и введены в действие Методичес-кие указания МУК 4.2.1955-05 «Метод выявления и определения бактерий рода Salmonella и Listeria monocytogenes на основе гибридизационного ДНК-РНК анализа».

132

КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ g-ГЛОБУЛИНА ПРИ СВЯЗЫВАНИИ КАТИОНОВ МЕДИ

Жаркова М.С., Воробьева У.А., Бабаева Е.Е., Чекнев С.Б.НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Введение. Известно, что константные и вариабельные районы молекул антител экспрессируют сайты связывания меди и цинка, взаимодействие металлов с которыми может изменять пространственную упаковку и эф-фекторные свойства белков.

Целью исследования являлось изучение конформационных изменений человеческого сывороточного g-глобулина и оценка концентрационных зависимостей при связывании белка с катионами меди.

Материалы и методы. Приготовленный на 0.15 М растворе NaCl пре-парат g-глобулина (Serva) инкубировали с хлоридом или сульфатом меди (концентрации металла от 0,65 нг/мл до 4,0 мкг/мл) в течение 1 час при 37° С. Связывание меди с g-глобулином оценивали молекулярной уль-трафильтрацией на конусах CF-25 (Amicon) с определением количества свободной меди в фильтрате по реакции с диэтилдитиокарбаматом натрия. Для оценки конформационных изменений g-глобулина использовали спектрофотометрию в ультрафиолете – применяли сканирующий спект-рофотометр PU 8730 UV/VIS (Philips).

Результаты. Установлено, что содержание меди, как и цинка, в рас-творе определяет возможность развертывания молекулы g-глобулина во внемолекулярное пространство, за счет взаимодействия металла с боко-выми аминокислотными остатками, либо – компактизации глобулы, за счет встраивания катионов в сайты междоменной области. При этом оба эффекта обнаруживают насыщаемость белка металлом, однако, в отличие от катионов цинка, медь оказывается более активной на внешних связях g-глобулина. Закономерности связывания меди с g-глобулином свиде-тельствуют о последовательном, как и в опытах с цинком, заполнении катионами внешних и внутренних связей белка и наличии в макромоле-куле не менее чем трех групп сайтов связывания меди, различающихся константами диссоциации.

Заключение. Результаты работы обосновывают представления о зави-симости конформации g-глобулина в физиологических условиях от того, какие (внешние или внутренние) сайты вовлекаются во взаимодействие с медью при определенном молярном отношении белка и металла, обнару-живают присутствие в молекулах антител неэквивалентных и зависимых друг от друга участков связывания и указывают на возможность активного донорствования катионов g-глобулином находящимся в локальном окру-жении клеткам или биомакромолекулам.

133

ТУЛЯРЕМИЯ ВОЗВРАЩАЕТСЯ?

Жемчугов В.Е. НП «Межрегиональный институт иммунокоррекции и метаболической терапии»

Исторически Россия стала третьей страной, в которой был открыт воз-будитель туляремии – в 20-х годах прошлого века. К настоящему моменту ареал распространения F. tulareusis включает практически все северное полу-шарие, а в 2003 году M.Wipp et al., сообщено о выделении F. novicida в Авс-тралии. В середине прошлого века в России отмечались крупные вспышки, болели сотни тысяч человек. После начала массового применения вакцины на основе штамма 15 (Эльберта-Гайского) заболеваемость резко уменьши-лась, привиты были миллионы человек. К настоящему времени в год на всей территории РФ выявляется не более нескольких десятков заболевших в год, до 60 – 70% из которых составляют невакцинированные дачники. По оценкам специалистов, вакцинированных в разные сроки россиян сейчас насчитывается 2 – 3 млн. человек. (И.С.Мещерякова, 2003). Тем не менее, вспышки в Испании, Косово, аэрогенная вспышка в США, выделение не-арктического штамма в Словакии, вспышка нынешнего года в центральных областях РФ показывают, что туляремия далеко не в прошлом – она тихо и скрыто продолжается, как пожар на торфянике, иногда прорываясь яркими факелами. Летальность при нелечённых формах туляремии, вызванной воз-будителем неарктической (тип или подвид «А») разновидности, составляет 10-50%, что делает актуальной вакцинацию контингентов, подверженных за-болеванию (Kieffer T., et al., 2003). При этом побочные эффекты применения живой вакцины, особенно повторного, диктуют необходимость разработки вакцины нового типа – химической, субъединичной, генноинженерной и т.д. (Жемчугов В.Е., и др., Патент РФ 2221591, 2003).

На наш взгляд представление об эпизоотии туляремии, как о непре-рывной цепочке заболеваний восприимчивых животных, тем или иным способом передающих друг другу микроб, с сохранением возбудителя в природных экосистемах не всегда объясняет массивность и синхронность выделения культур от носителей, из объектов внешней среды, вспышки среди людей. Общебиологический закон – «стратегия» вида направлена на его сохранение и распространение, т.е. захват новых ареалов. В полной мере, как нам представляется, этот закон можно отнести к отдельным популяциям и роду Francisella в целом.

Предлагается концепция двухступенчатой стратегии развития микробной популяции – этиофактора зоонозной инфекции, на примере возбудителя туляремии (Жемчугов В.Е., 2004). Первым этапом реализации этой «стра-тегии» является накопление численности микроорганизмов на территории данного ареала в организме высокочувствительных животных-хозяев – «го-рючего материала». Второй этап – перемещение микробов, в том числе с

134

помощью низкочувствительных носителей на территорию нового ареала. При благоприятных условиях на новой территории начинается накопление численности популяции, обеспечивающее очередной скачок.

При невозможности реализации первой и второй ступеней нельзя ис-ключить диссоциацию патогенного микроорганизма в непатогенный(е); или разделение его генома на отдельные фрагменты, сохраняющиеся в клетках сапрофитов во внешней среде, или в клетках нормальной микрофлоры высокочувствительного макроорганизма-хозяина, что под-тверждается выделением некультивируемых форм возбудителя туляремии (Mishankin B.N. et al., 1997).

Практической реализацией представленной концепции может быть профилактика эпизоотий, вспышек и эпидемий зоонозных инфекций, в т.ч. туляремии, путем вакцинации высоко- и низкочувствительных носи-телей микробов на всей территории очага.

УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫЕ ЭНТЕРОБАКТЕРИИ В ЭТИОЛОГИИ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

У ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ

Жеребцова Н.Ю., Валишин Д.А., Савина И.А., Кудакаева Р.Х., Корюкова Т.С., Мавзютов А.Р.

Башкирский государственный медицинский университет, Уфа Республиканская клиническая больница имени Г.Г. Куватова, Уфа

Острые кишечные инфекции у детей продолжают оставаться акту-альной проблемой, поскольку наносят большой ущерб здоровью детей и экономике страны. В настоящее время все большее медицинское зна-чение приобретает условно – патогенная флора, в том числе семейства Enterobacteriaceac (УПЭ). В качестве одной из причин рассматривают из-менение патогенности микроорганизмов. Ведущая роль в данном процессе принадлежит мобильным генетическим элементам, в том числе «островам» патогенности, которые представляют фрагменты ДНК, размерами от 10 – 20 до 200 kb, включающие дискретные гены вирулентности и обнару-живаемые только у патогенных микроорганизмов. Поскольку патогенность является клональной характеристикой, обнаружение данных генетических элементов у конкретных клинических штаммов УПЭ несет информацию об их потенциальной патогенности и может служить маркером для эпи-демиологического типирования.

Нами проведено клинико-бактериологическое обследование 89 детей и подростков с острой кишечной инфекцией, вызванной УПЭ. Коллекция

135

штаммов была представлена: Klebsiella spp. (37 шт), Citrobacter spp. (9 шт), Епtеrobасter sрр. (17 шт), Hafnia alvei (1 шт), Могgапеllа morganii (11 шт), Рroteus spp. (14 шт). Методом полимеразной цепной реакции собранные клинические штаммы протестированы на наличие генов, ассоциированных с патогенностью: hlyA, hlyВ (гемолизины), sfaG (фимбриальный антиген типа S), cnf-1 (цитотоксический некротизирующий фактор-1), ATb (тер-мостабильный энтеротоксин b). Проведенные исследования позволили выявить в 32,58% случаях у тестируемых бактерий фрагменты ДНК, специфичные известным генам кластеров патогенности. В общем пуле исследуемых культур образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hlyА имели место в 9 (10,11%), hlуВ – 10 (11,24%), sfaG – 8 (9%), cnf-1 – 9 (10,11%), ST – 3(3,4%) случаях соответственно.

Таким образом, обнаружение данных генетических элементов может быть маркером, дифференцирующим патогенные и непатогенные клини-ческие штаммы, так как структурная организация этих элементов опре-деляет высокую вероятность их экспрессии. Это определяет возможность использования указанных маркеров для эпидемиологического типирования клинических штаммов УПЭ.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ И ИСХОДОВ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

НА ОСНОВЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МИШЕНЕЙ ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЮЧЕВЫХ СИСТЕМ

ГОМЕОСТАЗА ЧЕЛОВЕКА

Жукова О.Б., Рязанцева Н.В., Зима А.П., Новицкий В.В., Радзивил Т.Т., Литвак М.М., Михеев С.Л., Чечина О.Е., Мороз Е.А., Литвинова Л.С.,

Колобовникова Ю.В.Сибирский государственный медицинский университет, Томск

В проблеме вирусных инфекций нерешенным остается вопрос о меха-низмах, приводящих при одном и том же возбудителе к разным исходам болезни – выздоровлению, бессимптомному носительству, трансформа-ции в прогредиентную хроническую форму заболевания. Известно, что функциональное состояние системы иммунитета определяет направление иммунного ответа при инфицировании. Доказано влияние индивиду-альных особенностей процессов межклеточной кооперации и апоптоза иммунокомпетентных клеток на предрасположенность к различным па-тологическим процессам, в том числе и к инфекционным заболеваниям, на характер и тяжесть их течения, на чувствительность к проводимой терапии, на исход инфекции.

136

В связи с этим целью исследования явилось: выявление молекуляр-ных мишеней иммуноповреждающего действия персистирующих вирусов клещевого энцефалита, (КЭ) гепатитов В и С и разработка технологии управления реакциями противовирусного иммунитета.

У 75 пациентов с длительной антигенемией вируса КЭ, 109 больных хроническим вирусным гепатитом (ХВГ) В, 183 человек, страдающих ХВГ С, и 50 здоровых доноров иммуноцитохимическим методом было оцене-но содержание CD3+, CD4+, CD8+, CD22+, CD56+-, и CD95+-клеток, методом ИФА - продукция мононуклеарами крови IL-2, IL-4, IL-10, IL-12, IFN-g, TNF-α, sTNF-αRI («Cytimmune», США, «Procon», Россия), методом проточной цитофлуориметрии – экспрессия соответствующих мембраносвязанных рецепторов (IL-2R, IL-4R, IL-10R, IL-12R, IFN-gR, TNF-αRI) («Сaltag», США), апоптоз в аннексиновом тесте и уровень ми-тохондриального потенциала на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция).

В результате проведенных исследований было установлено, что основ-ными вирусиндуцированными проявлениями модуляции межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток являются дисбаланс продук-ции Тh1/Th2-цитокинов мононуклеарными лейкоцитами, нарушение экспрессии цитокиновых рецепторов лимфоцитов. Показано, что разно-направленные изменения апоптотической реакции лимфоцитов при КЭ, ХВГ вызваны дизрегуляционными перестройками рецептор-зависимого и митохондрально-опосредованного путей апоптоза клетки.

Таким образом, нарушения молекулярных механизмов регуляции межклеточной кооперации и апоптоза клеток иммунной системы игра-ют ключевую роль в формировании хронических вирусных инфекций. Выявление молекулярных мишеней иммуноповреждающего действия персистирующих вирусов даст возможность предложить новые критерии формирования групп риска заболевания, повышения эффективности диагностики, определения тактики индивидуализированной терапии и своевременной профилактики угрожающих жизни пациентов осложнений, а также прогнозирования и контроля эпидемиологической ситуации.

137

МОЛЕКУЛЫ АДГЕЗИИ И СОСТОЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОГО МАТРИКСА КАК ПРОГНОСТИЧЕСКИЕ

ФАКТОРЫ ПРИ РАКЕ

Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А.МНИОИ им. П.А. Герцена Росздрава

Введение. Одной из задач современной онкоморфологии является поиск признаков и свойств злокачественных новообразований, являющихся про-гностичическими факторами. Так агрессивность и инвазивная активность опухолей во многом определяется состоянием внеклеточного матрикса и молекул адгезии.

Цель исследования. Изучить экспрессию молекул адгезии и компонен-тов внеклеточного матрикса при раке мочевого пузыря, молочной железы и легкого.

Материалы и методы. Исследовано 48 случаев протокового рака молочной железы, 39 – переходноклеточного рака мочевого пузыря, 48 – рака легкого (по 24 случая плоскоклеточного и аденоплоскоклеточ-ного). Иммуногистохимическим методом изучена экспрессия Е-кадгерина, бета-катенина, СD44, металлопротеиназ 1, 2, 9, ингибиторов металлопро-теиназ 1 и 2, ламинина, коллагена IV типа, тенасцина.

Результаты и их обсуждение. Экспрессия Е-кадгерина и бета-катенина при раке мочевого пузыря коррелирует с степенью анаплазии опухоли: в низкодифференцированных раках реакция с антителами либо отсутство-вала, либо была крайне слабой, а в то время как при высокодифферен-цированном раке отмечалась интенсивная реакция в большинстве клеток опухоли. В низкодифференцированных раках реакция с CD44 уменьшалась в опухолевых клетках и одновременно увеличивалась во внеклеточном матриксе. Также при увеличении степени анаплазии опухоли наблюдалось усиление экспрессии металлопротеиназ 1, 2 и 9, снижение экспрессии ингибитора металлопротеиназы 1, разрушение базальных мембран и увеличение количества тенасцина во внеклеточном матриксе. При раке молочной железы и раке легкого в группах опухолей с метастазами пока-зано уменьшение экспрессии Е-кадгерина и бета-катенина, ингибиторов металлопротеиназ 1 и 2, разрушение ламинина и коллагена IV базальных мембран при увеличении экспрессии металлопротеиназ 1, 2, 9, CD44, тенасцина и появление бета-катенина в ядрах опухолевых клеток.

Заключение. Проведенное исследование состояния молекул адгезии и внеклеточного матрикса показало прямую связь нарушений адгезив-ных свойств клеток и изменений состояния компонентов внеклеточного матрикса со степенью анаплазии опухолей и наличием метастазов. По-лученные результаты позволяют использовать изученные маркеры для определения индивидуального прогноза течения болезни.

138

РОЛЬ ФУМАРАТА НАТРИЯ В ТЕРАПИИ НАРУШЕНИЙ СЕРДЕЧНОГО РИТМА ПРИ ОСТРОМ КОРОНАРНОМ

СИНДРОМЕ

Зайцев Ю.Е., Селиванов Е.А., Смолянинов А.Б.Научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии МЗСР РФ

Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

В последнее время все чаще в клинической практике встречаются больные острым коронарным синдромом (ОКС). Неблагоприятные усло-вия внешней среды, выраженные нарушения липидного обмена все это ведет к увеличению числа больных ишемической болезнью сердца и ОКС. Предложенный нами для лечения больных ОКС фумаратсодержащий препарат мафусол, способен улучшить течение ОКС, сделать благопри-ятным его исход. Мафусол – солевой инфузионный раствор, основным фармакологическим активным компонентом которого является фумарат натрия. В состав препарата входят также хлорид натрия, хлорид калия, хлорид магния. Осмолярность мафусола составляет 400 – 410 мосм/л.

Из 46 исследуемых больных, поступивших в стационар с диагнозом ОКС, у 20 (43,5%) больных причиной его постановки явились нарушения ритма в виде тахиаритмий впервые возникших или декомпенсации уже имеющейся постоянной формы мерцательной аритмии. На ЭКГ имелись изменения в виде признаков систолической перегрузки или наличия субэн-докардиальной ишемии различных сегментов левого желудочка – наиболее часто с заинтересованностью задней и боковой стенки.

Введение 200,0 мл мафусола со скоростью 6 мл в минуту без примене-ния каких либо антиаритмических препаратов при ОКС сопровождалось достоверным урежением сердечного ритма при постоянной мерцательной аритмии, его восстановлением у больных с впервые возникшей или па-роксизмальной мерцательной аритмии с давностью пароксизма не более 2-х суток. При исследовании электрокардиографических показателей у пациентов как с нарушением ритма (с последующим восстановлением), так и с изначально синусовым ритмом выявлено увеличение интервала PQ на 2,8±1,2 мс после введения мафусола (р<0,05). Влияния на внутри-желудочковую проводимость (комплекс QRS) и электрическую систолу (интервал QT) не отмечено.

Причиной, обуславливающей антиаритмический эффект мафусола, является способность данного фумаратсодержащего раствора при метабо-лизме в условиях ишемии образовывать АТФ. Это позволяет сделать вывод о наличии у мафусола противоаритмических свойств, которые проявляются как отрицательные хронотропный и дромотропный эффекты.

139

ЛАЗЕРНО-ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГРИБОВ РОДА CANDIDA

К АНТИМИКОТИКАМ

Зайцева Т.А., Александров М.Т., Бажанов Н.Н., Воробьев А.А., Пашков Е.П., Муравьева В.В.

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Кафедра микробиологии

Кафедра госпитальной и хирургической стоматологии

Ранее нами показано, что увеличение концентрации микроорганиз-мов приводит к усилению мощности флюоресценции, а уменьшение – к снижению интегрального нормированного показателя флюоресценции (НПФ), что и легло в основу предложенного экспресс-метода оценки эффективности антимикотиков в отношении грибов рода Candida.

Определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) клини-ческих штаммов Candida spp. к флюцитозину, амфотерицину, флюконазолу, итраконазолу одновременно стандартным методом визуальной регистра-ции мутности образцов и методом лазерно-флюоресцентной диагностики (ЛФД). ЛФД – метод молекулярной биологии и медицины.

Флюоресценцию оценивали в относительных единицах. Результаты учитывали через 2-3 часа, путем получения отношения величины мощнос-ти флюоресценции образцов с антимикотикам к контрольным образцам культуры без антибиотика.

МПК флюцитозина методом визуальной регистрации мутности образ-цов – 0,5 мкг/мл, методом ЛФД – 1 мкг/мл.

МПК амфотерицина соответственно 1 мкг/мл и 1мкг/мл.МПК флюконазола визуальным и ЛФД – 8 мкг/мл.МПК итраконазола – 0,25 мкг/мл и 0,5 мкг/мл.Полученные данные НПФ свидетельствуют о совпадении результатов

определения чувствительности грибов рода Candida двумя указанными методами.

Преимущества предложенного метода – ЛФД заключается в более вы-сокой чувствительности и объективности оценки действия препарата – по мощности и спектру флюоресценции, времени учета результатов – всего 2 – 3 часа после экспозиции с антимикробными препаратами. Возможность автоматизации учета, обработки и хранения информации при использо-вании ЛФД метода делает его предпочтительным.

140

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНА ЛАТЕНТНОГО ТРФβ1: ОЦЕНКА

НА МОДЕЛИ КРЫС DA С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ АУТОИММУННЫМ ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТОМ

Заргарова Т.А., Кулакова О.Г., Прасолов В.С., Жармухамедова Т.Ю., Цыганова В.Г., Туробов В.И., Иванов Д.С., Парфенов М.Г.,

Судомоина М.А., Chernajovsky Y., Фаворова О.О.Филиал Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и

Ю.А. Овчинникова, РАН, Пущино Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, РАН, Москва

Институт экспериментальной кардиологии, Москва St. Bartholomew’s and Royal London School of Medicine and Dentistry, London

Российский государственный медицинский университет, Москва

Введение. Рассеянный склероз (РС) – воспалительное аутоиммунное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы. Известно, что противовоспалительный цитокин трансформирующий ростовой фактор β1 (ТРФβ1) является одним из ключевых модуляторов иммунного ответа, препятствующих процессу демиелинизации при РС и его биомодели – эк-спериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ). Системное введение активного ТРФβ1 не приемлемо из-за его высокой лабильности и побочных эффектов, тогда как его латентный предшественник может активироваться непосредственно в очаге воспаления.

Цель исследования. Оценить возможность генной терапии РС с ис-пользованием гена латентного предшественника ТРФβ1 на модельных животных – крысах линии DA с ЭАЭ.

Материалы и методы. Использовали ретровирусный вектор ТРФβ1 pBabe neo (-5’UTR) для переноса гена предшественника ТРФβ1 человека в первичные фибробласты крыс DA. Эффективность экспрессии трансгена доказывали с помощью ОТ-ПЦР и биотеста на клетках Mv1Lu.

Результаты. Кондиционированная среда от трансдуцированных ТРФβ1 фибробластов (ТФ) при условии температурной активации продуциру-емого ТРФβ1 значительно (≥3 раза) ингибирует пролиферацию in vitro лимфоцитов из лимфоузлов крыс DA с ЭАЭ, оцениваемую по включе-нию [3H]тимидина в ДНК. Системное введение ТФ (3x106 клеток, внут-рибрюшинно) крысам DA на 3-ий день после индукции ЭАЭ приводит к значительному снижению как смертности животных (р=0,006), так и средней тяжести заболевания (р=0,001) в период с 11 по 23 день после иммунизации по сравнению с контрольными иммунизированными жи-вотными, обработанными нетрансдуцированными фибробластами. После трансплантации ТФ у крыс за период наблюдения (14 мес.) не наблюдали образования опухолей.

141

Заключение. На модельных животных показана эффективность геноте-рапевтического подхода к лечению РС, основанного на введении клеток, инфицированных ex vivo ретровирусным вектором, содержащим ген ла-тентного предшественника ТРФβ1.

НЕКОТОРЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (РПЖ)

И ПРОСТАТИЧЕСКОЙ ИНТРАЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ (ПИН)

Зезеров Е.Г., Северин Е.С., Аляев Ю.Г., Коваленко Н.А., Асламазов Э.Г., Винаров А.З., Лесничук С.А., Спиричев В.Б., Безруков Е.А.,

Барашков Г.К., Бутнару Д.В., Курынин Р.В., Забежинская О.М., Бекетова Н.А., Поляковский К.А.

Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Институт питания РАМН

В связи с постоянно возрастающей заболеваемостью и смертностью мужчин от РПЖ актуальна разработка новых, в том числе молекуляр-но-биологических, критериев и методов ранней диагностики РПЖ, его метастазов и особенно предракового состояния – ПИН 2. На фоне прак-тически отсутствующих в России подобных исследований (до 2000-х гг.) нами на основании анализа и синтеза мировой научной информации была разработана модель, интегрирующая связи эффекторных и регуляторных факторов, определяющих интенсивность и координацию пролиферации и апоптоза эпителиальных и стромальных клеток в простате, и изучено изменение этих связей при РПЖ, а также намечены пути собственных исследований (Зезеров Е.Г., Северин Е.С., Вестн. РАМН, 1998 №5, 1999 №З). В плане акцента на актуальность диагностики предракового состо-яния простаты мы выделили факторы, которые могут характеризовать канцерогенный потенциал пациента (ПСА, теломераза, ДНК-плоидия, дигидротестостерон) и антиканцерогенный потенциал (селен, витамины Е, Д, С, А, каротиноиды, изофлавоны).

В настоящем докладе представлены результаты, полученные с использо-ванием следующих методов. Активность теломеразы (AT) биоптатов ткани простаты (маркер пролиферации клеток и рака) анализировали модифи-цированным нами неизотопным вариантом метода TRAP (Коваленко Н.А. и др., Вопр.биол.,мед.,фарм. химии,2003 №I). Для оценки ДНК-плоидии ядер получали суспензию хорошо диспергированных клеток биоптата про-статы и после окрашивания ядерной ДНК йодистым пропидием проводили

142

проточную цитофлуорометрию. Концентрацию жирорастворимых витами-нов и каротиноидов в крови определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, витамина С – титрованием с реактивом Тиль-манса, а микроэлементов – методом атомно-эмиссионной спектроскопии. Для анализа микрометастазов использовали модифицированный нами метод выявления в крови мРНК ПСА-продуцирующих клеток – ОТПЦР (Забежинская О.М. и др., Вопр.биол.,мед., фарм.химии,2002 №3).

Из 27 пациентов у 19 гистологически диагностирован РПЖ., из них AT выявлена у 18 больных с высокой (4),умеренной (11) и низкой (3) сте-пенью дифференцировки рака при отсутствии костных метастазов у 69% АТ-положительных пациентов. В группе сравнения (2 – доброкачествен-ная гиперплазия простаты, ДГПЖ, 6 – ДГПЖ+ПИН) AT отсутствовала. Анализ ДНК-гистограмм выявил анеуплоидию у 3-х больных РПЖ при её отсутствии в случае ПИН I (I пациент) и ДГПЖ (3 пациента). При анализе сывороток крови обнаружено: а) пониженное содержание анти-оксидантов (каротиноидов, ликопина, β-каротина, витамина С) у 90% больных РПЖ (7 пациентов); б) та же тенденция, особенно по ликопину, но боле сла-бая, в группе из 5 пациентов с «предраком» ПИН 2 в сочетании с ПИН I+ДГПЖ; в) в группе относительного контроля из 9 пациентов (ПИН 1, ДГПЖ, хронический простатит) отмечено только некоторое уменьшение содержания витамина С у 5 человек.

Ранние микрометастазы РПЖ, выявлены у 2-х из 8 больных локали-зованным РПЖ (Т3 NxМo), у 3-х больных РПЖ с костными (T3-4NxM1) и лимфометастазами (T3N1M1). У 4-х больных с костными метастазами после длительного гормонального лечения ранние микрометастазы уже не обнаружены. Интересно, что сама процедура биопсии простаты привела к появлению мРНК ПСА-продуцирующих клеток в крови у 4-х больных с локализованным РПЖ.. Получены предварительные данные о содержа-нии 26 микроэлементов в крови пациентов, которые будут рассмотрены в обсуждении.

Заключение. Проводимые нами оригинальные в условиях России исследования обосновывают критерии и методы ранней оценки предра-кового статуса человека и методы ранней диагностики РПЖ и его мик-рометастазов.

143

РОЛЬ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В ИНГИБИРОВАНИИ АПОПТОЗА КЛЕТОК ХОЗЯИНА И РАЗВИТИИ

ХРОНИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ

Зигангирова Н.А., Мартынова В.Р., Борцов П.А., Токарская Е.А., Гинцбург А.Л.

ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Апоптоз защитная реакция макроорганизма при врожденном и при-обретенном иммунном ответе на проникновение патогена, а при внут-риклеточном паразитировании апоптоз является основным механизмом элиминации возбудителя, позволяющим предотвратить распространение инфекции в организме. Однако многие патогенные бактерии в ходе параллельной эволюции выработали различные механизмы управления клеточной гибелью, что реализуется благодаря взаимодействию бактери-альных биологически активных молекул с сигнальными путями, ведущими к апоптозу, клетки хозяина. Так, подавление апоптоза приводит в дис-семинации возбудителя в различные ткани и органы, распространению инфекционного процесса, выживанию патогена и его персистенции. Все это определяет возможность развития тяжелых хронических состояний. Для большинства патогенных бактерий факторы ингибирующие апоп-тоз и механизмы их действия практически не изучены. Идентификация бактериальных факторов представляется принципиально важным в свете поиска новых подходов для лечения и профилактики хронических ин-фекций. Факторы ингибирующие апоптоз могут служить привлекатель-ными мишенями для действия антимикробных препаратов. Такого типа препараты, активирующие апоптоз на фоне инфекции, обусловленной внутриклеточными паразитами, единственный на данный момент подход для элиминации персистирующих форм возбудителя и борьбы с хрони-ческими инфекционными заболеваниями.

Целью работы является изучение механизмов блокирования апоптоза патогенными бактериями на примере облигатных внутриклеточных па-разитов, что позволит разработать принципиально новые подходы для лечения хронических инфекций.

Полученные к настоящему времени экспериментальные данные на модели патогенных для человека хламидий, C.trachomatis и C.pneumoniae, показали, что эти возбудители защищают эпителиальные клетки от спонтан-ного и индуцированного стауроспорином апоптоза. Результаты указывают на то, что антиапоптозные факторы хламидий секретируются метаболически активными формами в цитоплазму клетки хозяина, а также во внеклеточное пространство и обеспечивают поддержание жизни клеточной популяции на протяжении развития в ней нескольких циклов хламидийной инфекции.

144

В процессе молекулярной характеристики особенностей протекания апоп-тоза при хламидийной инфекции было установлено, что блокирование апоптоза зависит от белкового хламидийного синтеза и происходит на этапе выхода цитохрома С из митохондрий и активации каспазы 3.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ, МОНИТОРИРОВАНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО

ЛИМФОЛЕЙКОЗАЗуева Е.Е., Стадник Е.А., Слободнюк К.Ю., Тотолян А.А., Зарицкий А.Ю.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

В-клеточный хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является наиболее часто встречающимся лейкозом среднего и пожилого возраста в Западном полу-шарии. ХЛЛ характеризуется прогрессирующим накоплением клона опу-холевых лимфоцитов, синхронно экспрессирующих CD5+СD19+СD23+. Высокий уровень экспрессии СD38 на поверхностной мембране транс-формированных лимфоцитов является характерной чертой случаев ХЛЛ, протекающих с неблагоприятным клиническим течением: коротким вре-менем удвоения количества лимфоцитов, низкой выживаемостью, плохим ответом на химиотерапию и высокой частотой прогрессии заболевания после проведения терапии первой линии. Изменение экспрессии СD38 в ходе химиотерапии флударабином и циклофосфаном может рассматри-ваться как предиктор неэффективности стимуляции G-СSF при планиро-вании аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток. На сегодняшний день остаются неясными молекулярные основы низкой восприимчивости больных с высоким уровнем экспрессии сигналинговой молекулы СD38 к программной терапии и стимуляции С-СSF.

Основная цель настоящего исследования состояла в определении кли-нической значимости нестабильности экспрессии СВ38 в ходе лечения больных ХЛЛ в зависимости от исходного фенотипа опухолевых клеток и ответа на программную химиотерапию. Время наблюдения пациентов составило 8±5 лет, но не менее одного года. При статистической обработке данных были использованы методы непараметрического анализа.

Экспрессия СD38 более, чем на 40% опухолевых клеток (СD5+СD19+СD23+) была расценена как высокий уровень экспрессии. Высокий уровень экспрес-сии СD38 на клетках опухолевого клона ассоциирован с относительно ранним возрастом начала заболевания (до 53 лет), гепатоспленомегалией, высокой частотой развития тяжело протекающей герпес-вирусной инфекции и низ-ким уровнем ответа на терапию флударабином и циклофосфаном (р<0,05). Увеличение уровня экспрессии СD38 в два и более раза после трех курсов программной химиотерапии является предиктором неэффективности G-СSF стимуляции после шести курсов программной химиотерапии.

145

Заключение. Известно, что СD38 является сигналинговой молекулой. Разный уровень ее экспрессии у больных ХЛЛ с различной восприимчи-востью к внешним воздействиям (химиотерапия пуриновыми аналогами, инфекционная нагрузка) может являться отражением вовлечения разных сигналинговых путей при разном уровне экспрессии этой молекулы на поверхности трансформированных лимфоцитов.

КЛИНИЧЕСКИЙ ОПЫТ ПРИМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ

МУЛЬТИЛОКУСНОЙ ПЦР ДЛЯ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННОЙ ДИАГНОСТИКИ РАСПРОСТРАНЕННЫХ АНЕУПЛОИДИЙ

Иванов М.А., Литвиненко В.М., Стрельников В.В., Торганова И.Г., Немцова М.В., Залетаев Д.В.

НИИ Молекулярной медицины, Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова, г.Москва

Введение: В последнее время вспомогательные репродуктивные техно-логии получили широкое распространение во всем мире, в том числе и в России. В связи с этим возникла потребность в оценке важнейших гене-тических параметров эмбрионов еще до их имплантации в полость матки. Нами разработана модификация метода количественной флуоресцентной мультилокусной ПЦР (КФ-ПЦР) для выявления анеуплоидий 13, 18, 21 и половых хромосом на материале одной клетки.

Материалы и методы: Методом КФ-ПЦР исследовано 56 бластомеров от 51 эмбриона 17 пациенток. Биопсию бластомеров проводили на тре-тий день после инсеминации по стандартной методике, делая отверстие в блестящей оболочке механически, либо с помощью лазера. Затем блас-томер помещали в пробирку с лизирующим раствором, в которой, после соответствующей подготовки, проводили ПЦР. Анализ продуктов ПЦР с олигонуклеотидных праймеров, конъюгированных с флуоресцентными красителями, осуществлялся на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 по протоколам фирмы Applied Biosystems.

Результаты и обсуждение: На доклиническом этапе нами была пока-зана абсолютная идентичность данных, полученных при использовании КФ-ПЦР и классических методов. Эффективность ПЦР с одной клетки составила 96% (54/56), что сопоставимо с данными зарубежных авторов. По результатам клинического применения КФ-ПЦР в 4 бластомерах была выявлена анеуплоидия половых хромосом (XXY), в 3 бластомерах – трисо-мия 21 хромосомы. Во всех случаях обнаружения патологии диагностику проводили повторно на 5 день для подтверждения диагноза. 36 эмбрионов

146

было перенесено в полость матки 17 пациенток, после чего у 4 из них наступила беременность.

Заключение: Показана возможность клинического применения моди-фицированной КФ-ПЦР для преимплантационной диагностики распро-страненных анеуплоидий.

НОВЫЕ АСПЕКТЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ

АСТМЫ

Иващенко Т.Э., Останкова Ю.В., Келембет Н.А., Лаврова О.В., Баранов В.С. НИИ АГ им. Отта, Санкт-Петербург

Бронхиальная астма (БА) относится к типичным мультифакториальным заболеваниям.

В патогенезе бронхиальной астмы легко усматривается наличие как генетического, так и экзогенного компонентов. Генная сеть БА имеет мультикомпонентную основу.

Целью настоящей работы является проведение анализа ассоциации по-лиморфных вариантов некоторых генов системы детоксикации (GST M1, GSTT1) и генов цитокиновой системы (TNFα (–238 A/G и –308 A/G); IL-4 (С590Т); IL-4Rα (Q576R)) с развитием атопической бронхиальной астмы.

Выявленные нами достоверные увеличения частот мутаций в генах GST M1, GSTT1, относящихся к генам, кодирующим ферменты Фазы 2 сис-темы детоксикации, у больных бронхиальной астмой, свидетельствуют об участии этих генов в патогенезе БА. Можно предположить, что отсутствие активности ферментов второй фазы, нарушение баланса между первой и второй фазой системы детоксикации, накопление активных метаболитов способствует развитию оксидативного стресса – одного из ключевых ком-понентов повреждения дыхательных путей и развития воспаления.

При анализе полиморфизма TNFα гена (провоспалительного цитокина) выявлено, что аллель –238 A связанный с понижением промоторной ак-тивности является протективным по отношению к развитию БА, тогда как аллель –308 A характеризующийся повышенной промоторной активностью ассоциирован с заболеванием. Показана также ассоциация определённых полиморфных вариантов генов IL-4 и IL-4Rα с развитием бронхиальной астмы. Сочетание двух редких аллельных вариантов генов IL-4 (-590 Т) и IL-4Rα (-576 R) достоверно чаще встречается в группе больных с БА по сравнению с контрольной группой.

В ходе работы нами обнаружены достоверные отличия в распределении полиморфных вариантов изученных генов между пациентами мужского и женского пола.

147

На основе полученных данных обсуждается комплекс мероприятий по первичной профилактике аллергических заболеваний у детей, рожденных от матерей страдающих БА, которые осуществляются уже в период бере-менности матери. Новорожденным проводится оценка генетической пред-расположенности к аллергическим заболеваниям и формируется группа риска по развитию заболевания для последующей профилактики.

МИКРОЭЛЕМЕНТЫ И РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА: ПАЛЛИАТИВНАЯ ИЛИ РАДИКАЛЬНАЯ ЗАЩИТА «ПРЕДУПРЕДИТЕЛЬНОЙ» ТОКСИКОЛОГИИ ?

Калетина Н.И. , Калетин Г.И., Брусиловский А.И.1 – ММА им. И.М. Сеченова, кафедра токсикологической химии

2 – Институт доклинической и клинической экспертизы лекарственных средств ФГУ «НЦ ЭСМП» МЗСР РФ, Москва, Россия

3 – DR. AIB’s PRIVATE HISTOLOGY, Президент Лос Анджелес-Санта Моника, Калифорния, США

Взаимодействия «МЭ-апоптоз» имеют различную степень специфич-ности и зависят от природы микроэлементов (МЭ), химической структуры соединений, содержащих МЭ, времени и дозы при экспозиции. Соедине-ния металлов различной природы, обладающие как прямым, так и непря-мым генотоксичным эффектом, могут вмешиваться в процессы апоптоза и быть использованы для регуляции апоптоза как в лечебных целях, так при скрытой форме биотеррористических актов (экологических диверсий) с отдаленными результатами, приводящими к сокращению времени жизни человека и животных, значительному ухудшению ее качества. Усугубляю-щее влияние на проявление генотоксического эффекта металлов, прежде всего в ионогенной форме, может оказать как дефицит, так и избыток или дисбаланс ряда эссенциальных МЭ. С другой стороны, известно о феномене низкодозовой гиперчувствительности живых организмов при сочетанных воздействиях металлов под влиянием естественно встречаю-щихся изменений в колебаниях сверхслабых геомагнитных полей. Поэтому весьма важно иметь дополнительные доказательства скрытой роли метал-лов – экотоксикантов в деструкции здоровья человека. Среди наиболее опасных и наименее контролируемых угроз человечеству большинство экспертов различных стран называют биотерроризм и «экологические» войны. Блокирование или индукция генов – регуляторов апоптоза может быть вызвано различными внутренними и внешними сигналами. В работе обсуждается способность МЭ индуцировать или блокировать механизм апоптоза. Речь идет о корреляции результатов аналитической диагностики

148

(регистрации) патогенного действия химических ультра микро импульсов на клетку с изменениями, происходящими на организменном уровне.

Белки семейства bcl-2 и другие способны проникать в липидный бис-лой мембран и формировать pH-чувствительные ионные каналы, которые переносят катионы металлов в виде комплексов согласно кинетическим закономерностям. В генной регуляции апоптоза играют важную роль ин-гибитор апоптоза – белок bcl-2, обладающий антиоксидантными свойс-твами, действующий подобно свободно-радикальной ловушке, и другой регулятор генной стабильности – p53.Например, апоптоз, индуцированный агентами, вызывающими разрывы ДНК (металлы, радиация), зависит от транскрипции р53.

Ионы ряда металлов: Ni2+, Pb2+, Cd2+ и других могут вызывать мутации или повреждение Rb-гена, что приводит к клонированию мутировавшей клетки. Известно, что Cr, Pb, Hg, Cd проявляют синергизм в реализа-ции генотоксического эффектов. Другие группы: Se-Mo, Ni, As, Hg, Cr; As - Zn, Se; Zn -Ni, Pb, Fe, Cu, Cd, Hg, As; Pb - Mn, Co, Fe, Cu, Zn; Co - Pb, Cd; Fe – Mn,Cd, Cu, Hg, Zn, Ni, Pb; Cu – Pb, Fe, Cd, Zn; Cd – Mn, Co, Fe, Cu, Zn, Se проявляют антагонизм в реализации гено-повреждающего действия.

Поддержание стабильного уровня внутриклеточных МЭ является важнейшим фактором клеточного гомеостаза. Учитывая специфическое влияние различных МЭ на регуляцию апоптоза, дисбаланс МЭ опосредо-ванно может стать пусковым механизмом нарушения апоптоза. С другой стороны, хорошо известно, что дисбаланс МЭ может быть следствием как неполноценного питания, социально-экономического неблагополучия, природных условий геобиопровинций, в почвах и водах которых очень низкое или очень высокое содержание тех или иных МЭ, интоксикации, вызванной введением различных групп токсикантов (например, введением ряда лекарственных препаратов, этанола или наркотиков), так и следствием биотеррористической атаки или непродуманных медико- профилакти-ческих оргмероприятий типа всеобщей йодной профилактики, «борьбы» с анемией, использованием в детских учреждениях мультиминеральных смесей с витаминами различных химических групп и т.д.

В работе обсуждаются возможности и условия проявления геноток-сических эффектов эссенциальными МЭ на примере соединений железа и кобальта. Экспериментальные результаты показали возмож¬ность выявления корреляции между физиологическим действием металлов, их биокомплексов и изменением электронной структуры центрального атома. МЭ. в зависимости от ближайшего лигандного окружения, значений рН среды, степени окисления, ионогенной или ковалентной формы нахожде-ния в образце, по-разному действуют на клетку и опосредованно влияют на регуляцию апоптоза. Ионы Co2+, подобно ионам Fe2+, индуцируют

149

ПОЛ, подавляют репарацию ДНК и обладают комутагенными с Ni2+, Pb 2+, Cd 2+ эффектами, запускают синтез противовоспалительного цито-кина TNF-α, вызывающего апоптоз и некроз клеток-мишеней. Согласно литературным и собственным экспериментальным данным органические комплексы железа и кобальта стабилизируют геном, однако в ионизи-рованном состоянии эти элементы могут вызывать повреждение ДНК и провоцировать смерть клетки.

В эксперименте был использованы высокочувствительные физико-хи-мические методы анализа МЭ (ИСП-МС, ГРС, ГХМС) а также методы авторадиографии, флюоресцентного зонда, электрофореза ДНК апопто-тических клеток для подтверждения фрагментации ДНК. При деградации ДНК образуются амфотерные полидезоксирибонуклеотиды, определение которых стало возможным при использовании нового типа окраски клет-ки (АВ*НЕ), разработанного профессором биологии А. Брусиловским (Brusilovskiy, 2004). Были проведены диагностические исследования, выявляющие связь между активностью генов и общими фенотипами, получаемыми при окрасках АВ*НЕ. Амфотерные продукты протеолиза внутриклеточных ядерных белков — ламина В, топоизомеразы I, гистона Р1, которые являются маркерами апоптоза, вызванного ФНО-α, были обнаружены также при помощи метода окраски по Брусиловскому. При-чем время приготовления препарата составляло 20 – 30 с вместо обычных 10 – 15 мин.

Получить достоверные и надежные результаты при необходимости массовых исследований возможно в лабораториях, использующих сово-купность высокочувствительных, информативных и экспрессных методов анализа, таких, как ИСП-МС, ГРС, ГХМС. Увеличивающийся масштаб загрязнений окружающей среды оборачивается ростом генетических му-таций, раковыми, сердечно-сосудистыми и профессиональными заболева-ниями, отравлениями, дерматозами, нарушением иммунитета и связанных с этим болезней. К большому сожалению, в РФ нет четких указаний на обязательность элементного анализа как при медико-диагностических ис-следованиях, так и при доклинических и клинических испытаниях новых лекарственных средств.

150

РАСТВОРИМЫЕ ФОРМЫ МЕМБРАННЫХ АНТИГЕНОВ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПРИ СОЦИАЛЬНО

ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХКараулов А.В., Евсегнеева И.В., Новиков В.В.

ММА им. И.М. Сеченова, НГУ им. Н.И. Лобачевского

Большинство дифференцировочных антигенов клеток иммунной сис-темы имеют растворимые формы, обладающие свойствами мембранных гомологов, но нередко вызывающие противоположные эффекты. Раство-римые антигены участвуют в регуляции иммунного ответа, информация об их наличии и функциональной роли важны для понимания патогенеза имуноопосредованных заболеваний. Уже первые исследования в этом направлении показали несомненную диагностическую значимость изу-чения этих антигенов. Нами изучены закономерности изменения уровня растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы человека у больных с социально – значимыми заболеваниями. Для реше-ния поставленных задач проведено исследование более тысячи образцов сывороток от доноров, больных вирусными заболеваниями (гепатиты А, В, С, ВИЧ-инфекция), сифилисом, диабетом и центральной хориоретиналь-ной дистрофией сетчатки (ЦХРД). Изучали молекулы гистосовместимости I класса (sHLA-I), активационные антигены (sCD38, sCD25, sCD95, sHLA-DR) и молекулы адгезии (sCD50, sCD54).

Установлено, что изменения содержания растворимых мембранных антигенов клеток иммунной системы человека отражает характер и ди-намику иммунного ответа и позволяет определять особенности развития иммунных нарушений и прогнозировать течение заболевания при изу-ченных заболеваниях. Каждая форма вирусного гепатита характеризуется индивидуальной картиной изменений уровней растворимых форм иссле-дованных антигенов, отражающей особенности иммунопатогенеза заболе-вания. При гепатите А содержание sCD50, sCD95 и sHLA- I значительно повышено, что отражает эффективность иммунного ответа и приводит к выздоровлению. При моноинфицировании ВИЧ происходит повышение сывороточного уровня суммарной и димерной фракции растворимого CD38 антигена. Содержание антигенов при ВИЧ-инфекции повышает-ся при наличии антител к вирусу гепатитов В и С и цитомегаловирусу. У больных ранним скрытым сифилисом и при серорезистентности после лечения выявлено понижение содержания sHLA- I . Развитие диабетичес-кой ретинопатии (ДР) при диабете II типа сопровождается как увеличени-ем активационно-адгезионной активности лейкоцитов, так и увеличением уровня их растворимых форм. У больных ЦХРД выявлено увеличение содержания антигенов sCD95, sHLA-DR и sHLA-I, уровень которых нор-мализуется при назначении антиоксидантной терапии.

151

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ОРГАНИЗМА НА ТЕРМИЧЕСКУЮ

ТРАВМУ

Карелин А.А., Ушакова Т.А., Глоба А.Г., Демидова В.С., Алексеев А.А. ГУ Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Москва

В развитии системной воспалительной реакции организма на термичес-кую травму ведущее значение отводят цитокинам, модулирующим процесс программируемой клеточной гибели. Нарушения процесса элиминации поврежденных клеток путем апоптоза лежат в основе развития сепсиса. В своей работе мы попытались оценить преимущественную экспрессию про- или антивоспалительных интерлейкинов, а также некоторых марке-ров апоптоза.

Задача исследования: определить наличие, степень и длительность экс-прессии исследуемых генов у разной категории пациентов с термической травмой.

Объект исследования: больные с ожогами более 30% поверхности тела, находящиеся в тяжелом и крайне тяжелом состоянии.

Метод: полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени на приборе «АНК-16К-4Ц» Института аналитического приборостроения РАН.

Исследования включали несколько этапов: 1) выделение тотальной РНК из ЭДТА-консервированной лейковзвеси набором фирмы «Юнимед»; 2) постановка реакции обратной транскрипции с М-МLV обратной транс-криптазой с использованием случайных и олиго (dT) 16 праймеров фирмы «Синтол»; 3) оценка экспрессии β-актина к-ДНК, 4) ПЦР с праймерами на TNF-α, IL-6, IL-10, caspasae-8; 4) автоматический расчет по установленной фирмой «Синтол» программе; 5) оценка экспрессии определяемых генов по разнице циклов геномной и к-ДНК.

Анализы выполнялись в динамике, в течение всего острого периода: c момента поступления до достижения относительной адаптации или развития летального исхода. Оценивали также и клинико-лабораторные параметры.

Результаты обследования 13 больных позволяют сделать предваритель-ные выводы: 1.Системный воспалительный ответ, проявляющийся экспрес-сией генов цитокинов, наблюдается не более 15 сут после травмы. 2) При осложненном септическом варианте у выживших пациентов в дальнейшем происходит кратковременное усиление экспрессии, у погибших – исходное или раннее ингибирование каспазной и интерлейкиновой активности. 3) У пациентов с длительным сроком существования гранулирующих ран экспрессии определяемых генов цитокинов не наблюдается.

152

АНАЛИЗ АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ FABP2, MDR1 В СВЯЗИ С ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ

ДЕЙСТВИЯ АНТИКОНВУЛЬСАНТОВ

Качалин Е.Ю.1, Авакян Г.Н.2, Бадалян О.Л.2, Бурд С.Г.2, Аксенова М.Г.1

1 – Институт Экологии Человека и Гигиены Окружающей Среды им. А. Н. Сысина, лаб. молекулярно-генетической диагностики

2 – Кафедра неврологии и нейрохирургии Л/Ф Российского Государственного Медицинского Университета

Около 10% популяции хотя бы один раз в жизни переносят эпилепти-ческие приступы, большая часть этих людей – дети, около 1% населения страдают эпилепсией. У 60% больных эпилепсией удаётся достигнуть контроля эпилептических приступов, ещё у 10-20% пациентов можно получить положительный результат, вместе с тем часто сопровождаемый нежелательными осложнениями. Одним из наиболее распространённых средств, используемых при лечении эпилепсии, является вальпроевая кислота, которая по своей структуре является аналогом жирных кислот. Механизмы противоэпилептического действия вальпроевой кислоты хорошо изучены, однако они являются многосторонними и влияют на различные звенья патогенеза эпилепсии.

Задачей данного исследования являлось изучение полиморфных локусов генов белка, связывающего кишечные жирные кислоты (FABP2) 163G>A, гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1) 3435C>T, предположительно ответственных за транспорт вальпроевой кислоты. Та-кие результаты могут сделать подбор эффективной дозы препарата более точным и уменьшить риск возможных осложнений при его применении. Скорость метаболизма вальпроата оценивалась биохимическим методом с помощью измерения пиковой концентрации препарата в крови, а также косвенно по дозе препарата, которая оказывает эффективное действие на пациента. Частоты аллелей для полиморфного маркера FABP2 163G>A составили: G – 0,72; A – 0,28.

По результатам пилотного исследования, проведённого на выборке из 30 пациентов, было установлено, что средние эффективные дозы валь-проевой кислоты для разных групп пациентов статистически достоверно различаются в два раза, составляя 750 мг для носителей генотипов AA и AG и 1500 мг для носителей генотипа GG полиморфного маркера 163G>A гена FABP2. Это позволяет предположить, что аллельные варианты гена FABP2 ответственны за разные скорости связывания вальпроевой кислоты.

153

МЕЛАТОНИН – МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МАРКЕР ВОЗРАСТНОЙ ПАТОЛОГИИ

Кветная Т.В., Князькин И.В., Голубицкая Е.С.Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

Многочисленные данные свидетельствуют о важной роли мелатони-на в регуляции физиологических и патологических процессов в живом организме. При старении происходит инволюция пинеальной железы и гипоплазия экстрапинеальных источников мелатонина, что приводит к резкому снижению продукции гормона и развитию патологических состояний, ассоциированных с возрастом, среди которых ведущее место занимают нейродегенеративные и опухолевые процессы. В связи с этим, изучение мелатонина как биологического молекулярного маркера опухо-левых и нейродегенеративных заболеваний у лиц пожилого и старческого возраста представляется крайне актуальным.

Секрецию мелатонина, используя радиоиммунологический метод с применением наборов фирмы Stockgrand Ltd (UK), оценивали по показа-телям экскреции его основного метаболита – 6-сульфатоксимелатонина в утренних пробах мочи у онкологических больных, пациентов с болезнью Альцгеймера и у лиц, не страдающих онкологическими и опухолевыми заболеваниями (953 пациента, возраст 58-92 года, средний возраст 70,0 лет).

Установлено, что уровень мелатонина прогрессивно снижается с воз-растом. При опухолевых процессах секреция МТ изменяется. Изменения носят разноплановый характер и зависят как от органной локализации опухоли, так и от степени ее дифференцировки и прогрессии. Уровень экскреции 6-сульфатоксимелатонина прогрессивно снижается при уве-личении размеров опухоли и метастазировании. Установлено, что опе-ративное удаление опухоли в 78% случаев приводит к восстановлению нормального уровня секреции мелатонина. Зарегистрированы достоверные положительные корреляции между показателями экскреции 6-сульфаток-симелатонина и пролиферативной активностью опухолей. У пациентов с болезнью Альцгеймера установлено достоверное снижение экскреции 6-сульфатоксимелатонина, достоверно коррелирующее со степенью кли-нической выраженности деменции.

Результаты исследования свидетельствуют о высокой ценности ме-латонина как биологического молекулярного маркера при диагностике, оценке прогноза и эффективности лечения патологических процессов, ассоциированных с возрастом, в частности онкологических и нейродеге-неративных заболеваний.

154

ОТ APUD-СЕРИИ ДО ДИФФУЗНОЙ НЕЙРОИММУНОЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМЫ:

ЭВОЛЮЦИЯ ЗНАНИЙ О СИГНАЛЬНЫХ МОЛЕКУЛАХ

Кветной И.М. ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург

В последние годы появляется все больше и больше свидетельств о том, что идентичные пептидные гормоны и биогенные амины синтезиру-ются нервными, иммунными и эндокринными клетками. Исторически, A. Pearse был первым, кто объединил эндокринные клетки с пептидер-гическим и аминергическим типом метаболизма, локализованные в раз-личных органах и системах организма в APUD-серию, клетки которой (апудоциты) расположены в желудочно-кишечном тракте, дыхательной системе, поджелудочной железе, коже, плаценте, мочеполовой системе, тимусе и других органах.

Применение иммуноцитохимических и радиоиммунологических ме-тодов позволило также обнаружить синтез пептидов в нейронах и, тем самым, объединить пептидергические нейроны и апудоциты в единую диффузную нейроэндокринную систему. Позднее было установлено, что нервная и иммунная система тесно взаимосвязаны через продукцию и сек-рецию множества клеточных медиаторов, включая цитокины, интегрины, хемокины и другие молекулы, которые продуцируются как в иммуноком-петентных, так и в нейроглиальных клетках.

Таким образом, очевидно, что тесные взаимосвязи трех регуляторных систем (нервной, эндокринной и иммунной) обусловлены анатомо-фи-зиологическим феноменом их представительства в каждом висцеральном органе через пептид/аминергические нейроны, иммунокомпетентные клетки и апудоциты.

Учитывая это, представляется возможным расширить понятие «диф-фузная нейроэндокринная система», заменив его понятием «диффузная нейроиммуноэндокринная система», рассматривая последнюю как струк-турно-функциональную основу нейроиммуноэндокринологии – новой на-учной биомедицинской дисциплины, интегрирующей знания о сигнальных механизмах регуляции гомеостаза.

155

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Кекеева Т.В.1, 3, Алексеев Б.Я.2, Шегай П.В.2, Залетаев Д.В.1, 3, Немцова М.В.1, 3

1 – Научно-исследовательский институт молекулярной медицины при Московской медицинской академии им И.М. Сеченова, Москва2 – Московский научно-исследовательский онкологический центр

им. Герцена, Москва3 – Медико-генетический научный центр РАМН, Москва

Введение. Обнаружение специфичных для опухоли нуклеиновых кислот в крови больных раком предстательной железы, включающих различные эпигенетические и генетические изменения, такие как гиперметилирова-ние генов-супрессоров опухолевого роста, повышение уровня экспрессии простатспецифических белков, микросателлитная нестабильность, может являться одним из направлений поиска неинвазивных диагностических маркеров РПЖ.

Цель исследования: определить частоту метилирования гена GSTP1 и уро-вень экспрессии гена PSCA в плазме крови больных раком предстательной железы и сравнить полученные данные с контролем (здоровые доноры).

Материалы и методы. Исследован 21 образец плазмы крови больных раком предстательной железы, 4 образца плазмы крови здоровых доноров методами метилчувствительной ПЦР и количественной OT-ПЦР в реаль-ном времени. Уровень экспрессии оценивался относительно эндогенного контроля (гена B2M) сравнительным Ст методом.

Результаты и обсуждения. Метилирование гена GSTP1 c высокой частотой обнаруживается в ткани опухоли и является ранним событием канцерогенеза РПЖ. Аномальное гиперметилирование этого гена найдено у больных РПЖ также в плазме крови, моче, семенной жидкости. Гипер-метилирование промотора гена GSTP1 в крови больных составило 47% (8/17). У 3-х здоровых доноров и 1 пациента с хроническим простатитом метилирование GSTP1 не обнаружено. Ген PSCA кодирует простатспеци-фичный гликопротеин, экспрессия которого у больных РПЖ многократно увеличивается. Уровень относительной экспрессии гена PSCA был проана-лизирован на 7 образцах плазмы больных и 3 образцах плазмы здоровых доноров. В 86%(6/7) случаев количество мРНК гена PSCA в крови больных РПЖ по сравнению с контролем увеличено в 10 – 102 раз.

Заключение. Мониторинг опухолеспецифичных генетических изменений в плазме крови может иметь важное значение для неинвазивной детекции РПЖ на ранних стадиях. Предварительные результаты настоящей работы свидетельствуют о высокой чувствительности применяемых методов для выявления опухолеспецифической ДНК и мРНК в плазме крови.

156

ВОЗМОЖНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ ПРИ

ДИЛАТАЦИОННОЙ КАРДИОМИОПАТИИКириллов А.М., Коротеев А.В., Фатхудинов Т.Х., Гольштейн Д.В.,

Ржанинова А.А., Долотов В.К., Белянко И.Э., Сандриков В.А.ГУ «Российский научный центр хирургии РАМН»

НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий»ЗАО «Реметэкс»

Лечение застойной сердечной недостатточности одна из наиболее важных задач современной кардиологии и кардиохирургии. Исследование «Эпоха» показало, что от момента постановки диагноза «дилатационная кардиоми-опатия» пятилетняя выживаемость больных составляет менее 10%. В 2005 году Ученым советом и Этическим комитетом РНЦХ РАМН был утвержден протокол клинических исследований по изучению эффективности при-менения клеточных технологий для лечения сердечной недостаточности при дилатационной кардиомиопатии (ДКМП). На обсуждение выносится концепция клеточной терапии при ДКМП и протокол клинического иссле-дования применения аллогенных пренатальных мезенхимальных стволовых клеток и скелетных миобластов при данном заболевании.

Протокол исследования: Дизайн - проспективное, рандомизирован-ное, контролируемое исследование. В исследование включаются паци-енты с дилатационной кардиомиопатией и сердечной недостаточностью 2 – 4 ф/к по NYHA, условием включения является отсутствие хирур-гических вмешательств и других радикальных воздействий на организм пациента в течении 3 мес до трансплантации клеток и в период проведе-ния исследования. Точки наблюдения – 1, 3, 6 и 12 месяцев. Пациенты рандомизируются в три группы: 1 группа – интракоронарное введение 1х109 пренатальных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, 2 группа – интракоронарное введение 1х109 пренатальных скелетных миобластов, 3 группа – контрольная (проведение диагностической коро-нарографии). В настоящий момент в первую группу вошли 3 пациента, во вторую – 2, в третью – 1.

Методы исследования: наряду с динамическим расширенным кли-нико-лабораторным обследованием пациента проводятся комплексная эхокардиография, велоэргометрия в сочетании со спирометрией и эхокар-диографией, определение концентрации мозгового натрийуритического пептида в плазме крови (BNP).

Предварительные результаты: в первой и второй группах на протяжении от 0 до 3 мес наблюдения отмечалось снижение потребности больных в приеме мочегонных препаратов. В первой группе у двух пациентов была отмечена регрессия сердечной недостаточности с 2-го ф.к. в 1-ый ф.к.,

157

прирост фракции выброса (ФВ) составил 8 и 10% соответственно; больной, находившийся в 4-ом ф.к. прешел в 3-ий ф.к. (ФВ+7%).

Оба пациента рандомизированные во вторую группу находились в 4-ом ф.к. У одного больного было отмечено улучшение состояния и регрессия сердечной недостаточности до 2-го ф.к. в сроки 1,5 – 2,5 месяца после введения клеток с последующей отрицательной динамикой и возвратом к 4 ф.к.. Второй больной, находившийся в исходе в крайне тяжелом состо-янии (300 мг петлевых диуретиков в сутки) был выписан из стационара, доза диуретических препаратов была уменьшина более чем в 4 раза, при-рост ФВ составил 5%.

У всех пациентов в опытных группах концентрация BNP после имплан-тации культуры клеток значительно снижалась, была отмечена высокая кор-реляция между данными о резерве кардиореспираторной системы и концен-трацией мозгового натрийуритического пептида в плазме крови (r=0,82).

Больной рандомизированный в контрольную группу не отмечал изме-нений в своем состоянии, лабораторные и инструментальные оставались прежними.

НОВЫЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ БИОПРЕПАРАТЫ, СОЧЕТАЮЩИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ И

АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА

Киселев С.М., Дигтярь А.В., Луценко Е.В., Фельдман Н.Б., Луценко С.В., Северин С.Е.

Московский НИИ медицинской экологии, Москва

Современные представления о патогенезе опухолевого процесса поз-воляют расширить спектр мишеней противоопухолевого воздействия, одной из которых являются структурные элементы кровеносных сосудов, образующихся в опухоли. Разработка подходов к созданию биопрепара-тов, сочетающих в своей структуре антиангиогенный и цитотоксический компоненты может позволить достичь более высокой эффективности лекарственного воздействия и реализовать в одном препарате идею ком-бинированной терапии злокачественных новообразований.

Цель работы: получение ковалентных конъюгатов ингибиторов ангио-генеза – ангиостатина и эндостатина с противоопухолевым антибиотиком доксорубицином (ДР) и изучение их активности in vitro.

Материалы и методы: Ангиостатин получали путем ферментативного расщепления плазминогена человека эластазой. Эндостатин получали в виде рекомбинантного белка стандартными генно-инженерными методами. Очищенные белки конъюгировали с ДР, используя глутаровый альдегид в

158

качестве сшивающего реагента. Очистку целевых конъюгатов проводили методом гель-фильтрации на сорбенте Sephadex G-25. Цитотоксическую активность полученных препаратов изучали на клеточных линиях карцино-мы предстательной железы человека линии DU145 и карциномы молочной железы человека линии MCF-7.

Результаты: Разработан метод получения конъюгатов антиангиоген-ных полипептидов с цитотоксическим химиопрепаратом ДР. Получены высокоочищенные конъюгаты ангиостатина и эндостатина с ДР с мо-лярным соотношением 1:3 и 1:1 соответственно. Выявлена выраженная цитотоксическую активность конъюгатов в отношении опухолевых клеток исследуемых линий DU145 (IC50 = 0,13 мкМ и 0,28 мкМ для конъюгатов ангиостатин-ДР и эндостатин-ДР) и MCF-7 (IC50 = 0,12 мкМ и 0,31 мкМ, соответственно).

Заключение: Апробирован новый подход к моделированию противо-опухолевых биопрепаратов, заключающийся в ковалентном связывании антиангиогенного (ангиостатин, эндостатин) и цитотоксического (ДР) компонентов. В качестве сшивающего реагента предложен глутаровый альдегид, образующий кислотолабильную связь между конъюгируемыми компонентами, что способствует контролируемому высвобождению ак-тивных компонентов в очаге развития опухоли.

НОВЫЕ ПОДХОДЫ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РАКА

Киселев Ф.Л.НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН

Рак – заболевание генетического аппарата клетки и во всех опухо-лях выявлены те или иные нарушения в структуре этого аппарата или в функциональной активности генов, участвующих в контроле клеточной пролиферации. Расшифровка структуры генома человека позволила иден-тифицировать многие гены, мутации в которых играют ключевую роль в превращении нормальных клеток в опухолевые. Классическим примером такого типа являются мутации в «горячих точках» гена р53 в различных типах опухолей, мутации в генах BRCA 1 и BRCА 2 в опухолях молочных желез и яичников и многие другие.

Обнаружение мутаций в гене имеет важное значение для клиники, т.к. может быть маркером предрасположенности к данному типу рака и ранним диагностическим маркером (в этом случае важная роль принадлежит методу олигонуклеотидных микрочипов) и может служить также прогностическим фактором. Основная трудность – это сам поиск мутаций и дискриминация между функционально значимыми и «бессмысленными» мутациями.

159

В последнее время накоплен огромный экспериментальный и клиничес-кий материал свидетельствующий о том, что анализ экспрессии генов в опухо-левых клетках имеет решающее значение как для верификации диагноза, так и для выбора правильной тактики лечения. Метод экспрессионных микрочипов имеет ряд преимуществ, существенных для внедрения в регулярную практику онкологических клиник. Его использование дает возможность анализировать одновременно экспрессию всех генов клетки, вычление кластеров генов, спе-цифичных для опухолей различных локализаций или определенных стадий каждой индивидуальной опухоли, и создание упрощенных диагностических вариантов микрочипов, содержащих не более 100 –1000 генов. Паттерн экс-прессии генов может определять спектр чувствительности к различным хи-миопрепаратам и определять тактику лечения, проводить целенаправленный поиск новых ген-направленных противоопухолевых препаратов, верифици-ровать диагноз в сложных случаях, прогнозировать течение процесса.

Имеющиеся данные позволяют считать, что генетический портрет каж-дой опухоли индивидуален и можно предполагать, что последовательное использование различных схем лечения, направленных на группы генов, активирующихся на разных стадиях опухолевого процесса, позволит продлевать жизнь больного на 15 – 20 лет, превратив рак из летального заболевания в хроническое.

ВОЗМОЖНОСТЬ ИНДИКАЦИИ ВИРУСНЫХ ПАТОГЕНОВ ПРИ ПОМОЩИ АТОМНОЙ СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ И

ГАЗОРАЗРЯДНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ (ЭФФЕКТ КИРЛИАНА)

Клименко С.М.1, Цилинский Я.Я.1, Маныкин А.А.1, Лисицын Ф.В.1, Суэтина И.Н.1, Богдасарова О.В.2, Богдасаров О.Е. 2, Девятков В.В. 2

1 – ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 2 – МГТУ им. Н.Э.Баумана

Введение: Биотерроризм, это угроза, для предотвращения которой необходимо использовать весь арсенал современной науки. Предметом нашей работы является применение для диагностических целей атомной силовой микроскопии (АСМ), просвечивающей электронной микроско-пии (ПЭМ) и основанном на эффекте Кирлиана методе газоразрядной визуализации (ГРВ).

Цель исследования: Определение различий морфологических и физико-химических свойств инфицированных и контрольных клеток с помощью анализа поверхности методом АСМ и ГРВ; создание ГРВ-аппаратуры и получение Кирлиан свечения (КС), для изучения указанных объектов.

160

Материалы и методы: Вирусы Венесуэльского энцефаломиелита лоша-дей (ВЭЛ), краснухи, осповакцины, папилломавирусы и восприимчивые клетки: перевиваемые фибробласты кожи человека (ПФКЧ), клетки VERO, BHK-21 и клетки плоского эпителия человека. Атомный силовой микроскоп NT-MDT Solver 47 Bio, эектронный микрокоп Jeol 100S. Часть материала исследовали параллельно при помощи АСМ и ПЭМ. Разрабо-танный авторами прибор ГРВ, с помощью которого КС регистрировалась на цифровую кинокамеру и анализировалась на ЭВМ программе. Опреде-лялась площадь свечения, распределение яркости, а так же красная, синяя и зеленая составляющие видимого спектра излучения.

Результаты и обсуждение: АСМ-изображения ПФКЧ представляли собой поверхность клетки, на которой легко идентифицировалось ядро, с хорошо видимыми ядрышками, четко очерченные вакуоли, распреде-ленные по периферии цитоплазмы, и клеточная мембрана с типичными для фибробластов остроконечными выступами, фиксирующими клетку на стекле. При изучении ультратонких срезов того же материала мы наблю-дали предшественников вирионов вируса ВЭЛ в контакте с мембраной вакуолей. Полученные ультраструктурные данные о поверхности инфи-цированных фибробластов и внутренней структуре цитоплазмы показали, что АСМ-метод может быть использован для идентификации зараженных вирусом и неинфицированных клеток, а также для выявления различий между ними. Исследования клеток плоского эпителия, зараженных ви-русом папилломы человека (коилоцитов), были проведены на стандарт-ных цитологических препаратах и сопоставлены с АСМ-изображением. Дополнение цитологической картины инфицированных клеток плоского эпителия трехмерной картиной клеточной поверхности, полученной в АСМ, позволили существенно улучшить точность диагностики. ГРВ-граммы контрольных культур и клеток ПФКЧ, зараженных вирусом ВЭЛ, отличались визуально по площади свечения. При обработке результатов по ЭВМ программе, выявлены различия по спектральному распределению яркостей и красной составляющей видимого спектра излучения. ГРВ-граммы клеток, инфицированных вирусом осповакцины, также имели свою специфику. По предварительным данным, создается возможность дифференцировать РНК и ДНК геномные вирусы по КС.

Заключение: Использование новейших физических методов – АСМ и ГРВ для анализа морфологических и физико-химических свойств ин-фицированных вирусами клеток, а также их энерго-информационной активности позволит, в конечном итоге, разработать новые способы диа-гностики вирусных инфекций, повысив их точность и сократить время получения результата.

161

ИНТЕНСИВНОСТЬ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ СЫВОРОТКИ У ДЕТЕЙ С ВПЕРВЫЕ УСТАНОВЛЕННЫМИ

АЛЛЕРГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ Князева Т.Д., Хрипач Л.В., Иванов В.Д., Маковецкая А.К.

ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН, Москва

Интенсивность люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) является одним из общепринятых маркеров нарушения оксидантного равновесия организма. Существует достаточно большое количество лите-ратурных данных, свидетельствующих о наличии сложных двусторонних связей между аллергическими процессами и свободнорадикальными реакциями, опосредованными активным кислородом (Horejsi et al., 1997; Yoshimaru et al., 2002; Marcal et al., 2004; Swindle et al., 2004; Nadeem et al., 2005; Janssen-Heininger et al., 2005).

Цель исследования: изучение возможных связей между интенсивностью ЛЗХЛ сыворотки, иммунными показателями состояния организма и различ-ными сопутствующими факторами у московских детей с впервые устанавли-ваемыми аллергическими заболеваниями.

Результаты: По данным измерения интенсивности ЛЗХЛ сыворотки веноз-ной крови (индуктор – перекись водорода) у 83-х московских детей в возрасте от 1 до 16 лет с впервые установленными аллергическими заболеваниями мы не нашли достоверных корреляционных связей между интенсивностью хемилюми-несценции сыворотки и следующими показателями: содержанием в сыворотке иммуноглобулинов А, G и Е; соотношением IgE/IgG, выраженностью кожных реакций к причинно-значимым антигенам (как при анализе матрицы данных в целом, так и внутри подвыборок детей с разными диагнозами – бронхиальной астмой, аллергическими дерматитами, поллинозами и сочетанием двух и более аллергических процессов). Только в группе детей, уже имевших какое-либо аллергическое заболевание, интенсивность ЛЗХЛ сыворотки была несколько увеличена (p<0,15) по сравнению с остальными подвыборками. Были найдены достоверные регрессионные связи между ЛЗХЛ сыворотки детей и следующими факторами: 1) индексами загрязнения атмосферы химическими соединениями по месту проживания детей; 2) интенсивностью курения матерей (но не отцов и не фактом курения в квартире).

Выводы: По-видимому, в начальной стадии аллергических заболеваний патологический процесс еще не генерализован, по крайней мере с точки зрения нарушения оксидантного равновесия в периферической крови. Уве-личение скорости свободнорадикальных реакций под влиянием курения мате-рей, возможно, связано с внутриутробным воздействием. Семьям, имеющим детей с аллергическими заболеваниями, необходимо учитывать экологические характеристики московских районов при обмене и получении жилья.

162

ОЧИСТКА БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА ИЗ ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА

В ПРИСУТСТВИИ АМИКАЦИНА СУЛЬФАТА

Коваленко Н.А.1, Обухова В.В.2, Косенков Д.А.3, Дарбинян Т.Г.3, 6, Ляшенко А.А.4, Абакумова О.Ю.5, Добровольская О.В.3, Северин Е.С.2, 6,

Кешелава В.В.7

1 – НИЦ кафедра урологии ММА им. И.М.Сеченова, г. Москва2 – Кафедра биохимии ММА им. И.М.Сеченова, г. Москва

3 – Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии 4 – НИИ Молекулярной Медицины ММА им. И.М.Сеченова, г. Москва

5 – НИИ Биомедхимии, г. Москва6 – Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, г. Москва

7 – РНЦ рентгенорадиологии МЗ РФ

Белки теплового шока (БТШ) являются антиапоптотическими опухо-левыми белками; уровень их синтеза значительно повышен в опухолевой ткани по сравнению с таковым в нормальной ткани. Противоопухолевый иммунитет обусловлен наличием опухоль-ассоциированных пептидов, образующих комплексы с БТШ. Кроме того, наличие рецепторов к БТШ на поверхности антиген-презентирующих клеток позволяет представлять широкий репертуар опухолевых пептидов в комплексе с БТШ, которые вносят специфику в распознавание опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами.

Разработан способ выделения и очистки БТШ из опухолевой ткани молочной железы человека; он включает в себя гомогенизирование, высаливание, гель-фильтрацию и аффинную хроматографию на гепарин-сефарозе. Условия очистки позволили получить фракцию, обогащенную тремя видами БТШ – БТШ70, БТШ90, БТШ96. Введение при очистке БТШ антибиотика (амикацина сульфата) увеличивает выход полнораз-мерных БТШ.

Для тестирования возможной цитотоксичности и стимуляции пролифе-рации выделенными БТШ использованы различные типы клеток – опу-холевые (НГУК1, Hela-Gal, MCF7, K-562) и нормальные эмбриональные фибробласты человека. Показано, что протестированные белковые пре-параты не обладают цитотоксическим действием и не изменяют синтез ДНК по сравнению с контролем.

Таким образом, выделенные БТШ не обладают токсичностью, не оказывают влияния на пролиферацию клеток. Использование амикацина сульфата при очистке БТШ не оказывает влияния на процесс выделения БТШ, вместе с тем увеличивая выход полноразмерных белков.

163

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАТОГЕНЕЗА ЛЕГОЧНОГО ФИБРОЗА, ПРЕДРАКА И РАКА ЛЕГКОГО

Коган Е.А.ММА им. И.М.Сеченова, г. Москва

Основываясь на морфологическом и имунногистохимическом изучении 175 случаев идиопатического фиброзирующего альвеолита, установлены особенности патогенеза идиопатического легочного фиброза (ИЛФ) и различных идиопатических интерстициальных пневмониях. Первичное повреждение легочной ткани при ИЛФ превалирует в интерстиции за счет гиперпродукции протеаз, активных форм кислорода, TNF-α интерстици-альными макрофаги и нейтрофилами. При этом альвеолярный и бронхио-лярный эпителий повреждаются в меньшей степени. Склероз интерстиция при ИЛФ потенцируется экспрессией стромальными и эпителиальными клетками факторов роста (инсулиноподобного фактора роста I, TGF-α, фактора роста фибробластов), которые вместе с стимуляцией склероза интерстиция, стимулируют гиперплазию эпителиальных клеток. На поз-дних стадиях ИЛФ в ответ на гиперпродукцию факторов роста уже как в интерстиции, так и в эпителии, интерстиций преобразовывается в сотовое легкое эпителий же отвечает аденоматозной гиперплазией альвеолярного эпителия и атипической аденоматозной гиперплазией, которая может стать основой для развития бронхиоло-альвеолярного рака легкого. При деск-вамативной интерстициальной пневмонии гиперактивированные альвео-лярные макрофаги выделяют биологически активные вещества (протеазы, активные формы кислорода, TNF-α ) и в большей степени повреждается альвеолярный эпителий и минимально легочный интерстиций. В свою очередь эпителий отвечает на повреждение гиперплазией пневмоцитов 2-го порядка, десквамацией пневмоцитов 2-го порядка в просвет альве-ол. При облитерирующем бронхиолите с организующейся пневмонией в первую очередь поражается паренхима легкого вокруг терминальных бронхиол и альвеолярных ходов за счет активации интерстициальных макрофагов. В позднюю стадию заболевания вторично происходит склероз интерстиция (экспрессия TGF-α в легочном интерстиции 2 балла). Для неспецифической интерстициальной пневмонии характерно повреждение интерстиция уже с самых ранних стадий заболевания, воспалительная инфильтрация. Поздняя стадия проявляется выраженным гомогенным склерозом интерстиция, при этом ответ эпителия минимален на всем протяжении болезни.

164

МЕЖДУНАРОДНОЕ СОТРУДНИЧЕСТВО – ЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ СНИЖЕНИЯ УГРОЗЫ

РАСПРОСТРАНЕНИЯ ОРУЖИЯ МАССОВОГО ПОРАЖЕНИЯ, ТЕХНОЛОГИЙ И ПРОДУКЦИИ ДВОЙНОГО

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Короткин Л.М.ОАО «Биопрепарат», Москва

После периода «холодной войны», на фоне благоприятной политичес-кой обстановки международным сообществом были созданы ряд догово-ренностей (режимов), направленных на решение проблем нераспростра-нения оружия массового поражения (ОМП), а также контроля за чувс-твительными материалами, оборудованием, технологиями, технической информацией, которые могут быть использованы для создания ОМП.

В настоящее время в области предотвращения распространения ОМП действуют четыре основных международных режима: 1. Группа ядерных поставщиков (ГЯП). 2. Режим контроля за ракетной технологией (РКРТ). 3. Вассенаарские договоренности по экспортному контролю за обычны-ми вооружениями, товарами и технологиями двойного применения. 4. Австралийская группа – контроль за распространением химического и биологического оружия.

Россия являясь членом первых трех режимов, но пока не входит в Авс-тралийскую группу. Указанные режимы внесли важный вклад в снижение риска распространения ядерного, химического и биологического оружия, а также материалов и технологий двойного использования.

Особое внимание хотелось бы обратить внимание на Режим нераспро-странения биологического оружия, в основе которого лежит Конвенция о запрещении разработки, производства и накопления бактериологического (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении (КБТО), при-нятая в 1972 году. При разработке КБТО были учтены положения Протоко-ла о запрещении использования на войне удушающих, ядовитых и прочих газов и бактериологических методов ведения боевых действий (Женевский протокол), принятого в 1925 г. и вступившего в силу в 1928 г.

Важнейшим компонентом всей международной деятельности по не-распространению ОМП является наличие национальных политических и законодательных структур, в деятельности которых нашло отражение согласие, достигнутое международным сообществом в вопросе передач опасных материалов и чувствительных технологий.

В России такой структурой является система экспортного контроля, представляющая собой комплекс мер, обеспечивающих предотвращение несанкционированного вывоза за рубеж товаров, информации, работ,

165

услуг и результатов интеллектуальной деятельности, которые могут быть использованы при ОМП, средств его доставки, иных видов вооружения и военной техники.

Российская Федерация рассматривает задачу нераспространения ОМП, как ключевую с точки зрения своих национальных интересов, сохранения международной стабильности и безопасности в целом.

Основой для деятельности в России системы экспортного контроля за товарами двойного применения биологического профиля в настоящее время являются:

- Федеральный закон Российской Федерации «Об экспортном контро-ле» от 19 июля 1999 г. № 183-ФЗ;

- Указ Президента Российской Федерации от 8 августа 2001 г. № 1004 «Об утверждении Списка возбудителей заболеваний (патогенов) человека, животных и растений, генетически измененных микроорганизмов, токси-нов, оборудования и технологий, подлежащих экспортному контролю»;

- Указ Президента Российской Федерации от 5 мая 2004 г. № 580 «Об утверждении Списка товаров и технологий двойного назначения, которые могут быть использованы при создании вооружений и военной техники и в отношении которых осуществляется экспортный контроль»;

- и еще 12 законодательных и нормативных документов.Чтобы международно-правовая база стала еще более эффективным

инструментом контроля за биотехнологической продукцией двойного ис-пользования, необходима системная модификация современных договоров и соглашений и их обновление с учетом, как новых политико-экономичес-ких условий, так и прогресса в области генной инженерии, биотехнологии и молекулярной биологии.

166

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ МИКРОДИССЕКЦИИ И ДНК-ЧИПОВ ДЛЯ ВЫЯСНЕНИЯ ТОЧЕК РАЗРЫВОВ

В СЛУЧАЯХ МАЛЕНЬКИХ СВЕРХЧИСЛЕННЫХ МАРКЕРНЫХ ХРОМОСОМ ЧЕЛОВЕКА (sSMC)

Косякова Н.В.1, Штарке Х.2, Лир Т.2, Вермееш Й.Р.3, Бакс Л.3, Мелотте C.3

1 – Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Россия2 –Институт генетики человека и антропологии Университета

им. Фридриха Шиллера г. Йены, Йена, ФРГ3 – Центр генетики человека, Университетский госпиталь Gasthuisberg,

Лёвен, Бельгия

Маленькие сверхчисленные маркерные хромосомы (sSMC) человека это морфологически гетерогенная группа структурно аномальных хромосом. Фенотип носителя маркерной хромосомы может варьировать от нормаль-ного до тяжелой степени патологии в зависимости от генетического со-става маркера. Происхождение sSMC практически невозможно установить стандартными методами цитогенетики; с этой целью применяют флуорес-центную гибридизацию in situ (FISH), включая обратную гибридизацию с микродиссекционными зондами. Недавно разработанная технология ДНК-чипов с использованием матрицы из 3500 BAC клонов, покрываю-щей человеческий геном с разрешением в 1 Mb, позволила существенно продвинуться в изучении хромосомного дисбаланса. Мы сообщаем об опыте применения микродиссекции и метода ДНК-чипов для установле-ния точек разрыва, вовлеченных в формирование маркерных хромосом человека. ДНК-библиотеки из sSMC получали с помощью механической микродиссекции. Все диссектированные фрагменты амплифицировали (ПЦР с частично вырожденным праймером) и метили (биотин-дУТФ). Полученные фрагменты ДНК тестировали методом обратной in situ гибри-дизации на метафазных хромосомах пациента и здорового донора. В общей сложности было диссектировано 9 маркеров, происходящих из различных хромосом. Обратная in situ гибридизация подтвердила результаты, предва-рительно полученные с использованием центромерспецифичных зондов и многоцветной FISH (cenM-FISH, subcenM-FISH) и многоцветной ис-черченности (MCB). Точки разрыва могли быть локализованы в участках размером всего 0.3÷1.5 Mb.

Авторы выражают благодарность DFG (грант 436 RUS 17/109/04) за финансовую поддержку, а также Mapping Core и Map Finishing группы из Wellcome Trust Sanger Institute за предоставление и верификацию кло-нов.

167

ПЕРВЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ ИНФЕКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ

БАКТЕРИЯМИ РОДА BARTONELLA В РОССИИ

Круглов А.Н., Осадчая В.А., Фролова Г.П., Бармина Г.В., Морозова О.А., Смирнов Г.Б., Башкиров В.Н., Марков А.П.,

Лопырев М.В., Кириллов М.Ю., Kosoy M.ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, ГНИИ ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи

Centers for Disease Control and Prevention, Fort Collins, Colorado (США)

Представители рода Bartonella были впервые описаны около 100 лет назад как типичные возбудители трансмиссивных антропонозов. Извест-но, что такие виды как Bartonella quintana, bacilliformis вызывают окопную или волынскую лихорадку, болезнь Карриона и бациллярный ангиоматоз. B. henselae – причина болезни кошачьей царапины. До недавнего вре-мени считалось, что другие представители этого рода, вызывая мощные эпизоотии в природе, у человека вызывают заболевания довольно редко. Однако, за последние 10 лет в мировой литературе появилось большое число сообщений о том, что вызываемые бартонеллами инфекционные заболевания характеризуются широким спектром симптомов, включая инфекционный эндокардит, хроническую бактериемию, лихорадочные состояния, патологию кожных покровов, лифоаденопатию и другие изме-нения со стороны центральной нервной системы, печени, глаз и костной ткани. Особенно выражено инфекция протекает и иммунокомпременти-рованных пациентов. В современное время, когда велик риск иммуно-супрессий, глобальных катаклизмов, сопровождающихся скученностью людей и антисанитарией, перспектива массовых заболеваний, вызванных бартонеллами, весьма велика.

В рамках международного проекта МНТЦ при поддержке фонда БТЕП Министерства здоровья США, проводилось изучение распространенности бартонелл в природе среди мелких грызунов, а так же среди пациентов клиник ММА с диагнозами «инфекционный эндокардит», «лихорадка неясного генеза». Основными методами исследования были: культивиро-вание биологических образцов на культурах клеток Vero, культуральное выделение на бифазных системах в атмосфере 10% СО2, определение титра антител методом непрямой иммунофлюоресценции, ПЦР с 4-мя парами специфических праймеров и RFLP.

Было проанализировано 103 образца крови мелких грызунов из мос-ковского региона. Обследовались 95 больных с инфекционным эндокар-дитом и лихорадкой неясного генеза, у которых, с их информированного согласия, бралась на исследование кровь, собирались эпидемиологический анамнез и данные клинического обследования.

168

Методом ПЦР с праймерами 16SrDNA, gltA, ftsZ, и ribC была показана зараженность мелких грызунов бактериями рода Bartonella в 74% случаев. Видовую принадлежность штаммов установили с использованием RFLP и определили близость всех выделенных штаммов к B.grahamii (7случаев) и B.teilori (14 случаев). В остальных культурах обнаружен микст обоих видов бартонелл.

Среди пациентов клик ММА с помощью клеточного культивирова-ния было выделено 2 культуры Bartonella от женщин 20 и 30 лет. У одной имелось подозрение на инфекционный эндокардит, вторая, с симптома-тикой лихорадки неясного генеза, незадолго до болезни была поцарапана домашней кошкой. Состояние их было средней тяжести, субфебрилитет не превышал 38,2° С. После терапии цефалоспоринами 3-го поколения обе выздоровели и были выписаны. В сыворотках больных определен диагностически значимый титр антител к B. vinsonii – 1/64. Биохимичес-кие свойства и антимикробная чувствительность обоих штаммов были типичными для рода Bartonella. Методами ПЦР с 4-мя парами праймеров и RFLP была установлена их принадлежность к B. vinsonii subsp. arupensis. Из литературы известно только о 2-х случаях выделения бартонелл этого вида от больных людей: в Вайоминге США в 1999 г. от пациента с выра-женной лихорадкой и во Франции в 2005 г. от больного инфекционным эндокардитом.

Таким образом, в результате нашей работы установлены:• Высокая распространенность бартонелл среди диких грызунов. • Впервые в России достоверно определена заболеваемость бартонел-

лезом среди людей. Полагаем, что бартонеллы, как реэмерджентная инфекция, несут в

себе потенциальную угрозу здоровью населения и в перспективе должны тестироваться у всех больных, подозрительных на бартонеллез.

169

ФАКТОР РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ (VEGF) В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ОПУХОЛЯМИ КОСТЕЙ

Кузнецов И.Н., Соловьев Ю.Н., Булычева И.В., Борисов Д.А., Руссо Е.Ю.ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Цель исследования – сравнительный анализ содержания VEGF в сы-воротке крови больных остеогенной саркомой и доброкачественными новообразованиями костей.

Материал и методы. В исследование включены образцы сыворотки крови 38 больных остеосаркомой, 9 больных доброкачественными новообразова-ниями костей и 25 практически здоровых людей (группа контроля). Возраст больных был в пределах от 15 до 72 лет, среди них мужчин 26 (55,3%), жен-щин – 21 (44,7%). Опухоли чаще всего располагались в длинных трубчатых костях: бедренной – 24 (51,1%), большеберцовой – 10 (21,3%), малобер-цовой – 2 (4,3%), плечевой – 4 (8,5%). Реже в плоских костях: крестце – 2 (4,3%), костях таза – 2 (4,3%), лопатке – 1 (2,1%). Также опухоли выяв-лены в реберных костях и локтевой кости – по одному наблюдению (2,1%). В группу контроля вошли 25 практически здоровых человек, из них 16 (64%) мужчин и 9 (36%) женщин. Возраст обследуемых колебался в пределах от 17 до 60 лет. Концентрацию VEGF определяли до лечения в сыворотке крови иммуноферментным методом реактивами фирмы «R&D» (США). Анализ гистологического строения опухолей костей проводили на основе Международной классификации новообразований костей (ВОЗ, 1987г.). Статистическую обработку данных проводили, используя как параметричес-кие, в случае нормального распределения данных, так и непараметрические критерии, в случаях, когда данные не подчинялись критериям гауссовского распределения. Расчеты проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windows, Version 5.1». Во всех случаях различия считали до-стоверными при уровне вероятности большим 95%, т.е. p<0,05.

Результаты. Обнаружено, что показатели VEGF в сыворотке крови больных остеогенной саркомой достоверно выше, чем у здоровых людей и больных доброкачественными новообразованиями костей. Не найдено какой-либо зависимости между содержанием сывороточного VEGF у обследованных пациентов с полом и возрастом. Уровень VEGF в сыворотке крови больных остеогенной саркомой с метастазами достоверно выше, чем у пациентов без метастазов. Впервые получены доказательства о существовании достоверной разницы между концентрацией VEGF у больных с метастазами остеосаркомы, возникшими в период наблюдения до года (от начала лечения), и пациентов с метастазами, возникшими в более поздние сроки (р<0,05).

Заключение. Доказана тесная связь между концентрацией VEGF в сыворотке крови больных остеогенной саркомой до лечения и временем метастазирования этой опухоли.

170

ПОИСК И ХАРАКТЕРИСТИКА НОВЫХ МАРКЕРОВ МЕТИЛИРОВАНИЯ И ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В

КАНЦЕРОГЕНЕЗ, МЕТОДОМ МЕТИЛЧУВСТВИТЕЛЬНОГО ПЦР-ФИНГЕРПРИНТИНГА

Кузнецова Е.Б., Стрельников В.В., Дрозд О.В., Немцова М.В., Залетаев Д.В.НИИ Молекулярной медицины, Московская Медицинская Академия

им. И.М.Сеченова, Москва

Введение. Одной из главных задач онкогеномики является создание панелей молекулярных диагностических маркеров, позволяющих эффек-тивно дифференцировать различные типы злокачественных новообразо-ваний. Решение этой задачи сопряжено с идентификацией новых генов, вовлеченных в канцерогенез.

Цель исследования: поиск и характеристика новых маркеров метили-рования и генов, вовлеченных в канцерогенез.

Материалы и методы. Исследовано 74 образца рака молочной железы (РМЖ), 32 образца нормальной ткани молочной железы, и 30 образцов периферической крови здоровых доноров. Для поиска дифференциально метилированных CpG-островков применена разработанная нами моди-фикация метода метилчувствительного фингерпринтинга (МЧФП). Оп-ределение нуклеотидных последовательностей и анализ экспрессии генов проводились на оборудовании и по протоколам фирмы Applied Biosystems (США). Для определения статуса метилирования конкретных CpG-ост-ровков применялись метилчувствительная ПЦР и метилспецифическое секвенирование.

Результаты и обсуждение. Выявлено аномальное метилирование CpG-островков генов LAMC3, LAMR1, SEMA6B, CACNG4, KCNH2, PSMF1, BIN1 и VCIP135. Метилирования этих CpG-островков в крови здоровых доноров и в нормальной ткани молочной железы не обнаружено. В образ-цах РМЖ метилирование промоторной области гена LAMC3 выявлено в 8% , SEMA6B в 38%, VCIP135 в 17%, BIN1 в 22% и KCNH2 в 7% случаев. Промоторные области генов LAMR1, CACNG4 и PSMF1 метилированы в единичных случаях (менее 5%). Показано достоверное снижение экс-прессии генов LAMC3 или SEMA6В при РМЖ, что является прямым доказательством вовлечения этих генов в процессы канцерогенеза.

Заключение. Выявлена эпигенетическая патология восьми генов при РМЖ, доказана опухолеспецифичность обнаруженных нарушений.

171

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СОДЕРЖАНИЯ ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ В КРОВИ ЗДОРОВЫХ

ЛЮДЕЙ И БОЛЬНЫХ ОСТЕОСАРКОМОЙ

Кузнецова О.М., Березов Т.Т., Кушлинский Н.Е., Соловьев Ю.Н.Кафедра биохимии медицинского факультета РУДН

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Рост солидных опухолей, а так же процессы инвазии и метастазиро-вания зависят от ангиогенеза, процесса формирования и роста новых кровеносных сосудов. Среди известных ангиогенных факторов выделяют фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), который играет центральную роль в процессе неоангиогенеза.

Цель исследования – сравнительный анализ содержания фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в сыворотке крови больных остеосаркомой, доброкачественными новообразованиями и практически здоровых лю-дей.

Материалы и методы: исследованы образцы сыворотки крови 38 боль-ных остеосаркомой (без отдаленных метастазов), 9 пациентов с добро-качественными новообразованиями и 25 практически здоровых людей (группа контроля). Концентрацию VEGF в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного метода с использованием набора реактивов фирмы R&D (США). Клинико-рентгенологический диагноз остеосаркомы у всех больных подтвержден данными гистологического исследования опухоли на основе Международной классификации новообразований костей (ВОЗ, 1987).

Результаты исследования: Наиболее высокие значения VEGF были обнаружены в группе больных остеосаркомой (медиана 190,14 пг/мл), а наименьшие - в группе пациентов с доброкачественными новообразовани-ями (77,64 пг/мл) и группе контроля (126,4 пг/мл). При сравнении средних показателей VEGF в группах не обнаружено статистически достоверных различий в зависимости от пола и возраста. В группе больных остеосар-комой концентрация VEGF у пациентов с метастазами оказалась выше, чем у пациентов без метастазов (р<0,05), причем концентрация VEGF в случаях, когда метастазы возникли в период до года, была выше, чем в случаях, когда метастазы возникли в более поздний период (р<0,05).

Выводы: продукция VEGF значительно повышена у больных остео-саркомой по сравнению с таковой у пациентов с доброкачественными новообразованиями и здоровыми людьми. Очевидна прогностическая значимость показателя VEGF в сыворотке крови больных остеосаркомой в оценке раннего гематогенного метастазирования.

172

ПОИСК МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ПРИ РАКЕ МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ

Кузнецова О.А1., Башкатов С.В.2, Карякин О.Б.2, Теплов А.А.3, Ульянов Р.В.3, Морозов А.А.3, Немцова М.В.1,4

1– НИИ молекулярной медицины при Московской Медицинской Академии им. И.М. Сеченова

2 – Медицинский радиологический научный центр РАМН 3 – ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена

4 – Медико-генетический научный центр РАМН

Введение. Рак мочевого пузыря (РМП) является одним из наиболее тяжелых онкологических заболеваний и по частоте встречаемости занимает пятое место среди злокачественных опухолей. Мужчины страдают этой формой опухоли в три раза чаще женщин. Такие повреждения ДНК как мутации и делеции, приводящие к нарушению функции генов, характерны для разных типов опухолей. Поэтому поиск молекулярно-генетических маркеров связанных с ранним выявлением, клиническим течением и прогнозированием РМП является важной задачей, стоящей перед моле-кулярной генетикой.

Цель исследования: определить мутации в гене FGFR3 (7 и 10 экзоны) в материале опухоли мочевого пузыря, а также изучить потерю гетерози-готности (ПГ) в области локализации гена TP53, которые ассоциированы с различным клиническим течением заболевания.

Материалы и методы. Методами ПЦР, анализа однонитевого конфор-мационного полиморфизма ДНК (SSCP), микросателлитного анализа и прямого секвенирования исследовано 28 парных образцов (опухоль/ морфологически нормальная ткань) опухолей мочевого пузыря.

Результаты и обсуждения. Мутации в гене FGFR3 ассоциированы с более благоприятным течением заболевания (опухоль монофокальная, неинвазивная). При обследовании 7 и 10 экзонов гена FGFR3 нами об-наружены мутации в 7-ом экзоне в пяти случаях (5/28), 2 случая –CGC→TGC, 3 случая -TCC→TGC; мутаций в 10 экзоне не обнаружено.

Потеря гетерозиготности в области локализации гена TP53 является прогностически неблагоприятным маркером, ассоциированным с более высокой стадией и инвазивным ростом опухоли. В результате исследования ПГ выявлена в трех случаях (3/17).

Заключение. Поиск молекулярно-генетических маркеров, характерных для рака мочевого пузыря позволит более точно оценивать динамику опухолевого процесса и прогноз заболевания.

173

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ В ЛЕЧЕНИИ НЕДЕРЖАНИЯ МОЧИ У ЖЕНЩИН: КЛИНИЧЕСКИЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Кулаков В.И., Сухих Г.Т., Балан В.Е., Сметник В.П., Тихомирова Е.В., Ермакова Е.И.

ГУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН(директор – академик РАМН Кулаков В.И.)

Введение: Современные прогрессивные медицинские технологии, такие как клеточная и тканевая инженерия, начали с успехом применяться в области урологии и урогинекологии. Экспериментальные и клинические исследования, проведенные в последние годы, показали, что стрессовое недержание мочи с высокой эффективностью может лечиться при помощи трансплантации аутологических и аллогенных (клетки пуповинной крови) стволовых клеток (миобластов и фибробластов).

Материалы и методы: В ГУ НЦАГиП РАМН в период с октября 2004 года по май 2005 года пролечены 13 женщин с помощью новых клеточных технологий, путем трансплантации аллогенных стволовых и прогениторных клеток. Пациентки были разделены на две группы. I группа включала 8 женщин, страдающих стрессовым недержанием мочи III типа (возраст от 45 до 60 лет). II группа состояла из 5 женщин с синдромом императивных нару-шений мочеиспускания (возраст от 51 до 72 лет). Перед процедурой введения клеточного трансплантата всем пациенткам проводилось общеклиническое, комплексное уродинамическое исследования, а также ультразвуковое иссле-дование с применением трехмерной реконструкции изображения.

Эмбриональные и фетальные соматические стволовые и прогениторные клетки получали из аутопсийного материала 7 – 8 и 9 –19 недель гестации. Полученные клетки подвергались обязательному тестированию на вирус-но-бактериальную контаминацию, а также исследовался их кариотип.

Пациенткам I группы со стрессовым недержанием мочи вводились аллогенные миобласты (в количестве 50 – 80х106) непосредственно в рабдосфинктер под контролем ультразвука, а аллогенные фибробласты (в количестве 40 – 60х106) – в подслизистое пространство в область прок-симальной уретры. Пациенткам II группы с ургентным недержанием мочи проводилась внутривенная трансфузия фетальных аллогенных соматичес-ких мезенхимальных и нейральных стволовых и прогениторных клеток (в количестве 90 –100х106).

Результаты: Контрольное обследование, включающее анкетирование, гинекологический осмотр, проведение кашлевого теста, лабораторные исследования, УЗИ с трехмерной реконструкцией, комплексное уродина-мическое исследование, выполнялось через 1, 3 и 6 месяцев после введения клеточных трансплантатов. По результатам обследования к концу 1-го месяца наблюдения шесть пациенток I группы (75%) полностью удер-

174

живали мочу. Две женщины этой группы (25%) отмечали существенное уменьшение частоты эпизодов недержания мочи, возникающих только при сильной физической нагрузке. По данным трехмерной эхографии у всех пациенток этой группы наблюдалось увеличение толщины рабдосфинктера (в среднем от 2 до 3,2 мм) и его сократительной способности (в среднем от 0,6 до 1,8 мм)

Во II группе женщин к концу 1-го месяца наблюдения у четырех па-циенток (80%) отмечалось полное исчезновение симптомов ургентного недержания мочи. У одной женщины (20%) регистрировалось уменьше-ние частоты мочеиспускания в сутки и эпизодов неудержания мочи. По данным уродинамического исследования наблюдалось увеличение макси-мального цистометрического объема мочевого пузыря на 43,9%, признаков нестабильности детрузора не отмечалось ни у одной пациентки.

Каких либо побочных эффектов и осложнений во время и после вве-дения клеточных трансплантатов не наблюдалось.

Заключение: Наши начальные клинические наблюдения, очевидно, дают основание сделать заключение, что использование трансплантации аллогенных эмбриональных и фетальных соматических стволовых и про-гениторных клеток может рассматриваться как альтернативный метод хирургического и фармакологического методов лечения недержания мочи как стрессового, так и ургентного. Дальнейшие клинические исследова-ния необходимы для того, чтобы оценить длительность и выраженность полученных клинических результатов.

ОСОБЕННОСТИ ПРОДУКЦИИ ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 У БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ И

ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫМИ ОПУХОЛЯМИ КОСТЕЙ

Кушлинский Н.Е., Тарасова Т.А., Соловьев Ю.Н., Борисов Д.А., Кузнецов И.Н., Булычева И.В.

ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Известно, что на опухолевый рост в костях оказывают влияние раз-личные гормоны, полипептидные факторы, цитокины, осуществляющие регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий, к которым относится и интерлейкин-6 (ИЛ-6).

Цель исследования – анализ содержания ИЛ-6 в сыворотке крови практически здоровых людей, больных саркомами и доброкачественными новообразованиями костей с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.

175

Материал и методы. Обследовали 106 больных в возрасте от 5 до 62 лет. У всех пациентов клинико-рентгенологический диагноз подтвержден данными гистологического исследования опухоли. Выделены следующие морфологические варианты: остеосаркома (36), хондросаркома (24), опу-холь Юинга (16), злокачественная фиброзная гистиоцитома кости (ЗФГ) (8), гигантоклеточная опухоль кости (ГКО) (15), аневризмальная киста кости (3), костно-хрящевой экзостоз (3), остеобластома (1). В качестве контроля использованы сыворотки крови 17 практически здоровых людей в возрасте от 16 до 60 лет и 23 детей в возрасте от 5 до 14 лет. Концент-рацию ИЛ-6 в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом реактивами фирмы «R&D» (США).

Результаты. Обнаружено, что частота выявления и концентрация ИЛ-6 в сыворотке крови практически здоровых людей достоверно ниже, чем у больных новообразованиями костей. Максимальные значения ИЛ-6 выявлены при генерализации опухолевого процесса у больных остеосар-комой, хондросаркомой и опухолью Юинга. Также высокие показатели ИЛ-6 отмечены и при ЗФГ и ГКО. Содержание ИЛ-6 в сыворотке крови больных, у которых были в последствии выявлены метастазы и рецидивы опухоли, было выше при первичном обследовании, чем у пациентов, у которых прогрессирования заболевания за период наблюдения не отме-чено. Полученные данные свидетельствуют о том, что высокая продукция ИЛ-6 характерна для большинства больных саркомами костей. Кроме того, исходно высокие показатели цитокина в крови больных до лечения могут указывать на неблагоприятный прогноз болезни, а именно, раннее реци-дивирование. Следовательно, определение уровня ИЛ-6 в сыворотке крови больных саркомами костей до лечения может служить дополнительным фактором прогноза этих заболеваний.

Заключение. Обсуждается роль ИЛ-6 в патогенетических механизмах бластомогенеза сарком костей, в прогнозе этих заболеваний, а также вы-делении групп пациентов с более неблагоприятным клиническим течением болезни.

176

РАСТВОРИМАЯ ФОРМА МОЛЕКУЛЫ АДГЕЗИИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ 1 ТИПА (sVCAM-1) ПРИ

НОВООБРАЗОВАНИЯХ КОСТЕЙКушлинский Н.Е., Соловьев Ю.Н., Руссо Е.Ю., Бабкина И.В.,

Борисов Д.А., Булычева И.В.

В процессах прогрессирования и инвазии опухолей костей участвуют различные факторы. VCAM-1 – один из членов семейства иммуноглобули-нов, который вовлекается в лейкоцитарно-эндотелиальное взаимодействие. sVCAM-1 является продуктом протеолитического распада VCAM-1, при этом известно, что он содержится как в крови практически здоровых людей, так и у пациентов с различными заболеваниями. Повышение уровней sVCAM-1 в крови выявлено при раке яичников, опухолях желудочно-кишечного тракта, раке почки, мочевого пузыря, предстательной железы, заболеваниях крови.

Цель настоящего исследования – сравнительный анализ содержания sVCAM-1 в сыворотке крови практически здоровых людей и больных опухолями костей с учетом основных клинических и морфологических характеристик заболевания.

Материал и методы. Обследовано 24 больных опухолями костей (14 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 14 до 65 лет. У всех диагноз уста-новлен впервые и подтвержден данными гистологического исследования опухоли: у 9 выявлена остеосаркома, у 7 – хондросаркома, у 3 – гиганток-леточная опухоль кости, у 1 – примитивная нейроэктодермальная опухоль, у 1 – злокачественная фиброзная гистиоцитома, у 3 – доброкачественные новообразования костей. Группу контроля составили 16 практически здоровых людей (9 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 13 до 70 лет. Кон-центрацию sVCAM-1 определяли в сыворотке крови иммуноферментным методом реактивами фирмы «Bender MedSystems» (Австрия).

Результаты. У практически здоровых людей среднее содержание sVCAM-1 в сыворотке крови составило 668,4±52,0 нг/мл и было выше, чем у пациентов с новообразованиями костей – 567,8±25,1 нг/мл, однако статистический анализ достоверных различий не выявил. Минимальные уровни sVCAM-1 в сыворотке крови обнаружены у больных доброкачес-твенными новообразованиями кости (473,7±52,0 нг/мл), а максимальные - при хондросаркоме (622,0±62,0 нг/мл). Не обнаружено различий в пока-зателях sVCAM-1 как у здоровых людей, так и больных опухолями костей с учетом пола. У пациентов в возрасте до 20 лет содержание sVCAM-1 в сыворотке крови было более низким по сравнению с больными старшего возраста (516,1±54,5 и 589,2±27,0 нг/мл соответственно).

Заключение. Обсуждается роль sVCAM-1 в патогенетических механиз-мах бластомогенеза при саркомах костей, а в сочетании с другими биоло-гическими маркерами и клинико-морфологическими характеристиками опухолей в клиническом течении и прогнозе заболевания.

177

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ПРИМЕНЕНИЯ ТРАНСФЕЦИРОВАННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ

ЛЕЧЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ НИЖНИХ КОНЕЧНОСТЕЙ

Лавров А.В., Никитина В.А., Бочков Н.П.ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

Лечение ишемии нижних конечностей любого генеза является одной из актуальных задач современной медицины.

В настоящее время разрабатываются и испытываются генно-терапев-тические методы, направленные на введение различных генов ангиогенеза для лечения хронических ишемических состояний нижних конечностей. Используются гены факторов роста кровеносных сосудов: ANG – ангиоге-нин, VEGF – сосудистый фактор роста эндотелия, FGF-2 – фактор роста фибробластов 2. Однако применение конструкций на основе плазмид и вирусов не дает заметных результатов выздоровления. Внутривенное и внутримышечное введение генных конструкций недостаточно эффективно как из-за возникающих проблем адресной доставки, так и из-за быстрого, в течение нескольких дней, разрушения конструкций в клетках.

С другой стороны, активно исследуются возможности клинического применения стволовых клеток при лечении ишемических заболеваний. Показана эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток в сердечную мышцу при инфаркте миокарда. Получены положительные результаты при пересадке стволовых клеток в зоны инсульта, а также при лечении ишемической стопы. Однако, механизмы воздействия стволовых клеток на зоны поражения не известны, а лечебный эффект недостаточно высок и продолжителен.

Таким образом, логичным продолжением исследований в области генной инженерии при ишемической патологии, является трансфекция стволовых клеток генными конструкциями, содержащими гены ангиоге-неза и разработка условий, при которых вводимый ген экспрессируется и стимулирует скорейшую васкуляризацию пораженной ткани, а стволовые клетки способствуют регенерации тканей. В докладе будет представлен протокол трансфекции мезенхимальных стволовых клеток плазмидами с генами VEGF и ANG с последующей оценкой эффективности работы конструкции и характеристик трансфецированных клеток.

178

ГЛУТАМИН(АСПАРАГИН)АЗА – ПОТЕНЦИАЛЬНЫЙ АНТИОПУХОЛЕВЫЙ АГЕНТ

Лебедева З.И.1, Березов Т.Т.2

1 – ГУ НИИ Биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва 2 – Медицинский факультет Российского университета Дружбы народов,

Москва

Ферменты могут быть использованы в качестве одного из самых изби-рательных инструментов для направленного изменения метаболизма ра-ковой клетки. Семейство бактериальных амидогидролаз активно изучается с целью применения этих ферментов в качестве лекарственных средств в онкологии. Глутамин (аспарагин) аза, [ГА, КФ 3.5.1.38] принадлежащая с этому семейству, катализирует гидролиз амидной группы глутамина и аспарагина до соответствующих аминодикарбоновых кислот и аммиака. К ферментам, рекомендуемым в качестве антиопухолевых средств, предъ-является ряд требований.

Цель: Изучить каталитические свойства ГА, стабильность ГА в различной среде и при различных температурах, а также активность фермента в при-сутствии антагонистов глутамина (метотрексата, ДОН, азасерина), исполь-зуемых при комплексном лечении злокачественных новообразований.

Материалы: Использованы гомогенные препараты ГА, выделенные из микроорганизма Pseudomonas aurantiaca – отечественного непатогенного штамма-продуцента.

Результаты: Фермент катализирует гидролиз L глутамина и L аспараги-на, а также их D изомеров. Он практически не действует на производные L глутамина и L аспарагина, замещенные по α аминогруппе. Оптимум рН находится при физиологических значениях рН среды для глутаминазной активности и несколько смещен в щелочную область для аспарагиназной активности. ГА проявляет высокое сродство к обоим субстратам. Продукты реакции, L глутамат и L аспартат, являются обратимыми ингибиторами фермента. ГА обладает максимальной стабильностью при физиологичес-ких значениях рН среды, при значениях рН ниже 5,0 стабильность резко падает. ГА устойчива при температуре от 0 до 46°, но быстро инактиви-руется выше 48°. Инкубация ГА с 6 диазо 5 оксо L норлейцин (ДОН) или азасерином вызывает полную инактивацию фермента, метотрексат не оказывает влияния на активность ГА.

Выводы: Полученные результаты свидетельствуют о том, что ГА удов-летворяет большинству критериев первичного отбора перспективных ан-тиопухолевых ферментов. Влияние антагонистов глутамина на активность фермента необходимо учитывать при исследовании противоопухолевых свойств ГА.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 02-04-49744).

179

ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ АПОПТОЗА ГЕПАТОЦИТОВ В МОДЕЛИ ПОДОСТРОГО ТОКСИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА

Левицкая А.Б., Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н., Кирпатовская Н.А., Москалева Е.Ю.

ГУ НИИ питания РАМН; ВНЦ молекулярной диагностики и лечения г. Москва

Известен широкий круг веществ, обладающих гепатотоксичностью. К их числу относятся природные соединения, продукты химической и фармацевтической промышленности, отходы этих производств. Патогенез токсического поражения печени сложен и не всегда ясен. Действие хлори-рованных углеводородов может быть связано с повреждением митохондрий и индукцией процессов апоптоза.

Апоптоз – один из вариантов программированной клеточной гибе-ли – обязательный компонент нормального развития организма, Спон-танный апоптоз в печени регистрируется в 2-4 клетках из 10000. Уровень апоптоза может возрастать при действии ряда экзогенных факторов, таких как, например, инфекции, интоксикации.

Существует ряд биохимических критериев развития каспаза-зависимой формы апоптоза, таких как активация каспазы-3 и межнуклеосомная фрагментация ДНК, характерные для его заключительной стадии.

Целью настоящей работы явилось изучение уровня апоптоза гепатоци-тов при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом

Для создания модели подострого токсического гепатита крысам Вистар опытной группы в течение 9 дней вводили внутримышечно раствор 50% четыреххлористого углерода в оливковом масле в дозе 0,3 мл на 100 г массы тела. Контрольные и опытные животные содержались на общевиварном рационе и получали воду ad libitum.

Токсический гепатит у животных характеризовался увеличением от-носительной массы печени и почек, увеличением активности аланина-минотрансферазы и содержания прямого билирубина в сыворотке крови, увеличением концентрации креатинина в моче; снижением концентрации гемоглобина в крови, значительными морфологическими изменениями печени (мононуклеарная инфильтрация в центре долек и дистрофические изменения гепатоцитов). В печени крыс подопытной группы наблюдалось увеличение активности каспазы-3 на 9,3% по сравнению с аналогичным показателем контрольной группы, однако межнуклеосомной фрагментации ДНК гепатоцитов у животных как опытной, так и контрольной группы при этом не наблюдалось. Полученные результаты позволяют заключить, что при подостром токсическом гепатите, вызванном четыреххлористым углеродом, вклад процессов каспаза-зависимого апоптоза незначителен и гибель гепатоцитов развивается по другим механизмам.

180

ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАФОНОФОРЕЗА ГИДРОКОРТИЗОНА В ВОССТАНОВИТЕЛЬНОМ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ С БОЛЕЗНЬЮ ПЕЙРОНИ

Ли А.А., Поливанова Е.В.РНЦ восстановительной медицины и курортологии,

Городская поликлиника №62, Москва

В настоящее время наиболее оптимальным методом лечения болезни Пейрони является хирургическое лечение. Однако, вне зависимости от выполненного метода оперативного лечения, в послеоперационном пери-оде могут наблюдаться различные осложнения. Чаще всего мы выявляем осложнения воспалительного характера (10,4%), укорочение полового члена (14,3%), снижение ригидности полового члена (6%), возврат симптоматики болезни Пейрони (5%). Общее количество осложнений у пациентов с бо-лезнью Пейрони после оперативного лечения колеблется от 5 до 20%. Эти данные получены после обследования 110 пациентов с болезнью Пейрони, подвергнутых оперативному вмешательству и коррелируют с общемировыми данными. Эти пациенты нами были обследованы в до- и послеоперацион-ном периодах, обследование включало в себя проведение клинического, ла-бораторного, иммунологического, функционального и рентгенологического исследований. После проведения обследования пациенту назначался курс лечения. Путем случайной выборки пациенты были поделены на 4 группы. Основная группа (30 пациентов): применялись следующие методы – кур-сы сосудорасширяющих препаратов (трентал), полиоксидоний, витамин Е, противосклеротические препараты, противовоспалительные препараты (диклофенак per rectum) и ультрафонофорез гидрокортизона. 2 группа (30 пациентов): сосудорасширяющие препараты, полиоксидоний, витамин Е, противосклеротические препараты и противовоспалительная терапия. 3 группа (30 пациентов): ультрафонофорез гидрокортизона и противовоспа-лительные препараты. И контрольная группа (20 человек) – применялись только сосудорасширяющие препараты и противовоспалительная терапия по показаниям. После анализа полученных данных результаты применяемого восстановительного лечения были удовлетворительными во всех группах пациентов. Однако, в основной группе, где применялась сочетанная ме-дикаментозная и физиотерапевтическая терапия эффект наступал гораздо быстрее и количество осложнений снизилось на 50% по сравнению с пациентами из 2 и 3 групп, где процент снижения осложнений был равен 20 – 25. В контрольной группе было отмечено снижение воспалительных осложнений, однако общее количество осложнений осталось на прежнем уровне. Таким образом, на основе проведенного нами исследования в схему восстановительного лечения необходимо включать и физиотерапевтическую терапию (ультрафонофорез гидрокортизона), и медикаментозную комплек-сную терапию для быстрейшей реабилитации пациентов.

181

ВЫЯВЛЕНИЕ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ RPOB MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ПНК-БЛОКИРОВАНИЕМ ПЦР

Липин М.Ю., Степаншина В.Н., Майорова A.A., Гаврюшкин A.В., Шемякин И.Г.

Государственный научный центр прикладной микробиологии, п.Оболенск

Введение. Общепринятые методы определения лекарственной устойчи-вости M. tuberculosis занимают несколько недель. Рифампицин и изониазид является ключевыми препаратами первой линии. У 90% рифампицин-ус-тойчивых штаммов M. tuberculosis выявляются мутации в гене rpoB, среди которых в большинстве регионов мира доминирует мутация 531TTG, обнаруживаемая, в частности, у трех четвертей рифампицин-устойчивых штаммов M. tuberculosis семейства Beijing/W. Полипептидные нуклеино-вые кислоты (ПНК) являются структурными аналогами ДНК. Вследствие отсутствия распределенного отрицательного заряда у полипептидного остова формирование комплексов ПНК/ДНК более специфично, чем формирование комплексов ДНК/ДНК.

Цель. Разработка метода быстрого определения устойчивости M. tuberculosis к рифампицину посредством выявления мутаций в гене rpoB ПНК-блокированием ПЦР.

Материалы и методы. Были проверены образцы ДНК 20 изолятов M. tuberculosis с геном rpoB дикого типа и 20 изолятов с мутацией 531TTG в гене rpoB (согласно данным ПЦР-секвенирования). Прямой и обратный праймеры для katG и rpoB генов, 1 – 4 нг микобактериальной ДНК и 5 мкг ПНК (GCCGACTGTCGGCGCT, комплементарна региону вокруг 531 кодона гена rpoB дикого типа) были добавлены в стандартную смесь для ПЦР. ПЦР-продукты разделялись электрофорезом в 1% агарозном геле и окрашивались бромистым этидием.

Результаты. Наличие мутации в 531 кодоне подтверждалось амплифи-кацией фрагмента гена rpoB. Амплификация фрагмента гена rpoB дикого типа полностью блокировалось ПНК. Фрагмент гена katG (положительный контроль ПЦР) амплифицировался во всех случаях.

Выводы. Метод блокирования ПЦР полипептидными нуклеиновыми кислотами позволяет однозначно определять наличие мутаций.

182

СУПЕРОКСИДНЫЙ АНИОН-РАДИКАЛ КИСЛОРОДА: СУЩЕСТВЕННЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ

ДИНАМИКИ АТЕРОГЕНЕЗА У ЧЕЛОВЕКА

Литвицкий П.Ф., Коган А.Х.ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава

В отдельных исследованиях показана патогенная роль чрезмерной ин-тенсификации процессов липопероксидации (ЛПО) в механизме развития атеросклероза (Westhuyzen J,1997; Коган А.Х.и др.,1999; Светлова Н.В., Литвицкий П.Ф.,2003;). Вместе с тем, недостаточно изучена динамика и роль в атерогенезе одного из основных инициаторов процесса ЛПО – су-пероксидного анион-радикала кислорода (САРК) на разных стадиях ате-рогенеза у человека.

Цель исследования: изучить динамику генерации САРК различными пулами клеток (фагоцитирующими и нефагоцитирующими) атероскле-ротических бляшек артерий (фрагменты их резецировали при операциях аорто-бедренного, аорто-подвздошного шунтирования и профундопласти-ки у 30 пациентов с системным облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей на разных стадиях атерогенеза) в сравнении с таковой в стенках артерий у 30 практически здоровых лиц (контроль).

Результаты. Генерация САРК фагоцитами возрастала закономерно и значимо в фиброзных бляшках (в 1,6 раза в сравнении с контролем), еще более она увеличивалась на стадии их атероматозных изменений (в 2.3 раза), но снижалась на стадии их кальциноза. Одновременно уве-личивалось образование САРК нефагоцитирующими клетками интимы атеросклеротических бляшек: в фиброзных и атероматозных бляшках в 1,3 и 2.0 раза, соответственно; напротив, на стадии кальциноза генерация САРК уменьшалась.

Заключение: Генерация САРК фагоцитами атеросклеротических бляшек на различных стадиях их формирования имеет закономерную динамику: она прогрессирующее нарастает на стадии фиброзных и атероматозных бляшек, но существенно снижается на стадии их кальциноза. Одновремен-но увеличивается образование радикалов нефагоцитирующими клетками фиброзных и атероматозных бляшек. В отличие от этого, генерация САРК указанными клетками на стадии кальциноза снижается. Приведенные выше данные целесообразно учитывать при диагностике (в том числе – дифференциальной) стадий атеросклероза, а также – разработке стратегии лекарственной терапии атерогенеза на разных его этапах.

183

МЕХАНИЗМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ДЕЙСТВИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОБИОТИКА,

ПРОДУЦИРУЮЩЕГО ИНТЕРФЕРОН

Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Белявская В.А.1

ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН г. Томск 1 – ФГУП «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор», Кольцово, Новосибирская область

Новый препарат субалин создан на основе живых генетически моди-фицированных бактерий B. subtilis 2335/105, способных продуцировать α2-интерферон (ИФН) человека в кишечнике при пероральном введении. При таком способе доставки ИФН к слизистой кишечника происходит его защита от деградирующего влияния секретов ЖКТ, что повышает его биодоступность, стимулирует слизистый и гуморальный иммунитеты.

Цель: оценить способность субалина повышать эффективность ци-тостатической терапии экспериментальных опухолей и механизмы его противоопухолевого действия.

Материалы и методы. В работе использованы инбредные мыши, штам-мы перевиваемых опухолей. Цитостатики циклофосфан и фторурацил вводились по схемам парентерально, субалин перорально. Оценивали рост и метастазирование опухолей, функциональную активность клеток иммунной системы. Влияние субалина на химически-индуцированный канцерогенез оценивали на модели диметил-бензантрацен (ДМБА)-ин-дуцированной фибросаркомы у мышей.

Результаты. На модели карциномы легких Льюис (LLC) нами показано, что субалин обладает способностью существенно увеличивать антибластом-ную активность 5-фторурацила и циклофосфана (Цф) и умеренной собс-твенной противоопухолевой и антиметастатической активностью. На модели Цф – резистентной LLC выявлены химиосенсибилизирующие свойства субалина. Cубалин увеличивал длительность латентного периода появления ДМБА – индуцированных опухолей и продолжительность жизни животных с опухолью. Показано, что антибластомное действие субалина связано с акти-вацией макрофагов и естественных киллерных (ЕК) клеток и невозможно без участия системы Т-лимфоцитов. Химиомодифицирующие свойства субалина определяются его способностью активировать иммунокомпетентные клетки, восстанавливать эффекторные функции макрофагов и ЕК клеток и повышать чувствительность опухолевых клеток к действию цитостатиков.

Заключение. Представленные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения субалина с целью обоснования его использования в комплексной терапии рака в качестве препарата интерферонового ряда, об-ладающего такими преимуществами, как безынъекционный путь введения, отсутствие побочных реакций, возможность длительного использования.

184

ФЛАВИВИРУСЫ КАК НОВЫЕ И ВНОВЬ ВОЗНИКАЮЩИЕ ПАТОГЕНЫ

Локтев В.Б.

ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область

Флавивирусы это одни из важнейших вирусных патогенов для человека и домашних животных. Такие флавивирусы как вирусы Денге, Японского энцефалита, клещевого энцефалита, Западного Нила и желтой лихорадки вызывают миллионы тяжелых случаев лихорадок, геморрагических лихо-радок, энцефалитов и менингоэнцефалитов в различных регионах мира. Большинство других представителей семейства флавивирусов, которое на-считывает около 72 представителей, также высокопатогенны для человека и вызывают географически ограниченные вспышки заболеваний человека.

В течение нескольких последних лет было обнаружено появление новых флавивирусов и необычное распространение уже известных флавивиру-сов. Это такие новые флавивирусы как Алкхурма (Alkhurma), Рабенсбург (Rabensburg). Проникновение на территорию Северной Америки и распро-странение вируса Западного Нила (ВЗН) – яркий пример «агрессивного» поведения флавивирусов в современном мире. Обнаружение в центре Европы типичного Африканского вируса Усуту (Usutu), относящегося к комплексу вируса Японского энцефалита, проникновение вируса Япон-ского энцефалита в Австралию дополнительно подтвердило изменение географии распространения флавивирусов в настоящее время. В России также зарегистрированы подобные факты. Это вспышка лихорадки За-падного Нила в южных районах России в 1999 году, установление факта циркуляции современного генотипа Ia ВЗН на территории юга Западной Сибири и Приморского края, выявление нового генотипа ВЗН на Кавказе, обнаружение геморрагической формы клещевого энцефалита в Ново-сибирске в 1999 году и нового высокопатогенного геноварианта вируса клещевого энцефалита в Приморском крае в 2004 году.

Эти конкретные примеры иллюстрирует несовершенство наших пред-ставлений о циркуляции флавивирусов на территории нашей страны и в мире. Поэтому необходимость совершенствования наших представлений о флавивирусах, особенностях их эпидемиологии не вызывает сомнений. Знание биологии новых и вновь возникающих высокопатогенных фла-вивирусов, особенностей изменения ареала их распространения в сов-ременной России, мониторинг возникновения новых флавивирусов и их геновариантов является, на наш взгляд, важнейшей составляющей частью проблемы биобезопасности нашей страны.

185

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПОЛИАМИНА И МЕКСИДАНТА НА НЕЙРОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ/

ПРОГЕНИТОРНЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА

Макаров А.В.1, Сабурина И.Н.1, Кулибин А.Ю.1, Голобородько Е.В.2, Семенова М.Л.3, Гольдштейн Д.В.1

1 – НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий», г. Москва2 – ГУ Институт высшей нервной деятельности РАН, г. Москва

3 – Биологический факультет Московского государственного университета

Успех трансплантации клеток, как в эксперименте, так и в клинике во многом зависит от качества клеточного материала, который подвергается разнообразной обработке до трансплантации и от возможности сохранения как можно более высокой жизнеспособности данного клеточного матери-ала до момента введения реципиенту и после трансплантации.

В настоящей работе исследовали выживаемость культивированных по стандартной методике нейрональных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) человека в зависимости от состава среды хранения и транспорти-ровки, в которой эти клетки могут находиться до момента трансплантации и возможность их трансплантации в этой же среде реципиенту. Исполь-зовали следующие среды: полиамин, мексидант и 0,9% изотонический раствор хлорида натрия; для контроля использовали ростовую среду, но без добавления митогенов, сыворотки и антибиотиков. Жизнеспособность клеточной культуры оценивали по отношению живых клеток к погибшим по окраске трипановым синим и life-dead китом.

Помещение клеток в предложенные среды увеличивало их выживаемость по сравнению с контролем и физиологическим раствором. Через сутки при 20° С после помещения клеток в предложенные среды 80% НСПК оставалось живыми. При трансплантации культуры НСПК в предлагаемых средах стереотаксически в контрлатеральное полушарие мозга интактным животным и с моделью локальной ишемии головного мозга, было показано, что при введении клеток в предложенных средах (особенно с мексидантом) уже в первые сутки после трансплантации была значительно снижена вос-палительная реакция в районе прокола. Введенные НСПК переживают и не вызывают иммунной реакции. Они сохраняют способность к миграции и дифференцировке в нейрональном и глиальном направлении.

Результаты данного исследования показали, что антиоксидантные, мемб-раностабилизирующие и реологические свойства предложенных сред с поли-амином и мексидантом увеличивают количество живых НСПК в суспензии при хранении до суток, а также значительно улучшают выживаемость НСПК в мозге крыс при трансплантации, способствуя лучшему приживлению транс-плантированных клеток за счет снижения воспалительной реакции в районе прокола и улучшения миграции введенных клеток в область повреждения.

186

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ТРОМБОФИЛИИ И ЦИРКУЛЯЦИЯ АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ В ГЕНЕЗЕ ПРИЧИН

БЕСПЛОДИЯ И НЕУДАЧ ЭКОМакацария А.Д., Бицадзе В.О., Баймурадова С.М.

Кафедра акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета ММА им. И. М. Сеченова

Целью исследования явилось изучение роли тромбофилии у женщин с бесплодием (неясного генеза) и неудачами экстракорпорального опло-дотворения (ЭКО).

Обследовано 55 пациенток с бесплодием I и бесплодием II, которые составили 2 группы: Iа группа (n=38) – с неудачами ЭКО в анамнезе (одна и более неудачные попытки ЭКО, число попыток составило от 1 до 9). Iб группа (n=17) – c бесплодием I и II (неясного генеза) без попыток ЭКО в анамнезе. II группу – составили 20 беременных женщин после программы ЭКО, которые были обследованы и консультированы до наступления бе-ременности (с фертильного цикла) и наблюдались до конца беременности; группу сравнения составили 30 беременных после ЭКО (мужской фактор). Контрольную группу составили 50 беременных с физиологическим течением беременности. Возраст женщин составил от 24 до 45 лет.

Лабораторные исследования включали: выявление генетических форм тромбофилий методом ПЦР (мутации МТHFR C677Т, протромбина (G20210A), V фактора Лейден, полиморфизм PAI, полиморфизм в гене гликопротеина Gp-Ia, Gp-IIIa, полиморфизм в гене ангиотензиногена, полиморфизм в гене рецептора ангиотензина II 1-го типа (ATGR1), ан-гиотензинпревращающего фермента, фибриногена, тканевого активатора плазминогена). Определение концентрации АФА-АТ и кофакторов в плазме крови. Также определяли циркуляцию молекулярных маркеров тромбине-мии и фибринообразования (ТАТ, F1+2/ PF 4, Д-димер). Среди причин мультигенной тромбофилии у пациенток с бесплодием I или II (неясного генеза) и неудачами ЭКО доминировали полиморфизм генов вызывающих эндогенный гипофибринолиз и нарушение синхронизации процессов фиб-ринолиза и фибринообразования в процессе имплантации плодного яйца. Полиморфизм PAI-1 выявлен у 69,1% пациенток, «I/D» в гене тканевого активатора плазминогена – у 60,0%, «807 G/T» тромбоцитарного рецептора GpIa – у 51,0% пациенток, «-455G/A» в гене фибриногена – у 41,8%, «I/D» в гене ангиотензинпревращающего фермента у 25,5% пациенток. Тромбо-филия (включая сочетание нескольких форм тромбофилии), как сложный интегральный фактор неудач ЭКО обнаружена у 90% пациенток с неуда-чами ЭКО в анамнезе. В группе сравнения, тромбофилия была выявлена у 30%, в то время как в контрольной группе беременных с физиологическим течением беременности – у 26% (р<0,05).

187

У пациенток с бесплодием неясного генеза и неудачами ЭКО (при исклю-чении всех других возможных причин бесплодия и неудач ЭКО) необходимо обследование на наличие скрытой тромбофилии, поскольку «бесплодие» в таких случаях может быть обусловлено ранними преэмбрионическими поте-рями вследствие дефектов имплантации оплодотворенной яйцеклетки.

Это позволяет с принципиально новых позицией ставить вопрос о профилактике повторных неудачных попыток ЭКО с использованием противотромботических препаратов, особенно у пациенток с комбиниро-ванными формами тромбофилии.

КАТАСТРОФИЧЕСКАЯ ФОРМА АНТИФОСФОЛИПИДНОГО СИНДРОМА (К ВОПРОСУ О ПАТОГЕНЕЗЕ)

Макацария А.Д., Кодзасова З.А, Хизроева Д.Х., Бицадзе В.О., Баймурадова С.М.

Кафедра акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета ММА им. И. М. Сеченова

Термин «катастрофический» антифосфолипидный синдром (КАФС) применяют для обозначения крайней формы клинических проявлений АФС, результатом которой является полиорганная недостаточность. Для КАФС характерно:

а) клиническая картина мультиорганных поражений, развивающаяся за короткий период времени;

б) гистологическая картина множественной окклюзии сосудов мелкого калибра (нарушение микроциркуляции, хотя в меньшинстве случаев воз-можны тромбозы крупных сосудов);

в) серологическое подтверждение циркуляции антифосфолипидных антител (АФА) (волчаночный антикоагулянт (ВА) и/или антикардиолипи-новые антитела (АКА) и/или антитела к β2-гликопротеину I, аннексину V, протромбину).

Кроме того, для развития эпизода КАФС, как правило, необходимы те или иные пусковые моменты. Наиболее частыми триггерными факторами у пациентов с КАФС являются инфекция, операции, травма, инвазивные процедуры, новообразования, акушерские осложнения, отмена антикоа-гулянтной терапии.

В мировой практике на сегодняшний день описано не более 300 слу-чаев КАФС.

У нас имеется опыт ведения пациентов с катастрофической формой АФС. За последние 2 года «тромботический шторм» мы наблюдали у 7 пациенток. У 4 из них провоцирующими факторами были: тяжелая форма

188

гестоза, кесарево сечение, у 2-х – дефицит протеина С, у 1-й – последствие тромбоэмболии легочной артерии, у 1-й – инфекция (пневмония, септице-мия). Во всех случаях были выявлены антифосфолипидные антитела и анти-тела к кофакторам (β2-гликопротеину I, протромбину, аннексину V, протеи-ну С), циркуляция волчаночного антикоагулянта. В 4-х случаях обнаружены генетические формы тромбофилии (гетерозиготная форма мутации фактора V Лейден в сочетании с полиморфизмом в гене PAI-1, полиморфизмом I/D в гене АПФ и в гене тромбоцитарных рецепторов GpIa). Использование плазмафереза в сочетании с длительным приемом (от 2 до 6 месяцев) низко-молекулярного гепарина позволила добиться излечения больных.

Исходная скрытая генетическая тромбофилия в сочетании с циркуля-цией антифосфолипидных антител может быть неблагоприятным фоном, провоцирующим нарушение микроциркуляции и развитие полиорган-ной недостаточности у больных с КАФС. Это еще раз подчеркивает: а) крайнюю важность диагностики циркуляции АФА и генетических форм тромбофилии у беременных высокого риска; б) крайне важную роль про-тивотромботической профилактики и терапии в акушерской практике.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ПАТОГЕНЕЗА ЯТРОГЕННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ

ГОРМОНАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

Макацария А.Д., Акиньшина С.В.Кафедра акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета

ММА им. И. М. Сеченова

В связи с широким использованием препаратов заместительной гор-мональной терапии (ЗГТ) во всем мире, даже незначительное повышение риска, связанное с их применением, может нанести существенный вред здоровью огромному числу женщин.

Результаты крупных международных испытаний, включая Women,s Health Initiative (WHI) и Heart and Estrogen/Progestin replacement Study (HERS), свидетельствуют о неэффективности ЗГТ как для первичной, так и для вторичной профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). При применении ЗГТ риск инфаркта миокарда повышается в 2 раза, ве-нозных тромбозов – в 3 – 4 раза.

Большая частота тромбозов в течение первого года ЗГТ свидетельствует о существовании предрасположенности к развитию тромботических ослож-нений. Открытие и изучение патогенетических механизмов приобретенной тромбофилии, обусловленной антифосфолипидным синдромом (АФС), наследственных тромбофилий, а также процессов воспаления позволило раскрыть причины этого явления.

189

АФС и наследственные тромбофилии выявляются у 7 – 15% и являются одной из ведущих причин тромботических осложнений при применении ЗГТ, что подтверждают данные наших собственных исследований. В период с 2000 по 2005 год мы обследовали 27 женщин, у которых разви-лись тромботические осложнения на фоне ЗГТ. У 75% были выявлены акушерские осложнения в анамнезе (синдром потери плода, гестозы, преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты). В 100% случаев были выявлены различные генетические формы тромбофилии (гомозиготные формы в 20%, комбинированные в 80% случаев). В 49% случаев обнаружены маркеры АФС.

Не смотря на наличие у препаратов ЗГТ как про-, так и провоспалительных свойств, преобладание именно провоспалительных свойств может привести к появлению у препаратов ЗГТ выраженной прокоагулянтной активности. В этой связи маркеры воспаления, прежде всего повышенный уровень СРБ, могут быть прогностически значимыми для определения риска тромбоза.

Неоднозначное влияние оказывают препараты ЗГТ и на систему ге-мостаза. Одновременно наблюдаются неблагоприятные эффекты (развитие резистентности к активированному протеину С, снижение содержания антикоагулянтных белков: антитромбина III, протеина C и S) и поло-жительное влияние (снижение уровня гомоцистеина, липопротеина а (ЛПа), активация фибринолиза). Баланс смещается в сторону повышения коагуляции при наличии возрастных изменений параметров гемостаза и свойств сосудистой стенки, сопутствующих заболеваний. Дополнитель-ным фактором, повышающим чувствительность к провоспалительным и протромботическим стимулам, может служить определенная генетическая предрасположенность (полиморфизм генов альфа-рецепторов эстрогенов, гена СРБ, ингибитора активатора плазминогена PAI-1, ЛПа, провоспали-тельных хемокинов и цитокинов Il-1b, Il-6).

Таким образом, может быть выделена группа женщин, среди которых применение ЗГТ оправдано: женщины в перименопаузе с сохранным эндотелием при отсутствии факторов риска ССЗ с целью коррекция кли-мактерического синдрома. При этом препараты ЗГТ должны применяться в минимально эффективных дозах и в течение как можно более корот-кого периода времени. Для выявления патологий системы гемостаза мы рекомендуем тщательно исследовать семейный и личный тромботический анамнез, а также, акушерский и общесоматический анамнез. Перед на-значением ЗГТ мы считаем оправданным скрининг на предмет приобре-тенной и генетической тромбофилии, исследование маркеров воспаления и мутаций альфа-рецепторов эстрогенов. Каждые 3 месяца необходим контроль маркеров тромбофилии (D-димер, антифосфолипидные антитела, протеин С) и воспаления (СРБ) для определения возможности пролонги-рования ЗГТ. При наличии генетических форм тромбофилии и/или АФС ЗГТ абсолютно противопоказана.

190

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА УНИВЕРСАЛЬНЫХ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ПЦР

В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Малахо С.Г., Манзенюк О.Ю., Пехов В.М., Полтараус А.Б.Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Москва

Отечественные диагностические фирмы сравнительно недавно стали производить универсальные наборы реактивов для проведения ПЦР в ре-альном времени. Данные по сравнительному анализу их чувствительности и надежности относительно авторитетных зарубежных фирм, давно спе-циализирующихся в этой области, отсутствуют. Наличие унифицирован-ного протокола лабораторной диагностики острой миелоидной лейкемии методом ОТ-ПЦР в реальном времени (A Europe Against Cancer Program) [Gabert J., Beillard E. et al. 2003], позволило сравнить универсальные на-боры на примере выявления химерного гена PML-RARa.

Целью работы являлся сравнительный анализ референтных зарубежных и отечественных универсальных наборов реактивов, на основе которых можно создавать чувствительные и специфичные диагностические тест-системы для выявления онкомаркеров при различных видах онкопато-логии.

В работе использовали универсальные наборы для ПЦР-РВ: PCR Core Reagent Kit (Applied Biosystems) и Mix for Quantitative PCR (Sigma), а также отечественные: «Набор для ПЦР-РВ» (Синтол) и «РиалитиТМ» (ООО Биочип-ИМБ).

Основными параметрами сравнения наборов были: эффективность амплификации, коэффициент корреляции, величина нормированного сигнала относительно пассивного контроля ROX, коэффициент вариации и чувствительность.

Сравнительное лабораторное испытание отечественных универсальных наборов ПЦР-РВ и показало их соответствие по всем основным характе-ристикам зарубежным аналогам. Так, например, коэффициент корреляции (~1), отражающий достоверность измерения числа копий контрольной плазмиды, для всех наборов имеет значение более 0,993. РиалитиТМ по этому показателю превосходит другие тестированные наборы (0,999), для набора Applied Biosystems коэффициент корреляции составляет 0,996.

Таким образом, нами продемонстрировано высокое качество отечес-твенных универсальных наборов реагентов для ПЦР-РВ и, на примере выявления и количественного определения химерного гена PML-RARA, показана возможность применения их для онкодиагностики.

191

ОБЕСПЕЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТАХ С ОПАСНЫМИ ПАТОГЕНАМИ В ГНЦПМ В РАМКАХ МЕЖДУНАРОДНОГО СОТРУДНИЧЕСТВА

Маринин Л.И., Тюрин Е.А., Дьякова Т.А., Волков В.Я.Государственный научный центр прикладной микробиологии, п. Оболенск

Исследования, связанные с изучением патогенных микроорганизмов, сопряжены с риском возникновения аварийной ситуации и, как следствие, с внутрилабораторным заражением работающего персонала. Актуальность проблемы защиты людей и окружающей среды при работах с возбуди-телями инфекций еще более возросла в условиях широкого внедрения достижений микробиологии, генной инженерии, развития микробиологи-ческой промышленности, а также использования биологических агентов в террористических целях.

В соответствии с научными, в том числе Международными, про-граммами, в ГНЦПМ ведутся микробиологические, генетические, био-химические, иммунологические исследования с микроорганизмами 1-й и 2-й групп патогенности (возбудителями чумы, сибирской язвы, туля-ремии, мелиоидоза). Инженерно-технические и медико-биологические мероприятия позволяют обеспечить безопасность людей и окружающей среды путем нормального функционирования и поддержания в работос-пособном состоянии инженерных систем, своевременного проведения текущих и профилактических ремонтных работ. Однако вследствие дли-тельной эксплуатации инженерного оборудования некоторое физически и морально устарело, запасные части к отдельным видам используемого оборудования сняты с производства. С учетом фактического состояния была своевременной помощь, оказанная со стороны США. Партнером выступило Агентство по снижению угрозы (DTRA), которое в соответс-твии с объемом деятельности в рамках Проекта осуществляло следующие мероприятия: финансировало проект; оказывало техническую поддержку и контроль за выполнением проекта; устраивало регулярные совещания по рассмотрению результатов выполнения проекта; утверждало перечень зака-зываемого оборудования; оказывало материальную поддержку по участию персонала ГНЦПМ в международных конференциях. Благодаря матери-альной поддержке партнера повышены надежность, работоспособность и эффективность инженерного оборудования, обеспечен контроль режимов эксплуатации инженерно-технических систем; обеспечены необходимые температурные режимы хранения музейных коллекций микроорганизмов опасных патогенов; сохранен основной состав персонала.

Таким образом, помощь со стороны партнера позволила повысить безопасность работающего персонала и защиту окружающей среды при проведении фундаментальных и прикладных исследований с возбуди-телями опасных инфекций в ГНЦПМ в рамках научных, в том числе Международных, программ.

192

МЕТИЛИРОВАНИЕ ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ ГЕНА RAR-BETA2 В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ ЧЕЛОВЕКА

Машкова Т.Д.1, Опарина Н.Ю.1, Брага Э.А.2, Зиновьева О.Л.1, Кропотова Е.С.1, Прасолов В.С.1, Логинов В. И.2, Полтараус А.Б.1,

Киселев Л.Л.1

1 – Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, Москва 2 – Государственный НИИ генетики и селекции промышленных

микроорганизмов, Москва

Метилирование CpG-динуклеотидов в промоторных областях генов, инактивирующее их экспрессию, выявлено для многих кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста, в том числе для гена RAR-beta2, кодирую-щего белок-рецептор ретиноевой кислоты. Нами изучено метилирование протяженного (800 п.н.) CpG-богатого фрагмента промоторного района этого гена для рака молочной железы (BC), почечно-клеточного рака (RCC) и опухоли яичников (OET). Метилирование определяли методом комбинированного рестриктазного анализа бисульфит-обработанной ДНК (COBRA), позволяющим количественно оценивать степень метили-рования в определенных позициях гена, а также методом бисульфитного секвенирования, с помощью которого выявляют метилирование по всему секвенируемому участку ДНК. Степень метилирования гена RAR-beta2 определяли в парных образцах норма/опухоль и в соответствующих кле-точных линиях, а также в в ДНК крови доноров. Метилирование CpG-островков в промоторном участке гена RAR-beta2 в ДНК крови доноров не обнаружено. Выявлен высокий уровень метилирования гена RAR-beta2 только в ДНК клеточной линии (MCF7) и частичное метилирование CpG в 20-55% образцов опухолевых тканей, причем наблюдается неравномерное метилирование CpG в изучаемом участке. Выявлено также метилирование в образцах условно нормальной ткани, прилегающей к эпителиальной опухоли, однако и уровень и плотность распределения метилирования в опухолях выше. Показано, что в образцах морфологически нормальной ткани метилирована только часть изучаемого фрагмента (около 300 п.н.), в то время как в опухолевой ткани метилирование распространяется на соседние участки. Полученные результаты свидетельствуют о высоком уровне метилирования гена RAR-beta2 в эпителиальных опухолях. Выяв-ленное частичное метилирование промотора RAR-beta2 в прилегающей к опухоли ткани позволяет отнести метилирование 300-п.н. участка к наибо-лее ранним событиям канцерогенеза, что может иметь прогностическое и диагностическое значение.

193

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЁРЫ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ И СЕПСИСА

Миронов А.Ю., Истратов В.Г., Французов В.Н., Осман К.А.ММА им. И. М. Сеченова, Институт хирургии им. А. В. Вишневского РАМН

Проблема диагностики анаэробной инфекции (АНИ) мягких тканей обусловлена постоянно растущим числом техногенных и природных экс-тремальных ситуаций, сопровождающихся большим количеством раненых и пораженных, тяжестью и быстротой развития АНИ, высоким риском её генерализации с развитием сепсиса, сложностью и высокой стоимостью микробиологического исследования. Газовая хроматография и масс-спектрометрия (ГХ-МС) позволяют с высокой степенью достоверности определять развитие АНИ и септических осложнений на ранних стадиях заболевания. Мы использовали ГХ-МС для: 1) определение содержания метаболитов анаэробов и тканевых метаболитов в воспалительном очаге и крови больных для оценки степени интоксикации и соотношения метабо-литов Рочаг/кровь с целью прогноза развития сепсиса; 2) экспресс анализа метаболитов анаэробов в мягких тканях в качестве интраоперационного критерия радикальности оперативных вмешательств; 3) индикации моле-кулярных маркёров органных поражений для определения ранних призна-ков синдрома полиорганной недостаточности; 4) индикации сигнальных соединений «кооперативной чувствительности» микробов (ССКЧМ) для определения степени генерализации инфекционного процесса.

Патогенез АНИ мягких тканей характеризуется быстрым развитием патологического процесса, высокой интоксикацией летучими жирными кислотами (ЛЖК) и токсическими метаболитами, как микробными, так и тканевыми, поражением всех органов и систем, с развитием полиорганной недостаточности, что вполне соответствует основным диагностическим критериям сепсиса по классификации ACCP/SCCM 1992 года.

Приступая к ГХ-МС диагностике АНИ, мы считали, что для каждой болезни в организме имеется молекулярная мишень, которую можно использовать для диагностики заболевания. В крови больных АНИ оп-ределены основные молекулярные субстраты интоксикации – ЛЖК, фенилкарбоновые кислоты, ди- и полиамины, ароматические амины. В качестве критерия радикальности оперативных вмешательств предложен хроматографический показатель соотношения метаболитов анаэробов в очаге и крови больных — Рочаг/кровь. Радикальное оперативное вмеша-тельство должно предотвратить нарастание концентрации микробных и тканевых метаболитов в крови и предупредить развитие синдрома систем-ной воспалительной реакции и сепсиса. Возможность интраоперационного ГХ-МС исследования мягких тканей позволила оперативно проводить

194

коррекцию тактики оперативного вмешательства и существенно снизить необходимость повторных некрэктомий. Определены молекулярные маркё-ры органных поражений при АНИ, являющиеся элементами полиорганной недостаточности. Для ЦНС — это полиамины, ароматические амины, изомеры галактозы и инозитола; для печени — это фенилкарбоновые кислоты (фенилуксусная, фенилпропионовая); для почек — это фенолы, крезолы; для миокарда в начальных стадиях генерализации системной воспалительной реакции — это ЛЖК и изомеры высших жирных кислот в высоких концентрациях. Поскольку для генерализации инфекционного процесса и развития сепсиса необходим синергизм и кооперация бактерий в микробиоценозе, начало этого процесса и запуск генов патогенности можно определить по наличию ССКЧМ. В крови больных АНИ обнаруже-ны ССКЧМ — лактоны, хинолоны, фурановые эфиры бора, являющиеся «языком общения» микробов между собой и играющие важную роль в реализации микробами своей патогенности.

Диагностическими критериями синдрома системной воспалительной реакции и сепсиса у больных АНИ являются: содержание микробных и тканевых метаболитов в очаге воспаления и крови; послойное интраопе-рационное ГХ-МС исследование пораженных мягких тканей; индикация маркёров органных поражений; индикация активаторов «кооперативной чувствительности» микробов. Разработанный алгоритм ГХ-МС экспресс диагностики АНИ и сепсиса позволяет в 97% поставить правильный доопе-рационный или интраоперационный диагноз и назначить своевременное адекватное лечение.

195

ИНДИКАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЁРОВ TREPONEMA PALLIDUM

Миронов А.Ю., Истратов В.Г., Осман К.А., Терехова Ю.Б.ММА им. И.М. Сеченова, Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН

Проблема диагностики сифилиса обусловлена широким распростра-нением заболевания, возможностью поражения любых органов и тканей, наличием скрытых форм болезни, трудностью культивирования возбуди-теля. Газовая хроматография и масс-спектрометрия (ГХ-МС) позволяют с высокой степенью достоверности определять поражение органов при отсутствии положительных серологических реакций и клинических прояв-лений болезни. Мы использовали ГХ-МС для: 1) анализа биохимических изменений крови больных; 2) индикации молекулярных маркёров орган-ных поражений; 3) индикации сигнальных соединений «кооперативной чувствительности» микробов.

Сепсис — это состояние инфицированности организма, при котором резко усиливаются катаболические процессы в крови, определяются жизнеспособные микробы, резко повышается количество токсических микробных метаболитов, продуктов повреждения и деструкции тканей, а также медиаторов воспаления, а показатели активности эффекторного звена иммунитета снижены (Писаржевский С. А., 1999). Мы считаем, что патогенез сифилиса полностью соответствует вышеприведенному определению.

Приступая к ГХ-МС определению нарушений метаболизма в крови больных сифилисом, мы исходили из того, что для каждой болезни име-ется молекулярная мишень, которую можно использовать для диагнос-тики заболевания. Все патогены могут быть диагностированы методами молекулярной биологии, причём более точно и в более короткие сроки, чем классическими микробиологическими методами. Мы считаем, что Treponema pallidum обладает специфическим молекулярным маркёром, ГХ-МС индикация которого позволяет определить наличие данного патогена в организме.

В крови больных сифилисом определены липидные (ЛЖК, холестерин и его эфиры, триглицериды, фосфолипиды, С14-С20 жирные кислоты, изо- и антиизокислоты), углеводные (D-глюкоза и её изомеры, D-галактоза и её изомеры, L-фукоза, аминосахара, ацетилированные амины глюкозы и ман-нозы) и аминокислотные (алифатические, окси-, дикарбоновые, основные, ароматические, серосодержащие аминокислоты и амиды) компоненты, являющиеся фрагментами клеток T. pallidum. Определены молекулярные маркёры органных поражений при сифилисе. Для ЦНС — это D-галак-тоза, D-трентол, глюкоза и её циклический изомер — инозитол, которые

196

являются продуктами деградации наиболее активных субстратов ЦНС — фосфатидилинозитола и фосфатидилэтаноламина; для печени — это ароматические производные жирных кислот (фенилпропионовая и фе-нилуксусная кислоты), аминокислотные фрагменты, липидно-белковый комплекс неразделенный хроматографически; для костей — это ЛЖК, ЛПС и их субъединицы (С18-С20). В крови больных сифилисом обнаружены активаторы «кооперативной чувствительности» и их субъединицы, такие как бутиролактон, фуранилэтанол, 2-фуран-метанамин и 4-гидрокси-2-хинолинкарбоксиловая кислота, являющиеся «языком общения» микробов между собой. В частности активаторы «кооперативной чувствительности» играют важную роль в реализации микробами своей патогенности.

Информативность ГХ-МС индикации молекулярных маркёров орган-ных поражений и активаторов «кооперативной чувствительности» мик-робов выше по сравнению с традиционными клинико-лабораторными критериями сифилиса. Разработанные ГХ-МС критерии сифилиса имеют высокий уровень диагностической чувствительности (79,6 – 97,2%), диа-гностической специфичности (50,0 – 92,3%), диагностической предсказу-емости положительной (61,3 – 94,7%), диагностической предсказуемости отрицательной (60,9 – 95,1%), что позволяет использовать их в качестве лабораторных диагностических критериев развития сифилиса.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ VHL, RASSF1 И FHIT ПРИ РАКЕ ПОЧКИ

Михайленко Д.С.1, 2, Курынин Р.А.3, Еникеев М.Э.3, Григорян В.А.3, Аляев Ю.Г.3, Залетаев Д.В.1, 2

1 – Научно-исследовательский институт молекулярной медицины при Мос-ковской медицинской академии им. И.М. Сеченова 2 – Медико-генетический научный центр РАМН

3 – Клиника урологии при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова

Введение. Почечно-клеточный рак – наиболее часто встречающаяся опухоль почки. Около 80% рака почки составляет светлоклеточная кар-цинома, в которой инактивируются гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные в области 3р, в результате мутаций, потери гетерозигот-ности (ПГ) или метилирования промотора. По данным различных авторов, функциональное состояние VHL и характер ПГ генов VHL, RASSF1, FHIT может влиять на прогрессию первичной опухоли.

Цель исследования. Изучение спектра мутаций VHL, ПГ областей лока-лизаций VHL, RASSF1, FHIT в зависимости от клинико-гистологических характеристик рака почки.

197

Материалы и методы. Работа выполнена на 16 образцах рака почки (опухолевая и гистологически не измененная ткани), охарактеризованных ранее гистологически и по TNM-параметрам. Геномную ДНК выделяли с помощью протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракци-ей. Мутации в кодирующей части VHL выявляли SSCP-анализом экзонов 1-3 и секвенированием ПЦР-продуктов. ПГ определяли по 6 микросател-литным маркерам: D3S1317 и D3S1038 (VHL), D3S1568 и D3S966 (RASSF1), D3S1300 и D3S1234 (FHIT). Анализ экспериментальных данных проводили с помощью STATISTICA v.6.0.

Результаты и обсуждение. Выявлены соматические мутации VHL в 5 случаях, 3 из них (388_390del3insTC, 608delA и 8203_8216del14) описаны впервые. Обнаруженные мутации приводят к потере функции несущего их аллеля. ПГ исследуемых локусов была выявлена у 8 пациентов, при-чем не была обнаружена у 2 пациентов с мутациями VHL. Возможно, инактивация второго аллеля VHL в части наблюдений осуществляется с помощью метилирования. Все обнаруженные изменения имели место в образцах светлоклеточного рака почки. Ассоциации ПГ исследуемых генов с размерами первичной опухоли или метастазированием отсутствовали. Не исключено, что размер выборки недостаточен для обеспечения требуемой чувствительности статистического анализа.

Заключение. Проведенная работа позволила выявить у 63% (10/16) больных раком почки молекулярно-генетические изменения в опухолевой ткани, в том числе ранее не описанные мутации гена VHL. Необходимо расширение выборки с целью повышения чувствительности анализа воз-можных ассоциаций ПГ с клинико-гистологическими параметрами рака почки.

198

ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ АФП В ОТНОШЕНИИ ДЕНДРИТНЫХ

КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА И ЕГО АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Москалева Е.Ю. , Хомякова А.В., Родина А.В., Посыпанова Г.А., Гороховец Н.А., Макаров В.А., Северин С.Е., Северин Е.С.

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения,Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии

Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

АФП – основной белок сыворотки крови плода, выполняющий фун-кцию переноса полиненасыщенных жирных кислот, ионов тяжелых ме-таллов и некоторых других веществ в пролиферирующие клетки. Рецептор АФП практически отсутствует на мембране нормальных клеток, за исклю-чением моноцитов, макрофагов и нейтрофилов. В литературе имеются противоречивые данные о способности АФП и некоторых производных этого белка оказывать иммуносупрессивное действие и стимулирующее или ингибирующее действие в отношении пролиферации опухолевых клеток. Дендритные клетки (ДК) – важнейшие антигенпредставляющие клетки организма – имеют миелоидное происхождение и поэтому можно ожидать, что АФП может связываться и эндоцитироваться ДК и, модифицируя их активность, оказывать иммунорегуляторное действие. В связи с этим целью работы явилось изучение связывания и эндоцитоза АФП ДК, полученны-ми из моноцитов периферической крови человека, и влияния АФП и его отдельных фрагментов на процесс созревания ДК и их функциональную активность, а также влияния АФП на пролиферацию опухолевых клеток человека. В результате проведенных исследований показано, что АФП, выделенный из ретроплацентарной сыворотки человека и очищенный с помощью иммуноаффинной хроматографии, связывается и эндоцитируется ДК, хотя и менее интенсивно, чем моноцитами. При добавлении АФП к ДК за 24 ч до введения факторов созревания в среду инкубации спустя 48 ч не наблюдали изменения уровня экспрессии маркеров, характеризую-щих степень зрелости ДК: CD80, CD83, CD86, HLA DR, CD54. В то же время обработка ДК АФП изменяла их функциональную активность, т.к. у таких ДК наблюдали снижение антигенпредставляющей способности. Влияние отдельных фрагментов АФП – его домена III и синтетического биологически активного пептида EMTPVNPG из домена III – на антигенп-редставляющую активность ДК было значительно менее выраженным, чем влияние АФП. Ингибирования пролиферации опухолевых клеток человека различных линий под действием АФП (0,1 – 2 мкМ) не наблюдали.

199

ПОДХОДЫ К КОНСТРУИРОВАНИЮ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ТЕРАПИИ

Несвижский Ю.В., Воробьев А.А., Богданова Е.А.Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Концепция развития медицинской науки на ближайшие годы четко определила в качестве перспективных направлений внедрение в практи-ку достижений молекулярной и генотерапии. Успехи этих направлений сопряжены с проблемой внутриорганизменной «адресной» доставки био-логически активных молекул к органам и тканям-мишеням. В качестве векторов возможно использовать эукариотические (например, стволовые) и прокариотические (бактериальные) клетки, а также вирусы. Между тем, появление в макроорганизме генетически чужеродных структур сопря-жено с активным противодействием иммунной системы, которая может существенно снижать ожидаемую эффективность интервентной терапии. В свете сказанного, целесообразно апробировать векторные возможности бактерий, относящихся к группе аутохтонной микрофлоры тела человека и населяющих в норме его биотопы.

В этом плане одним из перспективных биотопов для колонизации бак-териальными векторами представляется слизистая желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Населяющая в норме этот биотоп аутохтонная микрофлора, может быть использована не только как средство доставки необходимого генетического материала, но также использоваться для внутриорганизмен-ной наработки биологически активных молекул: гормонов, вакцинного материала и др. Учитывая простоту перорального введения бактериальных векторов, способность утилизации организмом неизмененных молекул в ЖКТ, а также особенности строения иммунной системы ЖКТ, этот подход представляется вполне реальным.

Проведенные экспериментальные исследования на лабораторных жи-вотных (крысы) прояснили некоторые вопросы, возникшие при разработке проблемы. Так, было экспериментально установлено, что определенные дозы бактерий, представителей нормальной микрофлоры, при пероральном введении способны эффективно колонизировать пристеночный муцин кишечника животных. Показана также возможность усиления инвазивных свойств бактерий иммунобиологическими препаратами: интерфероном и иммуноглобулинами. Определены участки кишечника, наиболее эффек-тивно колонизируемые бактериями. Обсуждаются векторные возможности отдельных представителей аутохтонной микрофлоры тела человека.

200

НОВЫЕ МЕЖДУНАРОДНЫЕ ИНИЦИАТИВЫ В ОБЛАСТИ УСИЛЕНИЯ ПРАВИЛ БИОБЕЗОПАСНОСТИ

И ФИЗИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ЛАБОРАТОРИЙ, РАБОТАЮЩИХ С ИНФЕКЦИОННЫМИ АГЕНТАМИ

Нетесов С.В., Сандахчиев Л.С.Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»,

Кольцово, Новосибирской обл.

До эры антибиотиков, разработки правил антисептики и систем очис-тки питьевой воды инфекционные патогены играли главную роль в забо-леваемости и смертности населения. Достижения в изучении патогенов привели не только к потрясающим успехам в борьбе с инфекциями, но и к выявлению возможностей их применения в военных действиях. Кроме того, за последние годы было совершено несколько попыток их исполь-зования в террористических целях, показавших, что даже примитивно организованные теракты могут привести к значительным последствиям, а сами теракты могут быть совершены и в результате, судя по всему, кражи патогенов. Эти обстоятельства привели к необходимости радикального улучшения национальных правил и международных рекомендаций по работе, хранению и пересылке инфекционных агентов. Признано, что гармонизация этих правил пока что далека от требуемой из-за возрастания уровня международных контактов. Поэтому на ряде недавних конференций профессионалов в области биобезопасности выдвинуты новые инициати-вы в части разработки международных унифицированных требований по физической защите работ с опасными патогенами, среди которых:

1. Разработка под эгидой ВОЗ новых Рекомендаций по обязательному минимуму мер в области физической защиты биоагентов и лабораторий, работающих с ООИ;

2. Совершенствование под эгидой ВОЗ существующих национальных и международных рекомендаций по правилам учета, хранения и транс-портировки препаратов ООИ;

3. Объединение специалистов в области биобезопасности разных стран в ассоциации и общества с целью усиления международной координации работ и унификации правил;

4. Разработка этических кодексов для сотрудников, работающих с патогенами.

С учетом этого в России было принято решение о переработке пра-вил учета, хранения и транспортировки препаратов ООИ; о разработке технических регламентов в этой сфере; идет совершенствование систем подготовки персонала к работе с патогенами. Вместе с тем предстоит еще большая работа по внедрению новых технологий в области биобезопас-ности и физической защиты работ с опасными патогенами в России.

201

КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ ОЖОГОВОЙ ТРАВМЫ ГЛАЗ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ

Николаева Л.Р., Ченцова Е.В., Кузнецов С.Л.1, Спивак И.А.1, Полтавцева Р.А.2, Марей М.В.2, Сухих Г.Т.2

Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца1 – Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова

2 –Центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН, Москва

Введение. Ожоги глаз представляют собой тяжелое повреждение орга-на зрения и отличаются высоким процентом неблагоприятных исходов. Следствием ожогов глаз являются обширные эрозии и персистирующие язвы роговицы, а в дальнейшем – грубые, интенсивно васкуляризованные бельма. Возможность управления репаративными процессами с восстанов-лением прозрачности роговицы и образованием нежного рубца является актуальным и перспективным направлением в офтальмотравматологии.

Цель исследования. Изучение влияния трансплантации нейральных ство-ловых и прогениторных клеток (НСПК) на течение ожоговой болезни глаз.

Материалы и методы. Источником донорского материала служила ткань головного мозга плодов человека 8-12 недель гестации. Исследование проведено на 80 кроликах, на которых была создана стандартная модель тяжелого щелочного ожога роговицы. Сразу после нанесения ожога в опытной группе животных производилась субконъюнктивальная инъекция суспензии НСПК с концентрацией 300 тыс. клеток в 0,2 мл физиологи-ческого раствора. В контрольной группе вводили 0,2 мл физиологического раствора. Клиническую и гистологическую оценку состояния глаз проводи-ли на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е, 22-е, 30-е и 60-е сутки после трансплантации.

Результаты. К концу срока наблюдения в контрольной группе в 12% слу-чаев сохранялся поверхностный дефект стромы роговицы и в 17,3% – пер-систирующая эрозия, в то время как в опыте наблюдалось полное закрытие эпителиального дефекта роговицы на всех глазах. Степень васкуляризации роговицы и воспалительной реакции были более выражены в контроле (3 и 1 балла соответственно в контроле и 1 балл и 0 баллов в опыте). В опытной группе отмечалось формирование более нежного бельма роговицы, по срав-нению с контрольной (7 и 10 баллов соответственно). По данным гистологии к 60 суткам наблюдения в контрольной группе центральная оптическая область роговицы имела передний эпителий в 2 – 3 слоя эпителиоцитов, отмечалась дезорганизация волокнистых структур стромы, прорастание кровеносных сосудов, в то время как в опытной группе эпителизация дости-гала 5 слоев эпителиоцитов с признакамидифференцировки; наблюдалось купирование воспаления в строме, что выражалось в значительно меньшем

202

количестве сосудистого инфильтрата, более плотной упаковке волокнистых компонентов стромы, меньшей степени васкуляризации.

Заключение. На основании полученных клинических и гистологических данных доказана эффективность трансплантации НСПК в ранние сроки после ожога.

ОДОРАНТ-СВЯЗЫВАЮЩИЙ БЕЛОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ КАК ВАЖНЕЙШЕЕ ЗВЕНО В БИОТРАНСФОРМАЦИИ

ЛЕТУЧИХ КСЕНОБИОТИКОВ Новиков С.Н.

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург

Проведен анализ современного состояния по генетике и молекуляр-ной нейробиологии трех основных форм одорант-связывающих белков (odorant-binding proteins, OBPs) млекопитающих: афродизиака, OBP обонятельной выстилки и уропротеинов (MUPs и a2u-глобулины) с м.м. 18-22 kDa. Выделены основные этапы изучения OBPs за последние 25 лет и намечены главные тенденции развития в этом стремительно раз-вивающемся за рубежом научном направлении. Подробно рассмотрена роль OBP в механизмах детоксикации и обеспечении эффективной био-логической защиты организма при действии канцерогенных соединений, летучих ксенобиотиков и чужеродных генетических конструкций. Особое внимание уделено роли генетического полиморфизма OBPs в формиро-вании действенного барьера биобезопасности. На основании собствен-ных экспериментальных данных и результатов зарубежных исследований последнего десятилетия выдвинуто предположение о векторном характере действия транспортного комплекса «OBP-одорант» на специализирован-ные рецепторы обонятельных нейронов с последующим эндоцитозом и транснейрональным переносом данного комплекса в строго определенные области мозга. Сделан вывод о перспективности использования природно-го прототипа ОВРs млекопитающих при создании искусственных транс-портных полипептидных матриц для переноса физиологически активных соединений и лекарственных препаратов с низкой биодоступностью в гидрофильных средах. Обсуждается важность комплексного изучения OBPs, в первую очередь, – MUP и a2u-глобулина, при разработке новых методов молекулярной экспресс-диагностики ряда социально значимых онкологических и нейродегенеративных заболеваний у человека.

Ключевые слова: одорант-связывающие белки, биобезопасность, инт-раназальная фармакология, экспресс-диагностика, MUPs.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 02-04-49273 и 04-04-63050).

203

ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ИЗУЧЕНИИ ПАТОГЕНЕЗА ДЕСМОИДНЫХ ФИБРОМ

Новикова О.В., Батева М.В., Завалишина Л.Э., Дарьялова С.Л., Франк Г.А.МНИОИ им.П.А.Герцена Росздрава

Введение. Десмоидные фибромы представляют собой мезенхималь-ные опухоли мягких тканей, не имеющие морфологических признаков злокачественных образований. Эти опухоли никогда не дают отдаленных метастазов, однако отличаются инвазивным местно деструирующим ростом и крайне высокой частотой рецидивирования. В связи с относительной редкостью десмоидных фибром в литературе имеются лишь отдельные сообщения о результатах иммуногистохимических исследований. В нашей стране подобных работ пока не проводилось.

Цель исследования: изучение роли молекулярных нарушений в патоге-незе десмоидных фибром.

Материалы и методы: Изучено 10 первичных случаев десмоидных фиб-ром (9 женщин и 1 мужчина), спорадические опухоли зарегистрированы у 9 человек, ассоциированные с наследственным полипозом толстой кишки у 1 больного. Иммуногистохимическим методом определяли экспрессию бета-катенина, десмина, гладкомышечного актина, металлопротеиназ 1, 2, 9, ингибиторов металлопротеиназ 1, 2, BAG 1, PCNA, Ki67, рецепторов к эстрогенам и прогестерону.

Результаты и их обсуждение. Положительная реакция на бета-катенин и BAG 1 наблюдалась в 9 из 10 опухолей. Гладкомышечный актин обна-ружен во всех образцах, десмин - в 7, что может указывать на гистогенез опухоли. Рецепторы к эстрогенам и прогестерону не выявлены ни в одном случае,что согласуется с данными других авторов. Экспрессия металло-протеиназ установлена во всех наблюдениях, в тоже время практически во всех случаях ингибиторы металопротеиназ не обнаружены. Маркеры пролиферации демонстрируют умеренную, а в некоторых случаях и высо-кую пролиферативную активность опухолей. Возможно, эти молекулярные нарушения обеспечивают способность десмоидных фибром к инвазивному росту при их малоклеточности.

Заключение: Десмоидные фибромы характеризуются повышенным содержанием бета-катенина в ядрах клеток и белка BAG1, относящимся к семейству Hsp и взаимодействующим с рецепторами стероидных гормонов. Определение бета-катенина может иметь значение в дифференциальной диагностике десмоидных фибром, поскольку при других гистологических типах мезенхимальных опухолей он обнаруживается, согласно данным литературы, достаточно редко.

204

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К САХАРНОМУ ДИАБЕТУ ТИПА 1: ДОСТИЖЕНИЯ И

ПЕРСПЕКТИВЫНосиков В.В.1, Дедов И.И.2

1 – Государственный научный центр РФ «ГосНИИ генетика», г. Москва 2 – Эндокринологический научный центр РАМН, г. Москва

Введение. Сахарный диабет (СД) типа 1 относится к многофакторным, полигенным заболеваниям. Кроме генов, расположенных в области MHC на хромосоме 6p21.3, другие гены на разных хромосомах вовлечены в формирование предрасположенности к СД типа 1.

Целью данной работы являлось изучение сцепления с СД типа 1 семи районов хромосом 1, 2, 6, 9, 10, 11 и 16 с использованием полиморфных генетических маркеров и ядерных семей русского происхождения и поиск в этих районах генов, определяющих предрасположенность к СД типа 1.

Материалы и методы. В работе использовали ядерные семьи, собранные среди русских г. Москвы, с конкордантными (35 семей) и дискордантными (66 семьи) парами сибсов. Идентификацию аллелей полиморфных марке-ров проводили с использованием полимеразной цепной реакции.

Результаты. Наиболее сильное сцепление с СД типа 1 было обнаружено для областей 1q42 (маркер D1S1668, MLS = 2,73), 2q32.1–q33 (IDDM12, MLS = 4,11; Z’ = 4,07), 6q27 (IDDM8, Z’ = 2,59), 10p12.2 (IDDM10, MLS = 3,20; Z’ = 3,83) и 11p13 (маркер D11S907, MLS = 3,93; Z’ = 3,91). По-казано, что в локусах IDDM10 (10p12.2) и IDDM12 (2q32.1–q33) наиболее вероятными генами-кандидатами, определяющими предрасположенность к СД типа 1, являются гены TCF8В и CTLA4. В области 6q27 (локус IDDM8), расположенной вплотную к теломерному району, проведен анализ сцеп-ления с СД типа 1 четырех полиморфных маркеров внутри генов TBP и PDCD2, а также гаплотипов, формируемых аллелями этих маркеров, что позволило выявить гаплотип C-C-G, который наследовался сибсами с СД типа 1 с существенно большей частотой (Z’ = 2,59, Pc = 0,029). Ген CTLA4 кодирует один из поверхностных антигенов Т-лимфоцитов, продукт гена TCF8В подавляет экспрессию целого ряда генов цитокинов, а ген PDCD2 гомологичен гену мыши, кодирующему активатор программируемой ги-бели клеток, то есть все эти гены относятся к той группе генов, продукты которых, наряду с продуктами генов локуса MHC, по всей видимости, учас-твуют в программируемой гибели аутореактивных Т-клеток в тимусе.

Заключение. Обобщая полученные нами данные можно уверенно го-ворить о том, что в русской популяции области 1q42, 2q32.1–q33, 6q27, 10p12.2 и 11p13 сцеплены с сахарным диабетом типа 1, а гены CTLA4, TCF8В и PDCD2 могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов, определяющих предрасположенность к СД типа 1.

205

ТЕЧЕНИЕ АПОПТОЗА В ЭПИТЕЛИИ И ПОВЕРХНОСТНЫХ КЕРАТОЦИТАХ ПОСЛЕ ЧАСТИЧНОЙ КЕРАТЭКТОМИИ

ПРИ ДЕЙСТВИИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ БЕЛКА S100b

Олиневич В.Б., Зиангирова Г.Г., Грудень М.А., Панова И.Г., Шерстнев В.В.ГУ НИИ глазных болезней РАМН, г. Москва

НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, г. МоскваИнститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва

Установлено, что апоптоз кератоцитов, который наступает в ответ на нарушение эпителия независимо от характера повреждающего агента, может быть индуктором раневого процесса, и во многом определять его течении. Предполагают, что ингибирование апоптоза позволит повысить качественное заживление раны роговицы за счет повышения выживаемос-ти клеток в зоне повреждения.

Целью настоящего исследования являлось изучение влияние эндоген-ных синтетических аналогов 5-ти и 6-ти членных пептидных фрагментов белка S100b на процессы апоптоза кератоцитов и клеток базального слоя эпителия в роговице глаза крысы после частичной кератэктомии. Иссле-дуемые пептиды в концентрации 10 – 6 ммоль/л и контрольный раствор вводили трехкратно в конъюнктивальную полость либо эндонозально. Животных усыпляли с помощью эфира на 10 сутки. Окрашивания микро-препаратов роговицы глаза производилось полихромным красителем.

Было выявлено, что фрагменты белка S100b оказывали протектор-ное и стимулирующее влияние на поврежденные клетки роговицы, что проявлялось в ускорении восстановление эпителиального пласта за счет активации митозов, снижению в 2 –2,5 раза количества апоптотических клеток в базальном эпителии и кератоцитах по сравнению с контролем. При этом преобладал незавершенный апоптоз. Отмечено полное восста-новление базальной мембраны, роговичных пластин и активация синтеза протеогликанов. В контроле наблюдали преобладание процессов некроза кератоцитов, лизис роговичных пластин, частичное восстановление базаль-ной мембраны и апоптотическую гибель эпителия. Полученные результаты свидетельствуют, что снижение выраженности апоптоза в базальном эпи-телии и поверхностных кератоцитах, под влиянием пептидных фрагментов белка S100b, способствуют более раннему и качественному восстановлению поврежденной роговицы после частичной куратэктомии.

Работа поддержана РГНФ проект 06 05 01699а

206

ОСОБЕННОСТИ ТЕЧЕНИЯ ГИПЕРТРОФИЧЕСКОЙ КАРДИОМИОПАТИИ И НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

ПОКАЗАТЕЛИ У БОЛЬНЫХ С СЕМЕЙНЫМИ И СПОРАДИЧЕСКИМИ ФОРМАМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Ольбинская Л.И., Парфенова Е.В.1, Каплунова В.Ю., Орешина Т.В.Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

1 – Российский кардиологический научно-производственный кардиологический комплекс МЗ и СР РФ г. Москва

Цель: Оптимизация диагностического поиска гипертрофической карди-омиопатии (ГКМП) путем проведения клинико-генетических параллелей у больных с семейными и спорадическими формами заболевания.

Материалы и методы: Обследовано 39 больных с семейной формой ГКМП (1-я группа) и 45 больных со спорадической формой ГКМП (2-я группа). Проводилось общеклиническое обследование, исследование полиморфизмов гена ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) и гена рецепторов 1-го типа к ангиотензину II (AGTR1), а также исследование гена тяжелой цепи сердечного b-миозина (MYH7).

Результаты: У больных 1-ой группы отмечено более ранее появление клинических симптомов, более тяжелые варианты течения болезни, досто-верно более высокая летальность. В 1-ой группе выявлено 41% больных с DD генотипом гена АПФ, во 2-ой 36,5%. Во 1-ой группе выявлено 20% больных с II генотипом гена АПФ, 2-ой группе 36,5% (р<0,05). Отмеча-лась достоверно большая толщина межжелудочковой перегородки (МЖП) при ID генотипе гена АПФ у больных 1-ой группы. Корреляций между генотипом гена АПФ и тяжестью течения заболевания выявлено не было. В 1-ой группе выявлено 50% больных с АС генотипом гена AGTR1, во 2-ой группе 55,5% с АА генотипом гена AGTR1, в обеих группах СС генотип встречается достоверно реже. При анализе связи генотипа гена AGTR1 со степенью гипертрофии миокарда ЛЖ и тяжестью течения заболевания выявлено не было. При исследовании гена MYH7 выявлены мутации: V606M (ранее описанная); Т827С (de novo); А870С (de novo) у больных 1-ой группы; G584S (de novo) у больной 2-ой группы.

Заключение: У больных с семейными формами ГКМП заболевание выявляется в более раннем возрасте, протекает более тяжело, с достоверно большим процентом летальных исходов. В обеих группах преобладают боль-ные с DD генотипом гена АПФ. В группе с семейными формами ГКМП преобладают больные с АС генотипом гена AGTR1, в группе больных со спорадическими формами – с АА генотипом гена AGTR1. При исследо-вании гена тяжелой цепи бета-миозина выявлена одна ранее описанная мутация и три новые, не описанные мутации в исследуемом гене.

207

СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА ИНДИКАЦИИ И ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

Осин Н.С., Храмов Е.Н., Злобин В.Н.ФГУП Государственный научный центр «Государственный научно-

исследовательский институт биологического приборостроения», г. Москва

Средства индикации биопатогенов следует рассматривать как один из важнейших элементов системы, обеспечивающей биологическую безо-пасность страны.

Индикацию биопатогенов условно делят на неспецифическую и специ-фическую. Средства неспецифической индикации позволяют установить лишь сам факт наличия биопатогена в воздухе, воде, почве или иных мате-риалах. Они основаны на современных высокочувствительных физических методах регистрации сигнала, обусловленного биологическим объектом. Характерные для неспецифической индикации высокая чувствительность и короткое время анализа (от нескольких секунд до 5 минут) позволяют принять ряд экстренных мер по локализации очага заражения.

Средства специфической индикации – это большая группа прибо-ров, комплектов, укладок, с помощью которых решаются задачи иден-тификации биопатогенов для принятия экстренных мер профилактики и лечения. В основе методов специфической индикации лежат методы биоспецифического связывания с использованием в качестве реагентов ферментов, белков и пептидов иммунного комплекса, ДНК, РНК, отде-льных клеточных фрагментов или целых клеток, в том числе генетически модифицированных.

В докладе рассмотрены современные научно-методические направле-ния в создании средств индикации и лабораторной диагностики, в том числе приборов дистанционного и локального мониторинга атмосферы; средств отбора и подготовки проб из воздуха, воды, почвы, биологических материалов; укладок и комплектов для работы в стационарах и автолабо-раториях. Следует отметить, что уровень развития средств биоиндикации определяется современным состоянием методологии и техники детектиро-вания ультранизких концентраций маркеров биомолекул, а также успехами в области биоинженерии и молекулярной диагностики. В ближайшей перспективе следует ожидать заметного прогресса в разработке средств индикации нового поколения на основе достижений нанотехнологий в области мультикомпонентного анализа (биосенсорные усройства, биочипы и чип-лаборатории).

208

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И БИОБЕЗОПАСНОСТЬ

Папонов В.Д., Папонов В.В.Медико-генетический научный центр РАМН

Фонд новейших медицинских и экологических технологий, г.Москва

Обеспечение безопасности населения и отдельных индивидуумов в ус-ловиях высочайшего разнообразия вредных факторов среды и изощрённой фантазии террористов практически невозможно на основе традиционной нозологической диагностики заболеваний. Оптимистическую перспективу обеспечивает концепция общей патологии человека, развитая в монографии Саркисова Д.С., Пальцева М.А., Хитрова Н.К.(1997), о существовании неких интегральных характеристик организма человека, которые становятся ано-мальными при любых заболеваниях, независимо от их этиологии. Главным препятствием в поиске таких характеристик являлось отсутствие критерия для установления границы между нормой и патологией. Учитывая пред-ставления о доклиническом бессимптомном этапе в развитии заболеваний, такие характеристики могли быть только молекулярными.

Нам удалось найти маркёры общей патологии, обратившись к анализу функциональной деятельности генома человека на уровне содержания в лейкоцитах венозной крови определенных белковых продуктов генов в виде 53К/Н2А и 43К/Н2А, где 53К и 43К- белки с массами 53 и 43 кило-дальтон, с разным аминокислотным составом, Н2А- гистон.

В норме эти параметры составили 53К/Н2А<0,25, 43К/Н2А>1,61. Такие значения никогда не встречались оба в норме при обследовании нескольких тысяч больных с наследственными и приобретёнными забо-леваниями инфекционной и неинфекционной природы. Скрининг более 2000 новорожденных детей показал за 6 лет наблюдения, что дети , родив-шиеся с аномальными показателями лейкоцитов, в несколько раз чаще приобретают хронические заболевания (атопический дерматит), опухоли и создают основной контингент часто болеющих детей. Это дает основания для организации профилактики заболеваний у детей на основе скрининга новорожденных по маркерам общей патологии.

Вышеуказанные маркеры позволяют обеспечить раннее выявление па-тологических признаков природных и антропогенных вредных воздействий на популяции в том числе террористического характера.

Анализ белков лейкоцитов до и после однократного лекарственного или любого терапевтического воздействия позволяет объективно установить адекватность или неадекватность реакции организма человека и полностью исключить терапевтические осложнения , т.е. гарантировать безопасность населения (Папонов В.Д. и соавторы, Терапевтический архив 2002,№12, 91-95; 2004,№ 1,82-87, Гигиена и Санитария, 2005,№1,51-55)

209

Получены данные о крайне неоднородном распределении по террито-рии Москвы семей с патологическими отклонениями в репродуктивном периоде, что приводит к 3-х кратным различиям даже соседствующих му-ниципальных районов по процентной доле здоровых новорожденных детей (20 – 65%). Организация скрининга новорожденных по маркёрам общей патологии позволит в несколько раз снизить заболеваемость населения на основе адресных профилактических мероприятий терапевтического и санитарно-гигиенического характера по месту проживания родителей новорожденных детей, выделенных в группу риска. При этом достигается также резкое снижение затрат на здравоохранение. Проблема лишь в ис-пользовании новых прорывных технологий.

БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ КОСТНОГО МЕТАБОЛИЗМА ПРИ МЕТАСТАТИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ

СКЕЛЕТА

Пашков М.В., Любимова Н.В., Кочергина Н.В.ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

ВГМА им. Н.Н.Бурденко, Воронеж

Введение: одной из наиболее распространенных локализаций метаста-зирования злокачественных опухолей является костная ткань, при этом рак молочной (РМЖ) и предстательной (РМЖ) желез характеризуется вы-сокой остеотропностью. В настоящее время большое внимание уделяется исследованию новых современных маркеров костного метаболизма в связи с недостаточной чувствительностью и специфичностью инструментальных методов диагностики метастазов в костях.

Цель исследования: оценка клинической значимости тартратрезистен-тной кислой фосфатазы 5в (ТРКФ) и костной щелочной фосфатазы при метастазировании в кости.

Материалы и методы: в исследование были включены 178 больных РМЖ (95 с метастазами и 83 без метастазов в костях) и 102 больных РПЖ (48 с метастазами и 54 без метастазов в костях). Контрольную группу составили 77 практически здоровых женщин и мужчин. Активность фер-ментов определяли методами ИФА на основе моноклональных антител, высокоспецифичных для костной изоформы ТРКФ («Bone TRAP Assay», Medac Diagnostika, Германия) и КЩФ («Metra BAP EIA kit», Quidel Corporation, США).

Результаты и их обсуждение: активность ТРКФ у больных РМЖ и РПЖ с метастатическим поражением скелета в среднем высокодостоверно

210

(р<0,001) превышала соответствующие значения контроля (в 3,2 и 2,8 раза соответственно) и больных без метастазов в костях, тогда как показатели групп больных без костных метастазов достоверно не отличались от нормы. Средние значения КЩФ у больных РМЖ и РПЖ с поражением скелета также высокодостоверно (р<0,001) превышали показатели контроля (в 2,7 и 4,7 раза соответственно) и больных без метастазов в костях. При исследо-вании в динамике активность ТРКФ достоверно снижалась у больных, по-лучавших ибандронат. Диагностическая чувствительность ТРКФ и КЩФ, которую оценивали с учетом пороговых значений, соответствовавших 95% доверительному интервалу, составила 78,9% и 60,0% при специфичности 92,8% и 96,2%) для РМЖ и 64,7% и 84,4% (при специфичности 92,6% и 89,5%) для РПЖ соответственно.

Заключение: совместное определение ТРКФ и КЩФ способствует повышению точности диагностики и мониторинга костных метастазов у больных РМЖ и РПЖ.

ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР ДЛЯ МОНИТОРИНГА МИНИМАЛЬНОЙ

ОСТАТОЧНОЙ БОЛЕЗНИ ПРИ ОСТРОМ ЛЕЙКОЗЕ

Пехов В.М.1, Косорукова И.С.2, Малахо С.Г.1, Полтараус А.Б.1

1 – Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН2 – НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Современная терапия позволяет достичь ремиссии у большинства пациентов с острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ) с транслока-цией 1(15;17). Однако, и в полной клинической ремиссии в крови (ПК) и костном мозге (КМ) остается некоторое количество лейкозных клеток - минимальная остаточная болезнь (МОБ). Мониторинг уровня МОБ имеет решающее значение для прогноза, выбора тактики лечения и ранней диагностики рецидивов. Хромосомная транслокация 1; (15; 17) приводит к образованию химерного гена РМL-RАRа, который является молекулярным маркером ОПЛ.

Цель исследования заключалась в демонстрации возможности исполь-зования метода ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для мониторинга МОБ при ОПЛ путем определения уровня экспрессии химерного гена РМL-RАRа.

Исследование проводилось на клинических образцах от 2 больных ОПЛ с транслокацией 1(15; 17), полученных в динамике. У одного больного химерный ген РМL-RАRа был представлен L изоформой, у другого – 8. На основе выделенной тотальной РНК синтезировали кДНК. В качестве

211

внутреннего положительного контроля служил ген АВЬ. L и S изофор-мы РМL-RАRа, АВЬ амплифицировали методом ПЦР-РВ, на приборе АВI Prism 7000, с помощью отечественного набора реактивов Риалити™ (ООО Биочип-ИМБ). Использовали ТаgМаn зонд и праймеры, синтези-рованные согласно рекомендациям Европейской Программы по борьбе с раком. При анализе результатов рассчитывали нормализованное число копий (НЧК) – отношение числа копий РМL-RАRа к числу копий АВL.

Число копий РМL-RАRа в 1 мкг тотальной РНК до лечения достигало 831.5 тыс. (НЧК 0,265). Спустя 1 месяц после начала химиотерапии ко-личество РМL-RАRа снизилось в 25 – 1800 раз. Спустя 3,5 месяца после начала лечения у одного пациента наблюдалась молекулярная ремис-сия – копии РМL-RАRа в ПК и КМ не определялись методом ПЦР-РВ. У второго больного через 3 мес. после наступления ремиссии в КМ и ПК все еще детектировались маркеры лейкозных клеток (НЧК 0,0003 и 0,009, соответственно).

С помощью метода ПЦР-РВ достоверно определена копийность L и S изоформ химерного гена РМL-RАRа у больных ОПЛ на разных стадиях лечения. Чувствительность метода позволяла обнаружить 1 лейкозную клетку среди 104 – 105 нормальных, что в среднем в 10 раз превышает чувствительность других методов (иммунофенотипирования, ОТ-ПЦР и др.). Это дает возможность контролировать уровень МОБ и подбирать индивидуальные схемы лечения, предупреждая возникновение рецидивов заболевания.

212

ВЛИЯНИЕ ИММОБИЛИЗАЦИОННОГО СТРЕССА НА ДНК-СВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ РЯДА

ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ У НОРМОТЕНЗИВНОЙ ЛИНИИ КРЫС WAG И

ГИПЕРТЕНЗИВНОЙ ЛИНИИ НИСАГ

Пивоварова Е.Н., Редина О.Е., Маркель А.Л.Институт цитологии и генетики СО РАН

Гипертония является одним из наиболее широко распространенных сердечно-сосудистых заболеваний. В клинике в зависимости от этиологии принято различать первичную, или эсснециальную и вторичную, или сим-птоматическую формы гипертонии. Причины эссенциальной гипертонии, на долю которой приходится около 85% всех случаев гипертензии, не ясны. Гипертоническая болезнь формируется под действием многих наследствен-ных и средовых факторов. Одним из основных средовых факторов является психоэмоциональный стресс. Для изучения развития гипертонической болезни человека под влиянием психоэмоционального стресса в ИЦиГ СО РАН была создана уникальная модель крыс НИСАГ с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией.

В данной работе изучалось влияние эмоционального стресса на изме-нение регуляции экспрессии генов у гипертензивных крыс НИСАГ по сравнению с крысами нормотензивной контрольной линии WAG.

Методом задержки в геле в ядерных экстрактах печени была исследова-на ДНК-связывающая активность следующих транскрипционных факто-ров (ТФ): PPAR (рецептор активаторов пролиферации пероксисом), LXR (печеночный икс рецептор), AhR (арил гидрокарбоновый рецептор).

Были найдены существенные различия в ДНК-связывающей активнос-ти PPAR и LXR. У крыс НИСАГ их активность в покое и при стрессе была одинаково высокой. У крыс WAG активность данных ТФ повышалась до уровня НИСАГ только при стрессе. ДНК-связывающая активность AhR в покое была выше у крыс WAG. При стрессе она существенно увеличи-валась у обеих линий.

PPAR и LXR участвуют в регуляции генов липидного обмена. Пос-кольку их активность в покое у крыс НИСАГ была максимальной и не менялась при стрессе, можно предполагать, что крысы НИСАГ находятся в состоянии «хронического стресса», что должно приводить к нарушениям регуляции липидного обмена. AhR участвует в индукции цитохромов P450 1A1, 1A2 и 1B1, которые играют важную роль в детоксикации ксенобио-тиков и стероидном метаболизме. Наши данные предполагают индукцию данных цитохромов под действием психоэмоционального стресса.

Данная работа поддержана грантом РФФИ 05-04-48567.

213

ПРОБЛЕМА ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С У БЕРЕМЕННЫХ И БИОБЕЗОПАСТНОСТЬ

Побединский Н.П., Гурская Т.Ю., Никитин И.Г.Кафедра акушерства и гинекологии №1 ММА им. И.М. Сеченова

Кафедра госпитальной терапии №2 РГМУ

Вирусный гепатит С является значимой медико – социальной пробле-мой с точки зрения возможности инфицирования плода в ходе естествен-ного течения беременности и родов. Настоящим исследованием пресле-довалась цель оценить состояние диагностики хронического гепатита С у беременных на примере пациенток 2го акушерского отделения клиники акушерства и гинекологии ММА им. Сеченова. Период наблюдения бере-менных продолжался с 2002 по 2005 годы. По нашему наблюдению основ-ным критерием диагностики хронического гепатита С являлось выявление суммарных антител к вирусу гепатита С – anti – HCV. У 92% беременных наряду с определением уровня трансаминаз диагностика хронического гепатита С на этом заканчивалась, у 6 % беременных она дополнялась качественным определением РНК вируса в сыворотке крови, выполненное методом полимеразной цепной реакции (PCR – RT HCV RNA), у 2% вы-полнялась методика определения виремии (количественный вариант PCR – RT HCV RNA). В то время, как для диагностики хронического гепатита С разработаны четкие критерии, одобренные и принятые Национальным Институтом Здоровья США (NIH, 1999, 2003) и Европейской Ассоциацией по изучению печени (EASL, 1999, 2003). На основании этих консенсус-ных документов диагностика хронического гепатита С складывается из определения anti – HCVсуммарных (этап скрининга), уровня трансаминаз (прежде всего аланиновой), выполнение тестов PCR – RT HCV RNA (ка-чественно, а при необходимости и количественно), выполнение пункци-онной биопсии печени, дающей представление о некровоспалительном и фибротическом компоненте гепатита. Таким образом, только выполнение приведенных выше методов обследования дает право сформулировать (или отвергнуть) диагноз хронического гепатита С. А ведь информация, например, об уровне виремии, данных морфологического исследования печеночного биоптата, на наш взгляд существенно влияют как на способ родоразрешения, выбор анестезиологического пособия в родах, так и на последующие рекомендации наблюдения за младенцем.

Как показывают наши собственные наблюдения, определение anti – HCV проводится в женских консультациях тогда, когда женщина уже беременна. Это в существенной мере осложняет дальнейшую диа-гностику, например, проведение пункционной биопсии печени, в то же время определение PCR – RT HCV проводится однократно (как правило, в первом триместре), что никак не может определять не только тактику

214

ведения беременных, а зачастую формулировать диагноз вообще (харак-терна волнообразная виремия).

По нашему мнению, перед планированием беременности женщина в обязательном порядке должна быть обследована на anti – HCV, при их вы-явлении должна быть запущена полноценная программа обследования. При выявлении же anti – HCV уже на этапе беременности обязательно выполне-ние PCR – RT HCV RNA как минимум трехкратно с равными временными промежутками и обязательным биохимическим мониторингом.

Все это позволит правильно определить тактику ведения беременности, а также – тактику родоразрешения, рекомендаций по грудному вскарм-ливанию и т.д.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ЭКСПРЕССИИ ГОРМОНОВ В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ

Полякова В.О., Трофимов А.В.ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-ПетербургСанкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН

В последние два десятилетия появляется все больше и больше данных о том, что идентичные пептидные гормоны и биогенные амины синтезиру-ются нервными, иммунными и эндокринными клетками. Такая общность химических механизмов трех регуляторных систем организма – нервной, эндокринной и иммунной стимулировала бурное развитие исследований в новой области знаний, названной нейроиммуноэндокринологией. Однако, лишь отдельные исследования посвящены верификации конкретных гор-монов в лимфоцитах, в то время как другие типы иммунокомпетентных клеток в этом плане детально не изучены. В этой связи изучение возмож-ной экспрессии биогенных аминов и регуляторных пептидов в различных иммунокомпетентных клетках является актуальным.

Объектом исследования явились тимоциты и эпителиальные клетки ти-муса, тучные клетки, естественные киллеры и эозинофильные лейкоциты человека. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса абортных эмбрионов на 20-недельном сроке развития. После соответствующих процедур разде-ления тимоцитов на субпопуляции CD4+ или CD8+ экспрессию мембран-ных молекул для их идентификации определяли методом проточной ци-тофлуорометрии на проточном цитометре FACSСalibur (Becton Dickinson). В качестве тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S, ранее полученные путем трансформа-ции ТЭК эмбрионального тимуса человека вирусом SV40 и последующего клонирования трансформированных клеток. Естественные киллеры (NK-

215

киллеры) выделяли из селезенки доноров центрифугированием в гради-енте Ficoll-Paque. Тучные клетки и эозинофильные лейкоциты изучали на гастробиоптатах в слизистой оболочке и подслизистом слое желудка. Иммуноцитохимические исследования проводили с использованием ан-тител к различным гормонам.

В различных субпопуляциях тимоцитов человека, находящихся на различной стадии дифференцировки, обнаружена экспрессия следующих гормонов: в предшественниках Т-лимфоцитов (CD4-CD8-) содержатся серо-тонин и мелатонин; в незрелых кортикальных клетках (CD4+CD8+) обнару-жен только серотонин, в зрелых медуллярных клетках (CD4+CD8-) выявлен серотонин, мелатонин, бета-эндорфин и гистамин. В ТЭК, формирующих тельца Гассаля обнаружена экспрессия серотонина, соматостатина и гаст-рина. В тучных клетках верифицирована экспрессия серотонина, мелато-нина, гистамина, вазоактивного интестинального пептида. Положительная иммунореактивность к мелатонину, серотонину, инсулину, соматостатину и бета-эндорфину зарегистрирована в естественных киллерах. Эозинофиль-ные лейкоциты секретируют серотонин и мелатонин.

Выявленная экспрессия гормонов в иммунокомпетентных клетках отражает важную роль присущей им гормональной функции в обеспече-нии молекулярной сигнальной регуляции физиологических процессов в живом организме.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАТОГЕНОВ НА ОСНОВЕ НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО

ФОСФОРЕСЦЕНТНОГО МИКРОАНАЛИЗА

Помелова В.Г., Осин Н.С., Быченкова Т.А., Соколова А.С., Шарафудинова Т.Ю., Аслиян С.К.

ФГУП Государственный научный центр «Государственный научно- исследовательский институт биологического приборостроения», г. Москва

Введение и цель работы. Перечень потенциальных агентов биотеррориз-ма может включать более 40 наименований микробов, вирусов и токсинов. Цель работы состояла в разработке мультианалитической детектирующей системы для быстрого одновременного обнаружения и предварительной идентификации нескольких патогенов в образцах из объектов окружающей среды. Для этого была разработана новая диагностическая технология фосфоресцентного сканирующего мультианализа (сокращенно, ФОС-ФАН), сочетающая преимущества твердофазного микропланшетного сан-двич-иммуноанализа и сканирующего режима с временным разрешением фосфоресценции.

216

Материал и методы. В работе использовали вакцинные штаммы или изолированные антигены ряда возбудителей (сибирской язвы, чумы, ту-ляремии, венесуэльского энцефаломиелита лошадей и др.). На дне лунок оптически прозрачного полистиролового планшета создавали несколько пространственно разделенных зон (пятен) диаметром 1 – 1,5 мм. Каждая из этих зон содержала иммобилизованные антитела, специфические к тому или иному определяемому возбудителю. Для проявления иммуноре-акции использовали смесь биотинилированных антител и стрептавидин, меченный фосфоресцентной меткой Pt-копропорфирином. Сигнал от фосфоресцентной метки, биоспецифически связанной с детектируемым антигеном, регистрировали непосредственно со дна лунки микропланшета при сканировании лазером.

Результаты. Чувствительность разработанного метода анализа дости-гает 103 ИД50/мл при отсутствии перекрестных реакций с родственными возбудителями и чужеродным биологическим материалом, который может присутствовать в окружающей среде. Продемонстрирована возможность одновременного определения четырех возбудителей в одном образце.

Заключение. Технология ФОСФАН перспективна для разработки чувс-твительных и специфичных методов одновременного определения в пробах нескольких (множества) патогенов.

НОВЫЙ КАСКАД В ПЕРЕДАЧЕ СИГНАЛА РЕЦЕПТОРА ИНТЕРФЕРОНА I ТИПА И РОЛЬ ЭТОГО КАСКАДА В ЭФФЕКТИВНОЙ ТЕРАПИИ ИНТЕРФЕРОНАМИ

Помыткин И.А.1, Свентицкий Е.Н.2

1 – НПО «Тонкие Технологии», Москва 2 – ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, с-Петербург

Известно, что Jak-STAT путь передачи сигнала рецептора интерферона I типа играет ключевую роль в индуцируемой интерфероном активации транскрипции генов, ответственных за противовирусный эффект интерферо-нов альфа и бета. Активность факторов транскрипции, белков STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription), регулируется обратимым фосфо-рилированием остатков тирозина, причем тирозин-киназы Jak фосфорили-руют и активируют STAT в ответ на связывание интерферона с рецептором, а внутриклеточные протеин-тирозин-фосфатазы (ПТФ) дефосфорилируют и деактивируют STAT. Практическая важность исследований в области пере-дачи сигнала рецептора интерферона связана с тем, что наиболее опасные вирусы, например, вирус гепатита С, препятствуют действию интерферона, используя механизмы ингибирования Jak-STAT пути.

217

Нами обнаружено, что активация интерфероном-альфа STAT белков имеет более сложный характер, чем это было известно ранее. Найдено, что наряду с хорошо известной активацией реакции фосфорилирования STAT тирозин-киназами Jak, интерферон индуцирует быстрый процесс ингиби-рования ПТФ, что согласованно ведет к активации STAT. Молекулярный механизм индуцированного интерфероном ингибирования ПТФ включает интерферон-стимулированную активацию генерации Н2О2, физиологи-ческого ингибитора ПТФ, в респираторной цепи митохондрии, причем сукцинатдегидрогеназа (СДГ) играет ключевую роль в этом процессе.

Показано, что условия, влияющие на скорость генерации Н2О2 мито-хондрией, могут влиять на противовирусный эффект интерферона. Ян-тарная кислота, субстрат СДГ и наилучший субстрат для генерации Н2О2

в митохондрии, дозазависимо усиливает как фосфорилирование STAT, так и противовирусную активность интерферона. Деоксихолевая кисло-та, ингибитор генерации Н2О2 в митохондрии, дозазависимо ингибирует противовирусный эффект интерферона.

Таким образом, нами обнаружен неизвестный ранее каскад в передаче сигнала рецептора интерферона I типа, участвующий в активации STAT. Изучение факторов, влияющих на работу этого каскада, позволяет выявить новые механизмы развития резистентности к интерферонам с целью по-вышения эффективности цитокиновой терапии.

АЭРОЗОЛЬНОЕ ВВЕДЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

Помыткин И.А.1, Свентицкий Е.Н.2, Тяготин Ю.В.2, Егорова Т.С.2, Черняева Е.В.2

1 – НПО «Тонкие технологии», Москва2 – ГНЦ Гос НИИ особо чистых биопрепаратов, С-Петербург

Известно, что лекарственная форма и способ ее применения в значи-тельной мере определяют терапевтическую эффективность используемых средств. Наиболее распространенным методом введения современных белковых препаратов в организм пациента является инъекционный способ. Один из перспективных неинъекционных способов связан с возможностью использования аэрозольных форм препаратов. Они позволяют достичь не только системный, но и максимально местный эффект, обладают меньшим побочным воздействием, являются предпочтительными для пациентов по сравнению с инъекционным введением. Дополнительным преимуществом аэрозольных препаратов может быть их отличительная фармакокинетика, с ускоренным поступлением лекарственного средства в системный кровоток.

218

Таким образом, аэрозольный способ введения позволяет в определенной мере дополнить и оптимизировать профилактическую и лечебную терапию различных заболеваний.

В этой связи значительный интерес представляют аэрозольные препа-раты, вводимые в сублингвальную область – из-за большой поверхности контакта с организмом пациента (~ 0,4 м2) и возможности применения индивидуальных технических средств, обеспечивающих сравнительно не-высокую дисперсность аэрозоля с размером частиц более 20 мкм. Однако эффективное использование таких препаратов ограничивается недоста-точной проницаемостью поверхности слизистой для больших белковых молекул. Обычно используемые усилители абсорбции активизируют трансцеллюлярное (через клетку) поступление и наиболее пригодны для транспорта липофильных молекул.

Проведенные нами исследования поступления аэрозольных сублинг-вальных препаратов интерферона a2в, эритропоэтина, интерлейкина 1b, антагониста рецептора интерлейкина 1b в кровь животных (мыши С57Bl) показали:

1. Появление пиковых концентраций наблюдаемых белков в крови уже через 5 – 20 минут (при внутримышечном введении максимальное содер-жание этих лекарственных средств наблюдается через 120-240 минут)

2. Включение в препарат компонентов, повышающих трансэпители-альную проницаемость, позволяет увеличить в несколько раз содержание наблюдаемых белков в крови.

3. Использование в указанных целях парацеллюлярного (между клетка-ми) транспорта для доставки в циркуляцию гидрофильных белковых моле-кул повышает эффективность аэрозольных сублингвальных препаратов.

4. Полученные заключения о механизме активации парацеллюляр-ного транспорта могут быть использованы при разработке эффективных фармацевтических композиций для неинъекционного введения белковых лекарственных препаратов.

219

ПОТЕРЯ ЛАМИНИНА-5 КАК ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ КРИТЕРИЙ ДИАГНОСТИКИ АДЕНОКАРЦИНОМ

ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗ

Попова О.П., Кузнецова А.В., Данилова Т.И., Иванов А.А., Пальцев М.А.Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Исследования последних лет показывают, что паранеопластическая строма, благодаря своим паракринным эффектам, может оказывать ин-дуктивное действие на прогрессирование и инвазивный рост малигнизи-рованного эпителия. При этом происходят изменения путей регуляции как пролиферации эпителиальных клеток, так и экспрессии маркеров инва-зии, в частности, адгезивных и антиадгезивных белков и их рецепторов. В настоящей работе была исследована выработка ламинина-5, интегрина α6β1, тенасцина и факторов регуляции белков внеклеточного матрикса – фактора роста фибробластов –2 (ФРФ-2) и трансформирующего фак-тора роста – β (ТФР-β) при раке предстательной (n=25) и молочной желез (n=15), отличающихся формированием реактивной стромы и представ-ляющих собой гомологичные, в некоторых аспектах, аденокарциномы у мужчин и женщин.

Потеря ламинина-5, адгезивного компонента ацинарной базальной мембраны, явилась наиболее показательным и стабильным признаком обоих типов аденокарцином. В то же время экспрессия данного маркера на немалигнизированных участках обоих органов во всех случаях была со-хранена. Сходные изменения касались также интегринового рецептораα6β1

к ламинину: исключение составили низкодифференцированные опухоли с единичными метастазами, для которых было отмечено очаговое усиление экспрессии интегрина α6β1 на границе инвазивного роста. Для этих же случаев также было характерно и аномальное появление непосредствен-но в клетках карциномы экспрессии антиадгезивного белка тенасцина. При дальнейшем изучении характера распределения тенасцина в случае рака предстательной железы отмечена гетерогенность его локализации с некоторой тенденцией к периацинарному усилению в строме према-лигнизированных (ПИН) и малигнизированных участков опухоли. При раке молочной железы, для которого, в отличие от рака предстательной железы, не характерна гистологическая гетерогенность, было очевидным закономерное присутствие тенасцина в зонах злокачественного роста. При изучении регуляторных факторов только распределение ТФР-β отличалось определенной закономерностью. ТФР-β локализован почти исключитель-но во фрагментах опухолей с доброкачественными изменениями и не отмечен в эпителии фокусов злокачественного роста. Так как характер распределения ТФР-β ассоциировался с таковым ламинина-5, то можно

220

предположить кандидатную роль этого фактора в регуляции экспрессии ламинина. Разница в выработке обоих антигенов на доброкачественных и злокачественных участках опухолей была подтверждена исследованиями в первичных культурах.

Выявленные изменения имеют как прогностический, так и диагности-ческий потенциал. Экспрессия интегрина α6β1 и тенасцина, по-видимому, несут динамический характер и отражают разные стадии распространения карциномы. Стабильная потеря ламинина свидетельствует о глубоком нарушении структуры ацинарной базальной мембраны и утрате контакта с ней эпителия, что является закономерным этапом развития инвазии. Найденный признак может служить дополнительным критерием диффе-ренциальной диагностики рака предстательной и молочной желез.

221

РАЗРАБОТКА СИСТЕМ НЕВИРУСНОЙ ДОСТАВКИ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ

НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Посыпанова Г.А., Позмогова Г.Е., Чувилин А.Н., Киреева Н.Н., Гороховец Н.В., Северин Е.С.

Московский НИИ медицинской экологии Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения

Центр Биоинженерия РАН Институт молекулярной медицины ММА им. И.М.Сеченова, Москва

В последние годы активно развивается направление генотерапии, свя-занное с использованием антисмысловых олигонуклеотидов (АСОН) для лечения ряда заболеваний, таких как лейкемия, рак, СПИД. Но до сих пор актуальной остается проблема адресной доставки этих соединений в клетки-мишени, где АСОН должен найти ту мРНК или участок хромосом-ной ДНК, против которой он направлен. Перспективным представляется использование для адресной доставки АСОН белковых и пептидных век-торов, способных проникать в клетки-мишени путем рецепторопосредо-ванного эндоцитоза.

Целью исследования было создание нового типа адресованных пептид-ных векторов, способных доставлять в клетки-мишени и олигонуклеотиды, и плазмиды. Этод подход основан на способности белковых векторов, несущих в своем составе ДНК-связывающий домен, самоассоцииро-ваться с нуклеиновыми кислотами. Полученный нами рекомбинантный белок-вектор состоит из рецептор-связывающего домена (эпидермальный фактор роста, EGF) и мотива сигнала ядерной локализации (NLS). Пос-ледовательность NLS служит для связывания с ДНК и способствует ее транспорту в ядро. Новый вектор PGEk (EGF-NLS) получали экспрессией в E. coli. Модификация EGF по N-концу не изменяла его взаимодействия с рецепторами благодаря удаленности концевой NH2-группы от места связывания. Было показано, что полученный белок способен эффективно и направленно переносить фосфодиэфирные и тиофосфорильные АСОН в клетки, экспрессирующие рецепторы EGF. С помощью флуоресцентно меченых АСОН была исследована динамика этого процесса, определено оптимальное соотношение компонентов в комплексе, биологическая ак-тивность комплексов PGEk с АСОН к c-myc и теломеразе.

Простота и технологичность полученной новой конструкции делают ее весьма привлекательной для использования не только в экспериментах in vitro, но, возможно, в перспективе, и в качестве терапевтического средства для лечения онкологических и других заболеваний.

222

ВЛИЯНИЕ ICAM-1 (-241G/A И -469Т/С) ГЕННОГО ПОЛИМОРФИЗМА НА РАЗВИТИЕ ПАРОДОНТИТА

Почтаренко В.А.1, Янушевич О.О.1, Приор Карола2

1 – Московский государственный медико-стоматологический Университет2 – Вестфальский Университет Вильгельма, г. Мюнстер (Германия)

Воспалительные заболевания пародонта остаются в настоящее время одной из важных и наиболее сложных проблем в современной стоматоло-гии. По данным ВОЗ за 2000 г. распространенность заболеваний пародонта в возрастной группе 35-44 лет в целом по миру составляет в среднем 94,3%. Именно поэтому все большее внимание исследователей сфокусировано на факторах, которые не вызывают заболевание как таковое, но способны усугубить течение воспалительного процесса, делая человека более вос-приимчивым к развитию пародонтита. К подобным факторам риска, в частности, относят генетический фактор. Исследования в данной области идут по пути поиска конкретных генов, полиморфизм которых можно было бы использовать в качестве маркера развития пародонтита.

Цель работы: изучить взаимосвязь между полиморфизмом ICAM-1 гена (позиции -241G/A и -469Т/С) и развитием пародонтита, а также влияние генетического статуса пациентов с хроническим генерализованным паро-донтитом на динамику течения заболевания.

Материалы и методы: в исследование были включены 117 больных с хроническим генерализованным пародонтитом, а также 51 человек без признаков развития заболеваний пародонта. Для оценки динамики течения пародонтита проводилось измерение глубины пародонтального кармана и кровоточивости при зондировании, повторное обследование осуществля-лось через 10-14 недель. После забора 10 мл венозной крови для выделения ДНК всем пациентам проводилось соответствующее пародонтологическое лечение. Для проведения генотипирования использовалась аллель-специ-фическая ПЦР с последующим электрофорезом агарозного геля.

Результаты: Полиморфизм гена ICAM-1 изучался в позиции 241 (G→A транзиция) и в позиции 469 (T→C транзиция). Два из трех возможных генотипов в -241 (GА и GG) были обнаружены в обеих группах, тогда как гомозиготы АА были выявлены только среди пациентов в 3,4% случаев. В -469 в обеих группах встречались все три возможных генотипа (ТТ, ТС и СС). Однако никакой статистически значимой разницы в частотах аллелей и генотипов между группами обнаружено не было. Динамика клинических параметров была положительной вне всякой зависимости от генотипа пациента. Вывод: полиморфизм ICAM-1 (-241G/A и -469Т/С) гена не может использоваться в качестве маркера для ранней диагностики пародонтита.

223

ОСОБЕННОСТИ МАКРО- И МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО ГОМЕОСТАЗА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ И

СЫВОРОТКЕ ПУПОВИННОЙ КРОВИ

Протасова О.В.1, Максимова И.А.2, Ботвин М.А.3, Захарова О.В.3

1 – Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН2 – Отделение биологических наук РАН

3 – Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова

Дисбаланс макро- и микроэлементного гомеостаза отражает нарушение структурно-метаболических функций целостной системы. Сравнительное изучение количественных различий макро- и микроэлементов в сыворотке крови и её ультрафильтрате в конце беременности и в сыворотке пуповин-ной крови и её ультрафильтрате дало возможность получить принципиаль-но значимые представления об особенностях биоэлементного гомеостаза и функцией связанных с ним белковых молекул. Содержание макро- и микроэлементов исследовали методом атомной эмиссионной спектромет-рии с индуктивно связанной аргоновой плазмой. Измерения проводили на спектрохимической системе «Spectro-Ciros» (Германия).

Последовательность концентраций исследованных эссенциальных макро – и микроэлементов в сыворотке крови беременных и сыворотке пуповинной крови выстроена следующим образом – Na>S>P>Ca>K>Mg>Fe>Cu>Zn>Sr>Se>Mo>Co>Cr>B и Na>S>K>P>Ca>Mg>Fe>Zn>Cu>Se>Sr>Mo>Co>Cr>B соответственно. Так, содержание меди в сыворотке крови в конце беременности достигает 2,333мкг/мл (физиологическая норма 0,7 – 1,2 мкг/мл), содержание меди в пуповинной крови составляет 0,3 – 0,5 мкг/мл. В то же время, содержание ультрафильтруемой меди в сыворотке крови в конце беременности не отличается от физиологической нормы и составляет 1 – 3% от общего количества меди, что свидетельствует о том, что повышенное количество меди в конце беременности локали-зовано в церулоплазмине и белках с молекулярной массой более 100 kD. Зарегистрированное нами содержание ультрафильтруемой меди является ее «свободной» формой. В сыворотке пуповинной крови количество «сво-бодной» меди, т.е. меди не локализованной в белках составляет 7 – 9% от общего количества и свидетельствует о том, что существует особый меха-низм поддерживающий гомеостаз меди у новорожденных.

Показана особенность биоэлементного состава сыворотки крови бе-ременных и сыворотки пуповинной крови, которая заключается как в количественном различии, так и форме взаимосвязи неорганических ионов с белковой матрицей.

224

СТИМУЛЯЦИЯ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА ПРИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРЕНАТАЛЬНЫХ

ХОНДРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА

Пулин А.А., Бажанов Н.А., Шаменков Д.А., Фатхудинов Т.Х., Григорьян А.С., Гольдштейн Д.В.

Институт стволовой клетки и клеточных технологий РАМН ЗАО «РеМеТэкс»

Центральный научно-исследовательский институт стоматологии ФАЗСР РФ

В представленной работе изучались особенности репаративного остеогенеза при введении суспензионного клеточного ксенотрансплан-тата хондробластов (ХБ) человека. Для этого была разработана модель экспериментального повреждения диафиза бедренной кости у крыс. В опытной группе в дефект на одной из конечностей вводили клеточный трансплантат, на противоположной конечности – физиологический рас-твор. В контрольной группе в дефекты на обеих конечностях вводили фи-зиологический раствор. В раннем и позднем послеоперационном периоде состояние животных оставалось удовлетворительным, неугнетенным, без местных патологических реакций и осложнений. Выведение животных из эксперимента проводили на 10, 30, 60 и 90 сутки наблюдения. Кроме на-блюдений за общим состоянием животных и области экспериментальных ран, исследований макропрепаратов при аутопсии животных, основными методами исследования и верификации служили гистоморфологическое исследование тканей из области экспериментального воздействия и гис-томорфометрический анализ кинетики тканевых компонентов костного регенерата. В области введения клеточных трансплантатов, ксеногенных для подопытных животных, не наблюдалось сколько-нибудь выраженных реакций отторжения, воспаления, лимфо-гистиоцитарной инфильтрации. Введение ХБ в область дефекта кости обеспечивало ускорение и улучшение качества регенерации по сравнению с контрольной группой (р<0,05), осо-бенно выраженное на 10 сутки. Кроме того при одностороннем введении клеточного трансплантата был выявлен эффект стимуляции регенерации на противоположной конечности за счет ускорения созревания костной ткани (р<0,05), хотя он был выражен в меньшей степени. В более отдаленные сроки наблюдений, помимо построения костных трабекул, в регенерате на первый план выдвигались процессы созревания костной ткани. На 90 сутки наблюдения в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и образованная костная ткань успешно встраивалась в костный орган. Ксенотрансплантация пренатальных ХБ без проведения иммуносупрессии не продемонстрировала ранних и поздних осложнений, местных реакций отторжения трансплантата. В результате исследования

225

было показано, что костная ткань, образующаяся при трансплантации ХБ, встраивается в костный орган и подвергается полноценному ремоде-лированию. Полученные результаты могут служить экспериментальным обоснованием для аллогенных имплантаций пренатальных ХБ при лечении обширных дефектов костной ткани в клинической практике.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ АСПЕКТЫ ПАТОГЕНЕЗА ТРОМБОФИЛИИ У БЕРЕМЕННЫХ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ

СИНДРОМОМ

Пшеничникова Е.Б., Пшеничникова Т.Б., Макацария А.Д.Кафедра акушерства и гинекологии медико-профилактического факультета

ММА им. И.М. Сеченова

Учитывая тот факт, что метаболический синдром часто сочетается с тромбофилическими осложнениями, а также роль тромбофилии в акушер-ской патологии, следует сказать, что женщины с метаболическим синд-ромом (МС) входят в группу высокого риска по развитию разнообразной акушерской патологии, не говоря о риске тромботических осложнений, который присутствует в течение всего гестационного процесса.

Цель работы: изучение взаимосвязи между метаболическим синд-ромом, нарушением в системе гемостаза и разнообразной акушерской патологией.

Материал и методы исследования. Было обследовано 77 пациенток с МС в возрасте от 25 до 42 лет. Все женщины были разделены на две группы: I группа (n=32)- женщины получали терапию, начиная c фертильного цик-ла, II группа (n=45) беременные женщины, обследованные и получавшие терапию со II или III триместра беременности. Проводилось исследование системы гемостаза, выявление генетических форм тромбофилии методом ПЦР.

Результаты и их обсуждение: Проведенное нами исследование женщин с МС показало наличие мультигенной тромбофилии в 100% случаев, осо-бенностью которой явилось превалирование в общей структуре генетичес-ких форм тромбофилии полиморфизма «675 4G/5G» гена PAI-1 (92,2%). У 10(14,3%) женщин с метаболическим синдромом нами было выявлено сочетание АФС с генетическими формами тромбофилии. У женщин во II группе уровень маркеров реальной тромбофилии (ТАТ, Д-димер) значительно превышали таковые по сравнению с пациентами I группы, получавшими антитромботическую профилактику, начиная с фертильно-го цикла. При диагностировании наследственной, мультигенной формы

226

тромбофилии или комбинированной тромбофилии назначали терапию в зависимости от причины и степени её выраженности, наличия гомо- или гетерозиготной формы мутации, маркеров тромбофилии. В качестве антитромботической терапии применяли низкомолекулярный гепарин НМГ (Фраксипарин, Клексан, Фрагмин). НМГ применяли на протяжении всей беременности, отменяя за сутки до родоразрешения. Через 8 часов после родоразрешения его прием возобновлялся и продолжался в течение 10 дней. Дополнительно назначались антиоксиданты, фолиевая кислота, Магне В6, витамины, полиненасыщенные жирные кислоты, Утрожестан, гипотензивная терапия.

Выводы: Основные принципы профилактики акушерских осложнений у беременных с тромбофилией подразумевают начало ее с фертильного цикла. Чем раньше начата противотромботическая терапия, тем лучше исходы беременности.

227

ДИПЛОИДНЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ

Радаева И.Ф., Нечаева Е.А., Евланова Е.А.ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор», Кольцово, новосибирской области

В последнее время для лечения широкого спектра заболеваний все чаще начинают применять клеточную терапию. В качестве материала для трансплантации могут быть использованы различные типы донорских клеток. Наиболее востребованными являются фетальные диплоидные клетки человека. Они обладают полипотентными свойствами и способны дифференцироваться в другие типы клеток. Возможность культивирования диплоидных клеток человека, сохраняющих стабильные свойства в тече-ние десятков пассажей т у1йх>, подчеркивает перспективность наработки большого количества стандартных по биологическим свойствам клеток, создания на их основе аттестованных банков клеток, пригодных для ис-пользования в заместительной терапии.

В ГНЦ ВБ «Вектор» получены штаммы диплоидных клеток легкого человека ФЭЧ 16 – 1 и кожно-мышечной ткани человека ФЭЧ 16 – 2. Созданы и заложены на хранение на ранних пассажах культивирования посевные и рабочие банки клеток в количестве не менее 200 ампул каждый. Концентрация в ампуле составляет 2,0 3,0 млн клеток. Полученные банки диплоидных клеток были аттестованы в соответствии с требованиями ВОЗ. В процессе работы исследовали культуральные свойства, морфологию, кариологию, видовую идентичность, отсутствие посторонних агентов, онкогенные потенции. Показано, что диплоидные клетки ФЭЧ 16 – 1 и ФЭЧ 16 – 2, заложенные на хранение в виде посевных и рабочих банков, имеют типичную морфологию, не содержат посторонних агентов, являются онкогенно безопасными, имеют энзимограмму и кариотип, свойственные донору, сохраняют стабильность биологических свойств.

Соответствие требованиям было подтверждено ГИСК им. Л.А.Тарасевича, диплоидные клетки ФЭЧ 16-1 и ФЭЯ 16-2 рекомендованы Комитетом МИБП для использования в заместительной терапии.

Создание банков клеток из одного клеточного пула позволяет иметь достаточно большие запасы стандартного аттестованного материала, при-годного для применения в медицинской практике.

228

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭНТЕРОВИРУСНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДЫ В ОЦЕНКЕ

ЕЕ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

Рахманин Ю.А., Недачин А.Е., Лаврова Д.В.ГУ НИИ Экологии человека и гигиены окружающей среды

им. А.Н.Сысина РАМН

В настоящее время для индикации энтеровирусов (ЭВ), распространяю-щихся водным путем, актуальным становится использование молекулярных методов, позволяющих быстро дать ответ о наличии в воде инфекционных энтеровирусов. Это необходимо для своевременного проведения гигиеничес-ких мероприятий. Поэтому целью нашей работы было совершенствование системы индикации патогенных кишечных вирусов в водных объектах ок-ружающей среды, которая была бы экспрессной, чувствительной и специ-фичной. В работе были использованы вирусологический метод выделения ЭВ в чувствительных культурах клеток; метод полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР); метод ОТ-ПЦР, интегриро-ванной с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР).

В результате проведенного сравнения чувствительности культураль-ного метода и ИКК ОТ-ПЦР, было показано, что метод ИКК ОТ-ПЦР позволяет быстрее и с более высокой чувствительностью, чем на культуре ткани, определять ЭВ.

Нами была проведена модификация метода выделения РНК из концен-тратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников. Мы объединили 2 классических метода выделения РНК (фенол-хлороформная экстракция и сорбентовый метод) и показали, что такая комбинация является боле эффективной в отношении устранения ингибиторов ОТ-ПЦР, чем оба метода, используемые по отдельности.

Также было показано, что метод ИКК ОТ-ПЦР может быть использо-ван при контроле эффективности действия дезинфектантов в отношении вирусного загрязнения водных объектов, сокращая время анализа до 3 дней по сравнению с 21 днем для классического культурального метода.

Итогом проведенных исследований стало включение ИКК ОТ-ПЦР-анализа в комплексную систему санитарно-вирусологического контроля воды. Была создана схема санитарно-вирусологического анализа воды, в которой индикация вирусов осуществляется, в том числе и по наличию РНК инфекционных ЭВ.

Таким образом, использование усовершенствованного метода ИКК ОТ-ПЦР, внедренного в систему санитарно-вирусологического контроля воды позволит быстро принимать управленческие решения по внедрению гигиенических мер по профилактике энтеровирусных инфекций.

229

ПРОТИВОДЕЙСТВИЕ ИНФЕКЦИОННОМУ БИОТЕРРОРИЗМУ – ВАЖНЕЙШИЙ ФАКТОР

ГОСУДАРСТВЕННОЙ БЕЗОПАСНОСТИРашкин Л.А., Новиков Ю.Ю.

Академия проблем безопасности, обороны и правопорядка

В настоящее время защита общества от биологических угроз является задачей государственного масштаба. В то время как службы здравоохранения любой страны ведут борьбу с естественно возникающими инфекциями очень актуальной является борьба с биотеррористической угрозой. Так, в 1999 г. Центром по контролю за инфекционными заболеваниями США приведено распределение биологических агентов, которые представля-ют наибольшую опасность при биотеррористической атаке, включая возбудители вирусных геморрагических лихорадок: аренавирусы (Хунин, Мачупо, Гуанарито, Лас-са); буньявирусы (хантавирусы, вирус лихорадки долины Рифт); флавивиру-сы (Денге) и филовирусы (Эбола, Марбург). Угроза биотерроризма требует от специалистов высокого уровня готовности к обнаружению наиболее опасных агентов и принятию необходимых мер защиты.

Начало процесса создания механизма национальной биобезопасности в России можно отнести к середине 1970-х годов, когда стала очевидной необ-ходимость принятия государственно-правовых основ регулирования в этой области и создания стабильной системы, обеспечивающей биологическую безопасность. Интеграция России в мировое экономическое сообщество и его правовое поле, участие в Конвенции по биологическому разнообразию диктует необходимость создания в стране системы биобезопасности, ком-плиментарной международным схемам. Поэтому проблема уровня защи-щенности населения от эпидемий или вспышек особо опасных инфекций вследствие актов терроризма, становится все более актуальной. Эпидеми-ологические аспекты этой проблемы сегодня изучаются различными спо-собами, в том числе методами математического моделирования эпидемий. При оценке уровня защищенности населения используются значимые индексы заболеваемости, смертности и летальности, которые реализуются в ходе развития эпидемии. Системы здравоохранения ряда стран, в том числе России, сейчас ведут борьбу с инфекционной патологией на пределе своих возможностей. Уязвимость современного общества к особо опасным инфекциям объясняется тем, что системы здравоохранения не обладают адекватным потенциалом противодействия. Повышение такого потенциала и обеспечение необходимого уровня готовности к противодействию эпидеми-ям, вспышкам особо опасных инфекций и актам биотерроризма потребует сосредоточить усилия по формированию и реализации адекватных программ противодействия, по обучению и тренингу специалистов на компьютерных тренажерах с математическими моделями процес-сов становления и разви-тия эпидемий и вспышек особо опасных инфекций [Боев Б.В., 2004].

230

ОЦЕНКА МУТАГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ. ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Ревазова Ю.А., Сычева Л.П., Журков В.С.ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина

РАМН, Москва, Россия

Оценка потенциальной мутагенной активности лекарственных средств является одним из важнейших этапов доклинических исследований. Роль мутационных событий велика не только в сохранении генетического здоровья населения, но она существенна и в этиологии тератогенных и канцерогенных эффектов. Эта еще одна причина повышенного внимания специалистов именно к этому виду нежелательной активности. В нашей стране, начиная с 1976 г. (создание первых методических рекомендаций по оценке мутагенности лекарственных средств) постоянно проводилось их усовершенствование. Последние варианты методических рекомендаций (2000 и 2005 гг.) являются плодом коллективного труда и попыткой адапта-ции мнений и соображений отечественных ученых к позициям их коллег за рубежом, в первую очередь, европейскому сообществу. Существенную роль в вынесении вердикта о наличии или отсутствии мутагенных эффектов и о возможной опасности для человека принадлежит экспертам, в нашей стране они работали в токсикологической комиссии ФК МЗ РФ. Серь-езное дополнение отечественных рекомендаций к зарубежным аналогам сводится к тому, что при необходимости использования лекарственного препарата с выявленной мутагенной активностью рекомендуется генети-ческий контроль на первых стадиях клинических испытаний с помощью учета аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови человека. В настоящее время необходимым представляется: сертификация лабора-торий, проводящих подобную работу; активное обучение специалистов системе GLP; разработка и внедрение (на уровне факультативных) новых методов оценки мутагенности, например, полиорганного микроядерного теста; разработка критериев реальной генетической опасности (генети-ческого риска) введения лекарств-мутагенов в среду обитания человека; создание моделей для изучения генетического контроля индивидуальной чувствительности человека к действию лекарственных препаратов, в пер-вую очередь, по системам биотрансформации ксенобиотиков с помощью современных молекулярно-генетических методов.

231

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ АРТЕРИАЛЬНОГО ДАВЛЕНИЯ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ

КРЫС ЛИНИИ НИСАГРедина О.Е, Маханова Н.А., Маркель А.Л.

Институт Цитологии и Генетики СО РАН, Новосибирск

Артериальная гипертензия – это сложный признак, развитие которого обусловлено взаимодействием многих генетических факторов как друг с другом, так и с условиями среды. Однако, на сегодняшний день нет пол-ного понимания того, сколько генов и какие гены участвуют в контроле уровня артериального давления (АД), а особенности генетического конт-роля АД в условиях эмоционального стресса практически не изучены.

Целью работы являлось определение локусов генома, контролирующих уровень АД в покое и под действием эмоционального стресса у крыс НИ-САГ с наследственной стресс-индуцируемой артериальной гипертензией, созданной в ИЦиГ СО РАН для изучения генетической предрасположен-ности и механизмов развития гипертонии.

Методом QTL (quantitative trait locus), позволяющим находить ассо-циацию используемых микросателлитных ДНК-маркеров с исследуемым признаком, анализировали две популяции самцов гибридов F2 разного возраста: 3 – 4 месяца и 6 месяцев, полученных при скрещивании ги-пертензивных крыс НИСАГ и нормотензивных крыс WAG. Состояние эмоционального стресса достигалось помещением животных в тесную проволочную клетку на 30 минут.

Анализ 1-ой хромосомы (Chr. 1) был проведен с использованием 12 полиморфных микросателлитных маркеров. В молодой популяции F2 существенного вклада генов Chr.1 в контроль уровня АД как в покое, так и при стрессе найдено не было. В популяции самцов гибридов F2 в воз-расте 6 месяцев была найдена ассоциация маркеров D1Rat168 (P=0.00087, LOD score 3.42) и D1Rat76 (P=0.0006, LOD score 3.34) с уровнем АД в покое. Уровень АД при стрессе оказался ассоциирован с локусом D1Rat54 – D1Rat168 (P=0.0014, LOD score 3.08).

Локусы, контролирующие уровень АД в покое у крыс НИСАГ, отли-чаются от таковых, описанных на Chr. 1 для крыс SS (salt sensitive) и в основном совпадают с локусами, найденными для крыс SHR (spontaneously hypertensive rats) и крыс SHRSP (stroke-prone spontaneously hypertensive rats). Однако, описанный нами локус 1-ой хромосомы, контролирующий уровень АД при стрессе у крыс НИСАГ, ранее не был описан и отличается от локуса, найденного для крыс SHRSP.

Показано: 1) генетический контроль уровня АД зависит от возраста животных;

2) особенности генетического контроля АД у гипертензивных крыс, как в покое, так и при стрессе, зависят от генотипа животного.

Данная работа поддержана грантом РФФИ 05-04-48567.

232

ВЛИЯНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН -511G/A И +3953C/T В ГЕНЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1β НА ПРОДУКЦИЮ

ИНТЕРЛЕЙКИНА-1β В УСЛОВИЯХ In vitroРыдловская А.В., Петров А.В., Пигарева Н.В., Синева С.А., Конусова В.Г., Исаева Е.Н., Минаева Е.Н., Симбирцев А.С.ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург

Единичные нуклеотидные замены (SNP) -511G/A и +3953C/T – наибо-лее распространенные варианты полиморфизма гена IL-1β. Они приходят-ся на некодируемую часть гена – в результате, их наличие не отражается на нуклеотидном составе мРНК и, соответственно, структуре белка, однако, транскрипционная активность гена может меняться. В данной работе мы попытались оценить влияние предложенных нуклеотидных замен на уровень продукции IL-1β в условиях in vitro.

Материалом для исследования послужила периферическая кровь 50 здоровых доноров. Методом иммуноферментного анализа определялся уровень спонтанной и индуцированной (ЛПС, ФГА) продукции IL-1β клетками крови. Методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрик-ционных фрагментов) продуктов ПЦР специфических участков генома определялось наличие нуклеотидных замен в гене IL-1β.

Генетический анализ позволил оценить распределение вариантов гена IL-1β в популяции здоровых людей. Так, для SNP IL-1β(-511) рас-пределение генотипов оказалось следующим: GG– 35,2%, GA – 55,6%, AA – 9,2%; для SNP IL-1β(+3953): CC – 50,0%, CT – 44,4%, TT – 5,6%. Сопоставив генотип с уровнем продукции IL-1β, мы определили, что оба SNP являются значимыми, но их действие разнонаправлено. Так, наличие нуклеотидной замены -511G/A способствовало повышенной продукции IL-1β, и среди людей, гомозиготных по варианту гена -511A, клеточный ответ оказался в два раза выше, чем среди людей без нуклеотидной замены -511G/A в гене IL-1β. Наличие в том же гене нуклеотидной замены +3953 C/T, напротив, ингибировало продукцию цитокина, и генотипу +3953 ТТ сопутствовала продукция IL-1β, сниженная в три раза, по сравнению с генотипом дикого типа (+3953 СС).

Анализ совместного влияния двух вариантов SNP на индуцированный синтез IL-1β клетками крови позволил выявить полярные генотипы. Ими оказались сочетание -511АA/+3953 СС – оно обнаружено у людей с мак-симально низким уровнем продукции IL-1β, и сочетание -511GG/+3953 TT – оно составило генотип людей с максимально высоким уровнем продукции интерлейкина.

Подводя итог выше сказанному, можно отметить, что одним из фак-торов, влияющих на продукцию IL-1β, является нуклеотидный состав соответствующего гена. В частности, нами установлена связь между на-личием нуклеотидных замен -511G/A, +3953C/T в гене IL-1β и уровнем продукции IL-1β в условиях.

233

ЭКСТРЕННАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ МЕТОДОМ

ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Рябчикова Е.И., Виноградов И.В., Зайцев Б.Н., Тимошенко О.В., Богрянцева М.П., Маренникова С.С.

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и

благополучия человека

Экстренная дифференциальная диагностика возбудителя имеет крити-ческое значение для адекватного развертывания противоэпидемических мер при вспышке инфекционного заболевания вследствие биотеррористи-ческого акта. Вирус натуральной оспы считается агентом, использование которого биотеррористами наиболее вероятно. При появлении больных с везикулярными поражениями очень важно дифференцировать натуральную оспу от ветряной: заболевания очень схожи на начальных стадиях.

Исторический опыт показывает, что электронная микроскопия позво-ляет дифференцировать вирусы натуральной и ветряной оспы в жидкости из пузырьков на коже больного в течение 20 – 30 минут методом негатив-ного контрастирования. Для выявления вируса могут быть использованы также корочки кожных высыпаний. Метод негативного контрастирования достаточно прост, легок для освоения и не требует дополнительного обо-рудования. Исследование может быть проведено в любой лаборатории, оснащенной трансмиссионным электронным микроскопом. Вирусы натуральной и ветряной оспы однозначно различаются по размерам и морфологии, и за несколько часов можно научить любого специалиста, владеющего методом электронной микроскопии, их идентификации.

В целях организации эффективного противодействия биотерроризму целесообразно включить методику экстренной дифференциальной диа-гностики натуральной и ветряной оспы в набор методов диагностики в чрезвычайных ситуациях, внедрив ее в практику всех лабораторий, проводящих электронно-микроскопические исследования. Вовлечение в эту систему электронно-микроскопических лабораторий не медико-био-логические учреждений позволило бы создать сеть, способную обеспечить дифференциальную диагностику натуральной и ветряной оспы в экстре-мальных ситуациях по всей России.

234

УПРАВЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКОЙ НЕЙРОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ/ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ

ГЕНОВ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

Сабурина И.Н.1, Рыбалкина Е.Ю.2, Макаров А.В.1, Ревищин А.В.2, Павлова Г.В.2, Мирошникова О.А.2, Брагина Т.А.2, Корочкин Л.И.2,

Гольдштейн Д.В.1

1 – НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий», г. Москва

2 – ГУ Институт биологии гена РАН, г. Москва

Ограниченный терапевтический эффект, возникающий при исполь-зовании клеточной терапии в лечении ряда нейродегенеративных забо-леваний, по-видимому, объясняется гибелью пересаживаемых клеток. Перспективным для решения этой проблемы является использование для трансплантаций клеток с модицифированным геномом. Введение в геном трансплантируемых нейрональных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) и клеток не нейронального фенотипа генов ростовых нейротрофических факторов (GDNF и NGF) направлено на повышение выживаемости и стимулирование дифференцировки пересаженных клеток в мозге реципиента. Экспрессия трансгенов этих факторов защищает от апоптоза еще не погибшие нейроны реципиента.

В работе использовали монослойные культуры НСПК, сохраняющие при многократном пассировании недифференцированный характер (бо-лее 70% клеток оставались иммунопозитивными к маркеру стволовых клеток – нестину).

Трансфекцию клеток проводили с помощью реагента ExGen 500 (Fermentas) в соответствии с протоколом. Экспрессию трансгена, коди-рующего химерные белки GDNF/GFP и NGF/GFP, оценивали на флю-оресцентном микроскопе.

При ксенотрансплантации в мозг взрослых мышей клеток человека, трансфецированных генами GDNF и NGF, наблюдалась их высокая вы-живаемость и уменьшение экспрессии белков рубцовой ткани, что оце-нивалось по снижению количества клеток реципиента, синтезирующих фибронектин.

Использование модифицированных клеток, являющихся источником синтеза GDNF и NGF даже в малом количестве способствует лучшему приживлению трансплантата, повышению его жизнеспособности и спе-цификации составляющих его клеток, что может служить обоснованием допустимости пересадки трансфецированных клеток в ближайшей перс-пективе в неврологии.

235

УГНЕТЕНИЕ НАЧАЛЬНОЙ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ ГИПОХЛОРИТОМ НАТРИЯ И БИОГЕННЫМИ

ХЛОРАМИНАМИ

Савельева Е. Л., Рощупкин Д. И.ФГУ НИИ физико-химической медицины Росздрава

ГОУ ВПО РГМУ Росздрава

В организме в активированных нейтрофилах в результате реакции, катализируемой миело-пероксидазой, образуются гипохлорит-анион (гипохлорная кислота), а в качестве вторичных продуктов – хлорами-новые производные аминокислот и белков (биогенные хлорамины). Муриной М.А. и др. было обнаружено противоагрегационное действие биогенных хлораминов на тромбоциты; при введении в кровь в опытах in vitro и in vivo это действие проявляется на фоне отсутствия существен-ного повреждения эритроцитов и лейкоцитов.

Хлорамины предложены как перспективные соединения для борьбы с тромбозами, опосре-дованными тромбоцитами. Для выяснения механизма действия биогенных хлораминов на тромбоциты целесообразно изучать их начальную агрегацию – образование мелких агрегатов. Целью настоящей работы было: (1) оценить эффективность действия N,N-дихлортаурина (ДХТ) и гипохлорита натрия (ГХН) на начальную агрегацию тромбоцитов в составе обогащен-ной тромбоцитами плазме (ОТП) и выяснить вопрос о том, прямое или опосредованное плаз-мой их действие определяет проти-воагрегационный эффект; (2) изучить влияние ГХН, ДХТ, N-хлораланина (ХА) и N-хлорфенилаланина (ХФА) на активированные тромбоциты. Ис-следо-вание проводили на тромбоцитах кролика, которые активировали с помощью АДФ. Начальную агрегацию тромбоцитов изучали кинетическим нефелометрическим методом, разработанном в нашей лаборатории. ДХТ и ГХН угнетают начальную агрегацию тромбоцитов в составе ОТП. ДХТ эффективен при тех же концентрациях, которые требуются внутривенно в опытах in vivo (в пределах 1 мМ). Противоагрегационное действие обоих соединений является прямым. ГХН, ДХТ, ХА и ХФА угнетают начальную агрегацию и при действии на активированные клетки.

236

ОСНОВНЫЕ КОМПОНЕНТЫ СИСТЕМЫ АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА ПРИ РАКЕ И ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Сандыбаев М.Н., Казанцева И.А., Тулеуов А.Е., Герштейн Е.С., Казаков С.П., Кушлинский Н.Е.

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва Западно-Казахстанская государственная медицинская академия

им. М.Оспанова, Актюбинск

Цель исследования – сравнительный анализ содержания активаторов плазминогена тканевого и урокиназного (tPA, uPA) типов и их ингиби-тора (PAI-1) в цитозольной фракции рака (РЩЖ) и доброкачественных заболеваний щитовидной железы.

Материал и методы. Обследовано 146 больных в возрасте от 22 до 69 лет с заболеванием щитовидной железы. Клинический диагноз у всех подтвержден данными гистологического исследования: рак щитовидной железы (РЩЖ) выявлен у 44, аденома щитовидной железы (АЩЖ) – у 18, узловой коллоидный зоб щитовидной железы в сочетании с аденоматозом (УЗК с аденоматозом) – у 19, УЗК без аденоматоза – у 43, диффузный токсический зоб с аденоматозом (ДТЗ с аденоматозом) – у 9, ДТЗ без аденоматоза – у 13 больных. Содержание tPA, uPA и PAI-1 определяли иммуноферментным методом в цитозольных фракциях тканей железы с использованием наборов реактивов, разработанных в лаборатории проф. T. Benraad’а (г. Наймеген, Нидерланды).

Результаты. Проведенный анализ выявил наиболее низкие показатели tPA в РЩЖ (1,5±0,23 нг/мг белка), а самые высокие его значения – в группе больных УЗК с аденоматозом (2,08±0,27 нг/мг белка). Наиболее низкие значения uPA обнаружены у больных ДТЗ с аденоматозом и они не отличались от значений uPA в АЩЖ (0,15±0,03 и 0,14±0,02 нг/мг белка, соответственно). Самые высокие значения uPA (0,78±0,15 нг/мг белка) об-наружены при РЩЖ. Максимально высоким PAI-1 (1,15±0,21 нг/мг белка) был так же обнаружен при РЩЖ, а минимальные его значения выявлены при ДТЗ с аденоматозом (0,24±0,02 нг/мг белка). Полученные данные, поз-воляют предполагать о возможной связи компонентов системы активации плазминогена с процессами бластомогенеза в щитовидной железе. Следова-тельно, полученные результаты указывают на потенциальную возможность использования основных компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) для оценки риска малигнизации при гиперпластических процессах и доброкачественных новообразованиях щитовидной железы.

Заключение. Представленные данные свидетельствуют о связи продукции основных компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA, PAI-1) в цитозольной фракции с процессами бластомогенеза щитовидной железы.

237

ЛЕПТИН И РАСТВОРИМЫЙ Fas-АНТИГЕН (sFas) У БОЛЬНЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ И

ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫМИ НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ЯИЧНИКОВ

Сатенова Ж.К., Обушева М.Н., Бабкина И.В., Тулеуов А.Е.ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Западно-Казахстанская государственная медицинская академия им. М.Оспанова, Актюбинск

Цель исследования – сравнительный анализ уровней лептина и sFas в сыворотке крови здоровых женщин, больных раком и доброкачественными новообразованиями яичников.

Материал и методы. Обследовали 37 больных новообразованиями яич-ников: серозный рак яичников (РЯ) – 19; пограничные эпителиальные опухоли – 4; доброкачественные новообразования – 14. Пациентки были в возрасте от 19 до 63 лет. Лептин и sFas в сыворотке крови определяли до лечения иммуноферментным методом наборами реактивов («R&D», США – для sFas и «DRG», США – для лептина).

Результаты. Наиболее высокие значения sFas выявлены в сыворотке крови больных пограничными опухолями яичников (2,7±1,3 нг/мл), а наиболее высокие показатели лептина – при пограничных (8,4±3,7 пг/мл) и доброкачественных новообразованиях яичников (8,7±2,4 пг/мл) по сравнению с больными серозным раком яичников (sFas – 1,4±0,3 нг/мл; лептин – 6,8+1,6 пг/мл). Уровень sFas и лептина постепенно увеличивался с возрастом больных раком яичников. У больных доброкачественными новообразованиями яичников обнаружены незначительные изменения в концентрациях sFas и лептина с возрастом. Самые высокие показатели sFas и лептина отмечены среди нерожавших больных новообразованиями яичников, причем уровень лептина имел тенденцию к снижению с числом родов. Однофакторный дисперсионный анализ не выявил зависимости показателей sFas и лептина от степени дифференцировки рака яичников и стадии заболевания. Вместе с тем, многофакторный дисперсионный анализ соотношения sFas/лептин значимо (р<0,05) зависел от совместного влияния стадии и степени дифференцировки опухоли. При анализе сроков рецидивирования рака яичников и уровней sFas и лептина в сыворотке крови отмечена связь этих показателей со временем появления рецидива. Показано, что низкие уровни sFas и высокие показатели лептина харак-терны для больных серозным раком яичников с благоприятным прогнозом болезни (p<0,05), а значение соотношения sFas/лептин более чем в 6 раз ниже (p<0,03) у пациенток с благоприятным течением болезни.

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости проведения дальнейших клинических исследований sFas и лептина у боль-ных злокачественными и пограничными новообразованиями яичников.

238

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ЗАЩИТЫ НАСЕЛЕНИЯ СИБИРСКОГО РЕГИОНА ОТ ПРИРОДНЫХ И

ТЕХНОГЕННЫХ УГРОЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО ХАРАКТЕРА

Сафатов А.С.1, Андреева И.С.1, Бачинский А.Г.1, Бородулин А.И.1, Буряк Г.А.1, Зыков С.В.1, Марченко Ю.В.1, Марченко В.В.1, Олькин С.Е.1, Резникова И.К.1, Репин В.Е.1, Сергеев А.Н.1, Пененко В.В.2, Цветова Е.А.2, Белан Б.Д.3, Панченко М.В.3, Толмачев Г.Н.3,

Анкилов А.Н.4, Бакланов А.М.4, Куценогий К.П.4, Макаров В.И.4, Попова С.А.4

1 – Государственный Научный Центр Вирусологии и Биотехнологии «Вектор», Кольцово, Новосибирская обл.

2 – Институт Вычислительной математики и МатематическойГеофизики СО РАН, Новосибирск

3 – Институт Оптики Атмосферы СО РАН, Томск 4 – Институт Химической Кинетики и Горения СО РАН, Новосибирск

Для защиты населения Сибирского региона от природных и техно-генных угроз биологического характера желательно создать комплексную систему контроля за биологическими выбросами различной природы и оперативной оценки необходимых мер и ресурсов для снижения их воз-действия на население, а также ликвидации их последствий.

Оптимизированная система контроля за выбросами должна быть основана на пробоотборных устройствах нового поколения и современных методах анализа содержимого проб. Кроме того, должен быть учтен естественный биологический фон (и, в первую очередь, микробиологический) в регионе. Численное моделирование процессов переноса аэрозолей в атмосфере и помещениях позволит определить местоположение возможных источников аэрозолей, оценить создаваемые им поля загрязнений и возможные дозы биоаэрозолей и микроорганизмов, полученные людьми. Далее, используя эпидемические модели, можно будет спрогнозировать распространение эпи-демии по региону и оценить необходимые меры и ресурсы для снижения их воздействия на население, а также ликвидации их последствий.

В работе представлены данные по мониторингу естественного биоло-гического фона в регионе и результаты испытаний нового персонального пробоотборника для вирусных аэрозолей. Кроме того, представлены результаты моделирования с использованием разрабатываемых пакетов прикладных программ последствий возможного биотеррористического акта в г.Новосибирске для всего Сибирского ФО.

Полученные результаты и будущие работы в указанных выше направ-лениях лягут в основу системы защиты населения Сибирского региона от природных и техногенных угроз биологического характера и могут быть использованы для создания аналогичных систем в других регионах.

239

СОЗДАНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ

НАНОЧАСТИЦ

Свешников П.Г.1,2, Востроухов С.В.2, Гельперина С.Э.1,2

1 – Институт Молекулярной Медицины, Московская Медицинская Акаде-мия им. И.М. Сеченова

2 – Всероссийский Научный Центр Молекулярной Диагностики и Лечения, Москва

Целью исследования является разработка и изучение препаратов на основе полимерных биодеградируемых наночастиц для лечения бактери-альных инфекций, в том числе туберкулеза.

Для получения наночастиц использовали различные методы, такие как полимеризация, эмульсификация под давлением с последующим удалением растворителя, метод двойных эмульсий. Применение этих ме-тодов позволяет получать разнообразные наносомальные лекарственные формы, различающиеся по скорости биодеградации и скорости выделения лекарственного вещества из полимерной матрицы. Достигнута эффектив-ная сорбция ряда противотуберкулезных субстанций в наночастицах из различных полимеров, таких как быстро деградируемые полиалкилциано-акрилаты и промышленные фармацевтические полимеры – Eudragit® и Lactel®. Использование этих полимеров является важным фактором для разработки реальной промышленной технологии получения наносомаль-ных препаратов.

Фармакокинетические исследования показали, что при внутривенном введении использование как полиалкилцианоакрилатных, так и полилак-тидных наночастиц позволяет повысить концентрации антибиотика в плаз-ме и органах РЭС (печени, легких и селезенке); при этом интегральный показатель AUC препаратов в легких возрастал с ростом AUC в крови.

Предварительные результаты исследования наносомальных препаратов на мышах, инфицированных M. tuberculosis, показали, что наносомальные препараты более эффективно элиминируют популяции микобактерий в легких, печени и селезенке. Среди исследованных к настоящему времени препаратов наиболее эффективным оказался наносомальный рифампицин на основе полибутилцианоакрилатных наночастиц, модифицированных полоксамером 407. Этот результат коррелирует с результатом, получен-ным при изучении биораспределения: указанный препарат обеспечивал максимальное накопление антибиотика в легких.

Вывод. Полученные данные подтверждают нашу гипотезу о том, что применение наночастиц позволяет осуществить направленный транспорт антибиотиков в инфицированные органы и таким образом приводит к повышению эффективности при лечении внутриклеточных инфекций.

240

БИОМЕДИЦИНСКИЕ ИСПЫТАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ МАТЕРИАЛОВ

ОРГАНИЧЕСКОГО И НЕОРГАНИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЕЙ

КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Свиридова И.К.1, Сергеева Н.С.1, Решетов И.В.1, Кирсанова В.А.1, Ахмедова С.А.1, Баринов С.М.2, Комлев В.С.2, Самойлович М.И.3,

Белянина А.Ф.3, Клещева С.М.3, Елинсон В.М.4

1 – Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена

2 – Институт физико-химических проблем керамических материалов (ИПК) РАН, Москва

3 – Центральный научно-исследовательский технологический институт «Техномаш», Москва

4 – МАТИ-РГТУ им. К.Э. Циолковского, Москва

Введение. Прогресс в реконстуктивно-пластической хирургии в целом и в онкологии, в частности, в значительной мере связан с использованием современных нанотехнологий для получения спектра «интеллектуальных» материалов с целью формирования композиционных биотрансплантатов для заместительной клеточной терапии. Эти материалы должны обладать высокой биосовместимостью, многофункциональностью (способностью выполнять функции каркаса, матрикса для собственных и имплантируе-мых клеточных культур и тканевых эквивалентов, депо для питательных веществ и др.), регулируемой механической прочностью, эластичностью.

Цель исследования: создание и биомедицинские испытания матриксных свойств (оценка in vitro острой цитотоксичности, адгезивных качеств, ди-намики клеточной популяции, in vivo – биосовместимости) современных наноструктурированных материалов: нового поколения пористой био-керамики на основе гидрооксиапатитов; трехмерных структур на основе кубических упаковок наносфер SiО2; углерод-полимерных структур на основе полиэтилентерефталатных трековых мембран.

Материалы и методы. Острую цитотоксичность и адгезивные качества образцов в экспериментах in vitro оценивали МТТ-тестом на модели им-мортализованных фибробластов человека, биосовместимость – методом подкожной трансплантации биоматериалов мышам линии BDF1 после-дующей световой микроскопией.

Результаты. В экспериментах in vitro показана низкая токсичность и хорошие адгезивные свойства некоторых из этих материалов, в опытах in vivo – их биосовместимость. Для наиболее перспективных образцов подоб-раны оптимальные условия для эффективного формирования трехмерных

241

конструкций с фибробластами (плотность посева, длительность культиви-рования). В настоящее время эти наноматериалы проходят клинические испытания для замещения тканевых дефектов при краниофасциальной реконструктивно-пластической хирургии.

ФУМОНИЗИНЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ: ОЦЕНКА ОПАСНОСТИ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ НАСЕЛЕНИЯ

Седова И.Б., Тутельян В.А.ГУ НИИ питания РАМН, Москва

На современном этапе проблема биобезопасности пищевых продук-тов связана прежде всего с предотвращением попадания в пищевую цепь природных контаминантов биологического происхождения, в том числе микотоксинов. Фумонизины (Ф) – новый класс микотоксинов, образуемых грибами рода Fusarium. Эти токсины являются природными ингибиторами биосинтеза сфинголипидов, обладающих высокой биологической актив-ностью и регулирующих многочисленные процессы в клетках прокариотов и эукариотов. Ф, обладая строением, сходным со сфингозином, ингиби-руют активность сфингозин-сфингонин-трансферазы и церамидсинтазы, что приводит к нарушению клеточных процессов, таких как рост клетки, клеточная дифференциация, проницаемость клеток эндотелия и апоптоз. Международное агентство по изучению рака относит Ф к соединениям, вероятно канцерогенным для человека (группа 2В).

Данная работа была посвящена изучению частоты контаминации Ф продовольственного сырья и пищевых продуктов. Содержание ФВ1 и ФВ2 в зерне кукурузы и зернопродуктах определяли методом обращенно-фа-зовой ВЭЖХ с использованием флуориметрического детектора. Предел обнаружения составлял 0,01 мг/кг для ФВ1 и 0,04 мг/кг для ФВ2.

Полученные результаты впервые в России показали высокую частоту (более 90%) и широкую вариабельность уровней загрязнения Ф продо-вольственного зерна кукурузы и основных продуктов ее переработки. Так, в зерне кукурузы концентрация ФВ1 достигала 17,91 мг/кг (в среднем – 1,55 мг/кг), ФВ2 – 8,5 мг/кг (в среднем – 0,4 мг/кг). Обнаружено, что уровни загрязнения основных продуктов переработки кукурузы (крупы и муки) в 3 – 5 раз ниже, чем в зерне: для ФВ1 0,03 – 3,99 мг/кг, для ФВ2

0,04 – 0,76 мг/кг. Обращает на себя внимание высокая частота загрязнения Ф продуктов

детского питания. 45% специализированных продуктов детского питания, в состав которых входит кукуруза, содержали ФВ1 в концентрациях от 0,01 до 0,16 мг/кг (в среднем – 0,025 мг/кг). В 61% проб кукурузных хлопьев был

242

обнаружен ФВ1 – от 0,01 до 0,40 мг/кг при среднем содержании 0,049 мг/кг; в 11% случаев ФВ2 – от 0,04 до 0,06 мг/кг на низких уровнях загрязнения.

Предварительный расчет нагрузки Ф на человека не выявил превы-шения переносимого суточного потребления этих токсинов на человека, однако позволил отнести постоянных потребителей кукурузы и детей раннего и дошкольного возраста к группам риска.

ОБЕЗБОЛИВАЮЩИЙ ЭФФЕКТ ФУМАРАТСОДЕРЖАЩЕГО РАСТВОРА МАФУСОЛ

ПРИ ЛЕЧЕНИИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ КОРОНАРНЫМ СИНДРОМОМ

Селиванов Е.А., Смолянинов А.Б., Зайцев Ю.Е.Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

Научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии МЗСР РФ

Цель: изучение влияния и оценка обезболивающего эффекта различ-ных инфузионных сред при лечении больных, поступивших в стационар с острым коронарным синдромом (ОКС). В исследовании участвовало 126 человек больных ОКС. Распределение по группам было следующим.

I группа больных ОКС (46 больных): раствор мафусол в объеме 200 мл (натрия хлорид – 6,0, калия хлорид – 0,3, магния хлорид – 0,1, натрия фумарат – 14,0 и воды для инъекций до 1000 мл; рН раствора колеблется в пределах 6,0 – 7,6);

II группа (28 больных): поляризующий раствор (5% раствор глюкозы - 200 мл, простой инсулин – 8 ед., 3,5% раствор калия хлорида – 30 мл, 25% раствор магнезии сульфата –10 мл);

III группа (52 больных): полиионный раствор (0,9% раствор натрия хлорида – 200 мл, 3,5% раствор калия хлорида – 30 мл, 25% раствор маг-незии сульфата – 10 мл).

В процессе лечения ОКС в каждый из растворов добавляли ненаркоти-ческие анальгетики. Способ введения: внутривенно капельно со скоростью 6,0 мл в минуту в объеме 250,0 мл. Для постановки диагноза ОКС исполь-овались диагностические критерии нестабильной стенокардии Американ-ской Коллегии Кардиологов/ Американской Ассоциации Сердца.

Результаты: применение фумаратсодержащего раствора мафусол у больных, поступивших в стационар с диагнозом ОКС, показало его вы-сокую анальгезирующую эффективность, которая проявлялась в быстром купировании болевого синдрома, в большинстве случаев не требующее дополнительного введения наркотических анальгетиков и была выше чем у других исследуемых растворов (рис.1).

243

Данная способность мафусола обусловлена полифункциональными свойствами фумарата у больных ОКС: антигипоксантными и антии-шемическими за счет образования АТФ, уменьшения вязкости крови, улучшению ее реологических свойств, снижению в крови концентрации промежуточных и конечных продуктов перекисного окисления липидов.

Рис. 1. Частота применения групп анальгетиков для купирования болевого синдрома у больных острым коронарным синдромом.

244

НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ СУПРЕССИИ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ АНТИГЕН НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОЙ КОКЛЮШНОЙ

ВАКЦИНЫ

Семенова И.Б., Ахматова Н.К., Киселевский М.В., Курбатова Е.А.НИИ ЭМ им.Н.Ф. Гамалеи, НИИ ВС им. И.И. Мечникова,

РОНЦ им.Н.Н. Блохина

Известно, что корпускулярная коклюшная вакцина (ККВ) создает выраженную невосприимчивость к Bordetella pertussis и одновременно модулирует иммунный ответ (как гуморальный, так и клеточный) на ге-терологичный антиген – эритроциты барана (ЭБ).

В предварительных экспериментах были получены данные, свиде-тельствующие об активации врожденного иммунитета после применения ККВ. На мембранах дендритных клеток, обработанных вакциной in vitro экспрессируются молекулы CD40, CD80 и CD86. В крови мышей через 4 часа после введения ККВ обнаруживается нарастание уровней ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12, ФНО-α и ИФН-g. Этот феномен наблюдали при использо-вании вакцины в широком диапазоне доз: 2х1010, 4х107, 4х106 микробных тел/мышь.

Через 24 часа после инокуляции вакцины наблюдали выраженное угасание синтеза сывороточных цитокинов: ИЛ-1 (в 24 раза); ИЛ-6 (в 121 раза); ИЛ-12 (в 6,6раз) ФНО-α (в 34 раза); ИФН-g (в 7 раз). При исполь-зовании максимальной дозы вакцины (2х1010) через 4 часа регистрировали подавление, а через 24 часа усиление (в 13,6 раза) продукции ИЛ-10.

В тех случаях, когда мышам с угасающей продукцией цитокинов вводили гетерологичный антиген – ЭБ, наблюдали развитие иммуносуп-рессии как гуморального (по данным определения антителообразующих клеток – АОК), так и клеточного (по данным реакции ГЗТ) к этому ан-тигену. Уменьшение числа АОК и индекса ГЗТ определяли через 5 дней с момента введения ЭБ.

Обсуждается участие экзогенных соматических антигенов, прежде всего таких, как ксеногенные эритроциты (ЭБ) в развитии врожденного иммунитета и его связи с адаптивным иммунитетом.

245

ИССЛЕДОВАНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОПИЙНОСТИ И УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА-СУПРЕССОРА

ОПУХОЛЕВОГО РОСТА RBSP3(HYA22) В НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЯХ

Сенченко В.Н.1, Опарина Н.Ю.1, Анедченко Е.А.1, Краснов Г.С.1,Киселева Н.П.2, Киселев Ф.Л.2, Забаровский Е.Р.3

1 – Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва2 – Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,

Москва 3 – MTC, Karolinska Institute, Stockholm 171 77, Sweden

Эпителиальные опухоли – рак легких (SCLC и NSLC) почек (RСC), молочной железы (BC), шейки матки (CC), яичников (OC) вызывают более 80% всех летальных исходов от раковых заболеваний. Для этих ви-дов опухолей на хромосоме 3 человека выявлены две критичные области LUCA (3р21.31-р21.2) и AP20 (3p22 – p21.33), в которых найдены частые гомозиготные делеции (15 –20%). В этих областях выявлено несколько новых генов-супрессоров опухолевого роста, один из них, RBSP3 (HYA22), в области АР20 принадлежит к новому семейству малых CTD фосфатаз (C-terminal domain of RNA polymerase II phosphatases), которые могут кон-тролировать транскрипцию с помощью РНК-полимеразу II. Для измерения количества копий RBSP3 в геномной ДНК, а также уровня его экспрессии и соотнесения результатов с прогрессией опухоли отобраны образцы ДНК и кДНК, выделенные из опухолевых тканей I-IV стадий. Основным методом исследования служил количественный метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Подобраны специфические праймеры и пробы на трех участках гена, пограничных с разными экзонами. Использовали в качес-тве контролей гены β-актина, ACTB (для геномной ДНК) и GAPDH (для кДНК). Для достоверности измерений отобран еще один ген, кодирующий рибофорин (RPN1), который использовали в качестве контроля в геномных и экспрессионных экспериментах.

Оценены изменения числа копий RBSP3 в образцах геномной ДНК перечисленных выше эпителиальных опухолей и показана высокая частота изменений (более 90% случаев). Гомозиготные делеции в RBSP3 состав-ляют до 18% и вносят существенный вклад в его инактивацию. Наряду с делециями выявлены амплификации гена RBSP3. Показано значительное снижение экспрессии гена RBSP3 – более, чем в 20 раз – в 11 из 12 об-разцов опухолевых клеточных линий (RCC, OC, BC, SCLC, CC), почти 40-кратное снижение в клеточной линии SCLC и до 10 раз в 3 из 8 образ-цов биопсии опухолей (RCC, BC и ОС).

246

СТВОЛОВЫЕ (КЛОНОГЕННЫЕ ) КЛЕТКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ: ВОЗВРАЩАЯСЬ К

ПОЛУЧЕННЫМ РАНЕЕ ДАННЫМ

Сергеева Н.С.1, Свиридова И.К.1, Пелевина И.И.2

1 – Московский научно-исследовательский онкологический институт им.П.А.Герцена

2 – ИХФ РАН РФ

Около 30 лет назад было показано, что в опухоли сосуществуют популя-ции клеток, различающиеся по своему значению для развития опухолевого процесса: минорная популяция стволовых клеток (СК) с неограниченным пролиферативным потенциалом, комитированные опухолевые клетки, способные к ограниченному количеству делений и опухолевые клетки, не способные к размножению (более 90% всех). Поскольку отличитель-ной чертой СК опухоли является способность к неограниченному числу делений, их выявляли по способности делясь, образовывать колонии в полужидком агаре (A. Gamburger, S.Salmon, 1971). Уже в то время было описано несколько подходов к оценке эффективности колониеобразования (ЭКО) опухолей человека и животных in vitro и in vivo . Теоретические предпосылки и экспериментальные данные косвенно свидетельствовали о том, что эффективность любого противоопухолевого воздействия опре-деляется тем, достигнута ли с помощью него стерилизация СК, большая часть из которых находится в фазе покоя. Для некоторых опухолей было показано, что время безрецидивного течения после лучевой терапии и вероятность локального рецидива определяется исходной долей СК в опухоли, их способностью к репопуляции и радиочувствительностью. В процессе развития злокачественного новообразования, вероятно, не исключена возможность не только ассиметричного, но и симметричного деления СК, т.к. их количество возрастает. Нами апробированы различные подходы к выделению и клонированию СК рака легкого человека (in vitro и in vivo). Показано, что ЭКО определяется условиями микроокружения и составом газовой среды при культивировании. Чем ниже была степень дифференцировки, тем выше было ее ЭКО, которое, таким образом, от-ражает биологическую агрессивность опухолевого процесса.

247

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА

Сергиев В. П.Институт медицинской паразитологии и тропической медицины

им. Е.И.Марциновского ММА им. И.М.Сеченова

Известна способность вирусов и бактериальных генетических эле-ментов встраиваться в геном человека. По мнению лауреата Нобелевской премии D. Lederberg такие включения могли способствовать отделению человека, как самостоятельного вида Homo sapiens от линии развития ос-тальных гоминид.

Воздействие микроорганизмов на эволюцию человека происходит не только за счет генетического обмена. Существенна роль инфекционных и паразитарных болезней человека как фактора отбора. Именно такой отбор, в конечном счете, ответственен за появление выраженного полиморфизма у человека. Первым обратил внимание на причинную связь полиморфиз-ма человека и инфекций J.B.S. Haldane. Предполагается, что основным фактором генетического отбора у «европеоидов» выступал туберкулез. Для негроидов таким фактором была малярия. Однако специфические генетические аномалии выявлены у всех человеческих рас в популяциях, проживавших на территории интенсивных очагов малярии. Ряд гемоглоби-нопатий и других генетических аномалий, сформировавшихся в результате селективного малярийного пресса, обеспечивают разную степень защиты от этой инфекции.

В последние годы роль полиморфизма человека в развитии и особен-ностях клинического течения установлена для многих инфекционных и паразитарных болезней. В первую очередь этот полиморфизм относится к «главному комплексу гистосовместимости» (HLA). Система HLA по своей сути является комплексом генов иммунного ответа. Генетическая система HLA является наиболее полиморфной из известных систем человека и включает около 2000 аллельных вариантов. При этом имеются выраженные не только межрасовые, но и межэтнические различия в частоте встреча-емости тех или иных специфичностей. HLA-специфичность, ассоцииро-ванная с какой-либо нозологией, является достаточно высокочастотной в конкретной популяции.

Появилось большое число сообщений, связанных с выявлением на-следственных изменений человеческого генома, определяющих устойчи-вость к инфекции, вызываемой ВИЧ, или влияющих на скорость развития клинических проявлений при и СПИДе. К мутациям, безусловно, способ-ным в гомозиготном состоянии определять устойчивость к ВИЧ-инфици-рованию, в частности, относится делеция в гене, направляющем синтез хемокинового рецептора CCR5, обозначаемая D32.

248

БЕЗОПАСНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ВГС – «БЕЛЛЕРОФОНТА»

Сергиенко В.И., Сивов И.Г.НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, ФГУП ГНИИ «Биоэффект»

Минобразнауки РФ

Введение. Принцип использования генетического антивируса против вируса гепатита «С» (ВГС- «Беллерофонта»), может вызвать драматические последствия. Чтобы избежать этого, предлагается использование системы диагностики, основанной на принципе генетического антивируса-сенсо-ра.

Цель исследования. Разработать безопасный in vivo «ВГС-сенсор». Материалы и методы. Генно-инженерные, культивирование культур

клеток, ПЦР с модификациями, определение последовательности ДНК в автоматическом режиме, ИФА и измерение флуоресценции «зелёного» белка.

Результаты и обсуждение. Замену суицидной рамки трансляции «ВГС-беллеро-фонта» на ген секретируемого из клетки флуоресцирующего «зелёного» белка (EGFP) проводили с помощью двух высокоточных ПЦР, одну из которых ставили на матрице ДНК плазмиды pHCVbell, а вторую на ДНК плазмиды pEGFP, с последующим реклонированием в клетках E.coli. В одной из вставок гена EGFP обнаружили мутацию типа «сдвиг рамки». Полученные конструкции испытали на клетках линии HepG2, образующие белки репликативного комплекса ВГС, и моноцитах пери-ферической крови, полученных от ВГС-инфициро-ванных пациентов. Показана сильная положительная корреляция (Rxy=0,74; p < 0,01) между количеством заражённых «ВГС-сенсором» клеток и интенсивностью флу-оресценции EGFP. При использования конструкции, содержащей мута-цию «сдвиг рамки», положительная корреляция усиливается (Rxy=0,92; p < 0,001, слайд 7).

Выводы. Заражение «ВГС-сенсором» клеток линии HepG2, которые образуют белки репликативного комплекса ВГС, или ВГС-инфициро-ванных моноцитов периферической крови человека вызывает секрецию EGFP в среду.

249

ХРОМОСОМНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУР МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Сиднева Е.С.1,Косякова Н.В.1, Ржанинова А.А.2, Гольдштейн Д.В.2, Лир Т.3, Бочков Н.П.4

1 – ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва2 – НП Институт стволовой клетки и клеточных технологий, Москва

3 – Институт генетики человека и антропологии, Йена, Германия4 – ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва

Наряду с такими параметрами оценки качества стволовых клеток, как морфология, экспрессия определенных поверхностных антигенов, характе-ристика тканеспецифичных биохимических маркеров, кариотипирование является одним из важных этапов контроля, позволяя определить гене-тическую стабильность клеточных линий и исключить клеточные линии, несущие хромосомные перестройки.

Цель настоящей работы – разработать алгоритм цитогенетического анализа стволовых клеток для исследовательских и контрольных задач и провести хромосомный анализ культур мезенхимальных стволовых клеток человека (МСК).

Определены условия культивирования клеток, отработана методи-ка фиксации культур и приготовления цитогенетических препаратов. Проведенное кариотипирование дифференциально окрашенных (G-ок-раска) препаратов МСК не выявило нарушений хромосомного набора. Для анализа уровня анеуплоидии и полиплоидии в двух культурах МСК (с кариотипом 46,XY) была применена методика флуоресцентной гибри-дизации in situ (FISH). Для каждой из культур проводилось 2 гибридиза-ции: с зондами на хромосомы 12 и 17 и с зондами на хромосомы 3, X и Y (Vysis, Inc.). В каждом варианте гибридизации было проанализировано по 1000 ядер. Обнаружено, что частота полиплоидных клеток в культурах со-ставила 0,8 –3,0%. Частота клеток с моносомией по отдельным изученным аутосомам колебалась от 0 до 0,9%, с трисомией – от 0 до 0,5%. Нуллисо-мия по Y-хромосоме наблюдалась в 0,3 – 0,4% ядер; клеток, нуллисомных по хромосоме X, не обнаружено. Частота клеток с дисомией по половым хромосомам составила 0,1 –1,0%.

Полученные данные позволяют заключить, что размах спонтанной анеуплоидии укладывается в известные границы для культур клеток, в то же время уровень полиплоидии в культурах МСК повышен, что свидетель-ствует о необходимости дальнейшего изучения хромосомной изменчивости стволовых клеток человека, в том числе в процессе культивирования.

Грант DFG 436 RUS 17/109/04.

250

ИЗУЧЕНИЕ РЕАКТОГЕННОСТИ, БЕЗОПАСНОСТИ И ИММУНОГЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНОЙ БИВАКЦИНЫ

ПРОТИВ ОСПЫ И ГЕПАТИТА В ОРАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ НА ЛЮДЯХ

Скарнович М.О., Плясунов И.В., Сергеев А.А., Петрищенко В.А., Шишкина Л.Н., Пьянков О.В., Сергеев А.Н., Нетесов С.В., Сандахчиев Л.С.

ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская обл.

Искоренение натуральной оспы (НО) привело к практически полному исчезновению иммунной прослойки среди населения в связи со свер-тыванием программы вакцинации. Актуальность проблемы обусловлена возможностью применения вируса НО в качестве агента биологического оружия, вероятностью возникновения вспышек оспоподобных заболеваний в мире, а также выраженной реактогенностью ранее используемых вакцин против оспы. Целью исследования является определение реактогенности, иммуногенности и безопасности разрабатываемой рекомбинантной бивак-цины «Ревакс-ВТ» против НО и гепатита В (ГВ) орального применения.

Бивакцина создана на основе рекомбинантного штамма b7,5S2-S ви-руса вакцины (ВВ), кодирующего синтез белков HBs и preS2 вируса ГВ. Иммунизация добровольцев проводилась малой – (1 – 7)х106 оспообра-зующих единиц (ООЕ) и большой (1–4)х107 ООЕ дозами бивакцины по разным схемам. Было установленно, что рекомбинантный ВВ в пробах крови, слюны, мочи и кала ни в одном из случаев иммунизации бивак-циной «Ревакс-ВТ» не регистрируется (даже когда наблюдались местная и общая реакции). Однократная иммунизация добровольцев малой дозой бивакцины не позволяет создать нужного уровня сероконверсии к ВВ. При иммунизации большой дозой уровень сероконверсии к ВВ достигает 90%, но отмечается выраженная реактогенность среди привитых волонтеров (до 50%). Однако при этом численность волонтеров, имеющих протектив-ные значения титров вируснейтрализующих антител к ВВ, через 3 месяца уменьшается до 20%. Двукратной вакцинация сначала малой дозой бивак-цины и через 7 – 14 суток большой дозой достигается уровень сероконвер-сии к ВВ 100% при отсутствии реактогенности. При этом протективный иммунный ответ к ВВ сохраняется в течение 6 месяцев после вакцинации с иммунной прослойкой среди привитых 80%.

Протективный уровень сероконверсии к HBsAg вируса ГВ у волонтеров не отмечен ни при одной из схем вакцинации бивакциной. Но двукратная схема вакцинации бивакциной формирует базовый иммунитет к HBsAg, что позволит сократить схему вакцинации коммерческой рекомбинантной моновакциной против ГВ.

251

СЕРОДИАГНОСТИКА ЗАБОЛЕВАНИЙ И ИНДИКАЦИЯ ОСОБО ОПАСНЫХ ПАТОГЕНОВ НА ОСНОВЕ

ТЕХНОЛОГИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ЛИПОСОМНОГО ИММУНОАНАЛИЗА

Скопинская С.Н.1, Ярков С.П.1, Храмов Е.Н.1, Храпова Н.П.1, Пивень Н.Н.2, Прохватилова Е.В.2

1 – ГНЦ ФГУП ГосНИИ биологического приборостроения 2 – Волгоградский НИПЧИ

Основными требованиями к современным диагностическим средствам являются быстрота и надежность получения информации, что определяет актуальность поиска и развития новых аналитических подходов, в част-ности с использованием мембранных технологий.

Целью работы явилось создание на основе флуоресцентного липосом-ного иммуноанализа (ФЛИА) экспресс-метода обнаружения возбудителей особо опасных инфекций и специфических антител (АТ) к ним. Централь-ное место в ФЛИА занимают липосомные иммунореагенты, представляю-щие собой фосфолипидные везикулы, в поверхность которых встраивают молекулы антигена (АГ), а внутренний объем включает флуоресцирующее вещество в обеспечивающей самотушение концентрации. При формиро-вании на поверхности липосом иммуноспецифического комплекса АГ-АТ и последующей активации системы комплемента происходит нарушение проницаемости липосомной мембраны и вытекание флуоресцентного маркера, пропорциональное количеству образовавшихся иммунных пар, что используется для оценки содержания иммунных компонентов. Опре-деление АГ проводят по ингибированию реакции иммунного лизиса сво-бодным АГ. Важным достоинством ФЛИА является применение единого реагента для детектирования АТ и АГ.

Для получения липосомных реагентов использовали метод обраще-ния фаз, позволяющий одновременно вводить флуоресцентный маркер (кальцеин или сульфородамин 101) внутрь водного объема и антигенный материал в поверхность липосом. Показано, что метод ФЛИА позволяет выявлять специфические АТ к возбудителям холеры, брюшного тифа, туля-ремии, сапа, мелиоидоза и бруцеллеза с чувствительностью, превышающей традиционные методы анализа (РПГА, РА, РИД и др.) в 20 – 400 раз. Порог обнаружения клеток составил 105 м.т./мл для возбудителей теляремии и мелиоидоза, 106 м.т./мл для возбудителя сапа и 107 м.т./мл для возбудите-лей холеры и брюшного тифа. Порог регистрации липополисахаридных АГ возбудителей туляремии, холеры и брюшного тифа был равен 10 – 50 нг/мл, гликопротеидного Аг8, характерного для вирулентных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза – 200 нг/мл, белок-полисахаридного АГ возбудителя бруцеллеза – 2 мкг/мл.

252

Основными достоинствами метода ФЛИА являются следующие: высокая чувствительность, сравнимая с ИФА; экспрессность анализа (60 мин); простота постановки и гомогенность реакции; использование при разработке метода как поликлональных сывороток, так и моноклональных АТ; возможность получения объективных количественных данных.

ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ПОНИЖЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

ЛЕГКИХ К ВИРУСУ ГРИППА ПРИ ВВЕДЕНИИ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ДОЗ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ

Сметанникова М.А., Шишкина Л.Н., Жуков В.А., Фанкин И.В., Сергеев А.А., Пьянков О.В., Бондаренко В.Н., Петрищенко В.А., Сергеев А.Н.

ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», п. Кольцово, Новосибирская обл.

Иммуносупрессия, возникающая при хроническом стрессе и глюкокор-тикоидной терапии, способствует возникновению многих инфекционных заболеваний, в том числе гриппа. Однако причины и механизмы этого феномена к настоящему времени окончательно не установлены. Целью исследования является сравнительное изучение функциональной активнос-ти альвеолярных макрофагов (АМф) и нейтрофилов (Нф) при понижении противовирусной резистентности легких у мышей, инфицированных виру-сом гриппа после введения синтетического глюкокортикоидного гормона пролонгированного действия кеналога (Кн).

Беспородным мышам массой 15 – 17 г подкожно вводили Кн в дозе 5 мкг/г за 4 сут до инфицирования разными дозами ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2). После введения Кн понижалась и резистентность мышей к ВГ (снижение его 50 %-й летальной дозы), и восприимчивость легких к ВГ (повышение его 50 %-й инфицирующей дозы). Понижение восприимчи-вости легких к ВГ, вероятно, обусловлено противовирусными факторами сурфактанта, продукция которого могла увеличиваться под влиянием Кн. Повреждение легочной ткани у инфицированных мышей, предварительно получавших Кн, было более выражено, чем в инфицированном контроле, и сопровождалось уменьшением доли зрелых АМф и увеличением доли Нф в альвеолах. Тем не менее, титры ВГ в легких у мышей, получавших Кн до инфицирования ВГ, начиная с 4-х сут после заражения были меньше, чем в инфицированной контрольной группе. Через 2 сут после аэрогенного за-ражения ВГ у мышей, инъецированных Кн, было выражено преимущество абсолютного числа, фагоцитарной и супероксид-продуцирующей актив-

253

ности Нф над абсолютным числом, фагоцитарной и супероксид-продуци-рующей активностью АМф, в отличие от инфицированного контроля. По-видимому, именно дисбаланс между функциональной активностью АМф и функциональной активностью Нф, наблюдаемый после введения Кн и заражения ВГ, приводит к недостаточно эффективному осуществлению АМф клиренса легких от ВГ, чрезмерного количества рекрутированных Нф и продуктов тканевой деструкции, образующихся в ходе воспалительного процесса. На этом фоне в легких запускаются патологические процессы, вызывающие дыхательную недостаточность и инфекционно-токсический шок, что выражается в понижении резистентности организма к ВГ и приводит к повышенной гибели животных при их заражении ВГ после введения Кн.

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ХРОМОГРАНИНА А В КОЖЕ, ПОДВЕРЖЕННОЙ ХРОНИЧЕСКОМУ

УЛЬТРАФИОЛЕТОВОМУ ОБЛУЧЕНИЮ

Смирнова И.О., Кветной И.М., Смирнова О.Н.Санкт-Петербургской государственной медицинской академии

им. И.И. МечниковаГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН

Целью исследования было изучение особенностей экспрессии хро-могранина А (CgA) в коже, подверженной ультрафиолетовому облучению (УФО), одного из наиболее значимых факторов внешней среды. Объектом исследования служил операционный и аутопсийный материал, полученный от 45 пациентов в возрасте от 19 до 64 лет. Исследовали подверженную хроническому УФО кожу височной области головы и закрытую от инсо-ляции кожу заушной области. Для иммуногистохимического исследова-ния использовали моноклональные мышиные антитела к хромогранину A (Novocastra, RTU). Морфометрический анализ проводили с помощью системы компьютерного анализа микроскопических изображений.

Применение иммуногистохимического методов позволило обнаружить CgA в цитоплазме мастоцитов кожи человека. Количество CgA-иммуно-позитивных мастоцитов в коже, подверженной УФО, достоверно превы-шало таковое в закрытой от инсоляции коже (720,86±19,54 и 314,16±11,69 клеток в 1 мм2 кожи, p<0,001). Ранжирование пациентов на возрастные группы обнаружило, что содержание мастоцитов, экспрессирующих CgA, в коже височной области прогрессивно увеличивается с возрастом – со второй-третьей по седьмую декады жизни их число выросло более чем в 1,5. Поскольку в коже, закрытой от инсоляции, количество CgA-имму-

254

нопозитивных тучных клеток оставалось относительно стабильным на протяжении жизни пациентов, можно предположить, что их гиперплазия в коже височной области является следствием эпигенетического влияния УФО, а прогрессивный рост числа мастоцитов с возрастом предполагает зависимость показателя от кумулятивной дозы ультрафиолета.

Кроме того, в коже височной области определялось иммуноокраши-вание антителами к CgA эндотелиальных клеток сосудов дермы. Причем у пациентов, которым операция проводилась в сезон с высоким уровнем естественной инсоляции (апрель-май), отмечалось увеличение оптической плотности экспрессии маркера эндотелиоцитами на 10 – 12% (с 2,13±0,15 до 2,44±0,07 OpDEC у.е.). Появление экспрессии CgA в эндотелиоцитах дермы при хроническом действии на кожу УФО, сопровождающемся ги-перплазией тучных клеток и усилением их секреторной активности, может являться одним из адаптационных паракринных механизмов регуляции гомеостаза дермы в условиях индуцированного УФО воспаления.

ЭКСПРЕССИЯ ХРОМОГРАНИНА А ПРИ БАЗАЛЬНОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ КОЖИ

Смирнова И.О., Кветной И.М.Санкт-Петербургской государственной медицинской академии

им. И.И. МечниковаГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН

Целью исследования явилось изучение экспрессии хромогранина А (CgA) при базальноклеточном раке (БКРК), самой частой опухоли кожи.

Изучено 37 наблюдений БКРК. При иммуногистохимическом исследо-вании использовали антитела к хромогранину А (CgA) (Novocastra, RTU) и антигену Ki67 (Novocastra; 1:200). Контрольным материалом являлась кожа заушной (закрытой от инсоляции) и височной (подверженной хрони-ческому ультрафиолетовому облучению) области головы, полученная при пластических операциях от 35 пациентов. Подсчет количества позитивных клеток и определение интенсивности экспрессии молекул проводили с по-мощью компьютерной системы анализа гистологических изображений.

Экспрессия CgA клетками БКРК обнаружена в 11 наблюдениях (29,7%). Она определялась уже на ранних этапах опухолевой пролиферации в виде окрашивания единичных клеток, а в крупных пролифератах – иммунопо-зитивной реакции практически всей опухолевой ткани. Неясно, является ли иммуноокрашивание CgA в опухоли отражением его локального био-синтеза или поглощения из кровотока. Тем не менее, эти данные уклады-

255

ваются в сформировавшиеся в последние годы представления о выработке гормонов не только классическими нейроэндокринными опухолями, но и карциномами других типов. Независимо от механизмов появления CgA в клетках БКРК, его экспрессия может рассматриваться как фактор, имею-щий значение для роста и инвазии опухоли. Основанием для этого заклю-чения является зарегистрированная нами достоверная отрицательная кор-реляция (r=–0,63, F<0,01) между экспрессией опухолевыми клетками CgA и антигена Ki67, отражающего их пролиферативную активность – фактора, который определяет опухолевую прогрессию новообразования. С другой стороны, в 26 наблюдениях (70,3%) с появление БКРК ассоциировалось гиперплазия тучных клеток, экспрессирующих CgA. Количество последних достигало 1604,96±16,34 клеток на 1 мм2 кожи и достоверно превышало содержание мастоцитов в коже височной (950,64±16,47 клеток, p<0,01) и заушной (359,15±12,99 клеток, p<0,001) области у здоровых пациентов. По современным представлениям, изменения функциональной актив-ности стромы могут быть промотором опухолевой трансформации клеток эпителия. Имеются указания на наличие корреляции между количеством тучных клеток в дерме и степенью чувствительности кожи к поврежда-ющему действию ультрафиолета. Эти данные позволяют предположить, что гиперплазия CgA-иммунопозитивных тучных клеток может являться фактором, повышающими риск развития БКРК на коже, подверженной инсоляции.

256

РАЗЛИЧНАЯ СТЕПЕНЬ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

ЛЕТАЛЬНОМУ ФАКТОРУ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ТОКСИНА

Смолкина А.Е., Белова Е.В., Кравченко Т.Б., Шемякин И.Г.Государственный Научный Центр Прикладной Микробиологии

Возбудитель сибирской язвы играет главную роль в качестве опасного агента биотерроризма. Одним из основных факторов патогенности B. anthracis является экзотоксин, который состоит из трех компонентов: протективного антигена (ПА), летального фактора (ЛФ) и фактора отека (ОФ). Комплекс ПА-ЛФ представляет собой летальный токсин, который лизирует макрофаги и макрофагоподобные клеточные линии.

Целью данной работы являлось получение, характеристика монокло-нальных антител (МАт) к ЛФ и определение антигенных детерминант ЛФ, которые ответственны за различия ингибирующей активности МАт.

Панель мышиных МАт против ЛФ была получена методом гибридом-ной технологии. Был проведен анализ нейтрализации (МТТ) летального токсина (ПА-ЛФ) in vitro в присутствии различных концентраций иссле-дуемых МАт на макрофагоподобной клеточной линии J744 A.1.

Пять охарактеризованных МАт, а именно, 6G9, 10E9, 8D2, 8D5 и 3B4 проявляли иммунореактивность в отношении ЛФ и не имели перекрестной специфичности к ПА. Моноклональные антитела 8D2, 8D5 и 3B4 пред-ставляли собой иммуноглобулины изотипа IgG1, моноклональные антитела 6G9 и 10E9 – иммуноглобулины изотипа IgG2b. Наиболее эффективные антитела 6G9 ингибировали действие токсина на 90% при минимальной концентрации 0,006 мкг/мл. Увеличение концентрации МАт 6G9 не уве-личивало их нейтрализующего действия. Антитоксическое действие двух антител, 8D2 и 8D5, было меньше в 500 раз, чем действие 6G9. Их 90% нейтрализация была не ниже, чем 3 мкг/мл. Антитела 3B4 и 10E9 показали самую слабую ингибирующую активность. Они нейтрализовали ПА-ЛФ на 30% при концентрации 3 мкг/мл. Нейтрализующий эффект отсутствовал при их следующим двойном разбавлении.

Таким образом, нами был получен набор МАт против ЛФ, нейтрали-зующих действие ПА-ЛФ на макрофагоподобной клеточной линии J744 A.1. Ингибирующее действие МАт различалось на порядки. В настоящий момент выявляются структуры ЛФ, содержащие протективные антиген-ные детерминанты. Полученные результаты в будущем могут послужить основой для разработки эпитопных вакцин нового поколения.

257

КЛЕТОЧНАЯ КАРДИОМИОПЛАСТИКА МОБИЛИЗИРОВАННЫМИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ

ПРИ ИНФАРКТЕ МИОКАРДА

Смолянинов А.Б., Козлов В.А., Кириллов Д.А., Козлов К.Л.Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. НовосибирскРоссийская Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

Фундаментальные достижения в области биологии стволовой клетки привели к созданию нового направления – клеточной кардиомиопластики, основой которой является замещение поврежденных кардиомиоцитов путем иммобилизации или трансплантации стволовых клеток (СК). Клеточная реге-нерация сердца происходит в течение всей жизни организма, и СК способны регенерировать все тканевые компоненты миокарда [Anversa P. et al., 2004]. Старые клетки, умирая, замещаются новыми, молодыми функциональны-ми единицами. Клеточное обновление не ограничено паренхимальными клетками и вовлекает все клеточные популяции сердца. Существование СК объясняет высокую гетерогенность кардиомиоцитов в миокарде взрослого организма. Гипертрофированные кардиомиоциты смешиваются с молодыми дифференцированными кардиомиоцитами и с делящимися клетками, также присутствующими в сердце [Anversa P., Olivetti G., 2002].

Нами проведено исследование клинической эффективности и безо-пасности применения мобилизированных аутологичных стволовых клеток (МАСК) в комплексной терапии инфаркта миокарда (ИМ). В ходе иссле-дования у 19 больных в остром периоде ИМ на фоне стандартного меди-каментозного лечения проводилась терапия МАСК. Мобилизация клеток костного мозга проводилась при помощи курсового введения цитокина гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (G-CSF). G-CSF че-ловека является О-гликозилированным 19,6 кДа гликопротеином с pI 5,5, биологически активен в мономерной форме. G-CSF состоит из 207 амино-кислот. Ген G-CSF картируется на хромосоме 17q21-q22. Рецептор G-CSF (CD114) человека относится к мембранным белкам типа I, 130 кДа, состо-ит из 836 аминокислот, картирован на хромосоме 1q35-34,3. Связывание G-CSF с рецептором индуцирует димеризацию последнего с последующей трансдукцией сигнала роста и дифференцировки. G-CSF активирует JAK-семейство киназ, которые вызывают фосфорилирование тирозина фактора транскрипции STAT3. После этого STAT3 стимулирует пролиферацию и индуцирует дифференцировку стромальных стволовых клеток.

Целью нашего исследования явилось изучение влияния МАСК, вы-брос которых стимулирован ростовым фактором G-CSF, на клиническое, гемодинамическое течение ИМ. После введения G-CSF максимальная концентрация его в сыворотке крови достигается в пределах 2-8 часов, период полувыведения 3-4 часа.

258

Все 19 пациентов ИМ отмечали значимое улучшение самочувствия, повышение устойчивости к физическим и эмоциональным нагрузкам, уменьшение потребности в нитратах. В постинфарктном периоде (до 6 месяцев) после терапии МАСК явления сердечной недостаточности не на-растали ни у одного из 19 больных. Эти клинические особенности течения ИМ у пациентов, получавших терапию МАСК, нашли подтверждение в динамике результатов эхокардиографии, свидетельствующей об улучшении сократительной функции сердца и торможении процессов ремоделирова-ния миокарда. Так, фракция выброса на момент ИМ в среднем состав-ляла 39,5±3,8%, после терапии МАСК 58,7±3,5%; фракция укорочения 28,2±1,78% до и 35,2±2,86% после лечения.

Течение ИМ у всех 19 больных проходило без осложнений. Не было выявлено развития злокачественных нарушений сердечного ритма и про-водимости. Терапия МАСК не инициировала дополнительного ишемичес-кого повреждения миокарда. Это доказывал закономерный для ИМ харак-тер динамики уровня кардиоспецифических ферментов. Перечисленные данные рассматриваются нами как доказательство безопасности терапии МАСК у пациентов в остром, подостром и постинфарктном периоде ИМ. По нашему мнению, приведенные данные с достоверностью, насколько это возможно для пилотного исследования, свидетельствуют о безопасности и клинической эффективности МАСК в терапии ИМ.

259

ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ТЕЧЕНИЯ ИНФАРКТА МИОКАРДА НА ОСНОВЕ ДИНАМИКИ КОЛИЧЕСТВА СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОК

Смолянинов А.Б., Цыган В.Н., Кириллов Д.А., Чечеткин А.В., Халайчев Е.Е.Российская Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

Стволовые клетки (СК) способствуют репарации миокарда в зоне ин-фаркта и стимулируют ангиогенез, улучшая тем самым функцию сердечной мышцы. Целью работы было изучение динамики изменения уровня СК, для прогнозирования течения инфаркта миокарда (ИМ). У 24 больных ИМ исследовался уровень СК в периферической крови в на первые и 15 сутки пребывания в стационаре. Больным проводилось стандартное лечение ИМ. Динамику изменения количества СК крови оценивали по данным проточной цитометрии. Ее выполняли на проточном цитометре FACScan фирмы «Becton Dickinson» с использованием тройной комбинации прямых моноклоальных антител CD34FITC/CD38 PE/CD45 PerCP. У 11 пациентов группы исследования отмечался Q-ИМ, а у 13 не-Q-ИМ. У больных ИМ исследовали уровень СК периферической крови до лечения и на 15 сутки после стандартной терапии.

При мониторинге СК периферической крови у больных с Q-ИМ их количество составило в первые сутки наблюдения «CD34+CD38+»-0,07±0,02%, «CD34+CD38-»-0%. У пациентов не-Q-ИМ в первый день нахождения в стационаре уровень СК в периферической крови составил «CD34+CD38+»-0,15±0,02%, «CD34+CD38-»-0,02±0,001%. После прове-дения стандартной терапии ИМ уровень СК периферической крови на 15 сутки терапии Q-ИМ составил «CD34+CD38+»-0,18±0,01%, «CD34+CD38-»-0,12±0,001% (p<0,01). У пациентов не-Q-ИМ после проведенной стан-дартной терапии ИМ, через 15 дней уровень СК составил «CD34+CD38+»-0,29±0,018%, «CD34+CD38-»-0,21±0,011% (p<0,05).

Таким образом, у больных ИМ в периферической крови в течении первых суток заболевания отмечено отсутствие СК при Q-ИМ и весьма незначительное количество СК при не-Q-ИМ. Эти наблюдения показы-вают, что нами фиксируется только последствия выброса СК в период развития ИМ. Отсутствие СК при Q-ИМ говорит о том, что большая зона повреждения в миокарде поглощает полностью весь пул СК вышедший из костного мозга в периферическую кровь. Уровень СК, увеличивался на фоне стандартной терапии ИМ к 15 суткам. Но выброс неодинаков при Q-ИМ и не-Q-ИМ. Выброс СК в периферическую кровь больше при не-Q-ИМ. Содержание и мониторинг СК в периферической крови больных ИМ является важным прогностическим признаком течения заболевания. Выше приведенный пример динамики СК при ИМ, а также те законо-

260

мерности, которые коррелируют с клинической картиной и вариантами течения ИМ показывает то, что СК при ИМ выполняют компенсаторно-приспособительную реакцию организма человека направленную на защиту организма от повреждения.

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ АУТОЛОГИЧНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ТЕРАПИЯ ИНФАРКТА МИОКАРДА

Смолянинов А.Б., Козлов К.Л., Кириллов Д.А., Полынцев Д.Г., Кругляков П.В.Российская Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

«Транс-Технологии», г. Санкт-Петербург

Аутологичная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток (АТ-МСК) в настоящее время рассматривается современной кардиологией как наиболее перспективный метод клеточной кардиомиопластики, при тера-пии инфаркта миокарда (ИМ). Принципиально метод состоит из следую-щих составляющих: получение костного мозга при пункции подвздошной кости, выделение МСК, культивирование их, последующая аутологичная трансплантация больному ИМ. Костный мозг забирается из расчета 10 мл/кг массы тела пациента, что позволяет получить окончательную дозу ядросодержащих (мононуклеарных) клеток в пределах 1 – 4х108 клеток/кг. Это количество составляет только 1 – 5% общего объема костного моз-га и не приводит к снижению числа лейкоцитов и тромбоцитов. Нами обследованы 7 пациентов с ИМ, которым проводилась АТМСК на 14 сутки терапии ИМ. 10 пациентов ИМ (группа контроля) получали только стандартное лечение.

Целью нашего исследования явилось изучение клинических аспек-тов применения АТМСК в комплексной терапии больных ИМ. Нами в течение 12 месяцев наблюдались 17 пациентов, перенесших ИМ. По-пуляция МСК имела следующий фенотипический состав: CD34+ – 0%, CD45+ – 1,24±0,03%, CD71low – 0,022±0,001%, CD71high – 3,42±0,5%, CD90+ – 98,4±1,02%, CD106+ – 38,42±4,55%, CD44+CD90+CD105+ – 80,74±7,35%. Жизнеспособность клеточного материала МСК составляла 95,5±2,0%. В ходе трансплантации вводилось 1.000.000 МСК на 1 кг веса больного.

АТМСК не вызывала каких-либо осложнений или побочных эффек-тов, больными ИМ переносилась хорошо. У всех 7 пациентов группы исследования достигнуто неосложненное течение ИМ на фоне традици-онной медикаментозной терапии. Детальные клинические наблюдения и лабораторные исследования не выявили воспалительных процессов после АТМСК. Контрольные электрокардиографические исследования не

261

выявили развития нарушений ритма и проводимости, не наблюдавшихся у больных до трансплантации. В постинфарктном периоде нарастания явлений сердечной недостаточности не наблюдалось. Эти факты под-тверждают клиническую безопасность АТМСК у больных ИМ. Отмечена статистически достоверное улучшение сократительной функции миокарда левого желудочка у больных ИМ после АТМСК. Так, у пациентов группы исследования фракция выброса на 2-е сутки ИМ составляла 38,2±3,5%, на 60 сутки после трансплантации – 56±2,3% (р<0,01). Фракция укоро-чения на 2-е сутки составляла 27,1±0,36% и на 60-е сутки после АТМСК 34,1±0,78% соответственно (р<0,05). В группе контроля таких позитивных изменений не наблюдалось. Нами отмечена и явная положительная дина-мика в клинической картине заболевания в постинфарктном периоде. Эти позитивные изменения обусловлены блокированием процессов рубцевания миокарда и ремоделирования сердца, восстановления его сократительной способности.

262

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ БОЛЬНЫХ Q-ИНФАРКТОМ МИОКАРДА

Смолянинов А.Б., Цыган В.Н., Кириллов Д.А., Халайчев Е.Е.Российская Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

Центр клеточной и генной терапии

Иммунная система при развитии ишемической болезни сердца и ин-фаркта миокарда (ИМ) изменяется. Восстановление ее работы важно для дальнейшего течения заболевания. Целью нашего исследования явилось изучение иммунного статуса больных ИМ. Обследовано 25 больных ИМ (средний возраст 75,1±7,3 лет). У всех больных диагностировали Q-ИМ, у 16 с задней локализацией, у 9 с локализацией в области верхушки левого желудочка. В анамнезе у 14 больных была диагностирована артериальная гипертония, а у 3 пациентов сахарный диабет II типа, среднетяжелое течение. У пациентов ИМ были диагностированы изменения показате-лей состояния клеточного иммунитета: CD3+ (Т-лимфоциты) 74,3±3,2% (р<0,05); CD3+CD4+ (Т-лимфоциты хелперы/индукторы) 35,1±2,8% (р<0,05); CD3+CD8+(цитотоксические Т-лимфоциты) 34,1±1,8% (р<0,001); СD4+CD8+ (незрелые Т-лимфоциты) 4,5±0,8% (р<0,05); ин-декс CD3+CD4+/CD3+CD8+ 1,21±0,02% (р<0,01); CD3-CD16+CD56+ (истинные NK – клетки) 11,8±1,7% (р<0,01); CD3+СD16+CD56+ (Т-киллеры) 8,8±1,1% (р<0,01); CD19+ (В-лимфоциты) 14,2±1,1% (р<0,01); CD3+HLA-DR+ (активированные Т-лимфоциты) 18,3±2,2% (р<0,05); CD3-HLA-DR+ (активированные В-лимфоциты и NK-клетки) 20,1±1,9% (р<0,01); CD3+CD25+ (активированные Т-лимфоциты, a-цепь рецептора интерлейкина-2) 26,7±1,6% (р<0,01).

При Q-ИМ наблюдалось увеличение содержания циркулирующих иммунных комплексов, так среднемолекулярные составили 152,3±5,4 ед. (р<0,01); а низкомолекулярные 375,4±15,9% (р<0,001). У больных Q-ИМ в первые сутки повышается содержание CD3+CD8+ (Т-цитотоксических лимфоцитов), CD4+CD8+ (незрелых Т-лимфоцитов), усиливается плот-ность экспрессии активационных маркеров CD3+HLA-DR, CD3+CD25+ на поверхности Т-лимфоцитов, что свидетельствует об избирательной активации отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов. У пациентов Q-ИМ имеется нестабильность иммунологического фенотипа, возрастает плот-ность экспрессии маркера ранней активации, CD3+CD25+ и поздней активации CD3-HLA-DR.

Таким образом, от состояния реакции иммунной системы зависит тече-ние Q-ИМ. Огромную роль в его терапии могут играть иммуномодуляторы и цитокины, включение которых в схему стандартной терапии ИМ может значительно улучшить дальнейший прогноз течения заболевания.

263

ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ В СИСТЕМЕ КОНТРОЛЯ ЗА ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИЕЙ ИЗ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ

Сорокина Е.Ю., Чернышева О.Н.ГУ НИИ питания РАМН, Москва

В настоящее время в большинстве стран мирового сообщества законо-дательно введено требование вынесения на этикетку пищевых продуктов информации для потребителя об использовании генно-инженерных тех-нологий при их производстве и определен порог возможного присутствия случайных, технически неизбежных примесей генетически модифици-рованных источников. Для проведения контроля за выполнением этих требований разработаны, унифицированы и стандартизированы методы количественного определения в продукте носителей генетической моди-фикации: рекомбинантной ДНК или экспрессированного белка. В связи с тем, что ДНК является более стабильной мишенью для анализа, чем белок, в качестве наиболее приемлемых, рассматриваются методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени. Эти методы обладают наибольшей чувствительностью и специфичностью, отличаются отсутствием контаминации при проведении анализа и имеют простой формат исполнения.

В Российской Федерации унифицированы и утверждены методы ПЦР в режиме реального времени для наиболее распространенных на миро-вом продовольственном рынке генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения: сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату; кукурузы линий: NK 603 и GA 21, устойчивых к глифосату, MON 810, устойчивой к стеблевому мотыльку, MON 863, устойчивой к жуку диабротика.

Методом ПЦР в режиме реального времени нами проведены исследо-вания 100 образцов пищевых продуктов, имеющих генетически модифи-цированные аналоги, в их числе, изоляты и концентраты соевых белков, соевая мука, колбасные и кондитерские изделия, содержащие в своем составе соевые белки в качестве компонентов, кукурузная мука и крупа. Продукты были отобраны из торговой сети г. Москвы. В результате про-веденных исследований установлено, что 20 % продуктов переработки сои и 2 % продуктов переработки кукурузы, содержат рекомбинантную ДНК в количестве, превышающем 0,9 %, относятся к категории генетически модифицированных и подлежат маркировке. 60% продуктов содержат технически неустранимую примесь рекомбинантной ДНК.

264

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ РМЖ К АПОПТОЗ-ИНДУЦИРУЮЩЕМУ ДЕЙСТВИЮ

ЦИТОСТАТИКОВ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ НХТ

Стахеева М.Н., Чердынцева А Н.В., Слонимская Е.М., Бабышкина Н.Н.НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, г.Томск

Значительная часть применяемых в онкологии химиотерапевтических препаратов реализуют свой фармакологический эффект через индукцию апоптоза в клетках [М.Л.Гершанович и соавт., 1999]. Однако вследствие низкой селективности мишенями действия цитостатиков оказываются не только злокачественные, но и нормальные клетки, в частности, клетки иммунной системы [Р.И.Сепиашвили и соавт., 2000]. С другой стороны, известно, что развивающаяся опухоль, важной характеристикой которой является стадия регионарного метастазирования, обладает выраженным влиянием на состояние иммунной системы. Целью работы явилось иссле-дование количества CD95+ мононуклеарных клеток и клеток, имеющих морфологические признаки апоптоза, в периферической крови у больных раком молочной железы (РМЖ) при проведении неоадъювантной хими-отерапии (НХТ) в зависимости от степени вовлеченности регионарных лимфатических узлов в опухолевый процесс.

Материал и методы: В исследование были включены 70 больные РМЖ с T1-4N0-2M0. Пациентки были разделены на 3 группы: N0, N1, N2. Диагноз верифицирован морфологически. НХТ проводилась по схеме CАF стандартными дозами (2-3 курса). Мононуклеарные клетки перифе-рической крови (МКПК) выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования. Количество CD95+ клеток определяли цитохими-ческим методом. Уровень апоптоза МКПК оценивали с использованием ядерного красителя Hoechst 33342.

Результаты: Уровень апоптоза МКПК и количество CD95+клеток у больных РМЖ с N0-1 до начала НХТ не имели статистически значимых отличий от уровня здорового контроля, в то время, как у больных с N2 число CD95+клеток в периферической крови достоверно превышало по-казатели здоровых лиц (52,67±5,17% и 17,13±2,95% соответственно). После проведения НХТ исследуемые показатели у больных РМЖ с N0 остались на прежнем уровне. У больных РМЖ с N1 и N2 отмечено статистически значимое увеличение числа МКПК с морфологическими признаками апоп-тоза и снижение количества CD95+клеток. Отмеченный факт, очевидно, объясним доминирующим влиянием р-53-зависмого механизма апоптоза при применении цитостатических препаратов, распространяющимся и на клетки иммунной системы.

265

Заключение: У больных РМЖ в зависимости от степени распростра-ненности опухолевого процесса увеличивается чувствительность МКПК к апоптоз-индуцирующему действию цитостатиков при проведении НХТ.

A1/LAM СЕМЕЙСТВО MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Липин М.Ю., Иванов И.Ю., Низова А.В.Государственный научный центр прикладной микробиологии, п.Оболенск

Введение. Выявлено широко распространенное в Центральном регионе России семейство штаммов M. tuberculosis, отличающееся от W/Beijing, названное A1/LAM. Штаммы A1/LAM семейства характеризуются лекарс-твенной резистентностью, в том числе и мультирезистентностью (MDR).

Цель исследования заключалась в изучении молекулярной характерис-тики штаммов A1/LAM семейства M. tuberculosis.

Методы. Штаммы M. tuberculosis, выделенные из мокроты 260 больных легочным туберкулезом, проживающих в Тульской области (2001-2002 годы), проанализированы методами генотипирования (сполиго-, VNTR-, и RFLP-IS6110), PCR-сиквенирования (гены katG, rpoB, gyrA), и PCR (TbD1 регион). Чувствительность к изониазиду (1 мкг/мл) и рифампицину (20 мкг/мл) тестировалась методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена.

Результаты. Сполиго-, VNTR-, и RFLP-IS6110-типирование позволило выявить большую группу, состоящую из 171 (66%) штаммов, относя-щихся к одному генетическому семейству – A1/LAM. Все штаммы этого семейства принадлежат ко второй генетической группе (463CGG в katG гене и 95ACC в gyrA гене) современных штаммов M. tuberculosis (TbD1 регион отсутствует). Все они имеют идентичные VNTR-профили - 222222 (ETR-A,B,C,D,E,F), сполиготипы LAM (отсутствуют спейсеры 21-24 и 33-36) и большинство из основных 11 RFLP-IS6110 рестрикционных фрагментов (6010, 4840, 4640, 4510, 4120, 3280, 2750, 2620, 2000, 1280, 920 п. о.). MDR штаммы составили 53% у вновь выявленных пациентов и 95% – у хронических больных. Мутация 516GTC в гене rpoB выявлена у 74% рифампицин-устойчивых штаммов этого семейства.

Заключение. Незначительное генетическое разнообразие между штам-мами A1/LAM указывает на их недавнюю диссеминацию. Множественная лекарственная устойчивость свидетельствует о низкой эффективности противотуберкулезного лечения пациентов, инфицированных штаммами семейства A1/LAM.

266

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННО-РЕЗИСТЕНТНЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM

TUBERCULOSIS, ОТНОСЯЩИХСЯ К РАЗЛИЧНЫМ ГЕНЕТИЧЕСКИМ СЕМЕЙСТВАМ, ЯВЛЯЕТСЯ

РЕГИОН-ЗАВИСИМЫМ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ ЧАСТИ РОССИИ

Степаншина В.Н., Липин М.Ю, Иванов И.Ю, Низова А.В., Благодатских С.А., Шемякин И.Г.

Государственный научный центр прикладной микробиологии, п. Оболенск

Цель. Определение частоты встречаемости индивидуальных генотипов клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis в различных регионах Центральной части России.

Методы. Лекарственную чувствительность штаммов M. tuberculosis определяли методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1 мкг/мл изониазида, 5 мкг/мл стрептомицина, 30 мкг/мл канамицина, 20 мкг/мл рифампицина. RFLP-IS6110 типирова-ние осуществляли по van Embden et al. (1993), сполиготипирование – по Kamerbeek et al. (1997). Тандемные повторы в ETR-A,B,C,D,E,F локусах определяли согласно Frothingham et al. (1998).

Результаты. В период 2000-2001 гг. собрана коллекция M. tuberculosis, содержащая 557 лекарственно-резистентных клинических штамма, выде-ленных от ТБ больных, проживающих в Туле (n 328), Серпухове (n 98), Дзержинске (n 70) и Калуге (n 61). Штаммы семейств Beijing/W, LAM/А1, Haarlem и Т распределились следующим образом: в Туле – 114, 188, 20 и 6 соответственно; в Серпухове – 58, 20, 16 и 4 соответственно; в Дзержинс-ке – 55, 7, 7 и 1 соответственно; в Калуге 28, 23, 7 и 3 соответственно.

Частота штаммов Haarlem семейства в Серпухове выше, чем в Туле (16% против 6%, p=0.002). Частота встречаемости штаммов Beijing/W семейства возрастала в следующей последовательности: Тула, Калуга, Серпухов и Дзержинск (35%, 46%, 59%, 79% соответственно), в то время как частота встречаемости штаммов LAM/A1 в тех же населенных пунктах снижалась (57%, 38%, 20%, 10% соответственно). Разница между каждой парой населенных пунктов была существенной (p≤0,07).

Заключение. Среди больных в Центральном регионе России преоблада-ют штаммы А1/LAM и W/Beijing семейств. Распределение штаммов между семействами в четырех населенных пунктах неравнозначно.

267

РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РАСТВОРИМЫЙ Fas-АНТИГЕН (sFas)

Талаева Ш.Ж., Ермилова В.Д., Аббасова С.Г., Тагиева Т.Т., Костанян И.А., Карабекова З.К., Липкин В.М.

ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва

Западно-Казахстанская государственная медицинская академия им. М.Оспанова, Актюбинск

Цель исследования – сравнительный анализ клинического значения про-дукции sFas в сыворотке крови больных раком (РМЖ) и доброкачественны-ми новообразованиями молочной железы (ДНМЖ) и его связь с основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания.

Материал и методы. Изучены уровни sFas в сыворотке крови 107 боль-ных РМЖ (протоковый инфильтративный рак – 79, дольковый инфиль-тративный рак – 16, смешанный рак – 6, cancer in situ – 4, слизистый рак – 1, рак Педжета – 1) в различных стадиях заболевания, 22 больных ДНМЖ (внутрипротоковая папиллома – 3, фиброаденома – 10, фиброз-но-кистозная болезнь – 9) и у 55 практически здоровых женщин (группа контроля). Концентрацию sFas определяли до лечения в сыворотке крови иммуноферментным методом (Sandwich-ELISA), разработанным в ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина РАМН.

Результаты. Частота выявления sFas в контроле составила 47% и была ниже, чем у больных РМЖ и ДНМЖ (59 и 73%, соответственно). Уровни sFas у практически здоровых женщин также были наиболее низкими, как по средним показателям, так и по медиане (0,76±0,05 нг/мл; медиана – 0,76) и достоверно отличались от значений при РМЖ (1,87±0,14 нг/мл; медиана – 1,73; р=0,000004) и ДНМЖ (1,65±0,31 нг/мл; медиана – 1,2; р=0,001). Не выявлено зависимости между частотой обнаружения, уровнем sFas и возрастом в обследованных группах больных и в контроле. Частота выявления sFas у больных РМЖ с увеличением стадии заболевания сни-жалась, а концентрация его не зависела от стадии опухолевого процесса. Частота выявления sFas была выше при протоковом инфильтративном (61%), чем при дольковом инфильтративном (44%) РМЖ, однако средние уровни рецептора не различались между этими группами (1,94±0,18 и 1,63±0,24 нг/мл, соответственно). При ДНМЖ с учетом их гистологичес-кого строения не выявлено достоверных различий в частоте выявления и уровнях sFas. У больных РМЖ с РЭ+ опухолями частота выявления sFas была выше, чем при РЭ- опухолях, однако достоверных различий между этими группами пациентов в уровнях sFas не отмечено.

Заключение. Обсуждается роль sFas в патогенезе РМЖ.

268

РОЛЬ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ ЛИСТЕРИЙ НА ОСНОВЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПОЛИМОРФИЗМА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ФАКТОРОВ

ПАТОГЕННОСТИ В ОБЕСПЕЧЕНИИ БЕЗОПАСНОСТИ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

Тартаковский И.С., Ермолаева С.А., Карпова Т.И.НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва

За последние 15 – 20 лет листериоз превратился в одну из наиболее опасных инфекций с пищевым путем передачи, отличающуюся тяжелым течением и высоким процентом летальных исходов. Анализ эпидемических вспышек и спорадических случаев листериоза пищевого происхождения показал, что в основе их возникновения лежит адаптация патогенных листерий к интенсивному размножению в процессе изготовления, транс-портировки и хранения продуктов пищевой индустрии. Стало очевидным, что ключевым моментом в организации профилактики листериозной инфекции является обеспечение безопасности пищевых продуктов в от-ношении патогенных листерий.

Для решения этой задачи разработаны новые подходы к микробиоло-гической диагностике и идентификации листерий на основе сочетания бактериологических и молекулярно-генетических методов. Изучение меха-низма регуляции экспрессии факторов патогенности у листерий позволило разработать и внедрить в практику новый быстрый метод идентификации возбудителя. Метод основан на определении изменений в уровне леци-тиназной активности в присутствии активированного угля, характерного для L. monocytogenes, но не для других непатогенных для человека Listeria spp., часто присутствующих в продуктах питания. Показано, что сочета-ние лецитиназного теста и полимеразной цепной реакции с видоспеци-фическими праймерами plc1,plc2 в настоящее время является наиболее эффективным и надежным способом дифференциации возбудителя от непатогенных листерий. Разработан новый метод типирования штаммов L. monocytogenes на основе анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), синтезированного в ПЦР участка хромосомы, со-держащего гены патогенности prfA и plcA. Разработанный метод выявляет принадлежность выделенного штамма листерий к определенной филоге-нетической линии и позволяет определить его потенциальную эпидеми-ологическую значимость.

Разработанные методы внедрены и используются при мониторинге продовольственного сырья и пищевых продуктов на наличие патогенных листерий в Российской Федерации, необходимого для профилактики пи-щевого листериоза среди населения страны.

269

РОЛЬ СОВРЕМЕНЕННЫХ ЛУЧЕВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ В ВЫЯВЛЕНИИ СОЦИАЛЬНО

ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙТерновой С.К., Синицын В.Е.

ГОУ ВПО ММА им.И.М.Сеченова

Диагностика наиболее распространенных и социально значимых заболеваний может рассматриваться как одна из важнейших проблем национальной безопасности. В последние годы, в связи с неблагопри-ятными тенденциями в демографических показателях РФ, неоднократно подчеркивается важность профилактического направления в национальной медицине. Известно, что только первичная профилактика заболеваний позволяет снизить заболеваемость и смертность на уровне популяции. Для осуществления эффективных профилактических мероприятий необходимо использование высокоточных методов диагностики.

В нашей стране в 60 – 70 годах ХХ века были созданы и функциони-ровали программы массовых обследований населения с использованием флюорографии и маммографии. Из-за ограничений используемых на тот момент методов лучевой диагностики, эффективность их оказалась ниже ожидаемой. В настоящее время результаты нескольких крупных исследо-ваний по скринингу наиболее распространенных заболеваний показали, что при использовании современных технологий лучевой диагностики эффективность профилактических обследований населения возрастает на порядок. К числу наиболее социально значимых заболеваний относят коронарный атеросклероз и ИБС, рак легкого, толстой кишки, молочной железы и предстательной железы. Благодаря научно-техническому про-грессу, среди методов скрининга важнейшее место заняли новые мето-дики компьютерной томографии (КТ) – мультиспиральная КТ (МСКТ) и электронно-лучевая томография (ЭЛТ). В исследованиях, проведенных в ММА им. И.М.Сеченова и Институте кардиологии РКНПК МЗ и СР РФ, была убедительно показана возможность доклинической диагностики атеросклероза с помощью количественной оценки кальциноза коронар-ных артерий при проведении МСКТ и ЭЛТ. Были созданы референтные базы нормальных значений коронарного кальция, полученные результаты внедрены в клиническую практику. В настоящее время проводятся актив-ные исследования по ранней диагностике рака легкого (малодозная КТ) и толстой кишки (виртуальная колоноскопия с помощью МСКТ).

В России в последние годы отмечается неуклонный рост числа сов-ременных диагностических систем. Это позволяет говорить о том, что техническая база для проведения профилактических, скрининговых обследований уже создана. Для ее полноценной реализации требуется решение ряда насущных вопросов организации массовых обследований и подготовки кадров специалистов по лучевой диагностике.

270

ФАКТОРЫ РОСТА В ДИАГНОСТИКЕ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Трапезникова М.Ф., Морозов А.П., Казанцева И.А., Шибаев А.Н.МОНИКИ им. М.Ф.Владимирского

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

В последнее время рак предстательной железы (РПЖ) занимает веду-щие позиции в структуре онкологической заболеваемости. Это связано с быстрыми темпами увеличения заболеваемости, особенно среди мужчин пожилого возраста. Внедрение простатического специфического антигена (ПСА) в широкую клиническую практику позволило увеличить частоту выявления РПЖ на ранних стадиях. Однако, при достаточно высокой чувствительности (до 80%), специфичность этого теста остается неудов-летворительной (менее 45%). В связи с этим, усилия большинства иссле-дователей направлены на поиск новых маркеров, ростовых факторов для выявления РПЖ на ранних стадиях.

Цель настоящего исследования – изучение уровней фактора роста эн-дотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобных факторов роста I и II типа (IGF-I, IGF-II), ПСА и их соотношений при РПЖ и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ).

Материал и методы. Обследовали 38 больных локализованным РПЖ (средний возраст 66,6±5,5 лет) и 80 больных ДГПЖ (60,3±2,5 лет). Концен-трации VEGF, IGF-I и IGF-II в сыворотке крови определяли с помощью наборов реактивов фирмы «R&D» (США), ПСА – фирмы «Boehringer Mannheim» (Германия). Анализ чувствительности и специфичности тестов проводили построением характеристических кривых (ROC-кривые).

Результаты. Обнаружено, что в сыворотке крови больных РПЖ кон-центрация VEGF составила 518,9±60,7 пкг/мл и была достоверно выше по сравнению с больными ДГПЖ (267,9±99,9 пкг/мл) (р<0,001). Также выявлено, что концентрации IGF-I в сыворотке крови больных РПЖ и ДГПЖ достоверно различались и составили 178±19 и 136±9,0 нг/мл со-ответственно (р<0,05). Концентрация IGF-II в группах больных РПЖ и ДГПЖ составила 400±31 и 351±23 нг/мл соответственно (р<0,05). Соот-ношение концентраций всех исследованных факторов роста к показате-лям ПСА в сыворотке крови больных ДГПЖ достоверно превышало этот показатель у больных РПЖ (р<0,01). Чувствительность и специфичность ПСА (4 нг/мл) составили 85,7% и 57,0%; VEGF (151,5 пг/мл) – 76,2% и 57,6%; IGF-I (157 нг/мл) – 57,6% и 50,0%; IGF-II (392 нг/мл) – 57,6% и 50,0% соответственно. Чувствительность и специфичность соотношений VEGF/ПСА – 85,7% и 70%; IGF-I/ПСА – 84,2% и 75%; IGF-II/ПСА – 84,2% и 79,6% соответственно.

Заключение. Соотношение концентраций IGF-I, IGF-II и VEGF к ПСА

271

в сыворотке крови обладают высокими показателями чувствительности и специфичности при выявлении РПЖ. Обсуждается клиническое значение определения показателей VEGF, IGF-I, IGF-II в сыворотке крови для оценки прогноза и клинического течения РПЖ, а также чувствительности опухоли к гормонотерапии.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ В ГЕНЕЗЕ

АДЕНОМИОЗА.

Унанян А.Л., Сидорова И.С., Коган Е.А.ММА имени И.М. Сеченова, кафедра акушерства и гинекологии ФППОВ

Эндометриоидное поражение матки является наиболее часто встречаю-щейся формой генитального эндометриоза. Вопрос о генезе эндометриоза до настоящего времени остается предметом дискуссий. Недостаточно изучены молекулярно-биологические аспекты эндометриоза, который по патогенетическим особенностям приближается к опухолевому процессу.

Цель исследования. Выявление молекулярно-биологических особен-ностей процессов апоптоза и пролиферации в патогенезе аденомиоза для совершенствования научно обоснованной диагностики и лечения.

Материал и методы исследования. Для гистохимических методик отоб-раны 42 удаленных препаратов матки. В качестве первичных специфичных антител использовались моноклональные антитела к bcl-2 (DAKO-Гер-мания), к c-myc (NOVOCASTRA-Германия), поликлональные кроличьи антитела к Ki-67 (DAKO-Германия), к bax (CALBIOCHEM-Великобри-тания). В качестве вторичных антител применяли биотинилированные антикроличьи и антимышиные иммуноглобулины (DAKO-Германия). В работе использован TUNEL-метод с использованием ApopDETEK теста (ENZO-США, ApopDETEK Cell Death Assay System).

Результаты исследования и их обсуждение. Показатель bcl-2 в очагах внутреннего эндометриоза составил 4,48, в нормальном эндометрии bcl-2 равен 2,07, в гиперплазированном 5,43 (р<0,01). Уровень экспрессии Bax в очагах внутреннего эндометриоза составил 1,3, в негиперплазированном эндометрии 2,69, в гиперплазированном – 2,57 балов. Экспрессия c-myc в нормальном и гиперплазированном эндометрии женщин основной группы составила – 4,53 и 5,14 соответственно. Самый высокий пока-затель c-myc оказался в очагах аденомиоза – 5,44. В очаге внутреннего эндометриоза Ki-67 также оказался высоким – 11,8 (р<0,001). Оказалась большой разница экспрессии Ki-67 в нормальном и гиперплазированном эндометрии пациенток основной группы – 0,6 и 17,4. Самый низкий

272

показатель ApopDETEK теста оказался в очагах аденомиоза и составил – 0,7 (р<0,001).

Заключение. Полученные результаты ApopDETEK теста, экспрессии bcl-2, bax, c-myc и Ki-67 указывают на низкий апоптоз и высокую проли-феративную активность в очагах внутреннего эндометриоза по сравнению с аутологичным эндометрием, что по-сути выявляет пути фармокологи-ческой коррекции при аденомиозе.

АНГИОГЕНЕЗ И ЭКСПРЕСИЯ ФАКТОРОВ РОСТА В ГЕНЕЗЕ АДЕНОМИОЗА С СОЧЕТАНИЕМ ЛЕЙОМИОМОЙ

МАТКИ

Унанян А.Л., Сидорова И.С., Коган Е.А.ММА имени И.М. Сеченова, кафедра акушерства и гинекологии ФППОВ

Многофакторность патогенеза эндометриоза и миомы матки, много-численность теорий развития свидетельствуют об отсутствии истинного представления об этих заболеваниях. За несколько последних десятилетий достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной биологии клетки. Стали известны многие механизмы контроля клеточного деления и смерти, механизмов ангиогенеза и стромообразования. В этом аспекте особо актуально исследование по выявлению роли молекулярно-биологи-ческих процессов генезе эндометриоза в сочетании с миомой матки.

Цель исследования. Выявление особенностей ангиогенеза и экспрессии факторов роста в генезе аденомиоза с сочетанием лейомиомой матки для совершенствования научно обоснованной диагностики и лечения.

Материал и методы исследования. Для гистохимических методик отобра-ны 42 удаленных препаратов матки. В качестве первичных специфических антител использовали моно- и поликлональные антитела производства фирм NOVOCASTRA и DAKO (Germany) и CALBIOCHEM (UK) к сле-дующим антигенам: CD-31 (маркеру эндотелиальных клеток сосудов), ТФР-b, СЭФР.

Результаты исследования и их обсуждение. Исследование очагов адено-миоза и ткани миом с использованием антител к рецептору CD-31 – мар-керу эндотелиальных клеток сосудов, позволило визуализировать сосуды и оценить уровень ангиогенеза. В пролиферирующих миомах с сочетанием аденомиоза было отмечено, помимо крупных множество, мелких сосудов, в основном синусоидного типа. Кроме высокой активности ангиогенеза, выявлено сдавление сосудов пучками пролиферирующих миоцитов и развитие очагов ишемии и некроза. Активная продукция СЭФР (3 балла) была типична для очагов аденомиоза. Продукция и накопление ТФР-b

273

были прямо противоположными, пропорционально нарастанию склероза и гиалиноза. Достоверные различия получены нами при исследовании продукции ТФР-b и СЭФР в очагах аденомиоза в сочетании с миомой и аутологичным эндо и миометрием. Так, максимальные показатели (2 – 3 балла) для ТФР-b характерны для очагов аденомиоза.

Заключение. Таким образом, полученные результаты указывают на высокий уровень ангиогенеза и экспрессии факторов роста в очагах аде-номиоза при сочетании с лейомиомой. В этом аспекте, аденомиоз можно считать как одним из ангиогенных заболеваний.

К ВОПРОСУ О ВАЛИДАЦИИ ИФА ТЕСТ-СИСТЕМЫУстинникова О.Б., Волкова Р.А., Звонарев А.Ю., Кулякина М.Н.

ФГУН ГИСК им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора, Московское подразделение по производству бактерийных препаратов ФГУН НПО «Микроген» МЗ РФ

Большая группа вакцин против вирусных инфекций представляет собой препараты, полученные при выращивании вакцинного штамма вируса на культуре клеток. Такими вакцинами являются живые – коревая и паро-титная вакцина, инактивированные – антирабическая, против клещевого энцефалита, против герпеса, очищенные концентрирванные против кле-щевого энцефалита и антирабическая. В процессе культивирования в среду добавляют сыворотку крупного рогатого скота (СКРС). При нарушении технологии производства в готовом препарате могут содержаться белки СКРС. Бычий сывороточный альбумин (БСА), составляющий около 50% белков СКРС, обладает высокой сенсибилизирующей способностью и может вызывать побочные реакции у привитых. Это обуславливает необ-ходимость его контроля в вакцине.

В качестве метода контроля содержания БСА в отечественных вакцинах в основном используется ракетный иммуноэлектрофорез (РИЭФ). Чувс-твительность метода для БСА составляет 0,5 мкг/мл.

В связи с рекомендациями ВОЗ по уменьшению допустимого со-держания БСА в коревой, паротитной и краснушной вакцинах с 0,5 до 0,05 мкг/дозе необходима замена метода РИЭФ на метод ИФА , чувстви-тельность которого составляет несколько нанограмм.

Нами была проведена оценка тест-системы «Immunoenzimetric Assay for the Measurement of BSA« производства фирмы «Cygnus Technologies, Inc.», USA.

Коэффициент вариации для концентрации 32 нг/мл составил от 10,8 до 11,1%.

При использовании метода добавок выявление БСА различной кон-центрации (5,10,20 и 32 нг) колебалось от 79,2 до 121,7 %.

274

Результаты определения БСА при использовании стандартных образ-цов тест-системы были ниже результатов при использовании отраслевого стандартного образца (ОСО) содержания БСА аттестованного в ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Различие достигало 30 %.

Регрессионный анализ показал линейность зависимости доза-ответ для обоих СО (критерии Кохрена меньше табличных). Однако, различие между ними оказалось статистически достоверно (Критерий Стьюдента больше табличного).

Предел количественного определения, рассчитанный на основании стандартного отклонения для нулевой концентрации составляет в среднем 6 нг/мл.

ЗНАЧЕНИЕ АНАЛИЗА СОЧЕТАНИЙ НЕСКОЛЬКИХ ГЕНОВ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ПОЛИГЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Фаворова О.О.Кафедра молекулярной биологии и медицинской биотехнологии

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет», Москва

Введение. Мультифакториальные полигенные заболевания (ПЗ) состав-ляют абсолютное большинство всех заболеваний человека. Выявление фак-торов генетической предрасположенности к таким заболеваниям остается нерешенной проблемой молекулярной медицины. Основная сложность при решении этой проблемы связана с вовлечением в развитие заболевания множества полиморфных генов, каждый из которых в отдельности вносит только небольшой вклад в общий риск развития болезни. Поэтому со всей остротой встает задача выявления суммарного вклада ряда независимо действующих и/или взаимодействующих генов, число сочетаний которых растет экспоненциально по мере возрастания количества рассматриваемых участков. Наши исследования посвящены решению этой задачи в случае двух ПЗ большой социальной значимости – рассеянного склероза (РС) и ишемического инсульта (ИИ).

Цель исследования. 1) Провести геномное типирование большого количества полиморфных участков генома, выбранных с помощью под-хода «ген-кандидат», для каждого индивида, включенного в исследуемые репрезентативные группы больных РС и ИИ и здоровых контролей, и 2) применить к полученным базам данных новые статистические подходы, позволяющие анализировать вклад в восприимчивость к исследуемому заболеванию, наряду с отдельными генами, их различных сочетаний.

275

Материалы и методы. Исследование проводили методом «случай-конт-роль». Типирование генов иммунного ответа в случае РС (15 полиморфных участков) и генов систем транспорта и метаболизма липидов, гемостаза и ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (9 полиморфных учас-тков) проводили методами на основе ПЦР. Обрабатывали полученные экспериментальные данные с помощью нового статистического подхода, основанного на применении метода Монте-Карло Марковскими цепями (MCMC, А. Favorov, М. Ochs, 2004).

Результаты. Наряду с отдельными аллелями генов, ассоциированных с РС, ИИ и гипертонией при ИИ, выявлены предрасполагающие сочетания из 2-х и 3-х аллелей отдельных генов («генетические ансамбли»). При этом входящие в ансамбль аллели порознь не ассоциированы или ассоцииро-ваны более слабо с восприимчивостью к заболеванию.

Заключение. Комплексный анализ факторов генетической предраспо-ложенности к полигенным заболеваниям позволяет выявлять отдельные группы высокого риска.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ ПРЕНАТАЛЬНЫХ

МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ХОНДРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА

Фатхудинов Т.Х.1, Григорьян А.С.2, Ржанинова А.А.1, Пулин А.А.1, Шаменков Д.А.1, Бажанов Н.А.1, Гольдштейн Д.В.1,3

1 – НП «Институт стволовой клетки и клеточных технологий»2 – ГУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии

МЗСР РФ»3 – ЗАО «Реметэкс»

Регенерация костной ткани и развитие кости в эмбриогенезе протекает с участием одних и тех же незрелых клеток мезенхимы, которые сохра-няются в стволовых нишах периоста, эндоста и костного мозга. Можно выделить три популяции самообновляющихся клеток, которые обладают высокой пролиферативной активностью и обусловливают рост и пере-стройку костной ткани. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), осте-областы и хондробласты (ХБ) могут быть успешно получены, размножены в культуре и использованы для стимуляции регенерации при различных заболеваниях костной и хрящевой тканей.

Для оценки влияния ксенотрансплантации суспензии МСК и ХБ на репаративный остеогенез в качестве экспериментальных животных ис-

276

пользовали самцов беспородных белых крыс массой 190 – 200 г, у кото-рых воспроизводили стандартные дефекты (диаметром 1,5 мм и глубиной 0,5 мм) диафизов бедренных костей. В дно дефекта вводили клеточный трансплантат – 1х107 клеток в 0,1 мл физиологического раствора – или только физиологический раствор в том же объеме. Для фиксации в области дефекта клеточного трансплантата накладывали полиэфирсульфоновую мембрану. Выведение животных из эксперимента проводили на 10, 30, 60 и 90 сутки наблюдения. В опытных группах в дефект на одной из конеч-ностей вводили клеточный трансплантат, на противоположной конечности – физиологический раствор. В контрольной группе в дефекты на обеих конечностях вводили физиологический раствор.

При ксенотрансплантации пренатальных МСК и ХБ человека без проведения иммуносупрессии в раннем и позднем послеоперационном периоде состояние животных оставалось удовлетворительным, неугнетен-ным, не было выявлено осложнений и реакций отторжения трансплантата. Введение МСК и ХБ в область дефекта кости обеспечивало ускорение регенерации на 10, 30 сутки наблюдения за счет увеличения площади костной части регенерата, зрелой пластинчатой кости и уменьшения доли соединительной ткани (р<0,05). При имплантации МСК в область дефекта кости отмечалось более выраженная стимуляция репаративного остеогенеза, чем при введении ХБ (р<0,05) в основном за счет увели-чения доли зрелой пластинчатой костной ткани. При одностороннем введении клеточного трансплантата был выявлен эффект стимуляции регенерации на противоположной конечности за счет ускорения созре-вания костной ткани (р<0,05). На 90 сутки наблюдения во всех группах в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и образованная костная ткань успешно встраивалась в костный орган.

277

ИССЛЕДОВАНИЯ pH6-АНТИГЕНА И ДРУГИХ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ АДГЕЗИНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

Филиппов А.А., Панферцев Е.A., Тагарева Г.М., Бахтеева И.В., Кравченко Т.Б., Дентовская С.В., Баннов В.А., Светоч Т.Э.,

Филиппова С.В., Иванов С.А., Анисимов А.П.Государственный научный центр прикладной микробиологии, п.Оболенск

Пилевой адгезин возбудителей чумы (Yersinia pestis) и псевдотуберку-леза (Yersinia pseudotuberculosis) имеет оптимум синтеза при температуре 37° C и pH 6 и поэтому называется pH6-антигеном (PsaA). В отличие от кишечного патогена Y. pseudotuberculosis, который, помимо pH6-антигена, продуцирует важные адгезины YadA, Ail и InvA, у чумного микроба белок PsaA, по-видимому, является основным фактором адгезии. Вместе с тем обнаружены гены Y. pestis, кодирующие потенциальные дополнительные адгезины (Parkhill et al., 2001). Данные о цитотоксичности pH6-антигена (Bichowsky-Slomnicki, Ben-Efraim, 1963; Sundin et al., 2002) и его влиянии на фагоцитоз (Marra, Isberg, 1997; Huang, Lindler, 2004) противоречивы. В зависимости от штаммов Y. pestis, мутации в гене psaA приводили к умеренному снижению вирулентности (Lindler et al., 1990) или к полной ее утрате (Панферцев и др., 1991).

Настоящая работа посвящена изучению структуры и функций pH6-антигена и других потенциальных адгезинов возбудителя чумы. Мы кло-нировали оперон, определяющий синтез PsaA, его транспорт и сборку пилей адгезии, из штамма 231 биовара Antiqua, у которого psaA-мутация вызывает полную авирулентность. Проведен рестрикционный анализ и осуществляется секвенирование psa-оперона. Получен очищенный ре-комбинантный pH6-антиген, который не обладал цитотоксичностью по отношению к мышиным макрофагам линии J774A.1. При использовании производных Y. pestis 231 и EV получены новые данные о том, что уро-вень экспрессии PsaA в большей степени зависит от состава среды, чем от pH и температуры культивирования. В экспериментах с рекомбинант-ными штаммами Escherichia coli показано, что pH6-антиген способствует снижению количества жизнеспособных бактериальных клеток, погло-щенных макрофагами. Получены нокаутные psaA-мутации Y. pestis 231 и EV и изучается их влияние на фагоцитоз. Секвенированы четыре гена Y. pestis 231, кодирующие продукцию потенциальных адгезинов (YPO1707, YPO2945, YPO2950 и YPO4041). Все они идентичны генам штаммов, при-надлежащих биоварам Orientalis (Parkhill et al., 2001), Medievalis (Deng et al., 2002) и Microtus (Song et al., 2004). Это подтверждает консервативность указанных последовательностей и свидетельствует о высокой вероятности того, что эти гены функционируют и действительно связаны с адгезией возбудителя чумы.

278

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОДВЕРЖЕННОСТИ К ИНФЕКЦИОННЫМ

ЗАБОЛЕВАНИЯМ У ЧЕЛОВЕКА

Фрейдин М.Б., Пузырев В.П.ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, г. Томск

Известно, что устойчивость или подверженность к инфекционным болезням у человека в значительной мере определяется его генетически-ми факторами. Накопление знаний о роли конкретных полиморфизмов генома человека в развитии туберкулеза, малярии, вирусных заболеваний и других распространенных инфекционных нозологий представляет акту-альную научно-практическую задачу. В течение последних семи лет в ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН ведутся работы по изучению полиморфизма генов клеточного и гуморального иммунитета в связи с ин-фекционными болезнями. За это время сформирован банк ДНК и данных семейных и спорадических случаев туберкулеза, сальмонеллеза, вирусных гепатитов B и C, клещевых трансмиссивных заболеваний в этнически дифференцированных популяциях (тувинцы, русские). Установлен вклад полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, IL1B, IL4RA, IL1RN, VDR в развитие этих патологий, формирование особенностей их течения и осложнений, а также в варьирование их количественных эндофенотипов. Показана эт-ническая специфичность распределения частот функционально значимых аллелей этих генов, что, вероятно, лежит в основе дифференциальной подверженности к инфекционным заболеваниям в различных популяциях человека. Установлена этническая специфичность вклада полиморфизма исследованных генов в развитие инфекционных болезней. Так, полимор-физмы генов NRAMP1 и IL12B ассоциированы с туберкулезом у русских, но не у тувинцев. Показана также нозологическая специфичность вклада изученных генов в отношении инфекционных заболеваний. В частности, для внутриклеточной бактериальной инфекции (туберкулез, сальмонеллез) отмечена значимость полиморфизма генов NRAMP1 и IL12B, в то время как для вирусных и внеклеточных бактериальных заболеваний (клещевой энцефалит, Лайм-бореллиоз) более выражена роль генов IL1B и IL1RN. Установлена также важность гаплотипической структуры исследованных генов в определении подверженности к инфекционным заболеваниям. В целом, полученные данные вносят существенной дополнение к имею-щейся информации о роли полиморфизма конкретных генов в формиро-вании инфекционных заболеваний у человека.

279

СЫВОРОТОЧНЫЕ ГЕПАТИТЫ И НЕСОСТОЯВШИЙСЯ АБОРТ

Фролов А.Л., Трофимова О.В.Башкирский государственный медицинский университет

Республиканский перинатальный центр, г. Уфа

Цель: выявить возможное влияние вирусных гепатитов на развитие такой акушерской патологии как несостоявшийся аборт.

Материал и методы исследования: Обследовано 103 беременные женщи-ны в 1 триместре беременности. Из них группу исследования составили 64 беременные с замершей беременностью и 38 – пациентки, поступившие для прерывания беременности, группу контроля. В качестве материала для исследования использовали сыворотку крови, полученную после забора крови из периферической вены перед операцией. Клинический диагноз подтверждался данными УЗИ. Все женщины обследованы на наличие антител к различным антигенам вирусов гепатитов А, В, С, D, Е, G ме-тодом ИФА и присутствие возбудителя в крови методом полимеразной цепной реакции.

Результаты: наиболее часто в группах исследования были обнаружены антигены к гепатитам А и В. Причем, антитела к гепатиту А достоверно чаще встречались в группе контроля (20 женщин (52,6%)), чем в группе исследования (28(43,7%). Различий по частоте выявляемости антител к гепатиту В по группам не обнаружено, соответственно 22,2% и 22,7%. Антитела к гепатитам С, Е, G обнаружены в единичных случаях в обеих группах исследования. Антигены к гепатиту D не были обнаружены ни в одном случае.

Определение наличия возбудителей сывороточных гепатитов в крови методом ПЦР также не дал ни одного положительного результата.

Выводы: таким образом, нами не обнаружено не одного острого случая сывороточного гепатита при несостоявшемся аборте, что может быть дока-зательством отсутствия прямого воздействия инфекции на формирование данной акушерской патологии.

280

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ ВИДОВ B. PSEUDOMALLEI И B. MALLEI С ПОМОЩЬЮ ГЕНОМНЫХ МАРКЕРОВ, ПОЛУЧЕННЫХ МЕТОДОМ

ВЫЧИТАЮЩЕЙ ГИБРИДИЗАЦИИФушан А.А.1, Монастырская Г.С.1, Абаев И.В.2, Свердлов Е.Д1

1 – Лаборатория Структуры и Функций Генов Человека, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН, Москва 2 – Государственный научно-исследовательский центр прикладной

микробиологии, г. Оболенск, Серпуховской район Моск. обл.

АбстрактBurkholderia pseudomallei и B. mallei – два вида грамм-отрицательных

микроорганизмов, представители которых являются возбудителями опас-ных заболеваний человека и животных, мелиоидоза и сапа, соответственно. В настоящее время отсутствуют эффективные системы молекулярного типирования и дифферециальной диагностики представителей этих близ-кородственных видов бактерий. Для создания таких систем требуются ДНК маркеры, которые позволили бы отличить интересующие бактериальные штаммы друг от друга. Источником таких маркеров является генетический полиморфизм. Полиморфизм может быть обнаружен разными способами. Одним из таких способов является вычитающая гибридизация – метод, который позволяет сравнивать целые геномы без предварительного знания их нуклеотидной последовательности.

Ранее, мы сравнили геном штамма B. pseudomallei С-141 с геномом штамма B. mallei C-5 методом вычитающей гибридизации. 56 фрагментов ДНК, отличающих геном B. pseudomallei С-141 от B. mallei C-5, были использованы в данном исследовании для создания ДНК эррея. Ра-диоактивно-меченные геномы 28 штаммов B. pseudomallei и 8 штаммов B. mallei были гибридизованы с таким ДНК эрреем. В результате, для каж-дого штамма B. pseudomallei и B. mallei был получен специфичный набор гибридизационных сигналов («гибридизационный паттерн»). Результаты гибридизаций были проанализированы методом кластерного анализа. В результате, были обнаружены 18 уникальных типов паттернов, специфич-ных для B. pseudomallei, и 6 типов паттернов, специфичных для B. mallei. Полученные результаты позволили отличить большинство исследованных вариантов B. pseudomallei друг от друга и от штаммов B. mallei. ДНК марке-ры, полученные вычитающей гибридизацией, могут быть использованы для создания систем молекулярного типирования бактерий видов B. pseudomallei и B. mallei и, потенциально, для их дифференциальной диагностики. Пред-ложенный подход может быть также применен для создания систем геноти-пирования представителей любых других видов микроорганизмов.

281

ВАКЦИНЫ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ В КОНТЕКСТЕ БИОБЕЗОПАСНОСТИ

Хаитов Р.М.Государственный научный центр Российской Федерации –

Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства, г. Москва

Сформулирован, теоретически и экспериментально разработан новый принцип создания иммуногенов и вакцин путем химического соединения (конъюгирования) заданных гаптенов и антигенов с иммуномодулирующим полимером – полиэлектролитом с контролируемой структурой. Принцип апробирован на примере десятков различных антигенов и внедрен в прак-тику здравоохранения Российской Федерации.

Иммуногенность и протективные свойства конъюгированных с полиэ-лектролитами антигенов возрастает в десятки и сотни раз с усилением как антительного, так и клеточно-опосредованного иммунного ответа.

Открыты механизмы иммуностимулирующего действия полиэлектро-литов, состоящие в активации Т- и В-клеточной миграции, клеточной кооперации, компенсации функции Т-помощников, кластеризации мемб-ранных белков, сопровождающейся повышением проницаемости клеточной мембраны для ионов Са2+, Na+, K+ и активацией Са2+- и (Na+, K+)-АТФаз. Доказано, что иммуностимулирующие и мембранно-активные свойства полиэлектролитов критически зависят от степени полимеризации и наличия повторяющихся ионогенных или дипольных групп, то есть обусловлены «полимерностью» как таковой.

На основе сформулированного принципа разработан ряд конъюгиро-ванных антиген-полимерных вакцин, которые производятся и эффективно используются в течение ряда лет. Накопленный опыт свидетельствует, что путем конъюгирования с синтетическим полиэлектролитом – иммунос-тимулятором можно получить высокий антительный и клеточный ответ практически против любого эпитопа вирусов, бактерий, паразитов и фи-зиологически (биологически) активных соединений, то есть эффективную иммунную защиту, что имеет прямое отношение для повышения уровня биологической безопасности населения, сельскохозяйственных и домашних животных и других организмов.

282

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИНДУКЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЦТЛ ПРИ ВВЕДЕНИИ

ОПУХОЛЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ В ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ В ВИДЕ КОМПЛЕКСА С РЕКОМБИНАНТНЫМ HSP70 M. TUBERCULOSIS

Хомякова А.В.2, Гукасова Н.В.1, Москалева Е.Ю.1,2, Позднякова Л.П.3, Свешников П.Г.3, Северин С.Е.1,2, Северин Е.С.2,3

1 – Московский НИИ медицинской экологии, Москва 2 – Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова, Москва

3 – Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва

Белок теплового шока Hsp70 играет важную роль в формирования комплекса иммуногенных пептидов экзогенных антигенов с молекулами МНС I. Экзогенные пептиды в составе комплексов Hsp-пепид эндоцити-руются антигенпредставляющими клетками (АПК) и транспортируются те компартменты эндоплазматического ретикулума, где формируются их ком-плексы с молекулами МНС I. Кроме того, Hsp активируют созревание и функциональную активность АПК. Hsp70 M. tuberculosis взаимодействует с АПК человека, и, кроме того, являясь бактериальным иммуногенным бел-ком может оказывать дополнительное стимулирующее воздействие, опти-мизировать цитокиновое микроокружение АПК и Т-лимфоцитов и может быть использован в качестве адьюванта при нагрузке дендритных клеток (ДК) для приготовления ДК-вакцин. Целью работы явилось исследование активности ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными опухолеспецифи-ческими антигенами (ОСА), и ДК, нагруженными комплексами этих ОСА с rHsp70 M. tuberculosis. В качестве ОСА использовали лизат опухолевых клеток, опухолеспецифические белки (простатаспецифический антиген – ПСА, и специфический для рака шейки матки HPV-специфический белок Е7) и опухолеспецифические пептиды (пептид простатаспецифического мембранного антигена – ПСМА и пептид Е7). ДК получали из моноцитов периферической крови здоровых доноров с использованием ГМ-КСФ и ИЛ-4. Для индукции ЦТЛ ДК нагружали ОСА и после отмывания инку-бировали с сингенными лимфоцитами в соотношении 1:10. Обнаружена более высокая продукция Ифg при взаимодействии наивных лимфоцитов с ДК, нагруженными комплексами ОСА с rHsp70 M. tuberculosis. Аналогич-ные данные получены в отношении ЦТА лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженных такими комплексами. Таким образом, использование rHsp70 M. tuberculosis при приготовлении комплексов ОСА для нагрузки ДК обеспечивает более высокий уровень продукции Ифg и позволяет по-высить эффективность индукции опухолеспецифических ЦТЛ.

283

ОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ОРГАНИЗМА КАК ОДИН ИЗ ФАКТОРОВ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА ПРИ

КОНТАКТЕ ЛЮДЕЙ С ВЫСОКОТОКСИЧНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ

Хрипач Л.В., Ревазова Ю.А., Зыкова И.Е.ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды

им. А.Н. Сысина РАМН, Москва

Оксидантное равновесие организма неспецифически изменяется при различных патологических и предпатологических процессах и может рассматриваться как один из факторов нестабильности генома. Данное исследование было проведено с целью изучения последствий профессио-нального контакта людей с некоторыми высокотоксичными химическими соединениями. Всего было обследовано 69 чел. (30 чел. в трех группах экспонированных лиц, 32 чел. в группах сравнения и 7 пациентов карди-ологического отделения как внутренний стандарт). Анализ полученных данных с учетом длительности и давности экспозиции и особенностей поддерживающей терапии свидетельствует о том, что длительный контакт с изучаемыми веществами может сопровождаться достоверным увеличением интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) плазмы крови по сравнению с соответствующим возрастным диапазоном.

Связь между интенсивностью ЛЗХЛ плазмы крови и уровнем хромо-сомных аберраций (ХА) в лимфоцитах обследованных лиц полностью укладывалась в построенную нами ранее «аутокаталитическую» модель оксидантного повреждения генома (Хрипач, 2003). Максимум на полино-миальной зависимости между этими переменными находился значитель-но левее, чем в ранее проведенных нами исследованиях, что привело к возникновению между ними обратной корреляционной связи (R= -0,226, р<0,064) и парадоксальному, с точки зрения общепринятых представлений, соотношению внутригрупповых уровней ХА.

Из пяти изученных полиморфно наследуемых генов (СYР1А1 I462V; СYР2Е1 VI79I; GSТМ1 +/0; GSТТ1 +/0; РОN1 L55М) только для GSТТ1 выявлена слабая достоверная связь с ЛЗХЛ плазмы крови (R= -0,262; р<0,04). Не было найдено связи между ЛЗХЛ плазмы и генотипом пара-оксоназы РОШ, предполагаемая антиоксидантная активность которой об-суждалась в связи с различной заболеваемостью носителей аллелей L и М атеросклерозом (Аviram еt аl., 1998; Маrathе еt аl., 2003; Теibеr еt al., 2004). Напротив, уровень ХА в лимфоцитах имел отчетливую корреляционную связь с соотношением РОN1/GSТМ1 (R = 0,419; р<0,0005). Результаты трехмерного моделирования свидетельствовали о независимом влиянии обоих предикторов на уровень ХА. За последние годы появилось много

284

новых данных о свойствах РОN-лактоны и полифенолы вошли в круг субстратов и индукторов (Satoh et al., 2002), обнаружен АhR-чувствитель-ный элемент в промоторе гена (Gouedard еt аl., 2004) Полученные нами данные позволяют предположить, что РОN1 не обладает антиоксидантной активностью и, по-видимому, способна активировать промутагенные со-единения (эндогенного или экзогенного происхождения).

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ СТРОМЫ КОСТНОГО МОЗГА: ОПЫТ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Чайлахян Р.К., Герасимов Ю.В., Чайлахян М.Р.ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Последние десятилетия ХХ века ознаменовались значительными ус-пехами в области клеточной и молекулярной биологии. Прогресс в тех-нологии клеточных культур, сепарации и идентификации клеток создали предпосылки для разработки методов лечения, использующих различные виды трансплантации клеточных взвесей или каркасов заполненных клетками с целью восстановления целостности поврежденных органов. Подавляющее большинство методов тканевой инженерии основаны на пересадке стволовых клеток. Эти клетки описаны для многих органов и тканей. Основным источником стволовых клеток взрослого организма является костный мозг. Он содержит два вида наиболее изученных стволо-вых клеток – стволовые кроветворные клетки и стволовые клетки стромы костного мозга или мезенхимальные стволовые клетки.

Именно из костного мозга нами в 1969 г. была выделена и описана новая популяция клеток-предшественников – стромальные клетки-пред-шественники. В последующих исследованиях удалось показать, что они являются стволовыми клетками стромы костного мозга, т.к. обладают высоким пролиферативным потенциалом, самоподдерживаются в процессе пролиферации и дифференцируются в нескольких направлениях, образуя костную, хрящевую, соединительную и другие типы тканей.

В 1984 г. нами был разработан и по решению Ученого Совета МЗ СССР внедрен в клинику биотехнологический метод восстановления дефектов костной ткани, гиалинового хряща суставов, сухожилий и связок. Он ос-нован на аутотрансплантации в область дефекта стволовых стромальных клеток костного мозга и включает в себя следующие этапы:

1. Получение у больного трепаната костного мозга и передача его в лабораторию;

2. Выделение и размножение в культуре ткани стволовых клеток стро-мы костного мозга;

285

3. Ретрансплантация выращенных клеток в область дефекта кости или хряща больного, костный мозг которого был использован для культиви-рования.

Продолжительность культивирования, т.е. получение необходимого для трансплантации числа клеток, зависит от величины дефекта кости или хряща и составляет в среднем 1 – 1,5 месяца. Положительный эффект достигается через 2 – 3 месяца после произведенной трансплантации и соответствующего лечения.

Области применения: травматология и ортопедия, челюстно-лицевая хирургия, стоматология (имплантология), нейрохирургия.

ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ КОМБИНАЦИЙ ВАРИАНТНЫХ АЛЛЕЛЕЙ ГЕНОВ АПОПТОЗА, ФЕРМЕНТОВ

МЕТАБОЛИЗМА И ЦИТОКИНОВ В РИСКЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И ПРОГНОЗЕ КЛИНИЧЕСКОГО

ТЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

Чердынцева Н.В., Белявская В.А., Севостьянова Н.В., Гервас П.А., Уразова Л.Н., Слонимская Е.М., Коломиец С.А.,

Литвяков Н.В., Бабышкина Н.Н., Стахеева М.Н., Денисов Е.В. Воевода М.И., Чойнзонов Е.Ц.

НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, Томск ФГУП «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии

«Вектор», Кольцово, Новосибирская область Институт терапии СО РАМН, Новосибирск.

Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков 2 фазы глутатион-S-трансфераз GSTT1 и GSTМ1 могут модифицировать функциональную инактивацию белка онкосупрессора р53 под действием генотоксических факторов. Показано, что регуляция транскрипционной активности р53 мо-жет осуществляться через сигнальный путь хемокинового рецептора ССR5. Установлено, что у больных раком молочной железы, несущих CCR5del32, снижены показатели безрецидивной выживаемости, при этом обнаружена зависимость от соматического статуса р53 в опухоли (Manes, 2004).

Цель. Исследовать комбинации аллельных полиморфизмов генов фер-ментов биотрансформации ксенобиотиков и генов апоптоза у больных раком легкого и раком молочной железы и оценить взаимосвязь с тяжестью клинического течения

Материалы и методы. В исследование включены 150 больных плос-коклеточным раком легкого и 150 больных раком молочной железы.

286

В качестве контрольной выборки служили свободные от онкологической патологии долгожители (125 человек, возраст 80-105 лет) (Сметаннико-ва М.А. и соавт., 2004). Полиморфизм генов р53, ССR5 GSTT1 и GSTM1 определяли в ДНК, полученной из крови пациентов, методом ПЦР. Соматический статус р53 оценивали по экспрессии мутантного белка в клетках опухоли.

Результаты. Выявлено, что у больных раком легкого накопление белка р53 в клетках опухоли ассоциировано с опухолевой прогрессией (мета-стазы в регионарные лимфоузлы). При этом у пациентов с сочетанием нулевых генотипов по GSTT1 и GSTM1 частота обнаружения р53 значимо выше, чем у больных с нормальными генотипами ферментов метаболиз-ма (OR=2,48 (CI 95% 1,17-5,29), р=0,015). У курильщиков при сочетании нулевых генотипов чаще выявляется р53 в опухолях, чем при наличии нормальных аллелей (OR=2,34 (CI 95% 1,0-5,5), р=0,048), у некурящих пациентов такой зависимости не обнаружено. Комбинации генотипов р53 и CCR5, включающие хотя бы один из мутантных аллелей этих генов с низкой функциональной активностью (Pro или GSTT1- и GSTM1-) более часто встречались у больных раком легкого, чем у здоровых долгожителей (OR=3,28, F: p=0,038). Для сочетания генов р53 и ССR5 имеет место такая же закономерность. У больных, несущих делеционный аллель ССR5del32, чаще выявляется в опухоли мутантный р53, и это связано с опухолевой прогрессией.

Оценка сочетаний вариантных аллелей ССR5 и р53 показала, что у молодых женщин, несущих сочетания генотипов ССR5/ ССR5del32 и Arg/Arg повышен риск заболеть раком молочной железы по сравнению с находящимися в постменопаузе. Интересно, что этот генотип являет-ся защитным в плане прогрессии опухоли (OR=2,54 (CI 95% 1,02-6,36), р=0,044). В работе проведен анализ выживаемости больных в зависимости от сочетаний генотипов изучаемых генов.

Таким образом, определенные генотипические сочетания р53, CCR5, GSTT1 и GSTM1 могут повышать риск и способствовать прогрессии рака легкого и рака молочной железы. Полученные данные свидетельствуют о том, что полиморфизмы генов ферментов биотрансформации ксенобио-тиков и гена хемокинового рецептора CCR5 могут оказывать влияние на функцию р53, различия которой обусловлены его полиморфизмом.

287

ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫЕ МАРКЕРЫ В ПРОГРАММАХ, НАПРАВЛЕННЫХ НА АКТИВНОЕ ВЫЯВЛЕНИЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ:

РЕАЛЬНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ

Чиссов В.И., Сергеева Н.С., Маршутина Н.В., Мишунина М.П.Московский научно-исследовательский онкологический институт

им. П.А.Герцена

Важной составляющей противораковой борьбы, способной реально улучшить результаты лечения злокачественных новообразований, является их скрининг – метод активного выявления лиц с онкологической пато-логией или риском ее развития, основанный на специальных диагности-ческих тестах. Адекватные скрининговые программы должны выявлять злокачественные новообразования на более ранних стадиях, что может привести к увеличению выживаемости больных.

В настоящее время доказана эффективность скрининга, направлен-ного на выявление рака молочной железы, ПСА-скрининга (для рака предстательной железы), цитологического метода (для рака шейки матки), тестов, выявляющих скрытую кровь в кале (для колоректального рака). То есть, показана принципиальная возможность улучшения выживаемости онкологических больных при выявлении рака с использованием скринин-говых программ. Проведенные исследования позволили сформулировать требования к методам скринингового типа, а также критерии для выбора злокачественных новообразований, для которых целесообразно разрабаты-вать скрининговые программы. В этом плане большой интерес вызывают серологические опухолеассоциированные маркеры (ОМ). Обоснованием для их использования на первом этапе скрининга являются: простота в исполнении, низкая стоимость, неинвазивность, а также то, что их уровень у первичных онкологических больных в 60 – 80% случаев в 10 – 40 раз пре-вышает верхнюю границу нормы. Результаты ряда скрининговых программ свидетельствуют о том, что уровни ОМ начинают повышаться за 1 – 2,5 года до клинического предъявления злокачественной опухоли. В то же время, в ряде случаев повышение ОМ может наблюдаться и при неопухолевых заболеваниях. Поэтому повышенный уровень какого-либо ОМ не всегда означает наличие злокачественного новообразования, но свидетельствует о наличии патологического процесса и является прямым указанием на необходимость дообследования. Наиболее перспективными ОМ для онко-логического скрининга являются: СА 125 (для рака яичников), SСС (для рака шейки матки), РЭА, СА 19-9 и СА 72-4 (для злокачественных опухолей органов желудочно-кишечного тракта), РЭА и Tu M2-PK (для колоректаль-ного рака) и UВС (для рака мочевого пузыря) и некоторые другие.

288

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ АНАЭРОБНЫХ ИНФЕКЦИЙ ПОЛОСТИ РТА В

ГЕНЕЗЕ МЕСТНОЙ И ОБЩЕЙ ПАТОЛОГИИ ОРГАНИЗМА

Чухловин А.Б., Соловьева А.М., Тотолян А.А., Матело С.К., Дмитриев А.В., Сысоев К. А., Морозова Е.Б., Хохлачева А.В.,

Тепляков Б.Г., Константинова В.Е., Кобиясова И.В., Матело Л.Н., Смирнова Т. В., Шаманова Н.А., Гагалева Л.А., Носов С.Н., Кузьминых Г.И., Стати Т.Н., Малыгина А.Н., Улитина В.П.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Существенная роль в генезе социально значимых стоматологических и сердечно-сосудистых заболеваний отводится анаэробным микроорга-низмам, ассоциированных с кариесом и периодонтитом. Микробиоценоз ротовой полости человека насчитывает более 600 различных видов микро-организмов. В связи с этим, целью нашего популяционного исследования было сравнение частоты выявления ряда маркерных бактерий, а именно Actinobacillus actinomycetemcomitans (AA), Porphyromonas gingivalis (PG), Васteroides Forsythus (BF), а также Streptococcus Mutans (SM) в группах по 500 человек (возраст от 6 до 70 лет) в 4 городах (Санкт-Петербург, Екате-ринбург, Нижний Новгород и Новосибирск).

Материалы и методы. Биологические пробы забирали с 3 точек (языка, под- и наддесневой областей). Выявление бактериальной ДНК проводилась методами геноспецифической ПЦР. Популяционные данные обрабатывали непараметрическими методами (пакет программ Winstat).

Результаты. Наиболее информативным было исследование материала в над- и поддесневых областях (зоны роста зубного камня и отслаивания десен). Выявляемость AA и BF в десневых пробах была наиболее частой среди жителей Новосибирска и значительно меньшей в выборках из Санкт-Петербурга и Нижнего Новгорода. Встречаемость S.Mutans оказа-лась существенно повышенной в контингентах Новосибирска и Нижнего Новгорода по сравнению с выборками из Санкт-Петербурга. Анализ сум-марной выборки (2000 человек) показал, что частота встречаемости AA, BF и PG в образцах зубного налета значительно повышалась с возрастом, особенно в группах лиц 15 и 35 лет, достигая максимума в старших груп-пах, что свидетельствует о патогенетической роли анаэробной флоры в возникновении хронической патологии периодонта.

Заключение. Результаты исследования предполагают необходимость дальнейшего изучения одонтопатогенной микрофлоры как фактора груп-пового и индивидуального риска воспалительных процессов среди лиц разных возрастов, живущих в различных регионах.

289

АНАЛИЗ АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА КСЕНОБИОТИКОВ ПРИ РАЗЛИЧНОЙ

ЭФФЕКТИВНОСТИ ГОРМОНОМОДЕЛИРУЮЩЕЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ЭНДОМЕТРИОЗОМ

Швед Н.Ю., Крамарева Н.Л., Иващенко Т.Э., Асеев М.В., Баранов В.С.НИИ АГ им. Отта, Санкт-Петербург

Основным направлением консервативной терапии больных эндомет-риозом (Э.) является восстановление нарушенного гормонального статуса с помощью антиэстрогенных лекарственных средств. Однако у пациенток часто наблюдается резистентность к гормономоделирующей терапии, а также серьезные побочные эффекты.

Ретроспективный анализ результатов гормонального лечения Э. поз-волил разделить пациенток на группы в зависимости от эффективности проводимой терапии. Выделены 2 условные группы – успешное лечение (группа I) и лечение со слабо выраженным эффектом (группа II). Выявле-но достоверное повышение частоты аллеля А1 гена ароматазы (CYP-19) в группе II (p<0,01). Более того, частота генотипа А1/A6 достигала в группе II 30,6%, тогда как в группе I эта величина не превышала 5%(OR 9,06)

При суммарном анализе сочетаний полиморфизмов функционально неполноценных аллелей генов GSTM1, GSTT1 и NAT2 были выявлены достоверные различия между двумя группами больных Э. Показано досто-верное увеличение доли таких генотипов как GSTT0/0 + S/S NAT2 (р<0,05, OR 8,3 CI95% 1,36-51,14), GSTM10/0+ S/S NAT2 (р<0,01, OR 8,6 CI95% 2,17-34,22) и GSTM10/0 + GSTT1 0/0 (р<0,05 OR 10,5 CI95% 1,81-60,91) в группе II. Существенно, что генотип GSM1 0/0+GSTT10/0 не иденти-фицирован ни у одного пациента группы I (успешное лечение), тогда как в группе II (лечение со слабым эффектом) его частота достигала 31%.

Суммарный анализ генов фазы 2 детоксикации показал, что в груп-пе больных Э., резистентных к гормональной терапии достоверно чаще встречаются функционально неполноценные генотипы в двух и более генах, чем в группе больных с успешным лечением (68,6 и 13% соот-ветственно, Х2=19,6, р<0,001). Риск слабого эффекта гормональной те-рапии при неблагоприятном генотипе, увеличивается в 14,6 раза (CI95% 4,45 – 47,76).

290

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДНК-МЕТОДОВ В ПИЩЕВОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Шевелева С.А.ГУ НИИ питания РАМН, Москва

В отличие от клинической диагностики, где ДНК-методы и в первую очередь ПЦР получили уже неплохое развитие, санитарно-пищевая мик-робиология ещё не так активно использует эти технологии для решения своих задач. Проблемы внедрения обусловлены несколькими аспектами. Так, исходя из правил контроля за безопасностью пищевых продуктов и необходимости давать юридическую оценку их соответствия установ-ленным требованиям, обязательны такие процедуры как стандартизация, межлабораторная валидизация и официальное утверждение методов оп-ределения возбудителей и других микробных контаминантов в пище. Это безусловно потребует времени и ресурсов.

Пищевые продукты, в отличие от большинства объектов клинической диа-гностики, могут содержать ДНК самых разнообразных возбудителей, причем как живых, так и инактивированных в процессе технологии. Концентрации патогенов зачастую очень низки. Поэтому методический аспект требует обя-зательной разработки специальных процедур, направленных на доведение количества загрязняющих пищу микробов до устойчиво детектируемого уровня (селективного подращивания, иммуносепарации) или доказательств их жиз-неспособности. Кроме того, особенности разных видов пищевых продуктов (высокая жирность, кислотность, пищевые добавки-консерванты и др.) делают их едва ли не самыми сложными объектами для выявления ДНК возбудителей, которому должно предшествовать устранение влияния пищевой матрицы. Соответственно, от эффективности всех этих процедур зависит достоверность ответа. Немаловажным является и необходимость оптимизации процедуры учета конечного результата к специфике работы баклабораторий, как правило, не оснащенных оборудованием для фореза. Внедрение ДНК-методов в прак-тику контроля пищи сдерживает и отсутствие отечественных тест-систем для определения патогенов и других актуальных микробных загрязнителей.

Несмотря на эти проблемы, потребность в ДНК-методах для пищевой микробиологии чрезвычайно возросла. В современных условиях, когда среди традиционных агентов инфекций появилось множество представителей с из-мененными свойствами, для их обнаружения на фоне массы фенотипически подобных микробных контаминанатов пищи пригодны только ДНК-методы. В схемах официального контроля безопасности они должны быть не альтер-нативным дополнением к классическому микробиологическому анализу, а обязательной процедурой. Основной областью их применения при текущем контроле продуктов сейчас является завершающее звено – идентификация выделенных культур, где требуется повысить специфичность определения. Но

291

для повышения скорости анализа сырья и верификации эффективности тех-нологий при организации контроля по ходу всей пищевой цепочки целесооб-разно и развитие методов прямого выделения ДНК патогенов. Наиболее пер-спективными технологиями для выявления последовательностей ДНК (РНК), специфичных для возбудителя, признаются молекулярно-гибридизационный анализ в жидких средах (который не требует дорогостоящего оборудования), и традиционная ПЦР с детекцией результатов иммунофлюоресценцией, ИФА колориметрией. Здесь большая потребность имеется в мультиплексных вари-антах с несколькими праймерами, а не с каким-либо одним, особенно если данная последовательность кодирует фактор патогенности, встречающийся и у других видов микрооорганизмов. Наиболее перспективной для внедрения в пищевую микробиологию следует признать технологию ПЦР в реальном времени, так как она позволит решить не только существующие проблемы лабораторной контаминации продуктами амплификации, но и практически снимет основную проблему при контроле пищи – подтверждение жизнеспо-собности возбудителя в исследуемом продукте.

Для целей быстрого расследования вспышек пищевых отравлений и инфекций, своевременного оповещения об инцидентах от пищи и об их природе в условиях глобализации торговли продовольствием требуется ус-корение и повышение специфичности процедур типирования возбудителей по характеристике нуклеиновых кислот. Наряду с методами быстрого выяв-ления возбудителей путем различных вариантов ПЦР, одним из наиболее необходимых направлений здесь должно быть использование доказавших свою эффективность методов фингерпринтирования изолятов, процедуры гель-электрофореза в пульсирующем поле. Метод позволяет эффективно ло-кализовать вспышку, ликвидировать источник и в 100% случаев подтвердить происхождение инкриминированного продукта даже при случаях, зарегист-рированных территориально далеко от места выпуска опасной продукции.

Важный раздел использования ДНК-методов в пищевой микроби-ологии – санитарно-эпидемиологическая оценка технологических и пробиотических микроорганизмов. Ряд задач оценки безопасности на этапе допуска новых штаммов в производство на сегодня в стране решен, но в целом при надзоре за выработанными с ними продуктами раздел нуждается в скорейшем внедрении основанных на ПЦР доступных ме-тодов подтверждения подлинности используемых штаммов и анализа на наличие маркеров генных модификаций.

Научные исследования в области оценки микробиологического риска должны развиваться в направлении прогнозирования поведения возбу-дителей в пищевых продуктах, изучения экспрессии генов патогенности, продукции стресс-белков, передачи генов антибиотикорезистентности пу-тем использования ПЦР в реальном времени, молекулярно-биологических методов изучения продуктов экспрессии значимых генов под влиянием условий в пище и в живом организме.

292

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СЕКВЕСТРАЦИИ И МЕТАБОЛИЗАЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ В ЛЕГКИХ ПРИ

СНИЖЕНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ВИРУСУ ГРИППА НА ФОНЕ ИСКУССТВЕННОГО ГЛЮКОКОРТИЦИЗМА

Шишкина Л.Н., Сметанникова М.А., Селятицкая В.Г.1, Сергеев А.А., Жуков В.А., Фанкин И.В., Бондаренко В.Н., Макарова О.П.1, Сергеев А.Н.

ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», пос. Кольцово, Новосибирская обл.

1 – ФГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины, г. Новосибирск

Известно, что легкие являются главным органом секвестрации и мета-болизации нейтрофилов (Нф). Ранее нами было показано существенное повышение численности Нф и понижение активности альвеолярных макрофагов (АМф) в бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) после введения высоких доз глюкокортикоидов (ГК). Однако значение этого феномена в патогенезе инфекционных заболеваний легких, в том числе гриппа, не изучено. На лабораторных животных, получавших син-тетический глюкокортикоид кеналог (Кн), мы исследовали миграцию меченых 51Cr Нф в органы и ткани, а также численность и функцио-нальную активность АМф и Нф при аэрогенном инфицировании легких вирусом гриппа A/Aichi/2/68 и при наличии в перитонеальной полости конкурентных очагов воспаления, индуцируемых хемоаттрактантами для Нф - гликогеном или С5а-desarg.

При введении меченых 51Cr Нф в кровь наблюдали их преимущест-венную аккумуляцию в легких по сравнению другими органами и у крыс, инъецированных Кн (опыт), и в контрольной группе. Причем в опыте миграция Нф в легкие была более выражена, чем в контроле. Индукция очагов воспаления в перитонеальной полости крыс с помощью хемоаттрак-тантов для Нф существенно уменьшала их приток в легкие и восстанав-ливала нормальное соотношение между АМф и Нф в БАЛЖ, нарушенное предварительным введением Кн. После введения Кн у мышей снижалась резистентность к вирусу гриппа, хотя его титры в легких при развитии инфекционного воспаления вплоть до летального исхода были ниже, а степень повреждения легочной ткани – выше, чем в инфицированной контрольной группе. Это сопровождалось преобладанием абсолютной численности, фагоцитарной и супероксид-продуцирующей активности Нф над аналогичными показателями АМф, в отличие от инфицированной кон-трольной группы. Очевидно, одной из причин понижения резистентности к вирусу гриппа после введения Кн является резкий дисбаланс между функциональной активностью популяций АМф и Нф, вызванный более выраженной в этом случае секвестрацией и аккумуляцией Нф в легких, ко-

293

торая обусловлена с одной стороны направленной миграцией Нф в легкие как очаг инфекционного воспаления, с другой стороны индуцированным ГК повышением количества циркулирующих и мигрирующих в легкие Нф с одновременным подавлением клиринговой способности АМф.

ИНДУКЦИЯ ПРОТЕКТИВНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У МЫШЕЙ ВАКЦИНИРОВАННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫМ АДЕНОВИРУСОМ ПТИЦ CELO, ЭКСПРЕССИРУЮЩИМ

ГЛИКОПРОТЕИН G ВИРУСА БЕШЕНСТВА

Шмаров М.М.1, Тутыхина И.Л.1, Логунов Д.Ю.1, Верховская Л.В.1, Черенова Л.В.1, Недосеков В.С.2, Цыбанов С.Ж.2, Новиков Б.В.2, Народицкий Б.С.1, Гинцбург А.Л.1

1 – ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва

2 – НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии РАСХН, г. Покров

Специфическая профилактика и терапия социально значимых инфек-ций нуждается в постоянной модификации вакцинных я лекарственных препаратов. Возможности совершенствования средств профилактики и терапии инфекционных болезней традиционными методами весьма огра-ничены (если не исчерпаны). В связи с этим, в последнее время ведется активная работа по созданию вакцин нового поколения (генно-инже-нерных вакцин) с привлечением методов молекулярной биотехнологии (ДНК-технологии).

В последнее десятилетие в качестве возможных терапевтических и профилактических средств борьбы с социально-значимыми заболеваниями активно испытываются рекомбинантные аденовирусы, экспрессирующие гены белков, оказывающих терапевтическое воздействие (опухолевые супрессоры, суицид-гены, цитокины и др.), и гены белков, вызывающих развитие протективного иммунного ответа по отношению к определен-ному патогену.

Настоящая работа посвящена изучению рекомбинантного аденови-руса птиц CELO, экспрессирующего ген гликопротеина G (gpG) вируса бешенства. Вектор на основе аденовируса птиц CELO был выбран в связи с его большой пакующей емкостью, способностью к накоплению в высоких титрах куриных эмбрионах. Данные свойства делают этот вектор экономически привлекательным с точки зрения разработки на его основе рекомбинантных вакцин для человека и животных.

В ходе экспериментов было продемонстрировано, что двукратное внут-римышечное ведение рекомбинантного аденовируса CELO, экспрессиру-

294

юшего ген gpG вызывало у мышей синтез вируснейтрализующих антител. Уровень защиты при экспериментальном заражении (100 LD) вирусом бешенства мышей, вакцинированных рекомбинантным аденовирусом CELO, составил более 90%, что превышает уровень защиты при иммуни-зации традиционной инактивированной вакциной (80%).

ОСОБЕННОСТИ СУБПОПУЛЯЦИОННОЙ АРХИТЕКТОНИКИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С АУТОИММУННЫМ МИОКАРДИТОМ

Шогенов З.С.1,4, Кекенадзе Н.Н. 1,4, Земцова М.А.3, Калинина Е.В.1, Сучков С.В. 2,3

1 – РГМУ, Москва, 2 – МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва 3 – ММА им. И.М. Сеченова, Москва

4 – Городская клиническая больница №81, Москва

Введение: Миокардит часто выступает в роли предвестника сердеч-ной недостаточности (СН) и дилятационной кардиомиопатии (ДКМП) с формированием в итоге локализованного аутоиммунного синдрома. Целью работы являлось сравнительное исследование наиболее значимых параметров субпопуляционного спектра крови у больных с различными вариантами течения АМ и МКС, оценка их патогенетической и клини-ческой значимости в практике.

Материалы и методы: Нами было обследовано 99 больных с различными вариантами течения АМ и МКС, и 40 клинически здоровых доноров (ЗД). При диагностике миокардитов использовали классификацию Н.Р. Палеева с соавт. (2002) и рекомендации NYHA.

Результаты: У большинства пациентов (40,4%) выявлено злокачествен-ное течение заболевания (ЗАМ) с выраженной декомпенсация сердечной деятельности. При доброкачественном течении АМ (ДАМ 23,3%) СН была менее выражена. При ЗАМ отмечалось увеличение индексов активации Т/В-лимфоцитов, рост экспрессии активационных маркеров на клетках обеих линий дифференцировки, формирование диспропорций в составе иммунорегуляторных субпопуляций с одновременным возрастанием роли ДК, значительное уменьшение интенсивности апоптоза аутореактивных Т-лимфоцитов. Весьма интересны прямые взаимосвязи между активнос-тью и степенью агрессивности АМ с одной стороны и динамикой клеток с активационным фенотипом CD21+ – если при ДАМ отмечается едва видимый рост численности указанной субпопуляции, то в группе с ЗАМ такая корреляция приобретает выраженный характер. У больных с МКС ассоциативность такого рода отсутствовала. Можно, таким образом, по-

295

лагать, что экспрессируемый на ДК и В-лимфоцитах CD21+-маркер, яв-ляющийся рецептором для комплемента, приобретает ключевое значение для активации В-клеток и индукции механизмов комплемент-зависимой АТ-опосредованной цитотоксичности, в первую очередь, при прогрессиро-вании АМ, что и наблюдается при ЗАМ. При ДАМ выраженных признаков иммунопатологии не обнаружено, и в связи с этим данную группу можно рассматривать как самостоятельный вариант течения АМ, требующий индивидуального подхода к разработке патогенетически обоснованных лечебно-реабилитационных мероприятий.

Заключение: Изучение экспрессии активационных маркеров на клетках периферической крови имеет значительные преимущества по сравнению с изучением эндомиокардиальных биоптатов, оснащая врача общей практики неинвазивным методом иммунодиагностики, позволяющим осуществлять мониторинг за состоянием иммунной системы пациента и проводить обос-нованный подбор терапии.

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКА nm 23 В ОПУХОЛЯХ ЖЕЛУДКА

Юрченко А.А., Делекторская В.В., Огнерубов Н.А., Кушлинский Н.Е.ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Воронежская Государственная медицинская академия им. Н.Н.Бурденко, Воронеж

Цель исследования – анализ уровней экспрессии nm 23 в раке желудка.Материал и методы. В исследование включены образцы опухоли от 54

больных раком желудка в возрасте от 36 до 75 лет, женщин – 18, муж-чин – 36. У 40 (74,1%) больных выявлена аденокарцинома, у 14(25,9%) – недифференцированный рак желудка. У 4 пациентов (7,4%) аденокарци-нома была высокой степени дифференцировки (G1), у 14 (25,9%) – уме-ренной (G2) и у 22 (40,7%) – низкой (G3). Следует отметить, что в 1 – 2 стадиях рака желудка было 26 больных (48,1%), в 3 – 26 (48,1%), в 4 – 2 больных. Экспрессию белкового маркера nm 23 определяли с помощью стрептавидин-биотинового иммунопероксидазного метода. Окрашивание парафиновых срезов ткани первичных опухолей желудка проводили с ис-пользованием моноклональных антител против белков nm 23-H1 (фирма «Dako», Дания). По интенсивности экспрессии nm 23 в цитоплазме клеток опухоли больных были разделены на группы: 1) отсутствие экспрессии; 2) низкая экспрессия; 3) высокий уровень экспрессии.

Результаты. Накопление белка nm 23 (низкий и высокий уровень экспрессии) выявили в 34 образцах цитоплазмы клеток опухолей (63,0%). При этом, наибольшее число опухолей было с низкой экспрессией nm 23

296

(37,0%), отсутствие экспрессии выявлено в 11,1% наблюдений, высокий уровень – в 25,9%. Пол больных не был связан с уровнем экспрессии белка nm 23 в цитоплазме клеток опухоли. Не выявлено связи экспрессии nm 23 с такими показателями как T и N. В отличие от опухолей, локализован-ных в теле желудка, экспрессия nm 23 в карциномах антрального отдела выявлялась крайне редко или была сниженной. У преобладающего числа больных недифференцированным раком желудка экспрессия белка nm 23 не выявлялась или была крайне низкой. Отмечено увеличение частоты выявления экспрессии nm 23 в опухолях больных в более молодом возрасте (до 50 лет). В 12 из 54 (22,2%) опухолей было выявлено окрашивание ядер опухолевых клеток антителами к nm 23. У больных недифференцирован-ным раком желудка окрашенные ядра отсутствовали во всех опухолях (0%), а при аденокарциномах выявлялись в 30% (р=0,03). Степень диф-ференцировки аденокарцином желудка не связана с наличием окрашен-ности ядер клеток опухоли. У 22 больных исследовали экспрессию nm 23 в непораженной слизистой желудка. У большинства больных выявлено умеренное и сильное окрашивание нормальной слизистой желудка (63,6 и 18,2%, соответственно).

Заключение. Снижение экспрессии nm 23 характерно для низкодиффе-ренцированных опухолей желудка, которые имеют крайне неблагоприятное клиническое течение и прогноз.