““DETERMINACIÓN DE DETERMINACIÓN DE INHIBIDORES DE INHIBIDORES DE

PROTEASAS EN EXTRACTOS PROTEASAS EN EXTRACTOS DE LEGUMINOSAS Y SU DE LEGUMINOSAS Y SU

EFECTO SOBRE PROTEASAS EFECTO SOBRE PROTEASAS ENDÓGENAS DEL MUSCULO ENDÓGENAS DEL MUSCULO

DE PESCADO”DE PESCADO”

La incubación de las Pastas de La incubación de las Pastas de Proteína de Pescado a 60 °C induce Proteína de Pescado a 60 °C induce

una:una:

disminución de las disminución de las PROPIEDADES PROPIEDADES MECÁNICASMECÁNICAS de los GELES DE de los GELES DE

PESCADOPESCADO

Fenómeno MODORIFenómeno MODORI

provoca la disminución del VALOR

COMERCIAL

Existen 3 Hipótesis sobre el origen del Existen 3 Hipótesis sobre el origen del fenómeno fenómeno MODORI:MODORI:

1.1. La coagulación de la proteína La coagulación de la proteína “Miofibrilar” durante el calentamiento a “Miofibrilar” durante el calentamiento a 60 °C.60 °C.

2.2. La degradación de la miosina causada La degradación de la miosina causada por una proteasa alcalina que actúa a por una proteasa alcalina que actúa a una temperatura óptima de 60 °C y pH 7.una temperatura óptima de 60 °C y pH 7.

3.3. Proteínas de carácter no enzimáticas Proteínas de carácter no enzimáticas cuya presencia induce al Fenómeno cuya presencia induce al Fenómeno MODORI.MODORI.

La cual afecta a ciertos tipos

de surimi

Se ha comprobado la existencia de una Se ha comprobado la existencia de una “Proteasa Alcalina”“Proteasa Alcalina”,, ESTABLE al CalorESTABLE al Calor

Provocando una degradación

Textual cuando la pasta CÁRNICA se

calienta alrededor de 60

°C

CISTEÍN-PROTEASA

considerablemente pequeña con un Peso molecular de

32 Kda, y CONDICIONES ÓPTIMAS DE

ACTIVIDAD a 55 °C y pH 6.5 – 7.0

CISTEÍN-PROTEASA de:Peso molecular superior a los

400 KDa

Existen diferencias en Existen diferencias en PESO MOLECULAR PESO MOLECULAR y y TIPO DE ENZIMATIPO DE ENZIMA, dependiendo de la especie , dependiendo de la especie

de Pescado:de Pescado: CarpaCarpa

((CarpinusCarpinus carpiocarpio)) Roncador BlancoRoncador Blanco

((GenyonemusGenyonemus lineatuslineatus))

Roncador del Roncador del AtlánticoAtlántico((PomadasysPomadasys crococroco))

Sin embargo:Sin embargo: RoncadorRoncador

del Atlantico del Atlantico

Sugiriendo que la ENZIMA responsable Sugiriendo que la ENZIMA responsable podría ser una podría ser una Serín-Proteasa.Serín-Proteasa.

Croca Croca

BlancaBlanca

Los inhibidores de Tripsinamuestran eficiencia previniendo la degradación proteolítica de éste.

Se ha identificado los 2 tipos: Serín y Cisteín-proteasas, en el musculo del pescado.

Serín y Cisteín-proteasa

Éstas pueden serÉstas pueden serACTIVADASACTIVADAS : Cisteína y 2-mercaptoetanol : Cisteína y 2-mercaptoetanol

DESACTIVADADESACTIVADA : Ácido 4-cloromercuribenzoico (PCMB) : Ácido 4-cloromercuribenzoico (PCMB) ácido etiléndiamino tetracético ácido etiléndiamino tetracético

(EDTA)(EDTA) ácido etilenglicol-bis-N,N-tetracético ácido etilenglicol-bis-N,N-tetracético (EGTA)(EGTA)

N-etilimaleimida (NEM)N-etilimaleimida (NEM) N-bromosuccinimida (NBS) N-bromosuccinimida (NBS)

2-metil-1,4-naftoquinona (K2-metil-1,4-naftoquinona (K33)) UREA ( CHUREA ( CH44NN22O)O)

Al someter la Pasta de Surimia T° de 80 °C,

antes de 60 °C

OBS: La INHIBICIÓN del F.M.

Probablemente: Por la INACTIVACIÓN TÉRMICA de las Enzimas PROTEOLÍTICAS.

ACTUALMENTE:ACTUALMENTE: El control de la Proteólisis de la El control de la Proteólisis de la

MIOSINA se realiza adicionando:MIOSINA se realiza adicionando:

INHIBIDORESINHIBIDORES de PROTESAS de PROTESAS

mejores aditivos como:mejores aditivos como:

SUERO de BOVINO CLARA DE HUEVO Extractos de PAPA o

ARROZ [ ] de SUERO QUESERO

LEGUMINOSAS

Contienen INHIBIDORESContienen INHIBIDORESdede

SERÍN-PROTEASASSERÍN-PROTEASASPts. a la fam.Pts. a la fam.

Inhibidor de KUNITZ BOWMAN-BIRKInhibidor de KUNITZ BOWMAN-BIRK TRIPSINA TRIPSINATRIPSINA TRIPSINA

(Peso molecular : 21 KDa) y QUIMOTRIPSINA(Peso molecular : 21 KDa) y QUIMOTRIPSINA (Peso molecular :8.3 KDa) (Peso molecular :8.3 KDa)

LEGUMINOSAS

Materiales:

ELABORACIÓN DEL SURIMI

Lenguado

Recipientes de acero

Desespinadora mecánica

Filtro con tela de algodón Mezcladora Bolsas de polietileno

Croca

Un viscosímetro Brookfield Un viscosímetro Brookfield

modelo 5XHBTDmodelo 5XHBTDCongelador de placas

PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTOUsar la técnica descrita por Montejano y MoralesUsar la técnica descrita por Montejano y MoralesEviscerar el pescado, descabezarlo y lavarlo en agua fría.Eviscerar el pescado, descabezarlo y lavarlo en agua fría.

Introducirlos en una desespinadora mecánica con orificios de Introducirlos en una desespinadora mecánica con orificios de tambor de 5mm de diametro.tambor de 5mm de diametro.Lavar la pulpa del pescado 3 veces en recipientes de acero Lavar la pulpa del pescado 3 veces en recipientes de acero inoxidable en agua a una temperatura menor a 10ºC empleando inoxidable en agua a una temperatura menor a 10ºC empleando una porción 3:1(agua : pulpa de pescado)una porción 3:1(agua : pulpa de pescado)En la tercera lavado adicionar 0.1%de NaClEn la tercera lavado adicionar 0.1%de NaCl

Agitar en forma continua durante 10 minutosAgitar en forma continua durante 10 minutos

Eliminar el agua a través de un filtro con tela de algodón.Eliminar el agua a través de un filtro con tela de algodón.

Incorporar 8% de sacarosa como crioprotector con el Incorporar 8% de sacarosa como crioprotector con el uso de una mezcladora.uso de una mezcladora.

Empaquetarlas en bolsas de polietileno y congelarlas a -Empaquetarlas en bolsas de polietileno y congelarlas a -30ºC por 3 horas en un congelador de placas.30ºC por 3 horas en un congelador de placas.

Por ultimo almacenarlo a -20ºC hasta su uso.Por ultimo almacenarlo a -20ºC hasta su uso.

LUEGO DE LA PREPARACIONLUEGO DE LA PREPARACION

Embutir la pasta de surimi en tubos de acero inoxidable con tapa Embutir la pasta de surimi en tubos de acero inoxidable con tapa rosca, hacerlo con la ayuda de una embutidora manual.rosca, hacerlo con la ayuda de una embutidora manual.

Incubar los tubos a 60ºC durante 30 minutos, luego llevarlos a Incubar los tubos a 60ºC durante 30 minutos, luego llevarlos a cocción a 90ºC durante 15 minutos.cocción a 90ºC durante 15 minutos.

Monitorear la temperatura del centro del gel utilizando un Monitorear la temperatura del centro del gel utilizando un termómetro de aguja en un tubo control.termómetro de aguja en un tubo control.

Luego de la cocción llevar los tubos a agua fría y posteriormente Luego de la cocción llevar los tubos a agua fría y posteriormente llevarlos a refrigerar 24 horas, antes de desmoldar los geles.llevarlos a refrigerar 24 horas, antes de desmoldar los geles.Después de desmoldarlos almacenarlos a -4ºC durante 48 horas Después de desmoldarlos almacenarlos a -4ºC durante 48 horas hasta realizar el análisis de la textura de torsión.hasta realizar el análisis de la textura de torsión.

OBTENCION DE LOS GELESOBTENCION DE LOS GELES

Se obtendrá:Se obtendrá:- Solubilizando el surumi Solubilizando el surumi

con 2.5% de cloruro de con 2.5% de cloruro de sodio en una cortadora de sodio en una cortadora de carne durante 5 minutos carne durante 5 minutos manteniéndola a una manteniéndola a una temperatura de 0 a 4ºCtemperatura de 0 a 4ºC

PRUEBA DE TORSIÓN - Para esta prueba sacamos los geles y los aclimatamos a una temperatura de

ambiente durante 2 horas.

- Cortarlo en segmentos de 2.8cm de longitud y darles forma de un reloj de arena.

- Analizar los geles con el viscómetro Brookfield modelo 5XHBTD con un dispositivo especial.

- En esta máquina el gel va a ser sometido a una fuerza rotacional a una velocidad de giro de 2.5rpm

- La prueba terminará cuando el gel se fracture.

- Se utilizará los valores de unidades Brookfield de torque UB y la distancia proporcional al número de giros, registrados en el graficador serán utilizados para calcular el esfuerzo y la deformación al corte, aplicando un factor de corrección.

Ecuación:Ecuación:

Donde UB = Unidades BrookfieldDonde UB = Unidades Brookfield

valores de deformación del corte se calcula con la ecuaciónvalores de deformación del corte se calcula con la ecuación

Donde:Donde: g = deformación al corte ( adimensional )g = deformación al corte ( adimensional ) D = Distancia en el graficador desde inicio de giro hasta la fractura.D = Distancia en el graficador desde inicio de giro hasta la fractura. V = velocidad de movimiento del papel en el graficador ( cm/s)V = velocidad de movimiento del papel en el graficador ( cm/s) si los valores de deformación del corte son mayores a 1.0 se realiza una si los valores de deformación del corte son mayores a 1.0 se realiza una

corrección usando una ecuación citada por Hamman y MacDonaldcorrección usando una ecuación citada por Hamman y MacDonald

t = 1580UB

g = 0.15 ( D/V ) – 0.00848 (UB)

Si los valores de deformación del corte(g) son mayores de 1.0 se realiza una corrección usando una ecuación citada

por Hamman y MacDonald:

g = ln( 1 + g3/2 + g( 1 + g2/4)1/2)

4- Determinación de actividad proteolítica a 60 4- Determinación de actividad proteolítica a 60 °C en surimi mediante el método de péptidos °C en surimi mediante el método de péptidos solubles en ácido tricloroacéticosolubles en ácido tricloroacético

1. Para determinar la actividad proteolítica se Introdujeron 700 mg de surimi crudo en tubos de ensaye de 13 x 100 mm Se adicionaron 0.2 mL de solución amortiguadora de fosfatos de pH 7 y se homogeneizaron

2. A continuación las muestras se incubaron a 60 °C por 2 horas para establecer la presencia de proteólisis

3. La reacción se detuvo con la adición de 2mL de ácido tricloroacético (TCA) al 5%. Después de homogenizar, las muestras fueron centrifugadas a 840xg por 5 minutos a temperatura ambiente.

4. Se determinó la presencia de péptidos solubles en ácido tricloroacético en el sobrenadante como un color blanquecino.

5- Obtención de los extractos crudos de 5- Obtención de los extractos crudos de leguminosasleguminosas

Los inhibidores de proteasas fueron obtenidos de: alubia, chícharo, garbanzo y soja, provenientes del comercio local. Los extractos se obtuvieron de acuerdo ala técnica de García-Carreño et al. (1996a). Las semillas fueron pulverizadas en un vaso de licuadora.

Posteriormente se mezcló 1 g de ésta harina de leguminosa por cada 3 mL de solución amortiguadora de NaH2PO4. El homogeneizado se mantuvo en agitación por 2 horas a temperatura ambiente, para posteriormente almacenarlo a 4 °C por 22 horas. Los extractos crudos fueron extraídos centrifugando dos veces a 840 x g por 10 y 30 minutos, filtrando en cada tiempo de centrifugación. Posteriormente se almacenaron a 4 °C.

6- Caracterización de los inhibidores de 6- Caracterización de los inhibidores de proteasas presentesproteasas presentes Se determinó el efecto inhibidor específico de los Se determinó el efecto inhibidor específico de los

extractos de leguminosas con extractos enzimáticos extractos de leguminosas con extractos enzimáticos de tripsina tipo III de páncreas de bovino, de tripsina tipo III de páncreas de bovino, quimotripsina tipo II de páncreas de bovino y papaína quimotripsina tipo II de páncreas de bovino y papaína de látex de papaya, los cuáles fueron preparados en de látex de papaya, los cuáles fueron preparados en concentración de 1 g/L en solución amortiguadora de concentración de 1 g/L en solución amortiguadora de NaH2PO4.NaH2PO4.

La especificidad de los inhibidores de proteasas fue La especificidad de los inhibidores de proteasas fue determinada mediante una modificación del método determinada mediante una modificación del método propuesto por García-Carreño et al. (1996a). Se propuesto por García-Carreño et al. (1996a). Se adicionaron 0.4 mL de extracto enzimático en tubos de adicionaron 0.4 mL de extracto enzimático en tubos de ensaye 13 x 100 mm. ensaye 13 x 100 mm.

A las muestras en que se determinó actividad proteolítica se les adicionó 0.2 mL de solución amortiguadora de NaH2PO4. Para el ensayo de inhibición,la solución amortiguadora de NaH2PO4 fue reemplazada por 0.2 mL de extracto de leguminosa (disuelto en la misma solución). Las muestras fueron incubadas a 25 °C durante 30 minutos, para permitir que actuase el inhibidor

.Como sustrato se adicionó 0.4 ml de azocaseína al 0.2%. Posteriormente fueron incubados a 60 °C durante 2 horas para establecer la presencia de proteólisis.

La reacción se detuvo con 0.8 mL de TCA al 5%..Después de homogenizar, las muestras fueron centrifugadas a 840 x g por 5 minutos a temperatura ambiente y se midieron a una absorbancia de 366 n

7- Efecto de los extractos en la actividad 7- Efecto de los extractos en la actividad proteolítica a 60 °C en surimiproteolítica a 60 °C en surimi

•Se introdujeron 700 mg de surimi en tubos de ensayo de 13 x 100 mm. A las muestras que se les determinó actividad proteolítica. Se les adicionaron 0.2 mL de solución amortiguadora de NaH2PO4.

• Para el ensayo de inhibición, se reemplazó la solución amortiguadora de NaH2PO4 por 0.2 ml de extracto de leguminosa (disuelto en la misma solución). Las muestras se incubaron a 25 °C durante 30 minutos, para permitir que actuase el inhibidor.

•Posteriormente se incubaron a 60 °C por 2 horas para establecer la presencia de proteólisis. La reacción se detuvo con la adición de 2 ml TCA al 5%. Después se determinó la presencia de péptidos solubles.

RESULTADOS Y CONCLUSIONESRESULTADOS Y CONCLUSIONES La incubación a 60La incubación a 6000C de los geles de Surimi de C de los geles de Surimi de

Lenguado y Croca provocó una disminución en los Lenguado y Croca provocó una disminución en los valores de esfuerzo cortante y deformación al corte, valores de esfuerzo cortante y deformación al corte, respecto a la muestra control.respecto a la muestra control.

El detrimento de las propiedades mecánicas El detrimento de las propiedades mecánicas aumentó por efecto del tiempo.aumentó por efecto del tiempo.

La importancia del Fenómeno Modori ha sido La importancia del Fenómeno Modori ha sido asociado con la presencia de actividad proteolítica asociado con la presencia de actividad proteolítica a 60a 6000C.C.

La presencia de inhibidores en los extractos fue La presencia de inhibidores en los extractos fue confirmada empleando Tripsina, Quimotripsina y confirmada empleando Tripsina, Quimotripsina y Papaína, teniendo azocaseina como sustrato.Papaína, teniendo azocaseina como sustrato.

La presencia de actividad proteolítica a 60La presencia de actividad proteolítica a 6000C en C en Surimi así como el efecto inhibitorio de los extractos Surimi así como el efecto inhibitorio de los extractos de leguminosas se determinó midiendo la presencia de leguminosas se determinó midiendo la presencia de péptidos solubles en TCA al 5%.de péptidos solubles en TCA al 5%.

Los inhibidores de proteasas presentes en los Los inhibidores de proteasas presentes en los extractos crudos de leguminosas podrían emplearse extractos crudos de leguminosas podrían emplearse para inhibir la actividad proteolitica en productos de para inhibir la actividad proteolitica en productos de pescado.pescado.