Индукция аутофагии в Т-лимфоцитах ... · 2012-11-09 ·...

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VII, № 3, 2012

Оригинальные исследования 1

Бронхиальная астма (БА) в настоящее время рассматривается как хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей с многофактор-ным патогенезом. Патогенез БА включает в себя бронхоспазм, аллергические реакции, цитокиновый ответ, в том числе вирусно-опосредованное воспа-ление и Th2 иммунный ответ, а также наследствен-ная предрасположенность [7]. В последние годы активно изучается роль апоптотического механиз-ма иммуносупрессии в патогенезе бронхиальной астмы. Имеется ряд работ, в которых установлено торможение апоптоза лимфоцитов при развитии астмы [8, 9].

Апоптоз является наиболее изученной формой программированной клеточной гибели. В качестве второго типа программированной гибели клеток в на-стоящее время выделяют гибель клеток, при которой запускается программа аутофагии [10]. Стимулами к запуску процессов аутофагии в клетках многокле-точных животных являются нехватка питательных веществ, наличие в цитоплазме поврежденных орга-нелл, например, митохондрий и т.д. [11].

Поскольку ранее было показано торможение апоптоза лимфоцитов больных бронхиальной аст-мой, мы предположили, что это может быть связано с индукцией другого процесса – аутофагии. Поэтому

Лимфоциты являются неотъемлемыми регуля-торами и эффекторами адаптивной иммунной си-стемы. Вместе с антиген-представляющими иммун-ными клетками, Т- и В-лимфоциты обеспечивают защитный иммунный ответ на различные патогены и формируют долгосрочную иммунологическую память [1]. Для поддержания целостности иммунной систе-мы, периферический пул зрелых лимфоцитов регу-лируется посредством постоянного баланса между продукцией, пролиферацией и смертью клеток. Ба-ланс этих процессов описывается как лимфоцитар-ный гомеостаз [2, 3]. Регуляция пролиферации и гибели лимфоцитов во время иммунного ответа спо-собствует поддержанию гомеостаза в адаптивном иммунном ответе. Несмотря на то, что количество эффекторных Т-клеток при первичном иммунном от-вете может увеличиваться в 1000 раз [4], програм-мированная смерть большинства этих клеток ограни-чивает накопление общего числа клеток [5].

Обширные исследования выявили множество факторов, которые регулируют гомеостаз перифе-рических лимфоцитов [2, 3]. Недавно проведен-ные исследования предполагают, что аутофагия, фундаментальный внутриклеточный процесс, обе-спечивает новый механизм регуляции гомеостаза Т-лимфоцитов [6].

e-mail: [email protected]

Индукция аутофагии в Т-лимфоцитах периферической крови больных атопической бронхиальной астмой

Ю.В. Скибо 1, А.А. Пономарева 2, И.Д. Решетникова 3, З.И. Абрамова 1 1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань2 Казанский институт биохимии и биофизики РАН, Казань3 Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии, Казань

Autophagy induction in peripheral blood T-lymphocytes of atopic asthma patientsY.V. Skibo 1, A.A. Ponomareva 2, I.D. Reshetnikova 3, Z.I. Abramova 1 1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan2 Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of RAS, Kazan3 Kazan SRI of Epidemiology and Microbiology, Kazan

Аутофагия является фундаментальным процессом, ко-торый обеспечивает регуляцию гомеостаза Т-лимфоцитов. Она может являться единственным механизмом гибели клеток, когда в клетке имеются нарушения в индукции апоптоза. Ранее было показано торможение апоптоза лим-фоцитов больных бронхиальной астмой, поэтому основные исследования данной работы были направлены на изуче-ние развития процесса аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой. В статье представлены основные морфологические изменения клеток, связанные с акти-вацией аутофагии (формирование аутофагосом). Помимо морфологических изменений лимфоцитов, приводятся ре-зультаты исследования экспрессии маркерного белка ауто-фагии – LC3B. В работе установлено, что в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмы происходит одновремен-ная активация как аутофагии, так и апоптоза, и аутофагия является стимулом к гибели клеток.

Ключевые слова: аутофагия, апоптоз, Т-лимфоциты, астма, LC3B белок.

Autophagy is a fundamental process that ensures the regulation of T-cell homeostasis. In case of apoptosis induction disruption in the cell it could be single mechanism of the cell death. Previously was shown inhibition of lymphocyte apoptosis in patients with bronchial asthma, so the main study of this work has focused on the study development process of autophagy in T-lymphocytes of patients with bronchial asthma. The article presents the main morphological changes in cells associated with activation of autophagy (formation autophagosome). In addition to morphological changes in lymphocytes, we have shown the expression of autophagy marker protein (LC3B). We found that in T-lymphocytes of patients with severe asthma are simultaneous activation of both autophagy and apoptosis, and autophagy is a stimulus to cell death.

Key words: autophagy, apoptosis, T-lymphocytes, asthma, LC3B protein.


Оригинальные исследования2

10 тыс. событий.Визуализация лизосом для флуоресцентной ми-

кроскопии. Визуализацию лизосом проводили окра-шиванием клеток после 3 сут. культивирования акри-диновым оранжевым (ПанЭко), приготовленным на буфере Макильвейна [12]. Лизосомы живых клеток флуоресцируют оранжевым цветом.

Статистическая обработка результатов проводи-лась с помощью пакета программ STATISTICA 6.0. При анализе данных были использованы общеприня-тые методы параметрической и непараметрической статистики. Различия считались достоверным при значении р < 0,05.

Результаты

Культивирование клеток в течение 3 сут. со-провождается истощением питательных веществ в среде, что служит стимулирующим фактором для запуска аутофагии. Для определения аутофагии в Т-лимфоцитах был применен метод электронной ми-кроскопии, позволяющий визуализировать аутофа-госомы в клетках. Аутофагосомы – двухмембранные структуры, формирующиеся вокруг различных бел-ков и органелл клетки, подлежащие удалению [11].

Большая часть лимфоцитов условно здоровых доноров обладает морфологией, соответствующей апоптотическим изменениям на ранней стадии про-цесса, а именно потеря клеточной мембраной микро-ворсинок (характерный морфологический признак апоптоза) и конденсация хроматина по периферии ядра (рис. 1A, B).

В процессе культивирования большая часть лим-фоцитов в группе с легкой формой АБА сохраняет типичную морфологию пролиферирующих клеток. Хорошо различимы крупное ядро с диффузным хроматином, митохондрии, аппарат Гольджи и эндо-плазматический ретикулум (рис. 1C). Кроме того, на микрофотографиях клеток обнаружены аутофагасо-мы, внутри которых достаточно хорошо детермини-рованы различные клеточные компоненты, находя-щиеся на стадии переработки (рис. 1D).

Большинство лимфоцитов в препаратах больных с тяжелой формой АБА имеют морфологию подоб-ную морфологии лимфоцитов группы больных с легкой формой (рис. 1E). Клетки имеют правильную округлую форму, ядро с конденсированным хромати-ном, как правило, занимает большую часть клетки, округлой формы, расположено центрально. В цито-плазме имеется большое количество митохондрий, с хорошо различимыми кристами, рибосомы, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Отмече-но повышенное содержание вакуолей и аутофага-сом. Вакуолизация цитоплазмы и конденсация хро-матина входят в число основных морфологических признаков апоптоза. С другой стороны, присутствие значительного количества аутофагасом в клетках свидетельствует об индукции аутофагии. Таким об-разом, в клетках происходит активация как апоптоза, так и аутофагии.

LC3B белок – специфический маркер аутофагии, экспрессирующийся на активированной мембране аутофагосом [13]. В нашем исследовании экспрес-сия LC3B белка была обнаружена как в группе с лег-кой, так и в группе с тяжелой формой АБА, однако количество аутофагасом и интенсивность экспрес-сии белка выше в группе больных с тяжелой формой АБА (рис. 2).

цель работы: исследовать развитие процесса ауто-фагии в Т-лимфоцитах больных атопической брон-хиальной астмой (АБА) с легкой и тяжелой формой заболевания.

Материал и методы

Объектом изучения послужили т-лимфоциты периферической крови 10 здоровых доноров и 20 больных АБА (10 пациентов c АБА легкого перси-стирующего течения и 10 пациентов с АБА тяжелого персистирующего течения). Диагноз и степень тя-жести астмы верифицировали согласно критериям «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008). Больные находились под наблюдением в поликлинике аллергических за-болеваний ФБУН КНИИЭМ (Казань). Все исследо-вания проводились в соответствии с правилами ко-митета по этике Хельсинкской декларации.

Выделение Т-лимфоцитов. Лимфоциты выделя-ли по стандартной методике на градиенте плотности фиколла (ρ = 1,077) (ПанЭко). Для получения чи-стой популяции Т-лимфоцитов использовали метод иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human T cells, Dynal, Invitrogen). Подсчет клеток про-водили в камере Горяева, окрашенных 0,1% раство-ром трипанового синего (ПанЭко).

Культивирование лимфоцитов. Т-лимфоциты (2×106 кл./мл.) суспендировали в среде RPMI 1640 (ПанЭко), содержащей 10% эмбриональной теля-чьей сыворотки (ПанЭко), пенициллин/стрептомицин (5000 ед/мл/5000 мкг/мл) (ПанЭко) и 1% L-глутамин (ПанЭко). Клетки инкубировали в течение 3 сут. при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере, содержа-щей 5 % СО2.

Визуализация аутофагосом методом электронной микроскопии. Суспензию лимфоцитов фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида (Serva, Гер-мания) на фосфатном буфере (рН 7,2) и 1% рас-твором ОsO4 (Serva, Германия) на том же буфере. Образцы дегидратировали в этаноле восходящей концентрации, ацетоне и окиси пропилена (Serva, Германия). Материал заливали эпоксидной смолой Эпон – 812 (Serva, Германия). Полимеризовали об-разцы в течение трёх суток в термостате при темпе-ратуре 37, 45 и 60°С, соответственно.

Срезы получали на ультрамикротоме LKВ-III (Швеция), контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата (Serva, Германия) и рас-твором цитрата свинца. Препараты просматривались на электронном микроскопе Hitachi-125 (Япония).

Определение экспрессии LC3B белка методом флуоресцентной микроскопии. Визуализацию аутофа-госом проводили после 3 сут. культивирования с при-менением антител меченых FITC против белка LC3B (LC3B Antibody Kit for Autophagy, Molecular Probes) на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss AxioScope A1 (оснащенный видеокамерой AxioCam MRc5).

Определение экспрессии LC3B белка мето-дом проточной цитофлуориметрии. Экспрессию LC3B белка определяли на проточном цитометре BD FACSCalibur (Becton Dickinson) с применением первичных моноклональных антител (LC3B rabbit monoclonal antibody, Invitrogen, Molecular Probes) и вторичных меченых FITC антител (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG, Invitrogen, Molecular Probes). Детекцию флуоресценции проводили в FL1 канале. В каждом образце было собрано и проанализировано



Рис. 1. Лимфоциты периферической крови больных с различными формами атопической бронхиальной астмы (АБА). Индукция аутофагии в процессе культивирования (72 ч.): А, Б – лимфоциты здорового донора; В – лимфоцит больного легкой формой АБА; Г – аутофагасома с клеточным материалом, подлежащим «перевариванию»; Д – лимфоцит больного тяжелой формой АБА; Е – аутофагасома, сформированная вокруг клеточного материала, подлежащего «перевариванию». Стрелками показаны аутофагасомы. Трансмиссионная электронная микроскопия. Ув.: A, Б, В, Д ×10000; Г, Е ×12000

А Б В Г Д

Е

А Б

В

Г

Рис. 2. T-лимфоциты периферической крови больных с различными формами атопической бронхиальной астмы (АБА). Определение экспрессии LC3B белка в процессе культивирования (72 ч.): А – отсутствие экспрессии LC3B белка в лимфоцитах здорового донора; Б – экспрессия LC3B белка аутофагасом в лимфоцитах больных легкой формой АБА; В – экспрессия LC3B белка аутофагасом в лимфоцитах больных тяжелой формой астмы; Г – количественная оценка и интенсивность экспрессии LC3B белка в Т-лимфоцитах больных легкой (1) и тяжелой (2) формами АБА. Стрелками показаны аутофагасомы с LC3B белком. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к LC3B белку, Г – проточная цитометрия


Оригинальные исследования4

Для переваривания клеточных компонентов, под-лежащих удалению, необходимо слияние аутофа-госом с лизосомами, содержащие гидролазы. Для обнаружения лизосом в клетках был использован краситель акридиновый оранжевый, тропный к лизо-сомам, который способен свободно проникать через

Обсуждение

Недавние исследования показали, что аутофагия может являться новым регулятором численности лимфоцитов в периферической крови [14]. Появ-ление различных стимуляторов (глюкокортикоидов, активных форм кислорода) или же снижение необ-ходимых питательных компонентов в окружающей среде может послужить сигналом запуска про-граммированной гибели клеток [9]. В этом случае, клетки, подлежащие удалению, аккуратно фрагмен-тируются на части (апоптотические тельца) и фаго-цитируются макрофагами или соседними клетками посредством апоптоза. Однако активация апоптоза происходит не всегда. Перед тем как запустить не-обратимый процесс смерти, в клетках активируется другой процесс – аутофагия [10]. Так в период кле-точного «голодания» поддерживается необходимый уровень тех соединений, которые нужны ей для жиз-недеятельности. Но при ликвидации большого числа органелл клеткой принимается решение о запуске программы «самоуничтожения». В том случае, если имеются нарушения в индукции апоптоза, аутофагия является единственным механизмом гибели, дей-ствуя в качестве резервного механизма исполнения смертного приговора, когда апоптоз в клетке заинги-бирован. Отношения между аутофагией и апоптозом являются сложными. Погибнет клетка путем апопто-за или по другому механизму по-прежнему остаётся неясным.

В представленной работе описывается активация аутофагии в лимфоцитах больных АБА в процессе культивирования. Результаты показали, что в отли-чие от группы контроля, в лимфоцитах больных лег-кой и тяжелой формой АБА происходит активация аутофагии (формирование аутофагасом, экспрессия LC3-белка и лизосом).

Тип II программированной клеточной смерти или аутофагия определяется посредством аккумуляции аутофагических вакуолей [15, 16]. В представлен-ной работе было показано, что формирование ау-тофагосом в Т-лимфоцитах больных астмой проис-ходит через 72 ч культивирования. В отличие от них, в клетках здоровых доноров инициируется ПКГ I-типа или апоптоз, на что указывают конденсация хромати-на и отсутствие микроворсинок на плазматической мембране клеток. Подобные морфологические изме-нения наблюдаются и у больных с тяжелой формой астмы. То есть в данном случае можно предположить, что снижение питательных веществ в культуральной среде является сигналом инициации как апоптоза, так и аутофагии. Полученные данные согласуются с ранее проведенными нами исследованиями по изу-чению процесса апоптоза лимфоцитов при развитии атопической бронхиальной астмы (легкой и тяжелой формы) [17]. В частности, на 6 сутки культивиро-вания (144 ч) наибольшее содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза было у больных с тяжелой формой АБА и в группе контроля. Что ин-тересно, в случае больных астмой, большая часть клеток подверглась деградации и превратилась в апоптотические тельца, значительная часть которых состоит из аутофагасом.

Ранее было показано, что Th2-поляризованные CD4+ Т-лимфоциты, погибают либо путем аутофа-гии, либо нуждаются в ней для запуска апоптоза при истощении необходимых факторов роста [14]. Со-гласно этим исследованиям, аутофагия представля-ется более важной для выживания CD8+, чем CD4+ Т-лимфоцитов, а Th2-поляризованные CD4+ Т-клетки более чувствительны к гибели через аутофагию, чем Th1-поляризованные клетки. В этом контексте

биологические мембраны в незаряженном состоя-нии. Его протонированные формы накапливаются в лизосомах, где он, образуя агрегаты, светится ярко оранжевым цветом. В нашем эксперименте лизосо-мы были обнаружены в обеих исследуемых группах больных бронхиальной астмой (рис. 3).

Рис. 3. T-лимфоциты периферической крови больных с различными формами атопической бронхиальной астмы (АБА). Активация лизосом в Т-лимфоцитах в процессе культивирования (72 ч.): А – отсутствие лизосом в лимфоцитах здорового донора; Б –лизосомы в лимфоцитах больных легкой формой АБА; В – лизосомы в лимфоцитах больных тяжелой формой АБА. Стрелками обозначены лизосомы. Окраска: акридиновый оранжевый

А Б

В



следует отметить, что астма является результатом переключения с Th1- на Th2-хелперный ответ. Ранее были получены результаты, свидетельствующие об увеличении количества CD4+ лимфоцитов в груп-пе с тяжелой формой АБА, в то время как в группе с легкой формой астмы отсутствовали изменения в численности данной субпопуляции [18]. Поэтому мы можем сделать вывод, что в условиях стресса в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой АБА проис-ходит одновременная активация I и II типа ПКГ (ау-тофагии и апоптоза) и аутофагия является стимулом к гибели клеток.

В случае легкой формы АБА, мы можем предпо-ложить, что изначально в клетках активируется ауто-фагия и предшествует апоптозу, который, исходя из ранее полученных результатов, заторможен. То есть в данном случае не совсем понятно, либо аутофагия способствует выживаемости лимфоцитов, которые после выполнений своей функции должны погибнуть, что может оказать негативное воздействие на весь организм, либо является стимулятором их гибели. В работе G. Kroemer с соавт. (2005) было показа-но, что аутофагия зачастую предшествует апоптозу,

являясь для клеток последней попыткой спастись от гибели [19]. В тоже время H. Pua с соавт. (2007) показали, что аутофагия требуется для гибели кле-ток, особенно когда апоптотический механизм нахо-дится под угрозой [6].

Полученные результаты показали, что в условиях снижения питательных веществ в среде происходит стимуляция смерти Т-лимфоцитов через аутофагию у больных с тяжелой формой астмы, являясь след-ствием Th2-хелперного ответа у таких больных. В случае легкого течения заболевания вопрос остает-ся открытым: либо аутофагия способствует выжи-ваемости лимфоцитов, либо является стимулятором их гибели? Поэтому представляется перспективным исследование механизма возможного переключения между апоптозом и аутофагией.

Благодарности

Авторы выражают благодарность лаборатории Биоматериалов и наноматериалов Казанского (При-волжского) федерального университета за помощь в работе на флуоресцентном микроскопе.

ЛИТЕРАТУРА:1. Бростофор Д., Мейл Д., Ройтт А. и др. Иммунология. Мо-

сква: Логосфера; 2007.2. Jameson S.C. Maintaining the norm: T-cell homeostasis. Nat.

Rev. Immunol. 2002; 2: 547–56.3. Plas D.R., Rathmell J.C., Thompson C.B. Homeostatic control of

lymphocyte survival: potential origins and implications. Nat. Immunol. 2002; 3(6): 515–21.

4. Blattman J.N., Antia R., Sourdive D.J. et al. Estimating the precursor frequency of naive antigen-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 2002; 195(5): 657–64.

5. Badovinac V.P., Harty J.T. Programming, demarcating, and manipulating CD8+ T-cell memory. Immunol. Rev. 2006; 211: 67–80.

6. Pua H.H., Dzhagalov I., Chuck M. et al. A critical role for the autophagy gene Atg5 in T cell survival and proliferation. J. Exp. Med. 2007; 204: 25–31.

7. Walter M.J., Holtzman M.J. A centennial history of research on asthma pathogenesis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 32: 483–9.

8. Бойчук С.В., Мустафин И.Г. Fas-рецептор и его роль при ато-пических заболеваниях. Иммунология 2001; 3: 24–8.

9. O’Sullivan S., Cormican L., Burke C.M. Fluticasone induces T cell apoptosis in the bronchial wall of mild to moderate asthmatics. Asthma 2004; 59(8): 657–61.

10. Lockshina R.A., Zakerib Z. Apoptosis, autophagy and more. Int. J. Biochem. Cell B. 2004; 36(12): 2405–19.

11. Klionsky D.J. The molecular machinery of autophagy: unanswered questions. Cell Science 2005; 118: 7–18.

12. Paglin S., Hollister T., Delohery T. et al. A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles. Cancer Res. 2001; 61: 439–44.

13. Kabeya Y., Mizushima N., Ueno T. et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO 2000; 19: 5720–8.

14. Li C., Capan E., Zhao Y. et al. Autophagy Is Induced in CD4-T Cells and Important for the Growth Factor-Withdrawal Cell Death. Immunology 2006; 177(8): 5163–8.

15. Bursch W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 2001; 8(6): 569–81.

16. Edinger A.L., Thompson C.B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology 2004; 16: 663–9.

17. Скибо Ю.В., Курмаева Н.Ш. Особенности апоптоза лимфо-цитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной аст-мой. Практическая медицина 2012. В печати.

18. Скибо Ю.В., Курмаева Н.Ш., Цибулькина В.Н. и др. Струк-тура основных популяций лимфоцитов у больных атопической брон-хиальной астмой разной степени тяжести. Практическая медицина 2012. В печати.

19. Kroemer G., Jaattela M. Lysosomes and autophagy in cell death control. Nat. Rev. Cancer. 2005; 5: 886–97.

Поступила 10.08.2012

Индукция аутофагии в Т-лимфоцитах ... · 2012-11-09 ·...

Documents