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Aus der Abteilung Allgemeine Pharmakologie
des Instituts für Pharmakologie und Toxikologie
(Leiter Univ. Prof. Dr. H. K. Kroemer)
der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Expression und Lokalisation von
P-Glykoprotein in humanem Herzgewebe
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin (Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2002
vorgelegt von Christiane Karsten
geb. am 24.03.1976
in Mönchengladbach
Dekan: Prof. Dr. H. K. Kroemer
1. Gutachter: Prof. Dr. H. K. Kroemer
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. G. Geisslinger
Raum: Hörsaal der Klinik für Innere Medizin
Tag der Disputation: 11. Juli 2003
Die Endlosigkeit des wissenschaftlichen Ringens
sorgt unablässig dafür, dass dem forschenden
Menschengeist seine beiden edelsten Antriebe
erhalten bleiben und immer wieder von neuem
angefacht werden: Die Begeisterung und die
Ehrfurcht.
Max Planck
Inhalt
1. EINLEITUNG 1
1.1 Hintergrund und Ziel der Arbeit 1
1.2 Transport von Substanzen über Zellmembranen 2
1.3 Transporter aus der ABC-Transporter-Familie 3
1.4 Das ABC-Transportprotein P-Glykoprotein 4
1.5 Anatomie des Herzens 8
1.6 Die Herzinsuffizienz 10
1.7 Kardiomyopathien führen zu einer Herzinsuffizienz 13
2. MATERIAL UND METHODEN 16
2.1 Material 16
2.2 Methoden 21
2.2.1 Präparation von Gesamt-RNA aus Gewebe 21
2.2.2 Umschreiben der RNA in cDNA 23
2.2.3 Vervielfältigung von cDNA-Fragmenten 24
2.2.4 Gelelektrophorese der PCR-Produkte 27
2.2.5 Immunhistochemische Darstellung von P-Glykoprotein 29
2.2.6 Statistische Auswertung der Ergebnisse 30
3. ERGEBNISSE 31
3.1 Isolation von RNA aus Herzgewebe 31
3.2 Ergebnisse der RT-PCR 32
3.3 Ergebnisse der Immunhistochemie 36
4. DISKUSSION 43
5. ZUSAMMENFASSUNG 50
6. LITERATUR 51
7. ANHANG 65
Abkürzungen
APAAP Alkaline Phosphatase anti-alkaline Phosphatase
APS Ammoniumpersulfat
Aqua dest. destilliertes Wasser
ATP Adenosin-Triphosphat
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
DCM dilatative Kardiomyopathie
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleotidtriphosphat
EDTA Ethylendiaminotetraacetat
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
HZV Herzzeitvolumen
ICM ischämische Kardiomyopathie
MDR Multidrug Resistance
MRP Multidrug Resistance associated Protein
MOPS Morpholinopropansulfonsäure
mRNA Boten-(messsenger)-RNA
NF Non-Failing (Gesund)
PCR Polymerasekettenreaktion
P-gp Phospho-Glykoprotein
RNA Ribonukleinsäure
rRNA ribosomale RNA
RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR
Taq Thermus aquaticus
TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer
TE Tris-EDTA-Puffer
TEMED N, N, N’, N’-Tetrametylethylendiamin
Tris Hydroxymethylaminomethan
UV Ultraviolett
Maße und Einheiten
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
bp Basenpaar
g Gramm
h Stunden
kb Kilobasenpaar
kDa Kilo-Dalton
mg Milligramm
min Minuten
V Volt
1. Einleitung 1
1. Einleitung
1.1 Hintergrund und Ziel der Arbeit
ATP-abhängige membranständige Transportproteine bestimmen die Konzentration
vieler endogener und exogener Stoffe in verschiedenen Zellen. Entdeckt wurde dieser
Effekt zunächst an resistenten Tumorzellen und schließlich auch in normalem Gewebe.
Viele verschiedene Transporter konnten in diesem Zusammenhang identifiziert werden,
einer davon ist das P-Glykoprotein (P-gp). Im Gehirn und im Darm dient P-
Glykoprotein als funktionelle Barriere, um den Eintritt toxischer Substanzen zu
verhindern. Auch im Herzen könnte eine solche Barriere den Herzmuskel vor
schädlichen Einflüssen schützen. Viele bei der Therapie von Herz-Kreislauf-
Erkrankungen eingesetzte Substanzen (Digoxin, β-Blocker) gehören zu den Stoffen, die
durch P-Glykoprotein transportiert werden. Auch Substanzen mit erwiesener
Kardiotoxizität (Doxorubicin) sind Substrate des P-Glykoproteins.
Die Expression von P-Glykoprotein ist individuell sehr verschieden. Hierfür werden
zum einen genetische Faktoren (Mutationen), zum anderen aber auch Umwelteinflüsse
(Substanzen, die P-gp induzieren oder hemmen können) verantwortlich gemacht.
Die gleichzeitige Gabe mehrerer Medikamente, die von P-Glykoprotein transportiert
werden, kann zu Interaktionen führen. Solche Interaktionen treten nicht nur in Darm
und Leber auf, sondern theoretisch in jeden P-Glykoprotein exprimierenden Gewebe.
Einige P-gp-Substrate haben eine sehr variable Kardiotoxizität, die ihre Ursache in einer
individuell unterschiedlichen Expression von P-Glykoprotein haben könnte. Daher
sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit Proben aus 15 humanen Herzen (linker
Ventrikel; 5 Gesunde, 5 mit ischämischer Kardiomyopathie und 5 mit dilatativer
Kardiomyopathie) auf die Expressionsstärke von P-Glykoprotein hin untersucht werden.
1. Einleitung 2
1.2 Transport von Substanzen über Zellmembranen
Jeder Wirkstoff und jeder endogene Stoff, der in eine Zelle hinein oder aus ihr heraus
gelangen soll, muss über die Zellmembran transportiert werden. Jedes Medikament
muss also auf dem Weg vom Darm ins Blut und vom Blut zum Wirkort eine Vielzahl
von Membranen passieren. Viele dieser Stoffe werden durch spezielle Transportsysteme
über die Zellmembran transportiert. Zu den wichtigsten Aufgaben dieser
Transportsysteme gehören die Anreicherung von Energieträgern und Baustoffen aus der
Umgebung sowie die Elimination von Schadstoffen und der Erhalt eines
Ionengradienten, der für die Erregbarkeit von Nerven und Muskelzellen unerlässlich ist.
Die verschiedenen Varianten dieser Transportsysteme werden in zwei große Klassen
eingeteilt. Der passive Transport benötigt keine Energie und erfolgt mit dem
Konzentrationsgradienten. Im Gegensatz dazu steht der aktive Transport, bei dem ein
Stoff mit Hilfe von Energie gegen einen Konzentrationsgradienten transportiert wird.
Zum passiven Transport zählen die freie Diffusion, die nur für Wasser und nichtpolare
Moleküle möglich ist, und die erleichterte (passive) Diffusion. Charakteristisch für die
erleichterte Diffusion ist eine begrenzte Kapazität durch das begrenzte Vorhandensein
von Träger-Proteinen (Carrier) oder Ionenkanälen. Diese Möglichkeit des Transports
ist also sättigbar. Weiterhin zeichnet sich diese Form des Transportes durch eine hohe
Spezifität der Carrier-Proteine für den zu transportierenden Stoff aus. Carrier sind
Proteine, die quer durch die Lipiddoppelschicht reichen und spezifische Bindungsstellen
für bestimmte Substanzen besitzen und deshalb auch nur diese transportieren können.
Ionenkanäle funktionieren ähnlich wie Carrier-Proteine. Ionenkanäle sind hoch
selektive Proteine, die in offener und geschlossener Form vorliegen können. Der
Funktionszustand der Ionenkanäle kann durch Signalmoleküle (z. B. Neurotransmitter),
Ionen oder GTP-bindende Proteine beeinflusst werden. Die Flussrichtung und
Geschwindigkeit wird vom Konzentrationsgradienten und von der Gesamtladung der
durchfließenden Ionen bestimmt.
Der aktive Transport transportiert Teilchen durch den Einsatz von Energie gegen das
Konzentrationsgefälle.
1. Einleitung 3
Beim primär-aktiven Transport ist der Transport direkt an eine energieliefernde
chemische Reaktion gebunden. Beispiele für diese Reaktion sind die Natrium-Kalium-
Pumpe und die Wasserstoff-Sekretion in den Belegzellen der Magenschleimhaut. Die
Energie wird durch die Spaltung von Adenosin-Triphosphat (ATP) gewonnen.
Der sekundär-aktive Transport hat die Besonderheit, dass die Energie nicht in Form von
ATP, sondern durch ein physikalisches Potential gewährleistet wird. Die Triebkraft für
den Transport eines Stoffes gegen den Konzentrationsgradienten ist der gleichzeitige
Transport eines anderen Stoffes mit dem Gefälle. Dies kann im Cotransport (Symport)
oder im Gegentransport (Antiport) geschehen. Beispiele sind die Aufnahme von
Glukose oder Aminosäuren im Intestinaltrakt oder im Tubulussystem der Niere.
Zu erwähnen ist noch die Möglichkeit der rezeptorvermittelten Endozytose, bei der
Stoffe (zumeist größere Moleküle) durch die Bindung an einen bestimmten Rezeptor
und nachfolgender Abschnürung der Zellmembran aufgenommen werden.
Die nachfolgend vorgestellten Proteine aus der ABC-Transporter-Familie gehören in die
Klasse des primär aktiven Transportes. Die notwendige Energie wird durch Spaltung
von ATP gewonnen.
1.3 Transporter aus der ABC-Transporter-Familie
ABC-Transporter (ATP-binding-cassette) sind eine große Gruppe von Transportern, die
alle gemeinsam haben, dass sie Substanzen mit Hilfe von ATP gegen den
Konzentrationsgradienten durch biologische Membranen transportieren. Transporter
dieser Familie hat man in vielen verschiedenen Spezies gefunden. Bisher sind 48
solcher Transportproteine beim Menschen bekannt.
Ein typischer ABC-Transporter besteht aus vier membranassoziierten Domänen, von
denen zwei hydrophob sind. Jede der hydrophoben Domänen besteht wiederum aus
sechs transmembranösen Segmenten (1). Entscheidend für die Zugehörigkeit zu dieser
Familie ist ein 200-250 Aminosäuren langer Bereich, in dem ATP gebunden wird (1).
1. Einleitung 4
Proteine der ABC-Transporter-Familie transportieren eine Vielzahl endogener und
exogener Stoffe. Einige dieser Transporter sind durch ihre Eigenschaft als
Resistenzproteine bei der Pharmakotherapie von Malignomen aufgefallen. Zu diesen
Transportern gehört die MRP-Familie (Multidrug Resistance associated Protein) und
das BCRP (Breast Cancer Resistance Protein). Der bekannteste Vertreter ist jedoch das
P-Glykoprotein.
1.4 Das ABC-Transportprotein P-Glykoprotein
Das Transportprotein Phospho-Glykoprotein (P-gp) wurde erstmals von JULIANO in
der Arbeitsgruppe von LING in Tumorzellen (Ovarien des chinesischen Hamsters)
entdeckt (2). Diese Tumorzellen waren in der Lage, Arzneimittel aus einer Zelle
herauszutransportieren. Zellen aus Lungen-, Darm-, Magen-, Brust- und
Schilddrüsentumoren, Neuroblastomen und Leukämien weisen oft eine erhöhte
Expression von P-gp auf (3). Folge dieser erhöhten P-gp-Expression ist eine
Multiresistenz gegenüber verschiedenen strukturell nicht miteinander verwandten
Stoffen. Diese Resistenz wird mit einem aktiven Auswärtstransport durch P-gp aus der
Zelle erklärt.
P-Glykoprotein ist das Genprodukt des MDR1-Gens, welches auf dem langen Arm des
Chromosoms 7 liegt (4). Dieses Gen wird auch MDR1-Gen genannt. Biochemische und
molekularbiologische Untersuchungen des P-Glykoproteins haben ergeben, dass es sich
um ein 1280 Aminosäuren langes, integrales Plasmamembranprotein mit einem
Molekulargewicht von 170 kDa handelt. Das Protein vermag ATP-abhängig
verschiedene hydrophobe Substanzen aus der Zelle zu transportieren und so deren
Konzentration im Intrazellularraum niedrig zu halten (5, 6).
P-gp besteht aus zwei Anteilen, die eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. Jede dieser
Hälften enthält eine hydrophobe Domäne, die wiederum aus sechs Transmembran-α-
Helices besteht, die für den Transport von Substanzen entscheidend sind, und eine
1. Einleitung 5
zytosolische, hydrophile Domäne mit der Nukleotid-bindenden Domäne 1 und 2 (NBD
1 und NBD 2). Beide Anteile des Proteins sind über eine „linker region“ verbunden (7,
8). Trotz einer hohen Sequenz- und Strukturhomologie nimmt man an, dass das P-
Glykoprotein eher durch die Fusion von Genen, die sich entwicklungsgeschichtlich
unabhängig voneinander entwickelt haben, als durch eine Genduplikation entstanden ist
(9). Einige ABC-Transporter wie das BCRP werden als Half-Transporter bezeichnet, da
sie nur aus einer hydrophoben Domäne mit sechs Transmembran-α-Helices und einer
ATP-Bindungsstelle bestehen. Um funktionsfähig zu sein, müssen diese Transporter
dimerisieren. Die hydrophilen Regionen des P-Glykoproteins haben eine große
Homologie zu aktiven Transportsystemen bestimmter Bakterien (7). Diese bakteriellen
Transportsysteme transportieren verschiedene Aminosäuren und Zucker (10, 11).
Abb. 1.1: Schematische Zeichnung des P-Glykoproteins (12)
Auch in gesunden Geweben wie z. B. in Epithel- und Endothelzellen der Leber, der
Niere, im Gastrointestinaltrakt und in der Blut-Hirn-Schranke konnte P-gp
nachgewiesen werden (siehe Tabelle 1.2). Die physiologische Funktion von P-gp ist
noch nicht vollständig erforscht. Auf Grund der Lokalisation von P-gp im Epithel des
Magen-Darm-Traktes und der Beteiligung an exkretorischen Vorgängen liegt nahe, dass
P-gp im Organismus eine Schutzfunktion gegen in der Natur vorkommende toxische
Substanzen hat. Diese toxischen Substanzen können z. B. mit der Nahrung
aufgenommene Xenobiotika sein (13). Fremdstoffe werden so gar nicht oder nur in sehr
geringen Mengen aufgenommen bzw. schneller wieder ausgeschieden. Untersuchungen
1. Einleitung 6
in exkretorischen und sekretorischen Organen beschreiben Funktionen im Rahmen der
Detoxifikation. So ist P-gp an der Sekretion von Metaboliten in die Galle, den Urin oder
direkt in das Lumen des Gastrointestinaltraktes beteiligt (14, 15).
Zum Schutz vor Toxinen, die bereits in die Blutbahn gelangt sind, wird P-Glykoprotein
entlang der Endothelien der Blutgefäße exprimiert. Dieses konnte bisher im Gehirn (16,
17) und im Hoden (18) gezeigt werden.
Die Bedeutung von P-gp für die Blut-Hirn-Schranke ist anhand von mdr1a (-/-)-Knock-
out Mäusen gezeigt worden. Diese Mäuse wiesen eine stark erhöhte Toxizität durch
hohe Konzentrationen verschiedener Substanzen auf (16). Andere Untersuchungen
haben überproportional hohe Konzentrationen des Anthrazyklins Doxorubicin in
kardialen Proben solcher Mäuse beschrieben (19).
Tab. 1.2: Beispiele für Zelltyp, genaue Lokalisation und Transportrichtung von P-gp in verschiedenen Organen (18).
Organ Zelltyp Lokalisation Transport
Leber Hepatozyt kanalikuläre
Membran
in die Galle
Darm Enterozyt apikale Membran in das Lumen des GI-
Traktes
Niere Epithelzellen des
proximalen Tubulus
apikale Membran in das Lumen des Tubulus
Gehirn Luminale Membran luminale Membran in das Blut
P-Glykoprotein transportiert eine Vielzahl sehr unterschiedlicher Substanzen. Diese
Substanzen haben kein einheitliches Strukturmerkmal. Es sind vor allem kationische
und amphiphile Moleküle (20). Neben dem Transport von körperfremden Stoffen ist P-
gp auch in den Transport von endogen synthetisierten Stoffen eingebunden. Es konnte
gezeigt werden, dass P-gp in der Lage ist, Kortisol, Aldosteron und Dexamethason zu
transportieren (21, 22). Eine Auswahl solcher sowohl natürlich in der Umwelt
vorkommender als auch synthetisch hergestellter Substanzen zeigt Tab. 1.3.
1. Einleitung 7
Tab. 1.3: Eine Auswahl natürlicher und synthetischer Substanzgruppen und Substanzen, die durch das MDR1-Genprodukt P-gp transportiert werden.
Substanzgruppe Substrat Literatur
β-Blocker Talinolol
Celiprolol
Spahn-Langguth et al. (23),
Gramatte et al. (24)
Karlsson et al. (25)
Herz-Kreislauf-
Pharmaka
Digoxin
Verapamil
Tanigawara et al. (26)
Safa et al. (27)
HIV-Protease-Hemmer Saquinavir
Indinavir
Kim et al. (28)
Lee et al. (29)
Zytostatika Doxorubicin
Vinblastin
Taxol
Etoposid
Beck et al. (30)
Akiyama et al. (31)
Schinkel et al. (32)
Beck et al. (30)
Immunsupressiva Cyclosporin A Saeki et al. (33)
Opioide Loperamid
Morphin
Callaghan et al. (34)
Callaghan et al. (34)
Antikonvulsiva Phenytoin Thisher et al. (35)
Hormone Kortisol
Dexamethason
Aldosteron
Van Kalken et al. (22)
Ueda et al. (21)
Ueda et al. (21)
Die Transportfunktion von P-gp kann durch unterschiedliche Mechanismen reguliert
werden. So kann die Gabe von hohen Dosen des Kalzium-Kanal-Blockers Verapamil
eine P-gp vermittelte Arzneimittelresistenz wieder rückgängig machen (36, 37). Durch
die Bindung von Verapamil an den Transporter kann der Export von Arzneimitteln
nicht mehr stattfinden. Auch Cyclosporin A (38), Chinidin, Chinin, Vinblastin,
Doxorubicin, Digoxin, Nifedipin und Rocuronium werden solch günstige Effekte in
Bezug auf Mehrfachresistenzen zugeschrieben. Eine andere Möglichkeit der Regulation
ist die Induktion von P-Glykoprotein. So bewirkt das Tuberkulostatikum Rifampicin bei
1. Einleitung 8
oraler Gabe eine erhöhte Expression des MDR1-Produktes im Bürstensaum der
Enterozyten (39, 40). In Fallbeschreibungen von Patienten und in Studien mit
Probanden konnte als Folge der durch Induktoren erhöhten P-Glykoprotein-Expression
eine signifikante Abnahme der Digoxinspiegel festgestellt werden. Solch eine
veränderte Kinetik trat sowohl bei oraler als auch bei intravenöser Gabe des P-gp-
Substrates Talinolol und des P-gp-Induktor Rifampicin auf (39).
Auffallend viele Substrate des P-Glykoproteins sind Substanzen, die bei der Therapie
von Herz-Kreislauf-Erkrankungen eingesetzt werden, also kardioaktiv sind. Auch
kardiotoxische Substanzen wie Doxorubicin sind Substrate von P-Glykoprotein. Die
toxische Wirkung dieser Substrate zeigt eine hohe interindividuelle Variabilität. Daher
soll die P-Glykoprotein-Expression im Herzen untersucht werden. Im Folgenden wird
zunächst die Anatomie des Herzens beschrieben.
1.5 Anatomie des Herzens
Das Herzmuskelgewebe hat einen mesodermalen Ursprung. Die Zellen reifen zunächst
zu Myoblasten und verschmelzen anschließend zu Kardiomyozyten. Reife
Herzmuskelzellen haben wie Skelettmuskelzellen eine Querstreifung, aber nur ein bis
zwei zentral gelegene Zellkerne. Jede Herzmuskelzelle ist von einem zarten
gefäßreichen Bindegewebe, dem Endomysium umgeben. Über Glanzstreifen (Disci
intercalares) sind die einzelnen Herzmuskelzellen miteinander verbunden. Die für die
Elektrophysiologie wichtigsten Bestandteile der Disci intercalares sind die Nexus. Über
diese herzspezifischen Verbindungen kommt es zu einer elektrischen Kopplung, die die
Herzmuskelzellen eines Bündels zu einem Verband zusammenschließt. Die
Erregungsausbreitung findet so von Zelle zu Zelle statt.
Im Gegensatz zu Muskelzellen der Skelettmuskulatur sind die Kalziumspeicher in der
Herzmuskulatur weniger stark ausgeprägt, so dass der transmembranöse
Kalziumeinstrom aus dem Extrazellularraum eine bedeutende Rolle für die Kontraktion
1. Einleitung 9
spielt. Die Permeabilität der äußeren Zellmembran für Kalzium kann durch Stimulation
von β-Rezeptoren, z. B. durch Adrenalin oder Noradrenalin, gesteigert werden. Die
Kontraktion an sich läuft ohne Unterschied zu anderen Muskelgeweben durch die
Interaktion von Aktin und Myosin ab. Um eine möglichst optimale Funktion zu
erreichen ist die Aktin-Myosin-Überlappungszone von entscheidender Bedeutung.
Durch passive Dehnung, wie bei der diastolischen Füllung des Herzens, wird die Aktin-
Myosin-Interaktion optimiert. Dieser Effekt wird als Frank-Starling-Mechanismus
bezeichnet. Bei zu starker Dehnung verbreitert sich der Abstand der Z-Streifen
(Sarkomer), die Kontraktion zeigt eine verminderte Kraftentwicklung in Folge von
weniger zur Verfügung stehenden Interaktionsorten. Bei einer Sarkomerlänge von mehr
als 3,6 µm sind die Aktin- und Myosinfilamente gänzlich auseinandergeglitten und es
kann zu keiner Kontraktion mehr kommen.
Die Blutversorgung des Herzens erfolgt über die beiden Herzkranzarterien (Aa.
coronariae cordis). Beide Herzkranzarterien entspringen aus der Aorta. Die Grenzen
innerhalb der die Koronararterien das Herz mit Blut versorgen, sind sehr verschieden.
Man unterscheidet drei Versorgungstypen: 1. den ausgeglichenen Typ, 2. den
Rechtsversorgertyp und 3. den Linksversorgertyp. Alle Herzkranzgefäße ziehen von
außen nach innen durch das Myokard. Die Zweige der Herzkranzgefäße bilden
funktionelle Endarterien, d. h. sie bilden keine Kollateralen oder Anastomosen zu
Nachbararterien. Der eigentliche Stoffaustausch findet in den Kapillaren statt.
Mikroskopisch bestehen Kapillaren aus dem Endothel, das die Auskleidung des
Blutgefäßes darstellt, einer dem Endothel anliegenden Basalmembran und aus
kontraktilen Zellen (Perizyten) die wiederum der Basalmembran aufliegen. Je nach
Organ und Funktion lassen sich elektronenmikroskopisch Kapillaren mit geschlossener
Endothelschicht (Blut-Gewebe-Schranken), mit gefenstertem Endothel
(Nierenglomeruli, Darm, Drüsen) und mit interzellulären Lücken (Leber, Milz)
abgrenzen. Der venöse Abfluss verläuft entlang der arteriellen Gefäße und mündet in
den rechten Vorhof.
Erkrankungen des Herzens führen oft zu einer verminderten Pumpfunktion, also zu
einer Herzinsuffizienz.
1. Einleitung 10
1.6 Die Herzinsuffizienz
Eine Herzinsuffizienz liegt vor, wenn die Auswurfleistung des Herzens nicht mehr
ausreicht, die Peripherie mit genügend sauerstoffreichem Blut zu versorgen (41).
Die Herzinsuffizienz ist eine der häufigsten internistischen Erkrankungen. In den
westlichen Ländern treten pro Jahr 1-4/1000 Neuerkrankungen auf (42). Prävalenz und
Inzidenz nehmen mit dem Alter deutlich zu (42).
Die Ätiologie dieser Erkrankung ist sehr vielfältig. So können perikardiale,
myokardiale, endokardiale Störungen, Veränderungen der Klappen oder der großen
Gefäße ursächlich sein. Nach der EPICAL-Studie sind koronare Herzkrankheit und
dilatative Kardiomyopathie die beiden häufigsten Ursachen einer Herzinsuffizienz (43).
Die Einteilung der Herzinsuffizienz erfolgt nach ursächlichen, zeitlichen und
wirkungsorientierten Gesichtspunkten. Man unterscheidet eine Rechts- und
Linksherzinsuffizienz, systolische und diastolische Insuffizienz, High- und Low-output-
Herzinsuffienz oder ein Vorwärts- und Rückwärtsversagen (44). Dem zeitlichen Verlauf
nach wird eine akute und eine chronische Herzinsuffizienz unterschieden. Gerade im
späteren Verlauf der Erkrankung gehen die einzelnen Formen ineinander über.
Eine erniedrigte Auswurfleistung in den Körperkreislauf zieht eine Reihe komplexer
Anpassungsmechanismen nach sich. Wichtige Anpassungsmechanismen sind die
Aktivierung des adrenergen Systems, die Aktivierung des Renin-Angiotensin-
Aldosteron-Systems (RAAS) und die Freisetzung des antidiuretischen Hormons (ADH).
Die Folgen dieser Anpassungsmechanismen sind ein erhöhter systemischer
Gefäßwiderstand und eine verstärkte Natrium- und Wasserretention mit vermehrter
Kaliumausscheidung und Arrhythmieneigung. Die Sensibilität gegenüber
Katecholaminen ist gemindert (45).
Das klinische Bild ist geprägt von Dyspnoe, Erschöpfung, Schwäche, sowie
abdominellen und zerebralen Symptomen.
1. Einleitung 11
Zur Prognose von Patienten mit einer Herzinsuffizienz sind viele Studien durchgeführt
worden. Sie ist abhängig vom Schweregrad der kardialen Dysfunktion und von der
Therapie (46).
Sowohl die symptomatische Herzinsuffizienz als auch jede kardiale
Pumpfunktionsstörung mit einer Ejektionsfraktion von unter 40 % ist eine
Behandlungsindikation. Die symptomatische Therapie der Herzinsuffizienz hat zum
Ziel: 1. die Letalität zu senken, 2. eine Progression zu verlangsamen oder ganz zu
vermeiden, 3. die Symptome zu verringern und die Lebensqualität zu verbessern, 4. die
Hospitalisationsrate zu senken und 5. die hämodynamischen Parameter zu verbessern
(47).
Zunächst sollte eine Beseitigung der auslösenden Ursachen und eine Behandlung der
Grunderkrankung vorgenommen werden. Diese kausale Therapie kann sowohl
operative und katheterinterventionelle Maßnahmen als auch eine medikamentöse
Therapie umfassen. Bei nicht ausreichendem Effekt allgemeiner Maßnamen wie
körperlicher Schonung, Trinkmengenbegrenzung und Salzrestriktion, Einschränkung
des Alkohol- und Nikotinkonsums und angemessenem körperlichem Training kommt
die medikamentöse Therapie zum Einsatz. Die klassischen Medikamente der
Herzinsuffizienz sind Diuretika, ACE-Hemmer und Digitalisglykoside. Außerdem
stehen noch β-Rezeptor-Antagonisten und AT1-Rezeptor-Antagonisten Substanzen zur
Verfügung.
Gerade bei leichter bis mittelschwerer Herzinsuffizienz sind alle Klassen der Diuretika
gut wirksame Medikamente. Sie führen zu einer signifikanten Gewichtsabnahme und zu
einer Beschwerdebesserung (48, 49). Elektrolytverschiebungen und die Auswirkung auf
das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System können Probleme bei der Therapie der
Herzinsuffizienz bereiten.
Angiotensin-Converting-Enzym-Hemmer (ACE-Hemmer) wirken durch die Hemmung
des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems und den verminderten Abbau von Kininen
günstig auf die hämodynamischen Verhältnisse bei chronisch herzinsuffizienten
Patienten (50, 51). Sie senken den peripheren Gefäßwiderstand und führen so zu einem
besseren Herzzeitvolumen (HZV). In mehreren kontrollierten Studien konnte die
1. Einleitung 12
Progredienz und die Hospitalisationsrate vermindert und die Letalität signifikant
reduziert werden (52, 53). In vielen Studien hat sich auch die Gabe von ACE-Hemmern
bei Infarktpatienten als günstig erwiesen (53-55).
AT1-Rezeptor-Antagonisten sind eine sinnvolle Alternative bei Patienten mit
Nebenwirkungen unter einer Therapie mit ACE-Hemmern. Auch AT1-Rezeptor-
Antagonisten haben Einfluss auf das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System. Sie
blockieren die Wirkung von Angiotensin II an seinen Rezeptoren. Eine Studie von PITT
und Mitarbeitern (2000) hat keine Unterschiede zwischen dem ACE-Hemmer Captopril
und dem AT1-Rezeptor-Blocker Losartan bei der Therapie der Herzinsuffizienz
hinsichtlich der Gesamtsterblichkeit ergeben (56). Therapieabbrüche waren auf Grund
von Nebenwirkungen sogar signifikant weniger häufig.
In Studien konnte belegt werden, dass ß-Rezeptor-Antagonisten einen positiven Effekt
auf den Krankheitsverlauf bei herzinsuffizienten Patienten haben. ß-Blocker wirken am
Herzen negativ inotrop, negativ chronotrop und negativ dromotrop. Durch zusätzliche
Gabe eines β-Blockers zur Standardtherapie konnte eine verbesserte Pumpfunktion
erreicht werden (57, 58). Sowohl β1-selektive Adrenorezeptorblocker (z. B. Metoprolol)
(58) als auch nicht selektive β-Blocker (z. B. Carvedilol) (57) zeigen diesen Effekt.
Herzglykoside wirken direkt an der Herzmuskelzelle über eine Hemmung der Na+/K+-
ATPase. Durch die steigende Natrium-Konzentration in der Zelle wird Kalzium nicht
mehr über einen Na+/Ca2+-Antiport aus der Zelle geschleust, wodurch der intrazelluläre
Ca2+-Gehalt steigt und es zu einer verbesserten Aktin-Myosin-Wechselwirkung kommt.
Die Wirkung am Herzen wird als positiv inotrop, negativ chronotrop, negativ dromotrop
und positiv bathmotrop (gesteigerte Erregbarkeit) beschrieben. Digitalisglykoside haben
keinen Einfluss auf die Gesamtletalität, jedoch kann ihre Gabe die Anzahl der
Krankenhausaufenthalte reduzieren (59). Zu beachten ist, dass Digitalisglykoside einen
proarrhythmogenen Effekt haben können (59, 60).
Neben den hier besprochenen Wirkstoffen gib t es noch weitere Substanzklassen, die bei
der Therapie der Herzinsuffizienz eingesetzt werden können. Zu diesen Substanzen
gehören z. B. die Vasodilatatoren und die Nitrate. Außerdem kann eine begleitende
Therapie mit Antikoagulanzien oder eine antiarrhythmische Therapie notwendig sein.
1. Einleitung 13
Als weiterführende Therapiemöglichkeiten stehen die Schrittmachertherapie und die
Herztransplantation als ultima ratio zur Verfügung.
Viele systemische und kardiale Erkrankungen führen zu einer Herzinsuffizienz.
Beispiele für solche kardiale Erkrankungen sind die Herzmuskelerkrankungen
(Kardiomyopathien).
1.7 Kardiomyopathien führen zu einer Herzinsuffizienz
Kardiomyopathien sind das Myokard betreffende Erkrankungen, die mit einer
myokardialen Dysfunktion einhergehen (61). Anstelle der früheren Klassifikation in
primäre und in sekundäre Formen unterscheidet man heute nur noch die drei Basistypen
der funktionellen Beeinträchtigung: 1. die dilatative, welche die häufigste ist,
gekennzeichnet durch eine ventrikuläre Dilatation und eine kontraktile Dysfunktion, 2.
die hypertrophe, die mit einer Hypertrophie des linken Ventrikels und oft auch des
Septums einhergeht und 3. die restriktive, die durch eine Beeinträchtigung der
diastolischen Füllung charakterisiert ist. Außerdem werden noch eine arrhythmogene
Form und nicht klassifizierte Kardiomyopathien unterschieden (61). Der Begriff
spezifische Kardiomyopathie wird in der jetzigen Terminologie bei
Herzmuskelerkrankungen benutzt, die mit spezifischen kardiologischen oder
systemischen Erkrankungen einhergehen. Zu diesen Erkrankungen gehört auch die
ischämische Kardiomyopathie (61). Das klinische Erscheinungsbild der
Kardiomyopathie gleich welcher Genese ist weitestgehend identisch. Die meisten
Formen weisen die Charakteristika einer dilatativen Kardiomyopathie auf (62).
Eine dilatative Kardiomyopathie (DCM) geht mit einer Herzvergrößerung, einer
Beeinträchtigung der systolischen Pumpfunktion eines oder beider Ventrikel und den
Symptomen einer Herzinsuffizienz einher. Die dilatative Kardiomyopathie ist die
häufigste Erscheinungsform der Kardiomyopathien. Die Inzidenz der Erkrankung liegt
bei 5-8 pro 100000 Einwohner pro Jahr (62) und scheint besonders in den
1. Einleitung 14
Industrieländern steigend zu sein. Die Erkrankung tritt gehäuft bei Männern im
mittleren Lebensalter auf.
Eine Vielzahl verschiedener zytotoxischer, metabolischer, immunologischer, familiärer
und infektiöser Noxen können zu einer dilatativen Kardiomyopathie führen (62).
Alkohol, Schwangerschaft, Selenmangel, Hypophosphatämie, Hypokalzämie und
unkontrollierte Tachykardien kann eine reversible Form der DCM hervorrufen.
Klinisch fallen Patienten mit einer DCM durch Symptome einer Rechts- bzw.
Linksherzinsuffizienz auf. Sie leiden unter Dyspnoe, Müdigkeit, peripheren Ödemen
und Palpitationen.
Die meisten Patienten mit einer DCM zeigen eine unaufhaltsame Progredienz ihrer
Erkrankung. Die Prognose ist abhängig von der Ursache der Erkrankung, der Therapie
und Risikofaktoren wie Alter, Ejektionsfraktion, ventrikulären Arrhythmien und
erhöhten Katecholaminserumspiegeln, um nur einige zu nennen (62).
Die Behandlung der DCM richtet sich in erster Linie nach der Ätiologie der
Erkrankung. So sollte neben der symptomatischen Therapie ggf. auch eine Therapie der
Grunderkrankung erfolgen. Die symptomatische Therapie umfasst eine Behandlung der
Herzinsuffizienz und der eventuell aufgetretenen Herzrhythmusstörungen. Ein
dauerhaftes Überleben eines Patienten kann jedoch nur durch eine Herztransplantation
erzielt werden.
Die ischämische Kardiomyopathie (ICM) gehört zu den spezifischen Kardiomyopathien
(61). Bei der ischämischen Kardiomyopathie sind zunächst die Koronargefäße krankhaft
verändert. Koronararterien sind eine Prädilektionsstelle für die Ausbildung einer
Arteriosklerose. Risikofaktoren für diese Erkrankung sind hohes Plasma-LDL, niedriges
Plasma-HDL, Adipositas, Nikotinabusus, Diabetes mellitus, arterielle Hypertonie und
eine positive Familienanamnese hinsichtlich ischämischer Ereignisse (63). Bei einer
Querschnittseinengung der Koronargefäße von etwa 75 % ist die Koronarreserve
eingeschränkt und bei 80 % ist bereits die Ruhedurchblutung des Herzens gemindert
(63). Ist die Durchblutung des Herzens nur kurzzeitig nicht ausreichend, kommt es zu
den typischen Symptomen der Angina pectoris. Dauert die Ischämie länger an, kommt
es zu einem Myokardinfarkt. Eine ischämische Kardiomyopathie entsteht durch
1. Einleitung 15
multiple kleine Infarkte, die jedoch die Entstehung dieser schwerwiegenden Erkrankung
nicht allein erklären können. Das klinische Erscheinungsbild der ischämischen
Kardiomyopathie entspricht meist dem einer dilatativen Kardiomyopathie (61).
Auch eine Vielzahl von Pharmaka kann zu einer Schädigung des Herzens mit dem
Resultat einer toxischen Kardiomyopathie führen. Zu diesen Pharmaka gehört das in der
Krebstherapie eingesetzte Anthrazyklin Doxorubicin. Hohe Dosen Doxorubicin führen
zu einer letalen Herzinsuffizienz. Neben der Gesamtdosis Doxorubicin konnten
verschiedene Risikofaktoren identifiziert werden. Hierzu gehören Bestrahlung, Alter,
vorbestehende Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Begleitmedikation (64) Auch die Art der
Applikation, ob als Bolusgabe oder Dauerinfusion, ist entscheidend. In diesem
Zusammenhang könnte auch die P-Glykoprotein-Expression im Herzgewebe eine Rolle
spielen, da Doxorubicin zu den von P-Glykoprotein transportierten Substanzen gehört.
Im nachfolgenden Teil sollen die Methoden zur Untersuchung der P-Glykoprotein-
Expression in humanem Herzgewebe besprochen werden.
2. Material und Methoden 16
2. Material und Methoden
2.1 Material
Zur Durchführung der Versuche sowie Ermittlung und Auswertung der Ergebnisse
wurden die nachstehenden Materialien verwendet. Alle Reagenzien wurden mindestens
in der Spezifikation „reinst“ oder in der höchstmöglichen kommerziell erhältlichen
Reinheit verwendet.
Chemikalien
Acrylamid Roth, Karlsruhe, Deutschland
Agarose Serva, Heidelberg, Deutschland
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma, Steinheim, Deutschland
Bromphenolblau Sigma, Steinheim, Deutschland
Borsäure Sigma, Steinheim, Deutschland
Ethylendiaminotetraacetat (EDTA) Sigma, Steinheim, Deutschland
Ethanol J. T. Backer, Deventer, Holland
Ethidiumbromid (EB) Sigma, Steinheim, Deutschland
Formaldehyd Sigma, Steinheim, Deutschland
Formamid, deionisiert Sigma, Steinheim, Deutschland
Hydroxymethylaminomethan (Tris) Roth, Karlsruhe, Deutschland
2. Material und Methoden 17
Isopropanol Sigma, Steinheim, Deutschland
Morpholinopropansulfonsäure
(MOPS) Sigma, Steinheim, Deutschland
Natriumacetat Sigma, Steinheim, Deutschland
Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma, Steinheim, Deutschland
N, N, N’, N’-Tetrametylethylendiamin
(TEMED) Roth, Karlsruhe, Deutschland
Saccharose Sigma, Steinheim, Deutschland
Vistra Green Nucleic Acid Stain Amersham Pharmacia Biotech
Freiburg, Deutschland
Enzyme und Enzyminhibitoren
AMV-Reserse Transkriptase Amersham Pharmcia Biotech, Freiburg,
Deutschland
RNase –Inhibitor (RNasin) Promega, Mannheim, Deutschland
Taq-Polymerase (rekombinant) Gibco BRL, Karlsruhe, Deutschland
Antikörper
JSB-1 Alexis Biochemicals, Grünberg,
Deutschland
2. Material und Methoden 18
Kits für die Molekularbiologie
PeqGOLD RNAPure peqlab, Erlangen, Deutschland
Strataprep Total RNA Miniprep Kit Stratagene, Amsterdam, Niederlande
100 bp-DNA-Marker peqlab, Erlangen, Deutschland
Kits für die Immunhistochemie
Ventana NexES IHC Staining System Ventana Medical Systems, Frankfurt,
Deutschland
ABC Detection Kit Ventana Medical Systems, Frankfurt,
Deutschland
Verwendete Lösungen
1x TBE-Puffer 90 mM Tris-HCl
90 mM Borsäure
2 mM EDTA (pH 8,0)
1x TE-Puffer 10 mM TRIS-HCl (pH 8,0)
1 mM EDTA (pH 8,0)
10x Saccharose-Auftragspuffer 0,2 mM EDTA
25 % Saccharose
0,25 % Bromphenolblau
2. Material und Methoden 19
10x MOPS-Puffer 200 mM MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0
Ethidiumbromidlösung 10 mg/ml
RNA-Ladepuffer 500 µl Formamid
166 µl Formaldehyd (37%ig)
100 µl 10x MOPS
34 µl Bromphenolblau (1% ig)
2,5 µl EB
200 µl Aqua dest.
Geräte und Verbrauchsmaterialien
Elektrophoresekammer Serva, Heidelberg, Deutschland
Elektrophoresekammer Bio Rad, München, Deutschland
Feinwaage Sartorius, Göttingen, Deutschland
Filtertips Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland
Floureszenzimager Storm 840 Molecular Dynamics, Krefeld,
Deutschland
Mikrodismembrator Braun, Melsungen, Deutschland
PCR System 9700 PE Applied Biosystems, Weiterstadt,
Deutschland
Personal Cycler Biometra, Göttingen, Deutschland
2. Material und Methoden 20
Pipetten Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Power Supply Biometra, Göttingen, Deutschland
Reaktionsgefäße Biozym, Hess. Oldendorf, Deutschland
Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg, Deutschland
UV-Spektrometer Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Waage Ohaus, Giessen, Deutschland
Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Zentrifuge Heraeus, Hanau, Deutschland
2. Material und Methoden 21
2.2 Methoden
Insgesamt standen 15 Gewebeproben aus menschlichem Herzmuskelgewebe zur
Verfügung. Alle Proben stammten aus dem linken Ventrikel. Je 5 Proben waren von
Gesunden (NF), Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) und von
Patienten mit einer ischämischen Kardiomyopathie (ICM). Die Proben wurden mit N1-5
für gesund, D1-5 für dilatative Kardiomyopathie und I1-5 für ischämische
Kardiomyopathie bezeichnet.
2.2.1 Präparation von Gesamt-RNA aus Gewebe
Um die bei –80 °C gelagerten Gewebestücke möglichst schnell in dem für die
Präparation der RNA notwendigen Lysepuffer ohne vorheriges Auftauen
homogenisieren zu können, wurde das Gewebe in gefrorenem Zustand mit Hilfe einer
Schwingmühle (Mikrodismembrator) pulverisiert. Das Homogenat wurde anschließend
wieder bei –80 °C gelagert.
Mit dem Ziel einer hohen Reinheit wurde die RNA mit zwei verschiedenen Methoden
hintereinander jeweils einmal isoliert. Die Präparation der Total-RNA aus 60-80 mg
homogenisiertem Gewebe erfolgte durch eine Guanidinium-Isothiocyanat-Extraktion
(peqGOLD RNAPure TM Kit) gefolgt von einer Aufreinigung durch einen DNAse-
Verdau (StrataPrep Total RNA Miniprep Kit). Die vom Hersteller angegebenen
Standardprotokolle wurden hierzu teilweise verändert.
Zunächst wurde das tiefgefrorene Gewebehomogenat in der 1,5-fachen vom Hersteller
angegebenen Menge des im peqGOLD RNAPure TM Kit enthaltenen Lysepuffers unter
Zuhilfenahme einer sterilen 3 ml-Spritze und einer sterilen Kanüle vollständig gelöst.
Erst nach Abwiegen und Aufnahme des Gewebes in den Lysepuffer wurde der Versuch
bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die anschließende RNA-Präparation erfolgte mit der
jeweils 1,5-fachen Menge der einzelnen Reagenzien. Das RNA-Pellet wurde in 50 µl
RNAse-freiem Wasser resuspendiert.
2. Material und Methoden 22
Die bereits mit dem peqGOLD RNAPure TM Kit isolierte RNA wurde ein zweites Mal
über den Strataprep Kit isoliert. Hierzu wurde die isolierte und in RNAse-freiem Wasser
gelöste RNA mit dem im Kit enthaltenen Lysepuffer, ß-Merkaptoethanol und 70%igem
Ethanol versetzt und auf das RNA-Isolationsröhrchen (Fiber Matrix Spin Cup) gegeben.
Die weitere Isolation folgte der Anleitung des Herstellers. Der im Standardprotokoll
vorgesehene DNAse-Verdau wurde mit der doppelten Menge DNAse durchgeführt.
Eluiert wurde die RNA in 2 x 30 µl Elutionspuffer.
Bis zur Reversen Transkription wurde die isolierte RNA bei –80 °C gelagert.
Da bei der Reversen Transkription die RNA in einer Konzentration von 100 ng/µl
vorliegen muss, ist es notwendig die Konzentration der isolierten RNA zu bestimmen.
Die Konzentration sowohl von RNA als auch von DNA wird durch die Messung der
optischen Dichte (OD) bestimmt. Die Methode beruht auf der Absorption von Licht
durch die Nukleotide bei einer Wellenlänge von 260 nm. Durch das Einsetzen in
folgende Formel kann die Konzentration errechnet werden.
Konzentration (c) = Absorption 260 nm x Umrechnungsfaktor x Verdünnungsfaktor
Der Umrechungsfaktor für RNA beträgt 40, für dsDNA 50.
Zusätzlich wurde die Absorption bei 280 nm gemessen. Hier liegt das
Absorptionsmaximum für Proteine. Bildet man den Quotienten aus der Absorption bei
260 und 280 nm so erhält man ein Maß für den Reinheitsgrad der Probe. Dieser Wert
sollte für RNA etwa 2,0 und für DNA ungefähr 1,8 betragen. Bei einer Kontamination
der Probe mit Proteinen sinkt der Quotient deutlich ab.
Über die Integrität der RNA bzw. der DNA macht die Konzentrationsbestimmung keine
Aussage, da für die Absorption die einzelnen Nukleotide verantwortlich sind. Um
jedoch eine Aussage zur Integrität der RNA machen zu können ist es notwendig, eine
Elektrophorese durchzuführen. Wie bei einer DNA-Elektrophorese werden die
Moleküle abhängig von ihrem Molekulargewicht getrennt.
Für die Auftrennung der RNA wurde ein Formamidgel benutzt. Durch die
denaturierende Wirkung von Formaldehyd ist eine exakte Analyse der RNA möglich,
2. Material und Methoden 23
da hier die Wasserstoffbindungen, die zur Ausbildung von Sekundärstrukturen und
Aggregaten in der RNA und damit zu unterschiedlichem Laufverhalten während der
Elektrophorese führen, denaturiert werden.
Da die zytoplasmatische RNA zu 95 % aus ribosomaler RNA (rRNA) besteht, erhält
man bei der Untersuchung eukaryontischer RNA in einem Gel zwei Banden. Für RNA
eukaryontischer Zellen entstehen diese Banden durch die 28S- und die 18S-rRNA-
Moleküle. Für menschliche rRNA wurden für die 28S-rRNA Werte von 5,1 kb und für
die 18S-rRNA 1,9 kb ermittelt.
2.2.2 Umschreiben der RNA in cDNA
Da eine Amplifizierung einer bestimmten Sequenz nur auf Basis der DNA möglich ist,
musste für den weiteren Versuch eine zu der gewonnenen RNA komplementäre DNA
(cDNA) hergestellt werden. Diese Reaktion wird als Reverse Transkription (RT)
bezeichnet. Ein spezifischer oligo(dt)-Primer lagert sich zunächst am Poly-A-Schwanz
der messenger-RNA (mRNA) an. Von hier aus synthetisiert die Reverse Transkriptase
zunächst einen cDNA-Einzelstrang, der anschließend zu einem Doppelstrang ergänzt
wird. Die Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die aus
dem Avian Myeloblastosis Virus von Vögeln (AMV-Reverse Transkriptase) oder aus
dem Moloney-Mäuseleukämievirus (M-MLV-Reverse Transkriptase) gewonnen werden
kann.
Für die Reverse Transkription wurde die zuvor isolierte RNA auf 100 ng/µl verdünnt. In
die Reaktion wurden 200 ng RNA in einen 15 µl großen Ansatz eingesetzt. Die übrigen
Reaktionskomponenten des Ansatzes waren: 1x RT-Puffer, 1 µM oligo(dt)-15-Primer,
1 mM dNTPs, 9,75 Units RNasin, 6,5 µl Aqua dest. sowie 7,5 Units AMV-Reverse
Transkriptase.
Für die einzelnen Schritte der cDNA-Synthese sind unterschiedliche Temperaturen
erforderlich. Bei einem 10-minütigem Schritt bei 23 °C lagert sich zunächst der
oligo(dt)15-Primer an den Poly-A-Schwanz der mRNA an. Im nachfolgenden Schritt
2. Material und Methoden 24
über eine Stunde bei 42 °C findet die Reverse Transkription statt. Eine 5-minütige
Denaturierung des Enzyms bei 95 °C schließt die Reaktion ab.
Die gewonnene cDNA wurde bei –20 °C gelagert.
2.2.3 Vervielfältigung von cDNA-Fragmenten
Da es nicht möglich ist, die durch die RT-Reaktion gewonnen cDNA-Fragmente auf
einem Gel zu identifizieren und zu quantifizieren, müssen die gewünschten Fragmente
zunächst noch vervielfältigt werden. Dies geschieht mit der von MULLIS und
Mitarbeitern (1983) etablierten Methode zur gezielten in vitro Amplifikation von
Abschnitten definierter Länge und Sequenz der DNA bzw. der cDNA, der
Polymerasekettenreaktion (PCR) bzw. der RT-PCR (65).
Für eine PCR werden zwei synthetisch hergestellte Oligonukleotid-Primer, die den zu
amplifizierenden Teil eingrenzen, benötigt (For-Primer und Rev-Primer). Eine DNA-
Polymerase kann mit Hilfe dieser Primer nun die gewünschte DNA amplifizieren. Die
einzelnen Schritte der PCR finden bei unterschiedlichen Temperaturen statt. Die
dreistufige Reaktionsfolge wird zyklisch wiederholt.
Im ersten Schritt wird die Doppelstrang-DNA denaturiert, die DNA liegt danach also als
Einzelstrang vor. Dieser erste Reaktionsschritt benötigt 90-95 °C. Im nächsten Schritt
lagern sich die Primer an den Einzelstrang an (Annealing). Die Bedingungen für die
Primeranlagerung sind abhängig von der Länge und Zusammensetzung der Primer.
Nach erfolgreichem Annealing der Primer findet nun die eigentliche Synthese der DNA
statt. Die Strangverlängerung (Elongation) durch Anlagerung der Einzelnukleotide
(Desoxynukleotidtriphosophat = dNTP`s) am freien 3`-OH-Ende wird bei einem
Reaktionsoptimum von 72 °C von der DNA-Polymerase katalysiert. Meistens wird als
DNA-Polymerase die Taq-Polymerase, die aus dem thermophilen Bakterium Thermus
aquaticus gewonnen wird, verwendet. Eine wichtige Anforderung an die Taq-
Polymerase ist eine Thermostabilität während des Denaturierungsschrittes. Nach der
2. Material und Methoden 25
Elongation erfolgt wieder eine Temperaturerhöhung auf 95 °C, die DNA denaturiert
erneut. Der beschriebene Zyklus beginnt von vorne.
Die bei der PCR eingesetzten Primer sind zuvor von BORDOW und Mitarbeitern
(1994) beschrieben worden (66). Die Primer für P-gp waren:
For-Primer 5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’
Rev-Primer 5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’
Ein mit diesen Primern amplifiziertes PCR-Fragment umfasst 157 bp der P-gp-cDNA-
Sequenz. (Bindungsstellen und Sequenz siehe Kapitel 7. Anhang)
Neben der Vervielfältigung eines Fragmentes der P-gp-cDNA-Sequenz wurde als
interne Kontrolle ein Fragment der cDNA für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-
Dehydrogenase (GAPDH) hergestellt (66). Die Primer für GAPDH waren:
For-Primer 5’-TTGGGAAGGTGAAGGTCGGA-3’
Rev-Primer 5’-GAAGGGGTCATTGATGGCAA-3’
Hier wurde ein 110 bp langes Fragment der GAPDH-cDNA-Sequenz vervielfältigt.
Um eine quantitative Aussage mit einer PCR machen zu können, muss berücksichtigt
werden, dass sich die Anzahl der PCR-Produkte mit jedem Zyklus verdoppelt. Limitiert
wird diese Verdopplung durch den Verbrauch der Reagenzien. Trägt man das PCR-
Produkt logarithmisch gegen die Anzahl der Zyklen auf, so erhält man eine sigmoidale
Kurve. Im flachen Bereich dieser Kurve (Plateau) kommt es trotz steigender Zyklenzahl
zu keiner Vermehrung der PCR-Produkte mehr. Um die Expressionsstärke messen zu
können muss eine Zyklenzahl gewählt werden, bei der es noch zu einer Vermehrung des
PCR-Produktes kommt. Die gewählte Zyklenzahl muss also im aufsteigenden Teil der
Kurve liegen. Aus diesem Grund wurden bei der PCR für das P-gp-Fragment 31 und für
das GAPDH-Fragment 28 Zyklen durchlaufen.
2. Material und Methoden 26
Tab. 2.1: Reaktionsansatz zur Vervielfältigung der entsprechenden P-gp- bzw. GAPDH-Fragmente mittels PCR
P-gp GAPDH
cDNA 1 µg 1 µg
dNTPs 0,08 mM 0,08 mM
Reaktionspuffer 1x 1x
MgCl2 2 mM 1,25 mM
For-Primer 50 pmol 50 pmol
Rev-Primer 50 pmol 50 pmol
Taq-Polymerase 1,25 Units 1,25 Units
Aqua dest. ad 50 µl ad 50 µl
Temperaturabfolge für P-gp:
95 °C 2 min Denaturierung
60 °C 1 min Annealing
72 °C 1 min Elongation
31 Zyklen 95 °C 30 sek Denaturierung
60 °C 1 min Annealing
72 °C 1 min Elongation
95 °C 1 min Denaturierung
60 °C 1 min Annealing
72 °C 5 min Elongation
4 °C bis zur Probenentnahme
2. Material und Methoden 27
Temperaturabfolge für GAPDH:
95 °C 2 min Denaturierung
65 °C 1 min Annealing
72 °C 1 min Elongation
28 Zyklen 95 °C 30 sek Denaturierung
65 °C 1 min Annealing
72 °C 1 min Elongation
95 °C 1 min Denaturierung
65 °C 1 min Annealing
72 °C 5 min Elongation
4 °C bis zur Probenentnahme
Das entstandene PCR-Produkte wurde bei 4°C gelagert. Zur Auswertung wurde eine
Gelelektrophorese angefertigt.
2.2.4 Gelelektrophorese der PCR-Produkte
Zur Identifizierung von amplifizierten DNA-Fragmenten nutzt man die Eigenschaften
der Elektrophorese aus. Hier ist die Größe und Ladung eines Fragmentes entscheidend
für die Wandergeschwindigkeit. Durch die angelegte Spannung wandert die negativ
geladene DNA zur positiv geladenen Anode, jedoch können kleinere Fragmente
schneller durch das Trägermaterial gelangen als große. Die Wandergeschwindigkeit
hängt aber nicht nur von der Größe und Form des Fragmentes, sondern auch von der
Porengröße des zu durchwandernden Trägermaterials, des gewählten Laufpuffers und
der Anwesenheit interkalierender Farbstoffe ab.
Agarose ist das wichtigste Trägermaterial zur Elektrophorese von Nukleinsäuren.
Agarose ist ein Polymer aus verschieden verknüpften Galaktoseeinheiten.
Abhängig von der Konzentration der Agarose lassen sich bei niedrigen Konzentrationen
große Fragmente und bei hohen Konzentrationen kleine Fragmente am besten
2. Material und Methoden 28
auftrennen. Da P-gp 157 bp und GAPDH 110 bp zählt, wurde zur Auftrennung ein
höher konzentriertes (3%iges) Agarosegel gewählt. Als Laufpuffer stehen Tris-Acetat-
(TAE)- oder Tris-Borat-(TBE)-Puffer zur Verfügung. In den Versuchen wurde TBE-
Puffer verwendet.
Die Bestimmung der Länge der zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle erfolgt durch
einen Vergleich mit einem geeigneten Längenstandard, der DNA-Fragmente definierter
Länge enthält.
Durch die Interkalation von Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-
phenylphenanthridiumbromid) in die DNA kommt es zu einer Fluoreszenzverstärkung
des Ethidiumbromids, wodurch eine optische Auswertung durch ultraviolettes Licht
möglich ist. Ethidiumbromid wird dem Gel und dem Laufpuffer in einem Anteil von
0,01 % zugesetzt. Licht bei einer Wellenlänge von 254-366 nm (ultraviolettes Licht)
führt in der interkalierten DNA zur Emission von Licht einer längeren Wellenlänge
(590 nm). Dieses wird mit einer Kamera aufgenommen und durch verschiedene
Farbabstufungen wiedergegeben.
Zur praktischen Herstellung wird Agarose in 1xTBE-Puffer durch mehrmaliges
Erhitzen gelöst, mit der entsprechenden Menge Ethidiumbromid versetzt und auf einen
Gelträger aufgebracht.
Die Proben wurden mit 1/10 Volumen Saccharose-Auftragspuffer versetzt und in die
Taschen aufgetragen. Saccharose erhöht die Dichte der DNA und verhindert so ein
Herausdiffundieren aus der Tasche in den Laufpuffer. Dem Auftragspuffer noch
zugesetztes Bromphenolbau läuft während der Elektrophorese mit der DNA zur Anode
und markiert so die bisher zurückgelegte Laufstrecke.
Die angelegte Spannung betrug zwischen 100 und 120 V über einen Zeitraum von 1 ½
bis 2 h.
Ein weiteres Trägermaterial, das für eine Elektrophorese zur Verfügung steht, ist das
Acrylamid. Polyacrylamidgele sind chemisch inert und sehr stabil. Durch
Copolymerisation von Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer wie z. B.
Ammoniumpersulfat (APS) entsteht ein klares und stabiles Gel mit guter Auftrennung.
Die Polymerisation erfolgt unter Luftabschluss, da es durch Sauerstoff zu einem
2. Material und Methoden 29
Kettenabbruch kommen würde. Deshalb werden diese Gele als Horizontalgele zwischen
zwei Glasplatten gegossen. Die anschließende Elektrophorese wurde 4 bis 5 h bei 160 V
durchgeführt. Nachteile dieses Verfahrens sind die kompliziertere Handhabung im
Gegensatz zu den Agarosege len und die Dermato- und Neurotoxizität des Acrylamids
vor der Polymerisation. Entscheidender Vorteil ist jedoch das höhere
Auflösungsvermögen.
Als Laufpuffer wird wie bei Agarosegelen der TBE-Puffer verwendet.
Um das Ergebnis sichtbar machen zu können, muss das Gel anschließend noch gefärbt
werden. Hierzu stehen neben Ethidiumbromid auch neuere weniger mutagene
Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung. Verwendet wurde hier der Farbstoff Vistra Green,
der durch Licht der Wellenlänge von 497 nm optimal angeregt wird, und ein
Emissionsmaximum von 520 nm hat. Der Farbstoff besitzt zusätzlich ein weiteres
Absorptionsmaximum bei 254 nm.
Detektiert wurden die Ergebnisse mit dem Fluoreszenzimager (Storm 840).
2.2.5 Immunhistochemische Darstellung von P-Glykoprotein
In Vorbereitung auf die Immunhistochemie wurde ein ca. 3 x 3 mm großes
Gewebestück zunächst 24 Stunden in 4%igem Formalin fixiert und anschließend in
Paraffin eingebettet. Von diesen Paraffinblöcken wurden mit Hilfe des Ventana NexEs
IHC Staining Systems Paraffinschnitte von 2 µm Dicke hergestellt.
Die technischen Arbeiten im Zusammenhang mit der Immunhistochemie wurden von
den Mitarbeitern des Institutes für Pathologie durchgeführt.
Die Immunhistochemie ist eine Methode zur Lokalisation von Proteinen und anderen
Substanzen im Gewebe.
Die Reaktion wurde am fixierten Gewebeschnitt mit der APAAP-Methode (Alkaline
Phosphatase anti-alkaline Phospathase-Methode) durchgeführt (67). Diese Methode
wurde bereits 1984 von der Arbeitsgruppe von CORDELL und Mitarbeitern
beschrieben. Benutzt wurde der monoklonale Maus-Antikörper Anti-P-Glykoprotein-
2. Material und Methoden 30
Antikörper JSB-1 in einer Konzentration von 1:20. JSB-1 ist ein Antikörper der
Subklasse IgG1. Die Epitope, gegen die sich JSB-1 richtet, sind zytoplasmatische
Epitope von P-gp (68). Als Zweitantikörper wurde der Anti-Maus-Antikörper aus dem
ABC Detection Kit in einer Verdünnung von 1:100 eingesetzt. Als Positivkontrolle
wurde humanes Nierengewebe verwendet.
2.2.6 Statistische Auswertung der Ergebnisse
Die mittels Fluoreszenzimager (Storm 840) registrierten Ergebnisse der RT-PCR
wurden mit den Programmen Image Quant, Excel und Prism ausgewertet. Es wurde
zunächst das Verhältnis der ermittelten Volumina von P-gp zu GAPDH gebildet und
anschließend der Mittelwert aus den errechneten Verhältnissen gebildet.
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem ungepaarten t-Test (einseitig).
Die mikroskopische Auswertung der Immunhistochemie erfolgte bei einer 200-fachen
Vergrößerung. Sie umfasste eine getrennte Betrachtung der Arteriolen und der
Kapillaren. Die Intensität der Anfärbung wurde in drei Kategorien eingeteilt: nicht
gefärbt (-), schwache Färbung (+) und starke Färbung (++). Die Auswertung der Proben
erfolgte in Unkenntnis der Krankheitsentität.
Es wurde die Anzahl ausgezählter Kapillaren bzw. Arteriolen einer Expressionsstärke in
Relation zu allen ausgezählten Kapillaren bzw. Arteriolen des gesamten Schnittes
gesetzt und so der prozentuale Anteil ermittelt.
3. Ergebnisse 31
3. Ergebnisse
Insgesamt standen 15 Gewebeproben aus menschlichem Herzmuskelgewebe zur
Verfügung. Je 5 Proben waren von Gesunden (NF), Patienten mit einer dilatativen
Kardiomyopathie (DCM) und von Patienten mit einer ischämischen Kardiomyopathie
(ICM). Die Proben wurden mit N1-5 für gesund, D1-5 für dilatative Kardiomyopathie
und I1-5 für ischämische Kardiomyopathie bezeichnet.
3.1 Isolation von RNA aus Herzgewebe
Unabdingbare Voraussetzung für die Untersuchung der P-gp-mRNA-Expression ist die
Präparation ausreichender Mengen intakter RNA aus dem Herzgewebe. Um die
Integrität der isolierten RNA zu überprüfen wurde ein denaturierendes Formamidgel
angefertigt. Das Gel zeigt die für eukaryonte Zellen charakteristischen beiden Banden
der 18S und 28S ribosomalen RNA.
Abb. 3.1: Denaturierendes Formamidgel zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA am Beispiel der Proben I1 und I2.
← 28 S
← 18 S
3. Ergebnisse 32
3.2 Ergebnisse der RT-PCR
Aus humanem Herzmuskelgewebe isolierte RNA wurde durch Reverse Transkription in
komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben und anschließend ein für MDR1
spezifisches cDNA-Fragment (157 bp) mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
amplifiziert (66).
Als interne Kontrolle wurde ein 110 bp langes cDNA-Fragment der Glycerinaldehyd-3-
phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) benutzt (66).
Nach Auftrennung des Reaktionsansatzes mittels Elektrophorese in einem 3%igen
Agarosegel zeigen sich die beiden amplifizierten PCR-Produkte im theoretisch
errechneten Bereich von 110 bp für GAPDH und 157 bp für P-gp.
Abb. 3.2: 3%iges Agarose-Gel mit Darstellung des 110 bp großen Fragmentes für GAPDH und des 157 bp großen P-gp-Fragmentes am Beispiel der Probe I5. In Bahn 1 ist der ein Marker (100 bp) aufgetragen, Bahn 2 ist die Negativkontrolle und Bahn 3 die Positivkontrolle (Plazenta-cDNA), Bahn 4 ist frei, Bahn 5 und 6 zeigen die Probe I5.
110 bp 157 bp
100 bp
200 bp
Kontrollen - / +
}
Probe I5
}
1 2 3 4 5 6
3. Ergebnisse 33
Zur besseren Beurteilung und quantitativen Auswertung wurde der gleiche
Reaktionsansatz durch eine Elektrophorese mit einem 8%igem Polyacrylamidgel
aufgetrennt.
Abb. 3.3: Im Polyamid-Gel aufgetrennte Proben. Bahn 1 zeigt den Marker, Bahn 2-6 enthält die Proben D1-D5, Bahn 7-11 die Proben N1-N5 und Bahn 12-16 zeigt I1-I5. Die Positiv- (Plazenta) und Negativkontrolle ist in Bahn 17 und 18 zu sehen.
Zur Minimierung von zufälligen Fehlern wurde für jede Probe eine Zwei- oder
Dreifachbestimmung angefertigt. Tabelle 3.1 zeigt die Einzelwerte, die Mittelwerte und
die Standardabweichung der gewonnenen Ergebnisse.
Die Werte zeigen, dass alle Gewebeproben P-gp enthalten, die interindividuellen
Unterschiede aber sehr stark ausgeprägt sind. Die Werte reichen von einem Verhältnis
P-gp zu GAPDH von 0,029 (D3) bis zu 0,514 (N2).
Der Vergleich der Daten untereinander ergibt: Patienten mit einer dilatativen
Kardiomyopathie haben im Mittel eine deutlich verminderte Expression des
Transportproteins P-gp im Vergleich mit gesunden oder an einer ischämischen
Kardiomyopathie erkrankten Personen. Diese Verringerung der P-gp-Expression hat
sich in beiden Fällen als statistisch signifikant (p < 0,05) erwiesen.
Vergleicht man die Gruppe der ischämischen Kardiomyopathien mit den Werten der
gesunden Personen, so zeigen diese beiden Gruppen nur sehr geringe Unterschiede in
der durchschnittlichen P-gp-Expression.
100 bp
200 bp P-gp
GAPDH
D1-D5 N1-N5 I1-I4 Kontrolle
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
3. Ergebnisse 34
Tab. 3.1: Aufstellung über die mit der RT-PCR gewonnen Ergebnisse. Gezeigt werden die Einzelwerte, die Mittelwerte und die Standardabweichung aus dem Verhältnis P-gp zu GAPDH.
Probe
rel. P-gp-
Expression
(P-gp/GAPDH)
Mittelwe rt
(P-gp/GAPDH) Standardabweichung
DCM
0,141
± 0,082
D1 0,184
D2 0,117
D3 0,029
D4 0,248
D5 0,125
NF 0,339 ± 0,168
N1 0,221
N2 0,514
N3 0,5
N4 0,328
N5 0,133
ICM 0,326 ± 0,111
I1 0,370
I2 0,230
I3 0,270
I4 0,5
I5 0,260
3. Ergebnisse 35
P-gp - Expression im Herzen
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
DCM NF ICM
rela
tive
P-g
p-E
xpre
ssio
n be
zoge
n au
f G
AP
DH
Abb. 3.4: Vergleich der einzelnen Patientengruppen untereinander. Der relative Gehalt an mRNA wurde aus den Mittelwerten der einzelnen Patienten errechnet. (Mittelwert ± Standardabweichung, * p < 0,05)
*
*
3. Ergebnisse 36
3.3 Ergebnisse der Immunhistochemie
Die in Formalin fixierten Gewebestücke wurden im Institut für Pathologie in Paraffin
eingebettet, 2 µm dicke Schnitte hergestellt und maschinell immunhistochemisch mit
dem monoklonalen Antikörper JSB 1 gegen P-gp gefärbt.
Zur Beurteilung der Stärke der Anfärbung wurden drei Qualitäten unterschieden. Diese
Qualitäten sind keine Anfärbung (-), schwache Anfärbung (+) und starke Anfärbung
(++). Jedes Gefäß eines Präparates wurden einer dieser Qualitäten zugeordnet. Die
Stärke der Anfärbung entspricht dem Grad der Proteinexpression.
Abb. 3.5: Mit dem monoklonalen Antikörper JSB-1 gegen P-gp immunhistochemisch gefärbter Paraffinschnitt. Zu sehen ist eine starke P-gp-Expression (++) entlang des Endothels eines Gefäßes.
3. Ergebnisse 37
Abb. 3.6: Mit dem Antikörper JSB-1 immunhistochemisch gefärbter Paraffinschnitt. Zu sehen ist eine P-gp-Expression mittlerer Stärke (+) im Endothel der mit dem Pfeil markierten Kapillare.
Abb. 3.7: Mit dem Antikörper JSB-1 immunhistochemisch gefärbter Paraffinschnitt. In dem mit einen Pfeil markierten Gefäß ist keine P-gp-Expression (-) erkennbar.
Das Diagramm (Abb. 2.5) und die Tabelle (Tab. 3.2) zeigen die Verteilung der drei
Qualitäten innerhalb der Gruppe der Kapillaren. Die Verteilung in den Präparaten der
3. Ergebnisse 38
Gesunden und der Personen mit einer ischämischen Kardiomyopathie sind nahezu
gleich. Es finden sich ca. 36-37 % nicht anfärbte Kapillaren, etwa 60 % schwach
angefärbte und um die 1-5 % stark anfärbte. Dagegen sind in der Gruppe der dilatativen
Kardiomyopathien 86 % der Kapillaren nicht angefärbt, nur 14 % weisen eine schwache
Anfärbung auf.
Tab. 3.2: Auswertung der Immunhistochemie für die Kapillargefäße. Die einzelnen Patientengruppen sind zusammengefasst und die Anzahl der Zuordnungen in jede Expressiongruppe ist in absoluten Zahlen und in Prozent angegeben.
Proben ausgewertete
Kapillargefäße absolut in Prozent
DCM
134
D - 115 86 %
D + 19 14 %
D ++ 0 0 %
NF 137
N - 49 36 %
N + 81 59 %
N ++ 7 5 %
ICM 148
I - 55 37 %
I + 92 62 %
I ++ 1 1 %
3. Ergebnisse 39
P-gp-Expression in Kapillaren
0
20
40
60
80
100
120
DCM NF ICM
P-gp
-Exp
ress
ion
in %
keine Expression
geringe Expression
starke Expression
Abb. 3.8: Säulendiagramm zur P-gp-Expression in den unterschiedlichen Patientengruppen. Betrachtet werden nur die Kapillargefäße.
P-gp-Expression in Arteriolen
0
20
40
60
80
100
120
DCM NF ICM
P-gp
-Exp
ress
ion
in %
keine Expressiongeringe Expressionstarke Expression
Abb. 3.9: Säulendiagramm zur P-gp-Expression in den unterschiedlichen Patientengruppen. Betrachtet werden nur die Arteriolen.
3. Ergebnisse 40
In der Gruppe der Arteriolen zeigen die Präparate der Gesunden und der Personen mit
ischämischen Kardiomyopathie keine so ausgeprägten Gemeinsamkeiten wie in der
Gruppe der Kapillaren. Etwa die Hälfte der Arteriolen lässt sich schwach anfärben,
21 % sind nicht angefärbt und 11 % sind stark angefärbt. Die Arteriolen der Patienten
mit einer ischämischen Kardiomyopathie dagegen weisen zum größten Teil (92 %) eine
schwache Expression auf, 8 % sind nicht anfärbbar. Präparate von Patienten mit einer
dilatativen Kardiomyopatie zeigen zu 79 % keine Anfärbung, nur in 21 % der Fälle lag
eine schwach Expression vor (Abb. 3.9 und Tab.3.3).
Tab. 3.3: Auswertung der Immunhistochemie für die Arteriolen. Die einzelnen Patientengruppen sind zusammengefasst und die Anzahl der Zuordnungen in jede Expressionsgruppe ist in absoluten Zahlen und in Prozent angegeben.
Proben ausgewertete
Arteriolen absolut in Prozent
DCM
28
D - 22 79 %
D + 6 21 %
D ++ 0 0 %
NF 48
N - 10 21 %
N + 26 54 %
N ++ 12 25 %
ICM 39
I - 3 8 %
I + 36 92 %
I ++ 0 0 %
3. Ergebnisse 41
Betrachtet man Arteriolen und Kapillaren zusammen, so zeigt sich, dass in den
Gewebeproben der Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie nur eine sehr
geringe Expression gefunden wird. 85 % der Gefäße weisen keine P-gp-Expression auf.
Dagegen wird in Herzproben von Gesunden und in denen der Patienten mit einer
ischämischen Kardiomyopathie in mehr als der Hälfte der Gefäße eine zumindest
schwache Expression gefunden. Gesunde zeigen in 10 % sogar eine starke Expression
(Abb. 3.10 und Tab. 3.3).
Tab. 3.3: Auswertung der Immunhistochemie für die Arteriolen und Kapillare. Auch hier sind die einzelnen Patientengruppen zusammengefasst und die Anzahl der Zuordnungen in jede Expressionsgruppe ist in absoluten Zahlen und in Prozent angegeben.
Proben ausgewertete Arteriolen
und Kapillaren absolut in Prozent
DCM
162
D - 137 85 %
D + 25 15 %
D ++ 0 0 %
NF 185
N - 59 32 %
N + 107 58 %
N ++ 19 10 %
ICM 187
I - 58 31 %
I + 128 68 %
I ++ 1 1 %
3. Ergebnisse 42
P-gp-Expression in Arteriolen und Kapillaren
0
20
40
60
80
100
120
DCM NF ICM
P-gp
-Exp
ress
ion
in %
keine Expressiongeringe Expression starke Expression
Abb. 3.10: Säulendiagramm zur P-gp-Expression in den unterschiedlichen Patientengruppen. Dargestellt sind Arteriolen und Kapillare zusammen.
In der vorliegenden Arbeit konnte die Expression von P-Glykoprotein in humanem
Herzmuskelgewebe gezeigt werden. Die Expression des MDR1-Genproduktes konnte
sowohl auf mRNA-Ebene mittels RT-PCR als auch auf Proteinebene mit der
Immunhistochemie gezeigt werden. Mittels Immunhistochemie ist P-Glykoprotein in
den Endothelzellen des Herzmuskelgewebes lokalisiert worden. Hinsichtlich der
Expression bei unterschiedlichen Krankheitsformen konnte eine signifikante
Verminderung (p = 0,05) bei Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie
verglichen mit gesunden Patienten beobachtet werden.
4. Diskussion 43
4. Diskussion
Abb. 4.1: Anatomische Zeichnung des menschlichen Herzens mit makroskopischer und mikroskopischer Ausschnittsvergrößerung (69, 70). Das histologische Bild zeigt quer angeschnittene Herzmuskelbündel, dazwischen liegt eine Kapillare.
Diese Arbeit beschreibt die Expression und Lokalisation des MDR1-Genproduktes P-
Glykoprotein in humanem Herzgewebe. Sowohl die mRNA als auch das Protein konnte
in allen 15 Herzproben detektiert werden. Die immunhistochemische Aufarbeitung der
Proben hat eine Lokalisation des P-Glykoproteins in den Arteriolen und Kapillaren
nicht aber in den Venen ergeben.
Zum Nachweis von P-Glykoprotein sind bisher sowohl Verfahren auf RNA-Ebene, als
auch Methoden zum direkten Nachweis des Proteins bekannt (14, 18, 66, 71). Die In-
4. Diskussion 44
situ-Hybridis ierung und die RT-PCR weisen die entsprechende mRNA nach, wobei die
In-situ-Hybridisierung die mRNA lokalisieren kann, aber mit der RT-PCR quantitative
Aussagen besser zu treffen sind. Mit Antikörpern, die gegen das gesuchte Protein
gerichtet sind, arbeiten Immunhistochemie und Western Blot. Quantitative Aussagen
können mit dem Western Blot gemacht werden, allerdings ist diese Methode weniger
sensitiv als die RT-PCR. Die Immunhistochemie lokalisiert das Protein im
Gewebeschnitt, quantitative Aussagen sind mit dieser Methode, wie auch mit der In-
situ-Hybridisierung, schwerer zu treffen.
Für diese Arbeit wurde ein Verfahren auf RNA-Ebene, die semiquantitative RT-PCR,
und ein Verfahren auf Protein-Ebene, die Immunhistochemie, gewählt.
Nachdem P-Glykoprotein in Herzmuskelgewebe von Ratten mittels RT-PCR gefunden
wurde (72), konnte die vorliegende Arbeit das Vorhandensein von P-gp-mRNA
erstmals mittels RT-PCR in humanem Herzgewebe zeigen. Die semiquantitative RT-
PCR wurde auf Basis der Experimente der Arbeitsgruppe von BORDOW und
Mitarbeitern (1994) durchgeführt (66). Es konnte gezeigt werden, dass alle Proben das
Transportprotein P-Glykoprotein enthalten. Die interindividuellen Unterschiede sind
aber groß.
Die Methode der Immunhistochemie an humanem Herzmuskelgewebe ist bereits von
THIEBAUT und Mitarbeitern (1989) und von CORDON-CARDO und Mitarbeitern
(1990) beschrieben worden (18, 73). CORDON-CARDO und Mitarbeiter (1990) und
THIEBAUT und Mitarbeiter (1989) haben eine Expression in den Kardiomyozyten und
nicht in den Gefäßen beschrieben (18, 73). Bei Untersuchungen von CORDON-
CARDO und Mitarbeitern (1990) wurde der Antikörper C 219 eingesetzt (18). Die
glatte Muskulatur zeigte keine Färbung, der Skelettmuskel zeigte eine heterogene
Expression bei der Darstellung mit C 219. Auch THIEBAUT und Mitarbeiter (1989)
konnten dieses Ergebnis nachvollziehen und eine Expression im myokardialen Gewebe
und im Skelettmuskelgewebe registrieren (73). Im weiteren Verlauf ihrer
Untersuchungen hat sich aber herausgestellt, dass dieses Ergebnis auf einer
Kreuzreaktion zwischen dem Antikörper C219 und den schweren Ketten des Myosins
4. Diskussion 45
beruht. Mit den Antikörpern HYB-241 und HYB-612 kamen weder das Myokard noch
die Gefäße zur Darstellung (18).
Der monoklonale Antikörper JSB 1 ist zuvor erfolgreich bei der immunhistochemischen
Darstellung von P-Glykoprotein zum Beispiel in Kapillaren des Gehirns (74), im
Endometrium und weiblichen Genitaltrakt (75, 76) und im hämatopoetischen System
(77) verwandt worden. Jedoch konnten RAO und Mitarbeiter (1995) neben der
Darstellung von P-Glykoprotein auch Kreuzreaktionen von JSB 1 zu anderen Strukturen
feststellen (78). Diese Strukturen konnten als mitochondrale Pyruvat-Carboxylase in
Ratten- und Rinderlebern identifiziert werden. Auch in humanem Gewebe konnten
Kreuzreaktionen in Skelettmuskelgewebe, einem Gewebe, das keine P-gp-Expression
aufweist, gezeigt werden.
Die Immunhistochemie wurde an 2 µm dicken Paraffinschnitten mit der APAAP-
Methode durchgeführt (67). P-Glykoprotein konnte eindeutig in den Endothelien der
Arteriolen und Kapillaren der Präparate lokalisiert werden. Die Venen wiesen keine
Expression auf. In den Kardiomyozyten selbst konnte keine Expression nachgewiesen
werden. Eine Kreuzreaktion, die zu einer falsch positiven Lokalisation führt, kommt
deshalb unserer Meinung nach nicht in Betracht.
In vielen Arbeiten konnte P-Glykoprotein nicht nur in Tumorgewebe, sondern auch in
gesundem Gewebe nachgewiesen werden. So wurde P-Glykoprotein bisher in
stoffwechsel- und ausscheidungsaktiven Organen wie der Leber, Niere und Darm
nachgewiesen (14, 18). Auch der Nachweis in der Blut-Hirn-Schranke und im Hoden
(Blut-Hoden-Schranke) gelang (18, 79). Gestützt auf diese Ergebnisse wurde P-
Glykoprotein eine Schutzfunktion zugeschrieben (13, 18). Wie unsere Untersuchungen
gezeigt haben, wird auch im Herzen P-Glykoprotein im Endothel der Arteriolen und
Kapillaren exprimiert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Schutzfunktion hin, wie sie auch
für den Hoden und das Gehirn angenommen wird (13). Es könnte so verhindert werden,
dass Substrate, die das Myokard schädigen könnten, aus dem Blut durch das Endothel
zu den Kardiomyozyten gelangen.
Im Vergleich hat sich ein signifikanter Unterschied der P-Glykoprotein-Expression bei
Patienten mit einer dilatativen Kardiomyopathie und Gesunden herausgestellt. Gesunde
4. Diskussion 46
und Proben von Patienten mit einer ischämischen Kardiomyopathie zeigen keine
Unterschiede. Die gezeigte Signifikanz der unterschiedlichen Expression ist sehr
kritisch zu sehen, da diesen Resultaten nur eine sehr gering Probenanzahl je
Erkrankungsgruppe (n = 5) zugrunde liegt. Um eine wirkliche Signifikanz feststellen zu
können, sind größere Untersuchungen notwendig. Der Einfluss von Krankheiten auf die
Expression von P-gp an menschlichen Herzen ist bisher noch nicht Gegenstand großer
Untersuchungen gewesen.
Auch bei anderen Erkrankungen haben sich Unterschiede in der Expression von P-
Glykoprotein gezeigt. So konnten YACYSHYN und Mitarbeiter (1999) eine
Verminderung von P-Glykoprotein in Darmlymphozyten bei Patienten mit einer Colitis
ulcerosa gegenüber Patienten mit einem Morbus Crohn und Gesunden zeigen (80).
Neben den Unterschieden zwischen den einzelnen Patientengruppen haben die
Untersuchungen große interindividuelle Schwankungen in der Höhe der Expression
ergeben. Dieses Ergebnis könnte zum Beispiel Resultat genetischer Varianz sein.
HOFFMEYER und Mitarbeiter (2000) und CASCORBI und Mitarbeiter (2001)
beschreiben mehrere Mutationen im MDR1-Gen, von denen einige auch mit einer
veränderten Funktion einhergehen (81, 82). Dies wäre auch mit einer individuell
unterschiedlichen Kardiotoxizität bei einer Therapie mit Anthrazyklinen vereinbar. Zum
anderen sind auch Umwelteinflüsse bekannt, die zu einer Modulation der
P-Glykoprotein-Expression führen können. Ein Beispiel für eine solche Modulation ist
die Einnahme von Rifampicin, das die Expression von P-Glykoprotein zumindest im
Darm erhöhen kann (39, 40). GREINER und Mitarbeiter (1999) konnten an acht
gesunden Probanden eine signifikante Verminderung des Digoxinserumspiegel bei der
gleichzeitigen Einnahme von Rifampicin beobachten (40). Diese Verminderung der
Digoxinserumspiegel korrelierte mit einem Anstieg der P-gp-Expression im Duodenum
der Probanden. Eine vermehrte Ausscheidung über die Niere, welche ja auch durch die
Induktion von P-gp denkbar wäre, konnte nicht bestätigt werden (40). WESTPHAL und
Mitarbeiter haben bei einer ähnlich konzipierten Studie mit Rifampicin und Talinolol
zeigen können, dass es auch bei intravenöser Zufuhr von Talinolol zu einer Sekretion
4. Diskussion 47
ins Darmlumen kommt. Diese Verminderung der Talinololspiegel korrelierte auch hier
wieder mit dem Anstieg der P-gp-Expression im Duodenum der Probanden (39).
Aber nicht nur eine Induktion durch MDR1-Modulatoren, sondern auch eine Blockade
ist als Medikamenteninteraktion relevant. Klinisch relevante Interaktionen sind
zwischen dem Antiarrhythmikum Chinidin und dem Herzglykosid Digoxin beschrieben
(83). So führt die zusätzliche Gabe von Chinidin bei Digoxin-behandelten Patienten
regelmäßig zu erhöhten Digitalisserumspiegeln und den Symptomen einer
Digitalisvergiftung (84). Zunächst wurde für diese Feststellung eine vermehrte
Absorption im Darm (85), eine verminderte Ausscheidung über Niere und Galle
verantwortlich gemacht (86). Untersuchungen von FROMM und Mitarbeitern (1999)
konnten an Mäusen zeigen, dass es sich um eine Interaktion durch Chinidin als
P-Glykoprotein-Inhibitor und Digoxin als Substrat für P-Glykoprotein handelt (87).
Weitere Interaktionen zwischen MDR1-Modulatoren und Digoxin, die auf P-
Glykoprotein zurück geführt werden konnten, sind Interaktionen mit Verapamil (88,
89), Cyclosporin A (90), Propafenon (91) und Itraconazol (92).
Die kardiale Toxizität von Zytostatika, wie z. B. Anthrazyklinen, ist ein wichtiger
Faktor bei der Behandlung von Malignomen. Bei einer Gesamtdosis von mehr als
500 mg/m² Körperoberfläche kann sich eine Kardiomyopathie mit Herzversagen
entwickeln (93). VAN ASPEREN und Mitarbeiter (1999) konnten eine verstärkte
Akkumulation von Doxorubicin in Herzen von homozygoten mdr1a-/- Mäusen zeigen
(19). Den umgekehrten Fall zeigt eine mit Gentherapie an Mäusen durchgeführte
Studie. Eine hohe Expression von P-gp korreliert mit der Abwesenheit von
degenerativen Veränderungen nach der Applikation von Doxorubicin (94). Bei der
Therapie von resistent gewordenen Tumoren hat sich die Comedikation mit MDR1-
Inhibitoren in Tierversuchen als hilfreich erwiesen (95). MILLER und Mitarbeiter
konnten bei Patienten mit resistent gewordenen Tumoren, die P-Glykoprotein
exprimierten, durch die zusätzliche Gabe von Verapamil als MDR1-Inhibitor bei der
Chemotherapie Erfolge verzeichnen (37). Jedoch konnten CAYRE und Mitarbeiter
(1996) eine signifikant erhöhte Konzentration von Daunomyocin in Anwesenheit von
MDR1-Inhibitoren wie z. B. Verapamil, PSC 833 oder S 9788 in kardialen Zellen
4. Diskussion 48
beobachten (72). Diese Untersuchungen legen den Verdacht nahe, dass eine verminderte
Expression von P-Glykoprotein bzw. eine Modulation durch MDR1-Inhibitoren mit
einer erhöhten Gefährdung für das Myokard einhergehen (19, 72).
Da unsere Arbeit zeigen konnte, dass die Arteriolen und Kapillaren des Herzens P-
Glykoprotein exprimieren, sind auch am Herzen Interaktionen, wie sie in anderen
Organen durch P-Glykoprotein vorkommen, denkbar. Bedeutend ist dies vor allem
deswegen, weil viele Substrate des ABC-Transporters P-Glykoprotein potente
Wirkstoffe bei der Pharmakotherapie von Herzerkrankungen sind (23, 32). Auch
Substanzen wie das Anthrazyklin Doxorubicin, die das Herz massiv schädigen können,
sind Substrate von P-Glykoprotein. Durch Wechselwirkungen dieser Substanzen könnte
die lokale Konzentration im Herzen moduliert werden. Durch die Induktion von P-
Glykoprotein könnte z. B. die Konzentration am Wirkort Herz niedrig gehalten werden.
Eine mögliche Folge wäre eine nicht ausreichende Wirkung eines Medikamentes. Auf
der anderen Seite könnte eine Blockade von P-Glykoprotein die lokale Konzentration
im Herzen anheben. Daraus resultieren könnte eine verstärkte, sogar toxische Wirkung.
Besonders gefährlich kann dies in der Malignomtherapie mit Doxorubicin werden.
Durch die Gabe von MDR1-Inhibitoren wie PSC 833 oder Verapamil um eine P-
Glykoprotein-vermittelte Tumorresistenz rückgängig zu machen, könnte das Herz
großen Schaden nehmen. Die Blockade von P-Glykoprotein als Schutzmechanismus am
Herzen könnte zu einer massiven Erhöhung der lokalen Toxizität von Doxorubicin
führen. Es droht eine letale Herzinsuffizienz als Folge einer toxischen Kardiomyopathie.
Wie P-Glykoprotein wird auch Proteinen der MRP-Familie (Multidrug Resistance-
associated Protein) eine Rolle bei der Resistenzentwicklung und Detoxifikation von
Substanzen zugeschrieben (96). Diese Proteine sind genau wie P-gp ATP-abhängige
Transportproteine, die den Transport von Substanzen aus der Zelle katalysieren (96, 97).
FLENS und Mitarbeiter (1996) beschreiben bei einer immunhistochemischen
Darstellung von MRP1 eine Expression im Herzmuskelgewebe selbst (98). Die
Endothelien der Herzmuskelgefäße ließen sich nicht darstellen.
THUM und Mitarbeiter konnten in letzter Zeit mehrere Isoenzyme des Cytochrom P450
in humanem Herz nachweisen (99). Cytochrome sind wichtige Monooxygenasen bei der
4. Diskussion 49
Biotransformation von Arzneimitteln. Das für die Metabolisierung von β-Blockern sehr
wichtige Cytochrom 450 2D6 konnte ausschließlich im rechten Ventrikel detektiert
werden. Ob auch P-Glykoprotein eine solche regional unterschiedliche Verteilung
aufweist, konnten unsere Untersuchungen nicht klären, da alle zu unserer Verfügung
stehenden Herzgewebeproben aus dem linken Ventrikel stammten. Auch in
Kardiomyozytenkulturen von Ratten ließen sich viele Cytochrom P450-Isoenzyme
nachweisen (100).
In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die Expression von P-Glykoprotein mittels
RT-PCR an humanem Herzgewebe gezeigt werden. Zusätzlich wurde P-gp an allen
Proben immunhistochemisch dargestellt. Damit ist neben der genetischen Ebene auch
die tatsächliche Expression des Proteins bestätigt worden. Die Lokalisation von P-gp in
den Endothelien der Arteriolen und Kapillaren lässt, wie auch in Gehirn und Hoden,
eine Schutzfunktion vor toxischen Stoffen annehmen.
Da viele Pharmaka in der Herztherapie Substrate von P-Glykoprotein sind, bedeutet
dies für die Praxis, dass nicht nur aus dem Serumspiegel eine mögliche Voraussage über
die Wirkungsstärke und Effizienz einer Therapie gewonnen werden kann, sondern auch
Stoffwechsel und Transportleistungen auf Ebene des Zielorgans zu berücksichtigen
sind. Die individuell sehr stark unterschiedliche Expression von P-Glykoprotein liefert
möglicherweise einen Beitrag zum besseren Verständnis der individuellen Wirkung und
Effizienz einer Pharmakotherapie bei verschiedenen Menschen und auch bei
verschiedenen Erkrankungen. Durch eine auf den jeweiligen Patienten mit seinen
Besonderheiten in der Expression von Enzymen und auch Transportsystemen
angepasste Therapie könnte eine Pharmakotherapie langfristig erfolgreicher und
risikoärmer sein.
5. Zusammenfassung 50
5. Zusammenfassung
Bei der Aufnahme von Arzneimitteln in Zellen spielen Transportprozesse eine große
Rolle. Das ATP-abhängige Transportprotein P-Glykoprotein ist häufig in Resistenzen
gegenüber Arzneimitteln involviert. Zunächst wurde dieser Effekt in P-Glykoprotein-
überexprimierenden Tumoren entdeckt. Später sind auch viele gesunde Gewebe, die P-
gp enthalten, identifiziert worden. Einige dieser Substanzen, die von P-Glykoprotein
transportiert werden, sind vielverwendete Medikamente bei der Therapie von
Herzerkrankungen. Für das unterschiedliche Ansprechen von Patienten auf diese
Medikamente könnte die individuelle Expression von P-Glykoprotein im Herzen eine
entscheidende Rolle spielen.
Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde die Expression von P-Glykoprotein an
15 humanen Herzmuskelgewebeproben untersucht. Zum einen wurde hierzu die
Methode der RT-PCR gewählt. Mit ausgewählten Primern wurde ein entsprechendes
Stück der P-Glykoprotein-cDNA-Sequenz vervielfältigt und anschießend durch eine
Gelelektrophorese ausgewertet. Zum anderen wurde der Nachweis der P-Glykoprotein-
Expression auf Proteinebene mittels immunhistochemischer Darstellung erbracht. Für
diesen Versuch wurde der monoklonale Antikörper JSB1 verwendet.
Die Expression von P-Glykoprotein in humanem Herzmuskelgewebe konnte an allen
Proben gezeigt werden. Bei der Immunhistochemie ist P-Glykoprotein in den
Endothelzellen des Herzmuskelgewebes lokalisiert worden. Hinsichtlich der Expression
bei verschiedenen Krankheiten konnte bei Patienten mit einer dilatativen
Kardiomyopathie eine signifikante Verminderung (p = 0,05) beobachtet werden.
Die in dieser Dissertation erbrachten Ergebnisse zeigen eine Beteiligung des Herzens an
Stoffwechsel- und Transportprozessen. Die Arbeit könnte somit einen Beitrag zum
besseren Verständnis von Interaktionen und zur Aufklärung von individuell
unterschiedlichen Wirkungen bei der Pharmakotherapie leisten.
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7. Anhang 65
7. Anhang
In der nachfolgenden Abbildung ist die cDNA-Sequenz des humanen P-Glykoproteins
(P-gp) nach CHEN und Mitarbeitern (1996) sowie die Lage der für die RT-PCR
eingesetzten Primer (blau) dargestellt (7).
Abb. 7.1: cDNA-Sequenz des humanen P-Glykoproteins. Blau dargestellt die Primer, rot das während der PCR zwischen den Primern synthetisierte Stück.
1 cctactctat tcagatattc tccagattcc taaagattag agatcatttc tcattctcct
61 aggagtactc acttcaggaa gcaaccagat aaaagagagg tgcaacggaa gccagaacat
121 tcctcctgga aattcaacct gtttcgcagt ttctcgagga atcagcattc agtcaatccg
181 ggccgggagc agtcatctgt ggtgaggctg attggctggg caggaacagc gccggggcgt
241 gggctgagca cagcgcttcg ctctctttgc cacaggaagc ctgagctcat tcgagtagcg
301 gctcttccaa gctcaaagaa gcagaggccg ctgttcgttt cctttaggtc tttccactaa
361 agtcggagta tcttcttcca agatttcacg tcttggtggc cgttccaagg agcgcgaggt
421 cgggatggat cttgaagggg accgcaatgg aggagcaaag aagaagaact tttttaaact
481 gaacaataaa agtgaaaaag ataagaagga aaagaaacca actgtcagtg tattttcaat
541 gtttcgctat tcaaattggc ttgacaagtt gtatatggtg gtgggaactt tggctgccat
601 catccatggg gctggacttc ctctcatgat gctggtgttt ggagaaatga cagatatctt
661 tgcaaatgca ggaaatttag aagatctgat gtcaaacatc actaatagaa gtgatatcaa
721 tgatacaggg ttcttcatga atctggagga agacatgacc aggtatgcct attattacag
781 tggaattggt gctggggtgc tggttgctgc ttacattcag gtttcatttt ggtgcctggc
841 agctggaaga caaatacaca aaattagaaa acagtttttt catgctataa tgcgacagga
901 gataggctgg tttgatgtgc acgatgttgg ggagcttaac acccgactta cagatgatgt
961 ctctaagatt aatgaagtta ttggtgacaa aattggaatg ttctttcagt caatggcaac
1021 atttttcact gggtttatag taggatttac acgtggttgg aagctaaccc ttgtgatttt
1081 ggccatcagt cctgttcttg gactgtcagc tgctgtctgg gcaaagatac tatcttcatt
1141 tactgataaa gaactcttag cgtatgcaaa agctggagca gtagctgaag aggtcttggc
1201 agcaattaga actgtgattg catttggagg acaaaagaaa gaacttgaaa ggtacaacaa
1261 aaatttagaa gaagctaaaa gaattgggat aaagaaagct attacagcca atatttctat
1321 aggtgctgct ttcctgctga tctatgcatc ttatgctctg gccttctggt atgggaccac
1381 cttggtcctc tcaggggaat attctattgg acaagtactc actgtattct tttctgtatt
7. Anhang 66
1441 aattggggct tttagtgttg gacaggcatc tccaagcatt gaagcatttg caaatgcaag
1501 aggagcagct tatgaaatct tcaagataat tgataataag ccaagtattg acagctattc
1561 gaagagtggg cacaaaccag ataatattaa gggaaatttg gaattcagaa atgttcactt
1621 cagttaccca tctcgaaaag aagttaagat cttgaagggc ctgaacctga aggtgcagag
1681 tgggcagacg gtggccctgg ttggaaacag tggctgtggg aagagcacaa cagtccagct
1741 gatgcagagg ctctatgacc ccacagaggg gatggtcagt gttgatggac aggatattag
1801 gaccataaat gtaaggtttc tacgggaaat cattggtgtg gtgagtcagg aacctgtatt
1861 gtttgccacc acgatagctg aaaacattcg ctatggccgt gaaaatgtca ccatggatga
1921 gattgagaaa gctgtcaagg aagccaatgc ctatgacttt atcatgaaac tgcctcataa
1981 atttgacacc ctggttggag agagaggggc ccagttgagt ggtgggcaga agcagaggat
2041 cgccattgca cgtgccctgg ttcgcaaccc caagatcctc ctgctggatg aggccacgtc
2101 agccttggac acagaaagcg aagcagtggt tcaggtggct ctggataagg ccagaaaagg
2161 tcggaccacc attgtgatag ctcatcgttt gtctacagtt cgtaatgctg acgtcatcgc
2221 tggtttcgat gatggagtca ttgtggagaa aggaaatcat gatgaactca tgaaagagaa
2281 aggcatttac ttcaaacttg tcacaatgca gacagcagga aatgaagttg aattagaaaa
2341 tgcagctgat gaatccaaaa gtgaaattga tgccttggaa atgtcttcaa atgattcaag
2401 atccagtcta ataagaaaaa gatcaactcg taggagtgtc cgtggatcac aagcccaaga
2461 cagaaagctt agtaccaaag aggctctgga tgaaagtata cctccagttt ccttttggag
2521 gattatgaag ctaaatttaa ctgaatggcc ttattttgtt gttggtgtat tttgtgccat
2581 tataaatgga ggcctgcaac cagcatttgc aataatattt tcaaagatta taggggtttt
2641 tacaagaatt gatgatcctg aaacaaaacg acagaatagt aacttgtttt cactattgtt
2701 tctagccctt ggaattattt cttttattac atttttcctt cagggtttca catttggcaa
2761 agctggagag atcctcacca agcggctccg atacatggtt ttccgatcca tgctcagaca
2821 ggatgtgagt tggtttgatg accctaaaaa caccactgga gcattgacta ccaggctcgc
2881 caatgatgct gctcaagtta aaggggctat aggttccagg cttgctgtaa ttacccagaa
2941 tatagcaaat cttgggacag gaataattat atccttcatc tatggttggc aactaacact
3001 gttactctta gcaattgtac ccatcattgc aatagcagga gttgttgaaa tgaaaatgtt
3061 gtctggacaa gcactgaaag ataagaaaga actagaaggt gctgggaaga tcgctactga
3121 agcaatagaa aacttccgaa ccgttgtttc tttgactcag gagcagaagt ttgaacatat
3181 gtatgctcag agtttgcagg taccatacag aaactctttg aggaaagcac acatctttgg
3241 aattacattt tccttcaccc aggcaatgat gtatttttcc tatgctggat gtttccggtt
3301 tggagcctac ttggtggcac ataaactcat gagctttgag gatgttctgt tagtattttc
3361 agctgttgtc tttggtgcca tggccgtggg gcaagtcagt tcatttgctc ctgactatgc
mdr1 for. Primer
mdr1 rev. Primer
7. Anhang 67
3421 caaagccaaa atatcagcag cccacatcat catgatcatt gaaaaaaccc ctttgattga
3481 cagctacagc acggaaggcc taatgccgaa cacattggaa ggaaatgtca catttggtga
3541 agttgtattc aactatccca cccgaccgga catcccagtg cttcagggac tgagcctgga
3601 ggtgaagaag ggccagacgc tggctctggt gggcagcagt ggctgtggga agagcacagt
3661 ggtccagctc ctggagcggt tctacgaccc cttggcaggg aaagtgctgc ttgatggcaa
3721 agaaataaag cgactgaatg ttcagtggct ccgagcacac ctgggcatcg tgtcccagga
3781 gcccatcctg tttgactgca gcattgctga gaacattgcc tatggagaca acagccgggt
3841 ggtgtcacag gaagagatcg tgagggcagc aaaggaggcc aacatacatg ccttcatcga
3901 gtcactgcct aataaatata gcactaaagt aggagacaaa ggaactcagc tctctggtgg
3961 ccagaaacaa cgcattgcca tagctcgtgc ccttgttaga cagcctcata ttttgctttt
4021 ggatgaagcc acgtcagctc tggatacaga aagtgaaaag gttgtccaag aagccctgga
4081 caaagccaga gaaggccgca cctgcattgt gattgctcac cgcctgtcca ccatccagaa
4141 tgcagactta atagtggtgt ttcagaatgg cagagtcaag gagcatggca cgcatcagca
4201 gctgctggca cagaaaggca tctatttttc aatggtcagt gtccaggctg gaacaaagcg
4261 ccagtgaact ctgactgtat gagatgttaa atacttttta atatttgttt agatatgaca
4321 tttattcaaa gttaaaagca aacacttaca gaattatgaa gaggtatctg tttaacattt
4381 cctcagtcaa gttcagagtc ttcagagact tcgtaattaa aggaacagag tgagagacat
4441 catcaagtgg agagaaatca tagtttaaac tgcattataa attttataac agaattaaag
4501 tagattttaa aagataaaat gtgtaatttt gtttatattt tcccatttgg actgtaactg
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass
eine Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Christiane Karsten
Lebenslauf
Name: Christiane Karsten
Geburtsdatum: 24.03.1976
Geburtsort: Mönchengladbach
Anschrift: Brüggstr. 14, 17489 Greifswald
Eltern: Wolfgang F. Karsten und Elke Karsten, geb. Tutt
Schulischer Werdegang:
1981-1986 Grundschule in North Tarrytown (USA), Neuss und
Mönchengladbach
1986-1996 Gymnasium an der Gartenstraße, Mönchengladbach
13.06.1996 Allgemeine Hochschulreife
Beruflicher Werdegang:
seit 1996 Medizinstudium an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität,
Greifswald
23.09.1998 Ärztliche Vorprüfung
31.08.1999 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
18.09.2001 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Famulaturen: Praxis für Anästhesie
Chirurgische Klinik des Maria Hilf Krankenhauses,
Mönchengladbach
Klinik für Pädiatrische Hämatologie / Onkologie, Münster
Klinik für Neurologie, Greifswald
Klinik für Innere Medizin, Kardiologie, Greifswald
Danksagung Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Kroemer für die Vergabe des interessanten
Themas, die wertvollen Anregungen und die Ausbildung in seinem Institut.
Für die wissenschaftliche Betreuung, die ständige Bereitschaft Fragen zu diskutieren
und die damit verbundenen vielen Denkanstöße, bedanke ich mich bei den Herren Dr.
Sperker und Dr. Meissner.
Des weiteren danke ich Frau Kalb für ihre hilfreichen Ratschläge und die Betreuung bei
den praktischen Arbeiten.
Herrn Prof. Dr. Warzok und den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Ernst-
Moritz-Arndt-Universität möchte ich an dieser Stelle Dank sagen für die
immunhistochemische Aufarbeitung meiner Proben.
Nicht zuletzt bedanke ich mich bei allen Diplomanden und Doktoranden für die
Anregungen und Tipps und der Freude bei der Anfertigung dieser Arbeit.
Ein herzlicher Dank gilt schließlich meinen Eltern für die liebevolle Unterstützung in
allen Phasen meines Studiums und meiner Dissertation, aber auch dafür, dass sie mir
mein Studium ermöglichten.