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FACULTAT DE BIOLOGIA

DEPARTAMENT DE FISIOLOGIA

EFECTO DE LA DIETA SOBRE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE INSULINA Y

GLUCAGÓN EN TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss) Y DORADA

(Sparus aurata) Y CARACTERIZACION DEL TRANSPORTADOR DE GLUCOSA

DE DORADA

TESIS DOCTORAL

PABLO CESAR ROJAS MELÉNDEZ

Barcelona. Octubre, 2005

UNIVERSITAT DE BARCELONA

UNIVERSITAT DE BARCELONA

FACULTAT DE BIOLOGIA

DEPARTAMENT DE FISIOLOGIA

EFECTO DE LA DIETA SOBRE LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE INSULINA Y

GLUCAGÓN EN TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss) Y DORADA

(Sparus aurata) Y CARACTERIZACION DEL TRANSPORTADOR DE GLUCOSA

DE DORADA

Memoria presentada por

Pablo César Rojas Meléndez

Para optar al grado de Doctor en Biología

Tesis realizada bajo la dirección de los Drs. Isabel Navarro Álvarez y Joaquim

Gutiérrez Fruitos del Departament de Fisiologia, Facultat de Biologia.

Adscrita al Departament de Fisiologia, Facultat de Biologia,

Universitat de Barcelona, programa de Fisiologia (bienio 2000-2001).

Dra. Isabel Navarro Dr. Joaquim Gutiérrez Pablo Rojas

Barcelona. Octubre, 2005

A Juanita por todo

P.C. Rojas Agradecimientos

Es curioso para llegar a este punto, he recorrido un largo camino que me ha

llevado incluso literalmente a cruzar medio mundo, y para lo cual he contado con el

apoyo de muchas personas, que me han enseñado tantas cosas a nivel profesional pero

sobretodo a nivel personal, por lo que quisiera agradecerles profundamente a todas

aquellas personas y amigos por compartir parte de sus experiencias.

A mis directores de tesis la Dra. Isabel Navarro Alvarez y Dr. Joaquim

Gutiérrez Fruitós por brindarme su apoyo y amistad en cada momento, así como la

oportunidad de realizar la tesis doctoral en un estupendo ambiente de trabajo a lo

largo de estos años.

Al Dr. Josep Planas por su ayuda y orientación en la parte del clonaje del

bendito transportador de glucosa de dorada.

Gracias a mis compañeros del laboratorio con los que he compartido el trabajo

entre risas y música que han hecho más placentera mí estancia en el laboratorio. A

Amaya, Mónica y Núria con las que prácticamente inicie y culminaré está experiencia.

Gracias también a Bárbara, Dani, Encarni, Joaaan, Jordi, Juan, Lamia, Lourdes y

Marta por su ayuda y los buenos momentos pasados en estos años.

Agradecer por el apoyo y los gratos momentos a Giovanni, Jean Charles, Ina,

Laia, Leire, María Laura, Nerea y Oxana durante sus estancias en el laboratorio a lo

largo de estos años.

Gracias a Pedro Gómez, Jaume Pérez y Becarios del Instituto de Acuicultura de

Torre la Sal por su amistad y todo su apoyo en los largos y a veces interminables

muestreos.

Agradecer a mis amigos Xavi petit y Ayalke por compartir aficiones y risas

durante estos años. Así como a Arantxa, Arnau, Begoña, Berta, Cleo, David, Eli, Jordi,

kelly y Núria por las risas y los gratos momentos.

Gracias a Beguito y Enric por su amistad y apoyo, así como por los excelentes

días pasados en la Font del Ferro y Valencia.

Agradecimientos P.C. Rojas

A Yzita y Quino por su amistad y compañia. A Eli, Gerardo, Julio y Liz por los

buenos momentos.

A mis amigos del Instituto del Mar del Perú (IMARPE), por su apoyo y la

amistad en todo momento.

Agradecer a Alex, Antonio, Angel, Carlos, Gustavo, Hadi, Hugo, Lema, Luchin,

Manolo, Oscar, Rene, Wendi Fro y los hermanos Zalamea por la amistad y las risas de

los viernes.

Gracias a Franc, Joan, Jordi, Ignasi, Ismael, Lluis, Rauliño, Jordi, Victor y Xavi

por compartir risas y el partidillo de los jueves.

Agradecer a todos los integrantes del Amateur Futbol Club y no comienzo a

nombrarlos porque sino no acabaría nunca, ya saben que los aprecio y disfrutamos del

futbol y tardes de un buen asado argentino en el coloso del Prat del Llobregat.

Gracias a mis amigos concontinentales Nancy, Natalia, Alejandro, Sergio y

Santiago, con sus respectivas familias, por la amistad y los buenos momentos vividos en

nuestras reuniones, y que me confirman que tenemos más cosas que nos unen de las que

nos separan.

Agradecer a todos los profesores, becarios y secretarias del Departament de

Fisiología que siempre han sido muy amables conmigo durante estos años.

Gracias a Cristina, Gabriel, Luchin y Matty por formar parte de mí familia y

hacerme sentir como en casa.

Agradecer a mis padres, hermanos y familia, aunque no entienden lo que hago

en la ciencia siempre me han apoyado para recorrer mí propio camino.

Gracias a la Agencia Española de Cooperación Internacional (AECI), por las

becas AECI y MAE-AECI del año 2000 al 2003 y el año 2005. Agradecer también a la

Universitat de Barcelona por la ayuda del año 2004.

A tots i cada un de vosaltres moltes gràcies

Pablo

INDICE

Rojas P.C. Índice

1.- INTRODUCCIÓN..................................................................................................... 1

1.1.- ACUICULTURA Y LA NUTRICIÓN EN PECES. ..................... 3

1.1.1.- Generalidades de la trucha arco iris. .....................4

1.1.1.- Generalidades de la dorada. .....................6

1.2.- SISTEMA DE INSULINA, FACTORES DE CRECIMIENTO TIPO INSULINA (IGF-I) Y GLUCAGÓN. ..................... 8

1.2.- SISTEMA DE INSULINA, FACTORES DE CRECIMIENTO TIPO INSULINA (IGF-I) Y GLUCAGÓN. ..................... 8

1.2.1.- Insulina. .....................8

1.2.2.- Factores de crecimiento tipo insulina (IGF-I). ...................10

1.2.3.- Receptores de insulina e IGF-I. ...................10

1.2.5.- Efectos biológicos de la insulina e IGF-I. ...................14

1.2.6.- Glucagón. ...................17

1.2.6.- Efectos biológicos del glucagón. ...................18

1.3.- TRANSPORTE DE GLUCOSA. ................... 20

1.3.1.- La glucosa en peces. ...................20

1.3.1.- Transportadores de glucosa. ...................21

2.- OBJETIVOS............................................................................................................ 25

3.- MATERIAL Y MÉTODOS ................................................................................... 29

3.1.- ANIMALES Y CONDICIONES EXPERIMENTALES. ................... 31

3.1.1.- BLOQUE EXPERIMENTAL I: Efectos de dietas con diferentes perfiles de aminoácidos en trucha arco iris y dorada. ...................31

3.1.2.- BLOQUE EXPERIMENTAL II: Efectos de la sustitución de la proteína animal por la proteína vegetal en la dieta de trucha arco iris y dorada........37

3.1.3.- BLOQUE EXPERIMENTAL III: Inyección de arginina y glucosa en dorada ................ 42

3.1.4.- BLOQUE EXPERIMETAL IV: Caracterización y clonaje del transportador de glucosa (GLUT4) del músculo esquelético de dorada. ...................42

3.2.- EXTRACCIÓN DE SANGRE Y TEJIDOS. ................... 43

3.3.- PARÁMETROS DE CRECIMIENTO Y EFICIENCIA DE UTILIZACIÓN DE NUTRIENTES Y ENERGÍA. ................... 43

Índice Rojas P.C.

3.4.- DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA EN PLASMA. ................... 44

3.5.- FUNDAMENTO DEL RADIOINMUNOENSAYO DE INSULINA Y GLUCAGÓN EN PLASMA. ................... 45

3.6.- RADIOINMUNOENSAYO DE INSULINA. ................... 46

3.6.1.- Marcaje de insulina de bonito. ...................46

3.6.2.- Cuantificación de la insulina plasmática. ...................47

3.7.- RADIOINMUNOENSAYO DE GLUCAGÓN. ................... 49

3.7.1.- Material y reactivos ...................49

3.7.2.- Procedimiento ...................50

3.8.- RADIOINMUNOENSAYO DE IGF-I. ................... 51

3.9.- SEMIPURIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES DE INSULINA E IGF-I EN EL MÚSCULO BLANCO. ................... 51

3.9.1.- Fundamento. ...................51

3.9.2.- Material. ...................51

3.9.3.- Procedimiento. ...................52

3.10.- ENSAYO DE UNIÓN DE LA HORMONA A SU RECEPTOR. ................... 53

3.10.1.- Material y métodos. ...................53

3.10.2.- Procedimiento ...................53

3.11.- CLONAJE DEL TRANSPORTADOR DE GLUCOSA (GLUT4) DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO DE DORADA. .............. 55

3.11.1.- Extracción del ARN del músculo rojo de dorada. ...................55

3.11.2.- Aislamiento del ARNm del músculo rojo de dorada. ...................56

3.11.3.- Síntesis de ADNc por la transcriptasa reversa. ...................57

3.11.4.- Amplificación del ADNc por PCR y PCR anidada.. ...................58

3.11.5.- Separación de los fragmentos de ADN amplificados. ...................59

3.11.6.- Aislamiento y ligación de los fragmentos de ADN amplificados. .................60

3.11.7.- Transformación y selección de las bacterias con los fragmentos de ADN amplificados. ...................61

3.10.8.- Secuenciación y alineamiento de los fragmentos de ADN amplificados. ...63

Rojas P.C. Índice

3.12.- ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN DEL ARN MENSAJERO DEL TRANSPORTADOR DE GLUCOSA (GLUT4) DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO DE TRUCHA ... 64

3.12.1.- Obtención de las membranas. ...................64

3.12.2.- Prehibridación y marcaje de la sonda btGLUT de trucha común................65

3.13.- CUANTIFICACIÓN A NIVEL DE PROTEÍNA DEL TRANSPORTADOR DE GLUCOSA (GLUT4) DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO DE DORADA. .......... 66

3.13.1.- Extracción de las proteínas del tejido muscular de dorada. ...................66

3.13.2.- Cuantificación de proteínas: método de Bradford. ...................66

3.13.3.- Electroforesis de proteínas. ...................67

3.13.4.- Geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). ...................67

3.13.5.- Detección con anticuerpos (“western-blot”). ...................69

3.15. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. ................... 72

4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................. 73

4.1.- BLOQUE I: EFECTOS DE DIETAS CON DIFERENTES PERFILES DE AMINOÁCIDOS EN TRUCHA ARCO IRIS Y DORADA. ................... 75

4.1.1.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en trucha arco iris. ...................76

4.1.2.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón en el plasma sanguíneo de la trucha arco iris ................ 78

4.1.3.- Caracterización de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco de trucha arco iris. ...................80

4.1.4.- Efecto de la alimentación forzada sobre los niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la trucha arco iris. ...................82

4.1.5.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en dorada. ...................85

4.1.6.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la dorada. ..............87

4.1.7.- Caracterización de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco de doradas. ...................89

4.1.8.- Efecto de la alimentación forzada sobre los niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la dorada. ...................91

4.1.9.- Discusión. ...................94

4.2.- BLOQUE II: EFECTOS DE LA SUSTITUCIÓN DE LA PROTEÍNA ANIMAL POR LA PROTEÍNA VEGETAL EN LAS DIETAS DE TRUCHA ARCO IRIS Y DORADA............... 102

Índice Rojas P.C.

4.2.1.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en trucha arco iris. .................103

4.2.2.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón en el plasma sanguíneo de la trucha arco iris. .................105

4.2.3.- Efectos de las dietas experimentales sobre la expresión del transportador de glucosa (GLUT4) en el músculo rojo de trucha arco iris. .................107

4.2.4.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en dorada .................108

4.2.5.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de las doradas..........110

4.2.6.- Discusión. .................112

4.3.- BLOQUE III: TRATAMIENTOS DE ARGININA Y GLUCOSA EN DORADA. .......... 117

4.3.1.- Crecimiento y eficiencia alimenticia de las doradas. .................118

4.3.2.- Niveles plasmáticos de glucosa en dorada: efectos de la administración de glucosa y arginina. .................119

4.3.3.- Niveles de insulina en el plasma de las doradas: efectos de la administración de glucosa y arginina. .................120

4.3.3.- Niveles plasmáticos de glucagón en la dorada: efectos de la administración de glucosa y arginina. .................121

4.3.3.- Niveles del IGF-I en el plasma de dorada: efectos de la administración de glucosa y arginina. .................122

4.3.4.- Caracterización de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco de las doradas: efectos de la administración de glucosa y arginina ......... 123

4.3.5.- Discusión. .................125

4.4.- BLOQUE IV: CARACTERIZACIÓN Y CLONAJE DEL TRANSPORTADOR DE GLUCOSA (GLUT4) DEL MÚSCULO ESQUELÉTICO DE DORADA. ................. 130

4.4.1.- Clonaje del transportador de glucosa (saGLUT) del músculo esquelético de dorada. .................131

4.4.2.- Expresión tisular del transportador de glucosa de dorada (saGLUT)........133

4.4.3.- Validación del anticuerpo para la determinación del transportador de glucosa de dorada (saGLUT). .................134

4.4.4.- Efecto del ayuno sobre el transportador de glucosa del músculo esquelético de dorada (saGLUT). .................134

4.4.5.- Efectos de la administración intraperitoneal de insulina sobre el transportador de glucosa (saGLUT) de dorada. .............. 136

Rojas P.C. Índice

4.4.5.- Efectos de la administración de glucosa y arginina sobre el transportador de glucosa en el músculo blanco de dorada (saGLUT). .................137

4.4.6.- Discusión. .................138

5.- CONCLUSIONES................................................................................................. 143

6.- BIBLIOGRAFIA................................................................................................... 147

7.- PUBLICACIONES ............................................................................................... 165

LISTA DE TABLAS

Rojas P.C. Lista de tablas

Tabla 1.1.- Estructura primaria de las secuencias de aminoácidos del glucagón en peces. ...................................................................................................................... 17

Tabla 3.1.1.- Composición de dietas experimentales con diferentes perfiles de aminoácidos para trucha arco iris ........................................................................... 33

Tabla 3.1.2.- Composición de dietas experimentales con diferentes perfiles de aminoácidos para dorada ........................................................................................ 34

Tabla 3.1.3.- Composición de aminoácidos en las dietas experimentales con diferentes perfiles de aminoácidos para trucha arco iris ......................................................... 35

Tabla 3.1.4.- Composición de aminoácidos en las dietas experimentales con diferentes perfiles de aminoácidos para dorada. ..................................................................... 36

Tabla 3.1.5.- Composición de dietas experimentales con sustitución de la proteína animal por la proteína vegetal para trucha arco iris................................................ 38

Tabla 3.1.6.- Composición de dietas experimentales con sustitución de la proteína animal por la proteína vegetal para dorada............................................................. 39

Tabla 3.1.7.- Composición de aminoácidos en las dietas experimentales con sustitución de la proteína animal por la proteína vegetal para trucha arco iris......................... 40

Tabla 3.1.8.- Composición de aminoácidos en las dietas experimentales con sustitución de la proteína animal por la proteína vegetal para dorada...................................... 41

Tabla 3.6.1.- Protocolo del radioinmunoensayo de insulina. ........................................ 49

Tabla 3.7.1.- Protocolo del radioinmunoensayo de glucagón. ...................................... 50

Tabla 3.11.1.- Protocolo de la reacción de la transcriptasa reversa (RT)...................... 57

Tabla 3.11.2.- Secuencia de cebadores degenerados utilizados para la clonación y secuenciación del Glut4 de dorada. ........................................................................ 58

Tabla 3.11.3.- Protocolo de las reacciónes de PCR....................................................... 59

Tabla 3.11.4.- Protocolo de ligacíon de los fragmentos ADN aislados......................... 61

Tabla 4.1.1.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las trucha arco iris alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ...... 76

Tabla 4.1.2.- Composición corporal y utilización de nutrientes de trucha arco iris alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ...... 77

Tabla 4.1.3.- Características de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo blanco de trucha arco iris alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ............................................................................................................ 80

Tabla 4.1.4.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las dorada alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos .......................... 85

Lista de tablas Rojas P.C.

Tabla 4.1.5.- Composición corporal y utilización de nutrientes de las doradas alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ..... 86

Tabla 4.1.6.- Características de los receptores de insulina en el músculo blanco de doradas alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ............................................................................................................ 89

Tabla 4.1.7.- Características de los receptores de IGF-I en el músculo blanco de doradas alimentadas con dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ............................................................................................................ 90

Tabla 4.2.1.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las truchas arco iris alimentadas con dietas experimentales de diferentes grados de sustitución de proteína animal por proteína vegetal .................................................................... 103

Tabla 4.2.2.- Composición corporal y utilización de nutrientes de las truchas arco iris alimentadas con dietas experimentales de diferentes grados de sustitución de proteína animal por proteína vegetal .................................................................... 104

Tabla 4.2.3.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las doradas alimentadas con dietas experimentales de diferentes grados de sustitución de proteína animal por proteína vegetal .............................................................................................. 108

Tabla 4.2.4.- Composición corporal y utilización de nutrientes en las doradas alimentadas con dietas experimentales de diferentes grados de sustitución de proteína animal por proteína vegetal .................................................................... 109

Tabla 4.3.1.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las doradas alimentadas con las dietas experimentales D0 y D75 ..... 118

Tabla 4.3.2.- Características de los receptores de insulina e IGF-I en los músculo blancos de doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina después de 3 horas del tratamiento......................................... 123

Tabla 4.4.1.- Características corporales y parámetros en plasma de las doradas en el experimento de ayuno después de 2 semanas ......... 135

LISTA DE FIGURAS

Rojas P.C. Lista de figuras

Figura 1.1.- Principales países productores de trucha arco iris ....................................... 5 Figura 1.2.- Principales países productores de dorada .................................................... 6 Figura 1.3.- Representación esquemática de la estructura de la insulina de salmón....... 9 Figura 1.4.- Representación esquemática de la estructura del factor de crecimiento tipo

insulina de salmón .................................................................................................. 10 Figura 1.5.- Representación esquemática de la estructura de los receptores de

insulina e IGF-I....................................................................................................... 11 Figura 1.6.- Cascada de la transmisión de la señal a partir de los receptores de

insulina e IGF-I....................................................................................................... 14 Figura 1.7.- Productos del gen de glucagón en mamíferos y peces en el páncreas

y en el intestino....................................................................................................... 18 Figura 1.8.- Diagrama esquemático de la estructura de los transportadores de glucosa

de difusión facilitada .............................................................................................. 21 Figura 3.1.- Representación de la ecuación básica del radioinmunoensayo ................. 45 Figura 3.2.- Protocolo de semipurificación de los receptores de insulina e IGF-I del

músculo blanco....................................................................................................... 52 Figura 3.3.- Protocolo del ensayo de binding de los receptores de insulina e IGF-I del

músculo blanco....................................................................................................... 54 Figura 4.1.1.- Niveles plasmáticos de glucosa sanguínea de trucha arco iris alimentadas

con las dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos..................... 78 Figura 4.1.2.- Niveles de insulina plasmática de truchas arco iris alimentadas con las

dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos. ................................ 79 Figura 4.1.3.- Valores de glucagón en el plasma sanguíneo de las truchas arco iris

alimentadas con las dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos. 79 Figura 4.1.4.- Binding específico de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo

blanco de trucha arco iris alimentadas con dietas de diferentes perfiles de aminoácidos. ........................................................................................................... 81

Figura 4.1.5.- Valores de glucosa en plasma sanguíneo de trucha arco iris en el

experimento de alimentación forzada con las dietas TM y TMGlu ....................... 82 Figura 4.1.6.- Niveles del insulina en el plasma de trucha arco iris en el experimento de

alimentación forzada con las dietas TM y TMGlu................................................ 83

Lista de figuras Rojas P.C.

Figura 4.1.7.- Valores de glucagón plasmático en trucha arco iris en el experimento de alimentación forzada con las dietas TM y TMGlu................................................. 84

Figura 4.1.8.- Niveles plasmáticos de glucosa de las doradas alimentadas con las dietas

experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ........................................... 87 Figura 4.1.9.- Niveles de insulina plasmática de doradas alimentadas con las dietas

experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos ........................................... 88 Figura 4.1.10.- Valores de glucagón en el plasma sanguíneo de las doradas alimentadas

con las dietas experimentales de diferentes perfiles de aminoácidos..................... 88 Figura 4.1.11.- Binding específico de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo

blanco de las doradas alimentadas con dietas de de diferentes perfiles de aminoácidos ............................................................................................................ 90

Figura 4.1.12.- Niveles de glucosa en plasma de las doradas en el experimento de

alimentación forzada con las dietas DM y DMGlu ................................................ 91 Figura 4.1.13.- Niveles del insulina en plasma de doradas en el experimento de

alimentación forzada con las dietas DM y DMGlu ................................................ 92 Figura 4.1.14.- Valores de glucagón plasmático de las doradas en el experimento de

alimentación forzada con las dietas DM y DMGlu ................................................ 93 Figura 4.2.1.- Niveles plasmáticos de glucosa sanguínea de trucha arco iris alimentadas

con las dietas experimentales de sustitución de la proteína animal por proteína vegetal................................................................................................................... 105

Figura 4.2.2.- Niveles de insulina plasmática de truchas arco iris alimentadas con las

dietas experimentales de sustitución de la proteína animal por proteína vegetal. 106 Figura 4.2.3.- Valores de glucagón en el plasma sanguíneo de las truchas arco iris

alimentadas con las dietas experimentales de sustitución de la proteína animal por proteína vegetal .................................................................................................... 106

Figura 4.2.4.- Análisis de la expresión del ARNm del GLUT4 en el músculo blanco de

trucha arco iris alimentadas con dietas de sustitución de la proteína animal por proteína vegetal ................................................................................................... 107

Figura 4.2.5.- Niveles plasmáticos de glucosa de las doradas alimentadas con dietas

experimentales de sustitución de proteína animal por proteína vegetal ............... 110 Figura 4.2.6.- Valores de insulina en el plasma sanguíneo de doradas alimentadas

con las dietas experimentales de sustitución de proteína animal por proteína vegetal................................................................................................................... 111

Figura 4.2.7.- Niveles de glucagón plasmático de las doradas alimentadas con las dietas

experimentales de sustitución de proteína animal por proteína vegetal ............... 111

Rojas P.C. Lista de figuras

Figura 4.3.1.- Niveles plasmáticos de glucosa sanguínea de las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina ......................... 119

Figura 4.3.2.- Niveles de insulina en el plasma sanguíneo de las doradas alimentadas

con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina................... 120 Figura 4.3.3.- Niveles plasmáticos de glucagón en las doradas alimentadas con las

dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina............................... 121 Figura 4.3.4.- Niveles del IGF-I en el plasma sanguíneo de las doradas alimentadas con

las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina ......................... 122 Figura 4.3.5.- Binding específico de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo

blanco de las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina................................................................................................. 124

Figura 4.4.1.- Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducida del transportador de

glucosa de dorada (saGLUT)................................................................................ 131 Figura 4.4.2.- Alineamiento de aminoácidos del transportador de glucosa de dorada

(saGLUT) con secuencias de las secuencias de transportadores de glucosa de diferentes especies ................................................................................................ 132

Figura 4.4.3.- Distribución tisular del saGLUT de dorada a partir de RT-PCR utilizando

cebadores específicos de saGLUT y 18S ............................................................. 133 Figura 4.4.4.- Inmunodetección del saGLUT mediante western blot en el músculo rojo

de dorada, utilizando diferentes concentraciones de proteínas y diluciones del anticuerpo btGLUT4. ........................................................................................... 134

Figura 4.4.5.- Efecto del ayuno de 2 semanas sobre los niveles de proteínas del

saGLUT en los músculos rojos y blancos de dorada............................................ 135 Figura 4.4.6.- Efectos de la insulina sobre los niveles de proteína del saGLUT en los

músculos rojos y blancos de dorada a las 3 horas de la inyección ....................... 136 Figura 4.4.7.- Efectos de la insulina sobre los niveles de proteína del saGLUT en los

músculos rojos y blancos de dorada a las 24 horas de la inyección ..................... 136 Figura 4.4.8.- Efectos de la glucosa y arginina sobre los niveles de proteínas del

saGLUT en los músculos blancos de dorada........................................................ 137

1.- INTRODUCCIÓN

Rojas, P. C. Introducción

3

1.1.- Acuicultura y la nutrición en peces.

La producción de la acuicultura constituye un aporte importante de la demanda

de peces y organismos acuáticos para consumo humano. Así, en el 2002 la contribución

de la acuicultura fue del 30 % del total consumido, y se calcula que en el 2015 podría

llegar hasta al 41 % (FAO, 2004). Este aumento en la producción acuícola estaría

limitado por el alimento requerido para sostener estos incrementos. Actualmente, en las

dietas utilizadas, la principal fuente de proteínas es la harina de pescado, lo cual eleva el

costo de elaboración de la dieta ya que proviene de la explotación de los recursos

marinos naturales. El uso de fuentes de proteínas alternativas o la mejora del

aprovechamiento de los carbohidratos (Baños et al., 1998) son estrategias que podrían

reemplazar o sustituir en parte a la harina de pescado, y así evitar la dependencia de la

acuicultura de está fuente de proteína animal. Además, de forma indirecta disminuiría el

esfuerzo pesquero sobre los bancos de peces naturales y evitaría la transformación

innecesaria en algunos casos de proteínas en forma de harina y promovería el consumo

directo de las especies explotadas.

Los peces se caracterizan por requerir altos niveles de proteínas en la dieta, y los

requerimientos energéticos de los peces, debido a su poiquilotermia, son más bajos en

comparación a los animales homeotermos, ya que estos últimos gastan mucha energía

en mantener su temperatura corporal, una vez cubierta sus necesidades estructurales, la

proteína restante es dirigida al catabolismo (Walton y Cowey, 1982). Estudios previos,

sobre el reemplazo parcial o total de la harina de pescado en la dieta de la trucha arco

iris, proponen la posibilidad de sustituir hasta un 66% de contenido de proteína animal

por proteínas de origen vegetal, sin causar efectos negativos en el crecimiento de los

animales (Gomes et al., 1995; Kaushik et al., 1995). Sin embargo, los niveles de

sustitución pueden variar mucho en función de la especie y la composición de la dieta.

Las fuentes vegetales de nutrientes incluidas en las dietas de peces cultivados, contienen

una gran variedad de sustancias “antinutricionales” que interfieren en el

aprovechamiento del alimento. Además, los ingredientes vegetales suelen ser

deficientes en algunos aminoácidos (Clarke y Wiseman, 2000), por lo que la

formulación de las dietas debe compensar posibles desequilibrios en la proporción de

aminoácidos. Muchos de estos compuestos como el gossypol, ácido fítico, inhibidores

Introducción Rojas, P. C.

4

de proteasas y saponinas pueden ser degradados o inhibidos con tratamientos previos a

su utilización. Algunos tratamientos que se aplican son la defitinización (Vielma et al.,

2002), procesos de calor, así también por la interacción entre ellas mismas (Francis et

al., 2001).

El aumento de la incorporación de proteína vegetal en la dieta de la trucha arco

iris, podría estar también favorecido por la suplementación de la dieta con algunos

amino ácidos esenciales, como la lisina que aumenta la digestibilidad de los

componentes de las dietas (Cheng et al., 2003a; Cheng et al., 2003b). Según Kim

(1997), las dietas con proporciones de proteínas menores (básicamente caseína y

gelatina) y suplementadas con algunos aminoácidos (arginina y metionina), cubren los

requerimientos de aminoácidos en trucha arco iris. Estudios en Ictalurus puntactus de

dietas con insuficiencia de arginina indican que la suplementación con ácido glutámico

favorece la síntesis de arginina endógena, cubriendo los requisitos nutricionales de los

animales. Aunque en algunos casos, el aumento del ácido glutámico en la dieta también

podría ser un factor del incremento de la excreción de amonio de los animales. Debido a

que por una serie de transformaciones, el ácido glutámico puede ser utilizado como

sustrato para la formación endógena de arginina a través del ciclo de la urea, que

incrementaría la formación de amonio (Buentello y Gatlin, 2001).

A pesar de estos estudios, la información es limitada por ejemplo para la dorada,

por lo que es de gran interés estudiar, el efecto de la composición de la dieta sobre el

crecimiento y parámetros fisiológicos de los animales, que permita obtener el

conocimiento necesario para obtener o mejorar el rendimiento actual en el cultivo de

estas especies.

1.1.1.- Generalidades sobre la trucha arco iris.

La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792), es un pez

perteneciente a la familia Salmonidae, orden Salmoniformes y clase Actinopterígio. La

trucha arco iris es nativa de la parte occidental de Norteamérica, desde Alaska hasta

México. Desde 1874, la trucha arco iris fue introducida para el cultivo y uso

recreacional en las aguas de todos los continentes excepto en la Antártida. Según la


5

FAO en 2002, la producción de trucha arco iris fue proveída por 64 países, de los cuales

destacan los países Europeos, Norteamericanos, Chile, Japón y Australia (Figura 1.1).

Figura 1.1.- Principales países productores de trucha arco iris (FAO, 2002)

La naturaleza anádroma de la trucha arco iris le permite ocupar diferentes

habitats, vive en mar abierto y para el desove se traslada a zonas de flujo rápido del

agua y muy oxígenadas de los ríos, aunque también puede habitar permanentemente en

lagos. La trucha arco iris tiene un crecimiento rápido, en 3 años consigue entre 7 y 10

kg en el mar, y los 4,5 kg en agua dulce, puede vivir en un amplio rango de temperatura

(0-27 ºC), pero el desove y desarrollo de los huevos se da entre los 9-14 ºC. La

temperatura óptima para el crecimiento de la trucha arco iris está por debajo de los 21

ºC. La temperatura y disponibilidad del alimento influencian sobre el crecimiento y la

maduración sexual de los individuos, siendo usualmente entre el tercer y cuarto año

(Cowx, 2005).

La formulación y procedimiento de elaboración de las dietas para la

alimentación de la trucha arco iris han evolucionado a lo largo del tiempo, los procesos

de compactación del alimento (pellet) permiten la alimentación en los diferentes

estadíos de vida de los animales. En cultivo, la dieta posee una energía alta por el

contenido de lípidos elevado (16-22%), el contenido de proteína de la dieta oscila entre

los 35 y 45%. En la elaboración de la dieta se utiliza harina de pescado, aceite de


6

pescado, granos vegetales y otros componentes. La trucha arco iris posee una tasa de

conversión alimenticia cercana a la proporción 1:1 (Cowx, 2005).

1.1.1.- Generalidades sobre la dorada.

La dorada (Sparus aurata Linnaeus, 1758), es una especie que pertenece a la

familia de los Espáridos, orden Perciformes y clase Actinopterígios. La dorada es

común del mar mediterráneo, aunque también se encuentra distribuida a lo largo de la

costa oriental del Atlántico desde Senegal hasta Gran Bretaña, y raramente en el Mar

Negro. Hasta el desarrollo de los sistemas de cultivos intensivos en los años 80 en los

diferentes países del mediterráneo (Figura 1.2), tradicionalmente, el cultivo de dorada se

realizó en lagunas costeras y estanques de agua de mar. La producción a gran escala de

dorada fue conseguida por España, Italia y Grecia entre 1988 y 1989. Está especie

presentó una alta adaptabilidad a las condiciones de cultivo del sistema intensivo, tanto

en estanques como en jaulas flotantes, así pues, la producción anual de la dorada se

incrementó regularmente hasta el 2000, cuando el pico de producción alcanzó las 87

000 toneladas (Colloca y Cerasi, 2005).

Figura 1.2.- Principales países productores de dorada (FAO, 2002)


7

La dorada es una especie de naturaleza euritermia y eurisalina, habita zonas

litorales en ambiente marinos, lagunas costeras y zonas de estuarios en particular

durante las primeras fases del ciclo de vida. En la vida silvestre, la dorada nace en mar

abierto entre Octubre y Diciembre, los juveniles típicamente migran hacia las zonas

costeras a principios de la primavera, porque la dorada es muy sensible a las bajas

temperaturas (letal a 4º C), y a finales de otoño vuelve a mar abierto. En el mar abierto,

la dorada es encontrada usualmente sobre rocas o campos de Posidonea oceanica, pero

es capturada generalmente en fondos arenosos. La dorada es una especie hermafrodita

proterándrica, la madurez sexual se alcanza en machos a los 2 años (20-30 cm) y las

hembras maduran entre el 2-3 año (33-40 cm). La dorada es un pez carnívoro que

presenta una diversidad alimenticia que está relacionada con la talla de los individuos;

los juveniles se alimentan de poliquetos y pequeños crustáceos, y los animales más

grandes de moluscos, lamelibranquios, gasterópodos y crustáceos (Arias, 1980; Colloca

y Cerasi, 2005). En el cultivo de dorada, las dietas comerciales están basadas en harina

de pescado, y el contenido de proteína oscila entre el 40 y el 48,5%, y las dietas poseen

un alto nivel de lípidos (15-24%) (Capilla et al., 2002; Company et al., 1999; Marcouli

et al., 2004; MartiPalanca et al., 1996).


8

1.2.- Sistema de insulina, factores de crecimiento tipo insulina (IGF-I)

y glucagón. El control endocrino desempeña un papel importante en la regulación del

crecimiento y la utilización de los nutrientes en peces (Duncan et al., 1998; Mommsen,

2001; Pérez-Sánchez y Le Bail, 1999; Peter y Marchant, 1995). En mamíferos, la

insulina actúa principalmente como hormona anabólica y estimula el acúmulo de

reservas energéticas en diferentes tejidos. Incrementa la captación postprandial de

glucosa en el hígado y el músculo esquelético así como la captación de glucosa y ácidos

grasos en el tejido adiposo. Además, la insulina acelera la incorporación de los

aminoácidos en proteínas en diversos tejidos, mientras que inhibe la gluconeogénesis y

activa la síntesis de glucógeno. A nivel del metabolismo lipídico, la insulina es un

activador de la lipogénesis y un importante inhibidor de la movilización lipídica

(Hazelwood, 1993). En mamíferos se comprueba que muchos de los efectos de la

insulina se dan a través de las cascadas de señalización intracelulares, que activan

determinadas proteínas, muchas de ellas enzimas implicados en la regulación del

metabolismo, y que estimulan las tasas de transcripción de diversos genes (Lloyd et al.,

1987; Miller, 1989; Standaert y Pollet, 1988).

En mamíferos, la insulina y glucagón son hormonas secretadas en respuesta a la

ingesta de nutrientes y la acción de hormonas gastrointestinales. Ambas hormonas

pancreáticas coordinan la disposición de los nutrientes procedentes del alimento, así

como el flujo de sustratos endógenos mediante acciones sobre el hígado, tejido adiposo

y masa muscular. En teleósteos existen evidencias de que los niveles plasmáticos de

insulina y glucagón incrementan tras la ingestión del alimento (Navarro et al., 1993;

Navarro y Gutiérrez, 1995). Sin embargo, la respuesta de estas dos hormonas

pancreáticas a diferentes dietas está muy poco estudiada en peces.

1.2.1.- Insulina.

La insulina es una hormona pancreática que está muy conservada a lo largo de la

evolución. En peces, se han descrito dos isoformas aisladas en diferentes especies, pero

aún se desconoce las posibles diferencias funcionales entre estas 2 isoformas (Conlon,

2001; Mommsen et al., 2001b). La insulina es sintetizada como un precursor de cadena


9

única denominado prepoinsulina en el las células β del páncreas. El fragmento N-

terminal de 24 aminoácidos es eliminado enzimáticamente durante su paso por el

retículo endoplasmático dando lugar a la proinsulina. La proinsulina es una molécula

formada por las cadenas A y B de la insulina madura unidas por un péptido C. Este

péptido C enlaza el extremo carboxi-terminal de la cadena B con el extremo N-terminal

de la cadena A, y facilita la formación de los puentes disulfuro. Por eliminación

proteolítica del péptido C, se genera la insulina madura, que tiene un peso molecular de

5600 Da aproximadamente (Hazelwood, 1993; Mommsen y Plisetskaya, 1991). En

algunos peces, el péptido C se continúa procesando y es secretada finalmente aunque se

desconoce su función (Conlon y Thim, 1986).

Las insulinas de peces presentan características comunes a la del resto de

vertebrados, tienen de 51 a 58 aminoácidos, formados por una cadena A de 21

aminoácidos aproximadamente y una cadena B de 29 aminoácidos (Figura 1.3), las

cuales están unidas mediante dos puentes disulfuro intercatenarios y un tercer puente

disulfuro intracatenario que determina la estructura terciara de está proteína (Plisetskaya

et al., 1994). La actividad biológica de la insulina se encuentra en la posición 22-26 de

la cadena B (Bornfeldt et al., 1991; Simon, 1989).

Figura 1.3.- Estructura de la insulina de salmón. Las líneas punteadas indican la posición de los puentes disulfuro (Modificado de Plisetskaya et al., 1994).

La familia de genes a la que pertenece la insulina es un grupo antiguo y muy

diverso que incluye a los factores de crecimiento tipo insulina IGFs (IGF-I y IGF-II), el

factor de crecimiento nervioso NGF y otras moléculas afines a la insulina de moluscos

(Blundell y Humbel, 1980; Smit et al., 1988).

GIV

EQ

CC

F

HK

PC

N I

D

L Q N YC N

KP

NY

FF

G

GK

EA

AQ H L C G S H L V A

D

L Y L V C

Dominio B

Dominio AA

GIV

EQ

CC

F

HK

PC

N I

D

L Q N YC N

KP

NY

FF

G

GK

EA

AQ H L C G S H L V A

D

L Y L V C

Dominio B

Dominio AA


10

1.2.2.- Factores de crecimiento tipo insulina (IGF-I).

El IGF-I es una proteína monocatenaria de peso molecular de 7500 Da

aproximadamente. El IGF-I al igual que el IGF-II, está constituido por cuatro dominios

(B,A,C y D), que están relacionados estructuralmente con la proinsulina. El extremo

amino-terminal de la cadena B está separado de la cadena por un dominio de conexión

corto (dominio C). Los IGFs también contienen un dominio D en el extremo carboxi-

terminal. La estructura terciaria del IGFs se mantiene por 3 puentes disulfuros en las

mismas posiciones de la insulina (Figura 1.4).

Figura 1.4.- Estructura del factor de crecimiento tipo insulina de salmón. Las líneas punteadas indican la posición de los puentes disulfuro (Modificado de Plisetskaya et al., 1994).

A diferencia de la insulina, que es sintetizada únicamente en el páncreas, el

hígado es el principal órgano productor de IGF-I en todos los vertebrados estudiados

hasta ahora, pero también el IGF-I es sintetizado localmente en gran cantidad de tejidos,

de manera que el IGF-I presenta importante funciones no solo a nivel endocrino sino

también autocrino y paracrino (Daughaday et al., 1985; Humbel, 1990; Stewart y

Rotwein, 1996).

1.2.3.- Receptores de insulina e IGF-I.

Los receptores de insulina (IR) e IGF-I (IGF-IR) son glucoproteínas de peso

molecular aparente de 350 kDa, que forman parte de la superfamilia de receptores

Q

F

D

PE

TL

C G A E L V T L F V CG

G

G

ER

YF

SK

PT

YS PHNR

GI

VDE

CC

F Q

G

SGC

C

E L

L

RR

EM

Y APVK

SK

Dominio B

Dominio A

Dominio C

Dominio DG

SRRS

AA

Q

FF

D

PPE

TL

C G A E L V T L F V CG

GG

GG

EERR

YYFF

SSKK

PPTT

YYSS PPHHNNRR

GGII

VVDDEE

CCCC

FF QQ

GG

SSGC

C

E L

L

RR

EM

Y APVK

SK

Dominio B

Dominio A

Dominio C

Dominio DGG

SSRRRRSS

AAAA


11

tirosina quinasa. Cada receptor consiste de dos subunidades α y dos β que están unidos

por puentes disulfuros que forman el heterotetrámero αβ−αβ (Figura 1.5). Las

subunidades α son las que contienen los sitios de unión (binding sites), y las

subunidades β el dominio tirosina quinasa (Stewart y Rotwein, 1996). El ligando

(insulina o IGF-I) causa la estimulación de la tirosina quinasa que es iniciada por la

autofosforilación del receptor. Las subunidades α de los receptores de insulina tienen un

peso molecular de 130 a 150 kDa en aves y mamíferos, además de estar localizadas

totalmente en el dominio extracelular. En el ovario de carpa, las subunidades α de los

IR e IGF-IR poseen un peso molecular de 125 y 120 kDa respectivamente (Maestro et

al., 1997). Mientras que en el hígado de lampreas las subunidades α tienen un peso de

130 kDa (Lappova y Leibush, 1995). En mamíferos, las subunidades β del IR poseen un

peso molecular que va desde los 90 a 95 kDa. La subunidad β está localizada en la

región transmembrana y en el dominio intracelular y es responsable de la actividad

tirosina quinasa (Ullrich et al., 1986).

Figura 1.5.- Representación esquemática de la estructura de los receptores de insulina e IGF-I (Modificado de Steward y Rotwein, 1996).

Los receptores de insulina e IGF-I son similares estructuralmente y poseen más

de un 50 % de homología en la secuencia de aminoácidos. El dominio tirosina-quinasa

es el que presenta mayor semejanza entre ambos receptores con un 84 % (Czech, 1989;

Ullrich et al., 1986). Debido a las similitudes de las secuencias existentes entre la

insulina y el IGF-I, se ha observado que existen uniones cruzadas entre ellos y sus

receptores, pero siempre la afinidad del péptido a su propio receptor es superior a la

β β

-S-S--S-S-

-S-S-

α α

Dominio de unióna la hormona

Dominiotirosina-cinasa CITOPLASMA

BICAPA LÍPIDICA

ESPACIO EXTRACELULAR

β β

-S-S--S-S-

-S-S-

α α

Dominio de unióna la hormona

Dominiotirosina-cinasa CITOPLASMA

BICAPA LÍPIDICA



12

afinidad por el otro receptor. Así, la insulina se une con mayor afinidad a su receptor

que el IGF-I, y la insulina se une con menor afinidad al receptor del IGF-I que el IGF-I

(Cohick y Clemmons, 1993; Jones y Clemmons, 1995).

La especificidad y la afinidad de la unión de la insulina ó el IGF-I a sus

receptores determinan el proceso de activación y la respuesta celular. Estos dos

parámetros vienen definidos por las propiedades estructurales del dominio de unión

cuando el ligando es presentado al receptor. Estudios de unión (binding) fueron los que

demostraron la existencia de receptores de IGF-I diferentes al de insulina (Rechler et al.,

1980). Estudios de binding normalmente dan como resultado curvas Scatchard, que ha

sido el análisis más utilizado para el estudio de las propiedades del binding de los

receptores de insulina e IGF-I (Gutiérrez et al., 1989; Gutiérrez et al., 1991). Las curvas

Scatchard permiten calcular el binding específico (Bsp), el número de receptores (Ro) y

la constante de disociación (Kd, inversamente proporcional a la afinidad). Altos valores

de binding se obtienen cuando el número de receptores y la afinidad son altos. Estudios

del binding del receptor de insulina en el músculo blanco de peces muestran que el

binding es muy inferior al encontrado en los músculos de mamíferos y aves. El músculo

de peces contiene entre 40 y 300 f mol/mg de receptores de insulina (Navarro et al.,

1999; Párrizas et al., 1994c; Párrizas et al., 1995b), mientras en mamíferos el valor Ro

está alrededor de los 1000 fmol/mg. Estructuralmente, los receptores de insulina están

muy conservados a lo largo de la evolución (Muggeo et al., 1979a; Muggeo et al.,

1979b). Receptores funcionales de insulina e IGF-I se han identificado en gran cantidad

de tejidos de diversas especies (Drakenberg et al., 1993; Gutiérrez y Plisetskaya, 1991;

Navarro et al., 1999; Planas et al., 2000c). En peces, al contrario de lo que se ha descrito

en mamíferos (Zorzano et al., 1988), el número de receptores de IGF-I es superior al

número de receptores de insulina (Castillo et al., 2002; Párrizas et al., 1995b; Párrizas et

al., 1995c; Planas et al., 2000b).

En relación a la regulación de los receptores de insulina e IGF-I, los primeros

estudios de Ablett y col., (1983) y Gutiérrez y col., (1991) describen que tratamientos

alimentarios modifican las respuestas de los receptores de insulina en el hígado y en el

tejido muscular de peces de forma paralela a los cambios de la insulina plasmática.

Estudios de Baños y col., (1998) en trucha arco iris alimentadas con dietas enriquecidas

con carbohidratos también describen incrementos en los niveles plasmáticos de glucosa,


13

insulina y los receptores de insulina en el músculo. Sin embargo, Capilla y

colaboradores (2003) utilizando dietas, también con diferentes contenidos de

carbohidratos, no observan cambios en la glucosa e insulina circulante, así como a nivel

de receptores en el músculo. Por lo que, el efecto sobre los receptores de insulina estaría

en función al grado de cambio de la composición de la dieta. Estudios llevados a cabo

en carpa y trucha indican que el ayuno causa una disminución en los receptores de

insulina tanto en el músculo como en el tejido adiposo (Párrizas et al., 1994a; Planas et

al., 2000c).

Experimentos con inyecciones de arginina (inducción de hiperinsulinemia) o

administración de dietas que producen el aumento de la insulina plasmática provocan un

incremento (up-regulation) en el número de receptores de insulina en el músculo

esquelético y en el tejido adiposo (Gutiérrez et al., 1991; Párrizas et al., 1994b; Planas et

al., 2000c). Algunos experimentos con carpas y truchas en situaciones de

hiperinsulinemia, muestran una disminución del número de receptores de insulina del

músculo rojo (Baños et al., 1997). En experimentos “in vitro” con cardiomiocitos de

trucha también se ha observado que el binding de insulina e IGF-I disminuyen (down-

regulation), cuando las células son incubadas en altas concentraciones de insulina e

IGF-I (Moon et al., 1996). Estos resultados demuestran la existencia de mecanismos

que regulan los receptores de insulina e IGF-I por sus propios ligandos, y cuya dirección

de la regulación depende del tejido (Gutiérrez et al., 2005).

A nivel de señalización intracelular, la unión del ligando, insulina o IGF-I a su

receptor, produce la autofosforilación de la subunidad β (Pirola et al., 2004). La

autofosforilación del IR y IGF-IR provoca la fosforilación posterior de otros substratos

intracelulares y segundos mensajeros (Figura 1.6), que se han estudiado en diferentes

especies de teleósteos (Gutiérrez et al., 1993; Gutiérrez et al., 1995; Maestro et al.,

1997; Párrizas et al., 1994c), y de los cuales, el substrato del receptor de insulina (IRS)

sería el inductor de la formación de complejos intracitoplasmáticos diversos

responsables de la estimulación de las diferentes vías de señalización (Baumann y

Saltiel, 2001; Butler et al., 1998; Gutiérrez et al., 2005)


14

Figura 1.6.- Cascada de la transmisión de la señal a partir de los receptores de insulina e IGF-I (Modificado de Gutiérrez et al., 2005).

1.2.5.- Efectos biológicos de la insulina y el IGF-I.

En mamíferos, la insulina es la principal hormona anabólica y anticatabólica que

estimula la captación de glucosa postprandial en el hígado y en el músculo esquelético,

así como también la captación de glucosa y ácidos grasos libres en el tejido adiposo. La

insulina acelera la incorporación de aminoácidos en varios órganos, en especial en el

hígado y el tejido muscular, donde también activa la síntesis de glucógeno y la

lipogénesis. Esta hormona juega un papel importante en el control de los niveles de

glucosa, lo cual es necesario para el funcionamiento normal del sistema nervioso

(Mommsen y Plisetskaya, 1991).

En muchos aspectos, la insulina de peces tiene un papel similar a la de la

insulina de mamíferos. Los principales secretagogos de la insulina en peces son los

mismos que en los mamíferos, pero en peces algunos aminoácidos poseen un efecto

estimulador sobre la secreción de la insulina mayor que la glucosa (Ince, 1979; Matty y

Lone, 1985; Navarro et al., 2002; Plisetskaya et al., 1991). También está descrito que la

insulina en plasma varía en función del estado nutricional, de manera que incrementa

IGF-IInsulina

P -

IR IGF-IR

ATPIRS GRB2

mSOSRAS GDP

MEK

ERK

RAF

RAS GTP

p85p110PI3K

MAPKK

MAPK

Diferenciación ProliferaciónMetabolismo

PDK

AKT

IGF-IInsulina

P -

IR IGF-IR

ATPIRS GRB2

mSOSRAS GDP

MEK

ERK

RAFRAF

RAS GTP

p85p110PI3K

MAPKK

MAPK

Diferenciación ProliferaciónMetabolismo

PDK

AKT


15

tras la ingesta del alimento y disminuye en respuesta al ayuno (Navarro et al., 1993;

Navarro y Gutiérrez, 1995).

En todos los peces estudiados, los niveles de insulina se incrementan tras la

ingesta del alimento, los niveles de insulina en plasma se incrementan entre la primera y

tercera hora de la post ingesta del alimento, y disminuye progresivamente hasta los

niveles basales a las 24 horas (Navarro et al., 1993; Sundby et al., 1991). En peces, la

concentración de la insulina en el sistema circulatorio está dentro del rango de

1 a 30 ng/ml de plasma. Aunque en una misma especie, la concentración de la insulina

varía en función de las condiciones fisiológicas y ocasionalmente en función del origen

de la sangre estudiada (vena porta o venas periféricas) (Mommsen y Plisetskaya, 1991;

Navarro y Gutiérrez, 1995). En algunos peces, dietas enriquecidas con carbohidratos

también incrementan los niveles de insulina en plasma (Párrizas et al., 1994a), pero

estos efectos no siempre son observados (Capilla et al., 2003; Novoa et al., 2004).

Estudios “in vivo” con tratamientos de insulina e inyecciones de arginina (potente

estimulador de la secreción de insulina), muestran el efecto hipoglucémico de la

insulina (Navarro et al., 2002). Estudios in vitro en células musculares y adipocitos de

peces han demostrado que la insulina estimula la captación de glucosa y alanina

(Castillo et al., 2004; Capilla et al., 2004), e incrementa la deposición de glucógeno e

inhibe la glucogenolisis en hepatocitos (Foster y Moon, 1989; Foster y Moon, 1990).

En mamíferos, el IGF-I posee efectos diversos sobre el crecimiento y la

diferenciación celular (Le Roith et al., 1997), y cumple un papel metabólico importante

similar al de la insulina en tejidos periféricos, particularmente en el músculo esquelético

(Duclos et al., 1991; Jones y Clemmons, 1995). En peces, el IGF-I juega un papel

importante en la regulación del crecimiento (Pérez-Sánchez y Le Bail, 1999),

estimulando la proliferación de diversos tipos célulares (Duan y Hirano, 1992; Negatu y

Meier, 1995), como lo han comprobado Castillo y colaboradores (2004) en células

musculares en cultivo, donde han descrito que el IGF-I estimula la proliferación celular,

la captación de glucosa y la captación de alanina en mayor medida que la insulina, así

como la captación de glucosa en adipocitos (Capilla et al., 2004a).

En dorada, Mingarro y colaboradores (2002), han observado que existe una

correlación directa entre los niveles plasmáticos de IGF-I y las tasas de crecimiento, y


16

que existe una regulación estacional en los niveles de IGF-I en plasma. Los IGFs

circulan por la sangre unidos a proteínas denominas proteínas de unión a los IGFs

(IGFBPs), cuya función principal es la de modular los efectos biológicos de los IGFs a

nivel local (Bach y Rechler, 1995; Baxter, 1993; Cohick y Clemmons, 1993; Jones y

Clemmons, 1995). La unión del IGF-I a las IGFBPs tiene como resultados prolongar la

vida media del IGF-I y por otro lado limitar sus efectos biológicos reduciendo la

accesibilidad al receptor (Duan y Xu, 2005; Ferry et al., 1999; Siharath et al., 1995). En

peces, se ha demostrado la presencia de 3 formas diferentes de IGFBPs tanto en sangre

como en diferentes tejidos (Kelley et al., 1992; Niu y LeBail, 1993; Siharath et al.,

1996; Siharath et al., 1995). En peces, la forma predominante tiene entre unos 40-50

kDa y se ha visto que está regulada por la GH, por lo que se le ha correlacionado con el

IGFBP3 de mamíferos (Kelley et al., 1992; Siharath y Bern, 1994). Las otras dos

formas, de 29 y 31 kDa, se han relacionado con los IGFBP-1 y -2 respectivamente. Los

niveles de IGFBPs observados en mamíferos son más altos a los encontrados en peces,

debido quizás a que los mamíferos presentan niveles circulantes de IGFs superiores a la

de los peces (Kelley et al., 2002).

Se ha demostrado que tanto la insulina como el IGF-I, poseen efectos

importantes sobre la regulación de la osmolaridad (Epple y Brinn, 1987; Madsen y

Bern, 1993; McCormick, 1996), así como a nivel reproductivo, regulando los efectos

esteroidogénicos de la hormona lutenizante (LH) en células ováricas de carpa (Maestro

et al., 1997) o induciendo la maduración del ovocito (Kagawa et al., 1994).


17

1.2.6.- Glucagón.

El glucagón es una hormona peptídica de cadena sencilla de 29 aminoácidos que

tiene un peso molecular aproximado de 3485 Da, y cuya secuencia ha sido muy

conservada a lo largo de la evolución (Navarro et al., 1991). En peces se han

identificado la secuencia de aminoácidos del glucagón en diferentes especies

(Plisetskaya y Mommsen, 1996a). Los análisis de las secuencias de aminoácidos del

glucagón en teleósteos muestran que 12 aminoácidos son invariantes en todas las

especies y otros 14 aminoácidos están presentes en la mayoría de especies y un solo

aminoácido es alternativo en la misma posición (Tabla 1.1).

Tabla 1.1.- Estructura primaria de las secuencias de aminoácidos del glucagón en peces.

1 10 20 29 Coho salmon HSEGT FSNDY SKYQE ERMAQ DFVQW LMNS Anguila HSQGT FTNDY SKYLE TRRAQ DFVQW LMNS Atún HSEGT FSNDY SKYLE TRRAQ DFVQW LKNS Aminoácidos del glucagón en teleósteos 1 10 20 29 Más abundante SE T TS LD RR Q D QW MNT Invariantes H--G- F--DY SKY-- Ø--A- -FV-- L--- Alternancia mayor TQ M SN QE KQ K E ET KSS

Ø Aminoácido variable Tabla modificada de Plisetskaya y Mommsen (1996).

El glucagón forma parte de una familia de péptidos estructuralmente

relacionados que son producidos especialmente por el páncreas y también en el intestino

y cerebro. En mamíferos como en peces, los miembros de la familia del glucagón son

derivados del proglucagón que es expresado en varios tejidos y que por procesos

proteolíticos dan lugar a una serie de hormonas de acción específica (Figura 1.7). En

mamíferos, el gen del glucagón codifica una serie de péptidos en los que se incluye el

glucagón y dos glucagón like peptides 1 y 2 (GLPs). Estos péptidos, especialmente el

glucagón, muestran alto grado de conservación estructural durante la evolución de los

vertebrados. En peces, el gen del glucagón por la pérdida de está región específica no

codifica el GLP-2 en el páncreas endocrino de los peces (Plisetskaya, 1995). Sin

embargo, la región que codifica el GLP-2 está conservada en el intestino (Plisetskaya y

Mommsen, 1996a).


18

Figura 1.7.- Productos del gen de glucagón en mamíferos y peces en el páncreas y en el intestino (Modificado de Plisetskaya y Mommsen, 1996).

1.2.6.- Efectos biológicos del glucagón.

En mamíferos, el efecto del glucagón se ha estudiado en gran detalle en diversos

estudios (Plisetskaya y Mommsen, 1996a), y se conoce que interviene en los procesos

glucogenolítico y gluconeogénicos, participa en el control de los lípidos, urea y en el

metabolismo de los aminoácidos. El glucagón también suprime la ingesta del alimento

(Morley, 2001) y acelera la saciedad postprandial (Geary et al., 1993).

En peces, el glucagón también está involucrado en múltiples procesos. En

diferentes especies, los estudios sobre la función del glucagón señalan que está hormona

está implicada en la regulación de la glucosa, el glucógeno hepático y de algunos

enzimas hepáticos; así como en las vías glucogenolíticas, gluconeogénicas y la

glucólisis (Plisetskaya y Mommsen, 1996b). Experimentos “in vivo” muestran que el

glucagón es hiperglucémico en las mayoría de estudios, y estimula el transporte de

aminoácidos hacia el hígado y otros tejidos de anguila (Inui y Ishioka, 1983; Inui y

MAMÍFEROS

GlucagónGRPPGlicetinaGLP-1-P2 GLP-2(GLP-1)

OxitomodulinaGLP-1 N-extendidoGLP-1GLP-1-IP2 GLP-2

Páncreas Intestino

PECES

GlucagónGLP-1Oxitomodulina

GlucagónGLP-1OxitomodulinaGLP-2

MAMÍFEROS

GlucagónGRPPGlicetinaGLP-1-P2 GLP-2(GLP-1)

OxitomodulinaGLP-1 N-extendidoGLP-1GLP-1-IP2 GLP-2

Páncreas Intestino

PECES






19

Yokote, 1977), incrementa la excreción de amonio (Mommsen et al., 1992), está

involucrado en la regulación del metabolismo lipídico estimulando a la triacilglicerol

lipasa en salmónidos (Sheridan, 1994) e incrementa la actividad lipolítica en adipocitos

de dorada (Albalat et al., 2005). Además, dependiendo de la concentración de glucosa,

el glucagón estimula la expresión del ARNm de las preprosomatostatinas (Ehrman et

al., 2005). La unión de glucagón marcado I125 a los hepatocitos de anguila y pez gato

sugieren la presencia de un receptor hepático específico del glucagón en ambas especies

(Navarro y Moon, 1994; Moon, 2004); mientras que en trucha arco iris donde no se ha

podido observar la presencia de este receptor, el efecto hiperglucémico del glucagón es

inferior (Mommsen y Moon, 1989; Navarro y Moon, 1994).

En los peces estudiados hasta el momento, los niveles de glucagón oscilan entre

los 0,01 y 4 ng/ml en plasma ( Gutiérrez et al., 1986; Carneiro et al., 1993; Plisetskaya y

Mommsen, 1996b). La respuesta postprandial del glucagón presenta un patrón de

incremento bifásico. En lubina, los dos picos de glucagón fueron observados a las 3 y 9

horas de la post ingesta (Pérez et al., 1988), y en trucha entre las 1-2 y 9-11 horas

(Navarro et al., 1993; Novoa et al., 2004). La disminución del glucagón entre los 2

picos puede ser que este asociada con el efecto inhibitorio de la insulina sobre la

secreción del glucagón (Navarro et al., 1993; Pérez et al., 1988). Los estudios sobre la

regulación de la secreción postprandial del glucagón en peces son escasos y

contradictorios. En bacalao y lubina, la alimentación con dietas con contenidos

diferentes de carbohidratos y fuentes de proteínas no parecen afectar la respuesta del

glucagón plasmático tras la ingesta de la alimentos (Hemre et al., 1990; Pérez et al.,

1988). Mientras que Harmon y colaboradores (1991), señalan a diferencia de

mamíferos, un incremento en el glucagón en plasma después de una inyección de

glucosa. En trucha arco iris, el incremento postprandial de glucosa por dietas

enriquecidas con carbohidratos provoca la disminución de la secreción de glucagón

(Novoa et al., 2004).

El estado nutricional es otro factor importante que regula la respuesta del

glucagón. En algunas especies, el ayuno de un corto período de tiempo, provoca el

incremento de los niveles de glucagón del plasma (Navarro y Gutiérrez, 1995). En

Dicentrarchus labrax y Salmo trutta, el aumento del glucagón plasmático ha sido

observado después de un ayuno de 4 a 5 días (Navarro et al., 1992), y de 2 días en


20

Brycon cephalus (Figueiredo-Garutti et al., 2002). Estos incrementos transitorios del

glucagón se han interpretado como señales para activar la degradación de las reservas

durante los períodos de ayuno corto (Navarro et al., 1992). Sin embargo, al contrario

que en mamíferos, el ayuno prolongado produce una disminución de los niveles de

glucagón, que a pesar de todo, permite la movilización de las reservas energéticas,

debido a que el ayuno produce una disminución más acusada en los niveles de insulina

que en los de glucagón (Navarro y Gutiérrez, 1995). No obstante, se conoce muy poco

de la respuesta del glucagón en dorada.

1.3.- Transporte de glucosa.

1.3.1.- La glucosa en peces. En muchos vertebrados, especialmente en mamíferos, la glucosa es la fuente

principal de energía para las células (Stephens y Pilch, 1995) y constituye la molécula

central en el metabolismo (Hemre et al., 2002). Sin embargo en peces, se ha hablado de

la poca “tolerancia” a la glucosa en estos animales, debido a la escasa utilización y

capacidad de almacenamiento de la glucosa encontrados en estudios con dietas de alto

contenido de carbohidratos o tratamientos con glucosa. En dichos estudios se observa

una reducción del crecimiento, hiperglucemia prolongada de los animales e incrementos

elevados del glucógeno hepático (Hemre et al., 2002; Krogdahl et al., 2005; Legate et

al., 2001; Moon, 2001; Peres et al., 1999). Aunque, la eficiencia en la utilización de los

carbohidratos de la dieta de los peces está en función de la especie, como lo describen

Panserat y colaboradores (2000a) sobre la capacidad del uso de carbohidratos donde

ordenan las especies del modo siguiente: carpa>dorada>trucha. En peces se han

determinado diversos factores que podrían estar afectando la utilización de los

carbohidratos de la dieta en comparación con los resultados encontrados en mamíferos,

como la actividad menor de algunos enzimas implicados en la asimilación de la glucosa,

los niveles plasmáticos de insulina, el escaso número de receptores de insulina y las

diferencias en los mecanismos de regulación de los transportadores de glucosa (Moon,

2001). En todas las especies de peces estudiadas se ha encontrado el mismo mecanismo

enzimático para la hidrólisis, así como de las rutas de digestión y absorción de los

carbohidratos que en general son las mismas para las especies herbívoras, omnívoras y

carnívoras; sin embargo, los resultados de las actividades de algunos enzimas como la


21

amilasa y glucoquinasas indican la existencia de diferencias en las actividades

enzimáticas entre especies (Krogdahl et al., 2005; Panserat et al., 2002).

En trucha común, Navarro y colaboradores (1993), observaron aumentos

significativos de los niveles de glucosa plasmática durante las primeras horas del

postprandial y estudios “in vivo” han demostrado que el incremento de la glucosa

postprandial es proporcional al contenido de carbohidratos de la dieta (Capilla et al.,

2003; Novoa et al., 2004; Panserat et al., 2002; Papatryphon et al., 2001). La glucosa

plasmática aumentada durante la ingesta del alimento tiene como destino principal

tejidos como el músculo blanco, músculo rojo e hígado (Blasco et al., 1996; Blasco et

al., 2001).

1.3.1.- Transportadores de glucosa.

En mamíferos, la glucosa necesita de la presencia de proteínas transportadoras

en la membrana para ser asimilada por las células. En las células de mamíferos se han

descrito dos familias de proteínas de transportadores: 1) los transportadores

dependientes de energía sodio/glucosa (SGLTs), que transportan la glucosa en contra su

gradiente de concentración, y 2) los transportadores de glucosa de difusión facilitada

(GLUTs), que trabajan en la dirección del gradiente de concentración de glucosa. Los

SGLTs median la captación de la glucosa procedente de la dieta en el lumen intestinal y

reabsorción renal de la glucosa (Hediger y Rhoads, 1994; Stephens y Pilch, 1995). En

mamíferos, la familia de los GLUTs está formada 13 miembros y son proteínas que

están altamente relacionadas entre sí (Watson et al., 2004). Todos los miembros de la

familia de los GLUTs poseen 12 dominios transmembrana (Figura 1.8).

Figura 1.8.- Diagrama esquemático de la estructura de los transportadores de glucosa de difusión facilitada (Modificado de Watson et al., 2004).

CITOPLASMA

BICAPA LÍPIDICA


CITOPLASMA

BICAPA LÍPIDICA



22

Los GLUTs se han clasificado en 3 clases según sus características estructurales

(Joost et al., 2002), la clase I (GLUTs 1-4), la clase II (GLUTs 5, 7, 9 y 11) y la clase III

(GLUTs 6, 8, 10, 12 y el HMIT1). En mamíferos superiores, la clase I es la que ha sido

más estudiada.

El GLUT1 está considerado como un transportador constitutivo de glucosa,

porque se expresa prácticamente en todos los tejidos (James, 1995; Pessin y Bell, 1992),

y con alta expresión en vasos sanguíneos del cerebro y en eritrocitos de humanos donde

representa el 5% del contenido de proteína total de la membrana (Watson et al., 2004).

El GLUT2 posee una distribución restringida al hígado, el intestino delgado, el riñón y

las células β del páncreas. El GLUT2 forma parte del sistema sensorial de glucosa de las

células β del páncreas e interviene en la absorción intestinal de la glucosa (Olson et al.,

1997). El GLUT3 se expresa principalmente en neuronas y conjuntamente con el

GLUT1 son los que permiten la llegada de la glucosa a las células nerviosas (Vannucci

y Simpson, 2003). El GLUT4 es expresado especialmente en el tejido muscular y tejido

adiposo, y es el responsable de la captación de glucosa en respuesta a la insulina,

producto de la traslocación del GLUT4 desde las vesículas intracelulares hacía la

membrana celular (Khan y Pessin, 2002; Stephens y Pilch, 1995; Watson et al., 2004;

Zorzano et al., 2005).

En mamíferos superiores, existen numerosos estudios sobre la regulación de los

GLUTs, debido principalmente al papel que podrían cumplir en el desarrollo de

tratamientos para contrarrestar la diabetes tipo 2 (no dependiente de insulina). En el

músculo esquelético de mamíferos, la expresión del GLUT4 es regulada por el

metabolismo y la insulina (Zorzano et al., 2005). Existen diferentes estudios que señalan

que la regulación del GLUT4 está en función de la fibra muscular, y las fibras del

músculo rojo expresan el transportador en mayor medida que el músculo blanco (Camps

et al., 1992; Stephens y Pilch, 1995). Estudios en ratas diabéticas evidencian que la

regulación hormonal y metabólica a nivel de expresión y proteína del GLUT4 en

músculo rojo es más rápida que en el blanco (Neufer et al., 1993)). Estados de

insuficiencia de insulina como el ayuno, provocan la disminución de los niveles de

proteína del GLUT4 en el músculo rojo, y que no es causada por cambios en la

expresión del ARNm del GLUT4. En músculo blanco, el ayuno no provoca cambios en


23

el nivel de proteínas del GLUT4, a pesar de observarse un incremento la expresión

ARNm de GLUT4 (Camps et al., 1992).

En peces, existe escasa información sobre los transportadores de glucosa de

difusión facilitada, se han identificado y caracterizado algunas isoformas de GLUTs y la

mayoría en salmónidos. Planas y colaboradores (2000a) clonaron un transportador de

glucosa del músculo esquelético de Salmo trutta que actualmente es denominado

btGLUT4 y que presentó una homología elevada a los GLUT4 de mamíferos. Según

estos autores, el patrón de expresión tisular del btGLUT4 está en función de las zonas

de captación de glucosa, así el btGLUT presenta una mayor expresión en tejidos como

el músculo esquelético y branquias. Estudios in vivo de la expresión del btGLUT4

muestran que es regulada por los niveles de insulina plasmática en el músculo rojo

(Capilla et al., 2002), sugiriendo que la similitud con el GLUT4 de mamíferos no es

solo estructural, sino también funcional. Otro dato que apoya la funcionalidad es que el

transportador de glucosa clonado en Oncorhynchus kisutch (okGLUT4), se logra

translocar en adipocitos 3T3-L1 tras la estimulación con la insulina (Capilla et al.,

2004a). En embriones de trucha arco iris, Teerijoki y colaboradores (2001a) clonaron un

transportador de glucosa (OnmyGLUT1), cuya secuencia de aminoácidos deducida

mostró una homología estructural del 77-79% al de los GLUT1s de mamíferos y aves.

A partir de una línea celular de carpa también ha sido clonado el transportador

(CyiGLUT1) que tiene una similitud estructural y funcional a la del GLUT1 de

mamíferos superiores, como lo indican los experimentos de selección de sustrato e

inhibidores de captación de carbohidratos (Teerijoki et al., 2001b). En el hígado de

trucha arco iris, se ha clonado un transportador (OnmyGLUT2) homólogo al GLUT2,

cuya secuencia de aminoácidos deducida presentó una homología del 58% y 52% con el

GLUT2 de aves y mamíferos respectivamente (Krasnov et al., 2001).

2.- OBJETIVOS

Rojas, P. C. Objetivos

27

La presente tesis ha sido desarrollada dentro de un proyecto europeo, cuyo objetivo

general fue el de evaluar las perspectivas del uso de proteínas de origen vegetal en la

acuicultura. Para ello se ha estudiado el crecimiento y control endocrino de dos especies

carnívoras de gran interés comercial en la comunidad europea, la trucha arco iris

(Oncorhynchus mykiss) y la dorada (Sparus aurata), alimentadas con diferentes dietas

en comparación con los parámetros obtenidos en animales alimentados con dietas

basadas en harina de pescado.

A partir de este objetivo general se definieron los siguientes objetivos

específicos:

1) Establecer en trucha arco iris y dorada, si la alimentación con dietas basadas

en los pérfiles de aminoácidos esenciales del músculo (M) pueden mejorar el

crecimiento con respecto a animales alimentados con dietas basadas en la

composición de aminoácidos esenciales corporales (C).

2) Determinar el efecto sobre el crecimiento de dietas que contienen diferente

relación de aminoácidos esenciales (IAA) y aminoácidos no esenciales

(DAA) en trucha arco iris y dorada.

3) Establecer el efecto sobre el crecimiento de dietas con distintos grados de

sustitución de proteína animal por proteína vegetal en la dieta de trucha arco

iris y dorada.

4) Determinar los efectos de las diferentes dietas sobre los niveles de glucosa y

los perfiles hormonales de insulina y glucagón del plasma sanguíneo en

trucha arco iris y dorada.

Objetivos Rojas, P. C.

28

5) Establecer las adaptaciones a las dietas del sistema hormona/receptor de

insulina en el músculo esquelético blanco de trucha arco iris y dorada.

6) Determinar los efectos de la administración de glucosa y arginina sobre los

niveles plasmáticos de glucosa, insulina y glucagón en dorada.

7) Caracterizar en la dorada el transportador de glucosa de difusión facilitada

tipo GLUT4, similar al descrito en otras especies, clonando dicho

transportador de glucosa y estudiando su posible regulación a nivel de

ARNm y proteína en diferentes condiciones experimentales in vivo.

3.- MATERIAL Y MÉTODOS

Rojas P.C. Materiales y métodos

31

3.1.- ANIMALES Y CONDICIONES EXPERIMENTALES.

3.1.1.- BLOQUE EXPERIMENTAL I: Efectos de dietas con diferentes perfiles de aminoácidos en trucha arco iris y dorada.

Dietas experimentales.

Se elaboraron cuatro dietas experimentales para cada especie, trucha arco iris (T)

y dorada (D). Las dietas fueron diseñadas considerando los diferentes perfiles de

aminoácidos esenciales que reflejan el contenido de aminoácidos esenciales de la

composición corporal (C) y músculo (M). Las dietas estaban compuestas por harina de

pescado, ingredientes de origen vegetal y suplementados con aminoácidos libres (Tablas

3.1.1 y 3.1.2). En las dietas TM, TC, DM y DC, el balance de aminoácidos esenciales

(IAA) y aminoácidos no esenciales (DAA), fue similar para las dietas basadas en los

perfiles de aminoácidos esenciales corporales y del músculo en cada especie

(Tabla 3.1.3 y 3.1.4). En las dietas TMGlu, TCGlu, DMGlu y DCGlu, la proporción

DAA fue incrementado con la adición de ácido glutámico (Tabla 3.1.3 y 3.1.4). La

relación IAA/DAA tuvo una variación entre 0,7 y 1,03 en dietas de trucha y de 0,8 a

1,13 en las dietas de dorada. Las dietas de ambas especies tuvieron la misma proporción

de proteínas (42 a 44 % DM en trucha y alrededor de 52 % en dorada), fueron

isoenergéticas (22,1 a 22,5 kj energía/g DM), y estuvieron establecidas de acuerdo al

National Research Council (NRC, 1993).

Animales y tratamiento. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)

Los animales fueron mantenidos en la instalación del INRA (Donzacq, Landes,

Francia). Cada dieta experimental fue administrada por triplicado en tres tanques a

grupos de 75 peces (peso medio inicial = 14,1 ± 0,04 g). Los peces fueron mantenidos

en tanques circulares de fibra de vidrio de 1 m3, alimentados ad libitum dos veces al día.

Cada tres semanas, los peces fueron contados y pesados por grupos. El experimento se

realizó durante 12 semanas (de marzo a junio de 2001) a temperatura constante de

17 ± 1 °C.

Materiales y métodos Rojas P.C.

32

Dorada (Sparus auratus)

Los animales fueron mantenidos en el Instituto de Acuicultura de Torre de la

Sal-CSIC (Torre de la sal, España). Doradas en grupos de 90 peces (peso medio inicial

= 14,7 ± 0,1 g), se distribuyeron en 3 tanques circulares de fibra de vidrio de 0,5 m3, en

sistemas con agua de mar a temperaturas entre 17 y 25 °C. Los animales fueron

alimentados dos veces al día, cada tres semanas los peces fueron contados y pesados en

grupos, hasta las 12 semanas que duró el experimento (entre abril y julio de 2001).

Alimentación forzada

Después de las 12 semanas de alimentación con las dietas TM, TMGlu y DM,

DMGlu en trucha arco iris y dorada respectivamente, 50 peces de cada especie y grupo

de dieta fueron anestesiados brevemente con MS-222 (0,1 g /l), pesados y utilizando

una jeringa alimentados con el 1% de su peso corporal de la misma dieta que consumió

durante las 12 semanas, y separados en grupos de 10 animales en tanques de 90 l. Los

peces fueron muestreados a las 1, 3, 6, 12 y 24 horas tras las alimentación forzada


33

Tabla 3.1.1.- Composición de dietas experimentales para trucha arco iris

TM TMGlu TC TCGlu

Ingredientes(g/Kg)

Harina de pescado (PC 70%) 389,93 316,39 459,96 363,27

Gluten de Trigo (Amylum) 71,39 0 50 100

Extrusionado de Trigo 135,71 71,78 200 200

Extrusionado de Guisantes 215,09 56,82 166,34 158,47

Harina de soja 25,26 331,25 0 0

Aceite de pescado 101,59 109,48 93,7 104,07

Ligante 10 10 10 10

Mezcla Mineral1 10 10 10 10

Mezcla Vitaminas1 10 10 10 10

CaHPO4.2H2O (18%) 10,89 16,06 0 0

L-His 1,77 1,75 0 0

L-Lys 6,46 5,94 0 0

DL-Met 0,91 1,99 0 0

L-Thr 1,53 1,73 0 0

L-Ile 5,92 4,1 0 0

L-Val 3,54 2,71 0 0

L-Glu 0 50 0 44,19

Composición aproximada

Materia seca (DM, %) 92,2 90,5 93,5 92,1

Proteínas (% DM) 45,1 46,3 43,7 44,1

Lípidos (% DM) 15,6 16,4 15,7 15,8

Energía total (kJ/g DM) 22,4 22,1 22,2 22,4

1 De acuerdo a NRC (1993), PC: Proteína cruda.


34

Tabla 3.1.2.- Composición de dietas experimentales para dorada

DM DMGlu DC DCGlu

Ingredientes(g/Kg)

Harina de pescado (PC 70%) 499,98 478,06 529,33 484,13

CPSP G1 50 0 0 0

Gluten de Trigo (Amylum) 0 0 100 100

Extrusionado de Trigo 0 56,08 147,98 138,50

Extrusionado de Guisantes 199,15 0 100 100

Harina de soja 121,89 300 0 0


Ligante 10 10 10 10



L-His 2,04 2,00 0 0

L-Lys 3,14 4,85 0 0

DL-Met 0,95 1,18 3,46 0

L-Thr 0,60 1,54 0 0

L-Ile 5,57 4,58 0 0

L-Val 3,07 2,61 0 0

L-Glu 0 24,58 0 53,09


Materia seca (DM, %) 92,1 93,7 89,3 92,7

Proteínas (% DM) 52,7 53 52,1 50,9

Lípidos (% DM) 15,7 16,4 15,9 15,2


1 Proteínas de pescado solubles, 2 De acuerdo a NRC (1993).


35

Tabla 3.1.3.- Composición de aminoácidos (g/100 g de materia seca) en las dietas experimentales para trucha arco iris.

Aminoácidos (% DM) TM TMGlu TC TCGlu

ARGININA 2,60 2,58 2,70 2,28

HISTIDINA 1,10 1,12 1,01 0,86

ISOLEUCINA 1,98 1,85 1,72 1,43

LEUCINA 3,05 2,96 3,33 2,92

LISINA 3,21 3,54 3,14 2,43

METIONINA 1,01 1,02 1,04 0,87

CISTEINA 0,49 0,47 0,49 0,50

FENILALANINA 1,71 1,63 1,84 1,66

TIROSINA 1,32 1,30 1,45 1,27

TREONINA 1,81 1,89 1,81 1,53

TRIPTOFANO 0,43 0,53 0,45 0,41

VALINA 2,19 1,97 2,14 1,78

Alanina 2,21 2,18 2,48 2,05

Ácido aspártico 3,40 3,97 3,79 3,09

Ácido glutámico 8,09 13,27 7,64 13,95

Glicina 2,37 2,29 2,66 2,23

Prolina 2,25 1,87 2,36 2,46

Serina 1,89 1,94 1,97 1,82

IAA1 20,90 20,86 21,12 17,95

DAA2 20,21 25,52 20,90 25,60

IAA/DAA 1,03 0,82 1,01 0,70

1 Aminoácidos esenciales (en mayúscula) 2 Aminoácidos no esenciales (en minúscula)


36

Tabla 3.1.4.- Composición de aminoácidos (g/100 g de materia seca) en las dietas experimentales para dorada.

Aminoácidos (% DM) DM DMGlu DC DCGlu

ARGININA 3,26 3,25 3,14 2,76

HISTIDINA 1,41 1,33 1,23 1,09

ISOLEUCINA 2,60 2,84 2,32 2,03

LEUCINA 3,68 3,85 4,01 3,50

LISINA 4,05 4,05 3,60 3,14

METIONINA 1,29 1,30 1,70 1,15

CISTEINA 0,49 0,53 0,63 0,56

FENILALANINA 2,04 2,09 2,28 2,02

TIROSINA 1,56 1,57 1,66 1,48

TREONINA 2,16 2,18 2,15 1,83

TRIPTOFANO 0,56 0,59 0,59 0,52

VALINA 2,78 2,84 2,75 2,39

Alanina 2,98 2,85 3,05 2,64


Ácido glutámico 6,87 9,74 9,64 13,57

Glicina 3,10 2,86 3,15 2,73

Prolina 3,00 3,16 3,68 3,14

Serina 2,09 2,12 2,27 1,96

IAA1 25,86 26,42 26,06 22,44

DAA2 22,86 25,57 26,34 27,95

IAA/DAA 1,13 1,03 0,99 0,80



37

3.1.2.- BLOQUE EXPERIMENTAL II: Efectos de la sustitución de la proteína animal por la proteína vegetal en la dieta de trucha arco iris y dorada. Dietas experimentales. Se elaboraron para cada especie cuatro dietas experimentales, trucha arco iris (T)

y dorada (D). Las dietas fueron diseñadas considerando el perfil de aminoácidos

esenciales que reflejan el contenido de aminoácidos esenciales de la harina de pescado y

con sustituciones de proteína animal del 0, 50, 75 y 100 % por proteína vegetal. Por lo

que las dietas estuvieron compuestas por diferentes proporciones de harina de pescado,

ingredientes de origen vegetal y suplementados con aminoácidos libres (Tablas 3.1.5 y

3.1.6). Las dietas de ambas especies estuvieron establecidas de acuerdo al NRC (1993)

tuvieron la misma proporción de proteínas (49 a 52 % DM en trucha y alrededor de 47 a

48 % en dorada), fueron isoenergéticas (22,7 a 24 kj energía/g DM) (Tabla 3.1.7 y

3.1.8).

Animales y tratamiento. Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)

Los animales fueron mantenidos en la instalación del INRA (Donzacq, Landes,

Francia). Cada dieta experimental fue aplicada a un grupo de 75 peces (peso medio

inicial = 19,2 ± 0,02 g). Los peces fueron mantenidos en tanques circulares de fibra de

vidrio de 1 m3, alimentados dos veces al día hasta observar la inapetencia de los

animales. Cada tres semanas, los peces fueron contados y pesados por grupos. El

experimento se realizó durante 12 semanas (entre marzo y junio de 2002) a temperatura

constante de 17 ± 1 °C. Cada dieta fue ensayada por triplicado en tres tanques

diferentes.

Dorada (Sparus auratus)

Los animales fueron mantenidos en el CSIC (Torre de la sal, España). Durante

12 semanas (entre abril y julio de 2002), grupos de 90 peces (peso medio inicial = 16,5

± 0,2 g), se distribuyeron en tanques circulares de fibra de vidrio de 0,5 m3, en sistemas

con agua de mar a temperaturas entre 17 y 25 °C, fueron alimentados dos veces al día.

Cada tres semanas los peces fueron contados y pesados en grupos. Las dietas fueron

administradas por triplicado.


38

Tabla 3.1.5.- Composición de dietas experimentales para trucha arco iris

T0 T50 T75 T100

Ingredientes(g/Kg)

Harina de pescado 637,9 319,0 159,5 0

Harina de gluten de maíz 0 116 177,1 232,4

Gluten de trigo 0 100 150 200

Extrusionado de guisantes (Aquatex) 0 80 120 163,3

Harina de colza (Primo 00) 0 46,9 75 100

Extrusionado de trigo 203,4 110,2 42,5 0


Ligante (Alginato de sodio) 10 10 10 10



CaHPO4.2H2O (18% P) 0 16,1 37,8 40

L-Arg 0 6,2 9,4 12,5

L-His 0 1,9 3,0 4,0

L-Lys 0 13,8 20,8 27,6

DL-Met 0 2,0 3,1 4,1

L-Trp 0 1,3 2,1 2,7

L-Thr 0 4,1 6,2 8,3

L-Ile 0 3,5 5,3 7,1

L-Val 0 4,7 7,0 9,4


Materia seca (DM, %) 92,0 93,1 93,7 94,2

Proteínas (% DM) 43,1 43,9 44,4 44,7

Lípidos (% DM) 18 18 18 18


1 De acuerdo a NRC (1993).


39

Tabla 3.1.6.- Composición de dietas experimentales para dorada

D0 D50 D75 D100

Ingredientes(g/Kg)

Harina de pescado 703,7 352 176 0

Harina de gluten de maíz 0 120 180 250

Gluten de trigo 0 120 180 250

Extrusionado de guisantes (Aquatex) 0 60 90 120

Harina de colza (Primo 00) 0 30,9 67,2 27,3

Lupino dulce 0 0 0 6,9

Extrusionado de trigo 142 94,9 30,6 15,5

Aceite de pescado 124,3 141,3 149,8 158

Ligante (Alginato de sodio) 10 10 10 10



CaHPO4.2H2O (18% P) 10 6,5 30,7 51,1

L-Arg 0 7,6 11,3 15,9

L-His 0 2,3 3,4 4,8

L-Lys 0 15,9 23,6 32,5

DL-Met 0 2,5 3,6 5,4

L-Trp 0 1,4 2,2 2,9

L-Thr 0 5,0 7,4 10,4

L-Ile 0 4,2 6,2 8,4

L-Val 0 5,4 8,0 11,1


Materia seca (DM, %) 92,1 93,0 93,6 94,5

Proteínas (% DM) 46,7 47,3 47,9 48,4

Lípidos (% DM) 18 18 18 18


1 De acuerdo a NRC (1993).


40

Tabla 3.1.7.- Composición de aminoácidos (g/100 g de materia seca) en las dietas experimentales para trucha arco iris.

Aminoácidos (% DM) T0 T50 T75 T100

ARGININA 3,03 3,03 3,03 3,03

HISTIDINA 1,24 1,24 1,24 1,24

ISOLEUCINA 2,20 2,20 2,20 2,20

LEUCINA 3,70 3,90 4,03 4,11

LISINA 3,79 3,79 3,79 3,79

METIONINA 1,43 1,29 1,22 1,14

CISTEINA 0,47 0,61 0,68 0,76

METIOCISTEINA 1,90 1,90 1,90 1,90

FENILALANINA 2,03 2,16 2,24 2,30

TIROSINA 1,55 1,53 1,52 1,50

FENILTIROSINA 3,58 3,68 3,76 3,80

TREONINA 2,13 2,13 2,13 2,13

TRIPTOFANO 0,54 0,54 0,54 0,54

VALINA 2,61 2,61 2,61 2,61

Glicina 2,91 1,93 1,43 0,94

Serina 2,02 1,77 1,64 1,51


Ácido glutámico 6,86 7,74 8,16 8,57

Prolina 1,97 2,37 2,69 2,78

Alanina 3,20 2,49 2,14 1,78

IAA1 24,71 25,02 25,22 25,36

DAA2 21,65 19,39 18,23 17,03

IAA/DAA 1,14 1,29 1,38 1,49



41

Tabla 3.1.8.- Composición de aminoácidos (g/100 g de materia seca) en las dietas experimentales para dorada.

Aminoácidos (% DM) D0 D50 D75 D100

ARGININA 3,26 3,26 3,26 3,26

HISTIDINA 1,33 1,33 1,33 1,33

ISOLEUCINA 2,38 2,38 2,38 2,38

LEUCINA 3,99 4,14 4,22 4,32

LISINA 4,12 4,12 4,12 4,12

METIONINA 1,56 1,41 1,33 1,28

CISTEINA 0,49 0,64 0,72 0,77

METIOCISTEINA 2,05 2,05 2,05 2,05

FENILALANINA 2,18 2,26 2,34 2,27

TIROSINA 1,68 1,63 1,61 1,60

FENILTIROSINA 3,86 3,89 3,95 3,86

TREONINA 2,30 2,30 2,30 2,30

TRIPTOFANO 0,54 0,54 0,54 0,54

VALINA 2,82 2,82 2,82 2,82

Glicina 3,14 2,12 1,57 1,12

Serina 2,17 1,94 1,80 1,77


Ácido glutámico 7,32 8,60 9,12 10,22

Prolina 2,17 2,64 2,87 3,24

Alanina 3,46 2,70 2,29 2,00

IAA1 26,69 26,85 27,01 27,02

DAA2 23,34 21,36 20,11 20,04

IAA/DAA 1,14 1,26 1,34 1,35



42

3.1.3.- BLOQUE EXPERIMENTAL III: Inyección de arginina y glucosa en dorada

Los animales fueron mantenidos en el CSIC (Torre de la sal, España). Durante 6

semanas (entre agosto y setiembre de 2002), grupos de 40 peces (peso medio entre 98 y

100 g), se distribuyeron en tanques circulares de fibra de vidrio de 0,5 m3, en sistemas

con agua de mar a temperaturas entre 23 y 25 °C, los peces fueron alimentados una vez

al día con las dietas D0 y D75 del bloque experimental II. Una semana antes del

tratamiento con arginina y glucosa, los peces fueron separados en grupos de 10 animales

en tanques de 90 l, siguiendo con la alimentación con la misma dieta. Al inicio del

experimento los peces fueron anestesiados brevemente con MS-222 (0,1 g /l), después

los animales fueron inyectados con 0,5 ml de arginina (1,4 mg/g de pez), 0,5 ml de D-

glucosa (0,5 mg/g de pez) y 0,5 ml de solución salina. Los peces fueron muestreados a

las 3 y 6 horas tras las inyecciones.

3.1.4.- BLOQUE EXPERIMETAL IV: Caracterización y clonaje del transportador de glucosa (GLUT4) del músculo esquelético de dorada.

Animales y condiciones experimentales Doradas obtenidas del Institut de Recerca i Tecnologia Agroalimentàries (IRTA)

de San Carles de la Ràpita (Tarragona, España), fueron aclimatadas durante 15 días en

el estabulario de la Facultat de Biología de la Universitat de Barcelona, en tanques

circulares de fibra de vidrio de 0,5 m3 con sistemas cerrados de agua de mar a una

temperatura constante de 20 ± 1 ºC. Una vez al día, los animales fueron alimentados

hasta observar la inapetencia. Los peces fueron mantenidos a fotoperíodos de día:noche

de luz artificial de 12:12 horas.

Ayuno Al finalizar el período de aclimatación, las doradas de peso medio inicial de

125,5 ± 4,9 g fueron separadas en dos grupos en tanques de 0,5 m3 diferentes, un grupo

de 6 peces diariamente fueron alimentados ad libitum con una dieta comercial. El otro

grupo de 7 animales se mantuvo en ayuno durante 2 semanas. El muestreo de los peces

se realizó a las 24 horas después de la ingesta.


43

Inyección de Insulina Doradas con un peso medio de 126,3 ± 3,9 g, al inicio del experimento los peces

fueron anestesiados con MS-222 (0,1 g /l) y pesados, los animales recibieron una

inyección intraperitoneal con insulina porcina (2,16 nmol/100 g de pez) y una solución

salina (1 µl/g de pez). Los peces fueron muestreados a las 3 y 18 horas de las

inyecciones.

3.2.- Extracción de sangre y tejidos.

En ambas especies, al final de los ensayos de crecimiento de los bloques

experimentales I y II, se tomaron cuatro peces por tanque a las 6 y 24 horas de post

ingesta. Se les sacrificó de un golpe en la cabeza, tomo el peso y se procedió a la

extracción de sangre mediante punción en la vena caudal utilizando jeringas

heparinizadas. Después de realizar una centrifugación a 3000 rpm durante 10 minutos,

el plasma fue separado en alícuotas y congeladas a –20 °C para el posterior análisis en

el laboratorio.

Las muestras de tejido muscular, fueron obtenidas tanto en trucha como en

dorada, inmediatamente después de la extracción de la sangre. Los trozos de músculo

blanco y músculo rojo fueron lavados con una solución de NaCl 0,7% para eliminar los

restos de sangre y congelados en nitrógeno líquido. Los tejidos fueron almacenados en

nitrógeno hasta el momento de ser utilizados.

En los experimentos en dorada, bloques experimentales III y IV, las muestras de

sangre y tejidos fueron obtenidas de la misma forma como se ha descrito anteriormente

para los otros dos bloques experimentales.

3.3.- Parámetros de crecimiento y eficiencia de utilización de nutrientes

y energía.

Al finalizar los períodos de adaptación a las dietas en los bloques experimentales

I, II y III, se procedió al calculó de los distintos parámetros con las siguientes

ecuaciones:


44

En ambas especies, la utilización de nutrientes y energía, se evaluó usando el

análisis comparativo de la carcasa. La composición del cuerpo se determinó en grupos

de 10 peces a comienzos del experimento y en grupos de cinco peces por tanque al

finalizar el experimento. El análisis se realizó siguiendo los procedimientos estándares:

el contenido de materia seca manteniendo a 110° C durante 24 horas, la proteína cruda

según el método de Kjeldahl después de una digestión ácida y los lípidos después de la

hidrólisis utilizando la extracción de éter. En trucha arco iris, el análisis de los animales

fue realizado por el personal del INRA (Donzacq, Landes, Francia). En dorada, el

análisis fue llevado a cabo por el personal del CSIC (Torre de la sal, España).

3.4.- Determinación de la glucosa en plasma.

La cuantificación de glucosa en plasma, se realizó mediante la reacción de la

glucosa-oxidasa que oxida a la glucosa en ácido glucónico, con formación de peróxido

de hidrógeno que en presencia de la peroxidasa reacciona con Fenol y 4-

Aminofenazona, originando un compuesto de color rojo, con una absorbancia máxima a

505 nm (Menagent Glucofix, Menarini diagnostics). Los niveles en plasma de glucosa,

son presentados como promedio ± error estándar, los análisis de glucosa por muestra se

han llevado a cabo por duplicados.

Tasa de crecimiento específico =[100 x [Ln(peso final corporal) - Ln(peso inicial corporal)]]

díasTasa de crecimiento específico =

[100 x [Ln(peso final corporal) - Ln(peso inicial corporal)]]

días

Tasa de conversión alimenticia =peso húmedo ganado

peso de alimento seco ingeridoTasa de conversión alimenticia =

peso húmedo ganado

peso de alimento seco ingerido

Tasa de eficiencia proteíca =peso húmedo ganado

peso neto de proteínas ingeridasTasa de eficiencia proteíca =

peso húmedo ganado

peso neto de proteínas ingeridas

Índice Hepatosomático =100 x peso del hígado

peso corporalÍndice Hepatosomático =

100 x peso del hígado

peso corporal


45

3.5.- Fundamento del radioinmunoensayo de insulina y glucagón en

plasma.

Los niveles de insulina y glucagón en plasma se cuantificaron por

radioinmunoensayos. Este ensayo se fundamenta en la competencia entre hormona fría

y hormona marcada isotópicamente por los lugares de unión a un anticuerpo. En este

sistema, la hormona marcada sirve como un trazador de la reacción antígeno –

anticuerpo.

La hormona marcada es el antígeno específico (Ag*) para la unión al anticuerpo

(Ab), cuando entran en contacto se establece un equilibrio dinámico entre el complejo

antígeno-anticuerpo y sus componentes libre (Ag* y Ab). La adición de hormona no

marcada (Ag) desplaza hormona del complejo (Ag* - Ab), la fracción de Ag*

desplazado es proporcional a la cantidad de Ag añadido. Así, la relación entre hormona

ligada al anticuerpo (Ag* - Ab) y hormona libre (Ag*) disminuye al aumentar la

concentración de la hormona fría, que compite con la marcada por la unión al

anticuerpo (Figura 3.1).

Figura 3.1.- Representación de la ecuación básica del radioinmunoensayo. Anticuerpo (Ab), hormona marcada (Ag*) y hormona fría (Ag)

Para realizar una curva estándar a cantidades fijas de anticuerpo y antígeno

marcada, se agregan cantidades crecientes de antígeno no marcado (hormona fría). De

está manera, la radioactividad de la fracción ligada al anticuerpo, variará inversamente a

la concentración de hormona fría. La cuantificación de la radioactividad y la

concentración de antígeno permite construir una curva patrón, y los valores de las

muestras problemas son determinados sobre está curva.

Ag*

Ag

Ab +

Ag*Ab

+

AgAb

Ag*

Ag

Ag*

Ag

Ab +Ab +

Ag*Ab

+

AgAb

Ag*Ab Ag*Ab

+

AgAb AgAb


46

3.6.- Radioinmunoensayo de insulina.

3.6.1.- Marcaje de insulina de bonito. Material y reactivos para la columna de celulosa - Tampón de marcaje (pH 7,5): 0,25 M tampón fosfato Solución A: 0,25 M NaH2PO4.2H2O Solución B: 0,25 M Na2HPO4.2H2O 19 ml (solución A) + 81 ml (solución B) - Tampón de lavado (pH 7,5): 50mM de tampón fosfato

- Tampón de elución (pH 7,5): Tampón de lavado al 6 % de albúmina bovina

(BSA)

- Cloramina T: 2,5 mg/ml de tampón de marcaje

- Metabisulfito de sodio: 7,5 mg/ ml de tampón de marcaje

- Insulina de bonito: 4 µg/10 µl de solución

100 µl (0,75 mg de insulina/ml de HCl 0,01N) + 85 µl de tampón de marcaje

- 125INa de Amersham (ref. IMS30): 1 mCi

- Columna de celulosa en una pipeta pasteur

Material y reactivos para la columna de Sephadex G-75 - Tampón de elución (pH 7,5): 0,04 M de KH2PO4 0,04 M de NaH2PO4.2H2O 0,1 M de NaCl 0,01 % de NaN3 0,1 % de BSA - Tampón de equilibrado (pH 7,5): tampón de elución al 0,5 % de BSA

- Columna de Sephadex (G-75 superfina)

Procedimiento

Se utilizó el método descrito por Gutiérrez y colaboradores (1984), la insulina de

bonito fue marcada utilizando como agente oxidante a la cloramina T que permite la

incorporación del 125I a la insulina. El metabisulfito de sodio para detener la reacción.

La solución de está reacción fue pasada por una columna de celulosa para la eliminación

de los excesos de 125I libre y la separación de fracciones de 1 ml de solución, en estas

fracciones se cuantificó la radioactividad mediante un contador γ se identificó el


47

segundo pico de radioactividad que corresponde a la fracción donde estuvo el porcentaje

mayor de proteína marcada y que después fue cromatografiada en la columna de

Sephadex G-75 previamente equilibrada con el tampón de elución al 0,5 % de BSA.

Para la purificación de la insulina marcada, añadimos tampón de elución a la

columna de Sephadex G-75. Recolectamos fracciones de 1 ml de solución, y

cuantificamos la radioactividad de las fracciones hasta identificar el pico de

radioactividad de la insulina marcada (alrededor de la fracción 20). A partir de la cual

se procedió a realizar las pruebas de unión (binding) de la insulina marcada al

anticuerpo anti-insulina y las pruebas de desplazamientos de las curvas patrones. El

procedimiento de marcaje de insulina de bonito se detalla en los siguientes pasos:

- En un tubo de 1,5 ml añadimos 100 µl de tampón de marcaje, 1mCi de 125INa, 10 µl de insulina de bonito (4 µg) y 10 µl de cloramina T (25 µg) e

incubamos está solución agitando a temperatura ambiente durante 3 minutos.

- Después agregamos 10 µl de metabisulfito de sodio y 30 µl de tampón de

elución y pasamos la solución a la columna de celulosa.

- En la columna de celulosa añadimos 6 ml de tampón de lavado y 5 ml de

tampón de elución y recogimos las fracciones para la cuantificación de la

radioactividad y seleccionamos la fracción que pasamos por la columna de

sephadex.

- En la columna de Sephadex G-75, agregamos tampón de elución

aproximadamente 30 ml, colectamos e identificamos las fracciones del

segundo pico de radioactividad y procedimos a realizar las pruebas de

binding y de desplazamiento de curva para determinar la alícuota a utilizar

para el radioinmunoensayo de insulina.

3.6.2.- Cuantificación de la insulina plasmática.

Material y reactivos - Tampón FAM (pH 7,5): 0,04 M de tampón fosfato 0,024 % de NaN3 0,3 % de BSA - Tampón NaFAM (pH 7,5): Tampón FAM al 6 % de BSA y 0,6 % de NaCl - Anticuerpo anti-insulina de bonito, obtenido de conejo (Gutiérrez, 1979),

dilución 1/ 30 000 en tampón NaFAM.


48

- Insulina de bonito subministrada por Kodama Ltd., Tokio. Utilizada como

hormona fría a diferentes concentraciones en tampón NaFAM, para la

elaboración de las curvas patrones.

- Insulina de bonito marcada con 125I, diluida en FAM hasta una concentración

de 10 000 cpm/100 µl.

Procedimiento

Las pruebas de binding y las muestras se valoraron por triplicado. La separación

del complejo antígeno - anticuerpo se realizó utilizando etanol al 80 % (Merck), después

de una centrifugación a 3000xg durante 30 minutos, el sobrenadante fue decantado y la

radioactividad cuantificada con un contador γ.

En las pruebas de binding de las fracciones de insulina de bonito marcada, en

cada fracción se analizó el porcentaje de binding específico (% BE) y el porcentaje de

binding no específico (% BNE). Después de la incubación a 4º C durante 24 horas, para

el radioinmunoensayo de insulina se seleccionaron las fracciones con % BE superiores

al 30 % y % BNE entre 7 y 14 %.

Donde: BC = Binding máximo entre la insulina marcada y el anticuerpo anti-insulina de bonito (expresada en cpm). F = Blanco (cpm). CT = Cuentas totales de radioactividad/minuto (cpm). Los niveles insulina plasmática son presentados como promedio ± error

estándar, los análisis de insulina por muestra se han llevado a cabo por triplicados. El

procedimiento de la cuantificación de la insulina en plasma queda resumido en la tabla

3.6.1.

Bo - F

CTX 100 =% BE

F

CTX 100 =% BNE

Bo - F

CTX 100 =% BE

Bo - F

CTX 100

Bo - F

CT

Bo - F

CTX 100 =% BE

F

CTX 100 =% BNE

F

CTX 100 X 100 =% BNE


49

Tabla 3.6.1.- Protocolo del radioinmunoensayo de insulina.

BC F Patrón Muestra

NaFAM 100 µl 200 µl - 90 µl

Anticuerpo 100 µl - 100 µl 100 µl

Patrón - - 100 µl -

Muestra - - - 100 µl

Incubación a 4º C durante 48 horas

125Insulina 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl


EtOH 80% 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Centrifugación a 3000xg durante 30 minutos a 4º C y cuantificación del precipitado

3.7.- Radioinmunoensayo de glucagón.

3.7.1.- Material y reactivos - Tampón de ensayo (pH 8,8): 0,2 M de glicina 0,25 % de albúmina humana - Tampón charcoal-dextrano (pH 8,8): 0,2 M de glicina 1 % de Charcoal (Noria A) 0,5 % de Dextrano T-70 - Anticuerpo anti- glucagón bovino porcino, 30K (Unger et al., 1962), dilución

1/ 30 000 en tampón de ensayo.

- Glucagón bovino porcino subministrada por el “Nacional Institute for

Biological Standard y Control”. Utilizada como hormona fría a diferentes

concentraciones en tampón de ensayo, para la elaboración de las curvas

patrones.

- Glucagón marcado con 125I (Amersham ref. IM 160), diluida en buffer de

ensayo hasta una concentración de 10 000 cpm/500 µl.

- Trasylol (Bayer)

- Suero de caballo (Sigma)


50

3.7.2.- Procedimiento

El glucagón plasmático fue medido según el método de Unger, validado para

ambas especies por Navarro y colaboradores (1995). Se utilizó glucagón marcado con 125I, y un anticuerpo anti-glucagón 30K (Unger et al., 1962). Las muestras se valoraron

por duplicado en 100 µL de plasma. La hormona libre se precipitó utilizando una

solución charcoal-dextrano y una centrifugación durante 30 minutos a 3000xg, se

cuantificó la radioactividad del sobrenadante que contenía el complejo antígeno-

anticuerpo mediante un contador γ.

Los niveles en plasma glucagón son presentados como promedio ± error

estándar. En la tabla 3.10.1 se describe el procedimiento de la cuantificación del

glucagón plasmático.

Tabla 3.7.1.- Protocolo del radioinmunoensayo de glucagón.

CT BC F Patrón Muestra

Tampón de ensayo 600 µl 200 µl 600 µl - 100 µl

Trasylol 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl

Patrón - - - 200 µl -

Muestra - - - - 100 µl

Anticuerpo - 400 µl - 400 µl 400 µl

Glucagón 125I 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl


Suero de caballo - 100 µl 100 µl - 100 µl

Tampón de ensayo - - - - 100 µl

Charcoal-dextrano - 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl

Incubación a 4º C durante 45 minutos

Centrifugación a 3000xg durante 30 minutos a 4º C y cuantificación del sobrenadante


51

3.8.- Radioinmunoensayo de IGF-I.

El análisis del IGF-I plasmático fue llevado a cabo por el personal del CSIC

(Torre de la sal, España). Después de una precipitación ácida-etanol, el IGF-I del

plasma fue cuantificado usando el RIA de IGF-I de pez. Este ensayo está basado en el

uso del IGF-I de Pagrus major (GroPep) como estándar y un anticuerpo IGF-I

anti-barramundi (Lates calcarifer) dilución 1:8000 como primer anticuerpo y un

anticuerpo secundario de anti-conejo IgG dilución 1:20 (Biogenesis, Poole, UK), ya que

la secuencia de aminoácidos del IGF-I del Pagrus major y el IGF-I de dorada es similar

al 100 %.

3.9.- Semipurificación de los receptores de insulina e IGF-I en el

músculo blanco.

3.9.1.- Fundamento. Los receptores de insulina e IGF-I se han purificado por cromatografía de

afinidad, previa homogenización del músculo y solubilización del homogenado

utilizando tritón al 2% como detergente. La aglutinina de germen de maíz (wheat germ

agglutinin, WGA) unida a la agarosa como soporte inerte (WGA-agarose, Vector

Laboratories, Burlingame, CA, USA), ha sido demostrada como el mejor ligando para

la cromatografía de afinidad de los receptores de insulina e IGF-I, ya que permite la

unión de glucoproteínas con una alta afinidad.

3.9.2.- Material. - Tampón de homogenización (pH 7,5): 25 mM de hepes 4 mM de EDTA 4 mM de EGTA 2 mM de PMSF 25 mM de benzamidina 1 mM de leupeptina 1 mM de bacitracina 1 mM de pepstatina - Tampón de lavado (pH 7,5): 25 mM de hepes 0,1 % de Tritón X-100 - Tampón de columna 1 (pH 8,5): 50 mM de trizma 0,2 % de Tritón X-100 1 M de NaCl


52

20 mM de NaN3 - Tampón de columna 2 (pH 4,5): 50 mM de CH3COONa 0,2 % de Tritón X-100 1 M de NaCl 20 mM de NaN3 - Tampón de columna 3 (pH 7,5): 50 mM de hepes 0,2 % de Tritón X-100 20 mM de NaN3

3.9.3.- Procedimiento. La semipurificación de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco

(figura 3.2), se va a realizar según el método descrito por Párrizas y colaboradores

(1994a).

Figura 3.2.- Protocolo de Semipurificación de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco.

Extracción del tejido almacenadoen nitrógeno líquido

Homogenización del tejido

Solubilización (Tritón X-100, 4º C, 60 minutos)

Ultracentrifugación (150 000xg, 4º C, 90 minutos)

Cromatografía de afinidad (WGA-agarosa)

Receptores semipurificados

Extracción del tejido almacenadoen nitrógeno líquido

Homogenización del tejido

Solubilización (Tritón X-100, 4º C, 60 minutos)

Ultracentrifugación (150 000xg, 4º C, 90 minutos)

Cromatografía de afinidad (WGA-agarosa)



53

El músculo blanco (entre 7 y 9 gramos) fue pulverizado mecánicamente y

mantenido en el mismo nitrógeno líquido durante el proceso. A continuación se realizo

la homogenización del pulverizado en un homogenizador (POLYTRON PT 3000),

diluyendo la muestra en 3 volúmenes por cada unidad de peso (3 v/p) en tampón de

homogenización. Al homogenado se le añadió tritón X-100, hasta llegar a una solución

final del 2 % de tritón que fue incubada a 4º C en agitación durante 1 hora, después la

solución fue ultracentrifugada ( 150 000xg a 4º C durante 90 minutos). El sobrenadante

fue pasado 3 veces por la columna de WGA-agarosa a 4º C. Las columnas fueron

lavadas con 80 ml de tampón de lavado y los receptores fueron recuperados son con una

solución al 0,3 M de N-acetil-D-glucosamina en tampón de lavado.

La solución eluida fue recogida en 3 fracciones, la primera de 0,5 ml, la segunda

de 1,5 ml y la tercera fracción de 0,5 ml. Se cuantifico la cantidad de proteínas de las

fracciones mediante el método de Bradford (1976), la fracción de mayor cantidad de

proteínas correspondió a la más enriquecida de receptores y que se utilizó para los

ensayos de unión (binding) a la hormona a su receptor.

3.10.- Ensayo de unión de la hormona a su receptor.

3.10.1.- Material y métodos. - Tampón de binding (pH 7,5): 25 mM de hepes 0,15 % de bacitracina 0,3 % de BSA - Tampón fosfato (pH 7,5): 50 mM de NaH2PO4 50 mM de Na2HPO4 - 0,2 % γ-Globulina bovina en 50 mM de tampón fosfato

- 25 % de PEG 8.000 en 10 mM de tampón fosfato

- 125I-Tyr-A14- insulina e 125I -IGF-I (ambos de AE=2 000 Ci/mmol, Amersham

Life Sci.)

3.10.2.- Procedimiento En la figura 3.3 se muestra el protocolo descrito por Párrizas y colaboradores

(1994a). La muestra eluida de la columna de WGA (30-50 µg de glucoproteína), se


54

incuba en el tampón de binding con el ligando marcado (35 pM 125I-insulina o 125I-IGF-

I, que corresponde a 20 000 cpm/100 µl de insulina o 15 000 cpm/100 µl en el caso del

IGF-I) y concentraciones crecientes de hormona fría (de 0,0125 a 100 nM de insulina

porcina Sigma, o IGF-I humano recombinante, proporcionado por Ciba-Geigy-Basel-

Suiza.

Figura 3.3.- Protocolo del ensayo de binding de los receptores de insulina a e IGF-I del músculo blanco.

La incubación se realizó a 4º C durante 16 horas. Después de este período se

precipitaron los receptores añadiendo la γ-globulina bovina y PEG 8 000 incubados a

4º C durante 45 minutos. Tras este período de incubación las muestras fueron


Muestra de receptores + insulina* o IGF-1* + tampón de binding + hormona fría (0-400 nM)

Precipitación (γ-globulina, PEG)

Centrifugación (14 000xg, 4º C, 7 minutos)

Cuantificación de la radioactividad

Análisis Scatchard

Incubación a 4º C, 16 horas

Incubación a 4º C, 45 minutos


Muestra de receptores + insulina* o IGF-1* + tampón de binding + hormona fría (0-400 nM)

Precipitación (γ-globulina, PEG)

Centrifugación (14 000xg, 4º C, 7 minutos)

Cuantificación de la radioactividad

Análisis Scatchard

Incubación a 4º C, 16 horas

Incubación a 4º C, 45 minutos


55

centrifugadas a 14 000xg 5 minutos a 4º C. El sobrenadante fue descartado por

aspiración y se procedió a la cuantificación de la radioactividad del precipitado.

Los resultados son analizados por el método de Scatchard (1949), obteniéndose

para cada punto de desplazamiento, la insulina unida (B, bound) y libre (F, free). Tanto

en el caso de la insulina como para el IGF-I se obtuvieron las curvas Scatchards, que

pueden explicarse por dos hipótesis: a) la existencia de dos clases de receptores con

diferentes afinidades o b) la existencia de cooperatividad negativa en una misma

población de receptores. Los cálculos se realizaron en función de la primera hipótesis,

más aceptada para la mayoría de investigadores (Gutiérrez y Plisetskaya, 1994),

teniendo en cuenta la primera parte de curva, correspondiente a los receptores de alta

afinidad y baja capacidad.

3.11.- Clonaje del transportador de glucosa (GLUT4) del músculo

esquelético de dorada.

3.11.1.- Extracción del ARN del músculo rojo de dorada.

Para obtener el ARN total a partir de las muestras de músculo rojo se utilizó el

kit comercial TriReagent de Molecular Research Center, INC. Este método combina el

fenol y tiocianato de guanidina en una solución de una sola fase para facilitar la

inhibición efectiva de la actividad RNAsa. Las muestras fueron homogenizadas con la

utilización de un politron. El brazo del homogenizador se trató previamente con agua

peroxigenada al 30% y entre cada muestra se realizaron lavados de 20 segundos con

tampón de homogenización y agua al 0,1 % de dietilpirocarbonato (agua DEPC). Por

cada 100 mg de muestra se añadieron 1 ml de TriReagent, posteriormente el

homogenado se separó en una fase acuosa y orgánica con cloroformo (0,2 veces la

cantidad del volumen inicial de TriReagent) seguido de una centrifugación (12000 xg,

4ºC, 15 min). El ARN que quedó en la fase acuosa, se precipitó con isopropanol (0,5

veces la cantidad del volumen inicial de TriReagent) centrifugando (12000 xg, 4ºC, 8

min). El precipitado se lavó con etanol 75% (el mismo volumen inicial de TriReagent) y

se centrifugó (7500 xg, 4º C, 5 min). El precipitado se solubilizó con 100 µl de

Formazol (Molecular Research Center) a 55ºC durante 15 minutos.


56

La concentración de ARN se determinó por espectrofotometría leyendo 2 µl de

cada muestra a una longitud de onda de 260 nm. Una vez determinada la concentración,

las muestras se conservaron a –80ºC hasta su utilización.

3.11.2.- Aislamiento del ARNm del músculo rojo de dorada.

Material y reactivos

- Tampón de unión: 0,5 M de LiCl 50 mM de citrato de sodio 0,1 % de SDS - Tampón de elución: 1 mM de citrato de sodio 0,1% de SDS - Otros reactivos: 1% de SDS, 75 % de etanol, 1 M de Tris, 5 M de NaCl e

isopropanol Todas las soluciones y materiales utilizados en el aislamiento fueron elaborados

y tratados con H2O DEPC. Procedimiento

La purificación del ARN mensajero se llevó a cabo en columnas de oligo

(dT)-celulosa (Molecular Research Center, INC), diseñadas para el aislamiento de la

fracción de poli A ARN mensajero del ARN total purificado mediante el TriReagent. El

procedimiento se detalla en los siguientes pasos:

1) Antes de su utilización las columnas fueron lavadas con 0,5 ml de tampón de

unión.

2) El ARN total de la muestra fue llevada a una concentración final de 1 µg/µl

con el tampón de unión.

3) La muestra fue eluida 2 veces por la columna y lavada 2 veces con el tampón

de unión.

4) A la columna se le agregó 600 µl del tampón de elución y se recuperó el

sobrenadante.

5) El sobrenadante fue llevado a una concentración 0,3 M y se le añadió 8 µl

del Polyacryl carrier (incluido en el kit de las columnas).

6) El ARN fue precipitado por una centrifugación a 12000xg a 4 ºC durante 5

minutos después de una incubación a temperatura ambiente con isopropanol

(1,5 volúmenes del paso 5) durante 5 minutos.


57

7) El precipitado fue resuspendido con 12 µl de H2O DEPC. Una vez

determinada la concentración, las muestras se conservaron a –80ºC hasta su

utilización.

3.11.3.- Síntesis de ADNc por la transcriptasa reversa. Para la síntesis del ADNc se utilizo el kit comercial First-Strand cDNA

Synthesis Kit (Amersham Biosciences). Antes de la reacción de la transcriptasa reversa

(RT), el ARNm aislado fue llevado con agua DEPC a una concentración de 18,8 ng/µl,

y 8 µl de la solución de ARNm fue incubado a 65 ºC durante 10 minutos. El

procedimiento de la RT se resume en la siguiente tabla:

Tabla 3.11.1.- Protocolo de la reacción de la transcriptasa reversa.

ARNm Not I-d(T)1 MIX2 DTT3 H20 DEPC

Control - - 1 µl 5 µl 1 µl 8 µl

Control + 150 ng/8 µl 1 µl 5 µl 1 µl -

Muestra 150 ng/8 µl 1 µl 5 µl 1 µl -

Incubación a 37º C durante 1 hora

Incubación a 90º C durante 5 minutos

1 Cebador Not I-d(T)18 en solución acuosa a 5 µg/µl 2 Mezcla de reacción (Bulk first-strand cDNA reaction mixes) 3 Solución 200 mM de dithiothreitol (DTT)


58

3.11.4.- Amplificación del ADNc por PCR y PCR anidada.. A partir del alineamiento de las secuencias de nucleótidos del transportador de

glucosa GLUT4 disponibles en las bases de datos públicas, se diseñaron algunos

cebadores degenerados para amplificar fragmentos de ADN de diferentes tamaños (tabla

3.11.2).

Tabla 3.11.2.- Secuencia de cebadores degenerados utilizados para la clonación y secuenciación del Glut4 de dorada.

Cebadores Secuencia Dirección PCR

DGlut1 5'-CAT GCC RNC TGG RTT TCA GCA WCT-3' sentido primera

DGlut2 5'-RTA RTA RAA NAC NGC RTT-3' antisentido primera

DGlut3 5'-TTT CAG CAW CTY GGA GGG GAG AC-3' sentido anidada

DGlut4 5'-GRC TYT CRG GRC ARA ARG-3' antisentido anidada

DGlut5 5'-TWC GAR ATG CTN ATH CTN G-3' sentido anidada

En el ADNc de la reacción de RT se realizó una primera reacción de PCR, cuyo

producto fue un fragmento de ADN correspondiente a 891 pb, en está PCR se realizó un

procedimiento de “HOT STAR” que consistió en incorporar los cebadores degenerados

cuando el resto de los componentes de la PCR alcanzaron los 94 ºC. En está PCR se

llevaron a cabo 39 ciclos con las siguientes fases: desnaturalización (94 ºC - 1 minuto),

emparejamiento (50 ºC - 2 minutos) y extensión (65 ºC - 2 minutos) y al acabar los

ciclos una extensión final a 65 ºC durante 7 minutos.

El producto de la primera PCR (dilución 1:10 de la muestra), fue utilizado como

sustrato para realizar una segunda PCR (nested PCR). Los ciclos de está PCR fueron:

desnaturalización (94 ºC - 1 minuto), emparejamiento (55 ºC - 1 minuto) y extensión

(65 ºC - 1 minutos) y la extensión final a 65 ºC durante 7 minutos. Para los controles

negativos y positivos de ambas PCR se utilizaron cebadores específicos de β-actina


59

(proteína constitutiva y de expresión elevada en el tejido muscular). El procedimiento y

la descripción de los ciclos de la primera y segunda PCR se detallan en la tabla 3.11.3:

Tabla 3.11.3.- Protocolo de las reacciónes de PCR.

ADN de la RT

Tampón de PCR1 dNTPs2 Taq Pol.3 Cebadores4 H20 mili-Q

Control - - 5 µl 1 µl 1,25 µl 2 µl 40,75 µl

Control + 4 µl 5 µl 1 µl 1,25 µl 2 µl 36,75 µl

Muestra 4 µl 5 µl 1 µl 1,25 µl 2 µl 36,75 µl 1 Tampón de PCR 10x (Biotools) 2 Mezcla de dNTPs a 20 mM (Biotools) 3 Taq polimerasa a 1U/µl (Biotools) 4 Cebadores sentido y antisentido a concentraciones de 200 pM/µl

3.11.5.- Separación de los fragmentos de ADN amplificados.


- Tampón de carga: 0,25 % de azul de bromofenol

0,25 % de cianol xileno FF 40 % de sucrosa en H2O mili-Q - Tampón de TAE 50x (pH 8,8): 242 g de tris base 57,1 g de ácido acético glacial 100 ml de EDTA 0,5 M Para 1l de solución

Procedimiento

Para la separación e identificación de los fragmentos de ADN amplificados, se

tomaron 40 µl de los productos de las reacciones de PCR y se les agregó 8 µl de tampón

de carga, después las muestras fueron cargadas en geles al 1% de agarosa y 1% TAE y

separadas con la ayuda de una fuente electroforética. Al finalizar la separación, el gel

fue sumergido en una solución de bromuro de etidio y expuesto a luz ultravioleta para la

identificación de las fragmentos de ADN esperados, teniendo como referencia los pesos

moleculares patrones cargados en los mismo geles.


60

3.11.6.- Aislamiento y ligación de los fragmentos de ADN amplificados.


- Kit comercial GENECLEAN turbo kit (Q.BIOgene)

- Kit comercial InsT/AcloneTM PCR Producto Cloning Kit (Fermentas)

Procedimiento

Después de la separación mecánica de las bandas del gel, que correspondían a

los fragmentos de ADN del tamaño esperado, se procedió al aislamiento del ADN

utilizando el kit comercial GENECLEAN y que consistió en el siguiente protocolo:

1) Por cada 100 mg de gel de agarosa se añadió un volumen de 100 µl de la

solución GENECLEAN Turbo Salt Solution.

2) Se incubó a 55 ºC en un baño maría durante 5 minutos hasta observar la

disolución de la agarosa (agitando cada minuto durante la incubación).

3) La mezcla se transfirió a un tubo GENECLEAN Turbo Cartridge unido a un

tubo de 2 ml y se centrifugó a 14 000xg durante 5 segundos.

4) Se agregó 500 µl de la solución GENECLEAN Turbo Wash y se centrifugó a

14 000xg durante 5 segundos, este paso se repitió dos veces más.

5) Después se centrifugó a 14 000xg durante 4 minutos y se agregó 30 µl de la

solución GENECLEAN Turbo Elution Solution y se centrifugó a 14 000xg

durante 1 minuto y se recuperó la solución eluida que contenía el ADN.

6) Una alícuota de 2 µl de la solución eluida fue cargada en gel de agarosa al 1% de

manera similar al punto 3.4.5, la concentración del ADN aislado de la muestra

fue cuantificado teniendo en cuenta la intensidad de la señal y como referencia a

los pesos moleculares patrones (concentración conocida de ADN).

La ligación del ADN aislado (inserto) se realizó con el kit comercial

InsT/Aclone, previamente de acuerdo al peso molecular del inserto se calculó la

cantidad de ADN necesaria para mantener la relación molar 3:1 (inserto:vector) para

aumentar el número de ligaciones positivas. La ligación se realizó a 4 ºC durante toda

una noche (ON), el control positivo fue un fragmento de ADN incluido en el kit. El

protocolo de la ligación se resume en la siguiente tabla:


61

Tabla 3.11.4.- Protocolo de ligacíon de los fragmentos ADN aislados.

Inserto1 Vector2 Tampón de ligación3

PEG 40003 BSA3 Ligasa

T44 H20 mili-Q

Control + 4 µl 3 µl 3 µl 3 µl 0,75 µl 1 µl 15,25 µl

Muestra X µl 3 µl 3 µl 3 µl 0,75 µl 1 µl Y µl 1 El volumen utilizado está en función del tamaño del inserto lo cual modifica el volumen de H2O 2 Vector pTZ57R(2886 bp) 3 Soluciones del kit 4 Ligasa T4 ADN (5U/µl)

3.11.7.- Transformación y selección de las bacterias con los fragmentos de ADN amplificados. Material y reactivos

- Kit comercial InsT/AcloneTM PCR Producto Cloning Kit (Fermentas)

- Medio SOC (100 ml): 2 g de Bacto-triptona 0,5 g de Extracto de levadura (Bacto-yeast extract) 1 ml de NaCl 1M 0,25 ml de KCl 1M 1 ml de solución de Mg2+ 2M, filtrada y estéril 1 ml de solución de glucosa 1M, filtrada y estéril Se añadió todos los componentes excepto el Mg2+ y la glucosa y completamos

hasta un volumen de 97 ml con agua destilada. Se disolvió y autoclavó la solución y se

dejó enfriar a temperatura ambiente. Se Agregó el Mg2+ y la glucosa, y por último se

filtró el medio SOC con un filtro de 0,2 µm.

- Medio LB (pH 7 ): 10 g de Bacto-trypone 5 g de Bacto-yeast extract 5 g de NaCl Hasta 1l con H20 destilada - Placas LB-Ampicilina: 15 g de agar Hasta 1l con medio LB Se autoclavó y cuando la solución alcanzó aproximadamente los 50 ºC se añadió

la ampicilina hasta llegar a una concentración final 100 µg/ml y rápidamente se

distribuyó en placas petris.

Procedimiento


62

Después de la ligación del inserto con el vector, se procedió a la transformación

de las bacterias competentes DH5α como se describe en el siguiente protocolo:

1) En un tubo de 1,5 ml se añadió 5 µl ligación y 50 µl de bacterias competentes

DH5α, y se incubó en hielo durante 20 minutos

2) Después se incubó a 42 ºC durante 1 minuto y 45 segundos, y el tubo se volvió a

incubar en hielo 2 minutos.

3) Al tubo se le agregó 950 µl de medio SOC y se cultivó a 37 ºC con una agitación

de 150 RPM durante 90 minutos.

4) Se centrifugó a 500 x g 4 ºC por 10 minutos y se descartó el sobrenadante.

5) Se resuspendió el precipitado en 100 µl de medio SOC y se plaqueó en las

placas de LB-Ampicilina, previamente a su uso a la placa se le añadió 100 µl de

IPTG 100mM y 20 µl de la solución de X-Gal (50mg de X-gal/ml de N,N’-

dimetil-formamida).

6) Las placas se cultivaron a 37º C durante toda la noche (ON) hasta observar la

formación de colonias.

La identificación de las colonias positivas se dio por selección de color, ya que

el vector posee el gen lacZ. Además se realizó una comprobación por PCR (screening

por PCR), ya que el inserto pudo ser amplificado utilizando cebadores específicos

M13F/M13R que se unen a regiones del vector, que después fueron separados en un gel

de agarosa para comprobar el peso molecular esperado. El primer paso de la reacción

del screening por PCR fue de 94 ºC durante 1 minuto, con 25 ciclos de 94 ºC - 30

segundos, 55 ºC – 30 segundos y 72 ºC 1 minuto.

A partir de las colonias positivas, se realizó un cultivó líquido de 16 a 24 horas

(ON) a 37 ºC en 4 ml de medio LB más 4 µl de ampicilina (100mg/ml). A partir del

cultivó líquido se obtuvo un stock de las colonias (850 µl del cultivó líquido + 150 µl de

glicerol). Después se procedió a la purificación de los plásmidos recombinantes

utilizando el kit comercial Plasmid DNA Purification siguiendo el siguiente protocolo:

1) El cultivó líquido se centrifugó a 11000 x g durante 30 seg. y se descartó el

sobrenadante

2) El precipitado fue resuspendido con 250 µl del tampón A1, después se agregó

250 µl del tampón A2 y se mezcló suavemente por inversión 6-8 veces y la


63

mezcla se incubó a temperatura ambiente durante un máximo de 5 minutos, y a

continuación agregamos 300 µl del tampón A3.

3) Se centrifugó a 11000 x g por 10 minutos y el sobrenadante fue traspasado a una

columna del NucleoSpin Plasmid QuickPure acoplado a un tubo recolector.

4) Se centrifugó a 11000 x g durante 1 minuto, posteriormente a la columna se

agregó 450 µl del tampón AQ y se centrifugó a 11000 x g 4 minutos.

5) Se añadió a la columna 50 µl de tampón AE y se incubó 1 minuto a temperatura

ambiente, después se centrifugó por 1 minuto a 11000 x g y se recuperó el

líquido precipitado de la columna.

3.10.8.- Secuenciación y alineamiento de los fragmentos de ADN amplificados.

A partir del plásmido recombinante purificado se realizó una digestión para

liberar el inserto del vector, para lo cual se utilizó 5 µl del plásmido purificado y se

añadió 1 µl de los enzimas EcoR1 y Hind III, 2 µl del tampón de EcoR1 y 11 µl de H2O

mili-Q, está digestión fue incubada a 37 ºC por 3 horas y después cargada en un gel de

agarosa al 1 % para comprobar la presencia del inserto y del vector.

Una vez comprobada la existencia del plásmido recombinante se realizó una

reacción de secuenciación utilizando el kit ABI Pris BIGDYE Terminador V3.1,

utilizando 0,5 µl del plásmido más 0,5 µl de los cebadores (M13F ó M13R), 4 µl de la

mezcla del kit y 15 µl de H2O mili-Q. El primer paso de la reacción de secuenciación se

realizó durante 1 minuto a 96 ºC, con 25 ciclos de 96 ºC - 30 segundos, 50 ºC – 15

segundos y 60 ºC por 4 minutos.

De la reacción de secuenciación se precipitó el ADN siguiendo el siguiente

protocolo:

1) Se añadió los 20 µl de la reacción de secuenciación en un tubo de 1,5 ml.

2) Se agregó 5 µl de EDTA (125nM) y 60 µl de etanol al 100 %, se agitó la mezcla

y se incubó a temperatura ambiente durante un máximo de 15 minutos.

3) Se centrifugó la solución a 4 ºC-14 000 x g durante 20 minutos y se descartó el

sobrenadante.

4) Se añadió 200 µl de etanol al 70 %, y se centrifugó a 4 ºC-14000 x g por 2

minutos, se descartó el sobrenadante y se repitió el lavado con el etanol al 70 %.


64

5) Se centrifugó a 4 ºC-14000 x g durante 2 minutos y se descartó el sobrenadante

al máximo utilizando una pipeta y si fue necesario se volvió a centrifugar para

eliminar el etanol.

Después el precipitado fue enviado a secuenciar a los servicios científico-

técnicos de la Universitat de Barcelona, las secuencias de los fragmentos de ADN,

fueron introducidas en las bases públicas (BLAST, PUBMED).

3.12.- Análisis de la expresión del ARN mensajero del transportador de

glucosa (GLUT4) del músculo esquelético de trucha mediante

Northern Blot.

3.12.1.- Obtención de las membranas.

En un gel de formaldehido-agarosa al 1,1 % se cargaron 15 µg del ARN total

del músculo rojo de trucha (aislados de manera similar al de dorada punto 3.4.4),

con tampón de carga (MOPS X 20, 0,25%, azul de bromofenol en 50% glicerol,

formaldehida 37%, bromuro de etidio 1 mg/ml) y Formazol (50% del volumen

final de la muestra). Antes de cargar las muestras se incubaron durante 15 minutos a

55ºC. Después se separaron bajo un campo constante de 50 V utilizando un tampón

de electroforesis MOPS X 1 (MOPS 4 M, 1 M NaOH, 1 mM EDTA a pH 7 ,

autoclavado).

Se comprobó que la electroforesis se realizó correctamente visualizando el gel

con luz UV de longitud de onda de 312 nm. Después se realizaron tres lavados al gel

para desnaturalizar el ARN: NaOH 0,5 mM (30 minutos), Tris HCl 0,1 M pH 7.5 (20

minutos), SSC X 10 (NaCl 1,5 M, citrato sódico tribásico deshidratado 0,15 M, a pH

7 ajustado con HCl) (10 minutos).

Después de estos lavados al gel, el ARN se transfirieron a una membrana

NytranN (Scheiler y Schuell) previamente normalizada con agua DEPC. La

transferencia del ARN se realizó por capilaridad con tampón SSC X10 durante 18

horas.

Después de la transferencia, la membrana se irradió 5 minutos con luz UV con

una potencia de 50 KJ. Los pesos moleculares (Ambion) que también se habían


65

cargado en el gel fueron cortados de la membrana y teñidos con una solución de

ácido acético 5% (2 min en agitación) y azul de metileno 0,4%-acetato de sodio 0,5

M (3 min en agitación) y se comprobó que el ARN se transfirió correctamente.

3.12.2.- Prehibridación y marcaje de la sonda btGLUT de trucha común.

Para la prehibridación de la membrana se utilizaron 10 ml de tampón comercial

(UltraHyb, Ambion Austin, TX). La prehibridación de la membrana se realizó en

agitación ligera en horno de hibridación a 42 ºC durante 2 horas.

Para el marcaje de 15 µg de la sonda de btGLUT (2,3 Kb, Nucleótidos

151-2472, GenBank AF247395), Se utilizó el kit comercial de marcaje Standard

Labeling Protocol (Invitrogen) y [α-32-P] dCTP 3000 Ci/mmol (Amersham).

El producto de la reacción se purificó con las columnas Microspin Columns

(Amersham) siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente se cuantificó

1 µl del producto marcado con un contador β. La membrana fue hibridada con 106

cpm/ml a 42ºC durante 16 horas. Después se realizaron 3 lavados de la membrana con

una solución de 2X SSC - 0,1% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, dos

lavados con 1X SSC - 0,1 % SDS de 15 minutos y por último 2 lavados 1X SSC - 0,1 %

SDS por 15 minutos. Después las membranas fueron expuestas durante un tiempo de 14

días con películas fotográficas (X-OMAT AR Kodak). Para hacer el control de carga del

ARN total, la membranas fueron rehibridadas con una sonda de 200 pb de ADN de la

subunidad ribosómica 18S que provenía de un clon de ADN obtenido por RT-PCR

utilizando ARN de ovario de Salmo trutta.

Después se realizaron tres lavados de 15 minutos con 2X SSC - 0,1% SDS, dos

lavados de 15 minutos con 1X SSC - 0,1% SDS y por último dos lavados con 0,1X

SSC - 0,1 % SDS a 42 ºC. Las membranas estuvieron expuestas durante un día a

películas fotográficas (X-OMAT AR Kodak). En todas las exposiciones se utilizaron

pantallas intensificadores (Dupont); posteriormente a la exposición de las películas, se

procedió a la cuantificación de la bandas utilizando el programa TOTAL LAB.


66

3.13.- Cuantificación a nivel de proteína del transportador de glucosa

(GLUT4) del músculo esquelético de dorada.

3.13.1.- Extracción de las proteínas del tejido muscular de dorada. Material y reactivos

- Tampón de lisis: 1 mM de ortovanadato de sodio

10 mM de tris-HCl

1 % de SDS

1 mM de benzamidina

0,96 µg/µl de leupeptina

0,34 µg/µl de pepstatina

Procedimiento

A partir de las muestras de tejido muscular obtenidas en los diferentes

experimentos se realizó la extracción de proteínas realizando siguiente protocolo:

1) En tubo de vidrio (pirex) se peso 1 gramo de tejido y se añadió 5 ml de tampón

de lisis hirviendo.

2) Se homogenizó el tejido en un politron y después se hirvió la muestra durante 10

segundo en un microondas.

3) Se centrifugó la mezcla a 12000 x g-15 ºC durante 5 minutos.

4) Se recuperó el sobrenadante y si fue necesario se centrifugó hasta observar el

sobrenadante limpio.

3.13.2.- Cuantificación de proteínas: método de Bradford.

La determinación de la concentración de proteínas se realizó con un “kit”

comercial basado en el método espectrofotométrico de Bradford (Bio-Rad Protein

Assay; Bio-Rad Lab., Germany). El método se basa en el cambio de diferencial de color

del azul brillante de Coomassie G-250 en respuesta a la concentración de proteínas. El

azul brillante de Coomassie G-250 tiene un máximo de absorbancia a 465 nm, éste

máximo cambia a 595 nm cuando se une a la proteína. El procedimiento del ensayo

tiene su linealidad para concentraciones de proteínas entre 1µg/ml a ≤ 25 µg/ml.


67

3.13.3.- Electroforesis de proteínas. El método de separación electroforética se basa en la migración diferencial de

las moléculas en solución a través de un campo eléctrico. Este método es de amplia

aplicación en la biología molecular, especialmente en la purificación y caracterización

de proteínas. La velocidad de migración o movilidad electroforética de las moléculas en

el campo eléctrico depende de su intensidad, del tamaño, forma y carga de las proteínas,

y también de la fuerza iónica y temperatura del medio en que se desplazan.

Actualmente, el soporte más frecuentemente utilizado para separa

electroforéticamente proteínas, es el gel de poliacrilamida. Estos geles se forman por la

polimerización de largas cadenas de monómeros de acrilamida unidas covalentemente

en presencia de bisacrilamida que actúa como agente entrecruzador. La polimerización

se inicia por la presencia de radicales libres que se forman al reaccionar el persulfato de

amonio (APS) con el catalizador N,N,N’,N’-tretametiletilenodiamida (TEMED).

3.13.4.- Geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE). Fundamento. Inicialmente, el sistema fue desarrollado por Laemmli (1970) y modificado por

Thomas y Koemberg (1978). En este tipo de electroforesis tanto el soporte (gel) como el

tampón de electroforesis tienen entre otros componentes al sodio dodecilsulfato (SDS)

como agente tensioactivo. Por otro lado, las proteínas se mezclan con tampón de

muestra, uniéndose al detergente aniónico SDS. Finalmente, todas las proteínas

desnaturalizadas se encuentran solubilizadas y cargadas negativamente por la unión del

SDS, la cantidad de SDS que se asocia a una proteína es aproximadamente proporcional

a su tamaño o mejor dicho a su peso molecular. Así, este método electroforético permite

estimar el peso molecular aparente (MWap) de una proteína en forma relativa al peso

molecular y movilidad electroforética de las proteínas estándares.

Material y reactivos.

- Tampón de carga: para 20 ml de LSBx3 1ml de tris-HCl 1,5 M (pH 6,8) 12 ml de glicerol 1,2 g de SDS 4 ml de H2Od


68

Antes de utilizar se agregó 23 mg de DTT/0,5 ml de LSBx3 (calentando a 100º C para disolver el DTT)

- Tampón de electroforesis: para 500 ml 1,53 g de trizma base 7,2 g de glicina 0,5 g de SDS - Tampón de transferencia: para 2 l 7,88 g de tris-HCl 28,52 g de glicina 400 ml de metanol - Tampón de lavado: para 2 l 1,48 g de tris-HCl 5,84 g de NaCl - Tampón de bloqueo: Tampón de lavado con 5% de leche en polvo sin grasas. - Gel apilador o concentrador (Stacking):

325 µl de Acrilamida 30% - Bisacrilamida 0,8% 625 µl de Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 1,52 ml de H2Od 25 µl de SDS al 10% 12,5 µl de APS al 10% 2,5 µl de TEMED - Gel separador (Resolving) al 12 %: 4 ml de Acrilamida 30% - Bisacrilamida 0,8% 2,5 ml de Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 3,5 ml de H2Od 100 µl de SDS al 10% 33,3 µl de APS al 10% 6,6 µl de TEMED Procedimiento

1) Los geles fueron preparados en lámina (“slab”) para electroforesis vertical de

tipo discontinuo (gel apilador y gel separador). El tamaño del gel fue de

13x12,5 cm (ancho x altura) y con un espesor de 1,5 mm.

2) Las placas, peines y espaciadores fueron lavados en agua, secados y

desengrasados con etanol. Para la electroforesis se utilizaron aparatos y sistemas

comerciales (Hoefer-Biorad).

3) Primero se prepara el gel separador y se vierte entre las placas de vidrio, se deja

reposar en posición vertical hasta que polimerice. El oxígeno es un inhibidor de


69

la polimerización, por está razón se añade suavemente agua, lo suficiente para

cubrir el gel. Cuando el gel polimeriza (15 minutos aprox.) se vierte el agua.

Después se añadió el gel apilador y se inserta el peine para formar los pozos,

quedando que no queden burbujas de aire atrapadas, se deja polimerizar durante

5-10 minutos. Se retira el peine y se lavan los pozos con tampón de

electroforesis.

4) Los lisados de proteínas fueron llevados a volúmenes de 10 µl con tampón de

lisis con concentraciones de 25 µg de proteínas para el músculo rojo y 50 µg

para músculo blanco, después se les añadió 5 µl de tampón de carga. El tampón

de carga tiene dos funciones, por un lado desnaturaliza las proteínas, y por otro

apantalla las proteínas cargándolas negativamente (el SDS se une a los dominios

hidrofóbicos formando micelas aniónicas). Finalmente, las proteínas se terminan

de desnaturalizar a 100 ºC durante 5 minutos; de está forma las proteínas

oligoméricas son desmontadas en subunidades monoméricas

5) Las muestras fueron cargadas en el gel y se realizó la electroforesis a 125 V

durante 90 minutos con el tampón de electroforesis.

3.13.5.- Detección con anticuerpos (“western-blot”). Fundamento. La electrotransferencia de proteínas desde un gel a una membrana se conoce

como “Western-blotting”. Este método combina la capacidad de resolución de la

separación de las proteínas con la especificidad de la identificación inmunológica. Estas

características hacen del western-blot un método rápido y altamente sensible. Para

conseguir resultados óptimos, las proteínas deben ser transferidas de manera eficiente

desde el gel a la membrana. Diferentes tipos de membranas se han utilizado como

soporte para inmovilizar proteínas; sin embargo, las ampliamente utilizadas son las

membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF), nitrocelulosa (NC) y nylon.

El reconocimiento específico con una fuerte afinidad de unión entre el antígeno

(proteína inmovilizada) y el anticuerpo es la base de la técnica. La proteína blanco es

localizada por anticuerpo policlonal o monoclonal específico. Después, un anticuerpo

secundario reconoce al anticuerpo primario. El anticuerpo secundario debe de ser

especie-específico, y contiene la marca para producir la imagen visual final.


70

Material y reactivos.

- Tampón de transferencia: para 2 l 7,88 g de tris-HCl 28,52 g de glicina 400 ml de metanol - Tampón de lavado: para 2 l 1,48 g de tris-HCl 5,84 g de NaCl Antes de utilizar se agregó a la solución Tween20 hasta llegar a una

concentración final de 0,1% de Tween20.

- Tampón de bloqueo: Tampón de lavado con 5% de leche desnatada - Anticuerpo primario btGLUT4 dilución 1:500 en tampón de bloqueo - ECL™ Western Blotting System (Amersham, ref. RPN2108)

Procedimiento

1) Finalizada la electroforesis se montó el sistema para transferir las proteínas del

gel a la membrana; para ello se realizaron los siguientes pasos:

2) Sobre uno de los soportes, se coloco un estropajo humedecido con el tampón de

transferencia.

3) Se colocó 1 hoja de Whatman 3MM empapada con tampón de transferencia.

4) Se cubrió con una membrana de PVDF (previamente hidratada con metanol y

lavada con tampón de transferencia).

5) Sobre la membrana se colocó el gel que previamente fue hidratado con tampón

de transferencia (evitando la formación de burbujas entre la membrana y el gel).

6) Se cubrió el gel con otra hoja de papel Whatman y otro estropajo humedecidos

con tampón de transferencia formando de está manera el “sandwich” y que se

montó en el equipo de transferencia.

7) La transferencia fue llevada a cabo en una cámara fría (4 ºC) con agitación

magnética a 0,1 amperios (constante) durante toda una noche.

8) Se desmonto el sándwich. Se marcaron los pozos para la identificación de los

carriles de la muestras y la membrana fue incubada en el tampón de bloqueo a

temperatura ambiente durante 2 horas.


71

9) La membrana fue incubada en agitación en un falcón con 5 ml del anticuerpo

primario btGLUT4 durante 2 horas y media.

10) Se lavó la membrana 3 veces con tampón de lavado durante 10 minutos.

11) Después se incubó la membrana en agitación en un falcón con 5 ml de

anticuerpo secundario anti-IgG para conejo conjugada con peroxidasa durante 1

hora.

12) Se lavó la membrana 3 veces con tampón de lavado durante 10 minutos.

13) La detección de la proteína fue realizada por quimioluminiscencia. Tras la

incubación de la membrana con los reactivos del ECL durante 1 minuto.

14) La membrana después de la incubación con el ECL fue expuesta a una película

fotográfica (X-OMAT AR Kodak) en una cámara oscura, y el film revelado

dependiendo de la intensidad de la marca, para la posterior identificación y

cuantificación densitométrica de las bandas correspondientes al transportador

GLUT4 utilizando el programa TOTAL LAB.

15) En la misma membrana se realizó un segundo western-blot de actina, para la

normalización de los valores de proteína del transportador de glucosa, realizando

los siguientes pasos:

16) Después de acabar con el western de GLUT4, la membrana fue lavada 3 veces

en agitación con tampón de lavado durante 5 minutos.

17) Se lavó la membrana a 4 ºC en agitación con tampón de lavado durante toda una

noche.

18) La membrana fue incubada en tampón de bloqueo a temperatura ambiente

durante 1 hora y se realizaron 3 lavados en agitación de 5 minutos con tampón

de lavado.

19) Durante 1 hora en agitación se incubó la membrana con el anticuerpo primario

de actina (JAL-20) dilución 1:20000 en tampón de lavado y se realizaron 3

lavados en agitación con tampón de lavado de 5 minutos.

20) Después se incubó la membrana con el anticuerpo secundario anti-IgM dilución

1:20000 en tampón de lavado durante 1 hora, la membrana fue lavada 3 veces en

agitación con tampón de lavado durante 5 minutos y se procedió a la incubación

con los reactivos del ECL y a la exposición de las películas de forma similar a la

detección y cuantificación del GLUT4.


72

3.15. Análisis estadístico.

Todos los análisis se realizaron en el programa estadístico SPPS 11.5.1. Las

diferencias significativas entre grupos se calcularon mediante las pruebas T-Student y

Students Newman-Keuls, considerando una significancia a p< 0,05. En algunos casos

se realizó la prueba ANOVA HSD Tukey (realizando previamente una prueba de

homogeneidad de varianzas). En el caso de que no hubo homogeneidad de varianzas, se

realizó la prueba ANOVA Games-Howell, en ambos casos a niveles de significancia de

p< 0,05.

4.- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Rojas, P. C. Bloque experimental I: Resultados y discusión

75

4.1.- BLOQUE I: Efectos de dietas con diferentes perfiles de

aminoácidos en trucha arco iris y dorada.

Este bloque experimental formó parte de la primera etapa de un proyecto

multidisciplinario, cuyo objetivo principal fue el de evaluar el uso en la dieta de

proteínas de origen vegetal en el cultivo de dos especies carnívoras, la trucha arco iris y

la dorada. En peces carnívoros en cultivo existe mucha información sobre el efecto de

los componentes principales de la dieta sobre el crecimiento de los animales, pero eran

escasos los estudios sobre el efecto de la composición de aminoácidos de la dieta y en

concreto de dietas que contienen proteína de origen vegetal.

En el presente bloque experimental tanto en trucha arco iris (T) como en dorada

(D), los animales fueron alimentados con 4 dietas experimentales durante 12 semanas

(punto 3.1.1). Las dietas TM y DM basadas en los perfiles de aminoácidos esenciales

del músculo (M) y las dietas TC y DC diseñadas a partir del perfil de aminoácido

esencial corporal (C) de cada especie, estas dietas fueron elaboradas con la finalidad

observar si la dieta del perfil de aminoácidos del músculo, puede mejorar el crecimiento

de los peces respecto a animales alimentados con una dieta basada en el perfil corporal

de aminoácidos esenciales. Las dietas TMGlu, TCGlu, DMGlu y DCGlu fueron

diseñadas para evaluar los efectos sobre el crecimiento de la variación del balance entre

aminoácidos esenciales (IAA) y aminoácidos no esenciales (DAA) de la dieta (relación

IAA/DAA), debido al incremento del aminoácido no esencial ácido glutámico (Glu) en

estas dietas.

En ambas especies, además de los parámetros de crecimientos analizados en los

animales alimentados con las distintas las dietas, también se evaluó los efectos de estas

dietas sobre los niveles plasmáticos postprandiales de glucosa, insulina y glucagón, así

como, la respuesta de los receptores de insulina e IGF-I a los tratamientos con dichas

dietas (puntos 3.4, 3.6, 3.7 y 3.9). En truchas arco iris y doradas alimentadas con las

dietas TM, TMGlu y DM, DMGlu respectivamente, también se evaluaron los cambios

de los niveles de glucosa, insulina y glucagón en plasma tras una alimentación forzada

con la dieta correspondiente en una cantidad del 1% del peso corporal del pez a lo largo

de distintos períodos de tiempo de la post ingesta del alimento (1, 3, 6, 12 y 24 horas).

Bloque experimental I: Resultados y discusión Rojas, P. C.

76

4.1.1.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en trucha arco iris. Las diferentes dietas experimentales utilizadas en trucha arco iris durante 12

semanas, no provocaron efectos significativos en el peso corporal final ni en la tasa de

crecimiento específico de los animales. En comparación con las otras dietas, los peces

alimentados con la dieta TMGlu presentaron valores inferiores del índice

hepatosomático que los grupos de las dietas TM y TC; además, los peces del grupo

TMGlu consumieron una mayor cantidad de alimento. Los peces alimentados con la

dieta TMGlu basada en los perfiles de aminoácidos del músculo y suplementada con

DAA, presentaron una menor tasa de conversión alimenticia y menor tasa de eficiencia

proteica. (Tabla 4.1.1).

Tabla 4.1.1.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las truchas arco iris alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

TM TMGlu TC TCGlu

Peso corporal inicial (g) 14,1 ± 0,04 14,1 ± 0 ,03 14,1 + 0,05 14,1 ± 0,06

Peso corporal final (g) 110,0 ± 2,0 100,1 ± 3,9 110,1 ± 8,1 103,6 ± 2,5

Índice Hepatosomático 1,87 ± 0,16a 1,42 ± 0,07b 1,87 ± 0,11a 1,84 ± 0,10ab

Tasa de crecimiento específico (%) 2,54 ± 0,02 2,42 ± 0,05 2,53 ± 0,09 2,46 ± 0,03

Tasa de conversión alimenticia 1,00 ± 0,02a 0,91 ± 0,02b 1,00 ± 0,05a 1,02 ± 0,02a

Tasa de eficiencia proteica 2,22 ± 0,04a 1,97 ± 0,05b 2,28 ± 0,11a 2,30 ± 0,05a

Los datos son medias (n=3) ± E.S. Tasa de crecimiento específico = [100 x [Ln(peso final corporal) - Ln(peso inicial corporal)]]/días Tasa de conversión alimenticia = peso húmedo ganado / peso de alimento seco ingerido Tasa de eficiencia proteíca = peso húmedo ganado / peso neto de proteínas ingeridas Índice Hepatosomático = 100 x (peso del hígado) / (peso corporal) a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos (p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


77

La composición corporal de los peces al final del experimento, las ganancias

diarias de nitrógeno, lípidos y la eficiencia de la retención de proteínas y lípidos se

muestran en la tabla 4.1.2. La composición química corporal de los peces y las

ganancias diarias entre dietas no fueron significativamente diferentes, excepto en la

dieta TMGlu que presentó una menor tasa de retención de proteínas y lípidos. Los

niveles de excreción de amonio de los animales alimentados con la dieta TMGlu fueron

significativamente superiores a los registrados con las otras dietas experimentales.

Tabla 4.1.2.- Composición corporal y utilización de nutrientes de trucha arco iris alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

TM TMGlu TC TCGlu

Composición corporal (% ó kJ/g peso húmedo) Agua 68,1 ± 0,5 68,0 ± 0,5 67,8 ± 0,6 68,1 ± 0,6

Proteínas 16,5 ± 0,4 16,4 ± 0,3 16,6 ± 0,2 16,3 ± 0,5

Lípidos 12,3 ± 0,4 12,5 ± 0,8 12,5 ± 0,6 12,4 ± 1,0

Ganancia (/g peso corporal/día)

Nitrógeno (mg) 483,6 ± 10,9 467,3 ± 12,1 489,8 ± 13,8 467,3 ± 17,1

Lípidos (g) 2,3 ± 0,1 2,3 ± 0,2 2,4 ± 0,1 2,3 ± 0,2

Retención (% crudo ingerido)

Proteínas 37,1 ± 0,9 a 32,9 ± 1,6 b 38,5 ± 2,1a 37,8 ± 2,3 a

Lípidos 83,0 ± 2,0 a 73,6 ± 3,7 b 83,4 ± 5,8 a 83,9 ± 5,9 a

Excreción (mg/kg/24 horas)

Amonio 308 ± 71 a 517 ± 72 b 243 ± 34 a 293 ± 38 a

Los datos son medias (n=3) ± E.S. Composición corporal de los peces al inicio del experimento: Agua 73,5 %; Proteínas 15,03 %; Lípidos 8,89 %. a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


78

4.1.2.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la trucha arco iris. En todos los grupos experimentales, los niveles plasmáticos de glucosa

sanguínea a las 6 horas de la ingesta fueron superiores a los registrados a las 24 horas.

Los valores de glucosa en plasma de los peces alimentados con las diferentes dietas

estuvieron comprendidos entre 96,7 ± 2,4 y 113,3 ± 6,0 mg/dl a las 6 horas y de

70,0 ± 5,1 a 74,7 ± 2,7 mg/dl a las 24 horas de la ingesta. Los niveles plasmáticos de

glucosa en ambos puntos del muestreo postprandial no mostraron diferencias

significativas entre dietas (Figura 4.1.1).

Figura 4.1.1.- Niveles plasmáticos de glucosa sanguínea de trucha arco iris a las 6 y 24 horas de la ingesta. No existen diferencias significativas en los valores de glucosa en plasma entre dietas. El asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

Los niveles de insulina a 24 horas post ingesta, variaron dentro del rango de 19,3

± 2,3 a 21,4 ± 1,5 ng/ml siendo por lo tanto muy similares entre grupos alimentados con

las diferentes dietas. A las 6 horas de la ingesta del alimento, se observaron valores

elevados de insulina (27,5 ± 1,5 a 31,9 ± 0,7 ng/ml), que fueron superiores en cerca del

30 % con respecto a los niveles a las 24 horas. La insulina circulante de los animales

alimentados con las dieta TMGlu y TCGlu (menor relación entre IAA/DAA), fueron

inferiores a los de los peces de las dietas TM y TC respectivamente, aunque la

diferencia solo fue significativa para la dieta TMGlu (Figura 4.1.2).

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

TM TMGlu TC TCGlu TM TMGlu TC TCGlu

* ** *


79

Figura 4.1.2.- Niveles de insulina plasmática de truchas arco iris alimentadas con las dietas experimentales. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas y el asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

Los niveles de glucagón en plasma a las 24 horas de la ingesta, oscilaron en el

rango de 0,6 ± 0,1 a 0,7 ± 0,1 ng/ml y fueron similares entre los diferentes grupos

experimentales. A las 6 horas de la ingesta, los peces alimentados con las dietas TC y

TCGlu, tuvieron valores de glucagón plasmáticos más altos que los grupos de las dietas

TM y TMGlu, aunque la diferencia solo fue significativa entre los grupos de la dieta

TM (0,6 ± 0,1 ng/ml) y TCGlu (1,0 ± 0,1 ng/ml). Los valores de glucagón en plasma

sanguíneo a las 6 horas fueron superiores a los valores encontrados a las 24 horas en los

grupos de las dietas TC y TCGlu (Figura 4.1.3).

Figura 4.1.3.- Valores de glucagón en el plasma sanguíneo de las truchas arco iris alimentadas con las dietas experimentales. a,b,c Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas y el asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

*a*b

*a *ab

0

5

10

1520

2530

35

40

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

TM TMGlu TC TCGlu

*a*b

*a *ab

0

5

10

1520

2530

35

40

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)


c

bc

*ab

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*ab

TM TMGlu TC TCGlu

c

bc

*ab

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*ab



80

4.1.3.- Caracterización de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco de trucha arco iris.

Los distintos parámetros de caracterización de los receptores de insulina del

músculo blanco de trucha, no presentaron diferencias significativas entre las dietas

experimentales. La constante de disociación de los receptores de insulina varió entre

0,11 ± 0,02 y 0,34 ± 0,10 nM. El número de receptores osciló en el rango de los

22,3 ± 10,1 a 59,1 ± 17,6 fmol/mg de glucoproteína (Tabla 4.1.3). La unión de la

hormona a su receptor (binding) específico de insulina fue similar entre los diferentes

grupos de animales alimentados con las dietas experimentales. Aunque las diferencias

no fueron significativas en las que se observó una tendencia a que el binding fuera más

alto en las dietas Glu, los valores del binding de insulina estuvieron en el rango de 1,2 ±

0,3 a 2,3 ± 0,5 % para 20 µg de glucoproteína (Figura 4.1.4).

El valor promedio del binding específico del IGF-I fue superior al nivel del

binding de insulina en todos los grupos de animales (Figura 4.1.4). La constante de

disociación de los receptores de IGF-I fue de 0,05 ± 0,02 a 0,24 ± 0,08 nM y no se

encontraron diferencias significativas entre dietas. En el binding de IGF-I tampoco se

observaron diferencias significativas entre dietas (valores entre 2,5 ± 0,6 y 3,5 ± 1,2 %

para 20 µg de glucoproteína). El número de receptores de IGF-I varió entre los 29,9 ±

10,7 y 72,0 ± 4,6 fmol/mg de glucoproteína. Los animales de la dieta TM presentaron

un mayor número de receptores de IGF-I que las otras dietas, siendo está diferencia

significativa solo con los grupos de las dietas TMGlu y TCGlu (Tabla 4.1.3).

Tabla 4.1.3.- Características de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo blanco de trucha arco iris alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

Kd, Constante de disociación (nM); Ro, Número de receptores (fmol/mg de glucoproteína) No existen diferencias significativas entre dietas a p<0,05 (prueba T-Student). a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas

Kd INS 0,34 ± 0,10 0,11 ± 0,02 0,12 ± 0,07 0,15 ± 0,09

Kd IGF-1 0,24 ± 0,08 0,06 ± 0,02 0,10 ± 0,04 0,05 ± 0,02

Ro INS 59,1 ± 17,6 25,3 ± 2,5 22,3 ± 10,1 38,8 ± 5,5

Ro IGF-1 72,0 ± 4,6a 29,9 ± 10,7b 32,0 ± 12,8ab 41,5 ± 5,5b

TM TMGlu TC TCGlu


81

Figura 4.1.4.- Binding específico de los receptores de insulina (A) e IGF-I (B) del músculo blanco de trucha arco iris. No existen diferencias significativas entre dietas a p<0,05 (prueba T-Student).

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

24 Horas0

1

2

3

4

5 INSULINA(A)

IGF-1

0

1

2

3

4

5

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

24 Horas

(B)

TM TMGlu TC TCGlu

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

24 Horas0

1

2

3

4

5 INSULINA(A)

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

24 Horas0

1

2

3

4

5 INSULINA(A)

IGF-1

0

1

2

3

4

5

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

24 Horas

(B)IGF-1

0

1

2

3

4

5

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

24 Horas

(B)



82

4.1.4.- Efecto de la alimentación forzada sobre los niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la trucha arco iris. Durante la alimentación forzada de trucha, los niveles de glucosa plasmáticos

alcanzaron los valores máximos de 241,1 ± 21,2 mg/dl (dieta TM) y 239,4 ± 12,1 mg/dl

(dieta TMGlu) a una hora después de la ingestión del alimento. Estos incrementos

significativos observados a lo largo del período post prandial, fueron disminuyendo de

forma paulatina hasta llegar a alcanzar los niveles basales de glucosa en plasma (24

horas). Los valores de glucosa en plasma en la alimentación forzada, fueron

significativamente superiores a los valores encontrados en la administración normal de

las dietas tanto a las 6 horas como a las 24 horas de la ingesta (Figura 4.1.5).

Figura 4.1.5.- Valores de glucosa en plasma sanguíneo de trucha arco iris en el experimento de alimentación forzada con las dietas TM (■) y TMGlu (▲). Niveles de glucosa en animales con administración normal con las dietas TM (□) y TMGlu (△). a,b,c Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre animales alimentados con la misma dieta a p<0,05 (prueba HSD Tukey, ANOVA) y (‡) indica diferencias significativas entre el postprandial normal y la alimentación forzada de animales alimentados con una misma dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

0

50

100

150

200

250

300

1 3 6 12 24Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

TM TMGlu TM TMGlu

a

aab

a

b

aaba

cbc

‡ ‡

‡‡

0

50

100

150

200

250

300

1 3 6 12 24Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

TM TMGlu TM TMGluTMTM TMGluTMGlu TMTM TMGluTMGlu

a

aab

a

b

aaba

cbc

‡ ‡

‡‡


83

La insulina plasmática mostró el mismo perfil de respuesta a lo largo del período

postprandial en los peces alimentados con las dos dietas. Sin embargo, los animales

alimentados con la dieta TM presentaron niveles más altos de insulina en plasma que el

grupo de la dieta TMglu, siendo está diferencia significativa a las 12 y 24 horas del

inicio del experimento. Los valores más altos de insulina fueron observados a las 6

horas de la ingesta con 27,8 ± 2,3 ng/ml para la dieta TM y 22,4 ± 1,2 ng/ml para el

grupo de la dieta TMGlu. En ambas dietas, la insulina en plasma de este tratamiento,

solo fue significativamente inferior al observado en el postpandrial de alimentación

normal en el grupo de la dieta TMGlu a las 6 horas de la post ingesta (Figura 4.1.6).

Figura 4.1.6.- Niveles del insulina en el plasma de trucha arco iris en el experimento de alimentación forzada con las dietas TM (■) y TMGlu (▲). Valores de insulina en animales con administración normal con las dietas TM (□) y TMGlu (△). a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre animales alimentados con la misma dieta a p<0,05 (prueba HSD Tukey, ANOVA). El asterisco indica diferencias significativas entre animales alimentados con dieta diferente a la misma hora en la alimentación forzada y (‡) indica diferencias significativas entre el postprandial normal y la alimentación forzada de animales alimentados con una misma dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

0

5

10

15

20

25

30

35

1 3 6 12 24

Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

bb

aab

b

TM TMGlu TM TMGlu

**

‡

0

5

10

15

20

25

30

35

1 3 6 12 24

Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

bb

aab

b

TM TMGlu TM TMGlu

**

0

5

10

15

20

25

30

35

1 3 6 12 24

Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

bb

aab

b


**

‡


84

En los niveles plasmáticos de glucagón para el grupo la dieta TM, no se

observaron diferencias significativas a lo largo del tiempo, el glucagón en plasma osciló

entre 1,35 ± 0,17 y 1,58 ± 0,06 ng/ml. Los valores de glucagón en plasma de los

animales alimentados con la dieta TMGlu, estuvieron en el rango de 1,08 ± 0,09 a

1,50 ± 0,08 ng/ml. El glucagón mostró perfiles algo distintos para las dos dietas, pero no

se observaron diferencias entre dietas a lo largo del período postprandial, excepto a las

24 horas donde el glucagón plasmático del grupo de la dieta TM fue superior al de los

animales de la dieta TMGlu. En ambos casos, los niveles de glucagón fueron más altos

en comparación con los valores observados en los animales en los que se administro el

alimento de forma normal (Figura 4.1.7).

Figura 4.1.7.- Valores de glucagón plasmático en trucha arco iris en el experimento de alimentación forzada con las dietas TM (■) y TMGlu (▲). Niveles de glucagón en animales con administración normal con las dietas TM (□) y TMGlu (△). a,b,c Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre animales alimentados con la misma dieta a p<0,05 (prueba Games-Howell, ANOVA). El asterisco indica diferencias significativas entre animales alimentados con dieta diferente a la misma hora en la alimentación forzada y (‡) indica diferencias significativas entre el postprandial normal y la alimentación forzada de animales alimentados con una misma dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

TM TMGlu TM TMGlu

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

1 3 6 12 24

Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*a

ab abab b

‡‡ ‡

‡

TM TMGlu TM TMGlu

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

1 3 6 12 24

Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*a

ab abab b


00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

1 3 6 12 24

Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

1 3 6 12 24

Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*a

ab abab b

‡‡ ‡

‡


85

4.1.5.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en dorada. Las doradas alimentadas con dietas basadas en los perfiles de aminoácidos de la

composición corporal y de músculo no mostraron diferencias significativas en el peso

corporal final de los animales. Los peces alimentados con las dietas del perfil de

aminoácidos corporales, presentaron valores mayores del índice hepatosomático que los

peces de las dietas del perfil del músculo, especialmente los del grupo de la dieta

DMGlu. La tasa de crecimiento específico y la tasa de eficiencia proteica no fueron

diferentes entre dietas; sin embargo, la tasa de conversión alimenticia de los peces

alimentados con la dieta DM fue significativamente superior al grupo de la dieta

DCGlu. (Tabla 4.1.4).

Tabla 4.1.4.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las dorada alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

DM DMGlu DC DCGlu

Peso corporal inicial (g) 14,7 ± 0,16 14,7 ± 0,02 14,6 + 0,09 14,1 ± 0,11

Peso corporal final (g) 74,9 ± 0,67 70,9 ± 1,37 72,9 ± 1,35 70,9 ± 1,24

Índice Hepatosomático 1,36 ± 0,04bc 1,20 ± 0,06c 1,54 ± 0,04a 1,50 ± 0,10ab

Tasa de crecimiento específico (%) 1,98 ± 0,003 1,91 ± 0,002 1,96 ± 0,03 1,90 ± 0,02

Tasa de conversión alimenticia 0,85 ± 0,02a 0,79 ± 0,06ab 0,82 ± 0,02ab 0,76 ± 0,05b

Tasa de eficiencia proteica 1,61 ± 0,03 1,51 ± 0,08 1,59 ± 0,03 1,50 ± 0,05

Los datos son medias (n=3) ± desviación estándar Tasa de crecimiento específico = [100x[Ln(peso final corporal)-Ln(peso inicial corporal)]]/días Tasa de conversión alimenticia = peso húmedo ganado/ peso de alimento seco ingerido Tasa de eficiencia proteica = peso húmedo ganado/ peso neto de proteínas ingeridas Índice Hepatosomático = 100 x (peso del hígado) / (peso corporal) a,b,c Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


86

En la dorada, la ganancia de nitrógeno no varió significativamente entre los

peces alimentados con las diferentes dietas experimentales. Los animales alimentados

con la dieta DMGlu presentaron los porcentajes más bajos de retención de lípidos en

comparación con las otras dietas y la retención de proteínas fue ligeramente mayor en

las dietas DM y DC. Los niveles de excreción de amonio de los animales alimentados

con la dieta DMGlu fueron significativamente superiores a los registrados con las otras

dietas experimentales (Tabla 4.1.5).

Tabla 4.1.5.- Composición corporal y utilización de nutrientes de las doradas alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

DM DMGlu DC DCGlu

Composición corporal (% peso húmedo) Agua 67,1 ± 0,2 67,4 ± 0,1 66,9 ± 0,2 66,9 ± 0,3

Proteínas 16,2 ± 0,3b 17,1 ± 0,3 a 16,4 ± 0,1b 15,9 ± 0,2b

Lípidos 11,8 ± 0,2 10,7 ± 0,2 11,5 ± 0,3 11,7 ± 0,4


Nitrógeno (mg) 409,4 ± 0,8 416,1 ± 2,9 398,3 ± 4,6 369,8 ± 13,8

Lípidos (g) 1,6 ± 0,2 1,5 ± 0,1 1,7 ± 0,1 1,72 ± 0,2


Proteínas 27,4 ± 0,6a 25,2 ± 1,6ab 26,5 ± 0,4ab 24,3 ± 0,7b

Lípidos 65,5 ± 0,7a 48,3 ± 3,1b 61,1 ± 2,9a 60,0 ± 1,6a


Amonio 811 ± 33b 953 ± 12a 759 ± 45b 792 ± 53b

Composición corporal de los peces al inicio del experimento: Agua 68,82 %; Proteínas 14,96 %; Lípidos 11,12 %. Los datos son medias (n=3) ± E.S. a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


87

4.1.6.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la dorada. Los niveles de glucosa fueron más altos a las 6 horas que a las 24 horas, siendo

está diferencia significativa en las dietas Glu. En las doradas alimentadas con la dieta

DMGlu, el valor de glucosa a las 6 horas de la ingesta fue inferior al registrado para las

otras dietas. A las 24 horas, no se observaron diferencias en los diferentes grupos y la

glucosa basal osciló entre los 38,1± 2,2 y 43,6 ± 2,6 ng/ml (Figura 4.1.8).

Figura 4.1.8.- Niveles plasmáticos de glucosa de las doradas alimentadas con las dietas experimentales. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas y asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

Los niveles de insulina plasmática a las 24 horas post ingesta fueron similares

entre los grupos de peces alimentados con las diferentes dietas; y los valores estuvieron

comprendidos entre 5,6 ± 0,3 y 6,2 ± 0,6 ng/ml (Figura 4.1.9). El incremento de la

insulina postprandial (6h) con relación al basal (24h) fue más pronunciado que el

observado en trucha. Los niveles de insulina a las 6 horas fueron hasta dos veces

superiores a los encontrados a las 24 horas en está especie (valores entre 13,8 ± 0,5 y

16,1 ± 0,5 ng/ml). Los niveles de insulina en los grupos alimentados con las dietas DM

y DC fueron mayores a los de las dietas DMGlu y DCGlu.

DM DMGlu DC DCGlu

ab ab*b

*a

0

20

40

60

80

100

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

DM DMGlu DC DCGluDM DMGlu DC DCGlu

ab ab*b

*a

0

20

40

60

80

100

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)


88

Figura 4.1.9.- Niveles de insulina plasmática de doradas alimentadas con las dietas experimentales. a,b,c Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas y asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

Los valores basales (a las 24 h) de glucagón fueron similares entre grupos y

oscilaron en el rango de 2,1 ± 0,4 a 2,6 ± 0,4 ng/ml. Los niveles circulantes de glucagón

a las 6 horas post ingesta muestran la tendencia inversa a los observados en trucha; así,

los animales alimentados con las dietas DC y DCGlu presentaron valores inferiores de

glucagón que los peces alimentados con las dietas DM y DMGlu, aunque la diferencia

solo fue significativa entre las dietas DM y DCGlu. El glucagón en plasma a las 6 horas

fue aproximadamente tres veces superior al de 24 horas (Figura 4.1.10). Los niveles de

glucagón en plasma fueron más altos que en trucha, en ambos puntos del muestreo

postprandial.

Figura 4.1.10.- Valores de glucagón en el plasma sanguíneo de las doradas alimentadas con las dietas experimentales. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas y asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

*a *

bc*ac

*b

0

4

8

12

16

20

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

DM DMGlu DC DCGlu

*a *

bc*ac

*b

0

4

8

12

16

20

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)


*a *

ab*b

0123456789

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l) *ab

DM DMGlu DC DCGlu

*a *

ab*b

0123456789

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l) *ab



89

4.1.7.- Caracterización de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco de doradas.

La constante de disociación y el número de los receptores de insulina en el

músculo blanco, no mostraron diferencias significativas entre las dietas experimentales.

En todos los grupos se observó una elevada variabilidad en estos parámetros. A las 6

horas de la ingesta, la constante de disociación de los receptores de insulina varió entre

los 0,15 ± 0,05 y 0,29 ± 0,05 nM, y el número de receptores fue de 70,5 ± 6,7 a 129,2 ±

18,6 fmol/mg de proteína. La constante de disociación del receptor de insulina a las 24

horas postprandial fue de 0,08 ± 0,03 a 0,38 ± 0,10 nM, el número de receptores de

insulina varió entre los 34,8 ± 6,7 y 124,5 ± 36,1 fmol/mg de glucoproteína (Tabla

4.1.6). Independientemente de la hora de la ingesta (6 y 24 horas), la unión de la

hormona a su receptor (binding) específico no mostró diferencias entre dietas, y los

valores del binding estuvieron entre los 2,7 ± 1,1 y 5,1 ± 0,5 % para 20 µg de

glucoproteína (Figura 4.1.11).

Tabla 4.1.6.- Características de los receptores de insulina en el músculo blanco de doradas alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

Kd, Constante de disociación (nM); Ro, Número de receptores (fmol/mg de glucoproteína) No existen diferencias significativas entre dietas a p<0,05 (prueba T-Student).

En los receptores de IGF-I, la constante de disociación del receptor de IGF-I fue

menor al de los receptores de insulina, la Kd del IGF-I estuvo en el rango de 0,01

± 0,00 a 0,11 ± 0,07 nM. El número de receptores de IGF-I varió entre los 49,0 ± 9,3 y

137 ± 34,3 fmol/mg de proteína (Tabla 4.1.7). El binding específico de IGF-I fue

similar entre los diferentes grupos de animales alimentados con las dietas

experimentales (valores entre 11,1 ± 1,8 y 13,6 ± 2,2 % para 20 µg de glucoproteína).

DM DMGlu DC DCGlu

Kd INS (6 Horas) 0,15 ± 0,05 0,18 ± 0,09 0,16 ± 0,09 0,29 ± 0,05

Kd INS (24 Horas) 0,08 ± 0,03 0,19 ± 0,07 0,11 ± 0,03 0,38 ± 0,10

Ro INS (6 Horas) 70,5 ± 26,8 107,7 ± 46,6 87,3 ± 37,1 129,2 ± 18,6

Ro INS (24 Horas) 34,8 ± 6,8 101,1 ± 32,9 96,2 ± 34,6 124,5 ± 36,1


90

Los valores del binding específico de los receptores de IGF-I fueron muy

superiores a los observados (del orden de 3 veces más) para los receptores de insulina

(Figura 4.1.11).

Tabla 4.1.7.- Características de los receptores de IGF-I en el músculo blanco de doradas alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

Kd, Constante de disociación (nM); Ro, Número de receptores (fmol/mg de glucoproteína) No existen diferencias significativas entre dietas a p<0,05 (prueba T-Student).

Figura 4.1.11.- Binding específico de los receptores de insulina (A) e IGF-I (B) del músculo blanco de las doradas en el experimento de dietas. No existen diferencias significativas entre dietas a p<0,05 (prueba T-Student).

IGF-1INSULINA

02468

1012141618

6 Horas 24 Horas

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

02468

1012141618

6 Horas 24 Horas

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

(A) (B)

IGF-1INSULINA

02468

1012141618

6 Horas 24 Horas

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

02468

1012141618

6 Horas 24 Horas

% B

sp/2

0 µg

de

prot

eína

(A) (B)


DM DMGlu DC DCGlu

Kd IGF-1 (6 Horas) 0,03 ± 0,01 0,05 ± 0,03 0,03 ± 0,00 0,11 ± 0,08

Kd IGF-1 (24 Horas) 0,07 ± 0,01 0,01 ± 0,00 0,03 ± 0,01 0,07 ± 0,02

Ro IGF-1 (6 Horas) 76,6 ± 20,1 84,2 ± 29,5 73,0 ± 10,9 79,4 ± 15,4

Ro IGF-1 (24 Horas) 115,3 ± 12,5 49,0 ± 9,3 54,6 ± 7,3 138,0 ± 34,3


91

4.1.8.- Efecto de la alimentación forzada sobre los niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la dorada. Los niveles de glucosa plasmática en la dorada a 1 hora tras la ingestión del

alimento fueron de 237,2 ± 11,2 mg/dl para la dieta DM y 225,7 ± 25,3 mg/dl para la

dieta DMGlu; estos valores de glucosa fueron disminuyendo a lo largo del período

postprandial en ambas dietas. Los animales alimentados con la dieta DM presentaron

mayores valores de glucosa que el grupo de la dieta DMGlu (1 y 6 horas). Los valores

de glucosa plasmática registrados en la alimentación forzada fueron superiores a los

observados a las 6 y 24 horas post ingesta de la administración normal de las dietas

(Figura 4.1.12).

Figura 4.1.12.- Niveles de glucosa en plasma de las doradas en el experimento de alimentación forzada con las dietas DM (■) y DMGlu (▲). Valores de glucosa en animales con administración normal con las dietas DM (□) y DMGlu (△). a,b,c Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre animales alimentados con la misma dieta a p<0,05 (prueba HSD Tukey, ANOVA). Asterisco indica diferencias significativas entre animales alimentados con dieta diferente a la misma hora en la alimentación forzada y (‡) indica diferencias significativas entre el postprandial normal y la alimentación forzada de animales alimentados con una misma dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

No se observaron diferencias significativas en los niveles de insulina plasmática

de los peces alimentados con la dieta DM, a lo largo del período postprandial; los

valores de insulina de este grupo estuvieron en el rango de 7,7 ± 0,5 a 11,2 ± 0,6 ng/ml.

Los valores de insulina en plasma de los animales alimentados con la dieta DMGlu,

0

50

100

150

200

250

300

1 3 6 12 24Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

DM DMGlu DM DMGlu

*a ab

c c

aa

b

b b

*b

‡‡

‡ ‡

0

50

100

150

200

250

300

1 3 6 12 24Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

DM DMGlu DM DMGluDM DMGlu DM DMGlu

*a ab

c c

aa

b

b b

*b

‡‡

‡ ‡


92

mostraron un incremento a partir de las 3 horas y se mantuvieron así hasta la 12 horas

de la post ingesta (valores entre 9,6 ± 0,7 y 11,3 ± 0,5). A las 6 horas del postprandial,

la insulina plasmática de la alimentación forzada para ambas dietas, fue

significativamente menor a los valores de insulina encontrados tras la ingesta normal de

las dietas (Figura 4.1.13).

Figura 4.1.13.- Niveles del insulina en plasma de doradas en el experimento de alimentación forzada con las dietas DM (■) y DMGlu (▲). Valores de insulina en animales con administración normal con las dietas DM (□) y DMGlu (△). a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre animales alimentados con la misma dieta a p<0,05 (prueba HSD Tukey, ANOVA). (‡) Indica diferencias significativas entre el postprandial normal y la alimentación forzada de animales alimentados con una misma dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

Los niveles de glucagón plasmático para ambas dietas no presentaron en este

experimento variaciones significativas a lo largo del postprandial. Los valores de

glucagón en plasma de los animales alimentados con la dieta DM, estuvieron en el

rango de 3,5 ± 0,5 a 4,4 ± 0,6 ng/ml. En el grupo de la dieta DMGlu, el glucagón en

plasma osciló entre 3,0 ± 0,5 y 4,5 ± 0,4 ng/ml. En ambas dietas, el glucagón en plasma

a las 6 horas de este tratamiento, fue significativamente inferior al observado en el

postprandial de la administración normal del alimento (Figura 4.1.14).

b

aaaab

0

4

8

12

16

1 3 6 12 24Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

‡

‡

DM DMGlu DM DMGlu

20

b

aaaab

0

4

8

12

16

1 3 6 12 24Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

‡

‡


20


93

Figura 4.1.14.- Valores de glucagón plasmático de las doradas en el experimento de alimentación forzada con las dietas DM (■) y DMGlu (▲). Niveles de glucagón en animales con administración normal con las dietas DM (□) y DMGlu (△). No existen diferencias significativas entre animales alimentados con la misma dieta a p<0,05 (prueba Games-Howell, ANOVA). (‡) Indica diferencias significativas entre el postprandial normal y la alimentación forzada de animales alimentados con una misma dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

0

2

4

6

8

1 3 6 12 24Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

‡‡

DM DMGlu DM DMGlu

0

2

4

6

8

1 3 6 12 24Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

‡‡



94

4.1.9.- Discusión.

En general, las tasas de crecimiento observadas tanto en trucha como en dorada

estuvieron de acuerdo con el crecimiento esperado, según el tamaño y la temperatura de

las condiciones de cultivo (MartiPalanca et al., 1996; Company et al., 1999; Capilla et

al., 2002). Así, aunque las tasas de crecimiento fueron correctas tanto para trucha arco

iris como dorada, no se han encontrado diferencias en el crecimiento de los peces

alimentados entre las dietas que poseían los perfiles de aminoácidos similares a la

composición corporal total o a la del músculo. Por lo tanto, la dieta con el perfil de

aminoácidos del músculo no mejoró el crecimiento de los animales de las 2 especies,

como cabría esperar según la hipótesis preliminar del presente estudio.

Los resultados obtenidos en el crecimiento en ambas especies, mostraron que el

incremento de las cantidades de aminoácidos no esenciales (ácido glutámico) en la

dieta, que afectaron la relación aminoácidos esenciales/no esenciales (IAA/DAA), no

produjo una mejora en el crecimiento de los animales. Incluso la tendencia observada

fue que estos grupos presentaban crecimientos ligeramente inferiores. Por lo tanto, el

aumento del contenido de aminoácidos no esenciales no mejoró el aprovechamiento o la

utilización de los aminoácidos esenciales de la dieta por parte de las especies en la etapa

de crecimiento estudiada.

Diferentes estudios en trucha arco iris con dietas suplementas con algunos

aminoácidos esenciales como lisina o arginina, donde la relación IAA/DAA se vio

incrementada, muestran una mejora en el crecimiento de los animales (Plisetskaya et al.,

1991). Pero parece ser que este incremento en el crecimiento de los animales estaría

más relacionado con la composición y proporciones de los aminoácidos esenciales de la

dieta, como se ha descrito también en dorada (Marcouli et al., 2004), que en la relación

IAA/DAA en sí misma. Estos datos están de acuerdo con la ausencia de diferencias en

el crecimiento entre las dietas de relación de IAA/DAA mayor y las de relación

IAA/DAA menor en ambas especies en el presente experimento, habiendo resultado una

composición de aminoácidos esenciales adecuada para cada especie.


95

La eficiencia de las dietas basadas en los perfiles de aminoácidos corporales y

del músculo en trucha, es similar si consideramos el peso corporal final y la tasa de

crecimiento específico de los peces. Sin embargo, la dieta TMGlu tuvo un efecto

negativo sobre la utilización de proteínas y la tasa conversión alimenticia, a pesar de

que se observó un aumento en la cantidad de alimento ingerido. Esta baja eficiencia

podría ser debida a que está dieta estuvo compuesta por un alto contenido de harina de

soja (331g/Kg), que contiene factores antinutricionales que afectarían el

aprovechamiento del alimento (Francis et al., 2001; Kaushik et al., 1995). Si este efecto

negativo fue por consecuencia de la relación IAA/DAA, este hubiera sido más

pronunciado en la dieta TCGlu (basada en los perfiles de aminoácidos corporales),

porque posee una relación IAA/DAA menor. Sin embargo, en dorada los animales

alimentados con la dieta DMGlu, no mostraron diferencias significativas en los distintos

parámetros de crecimiento respecto a los registrados en los peces alimentados con las

otras dietas experimentales. Teniendo en cuenta el alto contenido de harina de soja de la

dieta DMGlu, similar en proporción al de la dieta TMGlu, podemos sugerir que en

trucha existe una sensibilidad mayor a los factores antinutricionales de la harina de soja

que en dorada.

Las dietas experimentales utilizadas en ambas especies tuvieron un efecto

diferencial sobre la excreción de nitrógeno. En trucha, la excreción de amonio del grupo

TMGlu fue aproximadamente dos veces superior a los valores registrados para las otras

dietas. En dorada, la excreción de amonio en el grupo DMGlu fue superior en un 20% a

los niveles de excreción registrados para las otras dietas. Estudios previos en trucha arco

iris (Medale et al., 1998), nos indican que estos incrementos en la excreción de

nitrógeno de ambas especies, serían producto del aumento en el catabolismo de las

proteínas (Martin et al, 2003), debido muy probablemente al alto porcentaje de soja

presente en las dietas TMGlu y DMGlu. Aunque en algunos casos, el aumento del ácido

glutámico en la dieta también podría ser un factor del incremento de la excreción de

amonio de los animales. Ello podría ser debido a que por una serie de transformaciones,

el ácido glutámico puede ser utilizado como sustrato para la formación endógena de

arginina a través del ciclo de la urea, lo que incrementaría la formación de amonio

(Buentello y Gatlin, 2001). Las diferencias en las proporciones de excreción de amonio

entre trucha y dorada, nos indican una mayor sensibilidad de la trucha a estos factores

que afectan la excreción de amonio.


96

En trucha, los niveles de glucosa post ingesta fueron superiores a los niveles

encontrados en dorada, coincidiendo con los valores observados en la comparación

entre estas especies (Panserat et al., 2002). Novoa y colaboradores (2004), utilizando

dietas con elevado contenido de carbohidratos en trucha arco iris, han observado que el

incremento de la glucosa postprandial en plasma es proporcional al contenido de

carbohidratos de la dieta. Tras diferentes períodos de adaptación a dietas suplementadas

con carbohidratos (entre 8 y 20%), también se han registrado aumentos en los niveles

postprandiales de glucosa respecto a los valores de los animales alimentados con una

dieta sin carbohidratos (Panserat et al., 2000a; 2001a; Capilla et al., 2003). En la

presente investigación, en trucha arco iris tras la ingesta del alimento, los valores de

glucosa en plasma fueron similares entre los grupos de las diferentes dietas

experimentales tanto a las 6 como a las 24 horas post ingesta. Ello sugiere que las

diferencias entre las dietas experimentales en cuanto al contenido y digestibilidad de

carbohidratos, no serían suficientes para originar cambios en las glucemias durante el

período postprandial entre los distintos grupos. Conviene recordar que las dietas fueron

diseñadas para obtener un perfil de aminoácidos determinado y mantener un contenido

normal de carbohidratos similar en las diferentes dietas, aunque pueden existir

diferencias en el tipo de carbohidratos.

En el presente estudio a las 6 horas post ingesta, las doradas alimentadas con la

dieta DMGlu mostraron valores inferiores de glucosa en plasma que los peces de la

dieta DCGlu. En la dorada, no parece existir una correlación tan clara entre la glucosa

postprandial y el contenido de carbohidratos en la dieta. Así en doradas alimentadas con

dietas de diferentes proporciones de carbohidratos (entre 20 y 40 %), los niveles

plasmáticos de glucosa postprandial fueron similares a los valores de glucosa de

animales alimentados con dietas sin carbohidratos (Panserat et al., 2000a; Capilla E.,

2002). Por lo tanto, las diferencias en la glucosa post ingesta entre las dietas DCGlu y

DMGlu posiblemente podrían estar originadas por las diferencias en la composición de

aminoácidos u otros componentes que existen entre ambas dietas, que pudiera afectar el

metabolismo o la utilización de la glucosa.

En la alimentación forzada, se observó en ambas especies aumentos

significativos en los valores de glucosa en plasma en las dos dietas durante las primeras

horas después del tratamiento. Tanto en trucha arco iris como en dorada, los


97

incrementos en los niveles de glucosa plasmática fueron significativamente superiores a

los observados tras la ingesta normal de alimento. En ambas especies, se han descrito

aumentos significativos de la glucemia de los animales, debido al aumento de la

actividad gluconeogénica y una inhibición de la actividad de los enzimas glucolíticos en

situaciones de stress (Balm y Pottinger, 1995; Jeney et al., 1997; Tort et al., 2001;

Barton et al., 2005; Holloway et al., 2004; Trenzado et al., 2003; Wagner et al., 2003).

Por lo que, el incremento de la glucosa plasmática podría haber sido originada por la

manipulación de los animales durante el proceso de la alimentación forzada.

Estudios realizados en trucha y lubina (Navarro, et al., 1992; Pérez, et al., 1988),

demuestran que al igual que en mamíferos, los niveles de insulina y glucagón

plasmáticos desempeñan un papel importante en la regulación de los niveles de

metabolitos circulantes y su entrada a los tejidos tras la ingestión de alimento. En el

presente trabajo en la administración normal del alimento, los niveles basales

plasmáticos de insulina en trucha fueron superiores a los observados en dorada. Sin

embargo, independientemente de la dieta, el incremento postprandial relativo a los

valores basales de insulina fue superior en la dorada. Por lo que en dorada, el efecto

estimulador tras la ingesta normal del alimento sobre la insulina y glucagón

cuantitativamente mayor, sugiere una sensibilidad mayor que en trucha, en términos de

la respuesta de estas hormonas pancreáticas a la administración de estas dietas.

El efecto secretor de las diferentes dietas sobre los niveles plasmáticos de

insulina presenta un patrón similar en ambas especies, tanto en el experimento de dietas

en alimentación normal, como en la alimentación forzada. Considerando un mismo

perfil de aminoácidos (corporal o muscular), las dietas de mayor relación IAA/DAA,

presentaron niveles de insulina superiores a las 6 horas después de la ingesta. La

presencia de diferentes proporciones de proteínas y algunos aminoácidos que

constituyen las diferentes dietas, ejercerían un efecto estimulador sobre la secreción de

la insulina (Cowey et al., 1977; Mommsen et al., 2001a; Plisetskaya et al., 1991; Van

Loon et al., 2000). En comparación con los mamíferos, en peces teleósteos los

aminoácidos estimulan la secreción de insulina en mayor proporción que la glucosa

(Ronner y Scarpa, 1987). Se ha descrito que algunos aminoácidos como la arginina,

lisina, leucina y fenilalanina estimulan especialmente la liberación de insulina en

teleósteos (Ince y Thorpe, 1977; Matty y Lone, 1985; Navarro et al., 2002; Plisetskaya


98

et al., 1991). El hecho de que dichos aminoácidos sean todos esenciales está de acuerdo

con una mayor estimulación de la secreción de insulina en los peces alimentados con las

dietas con relación IAA/DAA mayor.

De acuerdo con lo encontrado por Gutiérrez y colaboradores (1986), los niveles

de glucagón plasmáticos en dorada fueron superiores a los registrados en trucha. La

única referencia sobre los niveles de glucagón en dorada durante muchos años ha sido la

del estudio de Gutiérrez y colaboradores (1986). En dicho estudio sobre los niveles de

glucagón de diferentes especies de peces, en dorada se encontraron que los niveles de

glucagón fueron superiores (entre 2 y 8 veces) respecto a los valores de glucagón del

resto de teleósteos estudiados. Recientemente, en dorada se ha demostrado que la

arginina tiene un efecto estimulador en la secreción de glucagón superior al de la

secreción de insulina (de Celis et al., 2004); efecto contrario al observado en

salmónidos, donde la acción insulinotrópica predomina sobre la secreción del glucagón

(Carneiro et al., 1993; Navarro et al., 2002). Sin embargo, no existen datos disponibles

del efecto de otros aminoácidos sobre la secreción del glucagón en peces. Incluso en

mamíferos, la información es limitada, aunque se sabe que el incremento de la

concentración de aminoácidos en plasma después de la ingesta estimula la liberación del

glucagón (Navarro et al., 2002). Los principales aminoácidos gluconeogénicos están

entre los más potentes estimuladores de las células alfa. En peces, los aminoácidos no

esenciales como alanina, ácido aspártico y ácido glutámico son potencialmente

importantes como sustratos gluconeogénicos (Jurss y Bastrop, 1995). En el presente

trabajo en trucha, dentro de cada dieta de perfil de aminoácidos (músculo y corporal),

los grupos alimentados con las dietas de menor IAA/DAA, con mayor proporción de

alanina, ácido aspártico y especialmente ácido glutámico presentaron niveles mayores

de glucagón en plasma. En mamíferos, se ha propuesto que la liberación del glucagón

postprandial sirve para estimular la producción de la glucosa hepática, para evitar la

hipoglucemia resultante de la acción de la insulina. En peces este control de la glucemia

no ha sido confirmado. Sin embargo, la secreción del glucagón estimula la

gluconeogenesis a partir de los aminoácidos en el hígado de la anguila y trucha (Inui y

Ishioka, 1983; Inui y Yokote, 1977).

A diferencia de la trucha, en dorada la secreción postprandial del glucagón tuvo

un patrón de respuesta similar al de la insulina. Los animales alimentados con las dietas


99

con el perfil de aminoácidos esenciales del músculo tuvieron niveles de glucagón

superiores al de los grupos de las dietas con el perfil de aminoácidos corporales a las 6

horas del postprandial, siendo está diferencia significativa entre los grupos de la dieta

DM (relación IAA/DAA mayor) y el grupo de la dieta de DCGlu (relación IAA/DAA

menor). Por tanto no se puede descartar en está especie la posibilidad de que el

glucagón tenga una sensibilidad mayor a los aminoácidos esenciales. En este sentido en

dorada, la secreción del glucagón parece ser especialmente más sensible al aminoácido

esencial arginina (de Celis et al., 2004).

Los experimentos de alimentación forzada se diseñaron para obtener los perfiles

hormonales completos después de la ingesta. Además, este método nos permitió estar

seguros de que todos los animales utilizados fueron alimentados con la misma ración y

al mismo tiempo, para eliminar la variabilidad de la respuesta hormonal.

En la alimentación forzada de trucha, los perfiles de respuesta de insulina fueron

similares entre dietas, pero con niveles de insulina más altos en el grupo de la dieta TM

en concordancia con las diferencias observadas en la administración normal del

alimento. Esto sugiere que las diferencias encontradas en los niveles de insulina a las 6

horas entre las dietas (TM y TMGlu), son debidas a la capacidad intrínseca

insulinotrópica de los componentes de la dieta y no debido a diferencias en las tasas de

tránsito intestinal del alimento o a la distinta estimulación temporal en la secreción

hormonal por los aminoácidos absorbidos de la dieta tras la ingesta del alimento.

Sin embargo, los perfiles de insulina observados, con un máximo a las 6 horas,

en la alimentación forzada son distintos a los encontrados en la ingesta normal del

alimento, donde los niveles elevados de insulina aparecen alrededor de la primera o

segunda hora tras la ingesta (Pérez et al., 1988; Navarro et al., 1993; Novoa et al.,

2004). Ello podría ser debido a la ausencia de una fase cefálica, que estimule la

secreción de insulina en los peces en la alimentación forzada, que explicaría la

diferencia respecto a los valores de insulina de animales con administración normal del

alimento. La estimulación cefálica de la liberación de insulina, está relacionada con

diversos factores como el estimulo visual al observar el alimento al acercarse la hora

habitual de la ingesta, la distensión progresiva del estómago y a otros factores

estimulantes de la secreción de la insulina (Papatryphon et al., 2001).


100

En trucha, la alimentación forzada no parece ser el método más adecuado para el

estudio de la respuesta postprandial del glucagón. Los niveles de glucagón fueron muy

superiores a los observados en animales alimentados en condiciones normales. Estos

altos niveles de glucagón observados a lo largo del todo el período, sugieren que

podrían ser causados por la situación de estrés a los que fueron sometidos los animales

durante la manipulación para la alimentación forzada, ya que algunos estudios han

relacionado alteraciones del glucagón en condiciones de estrés (Mommsen et al., 1999).

En dorada, los experimentos de alimentación forzada no produjeron cambios

significativos en los niveles plasmáticos de insulina y glucagón. En está especie, la

ausencia de la fase cefálica sería al parecer más necesaria para la estimulación de la

secreción de la insulina, debido a que tras la alimentación forzada en dorada, el

incremento de la insulina es escaso en comparación al encontrado en trucha. A nivel de

de glucagón, los resultados en dorada nos indican que quizás nos exista la misma

sensibilidad de está hormona a situaciones de estrés como en trucha, ya que después de

la alimentación forzada no se ha observado ningún cambio en el glucagón plasmático de

la dorada.

En comparación con mamíferos y otros vertebrados, los peces poseen niveles

menores de binding en los receptores de insulina en el músculo esquelético. Este hecho

se ha relacionado con el papel menos importante de la insulina en la regulación

metabólica del músculo en peces (Párrizas et al., 1994b). Además el binding y número

de los receptores de IGF-I son superiores a los de insulina; mientras que en mamíferos

los receptores de insulina predominan sobre los de IGF-I (Méndez et al., 2001; Navarro

et al., 1999; Párrizas et al., 1995a; Párrizas et al., 1995c; Planas et al., 2000c). Este

hecho sugiere que el IGF-I puede desarrollar un papel metabólico destacable en peces,

como se ha demostrado recientemente en miocitos de trucha en cultivo (Castillo et al.,

2004). En todos los grupos experimentales tanto para trucha arco iris como dorada, se

observa que los valores del binding de los receptores de IGF-I, son superiores al de los

receptores de insulina en el músculo blanco. En la comparación entre especies, los

niveles de binding de los receptores de insulina e IGF-I en dorada fueron superiores a

los encontrados en trucha arco iris. Asimismo en ambas especies, no parece existir

regulación de la insulina plasmática sobre los receptores de insulina en el músculo

esquelético, debido quizás a las diferencias escasas de la insulina en plasma entre los


101

distintos grupos. En este sentido, en estudios previos (Párrizas et al., 1994b), con dietas

enriquecidas con carbohidratos, donde los niveles de insulina aumentaron, se observó en

paralelo un mayor número de receptores de insulina en el músculo blanco. Así por

ejemplo, aumentos en los niveles de insulina por tratamientos de arginina en trucha (de

11,9 ± 0,5 a 23,0 ± 1,4 ng/ml) y en carpa (de 11,8 ± 0,3 a 17,9 ± 0,7 ng/ml), son capaces

de generar incrementos en el binding de los receptores de insulina. Por ello se ha

propuesto la existencia de una “up-regulation” en los receptores de insulina por los

niveles de insulina en plasma en el músculo blanco y tejido adiposo de estas especies

(Párrizas et al., 1994b; Planas et al., 2000b; Planas et al., 2000c). A partir de estos

resultados se deduce que está regulación requiere un cambio suficientemente grande en

los niveles de insulina, que no se alcanzó en las condiciones de los experimentos aquí

presentados.

En resumen en el presente bloque experimental, tanto en trucha arco iris como

en dorada, no observaron diferencias en los parámetros de crecimiento de los animales

alimentados con las dietas basadas en los perfiles de aminoácidos esenciales del

músculo y corporal, así como en las dietas donde hubo variación de la relación

IAA/DAA en la dieta. En ambas especies, los niveles plasmáticos postprandiales de

glucosa e insulina tampoco presentaron variaciones en función del perfil de

aminoácidos esenciales de la dieta. Sin embargo, las dietas suplementadas con el ácido

glutámico tuvieron un efecto estimulador menor sobre la secreción postprandial de la

insulina en ambas especies, que no modifica la unión de la insulina a su receptor. Los

niveles de glucagón fueron más elevados en dorada que en trucha arco iris. La respuesta

postprandial del glucagón a las dietas con diferentes perfiles y contenido de

aminoácidos fue distinta entre ambas especies. En trucha arco iris, la dieta con el perfil

de aminoácidos esencial corporal posee un efecto secretor mayor sobre el glucagón

postprandial que las dietas del perfil del músculo. Mientras en dorada, las dietas con el

perfil de aminoácidos esenciales del músculo tuvieron un efecto secretor del glucagón

mayor que las dietas con el perfil de aminoácidos esenciales corporales a las 6 horas del

postprandial.

Bloque experimental II: Resultados y discusión Rojas, P. C.

102

4.2.- BLOQUE II: Efectos de la sustitución de la proteína animal por la

proteína vegetal en las dietas de trucha arco iris y dorada.

En el presente bloque experimental, los objetivos fueron los de evaluar los

efectos sobre los parámetros de crecimiento y utilización de los nutrientes de animales

alimentados con dietas de distintos grados de sustitución de proteína animal por

proteína vegetal en la dieta de trucha arco iris y dorada. Así como, analizar los niveles

postprandiales de glucosa, insulina y glucagón de los animales alimentados con las

diferentes dietas. Además en trucha, se analizó el efecto de la incorporación de la

proteína vegetal en la dieta sobre la expresión del ARNm del transportador de glucosa

en el músculo esquelético rojo. Para lo cual, los animales fueron alimentados con 4

dietas experimentales en trucha arco iris (T) y dorada (D) durante 12 semanas (punto

3.1.2). Para cada especie se elaboraron 3 dietas con diferentes grados de sustitución de

proteína animal por proteína vegetal (50%, 75% y 100%). En trucha las dietas T50, T75

y T100 respectivamente y en dorada D50, D75 y D100 respectivamente y 2 dietas

control sin reemplazo de la proteína animal T0 (trucha) y D0 (dorada).

Rojas, P. C. Bloque experimental II: Resultados y discusión

103

4.2.1.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en trucha arco iris. En trucha arco iris, el reemplazo de la proteína animal por proteína vegetal en la

dieta tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento de los animales. Después de 12

semanas de alimentación con las dietas experimentales, los pesos y las tasas de

crecimiento de los grupos de las dietas T75 y T100 fueron significativamente inferiores

al de las truchas alimentadas con las dietas T0 y T50. La incorporación de proteína

vegetal en la dieta en cualquiera de las proporciones estudiadas produjo una

disminución en el índice hepatosomático. El incremento de la proporción de proteína

vegetal en la dieta generó una menor tasa de conversión alimenticia y se observó

además una menor eficiencia proteíca de los animales alimentados con T75 y T100

(Tabla 4.2.1).

Tabla 4.2.1.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las truchas arco iris alimentadas con las diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

T0 T50 T75 T100

Peso corporal inicial (g) 19,2 ± 0,2 19,2 ± 0,2 19,2 ± 0,2 19,2 ± 0,1

Peso corporal final (g) 147,1 ± 0,9a 142,4 ± 1,3a 135,6 ± 2,5b 111,1 ± 1,3c

Índice Hepatosomático 2,08 ± 0,08a 1,36 ± 0,06b 1,29 ± 0,10b 1,44 ± 0,10b

Tasa de crecimiento específico (%) 2,61 ± 0,02a 2,57 ± 0,01a 2,51 ± 0,03b 2,25 ± 0,01c

Tasa de conversión alimenticia 1,33 ± 0,02a 1,29 ± 0,01b 1,25 ± 0,01b 1,17 ± 0,01c

Tasa de eficiencia proteíca 2,58 ± 0,03a 2,63 ± 0,02a 2,55 ± 0,02b 2,42 ± 0,01c

Tasa de crecimiento específico = [100 x [Ln(peso corporal final) - Ln(peso corporal inicial)]]/días Tasa de conversión alimenticia = peso húmedo ganado / peso de alimento seco ingerido Tasa de eficiencia proteíca = peso húmedo ganado / peso neto de proteínas ingeridas Índice Hepatosomático = 100 x (peso del hígado) / (peso corporal) a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


104

El incremento en la proteína vegetal en la dieta produjo una disminución ligera

en el contenido de proteínas de la composición corporal de los animales. El aumento de

la proteína vegetal en la dieta mostró un efecto negativo sobre la ganancia diaria de

nitrógeno de los peces. La retención de proteínas y de lípidos también se vio disminuida

por el incremento de proteína vegetal en la dieta. Además, la incorporación de la

proteína vegetal en la dieta generó un incremento progresivo de la excreción de amonio

(Tabla 4.2.2).

Tabla 4.2.2.- Composición corporal y utilización de nutrientes de las truchas arco iris alimentadas con las diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

T0 T50 T75 T100

Composición corporal (% ó kJ/g peso húmedo) Agua 66,7 ± 0,1b 67,7 ± 0,3b 67,8 ± 0,1b 68,3 ± 0,2a

Proteínas 17,4 ± 0,03 a 16,7 ± 0,15 b 16,5 ± 0,09 b 15,8 ± 0,30 c

Lípidos 12,6 ± 0,1 12,3 ± 0,4 12,8 ± 0,1 12,4 ± 0,2


Nitrógeno (mg) 552,8 ± 3,7a 521,1 ± 5,3b 507,6 ± 2,9b 450,6 ± 12,3c

Lípidos (g) 2,6 ± 0,04a 2,5 ± 0,1ab 2,6 ± 0,02a 2,4 ± 0,04b


Proteínas 48,2 ± 0,7a 46,9 ± 0,2a 44,3 ± 0,6b 40,3 ± 1,0b

Lípidos 93,9 ± 2,0a 59,9 ± 0,8a 57,1 ± 0,4b 56,6 ± 0,1b


Amonio 511 ± 12d 545 ± 3c 576 ± 5b 612 ± 5a

Composición corporal de los peces al inicio del experimento: Agua 74,59 %; Proteínas 15,9 %; Lípidos 7,17 %. a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


105

4.2.2.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de la trucha arco iris. En los animales alimentados con las dietas con un alto contenido de proteína

vegetal, los niveles basales de glucosa (24 h) fueron similares al grupo de la dieta T0,

(valores de 87,9 ± 4,7 a 100,7 ± 4,7 mg/dl). A las 6 horas de la ingestión del alimento, la

glucosa en plasma tampoco mostró diferencias significativas entre dietas (valores entre

100,3 ± 4,7 y 110,4 ± 6,6 mg/dl); los niveles de glucosa de las truchas fueron similares a

los encontrados a las 24 horas en cada grupo, excepto en los animales de la dieta T100

en los que las diferencias son significativas (Figura 4.2.1).

Figura 4.2.1.- Niveles plasmáticos de glucosa sanguínea de las truchas alimentadas con las dietas de diferentes proporciones de proteína vegetal a las 6 horas y 24 horas post ingesta. El asterisco indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta p<0,05 (prueba T-Student).

Los niveles de insulina plasmática a las 6 horas de la ingesta no mostraron

diferencias significativas entre los grupos alimentados con las diferentes dietas. La

insulina en plasma estuvo en el rango comprendido entre 10,6 ± 0,7 y 11,5 ± 0,3 ng/ml.

24 horas después de la ingesta los valores más altos se encontraron en el T100, siendo la

diferencia significativa con respecto a la T75. En todos los grupos excepto en el T100

(Figura 4.2.2), los niveles de insulina en plasma sanguíneo a las 6 horas fueron

superiores a los encontrados a las 24 horas para cada dieta (valores entre 7,4 ± 0,4 y

8,0 ± 0,5 ng/ml).

T0 T50 T75 T100

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

*

T0 T50 T75 T100T0 T50 T75 T100

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

*


106

Figura 4.2.2.- Niveles de insulina plasmática de las truchas arco iris alimentadas con las dietas experimentales. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas. (*) Indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta p<0,05 (prueba T-Student).

A las 6 horas tras la ingesta del alimento, el glucagón plasmático fue similar

entre dietas, oscilando los valores de glucagón en plasma sanguíneo entre 3,9 ± 0,3 y

5,0 ± 0,5 ng/ml. Los niveles basales de glucagón también fueron similares entre grupos,

con valores comprendidos entre los 3,0 ± 0,2 y 4,3 ± 0,5 ng/ml. En todas la dietas

excepto el grupo T100, los niveles de glucagón en plasma a las 6 horas fueron

superiores a los valores registrados a las 24 horas después de la ingesta (Figura 4.2.3)

Figura 4.2.3.- Valores de glucagón en plasma sanguíneo de las truchas arco iris alimentadas con las dietas experimentales. (*) Indica diferencias significativas en los valores de insulina entre 6 y 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

0

1

2

3

4

5

6

7

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l) **

*

T0 T50 T75 T100

0

1

2

3

4

5

6

7

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l) **

*

T0 T50 T75 T100T0 T50 T75 T100

bab aab

* * *

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

T0 T50 T75 T100

bab aab

* * *

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

T0 T50 T75 T100

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 Horas

Insu

lina

(ng/

ml)

T0 T50 T75 T100T0 T50 T75 T100


107

4.2.3.- Efectos de las dietas experimentales sobre la expresión del transportador de glucosa (GLUT4) en el músculo rojo de trucha arco iris.

A partir del ARNm del músculo rojo de trucha arco iris alimentadas con las

dietas T0, T50, T75 y T100 a las 24 horas del postprandial y utilizando la sonda de

ADNc de trucha común (btGLUT), el northern blot mostró una banda de 3 kb, que

correspondió al transportador de glucosa (GLUT4). Los niveles de expresión del

GLUT4, no mostraron cambios significativos entre los distintos grupos de animales

alimentados con las distintas dietas experimentales (Figura 4.2.4).

En dorada, el northern blot del transportador de glucosa del músculo rojo no

mostró ninguna señal o banda de 3kb utilizando la sonda de ADNc de trucha común.

Por lo que posteriormente se procedió a obtener la secuencia del GLUT4 en está especie

(ver apartado 4.4.1).

Figura 4.2.4.- (A) Northern blot del ARN total de los músculos rojos de las truchas arco iris alimentadas con las dietas experimentales a las 24 horas del postprandial utilizando las sondas de btGLUT y 18S. (B) Análisis densitométrico de la relación Glut4/18S. No existen diferencias significativas entre grupos a p<0,05 (prueba T-Student).

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

T0 T50 T75 T100

Rel

ació

n G

LUT4

/18S

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

T0 T50 T75 T100

Rel

ació

n G

LUT4

/18S

Músculo rojo

GLUT4

18S

T0 T50 T75 T100

3 kb

Músculo rojo

GLUT4

18S

T0 T50 T75 T100

3 kb

(A)

(B)


108

4.2.4.- Crecimiento, eficiencia alimenticia y utilización de nutrientes en dorada. En dorada, el incremento de proteína vegetal en la dieta después de las 12

semanas mostró un efecto negativo sobre el crecimiento de los animales alimentados

con las tres dietas experimentales. Los pesos corporales finales fueron menores en los

animales alimentados con las dietas vegetales siendo el efecto más acusado cuanto

mayor fue el nivel de sustitución; los índices hepatosomáticos fueron similares entre los

animales de las distintas dietas. De acuerdo con el menor peso corporal en los grupos en

los que se administraron las dietas vegetales, las tasas de crecimiento específico y tasas

de conversión alimenticia fueron inferiores a las de la dieta control (D0); sin embargo,

los animales alimentados con dichas dietas de sustitución presentaron valores mayores

de las tasas de eficiencia proteica (Tabla 4.2.3).

Tabla 4.2.3.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las doradas alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

D0 D50 D75 D100

Peso corporal inicial (g) 16,4 ± 0,1 16,7 ± 0,1 16,5 + 0,2 16,4 ± 0,2

Peso corporal final (g) 73,8 ± 0,9a 69,7 ± 0,5b 66,5 ± 0,5c 58,1 ± 0,7d

Índice Hepatosomático 1,23 ± 0,06 1,31 ± 0,09 1,31 ± 0,13 1,38 ± 0,11

Tasa de crecimiento específico (%) 1,85 ± 0,01a 1,76 ± 0,01b 1,72 ± 0,01b 1,56 ± 0,02c

Tasa de conversión alimenticia 1,12 ± 0,01a 1,01 ± 0,01b 0,96 ± 0,09b 1,01 ± 0,02b

Tasa de eficiencia proteica 1,91 ± 0,01c 2,09 ± 0,03ab 2,16 ± 0,02a 2,04 ± 0,04b

Tasa de crecimiento específico = [100x[Ln(peso corporal final)-Ln(peso corporal inicial)]]/días Tasa de conversión alimenticia = peso húmedo ganado/ peso de alimento seco ingerido Tasa de eficiencia proteica = peso húmedo ganado/ peso neto de proteínas ingeridas Índice Hepatosomático = 100 x (peso del hígado) / (peso corporal) a,b,c Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


109

En la tabla 4.2.4, se muestran los resultados de la composición corporal y la

utilización de nutrientes de las doradas alimentadas con las dietas experimentales

después de las 12 semanas. La sustitución del 100% de la proteína animal por proteína

vegetal en la dieta, produjo una disminución en el contenido de lípidos totales de los

animales. Las ganancias de nitrógeno de los animales también se vieron afectadas por la

alimentación con las distintas dietas, así grupos con porcentaje mayor de sustitución de

proteína animal (D75 y D100), tuvieron ganancias menores de nitrógeno. Sin embargo,

las dietas D75 y D100 dieron lugar a porcentajes mayores de retención de proteína que

las dietas D0 y D50.

Tabla 4.2.4.- Composición corporal y utilización de nutrientes en las doradas alimentadas con diferentes dietas experimentales durante 12 semanas.

D0 D50 D75 D100

Composición corporal (% ó kJ/g peso húmedo) Agua 67,4 ± 0,3 67,3 ± 0,2 67,7 ± 0,5 68,3 ± 0,1

Proteínas 16,1 ± 0,1 ab 15,9 ± 0,1 b 16,1 ± 0,1 ab 16,4 ± 0,1a

Lípidos 11,7 ± 0,2 a 11,8 ± 0,2 a 11,4 ± 0,5 ab 10,3 ± 0,1b


Nitrógeno (mg) 385,5 ± 2,0 a 367,4 ± 0,6 b 363,9 ± 3,0 b 344,6 ± 2,2 c

Lípidos (g) 1,8 ± 0,04 a 1,8 ± 0,05 a 1,7 ± 0,09 a 1,4 ± 0,02 b


Proteínas 31,7 ± 0,21 a 33,6 ± 0,59 a 37,8 ± 0,27 b 38,9 ± 0,63 b

Lípidos 55,1 ± 0,8 ab 59,2 ± 1,4 a 58,9 ± 2,6 a 49,2 ± 1,0 b


Amonio 525 ± 23 b 548 ± 6 b 553 ± 7 b 574 ± 9 a

Composición corporal de los peces al inicio del experimento: Agua 71,1 %; Proteínas 15,4 %; Lípidos 9,2 %. a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba Student Newman–Keuls).


110

4.2.5.- Niveles de glucosa, insulina y glucagón plasmáticos de las doradas. En las doradas, los valores de glucosa plasmática en los animales alimentados

con las diferentes dietas oscilaron en el rango de 82,3 ± 2,4 a 109,4 ± 8,9 mg/dl a las

6 horas del período postprandial. Los animales de la dieta D100 fueron los que

presentaron los valores mas elevados de glucemia y tanto en el grupo D100 como el

D50 el incremento postprandial fue significativo. Los niveles basales de glucosa en

plasma fueron similares entre dietas, y estuvieron comprendidos entre 78,3 ± 3,7 y 88,8

± 2,7 mg/dl (Figura 4.2.5).

Figura 4.2.5.- Niveles plasmáticos de glucosa de las doradas alimentadas con las dietas experimentales. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre dietas. (*) Indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

En todos los grupos de doradas alimentadas con las dietas experimentales, los

niveles de insulina plasmática a las 6 horas fueron superiores a los registrados a las 24

horas de la ingestión del alimento. No se encontraron diferencias significativas entre

dietas en los niveles de insulina ni a las 6 y ni a las 24 horas después de la ingesta. Los

valores de insulina en plasma estuvieron comprendidos entre 10,9 ± 0,3 y

11,7 ± 0,2 ng/ml a las 6 horas del postprandial, mientras los niveles basales fueron de

6,0 ± 0,5 a 7,0 ± 0,5 ng/ml (Figura 4.2.6).

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

a

*ab ab

*bc

D0 D50 D75 D100

0

20

40

60

80

100

120

140

6 Horas 24 Horas

Glu

cosa

(mg/

dl)

a

*ab ab

*bc

D0 D50 D75 D100D0 D50 D75 D100


111

Figura 4.2.6.- Valores de insulina en plasma sanguíneo de doradas alimentadas con las dietas experimentales. (*) Indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

Los niveles de glucagón plasmáticos a la 6 horas de la administración del pienso

fueron superiores a los valores de glucagón registrados a las 24 horas del postprandial

excepto en el grupo D0. El glucagón en plasma osciló entre valores de 4,1 ± 0,5 a 5,8 ±

1,0 ng /ml a las 6 horas después de la ingesta del alimento. Los niveles basales de

glucagón estuvieron comprendidos entre 1,9 ± 0,3 y 3,2 ± 0,8 ng /ml. Las diferencias en

los valores de glucagón plasmáticos entre las dietas analizadas no fueron significativas

(Figura 4.2.7).

Figura 4.2.7.- Niveles de glucagón plasmático en doradas alimentadas con las dietas experimentales. (*) Indica diferencias significativas respecto a las 24 horas para cada dieta a p<0,05 (prueba T-Student).

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 HorasIn

sulin

a (n

g/m

l)

* * **

D0 D50 D75 D100

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 HorasIn

sulin

a (n

g/m

l)

* * **

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 HorasIn

sulin

a (n

g/m

l)

0

2

4

6

8

10

12

14

6 Horas 24 HorasIn

sulin

a (n

g/m

l)

* * **

D0 D50 D75 D100D0 D50 D75 D100

012

345

6

78

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*

**

D0 D50 D75 D100

012

345

6

78

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*

**

012

345

6

78

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

012

345

6

78

6 Horas 24 Horas

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

*

**

D0 D50 D75 D100D0 D50 D75 D100


112

4.2.6.- Discusión.

En este bloque experimental, se dan a conocer los resultados obtenidos en los

experimentos en que se ha realizado la sustitución parcial o total de la proteína animal

por la proteína de origen vegetal en las dietas de trucha arco iris y dorada,

correspondiente a la segunda etapa del proyecto europeo.

En trucha, el reemplazo parcial o total de la proteína animal en la dieta tuvo un

efecto negativo sobre el crecimiento de los animales excepto en el grupo de la dieta

T50. Las truchas alimentadas con la dieta T50 alcanzaron pesos corporales finales, tasas

de crecimiento específico y además tasas de eficiencia proteíca similares a los del grupo

control (dieta T0). Estos resultados de crecimiento en trucha con un 50 % de sustitución

de proteína animal, están de acuerdo con los observados por Gomes y colaboradores

(1995) que utilizó dietas con un rango de sustitución similar. Así el reemplazo parcial

del 66 % de la proteína animal en la dieta, no produjo efectos negativos sobre el

crecimiento de los animales. Sin embargo, otros estudios en trucha arco iris, muestran

que la sustitución total de la proteína animal es posible a partir de concentrados de

proteína de soja, ya que los pesos corporales finales y los parámetros de crecimiento

obtenidos fueron similares al del grupo control tras las 12 semanas de alimentación

(Kaushik et al., 1995). Por lo que, en la dieta de trucha arco iris, el grado de sustitución

de la proteína animal óptimo variaría en función de la fuente de la proteína vegetal

(Kaushik et al., 1995).

En trucha arco iris se ha señalado que puede existir una disminución en la

ingesta del alimento, en los peces alimentados con dietas donde el reemplazo de la

proteína animal está por encima del 66% (Gomes et al., 1995). Este consumo menor del

alimento, genera una disminución del peso corporal (Gomes et al., 1995; Mambrini et

al., 2004). Sin embargo, no parece ser nuestro caso ya que en los animales de las dietas

T75 y T100, las cantidades de alimento ingerido fueron incluso superiores a la de los

grupos T0 y T50. Por lo que los efectos negativos sobre el crecimiento de las dos dietas

con mayor reemplazo de proteína animal, no parecen ser causados por las diferencias en

el consumo del alimento. Sin embargo, cuando se incrementa la proteína vegetal en la

dieta, aumenta la proporción de factores antinutricionales presentes en las fuentes


113

vegetales, y está podría ser una posible explicación del menor crecimiento de los

animales; así, en estudios previos en truchas arco iris se han observado que factores

antinutricionales como el gossypol, ácido fítico, inhibidores de proteasas y saponinas

tienen efectos negativos sobre el crecimiento (Francis et al., 2001).

En dorada se observó un efecto negativo en el crecimiento de los animales

alimentados con las dietas de proteínas vegetales en las dietas 75 o 100%. Los

parámetros de crecimiento analizados en nuestro estudio, señalan que el porcentaje

adecuado de sustitución con proteína vegetal en la dieta sería de alrededor del 50 % en

nuestras condiciones de cultivo. Estudios previos del reemplazo de la proteína animal

por diferentes proporciones de concentrados proteicos de soja y colza en la dieta de la

dorada, muestran que la sustitución del 30 % de la proteína animal no produjo cambios

en el crecimiento de los animales respecto a una dieta control (Kissil et al., 2000). En

cambio, los resultados incorporando harina de maíz en la dieta, indican que se puede

realizar hasta un 60% de sustitución de la proteína animal en la dieta, sin afectar el

crecimiento de la dorada (Pereira y Oliva-Teles, 2003).

Como se ha descrito previamente en dorada (Kissil et al., 2000; Pereira y Oliva-

Teles, 2003) y al contrario de lo observado en trucha, el aumento de la proporción de la

proteína vegetal en la dieta, provocó un menor consumo del alimento de la dorada en

este experimento. Esta menor ingesta podría ser debida a una baja palatabilidad del

alimento, a deficiencias en algunos aminoácidos esenciales en la dieta o interacciones

sinérgicas entre factores antinutricionales (Gómez-Requeni et al., 2003). No obstante, la

sustitución de proteína animal en la dieta generó un aumento en la retención de

proteínas en las doradas alimentadas con las dietas D75 y D100. Estos resultados están

de acuerdo con los obtenidos por Company y colaboradores (1999), que señalan en está

especie, la existencia de un incremento de la retención de proteínas cuando los animales

están sometidos a situaciones de restricción alimentaria.

En trucha arco iris, los niveles de excreción de amonio incrementaron a medida

que aumentó la proporción de proteína vegetal en la dieta. Una posible explicación de

estos incrementos en los niveles de excreción de amonio, podría ser el aumento del

catabolismo de las proteínas, debido al incremento de la desaminación de los


114

aminoácidos en el hígado y riñón de las truchas alimentadas con las dietas de proteína

vegetal (Cheng et al., 2003b; Medale et al., 1998; Robaina et al., 1995).

En ambas especies, los niveles de glucosa en plasma presentaron escasas

diferencias entre las 6 y 24 horas tras la ingesta del alimento. En la glucemia de los

animales no se observaron diferencias entre dietas. Ello probablemente sea debido a que

en el diseño de las dietas no se pretendía alterar notablemente el nivel de carbohidratos.

En trucha arco iris, estudios previos de Panserat y colaboradores (2000a) han descrito

incrementos en la glucemia postprandial de animales alimentados con dietas que

poseían distintas proporciones de carbohidratos (entre 20 y 40%) y diferentes grados de

digestibilidad de carbohidratos (Capilla et al., 2003; Novoa et al., 2004). En la presente

investigación, aunque se observó una menor digestibilidad de carbohidratos en las

dietas con inclusión de proteína vegetal (datos no mostrados), estas diferencias no

produjeron cambios en los niveles de glucosa en plasma entre las distintas dietas en

ambos momentos del postprandial. También existe la posibilidad que los incrementos

de glucosa postprandial se dieran a distintos momentos después la ingesta de cada dieta,

como se ha descrito para trucha común (Navarro et al., 1993). Esta posible explicación

concuerda con las diferencias encontradas en la velocidad del transito intestinal del

alimento que podría ocasionar una entrada diferencial de glucosa y otros metabolitos al

torrente sanguíneo (PEPPA, 2003). Sin embargo serían necesarios más puntos de

muestreo para poder comprobarlo.

En está investigación, el incremento de proteína vegetal en la dieta, no afecto a

la expresión del ARNm del GLUT4 en el músculo rojo de trucha arco iris alimentadas

con las distintas dietas. Esto concuerda con el hecho de que no se observaran diferencias

en los niveles plasmáticos postprandiales de insulina y glucosa entre los animales

alimentados con las dietas experimentales; estudios previos en músculo rojo muestran la

existencia de una buena correlación entre los niveles de insulina plasmática y la

expresión del GLUT4 (Capilla et al., 2002).

Tal y como se ha comentado inicialmente en el bloque I, el efecto de dietas con

proteínas vegetales sobre los niveles de insulina en teleósteos es completamente

desconocido. En mamíferos, existen escasos estudios sobre la estimulación de la

secreción de la insulina por parte de proteínas vegetales, y además la mayoría de estas


115

proteínas provienen de plantas medicinales, que son de poco uso en la alimentación

(Gallagher et al., 2003; Gray y Flatt, 1998a; Gray y Flatt, 1998b; Gray y Flatt, 1999a;

Gray y Flatt, 1999b). En el presente trabajo, truchas arco iris alimentadas con la dieta

T100 tuvieron valores basales (24 h) de insulina elevados, incluso fueron similares a los

niveles de insulina encontrados a las 6 horas postprandial. Puesto que el perfil de

aminoácidos fue más o menos constante en las dietas, es difícil de explicar estos valores

elevados por una estimulación diferencial consecuencia de la composición de

aminoácidos. Distintos autores (Capilla et al., 2003; Gabillard et al., 2003; Larsen et al.,

2001) observaron en trucha niveles altos de insulina asociados a bajas temperaturas,

sugiriendo una disminución en el metabolismo y un enlentecimiento de la digestión

como causas posibles. Un retraso en la velocidad del transito del alimento, podría ser

una posible explicación de los niveles basales elevados de insulina en plasma en el

grupo T100, que probablemente alcanzaron valores más bajos en un momento posterior

a las 24 h.

La sustitución de la proteína animal por proteína vegetal en la dieta de la dorada,

no tuvo ningún efecto sobre los niveles postprandiales de la insulina. Por lo tanto, si

tenemos en cuenta las diferencias encontradas en los niveles de insulina tras la ingesta

del alimento en las doradas del bloque experimental I, el incremento de la proteína

vegetal no altera la respuesta secretora de la insulina a los aminoácidos, que se

mantienen igual en todas las dietas. En ambas especies, las escasas diferencias en las

proporciones de los aminoácidos insulinotrópicos como arginina, lisina, leucina y

fenilalanina entre las dietas, podrían ser una de las posibles causas de la similitud en los

niveles de insulina a lo largo del postprandial entre los distintos grupos.

En mamíferos así como en peces, no existe información del efecto en la

alimentación con dietas vegetales sobre los niveles de glucagón. En la presente

investigación, el reemplazo de la proteína animal en las dietas de ambas especies, no

generó diferencias en la respuesta postprandial del glucagón plasmático respecto al

grupo control. En ambas especies, los niveles de glucagón plasmático incrementaron

después de la ingesta del alimento. Los estudios sobre la secreción postprandial del

glucagón en peces son escasos y contradictorios. En bacalaos alimentados con dietas sin

carbohidratos, no se han encontrado cambios en los niveles de glucagón plasmático

respecto a animales con una dieta con carbohidratos (Hemre et al., 1990). En trucha,


116

Harmon y colaboradores (1991), señalan un incremento en el glucagón en plasma

después de una inyección de glucosa. Mientras que dietas enriquecidas con

carbohidratos en trucha arco iris producen una inhibición de la secreción del glucagón,

debido al incremento postprandial de la glucosa (Novoa et al., 2004). En ambas

especies, en la presente investigación se observó a las 6 horas una tendencia a la

disminución del glucagón con el incremento de proteína vegetal en la dieta, pero los

efectos no fueron significativos.

En resumen, en el presente bloque experimental, y en nuestras condiciones de

cultivo entre las que cabe destacar el tamaño del animal y época del año, los resultados

de los parámetros de crecimiento observados en animales alimentados que fueron

similares a los obtenidos en animales alimentados con una dieta control, nos indican que

existe la posibilidad de un reemplazo del 50% de la proteína animal por proteína vegetal

en la dieta de trucha arco iris. Mientras en dorada, la incorporación de proteína vegetal

por la proteína animal en la dieta tendría que ser menor al 50%; lo que indica un menor

grado de adaptación a componentes vegetales de la dieta en dorada que en trucha. En

ambas especies, la sustitución de proteína animal por proteína vegetal en la dieta, no

produce alteraciones en la respuesta postprandial de la glucosa, insulina y el glucagón,

ni afectan la expresión del transportador de glucosa GLUT4 en trucha arco iris.

Rojas, P. C. Bloque experimental III: Resultados y discusión

117

4.3.- BLOQUE III: Tratamientos de arginina y glucosa en dorada.

En el presente bloque experimental, el objetivo fue evaluar los efectos de la

administración de glucosa y arginina sobre los niveles plasmáticos de glucosa, insulina,

glucagón e IGF-I, así como los distintos parámetros de caracterización de los receptores

de insulina e IGF-I del músculo blanco de doradas. Dos grupos de 40 doradas fueron

adaptadas a las dietas D0 y D75 del bloque experimental II durante 6 semanas. Una

semana antes del tratamiento con glucosa y arginina, las doradas fueron separadas en

grupos de 10 peces y siguieron la alimentación con la misma dieta. Al inicio del

experimento, los peces fueron anestesiados brevemente con MS-222 (0,1 g /l), e

inyectados con 0,5 ml de arginina (1,4 mg/g de pez), 0,5 ml de D-glucosa (0,5 mg/g de

pez) y 0,5 ml de solución salina, para posteriormente ser muestreados a las 3 y 6 horas

tras las inyecciones.

Bloque experimental III: Resultados y discusión Rojas, P. C.

118

4.3.1.- Crecimiento y eficiencia alimenticia de las doradas. En este experimento de adaptación a las dietas durante 6 semanas realizado entre

agosto y septiembre del 2002, el reemplazo del 75 % de la proteína animal por proteína

vegetal en la dieta, no provocó un efecto significativo sobre el crecimiento de los

animales, aunque se observó una tendencia a una menor tasa de crecimiento específica.

Los pesos corporales finales y las tasas de crecimiento del grupo de la dieta D75 fueron

similares al de las doradas alimentadas con la dieta control (D0). Aunque, la diferencia

no fue significativa, la proteína vegetal en la dieta generó un consumo del alimento

inferior en el grupo D75. La incorporación de proteína vegetal en la dieta tampoco

produjo diferencias en las tasas de conversión alimenticia y tasas de eficiencia proteíca

de los animales (Tabla 4.3.1). Tabla 4.3.1.- Tasas de crecimiento y eficiencia alimenticia de las doradas alimentadas con las dietas experimentales durante 6 semanas.

D0 D75

Peso corporal inicial (g) 98,7 ± 0,3 a 100,9 ± 0,2 b

Peso corporal final (g) 178,9 ± 1,4 175,4 ± 1,9

Alimento ingerido (g DM /pez) 96,3 ± 2,6 82,6 ± 1,8

Tasa de crecimiento específico (%) 1,38 ± 0,01 1,29 ± 0,01

Tasa de conversión alimenticia 0,83 ± 0,03 0,90 ± 0,00

Tasa de eficiencia proteíca 1,83 ± 0,07 2,12 ± 0,01

Tabla modificada de Vega-Rubín y colaboradores (2004) Tasa de crecimiento específico = [100 x [Ln(peso corporal final) – Ln(peso corporal inicial)]]/días Tasa de conversión alimenticia = peso húmedo ganado / peso de alimento seco ingerido Tasa de eficiencia proteíca = peso húmedo ganado / peso neto de proteínas ingeridas a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba T-Student).


119

4.3.2.- Niveles plasmáticos de glucosa en dorada: efectos de la administración de glucosa y arginina. En los animales controles inyectados con la solución salina, la glucosa fue muy

similar a los valores control no tratados (0 horas), tanto en los animales alimentados con

la dieta D0 como con la dieta D75. En el grupo de la dieta D0, los valores de glucosa en

plasma variaron entre tratamientos tras las inyecciones de glucosa y arginina (Figura

4.3.1). En estos animales, el tratamiento de glucosa produjo un aumento de la glucemia

sólo a las 6 horas después de la inyección. La inyección de arginina generó un

incremento de los niveles plasmáticos de glucosa de los animales, con un valor máximo

a las 3 horas (309,4 ± 15,2 mg/dl) significantemente superior al registrado a las 6 horas

(160,8 ± 30,8 mg/dl). En las doradas alimentadas con la dieta D75, a las 3 horas después

de la inyección, los tratamientos de glucosa y arginina incrementaron los niveles de

glucosa en plasma (Figura 4.3.1). A las 6 horas del tratamiento de glucosa, los valores

de glucosa en plasma se mantuvieron elevados (170,6 ± 8,7 mg/dl) respecto a los

niveles registrados para el grupo salino (84,4 ± 8,1 mg/dl).

Figura 4.3.1.- Niveles plasmáticos de glucosa sanguínea de las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina. a,b,c,d Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos a p<0,05 (prueba HSD de Tukey).

Control Salino Glucosa Arginina

0

50

100

150

200

250

300

350

Glu

cosa

(mg/

dl)

dDIETA D0

0 horas 3 horas 6 horas

c

ac

aba

bc

a

0

50

100

150

200

250

300

350

Glu

cosa

(mg/

dl)

DIETA D75


aa a

d

cd

bc ab

Control Salino Glucosa ArgininaControl Salino Glucosa Arginina

0

50

100

150

200

250

300

350

Glu

cosa

(mg/

dl)

dDIETA D0


c

ac

aba

bc

a

0

50

100

150

200

250

300

350

Glu

cosa

(mg/

dl)

dDIETA D0


c

ac

aba

bc

a

0

50

100

150

200

250

300

350

Glu

cosa

(mg/

dl)

DIETA D75


aa a

d

cd

bc ab

0

50

100

150

200

250

300

350

Glu

cosa

(mg/

dl)

DIETA D75


aa a

d

cd

bc ab


120

4.3.3.- Niveles de insulina en el plasma de las doradas: efectos de la administración de glucosa y arginina. Los niveles de insulina en plasma de los animales controles no tratados (0 horas)

fueron similares a los valores de insulina plasmática encontrados en los animales

inyectados con la solución salina para ambas dietas. En el grupo de la dieta D0, las

inyecciones de glucosa y arginina no produjeron cambios significativos en los niveles

plasmáticos de insulina de las doradas. Sin embargo, se observaron las tendencias a que

ambos tratamientos generaran aumentos de los niveles de insulina plasmática en los

animales; la inyección de arginina produjo un incremento mayor de la secreción de

insulina tras las 3 horas y 6 horas después de la inyección (Figura 4.3.2).

En las doradas alimentadas con la dieta D75, el tratamiento con arginina provocó

un incremento ligero en los niveles plasmáticos de insulina a las 6 horas respecto al

grupo control (salino). Mientras que los animales tratados con glucosa, no presentaron

cambios significativos respecto al grupo control (Figura 4.3.2). En las doradas tratadas

con arginina, la insulina en plasma alcanzó valores de 2,92 ± 0,68 ng/ml a 2,94 ± 0,23

ng/ml a las 3 y 6 horas respectivamente tras la inyección.

Figura 4.3.2.- Niveles de insulina en plasma de las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos a p<0,05 (prueba HSD de Tukey).


0

1

2

3

4


Insu

lina

(ng/

ml)

DIETA D0

ab

0

1

2

3

4

Insu

lina

(ng/

ml)

DIETA D75


ab ab

aba

b

b


0

1

2

3

4


Insu

lina

(ng/

ml)

DIETA D0

ab

0

1

2

3

4

Insu

lina

(ng/

ml)

DIETA D75


ab ab

aba

b

b


121

4.3.3.- Niveles plasmáticos de glucagón en la dorada: efectos de la administración de glucosa y arginina. Los niveles de glucagón plasmático de los animales inyectados con la solución

salina y alimentados con ambas dietas fueron similares a los valores de glucagón en

plasma encontrados en los animales no tratados (0 horas). En los animales alimentados

con la dieta D0, a las 3 horas de la inyección, el tratamiento de arginina generó un

incremento significativo de los niveles de glucagón en plasma (Figura 4.3.3). Este

aumento del glucagón plasmático con la administración de arginina representa un

incremento del 110% con respecto a los controles inyectados con salino. Las doradas

tratadas con arginina tuvieron niveles de glucagón en plasma menores a las 6 horas que

a las 3 horas después de la inyección aunque no de forma significativa. Mientras que la

administración de glucosa no alteró los niveles plasmáticos de glucagón

En el grupo de la dieta D75, la inyección de glucosa no produjo cambios en los

niveles de glucagón en plasma respecto al grupo salino al igual que en las doradas

alimentadas con la dieta D0 (Figura 4.3.2). En las doradas tratadas con arginina, a las 3

horas después de la inyección, se observaron niveles plasmáticos de glucagón (4,29 ±

0,41 ng/ml) superiores a los valores registrados para los animales inyectados con la

solución salina y de forma significativa respecto a los controles de 0 horas.

Figura 4.3.3.- Niveles plasmáticos de glucagón en las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos a p<0,05 (prueba HSD de Tukey).

0

1

2

3

4

5

6

7

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

bDIETA D0



0

1

2

3

4

5

6

7

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

DIETA D75


ab

aa a

aa a

aba

aa

ab

b

0

1

2

3

4

5

6

7

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

bDIETA D0



0

1

2

3

4

5

6

7

Glu

cagó

n (n

g/m

l)

DIETA D75


ab

aa a

aa a

aba

aa

ab

b


122

4.3.3.- Niveles del IGF-I en el plasma de dorada: efectos de la administración de glucosa y arginina. En las doradas alimentadas con los dietas D0 y D75, los tratamientos de arginina

y glucosa no produjeron cambios en los niveles plasmáticos de IGF-I ni a las 3 y ni a las

6 horas del inicio del experimento (Figura 4.3.4). En la dieta D0, los niveles de IGF-I en

plasma estuvieron comprendidos entre 40,3 ± 4,5 y 50,9 ± 3,7 ng/ml a las 3 horas y

valores plasmáticos de IGF-I de 38,3 ± 3,5 a 44,6 ± 3,1 ng/ml a las 6 horas después de

las inyecciones. En el grupo D75, el IGF-I en plasma estuvo en el rango comprendido

entre 36,9 ± 1,9 y 43,5 ± 2,7 ng/ml a las 3 horas y de 31,9 ± 2,3 a 40,8 ± 3,1 ng/ml a

las 6 horas del inicio de los tratamientos.

Figura 4.3.4.- Niveles de IGF-I en plasma de las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina. No se han encontrado diferencias significativas entre tratamientos a p<0,05 (prueba HSD de Tukey).

0

10

20

30

40

50

60

IGF-

1 (n

g/m

l)


DIETA D0


10

20

30

40

50

60IG

F-1

(ng/

ml)

DIETA D75


0

10

20

30

40

50

60

IGF-

1 (n

g/m

l)


DIETA D0

0

10

20

30

40

50

60

IGF-

1 (n

g/m

l)

0 horas 3 horas 6 horas0 horas 3 horas 6 horas

DIETA D0


10

20

30

40

50

60IG

F-1

(ng/

ml)

DIETA D75


00 horas 3 horas 6 horas0 horas 3 horas 6 horas

10

20

30

40

50

60

10

20

30

40

50

60IG

F-1

(ng/

ml)

DIETA D75



123

4.3.4.- Caracterización de los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco de las doradas: efectos de la administración de glucosa y arginina.

Los distintos parámetros analizados de los receptores de insulina en el músculo

blanco de dorada, no mostraron cambios significativos entre tratamientos de arginina y

glucosa respecto al control (salino) a las 3 horas de la inyección y en todos los grupos se

observó una elevada variabilidad en estos parámetros. En la dieta D0, la constante de

disociación de los receptores de insulina varió entre 0,40 ± 0,09 y 0,56 ± 0,23 nM, y el

número de receptores fue de 122,8 ± 22,8 a 207,4 ± 67,4 fmol/mg de proteína. En la

dieta D75, la constante de disociación del receptor de insulina fue de 0,38 ± 0,05 a 0,75

± 0,36 nM y el número de receptores de insulina varió entre 179,7 ± 6,7 y 214,5 ± 104,6

fmol/mg de glucoproteína (Tabla 4.3.2).

En los receptores de IGF-I, la Kd de IGF-I fue menor al de los receptores de

insulina. Para ambas dietas, las Kd y los números de receptores de IGF-I fueron

similares entre tratamientos. En la dieta D0, la Kd del IGF-I estuvo en el rango de 0,11

± 0,04 a 0,12 ± 0,03 nM, el número de receptores de IGF-I fue de 52,3 ± 22,2 a 80,4 ±

36,6 fmol/mg de glucoproteína. En la dieta D75, la Kd de IGF-I osciló en el rango de

0,05 ± 0,02 a 0,08 ± 0,02 nM, los números de receptores de IGF-I variaron entre 128,5

± 11,2 y 171,8 ± 49,8 fmol/mg de glucoproteína (Tabla 4.3.2). En el grupo D75, los

números de receptores de IGF-I fueron superiores a los valores registrados para el

grupo de la dieta D0. Además, se observó una constante de disociación menor en el

grupo de la dieta D75.

Tabla 4.3.2.- Características de los receptores de insulina e IGF-I en los músculo blancos de doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino, glucosa y arginina después de 3 horas del tratamiento.

Kd, Constante de disociación (nM); Ro, Número de receptores (fmol/mg de glucoproteína)

No existen diferencias significativas entre tratamientos a p<0,05 (prueba T-Student).

Kd INS 0,51 ± 0,31 0,40 ± 0,09 0,56 ± 0,23 0,38 ± 0,05 0,55 ± 0,11 0,75 ± 0,36

Kd IGF-1 0,12 ± 0,03 0,11 ± 0,08 0,11 ± 0,04 0,07 ± 0,02 0,08 ± 0,02 0,05 ± 0,02

Ro INS 143,3 ± 64,0 122,8 ± 22,8 207,4 ± 67,4 179,7 ± 30,4 208,8 ± 51,0 214,5 ± 104,6

Ro IGF-1 56,8 ± 19,1 52,3 ± 22,2 80,4 ± 36,6 128,5 ± 11,2 136,0 ± 29,1 171,8 ± 49,8

Salino Glucosa Arginina

DIETA D0 DIETA D75



124

En ambas dietas, las uniones de las hormonas a sus receptores (binding)

específicos de insulina no mostraron diferencias entre tratamientos (Figura 4.3.5). En la

dieta D0, los valores del binding estuvieron entre 2,9 ± 0,3 y 4,3 ± 0,6 % para 20 µg de

glucoproteína. En el grupo D75, el binding de insulina fue de 4,4 ± 0,9 a 5,9 ± 3,8 %

para 20 µg de glucoproteína.

Los valores del binding específico de IGF-I fueron similares entre los diferentes

grupos de animales tratados con glucosa y arginina respecto al control en ambas dietas.

Sin embargo en el grupo D75, los niveles de binding de IGF-I fueron superiores a los

observados (del orden de 3 veces más) para los receptores de IGF-I del grupo D0 .

En el grupo de la dieta D75, los niveles del binding específico de los receptores

de IGF-I fueron superiores del orden de 3 veces más que los valores de los receptores de

insulina (Figura 4.3.5).

Figura 4.3.5.- Niveles de binding de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo blanco de las doradas alimentadas con las dietas D0 y D75 e inyectadas con salino (S), glucosa (G) y arginina (A) después de 3 horas del tratamiento. No se han encontrado diferencias significativas entre tratamientos a p<0,05 (prueba HSD de Tukey).

DIETA D0 DIETA D75DIETA D0 DIETA D75

0

5

10

15

20

25

% B

sp/2

0 ug

de p

rote

ína

S G A S G A

Binding de los receptores de IGF-1

S G A S G A

Binding de los receptores de insulina

0

5

10

15

20

25

% B

sp/2

0 ug

de p

rote

ína

0

5

10

15

20

25

% B

sp/2

0 ug

de p

rote

ína

S G A S G A


0

5

10

15

20

25

% B

sp/2

0 ug

de p

rote

ína

S G A S G A


S G A S G A


0

5

10

15

20

25

% B

sp/2

0 ug

de p

rote

ína

S G A S G A


0

5

10

15

20

25

% B

sp/2

0 ug

de p

rote

ína


125

4.3.5.- Discusión. En este bloque experimental, se dan a conocer los resultados de los efectos de

tratamientos de glucosa y arginina sobre la secreción de las hormonas pancreáticas

insulina y glucagón en doradas alimentadas con las dietas D0 y D75. A pesar de que se

han realizado estudios de los efectos de dichos metabolitos sobre la insulina en otras

especies como salmónidos, se desconocen los posibles efectos en la dorada.

Las doradas alimentadas con la dieta D75 no mostraron diferencias significativas

en los parámetros de crecimiento respecto al grupo control después de 6 semanas,

aunque en la dieta D75 se observó una tendencia a un menor crecimiento.

Contrariamente en el bloque experimental II, doradas alimentadas con dietas idénticas

durante 12 semanas, el crecimiento fue claramente menor con la dieta D75. En el bloque

experimental II, los pesos corporales iniciales de las doradas fueron inferiores a las del

presente estudio; este hecho indicaría que en individuos más grandes, cabe la

posibilidad de que el incremento de proteína vegetal en la dieta no afecte al crecimiento

de los animales. También hay que tener en cuenta que el período experimental es más

corto y durante una época del año algo distinta (agosto-septiembre). Al igual que en el

bloque experimental II, las doradas alimentadas con la dieta D75 consumieron

cantidades de alimento inferiores que los animales del grupo D0 aunque no

significativamente.

En el presente experimento, los tratamientos con glucosa generaron incrementos

en las glucemias de los animales como cabía esperar. Sin embargo, las respuestas en los

niveles de glucosa plasmática fueron diferentes entre dietas. En peces existen diversos

estudios en los que se han señalado hiperglucemias similares a las observadas en la

presente investigación después de tratamientos con glucosa (Blasco et al., 1996; Blasco

et al., 2001; Harmon et al., 1991). También se han observado niveles postprandiales de

glucosa elevados en peces alimentados con dietas enriquecidas de carbohidratos

(Furuichi y Yone, 1981; Ince y Thorpe, 1974; Mazur et al., 1992). Por todo ello se ha

considerado a estas especies poco tolerantes a la glucosa, debido a la hiperglucemia

prolongada tras su administración producto de la menor utilización de dicho metabolito

(Moon T., 2001).


126

En peces, los efectos del tratamiento de glucosa sobre los niveles de insulina son

diversos. En dorada, el tratamiento de glucosa en el presente experimento no produjo un

aumento significativo en los niveles de insulina a lo largo del período observado, al

igual que estudios en anguilas, pez gato y tilapia (Ince y Thorpe, 1974; Ottolenghi et al.,

1995; Wilson y Poe, 1987). Sin embargo, en especies como carpa, salmón chinook y

trucha común, el tratamiento de glucosa estimuló el incremento de la insulina

plasmática (Blasco et al., 1996; Blasco et al., 2001; Furuichi y Yone, 1981). En trucha

común, inyecciones intraperitoneales de glucosa generaron la disminución de los

niveles de insulina plasmática en los animales (Harmon et al., 1991). Blasco y

colaboradores (2001) en trucha común tras una carga de glucosa intravenosa, han

determinado que el incremento de la insulina en plasma se da durante las 2 primeras

horas después del tratamiento y que a las 3 horas, los niveles de insulina plasmática son

similares a los basales. Por tanto, cabe la posibilidad de que el estímulo de la glucosa

sobre la secreción de insulina pudo haber sucedido en el presente trabajo antes de las 3

horas. Sin embargo, el efecto de la administración intraperitoneal es siempre más lento.

Además en algunos estudios en peces, se ha descrito que la administración de glucosa

genera un incremento de la secreción de somatostatina, que inhibe la secreción de

insulina (Ronner y Scarpa, 1987), que podría ser otra posible causa de no observar

cambios en los niveles de insulina plasmática en está investigación.

Los estudios del efecto de la glucosa sobre los niveles de glucagón son escasos

en peces. Las respuestas de está hormona son variadas en función de la especie. En

dorada, en el presente trabajo, el tratamiento de glucosa no generó cambios en los

niveles de glucagón en ambas dietas. En estudios in vivo e in vitro, el tratamiento de

glucosa incluso aumenta la secreción de glucagón en trucha arco iris, anguila y pez gato

(Harmon et al., 1991; Ince y So, 1984; Ronner y Scarpa, 1987). Por otro lado, Carneiro

y col. (1993) han descrito que inyecciones intraperitoneales de glucosa, así como

tratamientos con dietas enriquecidas con carbohidratos (Novoa et al., 2004), provocan la

disminución de los niveles de glucagón en trucha común. Al igual que en mamíferos

este efecto inhibidor también se intuye en los resultados de está tesis, al menos si se

compara con los efectos producidos por la arginina.

Tanto en mamíferos como en peces, la arginina es un potente estimulador de la

secreción de la insulina (Mommsen y Plisetkaya, 1991). En salmónidos, la arginina


127

puede llegar a incrementar en unas 3-9 veces los niveles de insulina en plasma (Párrizas

et al., 1994a; Baños et al., 1999); se han utilizado inyecciones con este aminoácido en

diversos estudios como modelo de hiperinsulinemia (Carneiro et al., 1993; Párrizas et

al., 1994a; Baños et al., 1999; Mommsen et al., 2001). Sin embargo, en este primer

estudio de los efectos de inyecciones de arginina en dorada, los resultados obtenidos

indican que independientemente de la dieta, dosis altas de arginina sólo incrementan dos

veces los niveles insulina circulante. Esta menor respuesta de la insulina es similar a la

encontrada en carpa (Baños et al., 1997; Párrizas et al., 1994b), lo que sugiere una baja

sensibilidad de las células pancreáticas betas a este aminoácido en estas especies, si se

compara con la respuesta en los salmónidos y otras especies carnívoras.

En salmónidos, cuando se estudian los efectos de los tratamientos de arginina

sobre la insulina y el glucagón, la acción insulinotrópica predomina sobre la

estimulación del glucagón (Carneiro et al., 1993), con disminución o sin cambios en la

glucemia (Plisetkaya et al., 1991). Sin embargo, los resultados de la presente

investigación en dorada muestran una estimulación mayor del glucagón que la insulina.

Además, el incremento de la relación glucagón/insulina podría haber mediado el estado

de hiperglucemia en los peces tratados con arginina, ya que los perfiles plasmáticos de

glucosa y glucagón son paralelos a lo largo del tiempo. Estas observaciones son

apoyadas al hacer las comparaciones entre animales alimentados con las dietas D0 y

D75. La respuesta menor del glucagón en el grupo D75 coincide con el incremento

menor de los niveles de glucosa en plasma. Este factor junto con el aumento similar de

la insulina plasmática en ambas dietas (D0 y D75), sugiere que la respuesta conjunta de

la insulina y glucagón a la arginina es diferente en ambas dietas. Además, al igual que

en mamíferos donde niveles de glucagón elevados estimulan la secreción de la insulina,

el efecto insulinotrópico del glucagón también ha sido observado en peces (Pérez et al.,

1988). Por lo que es posible que los importantes incrementos del glucagón plasmático

observados a las 3 horas de la administración de arginina pudieran aumentar los niveles

de insulina en ambos grupos de dietas a las 6 horas de los tratamientos con arginina.

En mamíferos, los efectos estimuladores de la insulina sobre los niveles de

IGF-I se han demostrado en experimentos in vivo e in vitro (Griffen et al., 1987; Hurson

et al., 1995). Las acciones estimuladoras de la insulina y arginina sobre el IGF-I

también se han demostrado en salmónidos (Baños et al., 1999), así como, la


128

estimulación de la insulina sinérgicamente con la hormona de crecimiento (GH) sobre la

expresión del ARNm del IGF-I en hepatocitos de coho salmón (Duan y Hirano, 1992;

Duan y Plisetskaya, 1993). Se ha sugerido que la GH y la insulina actúan conjuntamente

sobre la síntesis y liberación del IGF-I en el hígado. En el presente trabajo, el efecto

insulinotrópico del tratamiento de arginina fue moderado, e independientemente de la

dieta, la arginina no tuvo un efecto sobre los niveles de GH (de Celis et al., 2004), estas

circunstancias podrían explicar la ausencia de cambios en los niveles plasmáticos de

IGF-I. Todo ello estaría también relacionado con la disminución de la actividad del eje

somatotrópico, que podría contribuir a la pérdida de la respuesta del IGF-I durante está

época del año (Mingarro et al., 2002; Pérez-Sánchez et al., 1994).

En relación a los receptores de insulina e IGF-I del músculo blanco, los

tratamientos de glucosa y arginina no produjeron diferencias en los porcentajes del

binding de los receptores de insulina y IGF-I a las 3 horas del tratamiento. A diferencia

de estos resultados, Planas y col. (2000b) en carpa y trucha han señalado incrementos

del binding de los receptores de insulina, asociados a aumentos de la insulina plasmática

tras los tratamientos de arginina. Probablemente en dorada, la estimulación moderada la

insulina por la administración de arginina puede que no fuese suficiente para generar

cambios a nivel del binding de los receptores de insulina.

Independientemente del tratamiento y la dieta, los tratamientos con glucosa y

arginina no produjeron cambios en los distintos parámetros de caracterización de los

receptores de IGF-I del músculo blanco de dorada. Al igual que en los resultados del

bloque experimental I, en el grupo de la dieta D75, los niveles del binding de los

receptores de IGF-I fueron superiores al binding de los receptores de insulina en el

músculo blanco de dorada. Sin embargo, en el grupo de la dieta D0, no se pudo observar

está diferencia entre los porcentajes del binding del IGF-I respecto a los valores de

binding del receptor de insulina. Estas diferencias en el binding del receptor de IGF-I

respecto al binding del receptor de insulina encontradas entre dietas, no están asociados

a cambios en los niveles del IGF-I en plasma, ya que en el presente experimento no se

han observado diferencias en los niveles plasmáticos de IGF-I entre dietas. Es posible

que este incremento en el binding del receptor del IGF-I fuera un factor compensatorio

que favorecería un mayor crecimiento de las doradas alimentadas con la dieta D75, y


129

explicaría el que no se encontrasen diferencias en los parámetros de crecimiento

respecto al de animales alimentados con la dieta D0.

En resumen en el presente bloque experimental, el tratamiento intraperitoneal

con arginina posee en dorada un efecto secretor de glucagón superior al de la insulina,

independientemente de la dieta, y no produce cambios en los niveles del IGF-I; mientras

que con el tratamiento con glucosa no se ha podido observar cambios en los niveles

plasmáticos de insulina, glucagón e IGF-I. La administración de glucosa y arginina no

produjo cambios a nivel de los receptores de insulina e IGF-I en el músculo blanco de

dorada.

Bloque experimental IV: Resultados y discusión Rojas, P. C.

130

4.4.- BLOQUE IV: Caracterización y clonaje del transportador de

glucosa (saGLUT) del músculo esquelético de dorada.

El presente bloque experimental se realizó con el objetivo de identificar y

caracterizar el transportador de glucosa de difusión facilitada GLUT4 en el músculo de

dorada similar al descrito en otros peces. Para lo cual, a partir del ARNm del músculo

esquelético de dorada se realizó una RT-PCR y una PCR anidada (apartado 3.10.4),

utilizando los cebadores degenerados diseñados para amplificar el transportador de

glucosa de dorada (tabla 3.10.2), y cuyos productos de PCR fueron secuenciados e

introducidos en las bases publicas (BLAST). Posteriormente mediante una RT-PCR se

analizó la distribución tisular del transportador de glucosa. Así como, la regulación a

nivel de proteína del transportador de glucosa en diferentes condiciones fisiológicas,

como el ayuno o situaciones de hiperinsulinemia mediante inyecciones intraperitoneales

de insulina o arginina.

Rojas, P. C. Bloque experimental IV: Resultados y discusión

131

4.4.1.- Clonaje del transportador de glucosa (saGLUT) del músculo esquelético de dorada. En la presente investigación, se obtuvo un fragmento de ADN de 636 pb por

PCR utilizando los cebadores degenerados. La secuencia de aminoácidos deducida a

partir de la secuencia nucleotídica fue un fragmento de proteína de 211 aminoácidos

(Figura 4.4.1). Está secuencia de aminoácidos al ser introducida en las bases públicas

(BLAST), mostró un grado de homología elevado con la familia de transportadores de

glucosa.

1 tttcagcaactcggaggggagacggtgactggaacccttgctctctcagtgttcaccgct

F Q Q L G G E T V T G T L A L S V F T A

61 gtattgggttcctttcagtttgggtacaacataggtgtcatcaacgctcctcagaagatc

V L G S F Q F G Y N I G V I N A P Q K I

121 attgaagcggactacaacgctacatgggtgcatcggtatggagagcccatccccagcagt

I E A D Y N A T W V H R Y G E P I P S S

181 accctcacaaccctctggtccctgtccgtagccatcttctctataggcggtatgatctcc

T L T T L W S L S V A I F S I G G M I S

241 tccttctgtgtgggcgtcatctcagagtggctggggaggaggaaagccatgctcattaac

S F C V G V I S E W L G R R K A M L I N

301 aacttgtttgccttcatcggaggaggtttgatgggcatggccaagatcagcaggtccttc

N L F A F I G G G L M G M A K I S R S F

361 gagatgatgattctgggacgattcgtcatcggtgcatactgtggattggcatcggggctg

E M M I L G R F V I G A Y C G L A S G L

421 gtgcccatgtatgtgggtgagatagcccctaccagtctgcgaggggcattgggcacgctc

V P M Y V G E I A P T S L R G A L G T L

461 caccagctggctatcgtcacagggattctcatggcacaggtcctgggtctggagtctttg

H Q L A I V T G I L M A Q V L G L E S L

521 ctgggcagtgaggagttgtggccagtgctggtgggtgtgaccgttctgcccactgtcctg

L G S E E L W P V L V G V T V L P T V L

581 cagatggtgctgctgcccttctgccccgaaagcca

Q M V L L P F C P E S

Figura 4.4.1.- Secuencias de nucleótidos y aminoácidos del transportador de glucosa de dorada. La secuencia de aminoácidos deducida es representada por letras en mayúscula.


132

En concreto, la secuencia de aminoácidos deducida en el presente estudio,

presentó una alto grado de homología (100%) con un fragmento del transportador de

glucosa (okGLUT4), clonada en Oncorhynchus kisutch. El transportador de glucosa

obtenido en dorada mostró una homología del 96 % respecto al transportador btGLUT4,

clonado de Salmo trutta; y una homología del 89 % con un fragmento del transportador

de glucosa tipo 4 (gmGLUT4), clonado de Gadus morhua. Esta secuencia obtenida se

denominó saGLUT. A partir de la secuencia de aminoácidos deducida se determinó la

existencia de 6 dominios transmembrana señalados en números romanos (Figura 4.4.2).

1 I 50 saGLUT4 ----FQQL-G GETVTGTLAL SVFTAVLGSF QFGYNIGVIN APQKIIEADY okGLUT4 MPSGFQQL-G GETVTGTLAL SVFTAVLGSF QFGYNIGVIN APQKIIEADY btGLUT4 MPPGFQHL-G GETVTGTLAL SVFTAVLGSF QFGYNIGVIN APQKIIEADY gmGLUT4 MPAGFQQLNG GETVTRTLAL SVFTAVLGSL QFGYNIGVIN APQKIIEQDY 51 II 100 saGLUT4 NATWVHRYGE PIPSSTLTTL WSLSVAIFSI GGMISSFCVG VISEWLGRRK okGLUT4 NATWVHRYGE PIPSSTLTTL WSLSVAIFSI GGMISSFCVG VISEWLGRRK btGLUT4 NATWVHRYGE LIPTATLTTP WSLSVAIFSI GGMISSFCVG VISEWLGRRK gmGLUT4 NATWQHRYGE PISPGTLTSL WSLSVAIFSI GGMASSFCVG FVSEWLGRRK 101 III IV 150 saGLUT4 AMLINNLFAF IGGGLMGMAK ISRSFEMMIL GRFVIGAYCG LASGLVPMYV okGLUT4 AMLINNLFAF IGGGLMGMAK ISRSFEMMIL GRFVIGAYCG LASGLVPMYV btGLUT4 AMLINNLFAF IGGSLMGMAK ISRSFEMMIL GRFVIGAYCG LASGLVPMYV gmGLUT4 AMLINNLFAF IGGGLMGMSK ICRSIEMMVL GRFVIGAYCG LASGLTPMYV 151 V 200 saGLUT4 GEIAPTSLRG ALGTLHQLAI VTGILMAQVL GLESLLGSEE LWPVLVGVTV okGLUT4 GEIAPTSLRG ALGTLHQLAI VTGILMAQVL GLESLLGSEE LWPVLVGVTV btGLUT4 GEIAPTSLRG ALGTLHQLAI VTGILIAQVL GLESLLGSEE LWPVLVGVTV gmGLUT4 GEIAPTSLRG ALGTLHQLAI VTGILIAQVL GLEALLGSEA LWPVLLGVTV 201 VI saGLUT4 LPTVLQMVLL PFCPES okGLUT4 LPTVLQMVLL PFCPES btGLUT4 LPTVLQMALL PFCPES gmGLUT4 LPTVLQMALL PFCPES

Figura 4.4.2.- Alineamiento de aminoácidos del transportador de glucosa de dorada (saGLUT) con las secuencias de transportadores de glucosa de diferentes especies, okGLUT4 (Oncorhynchus kisutch, GenBank: AF502957), btGLUT4 (Salmo trutta, GenBank: AF247395), y gmGLUT (Gadus morhua, GenBank: DQ109810). Las cajas con números romanos corresponden a seis dominios transmembrana. Aminoácidos de motivos importantes se señalan en negritas.


133

4.4.2.- Expresión tisular del transportador de glucosa de dorada (saGLUT). En la figura 4.4.3, se muestra la distribución tisular del saGLUT de dorada

analizada del ARNm mediante RT-PCR con 30 ciclos en la reacción de PCR, en el que

se utilizaron cebadores específicos diseñados a partir de la secuencia de nucleótidos

clonada del saGLUT. Las intensidades de las bandas de la RT-PCR del saGLUT, nos

indican que la expresión del ARNm del saGLUT es superior en el músculo rojo,

músculo blanco, corazón, cerebro, hígado, gónada y ojo. En las branquias, intestino,

riñón anterior, riñón posterior y piel, el saGLUT presenta una expresión intermedia y

una expresión del saGLUT inferior en el tejido adiposo, estómago y especialmente en

el bazo donde la expresión es muy baja.

Figura 4.4.3.- Distribución tisular del saGLUT de dorada a partir de RT-PCR utilizando cebadores específicos de saGLUT (parte superior) y 18S (parte inferior).

mús

culo

rojo

mús

culo

bla

nco

cora

zón

cere

bro

híga

dogó

nada

bran

quia

sin

testi

nori

ñón

ante

rior

riñó

n po

steri

orba

zo

ojo

piel

estó

mag

ote

jido

adip

oso

cont

rol +

(act

ina)

cont

rol -

(act

ina)

saGLUT

18S

mús

culo

rojo

mús

culo

bla

nco

cora

zón

cere

bro

híga

dogó

nada

bran

quia

sin

testi

nori

ñón

ante

rior

riñó

n po

steri

orba

zo

ojo

piel

estó

mag

ote

jido

adip

oso

cont

rol +

(act

ina)

cont

rol -

(act

ina)

saGLUT

18S


134

4.4.3.- Validación del anticuerpo para la determinación del transportador de glucosa de dorada (saGLUT). Los niveles de proteína del saGLUT fueron analizados por inmunodetección.

Para lo cual, mediante western blot se procedió a la validación del anticuerpo policlonal

de conejo diseñado contra el extremo carboxilo terminal del transportador de glucosa de

salmón btGLUT4 (Capilla et al., 2004). Se utilizaron diferentes diluciones de anticuerpo

(1:1000, 1:500, 1:200) en varias cantidades de extractos totales de proteínas del

músculo rojo de dorada (25, 50 y 100 µg). En la figura 4.4.4, se detectó una sola banda

de aproximadamente 50 kDa del mismo tamaño a la detectada en trucha. Además se

observó una buena correlación entre la cantidad de proteína y la concentración del

anticuerpo para la inmunodetección. La concentración de 50 µg de proteína y la

dilución del anticuerpo de 1:500 fueron las condiciones seleccionadas para los estudios

posteriores de western blot.

Figura 4.4.4.- Inmunodetección del saGLUT mediante western blot en el músculo rojo de dorada, utilizando diferentes concentraciones de proteínas y diluciones del anticuerpo btGLUT4.

4.4.4.- Efecto del ayuno sobre el transportador de glucosa de dorada (saGLUT).

En el experimento de ayuno de 2 semanas en dorada (apartado 3.1.4), los pesos

corporales finales fueron similares entre los grupos de animales alimentados y

ayunados. Sin embargo, las doradas ayunadas mostraron pesos de los hígados y valores

de los índices hepatosomáticos inferiores a los de las alimentadas. No se observaron

cambios en la glucemia de los animales ayunados respecto a los alimentados. En

dorada, el ayuno provocó una disminución de los valores de insulina en plasma (Tabla

4.4.1).

MW50 kDa 100 50 25 Trucha 50 25 100 50 25 µg

1/200 1/500 1/1000 Ab 1ario

MW50 kDa 100 50 25 Trucha 50 25 100 50 25 µg

1/200 1/500 1/1000 Ab 1ario


135

Tabla 4.4.1.- Características corporales y parámetros en plasma de las doradas en el experimento de ayuno después de 2 semanas.

Alimentados Ayunados

Características corporales

Peso corporal final (g) 122,8 ± 6,6 116,3 ± 7,5

Hígado (g) 1,48 ± 0,11 0,84 ± 0,12*

Índice Hepatosomático 1,22 ± 0,09 0,72 ± 0,09*

Parámetros en plasma

Glucosa (mg/dL) 128,1 ± 9,3 113,2 ± 3,1

Insulina (ng/mL) 5,02 ± 1,61 1,23 ± 0,57*

Índice Hepatosomático = 100 x (peso del hígado) / (peso corporal) a,b Medias con diferentes letras indican diferencias significativas entre tratamientos ( p<0,05; prueba T-Student).

En el músculo esquelético de dorada, el ayuno mostró un efecto diferente sobre

el transportador de glucosa (saGLUT) según el tipo de músculo; aunque, la diferencia

no fue significativa. En las doradas ayunadas, se observaron incrementos de los niveles

de proteína del saGLUT en los músculos rojos. Mientras que en músculo blanco, la

cantidad del saGLUT mostró una tendencia a disminuir con el ayuno.

Figura 4.4.5.- Efecto del ayuno de 2 semanas sobre los niveles de proteínas del saGLUT en los músculos rojos y blancos de dorada. No se encontraron diferencias significativas entre las doradas alimentadas y ayunadas a p<0,05 (prueba T-Student).

MÚSCULO ROJO

0

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a

Alimentadas Ayunadas

MÚSCULO BLANCO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6


Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a

MÚSCULO ROJO

0

0,04

0,08

0,12

0,16

0,20

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a


MÚSCULO BLANCO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6


Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a


136

4.4.5.- Efectos de la administración intraperitoneal de insulina sobre el transportador de glucosa (saGLUT) en el músculo esquelético de dorada .

En el músculo rojo de dorada, se observó un incremento del nivel de proteína del

saGLUT a las 3 horas de la inyección de insulina. En cambio, en el músculo blanco, el

tratamiento de insulina no provocó cambios a nivel de proteína en el transportador de

glucosa (saGLUT) a las 3 horas de la inyección (Figura 4.4.6).

Figura 4.4.6.- Efectos de la insulina sobre los niveles de proteína del saGLUT en los músculos rojos y blancos de dorada a las 3 horas de la inyección. Asterisco representa diferencia significativa entre grupo salino e insulina a p<0,05 (prueba T-Student).

A las 24 horas de una inyección de insulina, los niveles de proteína del saGLUT

no presentaron diferencias respecto a los animales tratados con la solución salina ni en

músculo rojo ni en músculo blanco de dorada (Figura 4.4.7).

Figura 4.4.7.- Efectos de la insulina sobre los niveles de proteína del saGLUT en los músculos rojos y blancos de doradas a las 24 horas de la inyección. No se encontraron diferencias significativas entre las doradas alimentadas y ayunadas a p<0,05 (prueba T-Student).

MÚSCULO ROJO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a MÚSCULO BLANCO

0

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

aMÚSCULO ROJO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a MÚSCULO BLANCO

0

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a

MÚSCULO BLANCO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a MÚSCULO ROJO

*MÚSCULO BLANCO

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

Salino Insulina

Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a MÚSCULO ROJO

*


137

4.4.5.- Efectos de la administración de glucosa y arginina sobre el transportador de glucosa en el músculo blanco de dorada (saGLUT).

Los análisis de proteína de saGLUT a partir de muestras de los músculos blancos

de las doradas alimentadas con la dieta D0 del experimento de inyección de glucosa y

arginina (bloque experimental III), mostraron que la glucosa y la arginina incrementaron

significativamente los niveles de proteínas de saGLUT a las 3 horas de las inyecciones

(Figura 4.4.8). Tanto en los animales tratados con glucosa como arginina, los niveles de

saGLUT fueron 4 veces superiores a los observados en los animales controles (salino).

Figura 4.4.8.- Efectos de la glucosa y arginina sobre los niveles de proteínas del saGLUT en los músculos blancos de doradas alimentadas con la dieta D0 a las 3 horas del inyecciones. a,b Valores promedios con letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos experimentales p<0,05 (prueba HSD Tukey, ANOVA).

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a b

a

b

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8


Rel

ació

n sa

GLU

T/A

ctin

a b

a

b


138

4.4.6.- Discusión.

En el presente trabajo, se ha clonado en dorada un fragmento de nucleótidos que

al ser introducido y traducido en aminoácidos dentro de las bases públicas (BLAST),

presentó una homología elevada con los fragmentos de proteínas de la familia de

transportadores de glucosa de difusión facilitada (GLUTs). El alineamiento y los

análisis de la secuencias de GLUTs clonados en peces, nos evidencian el alto grado de

conservación estructural de los diferentes GLUTs caracterizados en peces. La secuencia

de aminoácidos obtenida del saGLUT fue idéntica a la del fragmento correspondiente de

la proteína del transportador de glucosa del tejido adiposo (okGLUT4), clonada en

Oncorhynchus kisutch (GenBank: AF502957). El saGLUT tuvo una homología del 96

% respecto al transportador (btGLUT4), clonada del músculo esquelético de Salmo

trutta (GenBank: AF247395); y una homología del 89 % con el fragmento del

transportador de glucosa tipo 4 (gmGLUT), clonado de Gadus morhua (GenBank:

DQ109810). La fracción clonada del transportador de glucosa saGLUT presentó 6

dominios transmembrana de forma similar a los dominios transmembrana encontrados

en el btGLUT4 por Planas y colaboradores (2000). Asimismo, en el saGLUT entre los

dominios transmembrana I y II se encontró un residuo asparagina (lugar de

glicosilación) en la misma posición que en los descritos en el btGLUT4 y algunos

GLUTs de mamíferos y aves (Planas et al., 2000a). Además, en el dominio de VI del

saGLUT se encontraron los residuos prolinas que aparentemente tendrían un papel

importante en la actividad del transporte de glucosa, y que sería una región muy

conservada en los diferentes GLUTs a excepción del GLUT2 (Planas et al., 2000a;

Wellner et al., 1995).

El análisis de la expresión tisular del ARNm de saGLUT mediante RT-PCR, nos

indica que está proteína se expresa en todos los tejidos analizados, pero con una

expresión del saGLUT superior en el músculo rojo, músculo blanco y otros tejidos

como cerebro, gonada y ojo. En Salmo trutta, la expresión tisular del btGLUT4

predomina en el músculo esquelético, branquias y riñones (Planas et al., 2000a).

Mientras en dorada la expresión del saGLUT fue similar en más tejidos, excepto en el

tejido adiposo, estómago y bazo donde la expresión fue baja. Teniendo en cuenta que el

músculo esquelético representa una zona de elevada captación del glucosa en Salmo


139

trutta (Blasco et al., 1996), y la predominancia de la expresión del btGLUT4 en el

músculo rojo y blanco, los patrones de expresión tisular del saGLUT podrían estar

asociados a las zonas de captación de glucosa tal y como se ha sugerido en Salmo trutta

(Planas et al., 2000a). Los resultados de expresión tisular del saGLUT en dorada, nos

indicarían una mayor capacidad de captación glucosa por parte del conjunto de tejidos

en está especie con respecto a Salmo trutta.

En la comparación de la secuencia del saGLUT respecto a otros GLUTS en las

bases públicas (BLAST), los resultados indican una gran homología del saGLUT con

los transportadores de glucosa GLUT4 de diferentes mamíferos. En peces, los estudios

filogenéticos de GLUTs, señalan la homología elevada del btGLUT4 y el okGLUT4

con diferentes isoformas de GLUT4s de mamíferos (Planas et al., 2000a; Capilla et al.,

2004). En mamíferos, el GLUT4 es una proteína que se expresa principalmente en

músculo y tejido adiposo, regulado por insulina y señales metabólicas (Ikemoto et al.,

1995; Kahn, 1996). En peces, los resultados obtenidos con el btGLUT4 y okGLUT4

también evidencian la regulación sobre estos transportadores por parte de la insulina y

el estado fisiológico de los animales (Capilla et al., 2004a; Capilla et al., 2002).

Para evaluar los efectos sobre los niveles de proteína del saGLUT en diferentes

estados metabólicos, se validó el western blot del saGLUT. Se detectó una proteína de

50 kDa aproximadamente utilizando el anticuerpo dirigido contra el btGLUT4. Este

peso molecular es similar al de los detectados para los otros GLUT4s de peces (Capilla

et al., 2004a). Estos resultados, junto con la buena correlación observada entre la

cantidad de proteína y la concentración de anticuerpo, demuestran la validez del

anticuerpo anti-btGLUT4 para la detección de los niveles de proteína de saGLUT.

En la presente investigación, el ayuno no provocó cambios significativos en los

niveles de proteínas del saGLUT, ni en el músculo rojo ni en el músculo blanco, a pesar

de la disminución en los niveles de insulina plasmática de las doradas ayunadas. En

mamíferos existen diversos estudios que señalan que la expresión del GLUT4 en el

músculo esquelético es regulada de forma distinta en función de la fibra muscular, ya

que en músculos con predominio de fibras rojas ó oxidativas expresan el GLUT4 en

mayor medida que en músculos con fibras blancas o anaeróbicas (Camps et al., 1992;

Stephens y Pilch, 1995). En ratas, el ayuno provoca la disminución de los niveles de


140

proteína del GLUT4 en el músculo oxidativo, originada por la disminución de la síntesis

de la proteína o el incremento de la tasa de degradación del GLUT4, ya que no se han

observado efectos del ayuno sobre la expresión del ARNm de GLUT4; mientras que en

el músculo anaeróbico, el ayuno no producen cambios en el nivel de proteína del

GLUT4, a pesar de provocar un aumento en la expresión del ARNm de GLUT4 (Camps

et al., 1992). A diferencia de lo observado en mamíferos, el ayuno provocó una

disminución significativa del ARNm de btGLUT4 en el músculo rojo de la trucha

común; mientras en el músculo blanco no se produjeron cambios en los niveles de

expresión del btGLUT (Capilla et al., 2004a). Estas diferencias entre mamíferos y peces

en la regulación del GLUT4 especialmente en el músculo rojo podrían ser causadas por

las diferencias en la distribución de las fibras musculares de ambos grupos de

vertebrados. En peces, las fibras del músculo rojo y blanco están mucho más segregadas

que en mamíferos. Estos 2 tipos de fibras musculares difieren funcionalmente en peces,

así el músculo rojo es aeróbico y permite el mantenimiento de la locomoción, y en

cambio, el músculo blanco es anaeróbico y permite los movimientos rápidos y bruscos

(Bone, 1978). Además, la notable disminución de la tasa metabólica que se observa en

peces durante el ayuno (Navarro et al., 1992) podría influir en la regulación del saGLUT

en músculo esquelético.

En Salmo trutta, los resultados sobre la regulación del btGLUT4 sugieren que la

insulina podría estimular la expresión del btGLUT4 en el músculo esquelético rojo.

Mientras en músculo blanco, la expresión del btGLUT4 no parece estar regulada por la

insulina (Capilla et al., 2002). Estos resultados están de acuerdo con los encontrados en

está tesis, donde los resultados de la administración de insulina también parecen indicar

que a nivel de proteína, el saGLUT podría estar estimulado por la insulina en el

músculo rojo, mientras en músculo blanco, la insulina no tendría ningún efecto sobre el

saGLUT. Sin embargo, en este estudio se ha observado que los niveles de proteína de

saGLUT en el músculo blanco aumentan significativamente con tratamientos de glucosa

y de arginina que provocan una respuesta endógena de insulina y otros factores, que en

su conjunto son incluso más efectivos que un tratamiento directo con insulina sobre la

regulación del transportador de glucosa, aunque no se ha comprobado en este trabajo.

Posiblemente dichos tratamientos también generan un incremento de la expresión del

ARNm del saGLUT similar al descrito para el btGLUT en el músculo rojo por Capilla y

colaboradores (2002).


141

En resumen, en el presente bloque experimental, se ha comprobado la existencia

de un transportador de glucosa GLUT4 en dorada similar al descrito en otros peces, al

que se ha denominado saGLUT. Los experimentos in vivo han demostrado que en el

músculo rojo de dorada, la insulina aumenta los niveles de proteína del saGLUT.

Mientras que en el músculo blanco, no se ha podido observar ningún efecto directo de la

insulina exógena sobre el saGLUT. No obstante, la respuesta del saGLUT en el músculo

blanco al tratamiento con glucosa y arginina sugiere la existencia de mecanismos de

regulación de dicho transportador probablemente a través de la insulina endógena y

otros factores que necesitan de mayor estudio.

5.- CONCLUSIONES

Rojas, P. C. Conclusiones

145

1) Tanto en trucha arco iris como en dorada, la alimentación con dietas basadas en

los perfiles de aminoácidos esenciales del músculo determinaron parámetros de

crecimiento de los animales muy próximos a peces que fueron alimentados con

dietas diseñadas a partir del perfil de aminoácidos esenciales de la composición

corporal.

2) Independientemente de los perfiles de aminoácidos esenciales de las dietas

(corporal o músculo), la variación del balance entre aminoácidos esenciales y no

esenciales en la dieta (por el incremento del ácido glutámico), no afecto al

crecimiento ni en trucha arco iris ni en dorada.

3) En ambas especies, los niveles plasmáticos postprandiales de glucosa e insulina

no presentaron variaciones en función del perfil de aminoácidos esenciales de la

dieta. Sin embargo, las dietas suplementadas con el ácido glutámico tuvieron en

ambas especies un efecto estimulador menor en la secreción postprandial de la

insulina, y que no alteraron los distintos parámetros de caracterización de los

receptores de insulina en el músculo blanco.

4) Los niveles de glucagón son más elevados en dorada que en trucha arco iris. La

respuesta postprandial del glucagón a las dietas con diferentes perfiles y

contenido de aminoácidos es distinta entre ambas especies. En trucha arco iris, la

dieta con el perfil de aminoácidos esencial corporal posee un efecto secretor

mayor sobre el glucagón postprandial que las dietas del perfil del músculo.

Mientras en dorada, el perfil de aminoácidos esenciales de la dieta produce

cambios menores en la secreción del glucagón a las 6 horas del postprandial y

con un perfil inverso al de la trucha.

5) En trucha arco iris, la similitud en los parámetros de crecimiento obtenidos con

la dieta control y las de sustitución nos indican que en nuestras condiciones de

cultivo, se puede realizar un nivel de sustitución entre 50 y el 75 %. En la

dorada, en nuestras condiciones de cultivo (experimentales), los parámetros de

crecimiento sugieren una adaptación menor que la trucha a la sustitución de

proteína animal por proteína vegetal.

Conclusiones Rojas, P. C.

146

6) En ambas especies, la sustitución de proteína animal por proteína vegetal en la

dieta, no produce alteraciones en la respuesta postprandial del glucagón, insulina

y glucosa, ni afectan en trucha arco iris a la expresión del ARNm del

transportador de glucosa GLUT4.

7) En dorada, independientemente de la dieta suministrada, el tratamiento

intraperitoneal con arginina estimuló la secreción de glucagón en mayor medida

que la insulina, con un efecto final hiperglucémico, sin afectar los niveles

circulantes de IGF-I. La dosis administrada de glucosa no alteró los niveles

plasmáticos de dichas hormonas.

8) En dorada, se ha obtenido un fragmento de ADN de 636 pb, que ha demostrado

la existencia de un transportador de glucosa GLUT4 similar al descrito en otros

peces, al que se ha denominado como saGLUT, y que se expresa en diversos

tejidos principalmente en el músculo esquelético.

9) En el músculo rojo de dorada se ha demostrado que la insulina aumenta los

niveles de proteína del saGLUT. Mientras que en el músculo blanco, no se ha

podido observar directamente ningún efecto de la insulina sobre el saGLUT. No

obstante, la respuesta del saGLUT en el músculo blanco al tratamiento con

glucosa y arginina sugiere la existencia de mecanismos de regulación de dicho

transportador que necesitan de mayor estudio.

6.- BIBLIOGRAFIA

Rojas, P. C. Bibliografía

149

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