expresión de la proteína mayoritaria de cápside viral (vp1
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TRABAJO ESCRITO CORRESPONDIENTE A LA OPCIÓN DE TITULACIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
Expresión de la Proteína Mayoritaria de Cápside
Viral (VP1) del Calicivirus felino
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
INGENIERO BIOTECNÓLOGO
PRESENTA:
Yoloxochitl Paredes Morales
Ciudad de México a 30 de noviembre de 2016
DIRIGIDA POR:
Dra. Ana Lorena Gutiérrez Escolano
Dra. Ana Lorena Guitiérrez Escolano
2
Agradecimientos
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por el apoyo económico otorgado para la
realización de este trabajo a través del “Proyecto del Fondo Sectorial de la Salud” 261257.
A la Dra. Ana Lorena Gutiérrez Escolano, por recibirme en su laboratorio y tenerme la
confianza para desarrollar este proyecto, así como por todo su apoyo en el desarrollo
práctico y teórico del mismo.
De manera especial a la Dra. Clotilde Cancio Lonches, por su apoyo y enseñanza en el
desarrollo de las técnicas experimentales implementadas en este proyecto, y por su ayuda
en la resolución de problemas durante el proceso. Así como por su infinita paciencia e
incondicional amistad.
A la Lic. Brenda Xoconostle Morán, por su gran amistad y ayuda durante el análisis
bioinformático realizado en este proyecto.
A mi familia, por todo su amor y apoyo, por soportarme durante mi estrés, por escucharme
aunque no entendieran de que hablaba y por animarme cuando pensé que ya no podía
más.
A mis amigas Claudia, Astrid, Erendira y Rosa, por estar siempre a mi lado y apoyarme con
todo lo que necesite.
Al M. en C. César Agustín Jiménez Sierra y la Dra. Estela Gómez Flores, por aceptar ser
mis evaluadores, así como por sus comentarios y correcciones durante la redacción de este
proyecto.
Al Dr. Alejandro Castello, por contagiarme de su entusiasmo y amor por los virus durante el
tiempo que tuve el privilegio de tomar su clase.
3
Contenido
Agradecimientos ..............................................................................................................................2
Índice de Cuadros ...........................................................................................................................6
Índice de Figuras .............................................................................................................................7
Resumen ........................................................................................................................................12
Introducción ....................................................................................................................................13
Familia Caliciviridae ..................................................................................................................13
Norovirus humano .....................................................................................................................14
Calicivirus felino .........................................................................................................................15
Organización genómica ........................................................................................................16
Ciclo replicativo ......................................................................................................................18
La proteína mayoritaria de cápside (VP1) de FCV ...........................................................19
Justificación ....................................................................................................................................22
Objetivos .........................................................................................................................................22
General .......................................................................................................................................22
Particulares.................................................................................................................................22
Metodología....................................................................................................................................23
I. Preparación de células competentes ..........................................................................23
II. Transformación en células competentes DH5-α y BL-21(DE3) con los plásmidos
de interés ................................................................................................................................23
4
III. Extracción de ADN plasmídico (ADNp) ..................................................................24
IV. Obtención del gen de VP1 mediante ensayo de PCR a partir de un plásmido
con el genoma completo de FCV- Urbana. ........................................................................24
V. Clonación del gen que codifica para la proteína VP1 en el vector de tránsito
pCR2.1-TOPO. ......................................................................................................................26
VI. Subclonación de la proteína VP1 en el vector de expresión pGEX-5x-1. ..........27
VII. Expresión de la proteína VP1. .................................................................................28
VIII. Secuenciación ............................................................................................................29
IX. Ensayo de western blot. ............................................................................................29
Resultados y Discusión ................................................................................................................31
Clonación del gen que codifica para VP1 en el vector pCR2.1-TOPO ..............................31
Restricción del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1 .......................................................................33
Clonación del gen que codifica para la proteína VP1 en el vector de expresión pGEX-
5X-1 .............................................................................................................................................34
Expresión de la proteína recombinante GST-VP1 en células BL-21 .................................40
Análisis de la secuenciación ....................................................................................................43
Niveles de expresión y Localización de la proteína recombinante GST-VP1 ...................45
Conclusiones ..................................................................................................................................50
Recomendaciones .........................................................................................................................50
Referencias ....................................................................................................................................51
Anexos ............................................................................................................................................58
5
Anexo 1: Vector pCR2.1-TOPO ..............................................................................................58
Anexo 2: Vector pGEX-5X-1 ....................................................................................................59
Anexo 3: Sitios de corte para el vector pGEX-5X-1 y la secuencia de VP1 de FCV-
Urbana ........................................................................................................................................60
Anexo 4: Preparación de geles de poliacrilamida .................................................................61
Anexo 5: Alineamiento múltiple de nucleótidos .....................................................................62
Anexo 6: Alineamiento múltiple de aminoácidos ...................................................................64
.
6
Índice de Cuadros
Cuadro 1. Secuencia nucleotídica de los oligonucleótidos para la proteína VP1 de FCV-
Urbana .................................................................................................................................. 25
Cuadro 2. Programa para la reacción de PCR con los oligonucleótidos FW VP1 FCV Urbana
y RV VP1 FCV Urbana. ........................................................................................................ 25
Cuadro 3. Relaciones vector:inserto utilizadas para la ligación. ......................................... 36
Cuadro 4. Cambio de nomenclatura de las clonas positivas para el plásmido pGEX-5x1-
VP1, para ser usadas durante la cinética de expresión de la proteína recombinante GST-
VP1. ...................................................................................................................................... 40
Cuadro 5. Densidad óptica alcanzada para comenzar la inducción con IPTG de las clonas
1-6 positivas para el plásmido pGEX-5x-1-VP1. ................................................................. 41
Cuadro 6. Porcentaje de identidad de la secuenciación de las clonas 2 y 5 contra la
secuencia del genoma del FCV cepa Urbana. .................................................................... 43
Cuadro 7. Densidad óptica alcanzada en el cultivo de 50ml antes de comenzar la inducción
para la expresión de la proteína recombinante GST-VP1 ................................................... 46
Cuadro 8. Oligonucleótidos del vector de tránsito pCR2.1-TOPO ...................................... 58
Cuadro 9. Preparación de las soluciones utilizadas en la preparación de geles de
poliacrilamida. ....................................................................................................................... 61
Cuadro 10. Preparación de geles de poliacrilamida al 8 y 10%. ......................................... 61
7
Índice de Figuras
Figura 1. Calicivirus. Representación de la estructura icosahedrica T=3, así como del
genoma. Tomado de: (SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 2008) ................................... 14
Figura 2. Representación de la organización genómica del FCV. Modificado de: (Royal &
Locker, 2016). ....................................................................................................................... 17
Figura 3. Representación esquemática del ciclo replicativo del FCV. ................................ 19
Figura 4. Regiones conservadas y variables de la secuencia de aminoácidos del precursor
de la proteína VP1 del género Vesivirus. Tomado de: (Green, Chanock, & Kapikian, Human
Caliciviruses, 2001) .............................................................................................................. 20
Figura 5. Estructura terciaria y cuaternaria de la VP1 del FCV indicando el dominio S, P y
N-terminal. Tomado de: (Burmeister, y otros, 2015) ........................................................... 20
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de 1632pb
correspondiente al gen de la proteína VP1 del FCV-Urbana. En el extremo izquierdo se
muestra el marcador de tamaño molecular. ........................................................................ 31
Figura 7. Clonación del gen de la proteína VP1 del FCV en el vector de tránsito pCR2.1-
TOPO. El gen VP1 del FCV fue clonado en el plásmido pCR2.1-TOPO. Las clonas
candidatas fueron sometidas a una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos de VP1
(panel derecho) y del pCR2.1-TOPO (panel izquierdo). Los productos de amplificación de
1632 y 1797pb de las clonas positivas obtenidos con cada par de oligonucleótidos
respectivamente, se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0.8% y se señalan
con un asterisco. Los marcadores de tamaño molecular se muestran en el carril de la
extrema izquierda de cada gel (MTM). ................................................................................ 32
Figura 8. Restricción enzimática con EcoRI del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1. Las clonas
candidatas fueron sometidas a una reacción de restricción utilizando la enzima EcoRI.
Panel Derecho: El producto de restricción de 1589pb correspondiente al gen de la VP1, se
analizó por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y se señala con una flecha. Como
8
control negativo se incluyó la clona 10. El marcador de tamaño molecular se muestra en el
carril de la extrema izquierda del gel. Panel Izquierdo: Diagrama representativo de la
restricción con EcoRI del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1. .................................................... 33
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de 1632pb
correspondiente al gen de la proteína VP1 obtenido a partir del plásmido pCR2.1-TOPO-
VP1 perteneciente a la clona 4. En los carriles 1, 2 y 3 se ilustran los triplicados de la PCR
y en el último carril se muestra el control positivo (C+) el cual es el plásmido conteniendo el
genoma completo del FCV-Urbana. En el extremo izquierdo se muestra al marcador de
tamaño molecular en pb. ...................................................................................................... 35
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del vector pGEX-5X-1 y el amplicon del
gen de VP1. El vector de expresión pGEX-5x-1 (4.9kb) y el amplicon del gen de VP1
(1632pb) fueron cortados con las enzimas con NotI y SmaI para su posterior ligación. Se
muestra el vector pGEX-5X-1 de 4900pb (carril 1) y el amplicon de VP1 de 1632 pb (carril
2) cortados y purificados. En el extremo izquierdo se muestra el marcador de tamaño
molecular de 1Kb. ................................................................................................................. 35
Figura 11. Colonias obtenidas de células competentes DH5-α transformadas con las
reacciones de ligación. Células competentes DH5-α fueron transformadas con 2µL de
reacción de ligación y sembradas en plagas de agar Luria con ampicilina (1mg/ml). En el
panel 1, 2 y 3 se muestran las colonias obtenidas con las ligaciones A, B y C,
respectivamente. En el panel 4 se muestra la prueba de fondo donde se realizó la ligación
del vector sin inserto............................................................................................................. 37
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del ADN plasmídico de las clonas
candidatas obtenidas de la ligación del gen VP1 y el vector de expresión pGEX-5x-1. La
relación vector:inserto usada en la ligación se representa con las letras A: 1:1; B: 1:2, C:
1:3. ........................................................................................................................................ 38
Figura 13. Clonación del gen de la proteína VP1 en el vector de expresión pGEX-5x-1. El
gen VP1 del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1 fue clonado en el plásmido de expresión pGEX-
5x-1. Panel Derecho: De las clonas candidatas analizadas, las clonas B1, B2, B3, B5, C2 y
C5 resultaron positivas a la presencia del gen dela VP1, y las clonas A2, A3, A4, A5, C1
9
resultaron negativas mediante una reacción de restricción con la enzima EcoRI. Los
productos de restricción de 4947pb y 1585pb corresponden al vector pGEX-5x-1 vacío y al
gen de la VP1 respectivamente. Como control de restricción se usó el plásmido circular de
las clonas A2 y C2 pertenecientes al grupo de posibles negativas y positivas
respectivamente, señalándose con un (*). En el extremo izquierdo se muestra el marcador
de tamaño molecular. Panel Izquierdo: Se muestra un diagrama representativo de la
restricción con EcoRI en el plásmido pGEX-5X-1-VP1. ...................................................... 39
Figura 14. Cinética de inducción de la proteína VP1 recombinante en células competentes
E.coli BL-21 en geles de acrilamida al 10%. El plásmido pGEX-5x-1-VP1 de las 6 clonas
positivas se utilizó para transformar células competentes E. coli BL-21(DE3). La cinética de
inducción se realizó bajo 0.1mM de IPTG y duró 5 horas. A) Clona 1, B) Clona 2, C) Clona
3, D) Clona 4, E) Clona 5, F) Clona 6. Se observa una banda de 85kDa sobreexpresada en
las clonas 2, 3 y 5. En el extremo izquierdo se señala el marcador de peso molecular (MPM);
el primer carril contiene la alícuota pre-inducción (NI) y los carriles subsecuentes las
alícuotas de las horas 1, 2, 3, 4 y 5 post-inducción. ............................................................ 42
Figura 15. Mutaciones presentes en las secuencias del gen de VP1 del FCV-Urbana
clonadas en el vector de expresión pGEX-5X-1. En el panel superior se encuentra una
mutación en la posición 159 de una TxC y en el panel inferior una segunda mutación en la
posición 987 de una GxA. Obtenido mediante alineamiento múltiple de nucleótidos en el
programa bioinformático CLC Main Workbench 7.7.3. ........................................................ 44
Figura 16. Alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos del gen de VP1 clonado
en el vector de expresión pGEX-5X-1 y de la VP1 del FCV-Urbana. En el panel superior se
observa que la mutación nucleotídica en la posición 159 de las clonas 2 y 5 codificó para
una asparagina (N) (residuo 53) lo que resultó en una mutación silenciosa, al igual que la
mutación nucleotídica en la posición 987 que codificó para una alanina (A) (residuo 329).
Alineamiento realizado en el programa CLC Main Workbench 7.7.3. ................................ 45
Figura 17. Expresión de la proteína recombinante GST-VP1 en células competentes E. coli
BL-21 a partir del plásmido pGEX-5x-1-VP1 de las clonas 2 y 5 en un gel de acrilamida al
10%. Se realizó una segunda inducción para las clonas 2 y 5 en un volumen de 50ml de
medio Luria. Las horas de máxima inducción registradas para la Clona 2 y Clona 5 en la
10
figura anterior fueron 4 y 5 horas respectivamente. La banda de 85kDa correspondiente a
la proteína GST-VP1 se encuentra señalada por un rectángulo rojo. En el extremo izquierdo
de la figura se señala el marcador de peso molecular en kDa; el primer y tercer carril
contienen la alícuota pre-inducción de la clona 2 y 5 respectivamente, el segundo y cuarto
carril contienen la alícuota de los tiempos de máxima inducción de ambas clonas (4 y 5
horas respectivamente). ....................................................................................................... 46
Figura 18. Determinación de la localización de la proteína recombinante GST-VP1 en el
sobrenadante de los cultivos de E. coli BL-21(DE3) transformadas con el plásmido pGEX-
5X-1-VP1. Las células obtenidas después de la inducción fueron lisadas por sonicación y
centrifugadas. El agregado celular resultante, así como el sobrenadante fueron utilizados
en este ensayo. Los primeros 4 carriles pertenecen a extractos de la clona 2, mientras que
los siguientes 4 son extractos de la clona 5. Para ambas clonas: Los carriles con la letra P
representan los extractos proteínicos recuperados de la pastilla residual de la lisis celular,
en los cuales no se observa ninguna banda a la altura de 85kDa. Por otro lado, los carriles
con las letras a, b y c, contienen los extractos obtenidos del sobrenadante de la lisis celular
en donde se cargaron 20, 30 y 40µL, respectivamente. Las posibles bandas
correspondientes a la proteína recombinante GST-VP1 se señalan con unas flechas. En el
extremo izquierdo se indican los marcadores de peso molecular (MPM) en kDa. ............. 47
Figura 19. Ensayo de western blot para la detección de la proteína recombinante GST-VP1
presente en el sobrenadante de las clonas 2 y 5. A partir del agregado celular y
sobrenadante obtenidos del lisado celular, se realizó un ensayo de western blot utilizando
como control negativo extractos pre-inducción de las clonas 2 y 5. Para identificar la
proteína se usaron anticuerpos de ratón contra la bandera (GST) en una dilución 1:7500 y
para revelar se usaron anticuerpos anti-ratón con HRP en una dilución 1:5000. En el
extremo izquierdo se observa el marcador de peso molecular. Los primeros dos carriles
corresponden a los extractos pre-inducción y sobrenadante de la clona 2, seguidos de los
correspondientes a la clona 5. En el extracto del sobrenadante de la lisis celular de la clona
2, se observa una banda debajo del marcador de 100kDa correspondiente a la proteína
recombinante GST-VP1 de 85kDa....................................................................................... 48
Figura 20. Mapa de restricción del vector de tránsito pCR2.1-TOPO................................. 58
11
Figura 21. Mapa de restricción del vector de expresión pGEX-5x-1................................... 59
Figura 22. Mapa de restricción del vector pGEX-5x-1 obtenido con la herramienta
bioinformática NEBcutter de BioLabs. ................................................................................. 60
Figura 23. Mapa de restricción de la VP1 obtenido con la herramienta bioinformática
NEBcutter de BioLabs .......................................................................................................... 60
Figura 24. Alineamiento múltiple de nucleótidos de las secuencias consenso de las clonas
2 y 5 contra la secuencia de la VP1 del FCV-Urbana. Obtenido mediante el programa
bioinformático CLC Main Workbench 7.7.3. ........................................................................ 63
Figura 25. Alineamiento múltiple de aminoácidos entre las secuencias consenso de las
clonas 2 y 5 y la secuencia de la proteína VP1 del FCV-Urbana. Obtenido mediante el
programa bioinformático CLC Main Workbench 7.7.3. ........................................................ 64
12
Resumen
Los norovirus humanos son la principal causa de gastroenteritis aguda no bacteriana
a nivel mundial, que afecta a toda la población, siendo los niños y los adultos mayores los
más afectados. Se estima que éste agente viral provoca cerca de 200 000 muertes de niños
menores de cinco años anualmente (Patel, y otros, 2008) en países en desarrollo. El
principal obstáculo para el estudio de su biología y patogénesis es su inhabilidad para ser
cultivados in vitro, es por esto que se recurre a miembros de la misma familia como modelos
de estudio. Uno de estos es el Calicivirus felino (FCV) perteneciente al género Vesivirus. El
FCV es un virus no envuelto de 35 nm de diámetro, con un genoma de ARN monocatenario
de sentido positivo que consta de tres marcos de lectura abiertos (ORFs), el ORF-1 codifica
para seis proteínas virales no estructurales, el ORF-2 codifica para la proteína mayoritaria
de cápside VP1 y el ORF-3 para la proteína minoritaria de cápside VP2. El estudio de las
proteínas de la cápside ha permitido conocer aspectos relacionados con su función durante
la replicación viral, independiente de la de formar parte de la cápside viral. Se conoce que
VP1 participa en la replicación viral, y se une específicamente a la replicasa viral. Para
conocer el papel de VP1 en otras funciones virales, es necesario contar con herramientas
moleculares para su detección y localización subcelular entre otras. Es por ello que en este
trabajo se clonó y expresó en un sistema procarionte, con la finalidad de purificarla y
utilizarla para la producción de anticuerpos que nos permitan darle un seguimiento durante
la infección. Con base en las secuencias nucleotídicas del gen de la proteína VP1 del FCV
reportadas en el GenBank del National Center for Biotechnology Information se diseñaron
oligonucleótidos específicos para amplificar el gen por PCR. El producto obtenido se clonó
en el vector de tránsito pCR2.1-TOPO y después se subclonó en el vector pGEX-5X-1 para
expresión en procariontes. Las clonas que contienen a las secuencias de VP1, se
determinaron por ensayos de restricción y PCR, y las clonas usadas para la expresión se
confirmaron por medio de análisis bioinformático de la secuenciación. Para la expresión de
la proteína VP1 se transformaron células competentes Escherichia coli BL-21(DE3), y se
determinaron los tiempos de inducción. La expresión se analizó por electroforesis en gel de
poliacrilamida, con una expresión máxima a las 4 y 5 horas. Se corroboró la expresión de
la proteína recombinante GST-VP1 y su presencia se detectó en el sobrenadante del lisado
celular por ensayo de western blot mediante la detección con anticuerpos de ratón contra
la GST. Esto permitirá una más eficiente purificación para su uso en la obtención de
anticuerpos.
13
Introducción
Familia Caliciviridae
La familia Caliciviridae está compuesta por virus pequeños (27-40nm), no envueltos,
de estructura icosaedrica T=3 (Figura 1) los cuales poseen un genoma lineal, no
segmentado, sentido positivo de ARN monocatenario con una longitud de 6.7-8.5 kb (Black,
Burroughs, Harris, & Brown, 1978). Los genomas de los calicivirus se encuentran divididos
de dos a 4 marcos de lectura abiertos (ORF’s), dependiendo del género al que pertenezcan
(Clarke & Lambden, 1997; Bull & White, 2010). Adicionalmente, estos virus producen un
ARN subgenómico (sg ARN) durante la infección que es idéntico al extremo 3’ del genoma.
Ambos ARN están poliadenilados, pero carecen de la estructura cap (m7GpppN) y
contienen una proteína asociada al genoma (VPg) que se encuentra covalentemente unida
al extremo 5’, revisado en: (Gutiérrez-Escolano, 2014).
Los Calicivirus están clasificados en cinco géneros: Vesivirus, Lagovirus, Norovirus,
Sapovirus y Nebovirus (Cartens, 2010) y tres géneros propuestos adicionales: Recovirus,
Valovirus y Calicivirus de pollo (Farkas, Sestak, Wie, & Jiang, 2008; L'Homme, y otros,
2009; Wolf, Reetz, & Otto, 2011).
Los Norovirus y Sapovirus contienen los virus humanos entéricos del mismo
nombre, así como otros virus que causan enfermedades entéricas primarias en otros
animales tales como los norovirus murino y canino (Robilotti, Deresinski, & A., 2015).
Mientras que los Lagovirus y Vesivirus causan principalmente infecciones orales,
respiratorias y algunas veces sistémicas en animales (Green, Chanock, & Kapikian, 2001);
los representantes más importantes son el FCV clasificado en el género Vesivirus y el virus
de la enfermedad hemorrágica de conejo (RHDV) en el género Lagovirus (Radford, Coyne,
Dawson, Porter, & Gaskell, 2007).
14
Figura 1. Calicivirus. Representación de la estructura icosaedrica T=3, así como del genoma. Tomado de: (SIB Swiss Institute of Bioinformatics, 2008)
Norovirus humano
Los norovirus humanos (HuNoV), cuyo prototipo es el virus Norwalk, fue identificado
por primera vez en muestras fecales recolectadas durante un brote de gastroenteritis en
una escuela primaria de Norwalk, Ohio, E.U.A., y fue el primer agente viral demostrado en
causar gastroenteritis (Kapikian, y otros, 1972). Se estima que los HuNoV son responsables
de al menos el 50% de los brotes de gastroenteritis reportados en Estados Unidos y países
europeos; sin embargo, la incidencia de este agente es rara vez registrada a nivel
laboratorio en países en desarrollo; revisado en: (Hall, y otros, 2011; Patel, Hall, Vinjé, &
Parashar, 2009). Se ha reportado que el norovirus es sólo superado por rotavirus como
causante de gastroenteritis severa en niños (Sakai, y otros, 2001; Zintz, y otros, 2005);
considerando el éxito en la vacunación de infantes contra la infección por rotavirus, los
norovirus probablemente se convertirán en la causa más común de enfermedades
diarreicas infantiles (Karst, 2010).
Los norovirus son altamente transmisibles y se pueden propagar por exposición a
comida o agua contaminada, contacto persona a persona, partículas de vómito en forma de
aerosol, etc. Personas de todas las edades son susceptibles a la infección, y las infecciones
secundarias son comunes (Green K. , 2013). Los síntomas incluyen vómito y diarrea con o
sin náuseas y calambres abdominales (Karst, 2010); puede ser particularmente severa en
niños, resultando en la muerte en algunos casos (Lopman, Reacher, Vipond, Sarangi, &
15
Brown, 2004). Los brotes ocurren comúnmente en comunidades semi-cerradas como asilos
de ancianos, escuelas, hospitales, cruceros, sitios de socorro y entornos militares (Karst,
2010).
La inhabilidad del HuNoV para ser cultivado in vitro ha obstaculizado la
caracterización de su ciclo de vida; sin embargo, otros miembros de la familia Caliciviridae
han sido ampliamente utilizados como sistemas modelo para estudiar la biología del
norovirus humano (Vashist, Bailey, Putics, & Goodfellow, 2009). Uno de ellos, el FCV fue el
primer calicivirus para el cual estuvo disponible un sistema de cultivo celular y de genética
reversa (Sosnovtsev & Green, 1995), y ha sido usado ampliamente para estudiar la biología
de los calicivirus.
Calicivirus felino
El Calicivirus felino (FCV) es un patógeno altamente infeccioso, con una amplia
distribución en la población felina y que afecta principalmente a felinos domésticos. El virus
causa infecciones agudas del tracto respiratorio superior y enfermedades letales
sistémicas, principalmente en gatos viviendo en colonias (Radford, Coyne, Dawson, Porter,
& Gaskell, 2007; Radford, y otros, 2009). Debido al gran número de diferentes cepas de
FCV, se puede observar un amplio rango de signos clínicos. Los más característicos son
ulceras orales, descarga ocular y nasal, y ocasionalmente infecciones inaparentes o
neumonía (Cai, y otros, 2002). Los gatos pueden ser infectados por secreciones nasales,
orales o vía conjuntival (Radford, Coyne, Dawson, Porter, & Gaskell, 2007); siendo el
principal sitio de replicación del virus el tejido oral y respiratorio como pulmones, faringe y
tráquea. A pesar de que este virus no causa una enfermedad gastrointestinal, su semejanza
en la organización genómica con los que infectan a humano ha permitido que se pueda
estudiar aspectos de la biología de esta familia de virus.
En cultivo celular, las células infectadas muestran un efecto citopático característico
asociado con redondeo celular y formación de vesículas en la membrana, producto de la
formación de los complejos replicativos o fábricas virales (Knowles, 1988). En estas
condiciones, la infección con FCV provoca la inhibición de la síntesis de proteína celular
asociada con la escisión de los factores de iniciadores de la traducción en la célula
hospedera (Willcocks, Carter, & Roberts, 2004). Tal mecanismo puede permitir al virus
16
desviar la maquinaria traduccional celular de ser cap-dependiente a cap-independiente y,
por lo tanto, deteniendo la traducción del ARNm celular y permitiendo que la traducción se
enfoque en el ARN viral unido a VPg (Radford, Coyne, Dawson, Porter, & Gaskell, 2007).
Por otro lado, la infección de FCV en cultivo celular acciona la vía mitocondrial de muerte
celular, llevando a la activación de caspasas y finalmente la apoptosis (Natoni, Kass, Carter,
& Roberts, 2006; Sosnovtsev, Prikhod'ko, Belliot, Cohen, & Green, 2003). Las
consecuencias biológicas de éste proceso en términos de la replicación viral no son
conocidas; sin embargo, en nuestro laboratorio la inhibición de la apoptosis asociada a la
inducción de la proteína HSP70 mediante choque térmico, no afecta la producción de
partículas virales, pero si su salida de la célula infectada, lo cual está en concordancia con
el papel de la apoptosis en la diseminación de las partículas virales en el huésped (Alvarez,
y otros, 2015). Por otro lado, se ha demostrado que la inhibición de apoptosis durante la
infección por astrovirus disminuye drásticamente la cantidad de virus liberado de la célula
(Guix, Bosch, Ribes, & Pintó, 2004), mientras que la inhibición de la apoptosis en la
infección por el virus de stomatitis vesicular (VSV) no tiene efecto en la replicación (Hobbs,
Hommel-Berrey, & Brahmi, 2003).
Organización genómica
El FCV tiene un genoma ARN (+). Los virus ARN tienen tasas de mutación más altas
comparadas con las de los virus ADN, lo que les otorga la capacidad de evolucionar con
mayor rapidez, incrementando sus oportunidades de sobrevivir contra las defensas del
hospedero, revisado en: (Domingo, Menendez-Arias, & Holland, 1997; Moya, Holmes, &
Gonzalez-Candelas, 2004). Ésta alta tasa de mutación es atribuida a que la ARN
polimerasa dependiente de ARN no tiene actividad de edición o “proofreading” (Steinhauer,
Domingo, & Holland, 1992). Las tasas de mutación de los calicivirus están dentro de las
más altas entre los virus ARN, lo que contribuye a la plasticidad de su genoma y la amplia
variedad de genotipos, revisado en: (Elena & Sanjuan, 2005).
El genoma del FCV es de aproximadamente 7.7 kb, se encuentra poliadenilado en
el extremo 3’ y unido a la proteína VPg en el extremo 3’. Codifica para tres marcos de lectura
abiertos (ORF’s) al igual que los norovirus (Figura 2). El ORF-1 codifica para una
poliproteína que es procesada por la única proteasa viral, o NS6, para dar origen a las
proteínas no estructurales (NS) encargadas de mediar la replicación del virus en la célula
17
(Radford, Coyne, Dawson, Porter, & Gaskell, 2007); las proteínas NS reciben este nombre
ya que no son encontradas en las partículas virales maduras, a excepción de la VPg. La
Pro-Pol o NS6/7 es un precursor que al ser escindido se convierte en la proteasa madura y
la ARN polimerasa-ARN dependiente. La función principal de la proteasa es el corte de la
poliproteína, traducida del ORF-1, y del precursor de la proteína de cápside (Sosnovtsev,
Sosnovtseva, & Green, 1998; Sosnovtseva, Sosnovtsev, & Green, 1999). Se ha encontrado
que la VPg es requerida para la iniciación traduccional, actuando como cap para el
reclutamiento del ribosoma (Sosnovtsev & Green, 1995; Herbert, Brierley, & Brown, 1997).
La función de las proteínas no estructurales restantes es desconocida, sin embargo,
algunos estudios indican que pueden tener un rol en la formación de complejos replicativos
(Green, y otros, 2002).
Los ORF-2 y -3 codifican para la proteína mayoritaria y minoritaria de la cápside
(VP1 y VP2) respectivamente. VP1 es traducida como un precursor (668 residuos, 73kDa)
el cual es procesado por la proteasa viral en un péptido líder de 124 residuos denominado
Líder de la cápside o LC y la VP1 madura de 544 residuos (60kDa) (Burmeister, y otros,
2015)
Figura 2. Representación de la organización genómica del FCV. Modificado de: (Royal & Locker, 2016).
18
Ciclo replicativo
El reconocimiento de la célula hospedera y la entrada a la misma son dos pasos
críticos en el ciclo de vida de un virus. La unión específica de los calicivirus a la superficie
celular involucra moléculas de carbohidratos (Tan & Jiang, 2010), en el caso del FCV se
trata del α-2,6 ácido siálico (Stuart & Brown, 2007). La entrada del virus a la célula es por
endocitosis mediada por receptor y se ha reportado que la proteína de uniones estrechas
JAM-1 (Junctional Adhesion Molecule- 1) es el receptor celular para FCV (Makino, y otros,
2006); la unión de este receptor a la cara externa del capsómero induce un cambio
conformacional en la cápside del virus (Bhella, Gatherer, Chaudhry, Pink, & Goodfellow,
2008). A pesar de que el α-2,6 ácido siálico puede potenciar la unión del FCV a la superficie
celular, no puede mediar la entrada del virus a la célula por sí mismo; por otro lado, la
expresión de JAM-1 en células no permisivas las vuelve susceptibles a la infección (Makino,
y otros, 2006). Se ha demostrado que JAM-1 está ampliamente distribuida en tejidos felinos,
localizada en las uniones célula- célula endoteliales y epiteliales (Pesavento, y otros, 2011).
Se ha demostrado que la infección por FCV es dependiente del ambiente de los
endosomas con pH bajo (Kreutz & Seal, 1995). Por otro lado, Stuart y Brown demostraron,
mediante el uso de drogas que inhiben diferentes vías endocíticas, que la entrada del FCV
es mediada por la vía de la clatrina (Stuart & Brown, 2006).
Una vez dentro de la célula, el capsómero se desensambla y el ARN genómico es
liberado en el citoplasma y traducido de una manera dependiente de la proteína viral VPg
o NS4. Las proteínas NS participan en la formación de complejos replicativos y la RNA
polimerasa dependiente de RNA o NS6/7 usa el RNA genómico como molde para la síntesis
de la cadena de RNA negativo (RNA [-]); a su vez, la cadena negativa también es usada
para la generación de más RNA genómico (RNA [+]) y RNA subgenómico. El RNA
subgenómico (sgRNA) es traducido en etapas tardías de la infección para generar las
proteínas estructurales, o de cápside, VP1 y VP2, las cuales tienen la capacidad de auto-
ensamblarse junto con el genoma y formar a las partículas virales que son liberadas de la
célula mediante apoptosis, revisado en: (Gutiérrez-Escolano, 2014).
19
Figura 3. Representación esquemática del ciclo replicativo del FCV.
La proteína mayoritaria de cápside (VP1) de FCV
La VP1 está dividida en seis regiones A-F basado en la secuencia conservada y
variable de aminoácidos (Fig. 3) (Seal, Ridpath, & Mengeling, 1993). Las regiones B, D y F
son relativamente conservadas entre FCV mientras que las C y E son variables. Se sabe
que la región variable E contiene los principales epítopes para las células B del sistema
inmune (Geissler, Schneider, & Truyen, 2002; Radford, Willoughby, Dawson, McCracken,
& Gaskel, 1999). La región A es escindida para producir la proteína madura de cápside
(Carter, y otros, 1992; Sosnovtsev, Sosnovtsev, & Green, 1998).
20
Figura 4. Regiones conservadas y variables de la secuencia de aminoácidos del precursor de la proteína VP1 del género Vesivirus. Tomado de: (Green, Chanock, & Kapikian, Human Caliciviruses, 2001)
La estructura que muestra la proteína VP1 está compuesta de tres dominios (Fig.
4): un pequeño péptido desordenado localizado río abajo del sitio de corte proteolítico
(residuos 125-128) es seguido por el dominio del brazo amino terminal (NTA)
interconectando con subunidades vecinas para la formación de la cápside (residuos 129-
173). El dominio S que forma el armazón (residuos 174-330) es seguido del dominio P
carboxilo terminal (residuos 331-668) que forma un pico dimérico llevando el sitio de unión
al receptor (Burmeister, y otros, 2015).
Figura 5. Estructura terciaria y cuaternaria de la VP1 del FCV indicando el dominio S, P y N-terminal. Tomado de: (Burmeister, y otros, 2015)
21
La cápside viral está compuesta de 180 copias de la VP1, las cuales dimerizan y se
auto-ensamblan espontáneamente (Jiang, Wang, Graham, & Estes, 1992). Por otro lado,
aunque la VP2 no es necesaria para el auto-ensamblaje de la cápside viral vacía, ayuda a
estabilizar la estructura icosaedrica y es requerida para la producción y ensamblaje de
partículas infecciosas (Sosnovstev, Belliot, Chang, Onwudiwe, & Green, 2005).
La cápside viral tiene varias funciones además de la de formar a las partículas
virales; es responsable de la unión y entrada del virus a la célula, de la entrega del genoma
viral al citoplasma de la célula y participa en la replicación del ARN viral junto con la
replicasa viral. La cápside viral también debe empacar específicamente el genoma viral
para formar nuevos viriones. Por otro lado, también se ha reportado que se une
específicamente a la replicasa viral y a la proteína viral VPg (Kaiser, Chaudry, Sosnovtsev,
& Goodfellow, 2006).
22
Justificación Los norovirus humanos, pertenecientes a la familia Caliciviridae, son una de las
principales causas de gastroenteritis aguda no bacteriana a nivel mundial en humanos. En
países en desarrollo, se estiman más de 200 000 muertes anuales en niños menores de 5
años debido a infecciones por norovirus (Patel, y otros, 2008) y ha sido recientemente
reportado como la segunda causa de muerte relacionada a gastroenteritis en Estados
Unidos, resultando en 797 muertes al año (Hall, y otros, 2013).
Debido a su incapacidad para ser cultivado in vitro, se ha recurrido al uso de otros
miembros de la misma familia como modelos para estudiar su biología molecular. Uno de
estos miembros es el FCV, el cual fue el primer Calicivirus que pudo propagarse en cultivo
celular y del cual se tuvo un sistema de genética reversa.
Con el fin de estudiar a fondo la biología molecular de estos virus es indispensable
contar con las herramientas adecuadas; es por esto que el objetivo de este trabajo consiste
en expresar la proteína recombinante de cápside viral VP1 del FCV, con lo cual será posible
obtener anticuerpos específicos para su detección. Dado que las proteínas de las cápsides
virales tienen funciones adicionales a la encapsidación del genoma durante la replicación
viral, el uso de los anticuerpos para su detección en cultivos celulares permitirá estudiar su
interacción con otras proteínas, así como determinar funciones no descritas en el ciclo
replicativo.
Objetivos
General
Expresar a la proteína mayoritaria de cápside (VP1) del FCV en células competentes
Escherichia coli BL-21(DE3).
Particulares
1. Diseñar oligonucleótidos que amplifiquen la región que codifica para la proteína VP1
de la cepa urbana del FCV.
2. Clonar la proteína VP1 en el vector de tránsito pCR2.1-TOPO.
3. Subclonar a la región que codifica para la proteína VP1 en el vector de expresión
pGEX-5x-1 y corroborar su secuencia.
4. Expresar la proteína recombinante GST-VP1 en el vector de expresión para
procariontes pGEX-5x-1 usando células químicamente competentes E. coli BL-
21(DE3).
23
Metodología
I. Preparación de células competentes
Las células químicamente competentes para la propagación de los plásmidos utilizados
en el presente trabajo fueron Escherichia coli DH5-α y para la expresión del plásmido pGEX-
5X-1-VP1 se utilizaron las células BL-21(DE3), ambas fueron preparadas usando medio
SOB [Para 100ml: Bactotriptona 2g, Extracto de levadura 0,5g, NaCl 0.05g, KCl 250mM
1ml], Frozen Storage Buffer (FSB) [KCl al 100mM, CaCl2-2H2O al 50mM], Acetato de
Potasio al 1M pH 7.5 y Dimetil Sulfóxido (DMSO). El procedimiento fue el siguiente: Se
cultivó una colonia de E. coli DH5-α/BL-21(DE3) en 5ml de medio SOB, se incubó a
37°C/200rpm por 18h, los 5ml de cultivo se agregaron a 55ml de medio SOB estéril, se
incubó a 37°C/200rpm hasta alcanzar una DO de 0.4-0.6, posteriormente se dividió el
cultivo en 2 tubos falcon de 50ml y se centrifugó a 4,000 rpm por 15min a 4°C, cada pastilla
se resuspendió suavemente en 8ml de FSB frío y se incubaron 15min a 4°C, después se
centrifugó a 4,000 rpm/15min a 4°C, se volvió a resuspender suavemente la pastilla en 2ml
de FSB, se añadieron 70µL de DMSO y se incubó 5min a 4°C, se repitió el paso anterior
pero incubando 15min, finalmente se hicieron alícuotas de 100µL que fueron
inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y almacenadas a -80°C.
II. Transformación en células competentes DH5-α y BL-21(DE3) con los plásmidos de
interés
Todo el manejo de las células se realizó en condiciones de esterilidad. Las células
competentes se descongelaron en hielo, se mezcló el ADN plasmídico (clonación/ligación)
con los 100µL de células competentes y se incubó en hielo 30min, en un tubo eppendorf de
1.5ml se preparó el medio SOC agregando 450µL de medio SOB, 2.5µL de MgCl2 1M y 10
µL de Glucosa 1M; las células se sometieron a un choque térmico a 42°C por 90s en un
termoblock y enseguida se incubaron en hielo por 2min, la totalidad del vial de células
competentes se vació en un tubo eppendorf con medio SOC, se incubó a 37°C a 200rpm
por una hora y finalmente se sembró en placas de agar Luria [Caldo Luria 20g/L, agarosa
15g/L] con ampicilina (0.1mg/ml) como agente selector, incubándose a 37°C por 18 horas.
24
III. Extracción de ADN plasmídico (ADNp)
Se sembró una colonia obtenida en la transformación en 5ml de caldo Luria con
ampicilina (0.1mg/ml) y se incubó a 37°C con agitación de 200rpm por 18 horas. El cultivo
se centrifugó en tubos eppendorf de 1.5 ml a 14,000rpm por 2min, se descartó el
sobrenadante y se resuspendió la pastilla en solución de Stet [Sacarosa 8%, Tritón X-100
0.1%, EDTA 50mM, Tris-HCl 50mM pH8] 100 µL por cada 1.5ml de medio, y se adicionó
0.5 µL de ARNasa y 70 µg de lisozima por cada 1.5ml de medio; se mezcló por inversión,
se puso en baño maría por 2min, se centrifugó a la mismas rpm pero por 5min, con un palillo
estéril se eliminó el precipitado de proteínas (consistencia mucosa), se agregaron 100 µL
de isopropanol frío por cada 1.5ml de medio mezclando por inversión, y se hizo una
centrifugación final de 14,000rpm por 15min, se descartó el sobrenadante dejándose secar
la pastilla a temperatura ambiente y finalmente se resuspendió en agua destilada estéril
almacenándose a -20°C.
IV. Obtención del gen de VP1 mediante ensayo de PCR a partir de un plásmido con el
genoma completo de FCV- Urbana.
El ensayo de PCR fue realizado usando oligonucleótidos para la VP1 de FCV cepa
Urbana (Cuadro 1) diseñados específicamente para la posterior expresión en el vector para
células procariontes pGEX-5x-1. Los oligonucleótidos fueron diseñados manualmente a
partir de la secuencia de aminoácidos del precursor de la VP1 de FCV cepa Urbana
(Sosnovtsev & Green, National Center for Biotechnology Information, 2003), pero sin
considerar la secuencia líder de la cápside y agregando la secuencia de corte para las
enzimas de restricción necesarias para su clonación en el vector pGEX-5x-1 (SmaI para el
oligonucleótido sentido y NotI para el anti-sentido).
25
Cuadro 1. Secuencia nucleotídica de los oligonucleótidos para la proteína VP1 de FCV- Urbana
Nombre Secuencia 5’-3’ Enzima de
restricción
FW VP1
FCV
Urbana
GATGCCCCGGGTGCTGATGACGGATCCATAACTGCCC Sma I
RV VP1
FCV
Urbana
GATGCGCGGCCGCCTATAGTTTAGTCATTGTGCTCCTAAT Not I
Nota: El segmento resaltado en azul indica la secuencia de reconocimiento de las respectivas
enzimas de restricción.
Se agregaron 2µL de cDNA del plásmido pQ14, el cual contiene el genoma completo
del FCV-Urbana, a 23µL de una mezcla de PCR conteniendo 0.2 mM de oligonucleótidos
sentido: FW VP1 FCV Urbana y antisentido: RV VP1 FCV Urbana; 2.5µL de amortiguador
de la Taq polimerasa al 10X; dNTP’s 0.08mM (Jena Bioscience); 1U de Taq DNA
Polimerasa (Jena Bioscience). Las condiciones de la PCR en el termociclador Veriti ® 96
pozos de Applied Biosystems se muestran en el cuadro 2. Al terminar se cargó la reacción
en un gel de agarosa al 0.8% a 100V por 40min, donde el producto de PCR correspondiente
al gen de la VP1 es de 1632 pb.
Cuadro 2. Programa para la reacción de PCR con los oligonucleótidos FW VP1 FCV Urbana y RV VP1 FCV Urbana.
Etapa Temperatura Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 94°C 2’
Desnaturalización 94°C 30’’
35 Alineamiento 60°C 30’’
Extensión 72°C 1’ 30’’
Incubación final 72°C 10’
26
V. Clonación del gen que codifica para la proteína VP1 en el vector de tránsito pCR2.1-
TOPO.
La clonación del producto de PCR se realizó con el kit comercial de clonación TOPO®
TA de invitrogen en el vector de tránsito pCR2.1-TOPO (Anexo 1). La reacción se realizó
en un volumen final de 20µL conteniendo: 2µL del amplicón que contiene al gen de la
proteína VP1, solución de sales (NaCl 0.12M, MgCl2 6mM), amortiguador de PCR 1X, 10ng
de vector y 13µL de agua destilada estéril; y se dejó incubando a 4°C por 18h.
Las células competentes fueron transformadas con 2 y 5µL de la reacción de clonación,
sembrándose 100 µL por placa. Para determinar cuáles de las colonias tenían el inserto
deseado, se sembraron individualmente 10 colonias al azar, en tubos con 5ml de caldo
Luria con ampicilina. Se extrajo el ADNp y se determinó por PCR la presencia del plásmido
con la secuencia del gen de VP1, utilizando los oligonucleótidos FW VP1 FCV Urbana y RV
VP1 FCV Urbana y también los oligonucleótidos del vector pCR2.1-TOPO (M13 Forward
Primer y M13 Reverse Primer) (Anexo 1) por separado. Para las reacciones de PCR se
agregaron 50ng de ADNp a una mezcla de PCR de 9 µL con: 0.2 mM de primers FW VP1
FCV Urbana y RV VP1 FCV Urbana; 1µL de amortiguador de la Taq polimerasa al 10X;
dNTP’s 0.1mM (Jena Bioscience); 0.5 U Taq DNA Polimerasa (Jena Bioscience); y 0.1µg
de los oligonucleótidos M13 Forward Primer y M13 Reverse Primer del vector. Las
condiciones de la PCR utilizando un termociclador Veriti ® 96 pozos de Applied Biosystems
fueron: desnaturalización inicial a 94°C por 2 min; 35 ciclos de amplificación con
desnaturalización a 94°C por 30 s, alineamiento a 60°C para los oligonucleótidos de la VP1
y 55°C para los oligonucleótidos del vector por 30 s y extensión a 72°C por 1 min 30 s; y
una incubación final a 72°C por 10 min. Al terminar se cargó la reacción en un gel de
agarosa al 0.8% a 100V por 40min, donde el producto de PCR es de 1632pb para los
oligonucleótidos de VP1 o de 1797pb para los oligonucleótidos del vector.
Por otro lado, para corroborar la presencia del gen de VP1, los plásmidos obtenidos de
cada colonia se analizaron por una reacción de restricción con la enzima EcoRI (BioLabs)
donde se usaron 100ng de ADNp en una reacción de restricción de 20µL con: 2µL de Buffer
de enzima 10X y 2U de enzima EcoRI (BioLabs). Se incubó a 37°C por una hora y se corrió
un gel de agarosa 0.8% a 100V por 40min. El producto de restricción esperado fue una
banda de 1,643pb para el gen de la VP1 y una de 2,267pb para el vector vacío.
27
VI. Subclonación de la proteína VP1 en el vector de expresión pGEX-5x-1.
Para la clonación del gen de la proteína VP1 en el vector de expresión pGEX-5x-1
(Anexo 2) se amplificó el gen de VP1 mediante una reacción de PCR a partir de la clona 4
(T4) conteniendo el plásmido pCR2.1-TOPO-VP1. Para ello, se agregaron 20ng de ADNp
a una mezcla de PCR de 25 µL con: 0.2 mM de oligonucleótidos FW VP1 FCV Urbana y
RV VP1 FCV Urbana; 2.5µL de amortiguador de la Taq polimerasa al 10X; dNTP’s 0.08mM
(Jena Bioscience); 1U de Taq DNA Polimerasa (Jena Bioscience). Las condiciones de la
PCR en el termociclador Veriti ® 96 pozos de Applied Biosystems fueron: desnaturalización
inicial a 94°C por 2 min; 35 ciclos de amplificación con desnaturalización a 94°C por 30 s,
alineamiento a 60°C 30 s y extensión a 72°C por 1 min 30 s; y una incubación final a 72°C
por 10 min. El producto de amplificación se analizó por electroforesis en un gel de agarosa
al 0.8% con 2µL de cada reacción y como control positivo el plásmido con el genoma de
FCV Urbana.
Este ensayo de PCR se realizó por triplicado para concentrar el amplicon, al final se
obtienen 69µL del producto de amplificación, los cuales se purificaron mediante el PCR
Purification Kit de Jena Bioscience y se eluyó en un volumen final de 50µL de agua destilada
estéril.
Para realizar la reacción de ligación entre el gen de la VP1 y el vector de expresión
pGEX-5x-1, primero se realizó la reacción de restricción, al vector de expresión y al
amplicón, con las enzimas seleccionadas SmaI y NotI. Para el amplicón se usaron 45µL del
producto de PCR con 2U de NotI HF (alta fidelidad) de BioLabs en una mezcla de reacción
de 25µL con: BSA al 1X y amortiguador de la enzima al 1X, y se incubó a 37°C por 18 horas;
se purificó con el PCR Purification Kit y se eluyó en 50µL de agua destilada estéril; se realizó
la segunda restricción con Sma I (Jena Bioscience) agregándose 47µL de la purificación en
una mezcla de restricción de 23µL con: 10U de la enzima y amortiguador de la enzima al
1X, se incubó a 25°C por 2 horas. Para el vector de expresión pGEX-5x-1, se realizó la
restricción con NotI HF usando 1µg del plásmido en una mezcla de reacción de 45µL con:
amortiguador de la enzima al 1X, BSA al 1X y 2U de enzima; se purificó con el PCR
Purification Kit siendo eluido en 25µL de agua destilada estéril; se realizó la restricción con
Sma I usando 23µL de la purificación en una mezcla de reacción de 27µL con: amortiguador
de la enzima al 1X y 2U de enzima. Para la purificación final de ambos productos, se hizo
un gel con agarosa de bajo peso molecular al 0.8% donde se cargó la totalidad de las
reacciones de restricción y se corrió a 100V por 40min; la purificación se realizó mediante
el QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN) eluyéndose en un volumen final de 30µL de agua
28
destilada estéril. Se corrió una electroforesis en gel de agarosa al 0.8% a 100V por 40min,
cargándose 100ng del vector PGEX-5X-1 y de la VP1 purificados.
La ligación se realizó ensayando tres relaciones vector:inserto (A=1:1, B=1:2 y C=1:3)
usando 100ng de vector como base y se realizó un control de fondo (ligación del vector
solo). Las reacciones se llevaron a un volumen final de 20µL conteniendo amortiguador de
la enzima al 1X y 1U de T4 DNA ligasa (Fermentas), se incubó a 4°C por 72 horas.
Las células competentes DH5-α fueron transformadas con 2µL de la reacción de
ligación, sembrándose 70µL por placa. Para determinar cuáles colonias tenían el inserto
deseado en el vector de expresión, se sembraron individualmente 5 colonias al azar de
cada transformación en 5ml de caldo Luria con ampicilina. Se extrajo el ADNp, se cargaron
2µL de cada clona en un gel de agarosa al 0.8%. La electroforesis se corrió a 100V por
30min. Se determinó por restricción, con la enzima EcoRI, la presencia del gen de VP1 en
el vector pGEX-5x-1; para esto, se usaron 50ng de plásmido en una mezcla de reacción de
16µL con: amortiguador de la enzima al 1X y 2U de enzima, siendo incubada a 37°C por 18
horas. Las reacciones se cargaron en un gel de agarosa al 0.8% que se corrió a 100V por
50min.
VII. Expresión de la proteína VP1.
A partir del vector de expresión pGEX-5x-1, se expresó la proteína VP1. Para ello se
transformaron células competentes BL-21(DE3) con 100ng de ADN del plásmido pGEX-5x-
1-VP1 obtenido de las clonas B1, B2, B3, B5, C2 y C5. Se sembró una colonia de cada
clona en 5ml de caldo Luria y se incubaron a 37°C, 200rpm de agitación por 18 horas. Dos
ml de cada cultivo se inocularon en un tubo de 10ml de caldo Luria estéril, y se incubaron
a 37°C hasta alcanzar una densidad óptica (DO) de 0.5-0.6, a continuación, se tomó una
alícuota de 1ml antes de inducir (NI), se agregó el inductor (IPTG) a una concentración de
0.1mM y se tomaron alícuotas de 1ml en los tiempos: 1h, 2h, 3h, 4h y 5h. En cada tiempo,
las alícuotas se centrifugaron a 14,800rpm por 5 min, se eliminó el sobrenadante, se les
agregó 20µL de amortiguador de muestra para proteínas 2X [1ml de solución D, 2ml de
solución C, 100µL de β-mercaptoetanol, 6ml de glicerol, 8ml de agua, 100µL de azul de
bromofenol al 1%] y se hirvieron por 10min.
Se preparó un gel de acrilamida al 10% (Anexo 4) por cada clona, se cargaron 20µL de
las alícuotas (NI, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h), se sometieron a electroforesis a 100V por 2 horas, se
tiñeron. Los geles se tiñeron con solución de coomassie [azul de coomassie R-250 0.2%,
metanol 50% y ácido acético 7%] por 10min en agitación leve, se retiró el coomassie y se
29
agitó con amortiguador de desteñido [metanol 30% y ácido acético 7%] por 10 min
repitiendo el lavado hasta desteñir completamente. Con esto se reveló una banda de 85kDa
en las horas post-inducción de las clonas 2, 3 y 5 correspondiente a la proteína
recombinante VP1(~60kDa) unida a la proteína bandera Glutation S- transferasa (GST) de
25kDa.
VIII. Secuenciación
Se sembró una colonia de las clonas 2 y 5 con el plásmido pGEX-5X-1-VP1 en 10ml de
caldo Luria y se incubó por 14 horas a 37°C con una agitación de 200rpm. Se extrajo el
ADNp de ambas clonas mediante el kit de extracción de Bio Basic llamado Miniprep®. El
ADNp se eluyó en un volumen final de 150µL obteniéndose una concentración final de
25ng/µL.
El gen de la proteína VP1 se mandó a secuenciar al Laboratorio de Genética Bioquímica
(LAGENBIO) usando los oligonucleótidos FW VP1 FCV Urbana y RV VP1 FCV Urbana. El
análisis bioinformático se realizó mediante el programa CLC Main Workbench 7.7.3 y para
el análisis BLAST se utilizó la herramienta disponible en el National Center for
Biotechnology Information (NCBI).
IX. Ensayo de western blot.
Con el fin de determinar si la proteína recombinante era almacenada en cuerpos de
inclusión dentro de la célula o en el sobrenadante del lisado celular, se procedió a hacer
una cinética de inducción en mayor volumen (50ml de caldo Luria) deteniéndola en el tiempo
de mayor inducción para cada clona (4h para la clona 2 y 5h para la 5). Se tomaron alícuotas
de 1ml antes de la inducción y al finalizar la inducción; se les dio el mismo tratamiento del
punto VII para la cinética de inducción y se corrieron en un gel de poliacrilamida al 8% el
cual fue teñido con solución de coomassie. Al término de la inducción, cada cultivo se dividió
en dos tubos falcon de 50ml estériles y fueron centrifugados a 5,000 rpm por 15 minutos.
Se eliminó el sobrenadante y la pastilla celular fue guardada a -20°C.
La pastilla correspondiente a cada clona, se lisó por sonicación de la siguiente forma:
la pastilla celular se resuspendió en 2ml de PBS, se le adicionaron 1mg de lisozima y 5µL
de inhibidor de proteasas, y se incubó por 30 minutos en hielo. Para realizar la sonicación,
se programó el equipo SONICS Vibra Cell TM con 8 pulsos de 10 segundos de sonicación
alternado con 10 segundos de incubación en hielo, a una amplificación de 100%; una vez
30
que la suspensión se clarificó, se hicieron alícuotas de 1ml y se centrifugó el lisado celular
a 14,800rpm/4°C por 15 minutos; se recuperaron por separado la pastilla y el sobrenadante.
La pastilla fue resuspendida en 10µL de PBS, se le adicionaron 40µL de amortiguador
de muestra de proteínas 2X y se sometió a baño maría por 15 minutos. Se tomaron 20, 30
y 40µL del sobrenadante y se le adicionaron 10, 10 y 7µL de amortiguador de muestra de
proteínas al 2X, respectivamente, se sometieron a baño maría por 5 min. Las muestras se
cargaron en un gel de poliacrilamida al 8% el cual fue sometido a electroforesis por 1h y
45min y después fue teñido con solución de coomassie como ya se describió.
A continuación, se hizo otro gel de poliacrilamida al 8% donde se cargó una muestra no
inducida y otra con 30µL de sobrenadante de cada clona y se sometió a electroforesis. El
gel se transfirió a 12V por 1h en una cámara semi-húmeda con amortiguador de
transferencia [Tris base 5.82g, glicina 2.92g, metanol 100ml, agua bidestilada para aforar a
1L]. La membrana se bloqueó por dos horas con leche al 5% en TBS-Tween 1X [Trisma
base 100mM pH8, NaCl 1.5M, Tween-20 0.5%], se le hicieron 3 lavados de 10 min con
TBS-Tween, después se incubó con el anticuerpo primario (α-GST de ratón) en una dilución
1:5000 en 5% de leche en PBS-Tritón 1X [KH2PO4 1.8mM, Na2HPO4 2mM, NaCl 137mM,
KCl 2.7mM, Tritón X-100 1%] a 4°C por 17 horas, al terminar la primera incubación, se le
hicieron 3 lavados de 10 min y se incubó con el anticuerpo secundario (HRP α-ratón) en
una dilución 1:5000 en 2% de leche en PBS-Tritón a temperatura ambiente por dos horas;
finalmente se hacen tres lavados de 10 min.
Se preparó la solución de trabajo para el sustrato de máxima sensibilidad de Thermo
Scientific SuperSignalTM West Femto mezclando partes iguales de la Solución Estable de
Peróxido y de la Solución Potenciadora/Luminol. Se incubó la membrana con la solución de
trabajo por 1min, se retiró el exceso de la solución de trabajo y se colocó la membrana en
una mica protectora y se eliminaron las burbujas. En condiciones de obscuridad, la
membrana se expuso a una placa radiográfica sensible a la luz.
31
Resultados y Discusión
Clonación del gen que codifica para VP1 en el vector pCR2.1-TOPO
Las proteínas de la cápside de los virus, además de contener el genoma viral para
formar los viriones, poseen otras funciones relacionadas con la replicación viral. Para
determinar su localización subcelular y su función, es indispensable contar con
herramientas para su detección. Por esta razón en este trabajo, se clonó y expresó a la
proteína mayoritaria de la cápside o VP1 del FCV, que servirá para determinar las
interacciones con proteínas virales y celulares, y también como antígeno para obtener
anticuerpos para su detección utilizando técnicas de western blot e inmunofluorescencia.
Para ello inicialmente se diseñó un par de oligonucleótidos con los que se amplificó
el gen completo que codifica a la proteína mayoritaria de cápside VP1 del FCV cepa Urbana
a partir del plásmido pQ14 que contiene el genoma completo del FCV cepa Urbana (Figura
6. Carril derecho).
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de 1632pb correspondiente al gen de la proteína VP1 del FCV-Urbana. En el extremo izquierdo se muestra el marcador de tamaño molecular.
32
Este amplicón, fue clonado en el vector de tránsito pCR2.1-TOPO, y su presencia
fue corroborada mediante su amplificación por PCR mediante el uso de los oligonucleótidos
específicos FW VP1 FCV Urbana y RV VP1 FCV Urbana, así como los oligonucleótidos
específicos del sitio múltiple de clonación (SMC) del vector pCR2.1-TOPO: M13 Forward
Primer y M13 Reverse Primer (Anexo 1), proporcionados en el kit de clonación, con el fin
de elegir las clonas por medio de una doble selección positiva. En la figura 7 se puede
observar la presencia de una banda de 1632pb en las clonas 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8 y 9 del panel
derecho. Sin embargo, cuando se utilizaron los oligonucleótidos que se unen a la región del
vector, el producto de amplificación de 1797pb (VP1+SMC) solamente se observó en las
clonas 1, 2, 4, 8, 9 y 10. Por lo tanto, las clonas positivas fueron la 1, 2, 4, 8 y 9.
Figura 7. Clonación del gen de la proteína VP1 del FCV en el vector de tránsito pCR2.1-TOPO. El gen VP1 del FCV fue clonado en el plásmido pCR2.1-TOPO. Las clonas candidatas fueron sometidas a una reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos de VP1 (panel derecho) y del pCR2.1-TOPO (panel izquierdo). Los productos de amplificación de 1632 y 1797pb de las clonas positivas obtenidos con cada par de oligonucleótidos respectivamente, se analizaron por electroforesis en geles de agarosa al 0.8% y se señalan con un asterisco. Los marcadores de tamaño molecular se muestran en el carril de la extrema izquierda de cada gel (MTM).
Las clonas negativas para el plásmido pCR2.1-TOPO-VP1 obtenidas en el ensayo
de PCR pudieron generarse debido a una baja eficiencia de corte de una o ambas enzimas
de restricción. Una baja eficiencia de corte provoca que cierta cantidad del vector este
cortado únicamente por una enzima, por lo que es capaz de re-ligarse manteniendo su
capacidad de resistencia a la ampicilina, lo cual le permite a la bacteria crecer en el medio
de selección.
33
Restricción del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1
Para confirmar que el gen de la proteína VP1 del FCV se encontraba presente en el
plásmido pCR2.1-TOPO-VP1, se llevó a cabo una reacción de restricción con una enzima
que cortara al vector de tránsito en dos sitios, liberando al fragmento clonado. En el mapa
de restricción del vector pCR2.1-TOPO (Anexo 1) se detectó que este contiene dos sitios
de restricción para la enzima EcoRI dentro del SMC. Por otro lado, se analizó la secuencia
del gen de la VP1 mediante la herramienta bioinformática NEBcutter V2.0 disponible en
línea dentro de la página de BioLabs (Anexo 3) y se encontró un sitio de restricción para
esta enzima en la posición 1578/1582 por lo que el producto generado durante la restricción
es de 1589pb para la VP1, de 3883pb para el vector pCR2.1-TOPO vacío y 60pb para el
residuo el cual no es visible en el gel por su tamaño tan pequeño (Figura 8).
Figura 8. Restricción enzimática con EcoRI del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1. Las clonas candidatas fueron sometidas a una reacción de restricción utilizando la enzima EcoRI. Panel Derecho: El producto de restricción de 1589pb correspondiente al gen de la VP1, se analizó por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% y se señala con una flecha. Como control negativo se incluyó la clona 10. El marcador de tamaño molecular se muestra en el carril de la extrema izquierda del gel. Panel Izquierdo: Diagrama representativo de la restricción con EcoRI del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1.
34
Del análisis de restricción de las clonas 1, 2, 4, 8, 9 y 10 encontramos que las clonas
1, 2, 4, 8 y 9 liberaron el inserto esperado de 1589pb, lo cual confirma que estas clonas
contienen al gen de VP1 tanto por PCR como por restricción enzimática.
Por otro lado, para el caso de la clona 10, se obtuvo en el ensayo de PCR un
resultado positivo con los oligonucleótidos del vector pCR2.1-TOPO y un resultado negativo
con los oligonucleótidos para el gen de la proteína VP1. En el ensayo de restricción no se
observó liberación de ningún fragmento, lo que confirma que no contenía el gen de VP1,
por lo tanto, fue un falso positivo con los oligonucleótidos del vector.
Clonación del gen que codifica para la proteína VP1 en el vector de expresión
pGEX-5X-1
Para la clonación del gen de la VP1 en el vector de expresión pGEX-5x-1, primero se intentó
obtener al gen de la VP1 del vector de tránsito pCR2.1-TOPO por restricción con las
enzimas SmaI y NotI, sin embargo, a pesar de ensayarse diferentes relaciones
vector:inserto en la ligación, de probar diferentes marcas de ligasa, de cambiar las
condiciones de incubación para la ligación y el método de purificación, no fue posible clonar
el gen de la VP1 en el vector de expresión; es por esto que se recurrió a un segundo método
para lograrlo.
El amplicon del gen de VP1 obtenido por medio de una reacción de PCR del plásmido
pCR2.1-TOPO-VP1 perteneciente a la clona 4 (Figura 9) fue sometido a una doble
restricción con las enzimas NotI y SmaI al igual que el vector de expresión pGEX-5x-1,
seguido de una purificación, para poder ser ligados (Figura 10. Carril 1: Vector, Carril 2:
Amplicon).
35
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del producto de PCR de 1632pb correspondiente al gen de la proteína VP1 obtenido a partir del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1 perteneciente a la clona 4. En los carriles 1, 2 y 3 se ilustran los triplicados de la PCR y en el último carril se muestra el control positivo (C+) el cual es el plásmido conteniendo el genoma completo del FCV-Urbana. En el extremo izquierdo se muestra al marcador de tamaño molecular en pb.
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del vector pGEX-5X-1 y el amplicon del gen de VP1. El vector de expresión pGEX-5x-1 (4.9kb) y el amplicon del gen de VP1 (1632pb) fueron cortados con las enzimas con NotI y SmaI para su posterior ligación. Se muestra el vector pGEX-5X-1 de 4900pb (carril 1) y el amplicon de VP1 de 1632 pb (carril 2) cortados y purificados. En el extremo izquierdo se muestra el marcador de tamaño molecular de 1Kb.
36
Una vez preparados el vector de expresión pGEX-5X-1 y el amplicon del gen
codificante para la proteína VP1, se procedió a realizar la ligación utilizando las relaciones
vector:inserto indicadas en el cuadro 3, donde la cantidad de vector fue constante (100ng).
Cuadro 3. Relaciones vector:inserto utilizadas para la ligación.
Código Relación
A 1:1
B 1:2
C 1:3
Se sembró una placa de agar LB con ampicilina por cada ligación transformada en
células E. coli DH5-α, las clonas fueron nombradas de acuerdo al código de letras mostrado
en el cuadro 3. En el fondo se observó un crecimiento de 10 colonias (Figura 11. Panel 4),
mientras que en las transformaciones con las ligaciones A, B y C se observó un crecimiento
de 37, 42 y 50 colonias respectivamente (Figura 11. Panes 1, 2 y 3). De cada ligación se
escogieron 5 clonas al azar, a las cuales se les extrajo el ADNp.
La presencia de fondo indica que la eficiencia de corte de las enzimas no fue del
100%, sin embargo, considerando que la cantidad de colonias obtenidas en la
transformación de las ligaciones fue en promedio de 43 colonias, el fondo indica que un
37
23% de las colonias presentes contienen el vector pGEX-5X-1 vacío y el 77% tienen el
plásmido pGEX-5X-1-VP1.
Figura 11. Colonias obtenidas de células competentes DH5-α transformadas con las reacciones de ligación. Células competentes DH5-α fueron transformadas con 2µL de reacción de ligación y sembradas en plagas de agar Luria con ampicilina (1mg/ml). En el panel 1, 2 y 3 se muestran las colonias obtenidas con las ligaciones A, B y C, respectivamente. En el panel 4 se muestra la prueba de fondo donde se realizó la ligación del vector sin inserto.
Del ADNp de las clonas obtenidas a partir de la ligación de VP1 con el vector de
expresión pGEX-5x-1 se analizó por electroforesis en geles de agarosa para seleccionar
las clonas candidatas (figura 12) donde se observa que el ADNp superenrrollado de las
clonas B1, B2, B3, B5, C2 y C5 tiene un mayor tamaño, por lo que es posible que contengan
38
en gen de la VP1. Por lo tanto, se seleccionaron las clonas B1, B2, B3, B5, C2 y C5 como
posibles positivas y las clonas A2, A3, A4, A5 y C1 como posibles negativas.
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa al 0.8% del ADN plasmídico de las clonas candidatas obtenidas de la ligación del gen VP1 y el vector de expresión pGEX-5x-1. La relación vector:inserto usada en la ligación se representa con las letras A: 1:1; B: 1:2, C:
1:3.
Todas las clonas seleccionadas fueron sometidas a una reacción de restricción con
la enzima EcoRI ya que ésta corta al vector de expresión pGEX-5x-1 en el sitio 942/946 y
al gen de VP1 en el sitio 1578/1582, liberando el fragmento (Figura 13. Panel derecho). En
la figura 13. Panel izquierdo se puede observar que en el grupo de clonas con mayor
migración electroforética (extremo izquierdo) no hay liberación del inserto, mientras que en
las de menor migración (extremo derecho) se encuentra presente la banda de 1585pb
correspondiente al gen de la VP1.
39
Figura 13. Clonación del gen de la proteína VP1 en el vector de expresión pGEX-5x-1. El gen VP1 del plásmido pCR2.1-TOPO-VP1 fue clonado en el plásmido de expresión pGEX-5x-1. Panel Derecho: De las clonas candidatas analizadas, las clonas B1, B2, B3, B5, C2 y C5 resultaron positivas a la presencia del gen dela VP1, y las clonas A2, A3, A4, A5, C1 resultaron negativas mediante una reacción de restricción con la enzima EcoRI. Los productos de restricción de 4947pb y 1585pb corresponden al vector pGEX-5x-1 vacío y al gen de la VP1 respectivamente. Como control de restricción se usó el plásmido circular de las clonas A2 y C2 pertenecientes al grupo de posibles negativas y positivas respectivamente, señalándose con un (*). En el extremo izquierdo se muestra el marcador de tamaño molecular. Panel Izquierdo: Se muestra un diagrama representativo de la restricción con EcoRI en el plásmido pGEX-5X-1-VP1.
Con esto se determinó que con la relación de vector : inserto de 1:2 se obtuvo mayor
número de clonas positivas, seguido por la relación 1:3, mientras que usando una relación
1:1 no se obtuvo ninguna clona positiva. Este resultado implica que es necesario usar, al
menos, una cantidad del doble de inserto que de vector para tener una buena eficiencia de
ligación con fragmentos de los tamaños utilizados en este protocolo.
Dado que en una reacción de PCR se obtiene una gran cantidad ADN amplificado,
a diferencia de la cantidad que se puede obtener aislando a partir de un plásmido, este
hecho podría ser la razón por la cual fue posible realizar la clonación a partir de un amplicon
del gen de VP1 obtenido por PCR y no por el aislado del plásmido pCR2.1-TOPO.
40
Expresión de la proteína recombinante GST-VP1 en células BL-21
Dentro del vector pGEX-5x-1, el gen de la proteína VP1 (60kDa) quedó fusionada al
gen de la proteína Glutation S- transferasa (GST) con un peso de 25kDa, por lo que el peso
esperado de la proteína recombinante es de 85kDa. En el caso de éste vector de expresión,
la bandera se encuentra en el extremo amino-terminal de la proteína VP1. Una de las
ventajas de colocar la bandera en el extremo amino-terminal, es que la construcción puede
tomar ventaja de la eficiencia de los sitios de inicio de la traducción de la bandera. Otra
ventaja es que la bandera puede ser eliminada más limpiamente, dado que las
endoproteasas cortan sobre o cerca del extremo carboxilo-terminal de sus sitios de
reconocimiento, revisado en: (Malhotra, 2009). En el caso de la GST clonada de
Schistosoma japonicum, se ha observado que promueve la solubilidad y la expresión como
proteína bandera en el extremo amino-terminal (Smith & Johnson, 1988).
El plásmido pGEX-5x-1-VP1 de las clonas B1, B2, B3, B5, C2 y C5 se utilizó para
transformar células competentes BL-21(DE3), las cuales son óptimas para la expresión de
proteínas por ser deficientes de la proteasa Lon, que degrada muchas proteínas foráneas,
y de la proteasa ompT, la cual es una proteasa externa de membrana cuya función es
degradar proteínas extracelulares.
A partir de éste punto, las clonas fueron renombradas de acuerdo a la nomenclatura
del cuadro 4, con la cual serán referidas en el resto del presente trabajo.
Cuadro 4. Cambio de nomenclatura de las clonas positivas para el plásmido pGEX-5x1-VP1, para ser usadas durante la cinética de expresión de la proteína recombinante GST-
VP1.
Código anterior B1 B2 B3 B5 C2 C5
Código nuevo 1 2 3 4 5 6
Para realizar la cinética de inducción, una colonia de las clonas 2, 3 y 5 fue cultivada
en 5ml de caldo Luria por 16h a 37°C y con agitación de 200rpm para después usarse como
inóculo en 50ml de caldo Luria estéril. El cultivo fue inducido con IPTG a una concentración
de 0.1mM al alcanzar una DO de 0.569, 0.614 y 0.593, respectivamente, mientras que al
resto de las clonas se cultivaron de la misma manera, pero fueron inducidas dentro de un
rango de 0.6-0.62 (Cuadro 5).
41
En la figura 14 panel B y E, correspondiente a las clonas 2 y 5, se observa una
sobreexpresión de la proteína VP1-GST presentándose una máxima acumulación a las 4 y
5 horas respectivamente, por otro lado, en la figura 14 panel C se observa una única banda
sobreexpresada a las 4 horas.
Cuadro 5. Densidad óptica alcanzada para comenzar la inducción con IPTG de las clonas 1-6 positivas para el plásmido pGEX-5x-1-VP1.
Clona Densidad óptica (600nm)
1 0.570
2 0.569
3 0.614
4 0.603
5 0.593
6 0.600
42
Figura 14. Cinética de inducción de la proteína VP1 recombinante en células competentes E.coli BL-21 en geles de acrilamida al 10%. El plásmido pGEX-5x-1-VP1 de las 6 clonas positivas se utilizó para transformar células competentes E. coli BL-21(DE3). La cinética de inducción se realizó bajo 0.1mM de IPTG y duró 5 horas. A) Clona 1, B) Clona 2, C) Clona 3, D) Clona 4, E) Clona 5, F) Clona 6. Se observa una banda de 85kDa sobreexpresada en las clonas 2, 3 y 5. En el extremo izquierdo se señala el marcador de peso molecular (MPM); el primer carril contiene la alícuota pre-inducción (NI) y los carriles subsecuentes las alícuotas de las horas 1, 2, 3, 4 y 5 post-inducción.
43
Análisis de la secuenciación
La secuencia del gen de la proteína VP1 de las clonas 2 y 5 se sometió a un análisis
bioinformático; primero se compararon con el genoma completo de la cepa Urbana del FCV
mediante el programa BLAST en la página del NCBI.
La herramienta de BLAST realiza un alineamiento de secuencia de manera local
comparando una secuencia problema con la base de datos del NCBI, así mismo nos
proporciona el porcentaje de identidad de la secuencia problema con respecto a las
secuencias objetivo; la identidad se refiere a la coincidencia total entre dos secuencias. En
el cuadro 6 se muestra el porcentaje de identidad obtenido para la secuencia derivada del
oligonucleótido FW y RV en cada clona.
Cuadro 6. Porcentaje de identidad de la secuenciación de las clonas 2 y 5 contra la secuencia del genoma del FCV cepa Urbana.
CLONA OLIGONUCLEÓTIDO % IDENTIDAD
2 FW VP1 FCV Urbana 96
RV VP1 FCV Urbana (RC) 97
5 FW VP1 FCV Urbana 96
RV VP1 FCV Urbana (RC) 97
*RC: se utilizó la secuencia reversa complementaria
En este caso, el porcentaje de identidad obtenido para ambas clonas fue del 97%,
lo que indica que la probabilidad de que la secuencia clonada en el vector de expresión sea
la misma que la reportada para el FCV Urbana es muy alta.
Así mismo, se realizó un alineamiento múltiple en el programa CLC Main Workbench
7.7.3: primero se realizó un alineamiento entre las secuencias derivadas de la amplificación
de ambos oligonucleótidos de cada clona con la secuencia de la VP1 del FCV-Urbana, de
este alineamiento se obtuvo una “secuencia consenso” para cada clona; a continuación, se
realizó otro alineamiento entre las secuencias consenso de cada clona con la secuencia de
la VP1 del FCV-Urbana (Anexo 5), a partir de este alineamiento se identificaron dos
44
mutaciones en las posiciones 159 y 987 donde hay un cambio de CxT y de AxG,
respectivamente (figura 15).
Figura 15. Mutaciones presentes en las secuencias del gen de VP1 del FCV-Urbana clonadas en el vector de expresión pGEX-5X-1. En el panel superior se encuentra una mutación en la posición 159 de una CxT y en el panel inferior una segunda mutación en la posición 987 de una AxG. Obtenido mediante alineamiento múltiple de nucleótidos en el programa bioinformático CLC Main Workbench 7.7.3.
Para determinar si estas mutaciones generaban un cambio de aminoácido o eran
silenciosas, se realizó la traducción de las secuencias consenso y de la secuencia de VP1
del FCV-Urbana, y se hizo otro alineamiento múltiple usando el mismo programa (Anexo
6). De este análisis se observa que las mutaciones en los nucleótidos fueron silenciosas
(figura 16) ya que el triplete que corresponde a la posición nucleotídica 159 del gen de la
VP1 del FCV-Urbana es AAC y la mutación en las clonas 2 y 5 genera el triplete AAT, y
ambos tripletes codifican para el aminoácido asparagina (N) del residuo 53; de igual modo,
el triplete correspondiente a la posición nucleotídica 987 del gen de la VP1 del FCV-Urbana
es GCA y la mutación en las clonas 2 y 5 genera el triplete GCG, ambos codifican para la
alanina (A) del residuo 329.
45
Figura 16. Alineamiento múltiple de las secuencias de aminoácidos del gen de VP1 clonado en el vector de expresión pGEX-5X-1 y de la VP1 del FCV-Urbana. En el panel superior se observa que la mutación nucleotídica en la posición 159 de las clonas 2 y 5 codificó para una asparagina (N) (residuo 53) lo que resultó en una mutación silenciosa, al igual que la mutación nucleotídica en la posición 987 que codificó para una alanina (A) (residuo 329). Alineamiento realizado en el programa CLC Main Workbench 7.7.3.
Una vez realizado este análisis bioinformático, se corrobora que la secuencia
clonada en el vector pGEX-5X-1 de las clonas 2 y 5 es efectivamente el gen de la proteína
VP1 de la cepa Urbana del FCV y que se encuentra conservada.
Niveles de expresión y Localización de la proteína recombinante GST-VP1
Con el fin de obtener una mayor cantidad de la proteína recombinante GST-VP1, se
realizó una inducción para las clonas 2 y 5 en un volumen mayor (50ml). Las densidades
ópticas alcanzadas antes de comenzar la inducción se muestran en el cuadro 7; tomándose
alícuotas antes de la inducción y al tiempo de mayor expresión observado en la cinética
anterior, con el fin de corroborar la expresión de la proteína de interés (Figura 17).
Comparando las OD de la clona 2 en ambas inducciones, se registra una mayor
expresión con el segundo valor; en el caso de la clona 5 se tiene una mayor expresión con
el primer valor (cuadro 5 y 7; figura 14 y 17). Estos dos valores son prácticamente iguales
(0.592 para la clona 2 y 0.593 para la clona 5), lo que indica que si la OD con la que se
induce la expresión es menor a 0.59 o mayor a 0.6, la expresión de la proteína recombinante
GST-VP1 decae significativamente. Este hecho es muy importante para este trabajo, ya
que de acuerdo al proveedor del vector de expresión pGEX-5X-1 los valores de OD
46
recomendados para la inducción están en el rango de 0.6-1.0. En nuestro caso este rango
no se cumple, posiblemente porque la proteína recombinante GST-VP1 sea altamente
tóxica para la bacteria.
Cuadro 7. Densidad óptica alcanzada en el cultivo de 50ml antes de comenzar la inducción para la expresión de la proteína recombinante GST-VP1
Clona Densidad óptica (600nm)
2 0.592 5 0.618
Figura 17. Expresión de la proteína recombinante GST-VP1 en células competentes E. coli BL-21 a partir del plásmido pGEX-5x-1-VP1 de las clonas 2 y 5 en un gel de acrilamida al 10%. Se realizó una segunda inducción para las clonas 2 y 5 en un volumen de 50ml de medio Luria. Las horas de máxima inducción registradas para la Clona 2 y Clona 5 en la figura anterior fueron 4 y 5 horas respectivamente. La banda de 85kDa correspondiente a la proteína GST-VP1 se encuentra señalada por un rectángulo rojo. En el extremo izquierdo de la figura se señala el marcador de peso molecular en kDa; el primer y tercer carril contienen la alícuota pre-inducción de la clona 2 y 5 respectivamente, el segundo y cuarto carril contienen la alícuota de los tiempos de máxima inducción de ambas clonas (4 y 5 horas respectivamente).
La expresión de proteínas recombinantes tiende a saturar la maquinaria celular de
plegado de proteínas, resultando frecuentemente en el encauzamiento incorrecto del
polipéptido heterólogo en agregados que se acumulan como cuerpos de inclusión en
células procariotas (Ventura & Villaverde, 2006). Estos agregados proteínicos son
47
usualmente insolubles y metabólicamente estables bajo condiciones fisiológicas. Cuando
la proteína recombinante se acumula en estos cuerpos de inclusión, el proceso de
purificación se vuelve más problemático.
Es por esta razón que, con la finalidad de determinar si la ubicación de la proteína
recombinante era el citoplasma celular o había sido almacenada en cuerpos de inclusión,
se realizó la lisis celular por sonicación, la cual se centrifugó, y se analizó por SDS-PAGE
la pastilla y el sobrenadante en carriles separados.
Por un lado, en la figura 18 no se observa ninguna banda a la altura de 85kDa en
los extractos de la pastilla (P), indicando que la proteína recombinante no se encuentra
acumulada en cuerpos de inclusión, mientras que en los extractos del sobrenadante (a-c)
si hay presencia de bandas; esto indica que la proteína recombinante GST-VP1 permanece
como una proteína soluble en el citoplasma celular. Sin embargo, se observan dos bandas
entre los marcadores de 75 y 100kDa en los extractos del sobrenadante, por lo que no es
posible identificar cuál de ellas corresponde a la proteína recombinante GST-VP1
basándonos sólo en este ensayo.
Figura 18. Determinación de la localización de la proteína recombinante GST-VP1 en el sobrenadante de los cultivos de E. coli BL-21(DE3) transformadas con el plásmido pGEX-5X-1-VP1. Las células obtenidas después de la inducción fueron lisadas por sonicación y centrifugadas. El agregado celular resultante, así como el sobrenadante fueron utilizados en este ensayo. Los primeros 4 carriles pertenecen a extractos de la clona 2, mientras que
48
los siguientes 4 son extractos de la clona 5. Para ambas clonas: Los carriles con la letra P representan los extractos proteínicos recuperados de la pastilla residual de la lisis celular, en los cuales no se observa ninguna banda a la altura de 85kDa. Por otro lado, los carriles con las letras a, b y c, contienen los extractos obtenidos del sobrenadante de la lisis celular en donde se cargaron 20, 30 y 40µL, respectivamente. Las posibles bandas correspondientes a la proteína recombinante GST-VP1 se señalan con unas flechas. En el extremo izquierdo se indican los marcadores de peso molecular (MPM) en kDa.
Para identificar la banda correspondiente a la proteína recombinante GST-VP1 se
procedió a realizar un ensayo de western blot utilizando anticuerpos contra la etiqueta de
GST. Dado que utilizando 30 o 40 µL del sobrenadante se observa la misma intensidad en
las bandas, se decidieron cargar 30µL de sobrenadante en el gel para ambas clonas. La
detección de la proteína se realizó mediante el uso de anticuerpo de ratón contra GST
(proteína bandera). En el western blot mostrado en la figura 19, se utilizaron como controles
negativos (NI) los extractos no inducidos de las clonas 2 y 5; en este ensayo se observa
claramente una banda ligeramente debajo del marcador de 100kDa en el sobrenadante de
la clona 2. Esto indica que la banda correspondiente a la proteína recombinante GST-VP1
es la que está en la parte superior del doble bandeo observado en la figura 18. En el caso
de la clona 5 la banda se observa en menor intensidad, esto debido a que la expresión de
la proteína no fue eficiente, como se observó en la figura 17, además de que parte del
producto se pierde durante la sonicación.
Los extractos de las células no inducidas (Figura 19), no presentan ninguna banda
detectada por el anticuerpo contra GST, por lo tanto, antes de la inducción no hay expresión
de la proteína recombinante GST-VP1.
Figura 19. Ensayo de western blot para la detección de la proteína recombinante GST-VP1 presente en el sobrenadante de las clonas 2 y 5. A partir del agregado celular y sobrenadante obtenidos del lisado celular, se realizó un ensayo de western blot utilizando como control negativo extractos pre-inducción de las clonas 2 y 5. Para identificar la proteína se usaron anticuerpos de ratón contra la bandera (GST) en una dilución 1:7500 y para revelar se usaron anticuerpos anti-ratón con HRP en una dilución 1:5000. En el extremo izquierdo se observa el marcador de peso molecular. Los primeros dos carriles
49
corresponden a los extractos pre-inducción y sobrenadante de la clona 2, seguidos de los correspondientes a la clona 5. En el extracto del sobrenadante de la lisis celular de la clona 2, se observa una banda debajo del marcador de 100kDa correspondiente a la proteína recombinante GST-VP1 de 85kDa.
50
Conclusiones
Se clonó el gen codificante para la proteína mayoritaria de cápside VP1 de la cepa
Urbana del Calicivirus felino en el vector de tránsito pCR2.1-TOPO y en el vector de
expresión para procariontes pGEX-5X-1.
Se expresó la proteína recombinante GST-VP1 en células químicamente
competentes Escherichia coli BL-21(DE3).
Con base en la secuenciación obtenida, se corroboró la clonación del gen de la
proteína VP1 de la cepa Urbana del FCV en el vector de expresión pGEX-5X-1.
Se obtuvo la proteína recombinante GST-VP1, en estado soluble, en el
sobrenadante del lisado celular.
Recomendaciones
Futuros estudios derivados de este trabajo deberán corroborar la identidad de la
banda correspondiente a la proteína recombinante GST-VP1, antes de realizar un protocolo
de inmunización para obtener anticuerpos contra la misma.
Para la purificación de la proteína recombinante GST-VP1, se recomienda
aprovechar el estado soluble de la misma y la presencia de la bandera de GST para usar
el método de cromatografía de afinidad con Glutatión-agarosa.
Para la expresión de la proteína recombinante, se recomienda hacer una cinética de
crecimiento celular para determinar con mayor exactitud la fase exponencial de crecimiento
e iniciar la inducción en el momento adecuado. Así mismo se recomienda ajustar la
concentración de proteínas totales de los extractos obtenidos en durante la cinética para
tener una mayor seguridad sobre los niveles de expresión.
51
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58
Anexos
Anexo 1: Vector pCR2.1-TOPO
Cuadro 8. Oligonucleótidos del vector de tránsito pCR2.1-TOPO
OLIGONUCLEÓTIDO SECUENCIA 5’→3’
M13 FORWARD (-20) GTAAAACGACGGCCAG M13 REVERSE CAGGAAACAGCTATGAC
Figura 20. Mapa de restricción del vector de tránsito pCR2.1-TOPO.
59
Anexo 2: Vector pGEX-5X-1
Figura 21. Mapa de restricción del vector de expresión pGEX-5x-1.
60
Anexo 3: Sitios de corte para el vector pGEX-5X-1 y la secuencia de VP1 de FCV-Urbana
Figura 22. Mapa de restricción del vector pGEX-5x-1 obtenido con la herramienta bioinformática NEBcutter de BioLabs.
Figura 23. Mapa de restricción de la VP1 obtenido con la herramienta bioinformática NEBcutter de BioLabs
61
Anexo 4: Preparación de geles de poliacrilamida
Cuadro 9. Preparación de las soluciones utilizadas en la preparación de geles de poliacrilamida.
SOLUCIÓN CONTENIDO
Solución A Acrilamida 30g, Bis-acrilamida 0.8g. Aforar a 100ml con agua destilada. Filtrar
a 0.22nm. Guardar a 4°C. Solución B Tris base 12.11g, Ajustar pH 8.8 con HCl.
Aforar a 100ml con agua destilada. Guardar a 4°C.
Solución C SDS 10g. Aforar a 100ml con agua destilada. Guardar a temperatura
ambiente. Solución D Tris base 12.11g, ajustar pH a 6.8 con
HCl. Aforar a 100ml con agua destilada. Guardar a 4°C.
Persulfato de amonio Al 10% en agua destilada. Guardar a 4°C
Temed
Cuadro 10. Preparación de geles de poliacrilamida al 8 y 10%.
GEL SEPARADOR
Solución 8% 10% Solución A 2.64ml 3.3ml Solución B 3.7ml 3.7ml Solución C 100µL 100µL
H2O 3.3ml 2.7ml Persulfato de amonio 40µL 40µL
Temed 16.6µL 16.6µL GEL CONCENTRADOR
Solución A 665µL Solución D 625µL Solución C 50µL
H2O 3.6ml Persulfato de amonio 100µL
Temed 5µL
62
Anexo 5: Alineamiento múltiple de nucleótidos
63
Figura 24. Alineamiento múltiple de nucleótidos de las secuencias consenso de las clonas 2 y 5 contra la secuencia de la VP1 del FCV-Urbana. Obtenido mediante el programa bioinformático CLC Main Workbench 7.7.3.
64
Anexo 6: Alineamiento múltiple de aminoácidos
Figura 25. Alineamiento múltiple de aminoácidos entre las secuencias consenso de las clonas 2 y 5 y la secuencia de la proteína VP1 del FCV-Urbana. Obtenido mediante el programa bioinformático CLC Main Workbench 7.7.3.