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FACULDADE DE MEDICINA DE MARÍLIA
PRISCILA RAMOS DE OLIVEIRA
EFEITOS DO EXERCÍCIO FÍSICO SOBRE AS RESPOSTAS DA
AORTA À ANGIOTENSINA II EM RATOS NORMOTENSOS E
HIPERTENSOS 2R1C
MARÍLIA
2017
Priscila Ramos de Oliveira
Efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos
e hipertensos 2R1C
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
Acadêmico em ”Saúde e Envelhecimento” da
Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Saúde e
Envelhecimento.
Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies.
Co-orientadora: Profa. Dra. Patrícia de Souza
Rossignoli.
Marília
2017
Autorizo a reprodução parcial ou total deste trabalho, para fins de estudo e pesquisa,
desde que citada a fonte.
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina de Marília
Oliveira, Priscila Ramos de. Efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C / Priscila Ramos de Oliveira. - - Marília, 2017. 53 f. Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies. Coorientadora: Profa. Dra. Patrícia de S. Rossignoli. Dissertação (Mestrado Acadêmico em Saúde e Envelhecimento) - Faculdade de Medicina de Marília.
1. Angiotensina II. 2. Aorta. 3. Hipertensão. 4.
Endotélio. 5. Exercício. 6. Óxido nítrico. 7. Superóxidos.
O48e
Priscila Ramos de Oliveira
Estudo dos efeitos do exercício físico sobre as respostas da aorta à Angiotensina II em ratos
normotensos e hipertensos 2R1C
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado
Acadêmico em “Saúde e Envelhecimento” da
Faculdade de Medicina de Marília, para obtenção do
título de Mestre. Área de concentração: Saúde e
Envelhecimento.
Banca examinadora:
_________________________________________
Prof. Dr. Agnaldo Bruno Chies
Faculdade de Medicina de Marília
_________________________________________ Prof. Dr. Carlos Alberto Lazarini
Faculdade de Medicina de Marília
_________________________________________
Profa. Dra. Maricelma da Silva Soares de Souza
Universidade de Marília
Data da aprovação:___________________________
A Jeová Deus,
Ao meu marido Cido,
A minha filhinha Rayssa.
AGRADECIMENTOS
A Jeová Deus, por me dar o discernimento necessário para cumprir esta fase tão
importante da minha vida.
Ao meu marido e filha, por serem minha razão para tudo e obrigada por compreenderem quão
importante foi e sempre será para mim, esta jornada que estou findando.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Agnaldo, por ter me proporcionado este desafio, pela confiança
e pelo conhecimento que venho adquirindo.
A minha co-orientadora, Profa. Dra. Patrícia de Souza Rossignoli, que me proporcionou um
grande crescimento, sempre com muito profissionalismo, dedicação e paciência.
Aos meus amigos:
Priscilla, que é uma luz na minha vida, estando sempre ao meu lado de todas as formas;
Alisson, que sempre me ajudou prontamente e pacientemente;
Gabriela, que me inspira e me ajuda com seu conhecimento e carinho.
E a todos, que de alguma forma me ajudaram a fazer deste sonho, uma realidade.
“O amor é paciente, o amor é bondoso. Não
inveja, não se vangloria, não procura seus
interesses, não guarda rancor. O amor não se
alegra com a injustiça, mas se alegra com a
verdade.” (1 Coríntios 13:4-6)
RESUMO
O presente trabalho objetivou estudar os efeitos do exercício agudo e do treinamento sobre os
mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à angiotensina II (Ang II), em animais
submetidos ao modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip (2R1C). Logo, foi
proposto o estudo funcional das respostas de aortas torácicas à Ang II, nitroprussiato de sódio
e solução despolarizante em ratos machos Wistar normotensos (SHAM) e hipertensos
(2R1C), sedentários e treinados, estudados no repouso e após exercício agudo. Os desafios
com Ang II foram feitos na ausência e na presença de PD 123.319 (inibidor seletivo do
receptor AT2), L-NAME (inibidor não seletivo da óxido nítrico sintase) indometacina
(inibidor não seletivo da cicloxigenase) e tiron (sequestrante de radicais livres). Algumas
preparações foram estudadas após remoção endotelial. Paralelamente, realizaram-se análises
bioquímicas para avaliação da peroxidação lipídica (FOX) e capacidade antioxidante do
plasma (FRAP). Observou-se que o treinamento atenuou as respostas da aorta à Ang II em
animais SHAM. Esta redução de resposta deixou de existir após a remoção endotelial e
tratamento com PD 123.319, L-NAME, indometacina e tiron. A exposição ao exercício agudo
atenuou a sensibilidade da aorta à Ang II em animais 2R1C, atenuação não mais observada
após remoção endotelial e tratamento com PD 123.319 e L-NAME. No entanto, na presença
de indometacina, a magnitude de resposta à Ang II foi reduzida para todos os grupos
experimentais. Adicionalmente, na presença de tiron, houve atenuação da resposta à Ang II
em animais expostos ao treinamento e ao exercício agudo. Curiosamente, o inverso ocorreu
com os animais treinados que foram re-expostos ao exercício. Não houve diferença no padrão
de resposta das aortas após desafio com nitroprussiato e solução despolarizante, tanto em
animais SHAM quanto 2R1C, sedentários e treinados, expostos ou não ao exercício agudo. O
treinamento e/ou o exercício agudo também não alteraram as concentrações plasmáticas de
FOX e FRAP nos animais SHAM e 2R1C. O presente estudo demonstra que, em animais
SHAM, as respostas da aorta à Ang II são moduladas, em animais expostos ao treinamento,
por óxido nítrico de origem endotelial, liberado em consequência da ativação de receptores
AT2. Nos animais 2R1C, este mecanismo endotelial modulador é suprimido pela elevada
concentração tecidual de ânion superóxido que leva a um estado de estresse oxidativo.
Palavras-chave: Angiotensina II. Aorta. Hipertensão. Endotélio. Exercício. Óxido Nítrico.
Superóxidos.
ABSTRACT
The present work aimed to study the effects of acute exercise and training on the local
mechanisms that modulate the aorta responses to angiotensin II (Ang II), in animals submitted
to the two kidney, one clip (2K1C) renovascular hypertension model. Therefore, the
functional study of the thoracic aorta responses to Ang II, sodium nitroprusside and
depolarizing solution were proposed in normotensive (SHAM) and hypertensive (2K1C) male
Wistar rats, sedentary and trained, studied at rest and after acute exercise. The challenges with
Ang II were made in the absence and presence of PD 123.319 (selective AT2 receptor
inhibitor), L-NAME (nonselective inhibitor of nitric oxide synthase) indomethacin (non-
selective cyclooxygenase inhibitor) and tiron (free radical scavenger). Some preparations
were studied after endothelial removal. At the same time, biochemical analyzes were
performed to evaluate lipid peroxidation (FOX) and plasma antioxidant capacity (FRAP). The
training attenuated the responses of the aorta to Ang II in SHAM animals. This reduction in
response ceased to exist after endothelial removal and treatment with PD 123.319, L-NAME,
indomethacin and tiron. Exposure to acute exercise attenuated the sensitivity of the aorta to
Ang II in 2K1C animals, attenuation no longer observed after endothelial removal and
treatment with PD 123.319 and L-NAME. However, in the presence of indomethacin, the
magnitude of response to Ang II was reduced for all experimental groups. Additionally, in the
presence of tiron, there was attenuation of response to Ang II in animals exposed to training
and acute exercise. Interestingly, the inverse occurred with trained animals that were re-
exposed to exercise. There was no difference in the response pattern of the aortas after
challenge with nitroprusside and depolarizing solution, both in SHAM and 2K1C animals,
sedentary and trained, exposed or not to acute exercise. Training and/or acute exercise also
did not alter the plasma concentrations of FOX and FRAP in SHAM and 2K1C animals. The
present study demonstrates that in SHAM animals, the responses of the aorta to Ang II are
modulated, in animals exposed to training, by nitric oxide of endothelial origin, released as a
consequence of the activation of AT2 receptors. In 2K1C animals, this modulating endothelial
mechanism is suppressed by the high tissue concentration of superoxide anion leading to a
state of oxidative stress.
Keywords: Angiotensin II. Aorta. Hypertension. Endothelium. Exercise. Nitric Oxide.
Superoxide.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma do protocolo experimental.....................................................................22
Figura 2 - Massas corporais obtidas de animais SHAM e 2R1C..............................................26
Figura 3 - Massas úmidas cardíacas obtidas em animais SHAM e 2R1C................................26
Figura 4 - Desempenho em esteira dos animais SHAM e 2R1C..............................................27
Figura 5 - Valores de pressão arterial sistólica de ratos SHAM e 2R1C..................................27
Figura 6 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta
intactas e deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença PD 123.319 10-6
M, L-
NAME 10-4
M ou indometacina 10-5
M, provenientes de animais
SHAM.......................................................................................................................................29
Figura 7 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta
intactas e deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6
M, L-
NAME 10-4
M ou indometacina 10-5
M, provenientes de animais
2R1C.........................................................................................................................................31
Figura 8 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aorta
intactas tratadas com tiron 10-4
M, provenientes de animais SHAM e 2R1C..........................33
Figura 9 - Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio obtidas em preparações
de aorta intactas provenientes de animais SHAM e 2R1C.......................................................34
Figura 10 - Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio obtidas em preparações de
aorta deendotelizadas provenientes de animais SHAM e 2R1C...............................................35
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas e
deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6
M, L-NAME
10-4
M ou indometacina 10-5
M, provenientes de animais SHAM.............................................30
Tabela 2 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas e
deendotelizadas em salina, bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6
M, L-NAME
10-4
M ou indometacina 10-5
M, provenientes de animais 2R1C................................................32
Tabela 3 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas na
presença de Tiron 10-4
M, provenientes de animais SHAM e 2R1C.........................................33
Tabela 4 - Valores plasmáticos (µM/L) das análises bioquímicas do balanço redox (FOX e
FRAP) em animais SHAM e 2R1C..........................................................................................34
Tabela 5 - Valores de pEC50 para nitroprussiato de sódio e cloreto de potássio, determinados
em aortas provenientes de animais SHAM e 2R1C..................................................................35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ACh Acetilcolina
AMPc Adenosina-3’,5’-monofosfato cíclico
Ang II Angiotensina II
ANOVA Análise de Variância
Basal Aferição da pressão arterial sistólica antes da cirurgia
BHT
CaCl2
HidroxiTolueno Butilado
Cloreto de Cálcio
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
COX Ciclo-oxigenase
CO2 Gás Carbônico
ECA Enzima Conversora de Angiotensina
EC50 Concentração molar do agonista responsável por 50% do efeito máximo
EET Ácido epóxi-eicosatrienóico
Emax
Endo -
Efeito desencadeado pela concentração supra máxima do agonista
Deendotelização
eNOS Óxido Nítrico Sintase endotelial
E.P.M. Erro Padrão da Média
EROs Espécies Reativas de Oxigênio
FAMEMA Faculdade de Medicina de Marília
FeCl3.6H2O Cloreto Férrico hexahidratado
Fe2+
Íon Ferroso
Fe3+
Íon Férrico
Final Aferição da pressão arterial sistólica quatro semanas após a cirurgia
FOX Complexo Fe3+
- Xilenol Laranja
FRAP Poder Antioxidante de Redução do Ferro
GMPc Monofosfato de Guanosina cíclico
HAS Hipertensão Arterial Sistêmica
HCl Ácido Clorídrico
H2SO4 Ácido Sulfúrico
KCl Cloreto de Potássio
KH2PO4 Fosfato de Potássio
Km/h Quilômetro por hora
LOX Lipo-oxigenase
L-NAME N-nitro-L-arginina-metil-ester
M Molar
mg/dia Miligrama por dia
mg/kg Miligrama por quilo
MgSO4.7H2O Sulfato de Magnésio heptahidratado
mL Mililitro
mmHg Milímetro de mercúrio
mM Milimolar
min. Minuto
mol/L Molar
NaCl Cloreto de Sódio
NADPH Fosfato de Dinucleotídeo de Adenina e Nicotinamida
NaHCO3 Bicarbonato de Sódio
Nm Nanômetro
nM Nanomolar
NO Óxido Nítrico
NOR Noradrenalina
NOS Óxido Nítrico Sintase
ONOO- Peroxinitrito
O2 Gás Oxigênio
O2-
Ânion Superóxido
P Probabilidade de significância
PA
PAS
Pressão Arterial
Pressão Arterial Sistólica
PD 123.319 Bloqueador de receptor AT2 da Angiotensina II
pEC50 Negativo do logarítmo da EC50
pH Escala para medida do potencial Hidrogeniônico
PGI2
PGH2
Prostaciclina
Prostaglandina H2
RPM Rotações Por Minuto
SE Sedentário Exercício
SHAM Normotenso
SNS
SOD
Sistema Nervoso Autônomo Simpático
Superóxido Dismutase
SR Sedentário Repouso
SRAA Sistema Renina-Angiotensina-Aldosterona
TE Treinado Exercício
TPTZ 2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine
TR Treinado Repouso
V/V Volume por volume
μL Microlitro
Μmol Micromol
2K1C Hypertensive by renovascular hypertension model 2 Kidney – 1 Clip
2R1C Hipertenso pelo modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip
°C grau Celsius
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................. 14
1.1 Controle do tônus vascular ............................................................................... 14
1.2 Exercício físico e mecanismos que controlam o tônus vascular ...................... 17
1.3 Hipertensão arterial e controle do tônus vascular ........................................... 18
1.3.1 Exercício e controle do tônus vascular na hipertensão ......................................... 19
2 OBJETIVOS ..................................................................................................... 20
2.1 Geral .................................................................................................................. 20
2.2 Específicos ......................................................................................................... 20
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 21
3.1 Delineamento Experimental ............................................................................. 21
3.2 Protocolo de distribuição dos animais nos grupo experimentais .................... 21
3.3 Protocolo de exercício/treinamento .................................................................. 22
3.4 Modelo de hipertensão 2R1C ........................................................................... 22
3.5 Medida da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda
(“tail cuff”) ........................................................................................................ 23
3.6 Eutanásia dos animais e coleta de material ...................................................... 23
3.7 Estudo funcional de reatividade vascular ........................................................ 23
3.8 Quantificação da peroxidação lipídica ............................................................. 25
3.9 Avaliação da capacidade antioxidante do plasma ........................................... 25
3.10 Análise Estatística ............................................................................................. 25
4 RESULTADOS ................................................................................................. 26
4.1 Massas corporais e cardíacas ........................................................................... 26
4.2 Desempenho em esteira..................................................................................... 27
4.3 Pressão Arterial Sistólica .................................................................................. 27
4.4 Reatividade vascular à angiotensina II ............................................................ 28
4.5 Análises bioquímicas ......................................................................................... 33
4.6 Reatividade vascular ao nitroprussiato de sódio e à solução despolarizante
de cloreto de potássio... ..................................................................................... .34
5 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 36
6 CONCLUSÃO ................................................................................................... 41
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 42
APÊNDICES .............................................................................................................. 49
14
1 INTRODUÇÃO
O envelhecimento é um fator de risco para doenças cardiovasculares, que constituem a
principal causa de morbimortalidade na sociedade moderna. Mundialmente as doenças
cardiovasculares são responsáveis por cerca de 30 % de todas as mortes, sendo que a
hipertensão arterial sistêmica (HAS) é a mais comum. Cabe ressaltar que a incidência destas
doenças cardiovasculares tende a aumentar drasticamente nos próximos anos. Neste sentido,
torna-se necessário um maior aprofundamento acerca dos mecanismos fisiopatológicos
relacionados à HAS, bem como a identificação de possíveis estratégias, tanto medicamentosas
quanto não medicamentosas, que podem ser empregadas para o tratamento desta doença.1,2
1.1 Controle do tônus vascular
A pressão arterial (PA) é produto do débito cardíaco pela resistência total periférica e,
dessa forma, modificações nos mecanismos que regulam o tônus vascular estão envolvidas na
gênese e/ou manutenção da HAS. O tônus vascular é controlado primeiramente pela ação do
sistema nervoso autônomo simpático (SNS). Já está bem estabelecido que as terminações
nervosas do SNS liberam noradrenalina (NOR) e esta, atuando sobre os adrenoceptores
presentes na musculatura lisa vascular (predominantemente os α1-adrenoceptores) leva à
vasoconstrição.3 Em paralelo, a noradrenalina atua em receptores presentes no endotélio
vascular, sobretudo nos α2 e β2-adrenoceptores, levando à liberação de mediadores endoteliais
que acabam por modular a vasoconstrição mediada pela estimulação dos α1-adrenoceptores
presentes na musculatura lisa vascular.4 Com efeito, isto indica que as ações do SNS sobre os
vasos precisam ser moduladas pelo endotélio vascular a fim de que a homeostasia circulatória
seja mantida.
O endotélio reveste todo o vaso, sendo considerado um extenso tecido endócrino.
Diversos autores pontuam que o endotélio vascular exerce a função de sensor de alterações do
fluxo sanguíneo e é um importante modulador do tônus vascular.5,6,7,8
A modulação endotelial
sobre o tônus vascular fisiológico se dá através da produção equilibrada de substâncias tanto
vasodilatadoras quanto vasoconstritoras.9,10
Dentre as substâncias vasodilatadoras liberadas
pelo endotélio, destaca-se o óxido nítrico (NO), uma molécula muito pequena, extremamente
lipossolúvel e instável. Sua síntese acontece através de uma família de enzimas denominadas
óxido nítrico sintase (NOS), sendo que a isoforma endotelial (eNOS) é talvez a principal
produtora de NO em condições fisiológicas. A eNOS está constitutivamente presente no
endotélio vascular e é ativada pelo aumento da concentração intracelular de cálcio, que se dá
pela ação de mediadores endógenos como a angiotensina II (Ang II) ou por estímulos físicos
15
como o cisalhamento exercido pelo fluxo sanguíneo sobre a superfície endotelial.7,11,12
A
eNOS produz pequenas quantidades de NO, que difunde-se para a musculatura lisa vascular e
interage com o grupo heme da guanilato ciclase solúvel.13
Como resultado, há formação do
monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), cuja função é diminuir o nível intracelular de íon
cálcio. Assim, haverá ativação da proteína quinase e consequente abertura dos canais de íon
potássio, ocasionando o relaxamento da musculatura lisa.14
No endotélio vascular ocorre também a produção de prostanóides. A produção destes
prostanóides se dá através de uma via bioquímica que tem início pela ativação da enzima
fosfolipase A2, responsável pela produção de ácido araquidônico a partir de fosfolípideos de
membrana. O ácido araquidônico presente no citoplasma é substrato tanto para as enzimas
ciclo-oxigenases (COX) quanto para as lipo-oxigenases (LOX).15
A ação da prostaciclina
(PGI2), considerada um importante mediador vasodilatador endotelial, se dá pela ativação de
receptores P. A ativação destes receptores, que são acoplados à proteína G, leva à ativação da
enzima adenilato ciclase e à consequente elevação das concentrações intracelulares de
adenosina-3’,5’-monofosfato cíclico (AMPc) que, por sua vez, ativa a proteína quinase A para
promover a vasodilatação.9,16,17
Cabe ressaltar, por fim, que a PGI2 não é o único prostanóide
vasodilatador.15
O endotélio vascular também libera prostanóides vasoconstritores, tais como a
prostaglandina H2 (PGH2).6 A ação da PGH2 se dá através da ativação do receptor TP
acoplado à proteína G, que ativa a fosfolipase C levando à síntese de diacilglicerol e
inositoltrifosfato, ativando a proteína quinase, que ocasiona o aumento intracelular de íons
cálcio e consequentemente vasoconstrição.17,18,19
Mesmo a PGI2, considerada um prostanóide
vasodilatador, pode apresentar ações vasoconstritoras sobre alguns leitos vasculares em
determinadas situações fisiopatológicas.20
Cabe ressaltar, por fim, que outras substâncias de
origem endotelial, além do NO e dos prostanóides, podem exercer papel decisivo no controle
do tônus vascular.16,21
Paralelamente ao SNS, o controle do tônus vascular também envolve a ação do
sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA). Nesse sistema, destaca-se como um dos
principais efetores a Ang II, um potente peptídeo vasoconstritor. A Ang II é formada por meio
da clivagem enzimática da angiotensina I, que se dá principalmente pela ação da enzima
conversora de angiotensina (ECA). Vale ressaltar que as ações vasculares da Ang II também
devem ser moduladas pelos mecanismos endoteliais mencionados anteriormente, a fim de que
a homeostasia circulatória seja garantida.22
16
As ações cardiovasculares da Ang II se dão pela ativação tanto dos receptores AT1
quanto AT2, que geralmente resulta em efeitos opostos. Esta ação simultânea da Ang II em
AT1 e AT2 favorece a homeostasia circulatória.22-27
Por meio da ativação do receptor AT1, a
Ang II promove a vasoconstrição, indução do aumento da contratilidade e hipertrofia
cardíaca, aumento da atividade simpática e da secreção de aldosterona e vasopressina, entre
outros efeitos.9
A ativação dos receptores AT1 também leva à expressão/ativação da enzima fosfato de
dinucleotídeo de adenina e nicotinamida (NADPH) oxidase no endotélio vascular,
considerada a principal geradora de espécies reativas de oxigênio, sendo a Ang II um potente
ativador deste complexo. Ao ativar o receptor AT1, utiliza vias sinalizadoras intracelulares e
estimula a expressão de genes responsáveis pela ativação deste complexo, que culmina com a
formação de espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente o ânion superóxido (O2-),
responsável por 70% dos efeitos deletérios da Ang II. O O2-
pode atuar como um agente
redutor e, ao doar elétron ao NO, contribui para a formação de peroxinitrito (ONOO-). Por sua
vez, esta sequência de eventos ativa fatores de transcrição nuclear, levando à expressão de
genes pró-inflamatórios e consequente remodelamento vascular, causando dano tecidual por
estresse oxidativo.6,28,29
O estresse oxidativo ocasionado indiretamente pela Ang II causa diminuição da
biodisponibilidade de NO endotelial, além de vasoconstrição induzida pelo próprio O2- e das
consequências deletérias do ONOO-. Com isso, são reforçadas a vasoconstrição, a inflamação
vascular e o remodelamento celular, desencadeados diretamente pela Ang II.30
A perda da
integridade vascular expõe as células da musculatura lisa vascular à ação de substâncias
vasoconstritoras que estimulam a proliferação celular, causando hiperplasia e hipertrofia da
célula muscular lisa, além de disfunção endotelial, um marcador precoce das doenças
cardiovasculares.6,31
Dessa forma, a Ang II participa tanto da homeostasia circulatória quanto
de processos fisiopatológicos como a HAS e danos cardiovasculares relacionados a esta
doença.9,16,23
Por outro lado, tem sido demonstrado que as ações da Ang II em receptores AT2 se
contrapõem aos efeitos vasoconstritores mediados pelos receptores AT1,22,32-34
levando à
atenuação da inflamação, fibrose e apoptose, além de promover ações vasodilatadoras em
diversos leitos vasculares.35
Verificou-se em artérias renais e mesentéricas de ratos que estas
ações vasodilatadores mediadas por AT2 envolvem liberação de bradicinina e/ou NO, com
consequente aumento de GMPc nas células musculares.22,24-27
A ativação deste receptor
também pode ter ação vasodilatadora direta devido a ação do citocromo P450 sobre o ácido
17
araquidônico com consequente formação do ácido epóxi-eicosatrienóico (EET), fenômeno
observado em arteríolas eferentes de coelhos.8
1.2 Exercício físico e mecanismos que controlam o tônus vascular
Durante o exercício físico, ocorre um importante aumento da demanda metabólica,
sobretudo na musculatura cardíaca e na musculatura esquelética em atividade.36,37
Com isso,
ocorre um aumento no fluxo sanguíneo para o coração, diafragma e musculatura esquelética
envolvida na locomoção à custa de uma diminuição de fluxo para pele, estômago, intestinos,
pâncreas, fígado, rins, baço e musculatura esquelética em repouso.38,39
Estas modificações
circulatórias, que recebem a denominação genérica de "redistribuição circulatória", podem
influenciar ou ser influenciadas pelos diversos mecanismos reguladores do tônus vascular.
Para uma compreensão mais aprofundada destes processos é necessário considerar que a
redistribuição circulatória acarreta um aumento do cisalhamento exercido pelo fluxo
sanguíneo sobre a camada endotelial das artérias.40
Com isso, pode ocorrer um aumento da
expressão de eNOS e uma maior produção endotelial de NO41-44
e/ou prostanóides.45,46
Neste
sentido, tanto o exercício agudo47
quanto o treinamento48-52
parecem aumentar a liberação
endotelial de NO que, por sua vez, modula o tônus em diversos leitos vasculares. De fato, já
foi demonstrado que NO e prostanóides atenuam a vasoconstrição induzida pela estimulação
α-adrenérgica em território vascular da musculatura esquelética humana envolvida no
exercício.53
Curiosamente, estas adaptações endoteliais relacionadas ocorrem sobretudo em
territórios vasculares de regiões recrutadas durante o exercício.48
Dessa forma, é cabível
afirmar que a ação destes mecanismos vasomotores pode dirigir o fluxo sanguíneo para os
leitos vasculares envolvidos no suprimento de demandas metabólicas teciduais que foram
elevadas pelo exercício.
Adaptações promovidas pelo exercício sobre os mecanismos locais que regulam o
tônus vascular já foram descritas em diversos estudos anteriores. Estas adaptações geralmente
melhoram a função endotelial e favorecem a homeostasia circulatória.54-56
Cabe ressaltar, no
entanto, que os efeitos do exercício físico não se dão apenas sobre as ações cardiovasculares
do SNS. Evidências prévias sugerem que as ações do SRAA sobre o sistema cardiovascular
também podem ser influenciadas pelo exercício.57
De fato, exposições repetidas ao exercício
podem levar à modificações nos mecanismos locais de controle do tônus vascular e, como
consequência, influenciar a capacidade de resposta de diversos leitos vasculares à Ang II. De
fato, foi demonstrado que ratos submetidos a exposições repetidas ao exercício de natação,
apresentaram redução na capacidade de resposta das aortas e das artérias mesentéricas à Ang
18
II.58
Além disso, em animais submetidos ao exercício, prostanóides vasodilatadores passam a
cooperar com o NO para manter reduzidas as respostas à Ang II em veia femoral59
e em veia
mesentérica60
de ratos. O treinamento também reduz os níveis plasmáticos de Ang II61
e
diminui a vasoconstrição mediada por este peptídeo em aorta de ratos.62
1.3 Hipertensão arterial e controle do tônus vascular
Modificações no funcionamento endotelial, acompanhadas ou não de alterações nas
células musculares lisas ou da matriz extracelular dos diferentes vasos que integram o sistema
cardiovascular podem levar à HAS e/ou contribuir para a sua manutenção. Isto porque estas
modificações, que geralmente envolvem aumento da produção de O2-, fatores de crescimento
e moléculas de adesão, favorecem o aumento do tônus vascular e, mas tardiamente, as
alterações estruturais dos vasos sanguíneos.10,28,34,63
Para que se possa melhor compreender a
HAS, estes mecanismos de controle vascular também devem ser adequadamente
compreendidos. Neste sentido, é indispensável o emprego de modelos experimentais que
simulam a HAS dos seres humanos. Existem diferentes modelos experimentais de
hipertensão, que reproduzem com algum grau de confiabilidade as diversas etiopatogenias da
HAS humana.64
Dentre estes, o modelo de hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip (2R1C) é
o que mais se assemelha à hipertensão renovascular humana.65
Este modelo de hipertensão é
causado pela estenose da artéria renal através da implantação de um clip de prata.66
Como
resultado da diminuição do fluxo renal, ocorre liberação de renina na corrente sanguínea
levando à formação de Ang II pela ativação do SRAA. Assim, na hipertensão 2R1C, ocorre
uma intensa ativação do SRAA que culmina com a elevação dos níveis circulantes de Ang
II.67,68
Na fase aguda da hipertensão 2R1C, entre 4-5 semanas de estenose, os níveis
circulantes de Ang II são altos, predominando sua função endócrina. Porém, a partir da 6ª
semana de indução, os níveis plasmáticos de Ang II são atenuados, e por este motivo suas
ações autócrina e parácrina passam a ser predominantes.66
Devido a sua ação endócrina, a
Ang II aumenta a PA mediante aumento da retenção de sódio e água pela aldosterona e
também aumenta a atividade simpática. E com a ativação do SRAA há hipertrofia das células
musculares lisas e remodelamento vascular.69
Neste modelo, a Ang II também ativa o
complexo enzimático NADPH oxidase, com consequente formação de EROs e aumento do
estresse oxidativo.68,70
Como já foi apresentado, esta concentração de EROs no endotélio
reduz a biodisponibilidade de NO e atenua a vasodilatação dependente do endotélio.71,72
A
presença de EROs também pode regular a expressão/atividade das fosfolipases A2 e,
19
consequentemente, a produção de prostanóides.73
Esta disfunção endotelial desencadeada pela
hipertensão 2R1C foi observada tanto nas artérias de condutância como aorta72
e artéria
caudal,74
quanto em artérias de resistência, como a artéria coronária.75
1.3.1 Exercício e controle do tônus vascular na hipertensão
A literatura é abundante em estudos que mostram adaptações cardiovasculares
promovidas pelo exercício em animais normotensos. Todavia, existem poucos estudos que
analisam os efeitos vasculares do exercício na hipertensão 2R1C. Estes poucos estudos, no
entanto, demonstram que o exercício agudo promove benefícios cardiovasculares nos animais
2R1C.25,76
Tem sido descrito que o treinamento aumenta o vasorrelaxamento dos anéis de
aorta torácica, além de atenuar a rigidez arterial decorrente da hipertensão renovascular em
ratos 2R1C, devido à melhora na capacidade de relaxamento vascular em consequência de
uma maior atividade dos canais de potássio.77
O treinamento também reverte à disfunção
endotelial causada pela hipertensão 2R1C e, por conta disso, atenua a resposta vasoconstritora
à fenilefrina, em aorta de ratos 2R1C.70
Com base nesta revisão é possível afirmar que o exercício agudo e o treinamento
promovem adaptações benéficas ao sistema cardiovascular dos animais 2R1C. Existem
evidências de que a função endotelial e o balanço redox podem ser melhorados pelo exercício
agudo nos animais 2R1C.76
Contudo, esta mesma revisão de literatura também sugere que o
controle do tônus vascular envolve diversos mecanismos locais que podem modular de forma
distinta as ações do SNS e do SRAA. Assim, se por um lado existem evidências de que o
treinamento promove modificações vasculares que levam a uma atenuação das ações
vasoconstritoras da fenilefrina, por outro, pouco se sabe a respeito de seus efeitos sobre as
ações vasculares da Ang II. Neste sentido, o presente estudo preenche uma importante lacuna
de conhecimento na medida em que aprofunda a compreensão dos efeitos do exercício sobre
os mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C.
20
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Estudar as respostas da aorta torácica à Ang II em ratos normotensos e hipertensos 2R1C na
fase aguda, bem como os efeitos do exercício agudo e do treinamento sobre estas respostas.
2.2 Específicos
2.2.1 Investigar a participação dos mecanismos moduladores endoteliais relacionados ao
NO e aos prostanóides, bem como o envolvimento dos receptores AT2, em eventuais
modificações de respostas à Ang II induzidas pelo exercício agudo e/ou treinamento em aorta
de animais normotensos e hipertensos 2R1C.
2.2.2 Verificar se alterações no balanço redox podem estar envolvidas em eventuais
modificações de respostas à Ang II induzidas pelo exercício agudo e/ou treinamento em aorta
de animais normotensos e hipertensos 2R1C.
21
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Delineamento Experimental
Foram utilizados 123 ratos machos Wistar, com 8 semanas de idade, provenientes do
biotério central da Faculdade de Medicina de Marília (Famema). Durante todo o período de
experimento, os animais permaneceram no biotério de apoio, ligado ao laboratório de
Farmacologia. Esses animais foram mantidos em gaiolas coletivas (4 animais/caixa),
submetidos à dieta (APÊNDICE A) e água ad libitum em ambiente com temperatura
controlada (23-25°C) e ciclo claro-escuro de 12 h. Para evitar discrepância no peso, o
crescimento dos animais foi monitorado de forma que, tanto os sedentários quanto os
submetidos ao exercício agudo ou treinamento, pesassem entre 400 e 450 g no dia do estudo
funcional das respostas vasomotoras. Este projeto foi submetido e aprovado pela Comissão de
Ética no Uso de Animais (CEUA) com o número de protocolo 300/14.
3.2 Protocolo de distribuição dos animais nos grupos experimentais
A distribuição dos animais nos grupos experimentais foi realizada levando em
consideração a capacidade de exercício inata de cada animal, utilizando a estratégia proposta
por Melo, Martinho e Michelini.78
Brevemente, ratos de 8 semanas de idade foram treinados
diariamente (sessões de 10 minutos) para andar em esteira (Movement Technology LX 170)
com velocidade de 0,3 a 0,5 Km/h, sem inclinação. Ao final deste período, no 10° dia, estes
animais foram submetidos a um teste de esforço para a capacidade individual de corrida na
esteira. Neste teste os animais foram colocados em esteira com velocidade de 0,3 Km/h. Em
seguida, a cada 3 minutos, a velocidade da esteira foi aumentada em 0,3 Km/h até que o
animal apresentasse sinais de exaustão (parar de correr mesmo quando estimulados por leve
pressão na cauda). Para cada animal, foi registrado o tempo que este conseguiu correr até a
exaustão na escala de acréscimo de velocidade acima mencionada (capacidade máxima de
exercício). Ao final do teste de esforço, os animais foram distribuídos nos grupos, de acordo
com a capacidade máxima de exercício de cada um. Assim, os animais foram alocados em
quatro grupos: dois sedentários, estudados no repouso (grupo sedentário repouso – SR) e
imediatamente após uma sessão de exercício (grupo sedentário exercício – SE) e dois
treinados, estudados em repouso (grupo treinado repouso – TR) e imediatamente após uma
sessão de exercício (grupo treinado exercício – TE). Com base no teste de esforço, calculou-
se também a velocidade média de cada grupo, utilizada para o treinamento. A sessão de
exercício, no dia eutanásia, a qual o grupo SE foi submetido durou 15 minutos (tempo de
exercício previsto para o primeiro dia de treinamento) e a sessão de exercício do grupo TE
22
durou 60 min., com velocidade de 60% da capacidade máxima de exercício média de cada um
dos grupos.
Figura 1: Fluxograma do protocolo experimental
3.3 Protocolo de exercício/treinamento
Foi utilizada a metodologia de treinamento descrita em Melo, Martinho e Michelini,78
segundo a qual o grupo a ser treinado iniciou o programa de treinamento físico a uma
velocidade da esteira correspondente a 60% da média das velocidades máximas obtida pelos
animais pertencentes a este grupo no teste de esforço. Este programa de treinamento consistiu
em sessões diárias de exercício (1 hora), 5 dias/semana durante 10 semanas. Nas 3 primeiras
semanas, o tempo de exercício foi progressivamente aumentado de 20 minutos para 1
hora/dia, em esteira não inclinada (APÊNDICE B).
Na sexta semana de treinamento, o teste de esforço foi repetido e a velocidade da
esteira foi ajustada de acordo com o ganho do grupo em termos de desempenho. O
desempenho dos animais neste teste de esforço também serviu para indicar indiretamente a
efetividade do protocolo de treinamento utilizado. O peso dos animais também foi monitorado
no decorrer do treinamento. Por fim, a massa úmida do coração foi verificada no dia da
eutanásia (ao final das 10 semanas de treinamento).
3.4 Modelo de hipertensão 2R1C
A hipertensão renovascular 2R1C foi induzida em ratos por meio do modelo descrito
por Goldblatt et al.,66
com algumas adaptações, sendo que a cirurgia para a colocação do clip
foi realizada no decorrer do período de treinamento – 4 semanas antes do sacrifício dos
animais para os experimentos (APÊNDICE C). Para tanto, os ratos foram anestesiados com
Tribromoetanol (Sigma; 250 mg/kg, por via intraperitoneal) para depois serem submetidos a
uma laparotomia na linha média. Em seguida, a artéria renal esquerda foi isolada e, nesta, se
23
implantou um grampo de prata (clip) de 0,25 mm de diâmetro. Os animais normotensos
(SHAM) foram submetidos à laparotomia, porém sem a colocação do clip na artéria renal. No
pós-operatório, a analgesia foi feita com Dipirona Sódica (Farmace; 100 mg/dia, por 2 dias,
via subcutânea) e o antimicrobiano utilizado foi o Enrofloxacino (Bayer; 0,01 mg/dia, por 2
dias, via subcutânea). Após a cirurgia, os animais permaneceram em gaiolas isoladas por 4
dias. Neste período, os animais pertencentes aos grupos destinados ao treinamento (TR e TE)
foram poupados do exercício.
3.5 Medida da pressão arterial sistólica por pletismografia de cauda (“tail cuff”)
A pressão arterial sistólica (PAS) foi aferida por pletismografia de cauda. Para isso, os
ratos foram aquecidos a uma temperatura média de 40°C por 20 min., para a dilatação da
artéria caudal. Em seguida, os animais foram cuidadosamente acondicionados em um
contensor apropriado ao seu tamanho, e seu campo visual foi reduzido com o auxílio de uma
toalha vermelha, proporcionando assim um ambiente de estresse controlado.79
Na cauda de
cada animal, foi colocado um manguito acoplado a um sensor de fluxo para o registro das
pressões sistólicas com auxílio de um Powerlab 8/30 data acquisition system®
(Australia
ADInstruments). As aferições de pressão foram realizadas antes da cirurgia (Basal) e quatro
semanas após a cirurgia (Final), sempre no período da manhã. Foram considerados
hipertensos (2R1C) os animais que obtiveram um aumento maior que 20 mmHg na aferição
de PAS final em relação à PAS basal. Cabe ressaltar que os animais que não atingiram esse
aumento da PAS foram excluídos do estudo.
3.6 Eutanásia dos animais e coleta de material
Os animais foram eutanasiados em câmara de gás carbônico (CO2), em uma
concentração aproximada de 40% de CO280
, e imediatamente exsanguinados através da
punção da veia cava com auxílio de agulha/seringa heparinizada. O sangue obtido neste
procedimento foi centrifugado para a coleta do plasma, que foi congelado para posterior
análises bioquímicas, conforme o método preconiza. Paralelamente, após toracotomia, a aorta
torácica destes animais foi cuidadosamente dessecada e removida para um béquer contendo
solução de Krebs-Henseleit (APÊNDICE D).
3.7 Estudo funcional de reatividade vascular
Segmentos da aorta torácica foram transferidos para uma placa de Petri recoberta com
parafina e solução de Krebs-Henseleit, e sob lupa foram separados dos tecidos adjacentes e
24
seccionados em anéis de 2-3 mm. Estes anéis foram montados entre 2 ganchos de metal
inseridos no lúmen. Em seguida, essas preparações foram colocadas em cubas para estudo de
órgão isolado com capacidade para 2 mL, em solução de Krebs-Henseleit, pH 7,4, gaseificada
com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2) e aquecida a 37°C. Nestas cubas, um dos
ganchos foi fixado no fundo e o outro, no transdutor isométrico de força para a detecção de
modificações do tônus vascular. Modificações de tônus vascular foram registradas em
Powerlab 8/30 data acquisition system®
(Australia ADInstruments) (APÊNDICE E). As
preparações permaneceram em repouso durante 60 minutos, sob uma tensão basal de 1,5 g
para estabilização. Neste período, a solução nutritiva foi substituída a cada 20 minutos.
A integridade do endotélio das preparações foi avaliada funcionalmente. Para isso,
preparações pré-contraídas com NOR 10-5
M, no platô da resposta, foram desafiadas com
acetilcolina (ACh) 10-4
M. O relaxamento igual ou superior a 80% da contração inicial foi
considerado indicativo de integridade endotelial. Algumas preparações tiveram o endotélio
removido mecanicamente (preparações deendotelizadas) antes da montagem nas cubas de
órgão isolado. Neste caso, a ausência de relaxamento induzido por ACh 10-4
M foi indicativa
da efetividade de remoção endotelial.
Para o estudo da reatividade vascular, as preparações foram desafiadas
cumulativamente com Ang II (Sigma; 10-11
- 10-6
Mol/L), solução despolarizante de cloreto de
potássio (Sigma; 4,7x10-3
– 12x10-3
M, compensado pela redução do sódio em solução) e
nitroprussiato de sódio (Sigma; 10-9
– 10-4
Mol/L). Os desafios com Ang II foram feitos na
ausência e na presença de PD 123.319 (Sigma; 10-6
M; inibidor seletivo do receptor AT2), N-
nitro-L-arginina-metil-ester (Sigma; L-NAME 10-4
M; inibidor não seletivo da NOS),
indometacina (Sigma; 10-5
M; inibidor não seletivo da COX) e tiron (Sigma;10-4
M;
sequestrante de radicais livres). Todos estes inibidores foram administrados diretamente ao
banho 20 minutos antes do início dos desafios, e as respostas vasomotoras produzidas foram
expressas graficamente como curvas concentração-resposta. A partir destas curvas
concentração-resposta, foram obtidos o pEC50, que consiste no negativo do logarítmo da
concentração molar do agonista responsável por 50% do efeito máximo (EC50) e o Emax, que
consiste no efeito desencadeado pela concentração supra máxima do agonista. Para o cálculo
da EC50, os valores determinados nos registros foram normalizados pela máxima resposta
(maior valor da curva). Em seguida, fez-se o cálculo da EC50 por regressão não linear através
do programa Prisma®
(GraphPad Software Corporation).
25
3.8 Quantificação da peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica, que indica o grau de estresse oxidativo do meio biológico, foi
estimada pela análise do consumo do Complexo Fe3+
- xilenol laranja (FOX), segundo a
técnica descrita originalmente por Jiang e Cols.81
e adaptada para plasma e soro por Arab e
Steghens.82
Este método se baseia na oxidação do íon ferroso (Fe2+
) a íon férrico (Fe3+
) na
presença de hidroperóxidos lipídicos e formação de complexos de Fe3+
com o xilenol laranja,
gerando uma cor característica, a qual pode ser medida espectrofotometricamente.
Para a determinação do grau de estresse oxidativo no plasma, amostras de sangue
foram colhidas em seringas heparinizadas e posteriormente centrifugadas a 3000
RPM/5min./4°C. Em seguida, 20 μL do plasma coletado foram acrescidos a 180 μL do
reagente de trabalho (metanol absoluto 81%; xylenol orange 100 μmol; ácido sulfúrico -
H2SO4 25 mM; hidroxi tolueno butilado - BHT 40 mM; sulfato ferroso 250 μmol). Por fim,
procedeu-se a leitura das absorbâncias a 560 ηm, em paralelo a uma curva padrão de peróxido
de hidrogênio (8,8 M), por meio de um espectrofotômetro.
3.9 Avaliação da capacidade antioxidante do plasma
Esta avaliação foi feita pelo método do FRAP (poder antioxidante de redução do
ferro). Para isso foram preparadas três soluções: A (tampão acetato: 300 mM, pH 3,6 e ácido
clorídrico - HCl 40 mM), B (2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine - TPTZ - 10 mM) e C (cloreto
férrico hexahidratado - FeCl3.6H2O - 20 mM), formando o reagente de trabalho A+ B + C na
proporção 10:1:1 (V/V). O sangue dos animais foi coletado em seringa heparinizada e
posteriormente centrifugado a 2500 RPM/10 min./4° C. Em seguida, 0,8 mL do plasma obtido
foram adicionados a uma mistura de água deionizada (2,4mL) com o reagente de trabalho
(0,25mL). Depois, esta solução foi colocada em microplaca e as absorbâncias foram lidas a
593 nm, em paralelo a uma curva padrão de sulfato ferroso, por meio de um
espectrofotômetro.83
3.10 Análise Estatística
Os dados obtidos foram expressos pela média ± erro padrão da média (E.P.M.). A
análise estatística dos resultados foi realizada por análise de variância (ANOVA) de duas vias
(treinamento e exposição ao exercício) e ANOVA de medidas repetidas, seguida pelo pós-
teste de Bonferroni. Diferenças nos valores de p<0,05 foram consideradas estatisticamente
significativas. Para realização dos testes estatísticos foram utilizados os programas Prisma® e
SPSS®.
26
4 RESULTADOS
4.1 Massas corporais e cardíacas
Os dados obtidos mostram que nem os diferentes protocolos de exercício aos quais os
animais foram expostos, tampouco a elevação da PAS induzida pelo modelo de hipertensão
utilizado, causaram modificações significativas de massa corporal (Figuras 2A e 2B). As
massas úmidas cardíacas também não foram significativamente diferentes entre os grupos
estudados (Figuras 3A e 3B).
Figura 2 - Massas corporais obtidas em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e
treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE,
respectivamente), determinadas durante o protocolo de treinamento. Valores expressos em média ± erro padrão
da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
Figura 3 - Massas úmidas cardíacas obtidas em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos
sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e
TE, respectivamente), determinadas no dia da eutanásia. Valores expressos em média ± erro padrão da média
(E.P.M). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
300
350
400
450
500
SR (14 )
SE (15 )
T R (14 )
T E (16 )
SHAMA
Semanas de Pro toco lo
Ma
ss
as
Co
rp
ora
is (
g)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
300
350
400
450
500
SR (16 )
SE (16 )
T R (16 )
T E (16 )
2R 1CB
Semanas de Pro toco lo
Ma
ss
as
Co
rp
ora
is (
g)
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
SR (14 )
SE (15 )
T R (14 )
T E (16 )
SHAMA
10° Semana de Pro toco lo
Ma
ss
as
Úm
ida
s C
ard
íac
as
(g
)
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
SR (16 )
SE (16 )
T R (16 )
T E (16 )
2R 1CB
10° Semana de Pro toco lo
Ma
ss
as
Úm
ida
s C
ard
íac
as
(g
)
27
4.2 Desempenho em esteira
Os dados obtidos demonstram que, após 6 semanas de treinamento, os animais
pertencentes aos grupos treinados (TR e TE) apresentam um desempenho na corrida em
esteira significativamente maior em relação aos animais que nunca foram expostos a
treinamento (SR). Esta melhora no desempenho foi observada tanto nos animais SHAM
(Figura 4A) quanto nos animais 2R1C (Figura 4B).
Figura 4 – Desempenho em esteira dos animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos grupos sedentários e
treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE,
respectivamente), determinado antes de iniciar o protocolo (Inicial) e na 6ª semana de protocolo (Final). Valores
expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes
(n). *indica diferença significativa (p<0,001) em relação aos valores basais do mesmo grupo (ANOVA de
medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
4.3 Pressão arterial sistólica
Os resultados obtidos mostram que o procedimento cirúrgico para o acesso à artéria
renal esquerda, por si, não eleva significativamente a PAS em nenhum dos grupos estudados
(Figura 5A).
Figura 5 - Valores de pressão arterial sistólica obtidos em animais SHAM (A) e 2R1C (B), pertencentes aos
grupos sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de
exercício (SE e TE, respectivamente), determinados na 5ª semana de protocolo de exercício (Basal - uma semana
antes da cirurgia) e na 10ª semana de protocolo de exercício (Final - quatro semanas após a cirurgia), Valores
expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes
(n). * indica diferença significativa (p<0,001) em relação aos valores basais do mesmo grupo (ANOVA de
medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
Inicial Final0
5
10
15
20
25SR (14)
SE (15)
T R (14)
T E (16)
* *
SHAMA
Te
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Inicial Final
0
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* *
B
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min
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100
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2R1CB
* * * *
Pre
ss
ão
Art
eri
al
Sis
tólic
a
(mm
Hg
)
28
Por outro lado, quatro semanas após a implantação do clip na artéria renal esquerda, houve
um significativo aumento da PAS nos animais pertencentes a todos os grupos experimentais
(Figura 5B).
4.4 Reatividade vascular à Angiotensina II
O treinamento, seguido ou não de exposição ao exercício agudo, atenuou as respostas
da aorta à Ang II em animais SHAM, levando a uma redução significativa dos valores de
Emax, sem contudo modificar significativamente os valores de pEC50. Observou-se também
que a exposição ao exercício agudo não modificou significativamente os perfis de resposta à
Ang II nas aortas dos animais sedentários (Figura 6A; Tabela 1). Esta redução significativa de
Emax para Ang II, que foi observada nas preparações obtidas de animais treinados, re-
expostos ou não ao exercício, deixou de existir após a remoção endotelial. Com efeito, os
valores de Emax para Ang II, assim como os valores de pEC50, obtidos nestas preparações,
não diferiram significativamente daqueles obtidos nas preparações de animais sedentários
(Figura 6B; Tabela 1). Reduções de Emax para Ang II, induzidas pelo treinamento, também
não foram observadas em preparações intactas na presença do PD123.319, tampouco foram
observadas alteração nos valores de pEC50 (Figura 6C; Tabela 1). Por conta disso, não mais se
constatou aquela atenuação de resposta induzida pelo treinamento que havia sido observada
em preparações não tratadas (Figura 6A). Fato semelhante foi observado quando as
preparações intactas foram estudadas na presença de L-NAME. Nestas condições,
preparações obtidas dos animais submetidos ao treinamento mostraram um padrão de resposta
à Ang II semelhante aos demais. Desta forma, não foram observadas diferenças significativas
de Emax ou pEC50 para Ang II entre os diferentes grupos de animais estudados (Figuras 6D;
Tabela 1). Por fim, na presença de indometacina, as respostas à Ang II foram reduzidas nos
animais sedentários. Com isso, não se observou redução de Emax para Ang II induzida pelo
treinamento, semelhante àquela que havia sido observada em preparações não tratadas (Figura
6E). Nesta condição também não foram observados valores diferentes de pEC50 para Ang II
entre os diferentes grupos de animais estudados (Tabela 1).
Quando animais 2R1C sedentários foram expostos ao exercício agudo, observou-se
um deslocamento da curva concentração-resposta à Ang II, com redução significativa do
pEC50. Estas preparações também mostraram redução de Emax, porém não estatisticamente
significativa.
29
Figura 6 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas (A) e
deendotelizadas (Endo -) na presença de salina (B), bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M (C), L-
NAME 10-4M (D) ou indometacina 10-5M, provenientes de animais SHAM sedentários e treinados estudados no
repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores
expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes
(n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários estudados no repouso (ANOVA
de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SR (09)
SE (09)
TR (07)
TE (06)
SHAM (SALINA)
*
A
*
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SR (09)
SE (10)
TR (10)
TE (09)
SHAM (SALINA Endo -)
B
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SR (08)
SE (07)
TR (09)
TE (05)
SHAM (PD 123.319)
C
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SR (07)
SE (08)
TR (10)
TE (07)
SHAM (L-NAME)
D
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SR (07)
SE (09)
TE (10)
TR (07)
SHAM (INDOMETACINA)E
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
30
Tabela 1 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas provenientes de
animais SHAM
pEC50
SR SE TR TE
Salina
Intactas
8,30 ± 0,05
(09)
8,09 ± 0,16
(08)
8,34 ± 0,09
(07)
8,39 ± 0,07
(07)
Deendotelizadas
7,81 ± 0,12
(08)
7,76 ± 0,15
(10)
8,13 ± 0,08
(08)
8,19 ± 0,12
(09)
PD 123.319 (10-6
M)
Intactas
8.96 ± 0,23
(07)
8,46 ± 0,12
(09)
8,33 ± 0,09
(09)
8,42 ± 0,21
(05)
L-NAME (10-4
M)
Intactas
7,95 ± 0,06
(07)
8,05 ± 0,12
(08)
8,00 ± 0,09
(10)
7,96 ± 0,18
(07)
Indometacina (10-5
M)
Intactas
7,92 ± 0,10 (07)
8,03 ± 0,06 (09)
8,04 ± 0,13 (10)
8,22 ± 0,07 (07)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de
exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre
parêntesis, número de determinações independentes (n).
Em contrapartida, o treinamento, seguido ou não de re-exposição ao exercício, não
promoveu modificações significativas no padrão de resposta à Ang II nestas preparações
obtidas de animais 2R1C (Figura 7A; Tabela 2).
Após a remoção endotelial, contudo, as respostas à Ang II não apresentaram
diferenças acentuadas entre grupos experimentais estudados. Com efeito, os valores de Emax
e pEC50 também não diferiram significativamente entre grupos (Figura 7B; Tabela 2). Na
presença PD123.319 também não foram observadas modificações no padrão de resposta das
preparações à Ang II, em consequência do exercício agudo e/ou do treinamento (Figura 7C;
Tabela 2). A presença do L-NAME elevou muito discretamente as respostas à Ang II em
preparações obtidas de animais 2R1C, pertencentes aos diferentes grupos experimentais
estudados (Figura 7D). Estas elevações de resposta à Ang II, embora discretas, resultaram na
supressão da redução do pEC50 que havia sido observada em preparações obtidas de animais
sedentário-exercício tratadas apenas com salina (Tabela 2). Por fim, a magnitude de resposta à
Ang II foi reduzida nas preparações provenientes de todos os grupos experimentais, quando
tratadas com indometacina (Figura 7E). Estas reduções, contudo, não evidenciaram qualquer
diferença significativa de Emax ou pEC50 entre os grupos experimentais (Tabela 2).
31
Figura 7 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas (A) e
deendotelizadas (Endo -) na presença de em salina (B), bem como intactas na presença de PD 123.319 10-6M
(C), L-NAME 10-4M (D) ou indometacina 10-5M, provenientes de animais 2R1C sedentários e treinados
estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente).
Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações
independentes (n).
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8SR (12)
SE (11)
TR (10)
TE (11)
2R1C (SALINA)
A
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8SR (13)
SE (09)
TR (09)
TE (12)
2R1C (SALINA Endo -)
B
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8SR (08)
SE (07)
TR (08)
TE (08)
2R1C (PD 123.319)
C
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
TR (07)
TE (10)
SR (09)
SE (09)
2R1C (L-NAME)
D
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8SR (10)
SE (07)
TR (09)
TE (08)
2R1C (NDOMETACINA)
E
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
32
Tabela 2 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas provenientes de
animais 2R1C
pEC50
SR SE TR TE
Salina
intactas
8,30 ± 0,08
(12)
7,87 ± 0,08*
(11)
8,37 ± 0,10
(10)
8,25 ± 0,07
(11)
deendotelizadas
8,00 ± 0,06
(13)
8,06 ± 0,08
(09)
7,96 ± 0,13
(09)
8,18 ± 0,18
(12)
PD 123.319 (10-6
M)
intactas
8.30 ± 0,19
(08)
8,43 ± 0,19
(07)
8,43 ± 0,13
(08)
8,17 ± 0,20
(08)
L-NAME (10-4
M)
intactas
8,12 ± 0,05
(10)
8,06 ± 0,05
(10)
8,18 ± 0,09
(07)
8,12 ± 0,04
(10)
Indometacina (10-5
M)
intactas
8,21 ± 0,07 (10)
7,90 ± 0,16 (08)
8,20 ± 0,03 (09)
8,24 ± 0,07 (08)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de
exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre
parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,01) em relação aos
animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
Preparações obtidas de animais SHAM, quando estudadas na presença do tiron, não
mostraram diferenças evidentes no padrão de resposta à Ang II entre grupos. Com efeito, não
se observou diferenças significativas de Emax ou pEC50 entre os diferentes grupos estudados,
nestas condições (Figura 8A; Tabela 3). Quando foram estudadas preparações obtidas dos
animais 2R1C, na presença de tiron, observou-se que o treinamento físico, por si, atenuou as
respostas das aortas destes animais à Ang II. Por conta disso, observou-se uma redução
significativa nos valores de Emax para Ang II nas preparações destes animais treinados em
relação aos sedentários, ambos estudados no repouso. Adicionalmente, a exposição dos
animais 2R1C sedentários ao exercício agudo resultou em uma diminuição das respostas de
suas aortas à Ang II, em relação aos animais sedentários que permaneceram no repouso, e
observou-se um deslocamento da curva concentração-resposta à Ang II, com redução
significativa do pEC50. Curiosamente, o inverso ocorreu com os animais treinados que foram
re-expostos ao exercício (Figura 8B, Tabela 3).
33
Figura 8 - Curvas concentração-resposta para angiotensina II obtidas em preparações de aortas intactas tratadas
com tiron 10-4M, provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso
(SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica
diferença significativa (p<0,01) em relação aos animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas
vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
Tabela 3 - Valores de pEC50 para angiotensina II, determinados em aortas intactas
provenientes de animais SHAM e 2R1C
pEC50
SHAM SR SE TR TE
Tiron 10-4
M intactas
8,15 ± 0,09
(08)
8,27 ± 0,12
(07)
8,09 ± 0,08
(07)
8,51 ± 0,29
(08)
2R1C
Tiron 10-4
M
intactas
8,98 ± 0,27 (07)
7,78 ± 0,08* (07)
8,49 ± 0,02 (09)
8,55 ± 0,04 (08)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão
de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre
parêntesis, número de determinações independentes (n). * indica diferença significativa (p<0,05) em relação aos
animais sedentários, estudados no repouso (ANOVA de duas vias, seguida pelo pós-teste de Bonferroni).
4.5 Análises bioquímicas
O treinamento e/ou o exercício agudo não alteraram as concentrações plasmáticas de
FOX e FRAP nos animais SHAM e 2R1C (Tabela 4).
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SR (08)
SE (07)
TR (07)
TE (08)
SHAM (TIRON)A
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -40.0
0.2
0.4
0.6
0.8
SE (07)
TR (09)
TE (08)
SR (07)
2R1C (TIRON)B
**
Angiotensina II Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
34
Tabela 4 – Valores plasmáticos (µM/L) das análises bioquímicas do balanço redox (FOX e
FRAP) em animais SHAM e 2R1C
SR SE TR TE
SHAM
FOX
569,17 ± 72,75 (14)
629,19 ± 92,90 (15)
538,86 ± 68,45 (14)
573,58 ± 67,18 (16)
FRAP
1,20 ± 0,07 (16)
1,25 ± 0,09 (16)
1,30 ± 0,09 (16)
1,43 ± 0,08 (16)
2R1C
FOX
440,78 ± 52,93 (14)
430,34 ± 50,46 (15)
399,88 ± 33,06 (14)
351,69 ± 25,49 (16)
FRAP
1,07 ± 0,06 (16)
1,23 ± 0,13 (16)
1,08 ± 0,08 (16)
1,08 ± 0,08 (16)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou após uma sessão de
exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre
parêntesis, número de determinações independentes (n).
4.6 Reatividade vascular ao nitroprussiato de sódio e à solução despolarizante de cloreto
de potássio
Nos animais SHAM e 2R1C, o treinamento e a exposição ao exercício agudo não
alteraram os valores de Emax e pD2 das curvas concentração-resposta para nitroprussiato de
sódio, em anéis de aorta pré-contraídos com NOR 10-4
M (Figuras 9A e 9B; Tabela 5).
Figura 9 – Curvas concentração-resposta para nitroprussiato de sódio obtidas em preparações de aortas intactas provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR,
respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em
média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n).
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -30.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
SR (08)
SE (08)
TR (07)
TE (07)
SHAM (SALINA)A
Nitroprussiato de sódio Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -30.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
SR (08)
SE (09)
TR (06)
TE (06)
2R1C (SALINA)B
Nitroprussiato de sódio Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
35
Da mesma forma, não houve diferença no padrão de resposta da aorta à solução
despolarizante de cloreto de potássio em animais SHAM e 2R1C, sedentários e treinados,
expostos ou não ao exercício agudo (Figura 10A e 10B; Tabela 5).
Figura 10 - Curvas concentração-resposta para cloreto de potássio obtidas em preparações de aortas
deendotelizadas (Endo -) provenientes de animais SHAM (A) e 2R1C (B), sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão de exercício (SE e TE, respectivamente).
Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações
independentes (n).
Tabela 5 - Valores de pEC50 para nitroprussiato de sódio e cloreto de potássio, determinados
em aortas provenientes de animais SHAM e 2R1C
pEC50
SR SE TR TE
SHAM
Nitroprussiato de
sódio
6,93 ± 0,38
(08)
7,09 ± 0,16
(08)
7,08 ± 0,12
(07)
7,26 ± 0,27
(07)
Cloreto de potássio
1,85 ± 0,02
(08)
1,94 ± 0,01
(09)
1,93 ± 0,03
(06)
1,92 ± 0,03
(06)
2R1C
Nitroprussiato de
sódio
7,03 ± 0,15
(07)
7,54 ± 0,66
(07)
6,89 ± 0,27
(08)
6,87 ± 0,24
(08)
Cloreto de potássio
1,85 ± 0,08
(06)
2,12 ± 0,32
(05)
2,13 ± 0,13
(08)
2,03 ± 0,10
(05)
Animais sedentários e treinados estudados no repouso (SR e TR, respectivamente) ou estudados após uma sessão
de exercício (SE e TE, respectivamente). Valores expressos em média ± erro padrão da média (E.P.M.). Entre parêntesis, número de determinações independentes (n). Os valores de pD2 para nitroprussiato de sódio e cloreto
de potássio foram obtidos em preparações intactas e deendotelizadas, respectivamente.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
SR (07)
SE (07)
TR (08)
TE (08)
SHAM (SALINA Endo -)A
Cloreto de Potássio Log [mol/L]
Te
nsã
o (
g)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
SR (06)
SE (05)
TR (08)
TE (05)
2R1C (SALINA Endo -)B
Cloreto de Potássio Log [mol/L]T
en
sã
o (
g)
36
5 DISCUSSÃO
A proposta central do presente estudo foi investigar os efeitos do exercício sobre os
mecanismos locais que modulam as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C. Vale
ressaltar que os efeitos do exercício sobre as respostas de aortas a diversos agentes
vasoconstritores, inclusive Ang II, já foram descritos em animais normotensos.58,61,62
Paralelamente, Kumral e Cols.70
mostraram as ações do exercício sobre as respostas de aorta a
diferentes agentes vasomotores em animais 2R1C, porém nunca se estudou as respostas à Ang
II. Todavia, o fato deste estudo focar as respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C o torna
inédito. Neste sentido, entendemos que o presente estudo permite uma melhor compreensão
dos mecanismos mobilizados pelo exercício, que podem ser úteis na profilaxia e/ou
tratamento da HAS.
Optou-se, no presente estudo, por estudar os animais 2R1C na fase aguda do modelo.
Na verdade, esta opção deveu-se ao fato de estudos anteriores relatarem aumentos nas
concentrações plasmáticas de Ang II nesta fase do modelo 2R1C.67,68
Assim, eventuais
modificações de respostas das aortas destes animais à Ang II teriam um significado biológico
mais claro. Contudo, a dosagem de Ang II no plasma destes animais não mostrou níveis
circulantes aumentados deste peptídeo em comparação aos animais normotensos (dados não
apresentados). Concentrações plasmáticas de Ang II semelhantes entre animais SHAM e
2R1C, como as observadas no presente estudo, já foram relatadas por outros autores.22,84
Segundo estes autores, não se pode dizer que a Ang II deixa de ser importante já na quarta
semana do modelo 2R1C, mas pode-se dizer sim que, nesta fase, o SRAA tecidual já
prepondera em relação ao circulante.
Para que fosse possível estudar os efeitos do treinamento sobre aortas de animais
2R1C foi necessário verificar a eficácia do protocolo de treinamento e do modelo de
hipertensão. Neste sentido, analisou-se primeiramente o ganho de peso de todos os animais
incluídos no estudo. Estes dados mostram que os protocolos de exercício aos quais os animais
foram expostos não promoveram modificações significativas no ganho de peso corporal, tanto
nos animais SHAM quanto nos animais 2R1C. O treinamento também não promoveu
aumento da massa úmida cardíaca, tanto nos animais SHAM quanto 2R1C. Com efeito, estes
dados sugerem que o exercício praticado durante o treinamento foi de intensidade leve a
moderada.78
Também não foram observadas modificações significativas da massa corporal em
conseqüência do treinamento. A efetividade do treinamento, contudo, foi comprovada pelo
aumento do desempenho em esteira, que foi observado na sexta semana de protocolo de
treinamento. Os dados obtidos também mostram que o modelo de hipertensão empregado no
37
presente estudo foi bem sucedido. Isto porque houve um aumento significativo na PAS dos
animais considerados 2R1C, quatro semanas após a cirurgia para a promoção da estenose
renal.
Uma vez que a hipertensão 2R1C é uma variável central do presente estudo, no seu
delineamento experimental, optou-se por investigar as respostas à Ang II tanto em animais
SHAM quanto naqueles 2R1C, simultaneamente. Com isso, pode-se dizer que as alterações
observadas são realmente decorrentes da implantação bem sucedida do modelo de hipertensão
renovascular 2R1C, quando comparadas às respostas provenientes dos animais SHAM.
Nos experimentos de reatividade vascular observou-se que, em animais SHAM, o
treinamento promoveu uma redução da magnitude das respostas das aortas à Ang II. Esta
redução de resposta, contudo, não foi observada frente ao exercício agudo. Possivelmente, as
adaptações promovidas pelo exercício sobre os mecanismos que regulam o tônus vascular
instalam-se permanentemente à medida que o animal é exposto continuamente às sessões de
exercício durante o treinamento.54-56
Em preparações sem endotélio esta redução de resposta
induzida pelo treinamento não foi observada. Isto sugere que o treinamento mobiliza
substâncias vasodilatadoras provenientes do endotélio para atenuar as respostas contráteis à
Ang II. A atenuação das respostas à Ang II, observada em animais treinados, também deixou
de existir na presença do PD123.319, um bloqueador de receptor AT2. Isto sugere que a
mobilização de substâncias vasodilatadoras endoteliais, responsáveis pela atenuação das
respostas à Ang II em animais treinados, se dá através da estimulação de receptores AT2.
Além disso, os resultados obtidos também sugerem que esta substância vasodilatadora,
liberada pela estimulação de AT2, pode ser o NO. Isto porque a inibição da NOS pelo L-
NAME suprimiu a redução de resposta que havia sido observada nas preparações dos animais
treinados. Estes dados são corroborados por estudos anteriores nos quais observou-se que o
treinamento promove redução das respostas vasculares à Ang II por meio de mecanismos
vasodilatadores endoteliais relacionados ao NO.40-44
A participação dos receptores AT2 na
mobilização do NO, antagonizando assim os efeitos vasoconstritores provenientes mediados
por AT1, também tem sido proposta.8,22-27
Paralelamente, foi observado que os prostanóides também são importantes na
modulação do tônus vascular das preparações estudadas. Contudo, estes mediadores locais
aparentemente são essenciais na manutenção do tônus destas preparações. De fato, a inibição
da COX pela indometacina atenua as respostas destas preparações à Ang II, marcadamente
nos animais sedentários. Nos animais treinados, provavelmente pelo fato destas respostas já
estarem minimizadas pela ação do NO, não se observou efeitos importantes da indometacina.
38
Coincidentemente, estudos anteriores já demonstraram a participação dos prostanóides
vasoconstritores na manutenção do tônus vascular, e que seus efeitos vasoconstritores podem
ser suplantados pelas ações vasodilatadoras do NO.45,73
Como vimos, os resultados obtidos em animais SHAM mostram modificações
induzidas por repetidas exposições ao exercício compatíveis com as descritas na literatura.
Por outro lado, adaptações semelhantes parecem não ocorrer nos animais 2R1C. Nestes
animais, não se observou a redução da magnitude das respostas da aorta à Ang II, que ocorre
nos animais SHAM mediante o treinamento. Ao invés disso, observamos apenas uma redução
na sensibilidade da aorta à Ang II, que ocorre após exposição aguda ao exercício. Vale
destacar que esta redução de sensibilidade à Ang II não foi observada em preparações
deendotelizadas, nem tampouco em preparações intactas, estudadas na presença de
PD123.319 ou L-NAME. Estes dados sugerem que, nestas preparações, o exercício agudo
promove um aumento da liberação endotelial de NO mediada por AT2. Por ser um fenômeno
agudo, supomos que esta maior liberação de NO seja decorrente de um aumento na atividade
da NOS, ao invés de um aumento na sua expressão, pois isto ocorreria mais tardiamente.
Neste sentido, estudos prévios demonstram que o exercício agudo pode aumentar a liberação
endotelial de NO em artérias, antagonizando assim as ações vasoconstritoras dos agonistas
simpatomiméticos.47,53
É curioso notar que esta redução de sensibilidade à Ang II foi
observada apenas em aortas de animais 2R1C, e não naquelas obtidas de animais SHAM.
Talvez este seja um mecanismo protetor desenvolvido em paralelo à hipertensão 2R1C,
visando garantir a homeostasia, sempre que estes animais são submetidos agudamente a um
esforço físico.
O dado mais relevante do presente estudo talvez seja a não observação de redução de
resposta à Ang II induzida pelo treinamento em preparações provenientes de animais 2R1C.
Esperava-se que também nestas preparações, a liberação de NO mediada por AT2 estivesse
aumentada. Possivelmente, como neste modelo de hipertensão pode haver uma exacerbação
da ativação do receptor AT1, isso levaria a uma maior ativação de enzimas NADPH oxidases,
culminando em um aumento na geração de O2-.68,70
Além disso, existem evidências que o
acúmulo de O2- no endotélio vascular ou em tecidos adjacentes pode reduzir a
biodisponibilidade do NO.29,71,72
Desta forma, é cabível supor que o acúmulo de O2- nestas
preparações de animais 2R1C, sobretudo naqueles treinados, possa ter comprometido a
vasodilatação NO dependente desencadeada pela ativação de AT2.
Supondo que uma concentração de O2- nos tecidos das aortas dos animais 2R1C tenha
suprimido a redução de resposta à Ang II nos animais treinados, estas preparações foram
39
estudadas também na presença do tiron, um análogo da superóxido dismutase (SOD) capaz de
eliminar O2-.85-87
. Nestas condições, preparações obtidas de animais 2R1C expostos ao
exercício agudo, bem como ao treinamento, tiveram suas respostas à Ang II reduzidas em
relação àquelas obtidas dos animais nunca expostos a qualquer tipo de exercício. Isto
corrobora a hipótese de que a modulação exercida pelo NO sobre as respostas da aorta à Ang
II não ocorre nos animais 2R1C treinados devido a uma elevada concentração tecidual de O2-.
O aumento do estresse oxidativo, contudo, não foi acompanhado por um aumento na
peroxidação lipídica no plasma colhido dos animais 2R1C. Possivelmente, os mecanismos
antioxidantes presentes no plasma tenham evitado modificações significativas no grau de
peroxidação lipídica nestes animais. Estas defesas antioxidantes, no entanto, não são aquelas
avaliadas pelo FRAP uma vez que também não se verificou qualquer modificação
significativa nos valores de FRAP determinados no plasma destes animais.
Esta redução de resposta à Ang II, no entanto, parece ser suprimida quando estes
animais 2R1C treinados são re-expostos ao exercício. Mecanismos vasoconstritores locais
devem ser melhor investigados na busca por compreender estas respostas apresentadas pelas
preparações obtidas de animais treinado-exercício.
A influência do O2- sobre as respostas da aorta à Ang II, contudo, não é um fenômeno
simples. Contrariando nossas expectativas, a presença do tiron elevou as respostas à Ang II
em aortas de animais SHAM submetidos ao treinamento. Com isso, a atenuação de resposta
da aorta à Ang II, que havia sido observada em animais treinados, deixou de existir na
presença do tiron. Com base nestes dados inferimos que, enquanto o excesso de O2- pode
comprometer a atenuação exercida pelos mecanismos endoteliais relacionados ao NO sobre as
respostas da aorta à Ang II em animais 2R1C treinados, a presença de O2- é necessária para
que esta modulação ocorra nos animais SHAM. De fato, já foi sugerida a participação do O2-
na vasodilatação dependente do endotélio em arteríolas do músculo esquelético de ratos.88
A
forma como se dá esta participação do O2-, contudo, precisa ser melhor investigada.
Os dados obtidos sugerem uma maior participação do NO na modulação das respostas
da aorta à Ang II tanto em animais SHAM treinados quanto em animais 2R1C submetidos ao
exercício agudo ou ao treinamento. Esta maior participação do NO provavelmente envolva
um aumento de sua biossíntese. Contudo, para que esta inferência possa ser feita, devemos
descartar um aumento da sensibilidade destas preparações de aorta ao NO. Neste sentido,
preparações foram desafiadas também com o nitroprussiato de sódio, uma molécula doadora
direta de NO. Como não foi observada qualquer modificação de resposta ao nitroprussiato de
sódio entre os grupos estudados, fica corroborada a hipótese de que a maior atividade dos
40
mecanismos moduladores relacionados ao NO deve-se fundamentalmente ao aumento da
biodisponibilidade desta substância. A menor resposta à Ang II nas preparações provenientes
de animais treinados também não deveu-se à uma redução da capacidade contrátil da
musculatura lisa vascular nestas preparações. Isto porque as respostas à solução
despolarizante de cloreto de potássio também não foram modificadas pelo treinamento.
41
6 CONCLUSÃO
O presente estudo demonstra que, em animais SHAM expostos ao treinamento, as
respostas da aorta à Ang II são moduladas por NO de origem endotelial liberado em
consequência da ativação de receptores AT2. Já nos animais 2R1C, este mecanismo
modulador endotelial é suprimido, possivelmente pelo elevado estresse oxidativo que é
característico deste modelo experimental.
42
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49
APÊNDICES
APÊNDICE A – Composição nutricional da ração consumida "ad libitum" pelos
animais estudados
NUVILAB CR-1: Ração para animais de laboratório
Composição básica do produto:
Milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato de cálcio, fosfato bicálcico,
cloreto de sódio, premix vitamínico mineral e aminoácidos.
Níveis de Garantia por Quilograma do Produto:
Umidade 12,5%, proteína bruta 22,0%, extrato etéreo 4,5%, matéria mineral 10,0%, matéria
fibrosa 8,0%, cálcio 1,4% e fósforo 0,8%.
Enriquecimento por Quilograma do Produto:
Vitaminas - vitamina A 25.200,00 UI, vitamina D3 2.100,00 UI, vitamina E 60,00 mg,
vitamina K3 12,50 mg, vitamina B1 14,40 mg, vitamina B2 11,00 mg, vitamina B6 12,00 mg,
vitamina B12 60,00 mcg, niacina 60,00 mg, ácido pantotênico 112,00 mg, ácido fólico 6,00
mg, biotina 0,26 mg e colina 1.100,00 mg.
Microelementos Minerais - Ferro 50,00 mg; zinco 60,00 mg; cobre 10,00 mg; iodo 2,00 mg;
manganês 60,00 mg; selênio 0,05 mg; cobalto 1,50 mg.
Aminoácidos - lisina 100,00 mg; metionina 300,00 mg.
Aditivos:
Antioxidante 100,00 mg.
Fonte: Nuvital Nutrientes S/A
50
APÊNDICE B – Protocolo de treinamento (10 semanas)
Dias Duração
(min) Aquecimento Endurance Endurance Recuperação
minutos Veloc. Km/h 50% Veloc.
máx
60% Veloc.
máx minutos
Veloc.
Km/h
1 15 5 0,3 5 - 5 0,3
2 17 5 0,3 7 - 5 0,3
3 20 5 0,3 10 - 5 0,3
4 25 5 0,3 15 - 5 0,3
5 30 5 0,3 20 - 5 0,3
6 30 5 0,3 20 - 5 0,3
7 30 5 0,3 15 5 5 0,3
8 30 5 0,3 15 5 5 0,3
9 35 5 0,3 15 10 5 0,3
10 40 5 0,3 20 10 5 0,3
11 40 5 0,3 20 10 5 0,3
12 45 5 0,3 25 10 5 0,3
13 45 5 0,3 25 10 5 0,3
14 50 5 0,3 25 15 5 0,3
15 60 5 0,3 30 20 5 0,3
16 45 5 0,3 20 15 5 0,3
17 60 5 0,3 30 20 5 0,3
18 60 5 0,3 30 20 5 0,3
19 60 5 0,3 25 25 5 0,3
20 60 5 0,3 20 30 5 0,3
21 45 5 0,3 15 20 5 0,3
22 60 5 0,3 25 25 5 0,3
23 60 5 0,3 20 30 5 0,3
24 60 5 0,3 15 35 5 0,3
25 60 5 0,3 10 40 5 0,3
26 45 5 0,3 - 35 5 0,3
27 60 5 0,3 - 50 5 0,3
28 60 5 0,3 - 50 5 0,3
29 60 5 0,3 - 50 5 0,3
30 60 5 0,3 - 50 5 0,3
31 30 5 0,5 20 - 5 0,5
32 45 5 0,5 35 - 5 0,5
33 50 5 0,5 40 - 5 0,5
34 55 5 0,5 45 - 5 0,5
35 60 5 0,5 50 - 5 0,5
36 45 5 0,5 35 - 5 0,5
37 60 5 0,5 45 5 5 0,5
38 60 5 0,5 45 5 5 0,5
39 60 5 0,5 40 10 5 0,5
40 60 5 0,5 40 10 5 0,5
41 45 5 0,5 25 10 5 0,5
42 60 5 0,5 40 10 5 0,5
43 60 5 0,5 40 10 5 0,5
44 60 5 0,5 35 15 5 0,5
45 60 5 0,5 30 20 5 0,5
46 45 5 0,5 20 15 5 0,5
47 60 5 0,5 30 20 5 0,5
48 60 5 0,5 30 20 5 0,5
49 60 5 0,5 25 25 5 0,5
50 60 5 0,5 20 30 5 0,5
51
APÊNDICE C - Cirurgia de indução da hipertensão renovascular 2 Rins – 1 Clip
52
APÊNDICE D – Solução nutritiva de Krebs-Henseleit (modificado)
Para preparo de 1000 mL de solução nutritiva de Krebs-Henseleit (modificado):
Sais [mM] Peso (g)
NaCl 130 7,61
KCl 4,70 0,35
KH2PO4 1,18 0,16
MgSO4. 7H2O 1,17 0,25
NaHCO3 14,9 1,25
Glicose 11,1 2,00
CaCl2
1,60 0,18
a) Pesar todos os sais, exceto o CaCl2;
b) Em seguida, colocar todos os sais (previamente pesados) em um balão volumétrico de
1000 mL;
c) Completar o volume com água deionizada;
d) Posteriormente, homogeneizar a solução em agitador magnético;
e) Adicionar o CaCl2 e homogeneizar novamente;
f) Finalizar com a verificação de pH, visto que o pH ideal é 7,4.
53
APÊNDICE E - Reatividade Vascular
a) Anel de aorta torácica (2mm)
b) Transdutor isométrico
c) Registro de movimentação do vaso na presença do agonista (Ang II)
a b
c