expansiÓn in vitro de cÉlulas madre mesenquimales …

1

EXPANSIÓN IN VITRO DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES

SOBRE SUBMUCOSA INTESTINAL PORCINA

LINA MARÍA QUIJANO LUQUE

Código: 200323746

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

PREGRADO BIOLOGÍA

BOGOTÁ

2008

2

EXPANSIÓN IN VITRO DE CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES

SOBRE SUBMUCOSA INTESINAL PORCINA

LINA MARÍA QUIJANO LUQUE

Código: 200323746

Tesis para optar al título de Bióloga

Directora

CLAUDIA MERA REINA

Médico Cirujano, MSc

Codirectora

GLORIA INES URIBE BOTERO

Microbióloga, MSc

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA

PREGRADO BIOLOGÍA

BOGOTÁ

2008

3

A Dios por estar siempre conmigo.

A mis papas por darme todo el amor del mundo, por a poyarme siempre y por ser mi modelo a seguir.

A mi hermana por ser mi amiga, mi compañía, y por a legrarme todos los días.

A mi abuelita porque es la persona que me consiente , me cuida y me da fortaleza espiritual.

A Federico por creer en mí y por impulsarme a ser m ejor todos los días.

4

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a

Mi Familia, porque gracias a su amor y apoyo, salgo adelante todos los días. Porque tenerlos a ellos

me hace la mujer más afortunada del mundo.

A Federico porque es una persona incondicional que me ha hecho creer más en mí y porque tenerlo a

mi lado me hace muy feliz.

A Claudia Mera, porque me guió cada día en el desar rollo de este trabajo, porque gracias a su

dedicación y conocimiento, pude sacar adelante este proyecto. Me siento afortunada de haberla

tenido como directora de tesis, no solo porque fue la mejor directora que pude haber tenido, si no

porque conseguí una amiga incondicional con que la que sé que puedo contar siempre, gracias por

todo Clau.

A Gloria Uribe, porque siempre confió en mí y en mi trabajo, porque siempre estuvo dispuesta a

atenderme, a oírme y ayudarme a mejorar mi trabajo. Porque gracias a ella se abrieron puertas para

generar más investigación, por medio de la vinculac ión entre el Laboratorio de Biología Celular y

Molecular de la Facultad de Medicina de la Universi dad del Rosario y el Hospital de la Misericordia.

Al Laboratorio de Biología Celular y Molecular de l a Facultad de Medicina de la Universidad del

Rosario, porque me recibieron en su equipo de traba jo, y me apoyaron siempre que lo necesite.

A Sandra Ramírez, que desde que llegue al laborator io me hizo sentir parte del grupo de trabajo.

Siempre me guió y me dedico su tiempo para lograr t odos mis objetivos.

A Olga Lucia Rojas, porque siempre estuvo dispuesta a ayudarme y a dedicarme su tiempo. Porque

con su amplio conocimiento en investigación y en ci tometría de flujo, permitió que este proyecto

saliera adelante.

A la Fundación Santa Fe y en especial a Gamal Zayed , por toda su colaboración en la recolección de

muestras de medula ósea.

A Biomaster, y en especial a Ricardo Beltrán, pues gracias a su apoyo obtuvimos la Submucosa para

llevar a cabo este proyecto.

5

Tabla de Contenido 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................................... 8

2. JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................................................... 10

3. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................................................. 14

4. OBJETIVOS ............................................................................................................................................................. 22

4.1 Objetivo General: ............................. .................................................................................................................... 22

4.2 Objetivos específicos: ........................ .................................................................................................................. 22

5. HIPÓTESIS .............................................................................................................................................................. 23

5.1 Hipótesis Alterna ............................. ..................................................................................................................... 23

5.2 Hipótesis Nula ................................ ...................................................................................................................... 23

6. METODOLOGÍA ...................................................................................................................................................... 23

6.1 Tipo de estudio ............................... ...................................................................................................................... 23

6.2 Población ............................................................................................................................................................. 23

6.3 Criterios de Inclusión ........................ .................................................................................................................... 23

6.4 Obtención de la muestra ....................... ............................................................................................................... 23

6.5 Primera Fase: Cultivo de CMM sobre superficie p lástica .................................................................................... 24

6.5.1 Procesamiento de la muestra ................ ...................................................................................................... 24

6.5.2. Expansión de los cultivos sobre placas de cu ltivo ...................................................................................... 24

6.5.3. Determinación de la morfología de las CMM e n cultivo ............................................................................. 25

6.5.4. Identificación de Unidades Formadoras de Co lonias Fibroblastoides (UFC-F) .................... ..................... 25

6.5.5. Viabilidad y Proliferación Celular ........ ........................................................................................................ 25

6.5.5.1 Azul de Tripán .......................... ........................................................................................................... 25

6.5.5.2. MTT ..................................... ................................................................................................................ 26

6.5.5.3. 7AAD y CFDA-SE .......................... ..................................................................................................... 27

6.6 Segunda Fase: Co-cultivos sobre Submucosa Intes tinal Porcina (SIS) ............................... ............................... 31

6.6.1 Preparación de la SIS ....................... ............................................................................................................ 31

6.6.2 Expansión de las CMMs sobre SIS ............. ................................................................................................. 32

6.6.3 Verificación de que las CMMs se están adhirie ndo a la SIS ...................................... .................................. 32

6.6.3.1 Hematoxilina Eosina ....................... ....................................................................................................... 32

6.6.3.2 Cristal Violeta ........................... ............................................................................................................. 32

6.6.3.3 Giemsa Wright: ............................ .......................................................................................................... 33

6.6.4 Viabilidad y Proliferación .................. ............................................................................................................ 33

7. RESULTADOS ......................................................................................................................................................... 33

7.1 Obtención de Células Madre Mesenquimales (CMM) ......................................................................................... 33

7.2 Caracterización Morfológica de las Células Madr e Mesenquimales ................................................................... 35

7.3. Identificación de Unidades Formadoras de Colon ias Fibroblastoides (UFC-F) ....................... .......................... 37

7.4 Estandarización del cultivo de CMMs sobre la SI S. ............................................................................................ 38

7.5 Estandarización del Uso de MTT para Medir Prol iferación y Viabilidad de CMM Cultivadas con y sin SIS ...... 40

7.6 Tinciones sobre la SIS ........................ ................................................................................................................. 45

6

7.7 Tripsinización y Desprendimiento Mecánico de la s CMM cultivadas sobre la SIS ..................... ........................ 46

7.8 Citometría de Flujo para medir Viabilidad y Pro liferación .................................................................................... 49

7.8.1. Titulación 7AAD: ........................... ............................................................................................................... 50

7.8.2. Titulación CFDA-SE ......................... ............................................................................................................ 51

7.8.3. Análisis de viabilidad y proliferación con 7 AAD y CFDA-SE ..................................... .................................. 53

8. DISCUSIÓN ............................................................................................................................................................. 58

9. PROYECCIONES .................................................................................................................................................... 67

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................................................... 69

ANEXO 1: CONSENTIMIENTO INFORMADO ................. ............................................................................................. 74

ANEXO 2. HOJA DE REGISTRO ......................... ......................................................................................................... 78

7

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Nicho de las Células Madre Mesenquimales. ................................................................................................. 13

Figura 2. Diferenciación hacia los linajes: osteogé nico, adipogénico y condrogénico. ................. ................................ 16

Figura 3. Análisis FACS de CMM para tamaño y granul aridad ..................................................................................... 18

Figura 4. Número de células observadas después de l a siembra inicial. ................................ ...................................... 19

Figura 5. Esquema de las relaciones precursor-produ cto de las células en cultivos de CMMs ............ ........................ 19

Figura 6 Espectro de emisión de la fluoresceína (FI TC, PE, PI y 7AAD) ................................ ...................................... 28

Figura 7. Diagrama de disminución de la fluorescenc ia del CFDA-SE a la mitad. ........................ ................................ 29

Figura 8. SIS deshidratada. ....................... ..................................................................................................................... 31

Figura 9. Separación de los componentes de la medul a ósea por medio de Ficoll ........................ .............................. 34

Figura 10. Cambio de la morfología de las CMMs a me dida que pasaba el tiempo de cultivo .............. ....................... 36

Figura 11. Diferentes morfologías de las CMMs. .... ....................................................................................................... 36

Figura 12. CMMs cultivadas sobre superficie plástic a y sobre SIS. .................................... .......................................... 37

Figura 13. Colonias vistas macroscópicamente. ..... ....................................................................................................... 38

Figura 14. Anillos usados para cultivar las CMMs so bre la SIS..................................................................................... 39

Figura 15. Anillos con la SIS adherida a ellos por medio de SFB. ..................................... ........................................... 40

Figura 16. Cristales de Formazán en células cultiva das con y sin SIS ................................. ........................................ 41

Figura 17. MTT con y sin SIS usando Isopropanol y S DS ............................................................................................. 42

Figura 18. SIS con manchas moradas ................ ........................................................................................................... 42

Figura 19. Metodología para MTT con y sin SIS, con Isopropanol y SDS ................................. .................................... 43

Figura 20. Resultado del MTT con y sin SIS, con Iso propanol y SDS .................................... ....................................... 44

Figura 21. Resultado del MTT con y sin SIS a las 31 , 48 y 72 horas de cultivo. ....................... .................................... 45

Figura 22. Tinciones sobre la SIS con Hematoxilina Eosina, Cristal Violeta y Giemsa Wright. .......... .......................... 46

Figura 23. Espátula para raspar la SIS y tripsina . .......................................................................................................... 47

Figura 24. Células despegadas con tripsina y con la espátula. ..................................................................................... 48

Figura 25. Número de células y su viabilidad al ser tripsinizadas. ................................................................................ 49

Figura 26. Tinción con dos dosis de 7AAD: 2 µL y co n 10 µL. ...................................................................................... 50

Figura 27. Titulación del 7AAD. ................... ................................................................................................................... 51

Figura 28. Histograma de proliferación celular con CFDA-SE. ...................................................................................... 52

Figura 29. Titulación CFDA-SE. .................... ................................................................................................................. 53

Figura 30. Diagrama de puntos: Viabilidad celular, tamaño y granularidad. ............................ ..................................... 55

Figura 31. Número de células teñidas y no teñidas c ultivadas con y sin SIS ........................... ..................................... 56

Figura 32. Viabilidad celular de CMMs sembradas con y sin SIS. ....................................... ......................................... 57

Figura 33. Proliferación celular de CMMs sembradas con y sin SIS. .................................... ........................................ 58

Figura 34. Células sembradas sobre la SIS analizada s con MTT a las 8 y 72 horas de cultivo. .......... ........................ 63

8

LISTA DE TABLAS

Tabla 1 Datos iniciales de las 13 muestras obtenida s ................................................................................................... 34

9

1. INTRODUCCIÓN

Una célula madre es una célula indiferenciada capaz de autorenovarse, y de diferenciarse hacia

diferentes linajes celulares. Estas células cumplen una función muy importante en la homeostasis de

los tejidos, pues constantemente están renovando cé lulas que se han perdido (Blau, H.M., et. al.

2001). Dentro de las células madre, según la fuent e de obtención, se encuentran las células madre

embrionarias, y las células madre adultas. Las embr ionarias son las primeras células que se derivan

de las primeras divisiones del cigoto, y pueden for mar todo un individuo completo, mientras que las

Células Madre Adultas (CMAs), se encuentran en órga nos de individuos ya formados y están

encargadas de reemplazar células en diferentes teji dos (Mera, C. 2006).

Dentro de las células madre adultas, se encuentran las Células Madre Mesenquimales (CMM), las

cuales se encuentran en tejidos como medula ósea, c ordón umbilical, sangre periférica, músculo

esquelético, (Wagner, W., et. al. 2005), tejido adiposo, fluido amniótico, periosti o, y tejidos fetales

(Chamberlain, G., et. al. 2007). Sin embargo, la medula ósea, en comparación con otras fuentes, es

considerada una fuente accesible y rica en CMMs; ad emás es fuente de todo un pool de células

multipotentes con mayor capacidad de diferenciación a mas linajes celulares comparándola con otras

fuentes de CMMs. Por último, estas células tienen f ácil acceso a diversos tejidos, por medio de la

circulación, lo cual hace que lleguen a diferentes tejidos para cumplir los requerimientos necesarios de

mantenimiento y reparación del tejido especifico (T uan, R., et. al. 2002). Las CMMs, se diferencian a

células de tejido mesodérmico como condrocitos, adi pocitos y osteocitos (Muraglia, A., et. al., 2000;

Tuan, R., et. al. 2002). Sin embargo se ha visto que in vitro pueden diferenciarse también a células

neuronales, células musculares, células del tendón (Izadpanah, R, et. al., 2006; Chamberlain, G., et.

al. 2007; Tuan, R., et. al. 2002), cardiomiocitos (Weir, C., et. al. 2008; Xu, M., et. al. 2008) y

hepatocitos (Tuan, R., et. al. 2002).

Ya que estas células tienen un alto potencial de di ferenciación in vitro, han cobrado importancia en la

medicina regenerativa, sin embargo, no se conoce mu y bien su biología in vivo, y la forma mas fácil de

estudiar estas células es in vitro. Un ambiente apropiado es indispensable, para que las células

tengan una buena viabilidad y proliferen, es por es to, que es muy importante que las condiciones in

vitro se asemejen lo que mas se pueda a sus ambiente in vivo. De esa manera, las células crecerán

con las características mas parecidas como si hubie ran crecido in vivo, lo cual las hace mejor

candidatas para ser usadas para terapias regenerati vas.

10

Desde hace muchos años uno de los principales retos de la medicina ha sido el hecho de poder

mantener, restaurar o mejorar la función de órganos y/o tejidos dañados. En el siglo XX, en la década

de los 80 surge un nuevo campo de la medicina que u tiliza polímeros sintéticos biodegradables de

soporte, con el fin de crear sustitutos biológicos autólogos que puedan mejorar, mantener o restaurar

la función de órganos o tejidos dañados aplicando l os principios de cultivo celular.

La ingeniería de tejidos constituye una nueva disci plina en plena fase de desarrollo con múltiples

aplicaciones en las diferentes especialidades médic as, haciendo uso de células aisladas o

disgregadas recolectadas de órganos o tejidos donan tes. En la actualidad es un campo que ha

cobrado mucha importancia debido al potencial que o frece en investigación sobre regeneración tisular,

en la reconstrucción de tejidos tales como la pared abdominal, vasos sanguíneos, vejiga y tendones a

partir de injertos de soportes naturales y/o de sos tén como matrices de colágeno acelulares tales

como la Submucosa Intestinal Porcina (SIS) (Chen, M .K. & Badylak, S.F. 2001). Para reconstruir un

nuevo tejido, se deben tener 3 componentes esencial es como son (i) las células que serán disociadas

del tejido donante y cultivadas, (ii) el sustrato o matriz que servirá como soporte para que las célul as

se adhieran al ser cultivadas, para luego ser impla ntadas en el sitio deseado para la regeneración del

tejido y (iii) factores de crecimiento que promueva n tanto la adhesión como la proliferación, migració n,

y diferenciación celular (Hee Ahna, H et. al. 2007).

En una primera fase del estudio sobre Biología Bás ica de CMMs llevado a cabo en la Universidad del

Rosario, realizada por Angélica Roa (2007), se esta ndarizaron las condiciones de cultivo de las

CMMs, y ahora se busca optimizar estas condiciones simulando la situación in vivo, realizando co-

cultivos sobre una matriz de colágeno. Se cultivara n las CMMs en placas de cultivo de plástico

haciendo uso de la SIS, y se compararan dos condici ones de cultivo diferentes, (con y sin el uso de la

SIS), lo cual permitirá determinar si se puede mejo rar su viabilidad y obtener tasas de crecimiento ma s

altas al cultivar las CMMs.

2. JUSTIFICACIÓN

Durante los últimos años, alternativas terapéuticas para enfermedades terminales y degenerativas,

como secuelas de procesos fisiopatológicos que impi den una adecuada regeneración tisular, ha

llevado a la creciente investigación para generar o pciones de tratamiento y así mejorar la integridad

de los tejidos y el funcionamiento de los órganos. Una de las alternativas planteadas ha sido la

aplicabilidad clínica que pueden tener las Células Madre (CM). Esta población celular que se

11

encuentra en diversos tejidos y órganos en un indiv iduo adulto, se caracteriza por su capacidad de

auto-renovación a lo largo de la vida del individuo , y su potencial de diferenciación en diversos tipo s

especializados celulares. Sin embargo, aún se desco nocen muchos de los mecanismos moleculares

implicados en su proliferación, crecimiento y difer enciación. A pesar de contar ya con diversos

estudios en el ámbito internacional respecto a la e xpansión in vitro de las Células Madre en el

laboratorio, las condiciones utilizadas por cada la boratorio son diversas, haciendo necesario

estandarizar protocolos de proliferación celular de tal manera que los ensayos sean reproducibles por

cualquier grupo de investigación.

Dentro de la población de Células Madre Adultas (CM As) estudiadas durante los últimos años y que

ha despertado gran interés en el ámbito científico- clínico por su fácil obtención y manipulación, está n

las CMMs, con capacidad para diferenciarse in vitro hacia varios linajes celulares: osteoblastos,

adipocitos, condrocitos, miocitos (Short B et al, 2 003), células cardiacas (Xu W et al, 2004; Shim WS

et. al., 2004; Makino S et. al., 1999), y neuronas (Wislet-Gendebien S et. al., 2005). Las CMMs

pueden ser obtenidas de diversas fuentes en el indi viduo adulto, tales como hueso trabecular, tejido

adiposo, líquido sinovial, células perivasculares d e cordón umbilical, de la gelatina de Wharton de

cordón umbilical, músculo esquelético, dientes, san gre periférica y médula ósea (MO), tejido adiposo,

periostio y tejido alveolar. (Baksh, D. et. al. 2004; Roufosse, C.A et al. 2004; Kolf C., et al. 2007,

Wagner, W., et. al. 2005; Izadpanah, R, et. al., 2006; Barry, F. P. & Murphy, J. M. 2004, Ishii, M., et. al.

2005). Una limitación para el uso clínico en un fut uro es la baja frecuencia de estas células en el

organismo adulto, ya que su numero oscila entre 1-2 0 CMMs por 105 células mononucleares (Short,

B., 2003; Gronthos, S. & Simmons, P. J. 1996), por lo que se hace necesario contar con protocolos de

cultivo que garanticen un número adecuado de célula s para su posterior proceso de manipulación y

diferenciación in vitro hacia la población celular especializada de interé s, como es el caso de las

células cardiacas humanas. Con el fin de obtener un mayor número de CMMs para que puedan ser

estudiadas, manipuladas y diferenciadas hacia diver sos linajes de interés en el campo de las ciencias

regenerativas, se han llevado a cabo desde hace va rios años estudios que permitan definir

condiciones reproducibles y óptimas de expansión en el laboratorio.

En el Laboratorio de Biología Celular y Molecular d e la Universidad del Rosario durante el primer

semestre del año 2007, se estandarizaron las condic iones de cultivo para expandir estas células en

placas y frascos de cultivo, a partir de parámetros establecidos y documentados en la literatura

internacional, por Angélica Roa Lara en el 2007. En este estudio, se obtuvieron resultados

satisfactorios en el proceso de aislamiento, expans ión y caracterización morfológica y fenotípica de l as

12

CMMs, que coinciden con lo reportado en la literatu ra, en promedio con tasas de generación celular

(TGC) de 42 horas. Las curvas de crecimiento tuvier on un comportamiento logarítmico, con entrada a

la fase estacionaria hacia el día 45 de cultivo.

A pesar de ser la primera vez que se realiza este e studio de investigación básica con CMAs humanas

en la Universidad del Rosario, los resultados fuero n positivos, pero deben mejorarse aun varios

parámetros para su crecimiento en el laboratorio, p ara garantizar y asegurar una cantidad

representativa de estas células que serán manipulad as y diferenciadas in vitro, para que así, puedan

llegar a ser utilizadas en un futuro en medicina re generativa. Para mejorar las condiciones de cultivo ,

lo óptimo es intentar reproducir lo que más se pued a, su microambiente in vivo, dado por un soporte

natural presente en la médula ósea, el estroma medular, que da sosten y nutre a las diversas

subpoblaciones de CMAs que se encuentran en ella. D iversos estudios han aprovechado las ventajas

de las propiedades de diversas matrices de colágen o para tratar de reproducir in vitro el nicho celular

in vivo, siendo una de ellas la SIS.

La SIS (Matrigel ®), ya ha sido usada en estudios a nteriores realizados por la Universidad de los

Andes y Universidad del Rosario, donde se realizó l a expansión de fibroblastos y queratinocitos,

respectivamente. Estos estudios permitieron evidenciar que las células si se adhirieron a esta matriz

acelular (Borras, 2005; Amórtegui, 2005). En esta s egunda fase del estudio, se quiere evaluar el

efecto del uso de esta matriz sobre la proliferació n y viabilidad de las CMMs, en comparación con

aquellas superficies no tratadas.

Schofield introdujo por primera vez el concepto de "nicho" de CM en 1978, y este concepto ha ido

ganando cada vez mayor aceptación en los últimos añ os. El nicho comprende todos los elementos

que rodean a las CM cuando ellas están en su estado nativo, incluye también a células distintas de

las CM que pueden estar en directo contacto con ell as y a la vez a la matriz extracelular y moléculas

solubles presentes en ella, Figura 1. Todos estos c omponentes actúan en conjunto para mantener a

las CM en su estado indiferenciado hasta que se pre senta un estimulo, que conlleva a que las células

se comprometan hacia un linaje celular determinado. Aunque no se conoce con precisión todas las

proteínas solubles, factores de crecimiento, compon entes celulares que hacen parte del nicho de las

CMMs, se ha visto en varios estudios que componente s presentes en la matriz extracelular influyen en

los procesos de proliferación y diferenciación de e stas células. (Kolf C., et al. 2007). Por esta razó n, el

diseño de matrices artificiales que puedan simular el micro ambiente in vivo o que regulen una

13

adecuada diferenciación de las CM es un acercamient o promisorio para futuras aplicaciones

terapéuticas. (Kolf C., et al. 2007)

Hee Ahn H et al, 2007 utilizaron una matriz natural acelular, la SIS, par a el cultivo de células madre

estromales derivadas de médula ósea humana, donde s e observó que las células se adherían a la

matriz, formaban conexiones con el colágeno fibrila r de la matriz, mantenían su patrón típico con

grandes núcleos y forma ahusada, concluyendo que la SIS favorecía positivamente la proliferación

celular probablemente porque proveía de estímulos y señales similares al micro ambiente in vivo. Hee

Ahn H et al. 2007)

Figura 1. Nicho de las Células Madre Mesenquimales.

Tomado y modificado de Wolf et. al. 2007

Figura 1 . Nicho de las Células Madre Mesenquimales. Las Cél ulas Madre Mesenquimales (CMM) se muestran en su ni cho

perivascular putativo (BV, blood vesel: vaso sanguí neo), interactuando con (1) otras células ya difere nciadas (DC1, DC2, etc.)

por medio de moléculas de adhesión celular, como ca dherinas, matriz extracelular (ECM) depositados por las células del

nicho mediadas por receptores de integrinas y moléc ulas de señalización que incluyen factores autocrin os, paracrinos y

endocrinos. Otra variable es la tensión de O2, con la hipoxia asociada al nicho de las CMMs en el nich o de la medula ósea

Los resultados obtenidos en estos modelos facilitar án el diseño de estrategias para obtener un

número mayor de CMMs y garantiza así su aplicación terapéutica induciendo su diferenciación a

linajes específicos por ejemplo a cardiomiocitos pa ra el tratamiento de enfermedades de gran impacto

en salud pública como por ejemplo es el caso de las Enfermedades Cardiovasculares (EC), o en la

regeneración ósea y de cartílago, (Bruder, et. al. 1998; Kotobuki, et. al. 2004; Hui, et. al. 2005;

Dorotkaa, et. al. 2005) entre otras.

14

3. MARCO TEÓRICO

Las células madre, son un grupo de células indifere nciadas, con alta capacidad proliferativa, capaces

de auto-renovarse y dar lugar a un gran número de c élulas diferenciadas de diversos linajes (según

las señales generadas en el microambiente en el que se encuentren), lo que les permite tener un alto

potencial de regeneración tisular. (Blau, H.M., et. al. 2001). La forma en que estas células madre

mantienen un balance entre la cantidad de células i nmaduras utilizadas como reserva, y la cantidad

de células con la capacidad de diferenciarse, es po r medio de un proceso conocido como división

asimétrica (Mera, C. 2006) Al final de este tipo de división se tiene como resultado dos células, una de

ellas es idéntica a la célula madre, y la otra adqu iere la capacidad de diferenciarse, perdiendo la

capacidad de auto renovarse. (Gokhale, P.J. & Andre ws, P.W. 2006)

Las células madre se pueden clasificar de 3 maneras : i) Según su potencial de diferenciación, en

células totipotenciales, pluripotenciales, multipotenciales y unipotenciales; ii) Según el tejido de

origen, en células madre embrionarias, o adultas y finalmente iii) Según su capacidad de regeneración

tisular in vivo en corto o largo plazo de regeneración. (Mera, C. 2006)

Una célula totipotente tiene la capacidad de dar lu gar a un individuo completo, con todas sus células

diferenciadas, y tejidos de sostén. (Mera, C. 2006) . Las células pluripotentes, son aquellas que tiene la

capacidad de generar distintos tipos celulares, de las 3 diferentes capas germinales (ectodermo,

mesodermo y endodermo). Las células multipotentes s on aquellas que pueden dar lugar a varios tipos

celulares, pero solo de una capa germinal específic a. Por ultimo, las células madre unipotentes, tiene n

u0na menor capacidad de dar lugar a diferentes tipo s celulares, un ejemplo de estas células, son las

espermatogonias, que solo dan lugar a espermatozoid es (Gokhale, P.J. & Andrews, P.W. 2006).

Según el tejido de origen del que provengan, se cla sifican en embrionarias, y adultas. Las primeras,

se obtienen de las primeras células luego que el ci goto empieza a dividirse, y tienen la característic a

de ser totipotenciales. Las adultas por el contrari o, se encuentran en varios órganos de individuos

desarrollados, y se encargan de reemplazar células en los tejidos donde se requiera (Mera, C. 2006).

Por último, según su capacidad de regeneración tisu lar, puede haber células que se auto renuevan a

largo plazo de forma indefinida, (durante toda la v ida del individuo), o células que se renuevan a cor to

plazo de forma definida, (por un rango de tiempo de terminado) clasificación que ha sido aplicada a las

Células Madre Hematopoyéticas. (Mera, C. 2006).

15

Las células madre adultas, se encuentran en muchos tejidos, tales como medula ósea, cordón

umbilical, tejido adiposo, epitelio, sangre perifér ica, (Wagner, W., et. al. 2005; Izadpanah, R, et. al.,

2006; Gimble & Guilak, 2003), el líquido sinovial, tejido alveolar entre otros (Odorico, J.S., et. al. 2001,

Fuentes-Boquete, I., et. al., 2007). También tienen la capacidad de regenerar diferentes tejidos,

(Colter, D., et. al. 2000) por lo cual ha cobrado mucha importancia el e studio de estas células, pues

han empezado a ser utilizadas en terapias para enfe rmedades tales como la isquemia cardiaca

(Rosenstrauch, D., et. al. 2005), en lesiones de la espina dorsal, y reparaci ón de hueso, cartílago,

ligamento, tendón y menisco (Gonzalez, R., et. al. 2007; Kolf C., et al., 2007; Krampera , M., et. al.,

2006; Hankemeier , S., et. al., 2007; Hui, J., et. al. 2005; Dorotka, R., et. al. 2005; Guo, X., et. al.

2004; Jorgensen, C., et. al. 2004; Arnoczky, S., 1999). Sin embargo, las terap ias con este tipo de

células no han tenido resultados satisfactorios, co mo se esperaba ya que no se conocen muy bien ni

su biología, ni su comportamiento in vitro. La única forma de conocer la biología in vivo de las células

madre mesenquimales, es extrapolando los resultados que se obtienen de ensayos in vitro, pero para

que estos sean validos, estas condiciones deben ser lo mas cercanas posibles las condiciones de su

nicho in vivo.

Dentro del grupo CMAs, con capacidad pluripotencial , (Minguell, J.J. et. al.2001) se encuentran las

CMMs. Estas células, tienen una gran aplicación ter apéutica, y están siendo estudiadas por diferentes

disciplinas científica. Esto ha conllevado a obtene r diversos resultados, y por ende no se han podido

definir criterios únicos para definirlas. Sin embar go, según la Sociedad Internacional de Terapia

Celular, (ISCT, International Society for Cellular Therapy ), existen unos criterios mínimos para

caracterizar una CMM:

1. Crecen adheridas a la placa de cultivo

2. Expresan los siguientes antígenos de superficie: CD 105, CD 73 y CD 90, y no expresar CD

45, CD 34, CD 14, CD 11b, CD79 α, CD 19 y/o HLA-DR.

3. Presentan diferenciación multipotencial in vitro a células de tejidos provenientes del

mesodermo, tales como condroblastos, osteoblastos y adipositos Figura 2.

(Dominici, M., et. al. 2006; Weir, C., et. al. 2008; Deans & Moseley 2000)

No obstante, la literatura también reporta algunas otras características para describir las CMM: tiene n

morfología fibroblastoide, forman colonias a partir de una sola célula: Unidades Formadoras de

colonias Fibroblastoides (UFC-F), (Bianco, P. et. al. 2001) y tienen una alta capacidad proliferativa.

16

Además de diferenciarse en condroblastos, osteoblas tos y adipocitos, se ha demostrado que también

pueden ser diferenciadas a células neuronales, miot ubos, tenocitos, tejido del ligamento, estroma,

hepatocitos, y células cardiacas (Minguell, J.J. et. al. 2001; Caplan, A. & Bruder, S. P., 2001; Alhadlaq,

A. & Mao J. J., 2004; Urbani, S, et. al. 2006; Barry, F. P. & Murphy, J. M., 2004). Esta d iferenciación

depende del microambiente en el que se encuentren, (Blau, H.M., et. al. 2001) y al cual son

transportadas por el sistema circulatorio cuando se genere una necesidad específica, o cuando se les

induce usando medios de diferenciación in vitro. También se han hecho unos pocos estudios que

demuestran que in vivo, las CMM se movilizan hacia lugares donde hay tejid os dañados, y que se

diferencian de acuerdo al nicho biológico en el que se encuentren. Por ejemplo un estudio donde

estas células fueron inyectadas intraarticularmente en la rodilla de una cabra con rotura meniscal, y

después de 6 semanas encontraron que las CMM se hab ían movilizado hacia el menisco dañado y no

hacia el cartílago o el hueso. En otro caso, se lle vo a cabo el mismo experimento en la rodilla de una

rata, y las CMM se movilizaron hacia todos los teji dos dañados, diferenciándose hacia las células de

cada tejido al que llegaron. (Fuentes-Boquete, I., et. al., 2007)

Figura 2. Diferenciación hacia los linajes: osteogénico, adi pogénico y condrogénico.

Tomada y modificada de Deans & Moseley 2000

Figura 2. Las Células Madre Mesenquimales Humanas, expandida s en cultivo ex vivo exhiben una forma alargada co n

morfología de tipo fibroblastoide (panel de arriba ). Bajo condiciones apropiadas de inducción, el cu ltivo mostrara evidencia

de diferenciación adipogénica por medio de glóbulos de grasa, diferenciación condrogénica por medio de la tinción del

colágeno tipo II o diferenciación osteogénica por medio de la visualización de condiciones de calcio.

17

La cantidad obtenida de células varía según la edad del individuo donante y del lugar de donde se

obtengan. En el primero de los casos, un ejemplo cl aro, es que en la medula ósea de un feto humano,

aproximadamente 1 de cada 10.000 células mononucle ares son CMMs, por el contrario, en la medula

ósea de un adulto, 1 de cada 250.000 células mononu cleares son CMMs. Su baja densidad en la

medula ósea, hace necesaria la expansión in vitro de estas células. (González, R., et. al. 2007). En el

segundo caso, dependiendo del lugar de donde se aís len estas CMMs, además de variar en numero

de células, puede variar su potencial de diferencia ción (Izadpanah, R., et.al. 2006; Fuentes-Boquete,

I., et. al., 2007; Chamberlain, G., et. al., 2007). Por ejemplo, la diferenciación al linaje ad ipogénico es

menos obvia en CMM aisladas de sangre de cordón umb ilical (CU), en comparación con CMM

aisladas de MO y de tejido adiposo (TA) donde la di ferenciación hacia este tipo de células si se da

claramente (Wagner, W., et. al. 2005). Otro ejemplo, es que las CMM procedentes d e la medula ósea,

muestran una mayor tendencia a diferenciarse al lin aje osteogénico, mientras que las CMM de origen

sinovial tienen a diferenciarse más hacia el linaje condrogénico. (Fuentes-Boquete, I., et. al., 2007).

La MO, es un órgano que cumple la función de micro ambiente para el proceso de la hematopoyesis,

y está compuesto por dos linajes celulares diferent es, el tejido hematopoyético, y el tejido de soport e,

el estroma, y dentro de las células del sistema estromal, se encuentran las CMMs (Bianco, P. et. al.

2001). Las CMM que se extraen de esta MO, se aíslan a partir de una gradiente de densidades y son

recuperadas de la fracción de células mononucleares . Estas células se siembran bajo condiciones de

cultivo particulares como, temperatura, concentración de CO2 y medio de cultivo. La temperatura a la

que se deben mantener los cultivos es de 37º C, co n una concentración del 5% de CO 2. En cuanto a

los medios de cultivo , se han utilizado tanto el Medio Mínimo Esencial de Eagle-α (α-MEM del inglés

α−Minimum Essential Medium) y el usado en este estu dio, el Medio de Eagle Modificado por

Dulbecco bajo en glucosa (DMEM-LG del inglés Dulbec cos Modified Eagle Medium – Low glucose), el

cual contiene una concentración mayor de vitaminas y aminoácidos. (Inserto Sigma)

Entre las siguientes 24 horas y 3 días, se realiza el primer cambio de medio y las células que no se

adhieren a la placa, (células muertas o CMHs) son e liminadas. A medida que pasan los días, las

células se adhieren a la superficie de la placa de cultivo, y adquirieren una forma fibroblastoide

agrupadas en colonias. (Minguell, J.J. et. al. 2001; Alhadlaq, A. & Mao J. J. 2004). Cuando alcanz an

confluencia, se desprenden de la placa de cultivo c on tripsina/EDTA al 0.5% para luego expandirlas.

Una vez subcultivadas, se puede observar un cultivo homogéneo de células adheridas a la superficie

de la placa, con morfología alargada, y estrellada. (Barry, F. P. & Murphy, J. M. 2004).

Estas células empiezan a mostrar un potenc

duplican rápidamente, otras se detienen luego de un tiempo) (Minguell, J.J.

encontrado en cultivos de CMM, por medio de citomet ría de flujo, tres subpoblaciones de CMMs.

Estas se diferencian según su tamaño y la granulari dad del citoplasma. Hay unas células pequeñas

llamadas Recycling Cells 1 (RS-1), que tienen un ci

(Urbani, S., et. al. 2006). También están las

granular y son de tamaño pequeño. Por último, están las

citoplasma de moderada granularidad, y con una tasa de pro liferación menor. (

Colter et. al. 2000). Se ha visto que en cultivos estacionarios, la mayoría de las células pertenecen a

la población de mMSC (CMMs maduras) las cuales tien en a

solo unas pocas células de la población RS

Figura 3. Sin embargo cuando estas células son semb radas en bajas densidades, y el cultivo crece

lentamente, se ha podido observar cómo cambian las densidades de estas poblaciones a medida que

avanza el tiempo. Por ejemplo durante la fase lag d el cultivo, aparecen las células de la población RS

2, durante la fase logarítmica, el número de estas decrece y empiezan a expa

mMSC. Por último, durante la fase log tardía, las c élulas RS

las RS-1 (Figura 3 y 4). Es por esto que se ha propuesto un posible esquema de “precursores y

productos” Figura 5, sin embargo todaví

poblaciones, ni si en realidad esta es la relación que realmente comparten. (Colter

Figura 3. Análisis FACS de

Figura 3. Análisis FACS de células para tamaño y granularidad después de diferentes periodos de incubación. Expe rimentos

preliminares indican que la relación precursor

que crecían lentamente (datos no mostrados). Por es to el grupo de CMM seleccionadas para el experimen to, previamente

Estas células empiezan a mostrar un potenc ial de expansión alto pero muy variable (mientras u nas se

duplican rápidamente, otras se detienen luego de un tiempo) (Minguell, J.J. et. al.



que tienen un citoplasma agranular y una tasa de proliferación alta .

). También están las Recycling Cells 2 (RS-2), las cuales tienen un citoplasma

granular y son de tamaño pequeño. Por último, están las CMM maduras (mMSC), células con un

sma de moderada granularidad, y con una tasa de pro liferación menor. (Urbani, S.,

2000). Se ha visto que en cultivos estacionarios, la mayoría de las células pertenecen a

la población de mMSC (CMMs maduras) las cuales tien en activo su ciclo células, mientras que hay

solo unas pocas células de la población RS -1 (células recirculantes) con su ciclo celular dete nido


odido observar cómo cambian las densidades de estas poblaciones a medida que

avanza el tiempo. Por ejemplo durante la fase lag d el cultivo, aparecen las células de la población RS

2, durante la fase logarítmica, el número de estas decrece y empiezan a expandirse rápidamente las

mMSC. Por último, durante la fase log tardía, las c élulas RS-2 desaparecen y empiezan a expandirse

1 (Figura 3 y 4). Es por esto que se ha propuesto un posible esquema de “precursores y

, sin embargo todavía no se conoce muy bien el comportamiento de estas

poblaciones, ni si en realidad esta es la relación que realmente comparten. (Colter et. al.

Análisis FACS de CMM para tamaño y granularidad

Tomado y Modificado de Colter

Análisis FACS de células para tamaño y granularidad después de diferentes periodos de incubación. Expe rimentos

preliminares indican que la relación precursor -producto entre las poblaciones de células fu eron mas aparentes en cultivos


18

ial de expansión alto pero muy variable (mientras u nas se

et. al. 2001). Se han



toplasma agranular y una tasa de proliferación alta .

2), las cuales tienen un citoplasma

CMM maduras (mMSC), células con un

Urbani, S., et. al. 2006;

2000). Se ha visto que en cultivos estacionarios, la mayoría de las células pertenecen a

ctivo su ciclo células, mientras que hay

1 (células recirculantes) con su ciclo celular dete nido


odido observar cómo cambian las densidades de estas poblaciones a medida que

avanza el tiempo. Por ejemplo durante la fase lag d el cultivo, aparecen las células de la población RS -

ndirse rápidamente las

2 desaparecen y empiezan a expandirse

1 (Figura 3 y 4). Es por esto que se ha propuesto un posible esquema de “precursores y

noce muy bien el comportamiento de estas

et. al. 2000)

Tomado y Modificado de Colter et. al. 2000

Análisis FACS de células para tamaño y granularidad después de diferentes periodos de incubación. Expe rimentos

eron mas aparentes en cultivos


mostro una expansión lenta en cultivo, y tiene un inusual bajo valor de unidades formadoras de coloni as (u

células fueron sembradas a una densidad de 3 célula s /cm

se expandieron más rápido y que tuvieron mayores va lores de ufc.

b) Análisis en el día 5 de cultivo. c) Análisis en el día 7 de cultivo.

Scattering muestra el tamaño de la célula; SSC,

unidades arbitrarias.

Figura 4. Número de células observadas después de la siembra inicial.

Figura 4. Número de células observadas después de la siembra inicial. Los valores son tomados de la figura 3, aj ustado

para el número total de células en los cultivos

Figura 5. Esquema de las relaciones precursor

Figura 5. Esquema de las relaciones precursor

pobremente. Por eso las células RS- 2 que aparecen durante la fase lag deben surgir

Durante la fase log temprana de crecimiento, el nú mero de las células RS

grandes cantidades. Por esto, probablemente las cél ulas RS

excluyen completamente la posibilidad de que las células RS

mostro una expansión lenta en cultivo, y tiene un inusual bajo valor de unidades formadoras de coloni as (u

células fueron sembradas a una densidad de 3 célula s /cm2 que era equivalente a 1 célula/cm 2 o menos para muestras que

se expandieron más rápido y que tuvieron mayores va lores de ufc. a) Análisis de células en un cultivo estacionario al

Análisis en el día 7 de cultivo. d) Análisis en el día 10 de cultivo. FSC,

muestra el tamaño de la célula; SSC, Side Scattering muestra la granularidad del citoplasma. Los valores tie

Número de células observadas después de la siembra inicial.


Número de células observadas después de la siembra inicial. Los valores son tomados de la figura 3, aj ustado

para el número total de células en los cultivos

Esquema de las relaciones precursor-producto de las células en cultivos de CMMs


Esquema de las relaciones precursor-producto de las células en cultivos de CMMs. Las mM SC se replican

2 que aparecen durante la fase lag deben surgir a partir de las RS

Durante la fase log temprana de crecimiento, el nú mero de las células RS-2 decrece a medida que las mMSC aparecen en

grandes cantidades. Por esto, probablemente las cél ulas RS-2 son precursores de las mMSC. Sin embargo los resu ltados no

mente la posibilidad de que las células RS -2 rápidamente generen las células RS -

19

mostro una expansión lenta en cultivo, y tiene un inusual bajo valor de unidades formadoras de coloni as (ufc) de 12%. Las

o menos para muestras que

Análisis de células en un cultivo estacionario al día 14.

Análisis en el día 10 de cultivo. FSC, Forward

muestra la granularidad del citoplasma. Los valores tienen


Número de células observadas después de la siembra inicial. Los valores son tomados de la figura 3, aj ustado

cultivos de CMMs


producto de las células en cultivos de CMMs. Las mM SC se replican

a partir de las RS-10 (ver Figura 4 ).

2 decrece a medida que las mMSC aparecen en

2 son precursores de las mMSC. Sin embargo los resu ltados no

-1, y que las células RS-

20

1 den lugar después a las mMSC (línea punteada). Ta mbién, las primeras mMSC probablemente continúan re plicándose.

Durante la fase log tardía, el número de las célula s RS-2 disminuye y la subpoblación RS-1 se expande. Por eso, las células

RS-2 probablemente se “reciclan” en células RS-1.

Es ideal poder caracterizar las CMM y sus subpoblac iones, y una manera es por medio de la

presencia de antígenos de superficie, proteínas de membrana que caracterizan los linajes celulares,

por medio de citometría de flujo. Sin embargo la c aracterización inmunofenotípica de estas células no

esta completamente clara, ya que para estas células , no se han encontrado marcadores de superficie

únicos, y si expresan antígenos que comparten con o tras poblaciones celulares tales como células

epiteliales, musculares, endoteliales, hematopoyéticas (Alhadlaq, A. & Mao J. J. 2004). Por medio de

la citometría de flujo, se sabe que tienen unos ant ígenos típicos, tales como CD105 (type III TGFb1-3

receptor o endoglina), CD73 (5’-ectonucleotidasa), CD90 (glicoproteína de membrana:Thy-1),

(Dominici, M., et. al. 2006) que son los antígenos que debe tener según l a ISCT para caracterizarlas

como CMM, sin embargo algunos estudios demuestran q ue también presentan: CD29 (Integrina β1),

CD44 (receptor de acido hialurónico), CD166 (activa ted leukocyte cell adhesion molecule-1, ALCAM-

1), HLA-DP, - DQ, -DR-FITC, HLA-ABC-FITC, CD106 (mo lécula de adhesión), CD13 y receptor

PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), CD54 (Molécula de adhesión intracelular,

receptor de rinovirus humano), CD102 (molécula de a dhesión intracelular), CD121 (receptor de

interleukinas 1 y 2), CD123 (receptor de interleuki na 3), CD124 (receptor de interleukina 4), CD49

(integrina) (Urbani, S, et. al. 2006; Mareschi, K., et. al. 2006; Ishii , M., et. al., 2005; Alhadlaq, A. &

Mao J. J. 2004).

Teniendo la posibilidad de poder caracterizar la po blación celular de interés a ser cultivada, de tal

manera que se puedan establecer criterios tanto par a aislarlas como para seguirlas en los distintos

pases del cultivo, es favorable poder mejorar su cr ecimiento en el laboratorio. Con el advenimiento de

la ingeniería de tejidos y terapias regenerativas, cada vez se ha hecho más importante tratar de

reproducir al máximo las condiciones de expansión in vitro, y una herramienta muy cercana, que se ha

estudiado en los últimos años, es el uso de soporte s (matrices) que semejan al soporte en su nicho in

vivo.

Debido a que la viabilidad y proliferación de la ma yoría de las células de los mamíferos depende del

anclaje a un sustrato, se usara un biomaterial como soporte que asemeja las condiciones del nicho in

vivo de estas células. Esta superficie, debe funcionar como una superficie que permita la adecuada

adherencia, proliferación, migración y diferenciación de las células. Además, debe ser biocompatible,

no tóxico, fácil de manejar y de bajo costo (Hee Ah na, H et. al. 2007). Todas estas características las

21

ofrece la matriz de colágeno proveniente de la Subm ucosa Intestinal porcina, (SIS, por las siglas en

ingles Small Intestinal Submucosa).

La SIS se obtiene del yeyuno del intestino delgado del cerdo por remoción mecánica de la túnica

serosa y de la túnica muscularis, siendo en su mayo ría matriz extracelular (Badylak, S., et.al. 1999),

de la cual se retiran los remanentes celulares por la inmersión en una solución al 1% de acido acétic o

(Hee Ahna, H et. al. 2007), o en una solución al 0.1% de ácido paracét ico (Badylak, S., et. al. 1999).

Este es un material acelular y biodegradable, compu esto en mas del 90% de colágeno tipo I y III, y en

menor porcentaje colágeno tipo V y VI, glicosaminog lucanos, proteoglicanos, glicoproteínas

(fibronectina), citoquinas, moléculas de adhesión, factores de transformación, (Tabima, D.M. 2003)

sustratos para las moléculas de adhesión celular y factores de crecimiento tales como Factor de

Crecimiento Transformante β (TGF-β), Factor de Crecimiento Fibroblastoide (FGF-2), y Factor de

Crecimiento Vascular Endotelial (VEGF). (Cimini, M., et. al. 2005). La SIS, tiene muchas ventajas

sobre otras matrices, pues genera un microambiente para las células lo más parecido a sus

condiciones in vivo, pues se ha demostrado que permite una adecuada ad hesión, migración,

proliferación y diferenciación celular; además de f avorecer la homeostasis y la comunicación entre

células. (Dorotkaa, et. al. 2005; Cimini, M., et. al. 2005)); por ejemplo la fibronectina promueve la

migración celular, y la presencia de algunos factor es de crecimiento como el FGF estimula la

proliferación celular. Las glicoproteínas, tienen l a capacidad de unir componentes de la matriz

extracelular entre ellos y a su vez con las células . También se unen a receptores específicos como al

colágeno IV para acelerar el proceso de adhesión ce lular. Entre otros, la SIS tiene factores de

crecimiento que tienen actividad mitogénica, lo que favorece la rápida proliferación celular. (Lindber g,

K., &, Badylak, S. F. 2001)

Las características de esa matriz extracelular afec tan de manera directa el comportamiento del cultivo

(lo cual se puede ver, midiendo tasa de generación celular, viabilidad, cantidad de doblajes

poblacionales y tiempo de duración de cada uno de e llos, características morfológicas, etc.). Por esta

razón, es necesario usar una matriz que le permita a las células proliferar y crecer óptimamente, con

características lo más similares posibles a su ambi ente natural, para mantener el fenotipo propio de

esas células y así usarlas en terapia tisular.

Estudios in vivo han demostrado que la SIS permite una rápida remod elación de vasos sanguíneos en

el tejido en formación (angiogénesis) (Badylak, S., et. al. 1999), y que a pesar de provenir del cerdo,

no genera en el paciente una reacción inmunológica adversa (Hee Ahna, H et. al. 2007; Amórtegui, A.

22

X. 2005) generando un microambiente para las célula s lo más parecido a sus condiciones dentro del

organismo, algo muy importante, ya que los estudios in vitro podrán mostrar un mejor acercamiento al

comportamiento de estas células in vivo, lo que a su vez facilitará la aplicación medica e n humanos.

En una primera fase del estudio sobre Biología Bási ca de CMMs llevado a cabo en la Universidad del

Rosario, realizada por Angélica Roa (2007), se esta ndarizaron las condiciones de cultivo de las

CMMs, y ahora se busca optimizar estas condiciones, realizando co-cultivos sobre una matriz de

colágeno que permiten evaluar parámetros que indica n si el crecimiento celular es adecuado, algunos

de ellos son: la tasa de proliferación celular, tie mpo de doblaje poblacional, viabilidad celular y

características morfológicas.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General:

Comparar las características de crecimiento de las CMMs in vitro sobre placas de cultivo con y sin

Submucosa Intestinal Porcina (SIS), obtenidas a par tir de Médula Ósea humana

4.2 Objetivos específicos:

1 Estandarizar las condiciones de cultivo para las CM Ms, expandidas in vitro con SIS, a partir de

condiciones previas establecidas por Angélica Roa ( 2007).

2 Comparar la capacidad para formar colonias de las CMMs, expandidas in vitro con y sin SIS.

3 Comparar la tasa de proliferación celular, la viabi lidad celular y las características morfológicas

de las CMMs, expandidas in vitro tanto en la SIS como sobre la superficie plástica de las placas de

cultivo.

4 Estandarizar el uso de 7AAD y CFDA-SE en CMM para m edir su viabilidad y proliferación,

respectivamente.

23

5. HIPÓTESIS

5.1 Hipótesis Alterna

La tasa de proliferación, y la viabilidad celular d e las CMMs, se favorecen al cultivarlas sobre una

matriz de colágeno (SIS)

5.2 Hipótesis Nula

La tasa de proliferación, y la viabilidad celular d e las CMMs, no se favorecen significativamente al

cultivarlas sobre una matriz de colágeno (SIS)

6. METODOLOGÍA

6.1 Tipo de estudio

Este es un estudio prospectivo de tipo experimental in vitro.

6.2 Población

Se tomaron muestras de medula ósea de pacientes san os que asistan al servicio de Ortopedia y que

fueron programados para cirugías de rodilla (recons trucción de ligamento cruzado anterior) y para

artroscopia quirúrgicas sin reconstrucción ligamentaria, cuyo rango de edad osciló entre los 15 y los

35 años.

6.3 Criterios de Inclusión

Pacientes sanos cuyo rango de edad oscile entre los 15 y 35 años.

Ausencia de antecedentes de enfermedades hematológi cas malignas.

Pacientes que no hayan recibido quimioterapia.

6.4 Obtención de la muestra

Las muestras de médula ósea fueron recolectadas en tubos con anticoagulante heparina, con el

apoyo del servicio colaborador. Inicialmente se rev isaron las historias clínicas para verificar los

24

antecedentes patológicos y confirmar el cumplimient o de los criterios de inclusión que requiere el

estudio; una vez se seleccionado el paciente se ent revista para explicarle los objetivos del estudio y

solicitar su participación voluntaria. Teniendo la aprobación y el consentimiento informado

debidamente diligenciado, se prepara el material pa ra la toma de muestra que consiste en una aguja

para aspirado de médula ósea. Se toman entre 3 a 20 ml de aspirado (dependiendo de la edad del

paciente) que son añadidos al tubo con heparina el cual se almacena a temperatura ambiente

protegido de la luz, hasta que se procesa en el lab oratorio.

6.5 Primera Fase: Cultivo de CMM sobre superficie p lástica

Actividades Específicas:

6.5.1 Procesamiento de la muestra

La muestra se procesó de la siguiente manera: i) El volumen de muestra recogido fue procesado en

su totalidad, en tubos falcon de 15 ml con 3 ml de Ficoll/hypaque y se centrifugó a 2200 rpm por 30

min. a 22ºC, en seguida, ii) se recogió la interfase de las células mononucleare s con un pipeta pasteur

y se pasó a un tubo Falcon de 15 ml con 2 ml de PBS 1X estéril, y una vez mas se centrifuga a 1800

rpm por 5 minutos y se descarta el sobrenadante. iii) Se lleva a cabo el mismo procedimiento anterior,

pero con una solución de lisis de glóbulos rojos. iv) Se resuspenden las células en 1 ml de medio de

cultivo suplementado y se hace un conteo mediante l a tinción con azul de tripán en un hemocitómetro.

Finalmente v) se siembran en la superficie plástica de cajas de c ultivo; los criterios para determinar el

número de células sembradas ya sea en frascos o en placas de 24, son el número total de células

obtenido en esa muestra, y según la cantidad de cél ulas que deban ser sembradas en pozos de 24 y

en y/o en frascos de 25 y 75 cm 2 que permitan optimizar su adherencia y proliferaci ón.

En estos cultivos:

6.5.2. Expansión de los cultivos sobre placas de cu ltivo Las células fueron sembradas en frascos de 25, 75, o en placas de 24, según la cantidad de células

obtenidas del aspirado de medula ósea. Estas se dej aron por 7 días en la incubadora a 37° C con 5%

de CO2 hasta que se adhirieron a la placa de cultivo. Lue go de este tiempo, se hizo el primer cambio

de medio, donde se eliminaron células que no se adh irieron, como células muertas y células madre

hematopoyéticas. A medida que pasa el tiempo, cuand o la superficie de cultivo estaba mas

confluente, se desprendieron con tripsina/EDTA al 0 .5 % y se separaron en varios frascos, para

25

empezar a aumentar su número. Las células fueron se mbradas a una densidad de 4-8X10 3

células/cm2. Este procedimiento, que se hace varias veces, per mite ir obteniendo un mayor número de

células.

6.5.3. Determinación de la morfología de las CMM e n cultivo

Se observaron diariamente, por medio de un microsco pio invertido, las características morfológicas

que presentan estas células para correlacionarlas c on el estado de proliferación celular en los

diferentes subcultivos.

6.5.4. Identificación de Unidades Formadoras de Co lonias Fibroblastoides (UFC-F)

Se estima la capacidad de formar colonias de tipo f ibroblastoide (UFC-F) durante su expansión in

vitro, característica propia del patrón de crecimiento de las Células Madre Mesenquimales en cultivo.

Esto se hace para medir la capacidad que tienen las CMMs de formar colonias de tipo fibroblastoide,

establecer la frecuencia de CMMs en el total de cél ulas mononucleares y para determinar la densidad

celular óptima para el inicio de la expansión celul ar in vitro (Kulterer, B et al., 2007; Sagakuchi, Y et

al., 2005; Gronthos, S et al., 2003 ; Wexler, S.A. et al., 2002 ; Sotriropoulou, P.A., 2006) descrito por

Castro-Malaspina (Castro-Malaspina, G., 1980).

Como se dijo anteriormente, formar colonias de tipo fibroblastoide, es un patrón típico de las CMMs,

por esta razón, las colonias se visualizarán por me dio de la tinción con Giemsa, un colorante

constituido por una mezcla de azul de metileno y e osina. Este colorante, entra hasta el núcleo y se

une a los grupos fosfatos del ADN especialmente en regiones donde hay uniones Adenina – Timina,

tiñendo el núcleo de rosado. (Roa, 2007) De esta fo rma, se fijaran las colonias observadas con este

colorante y serán observadas y contadas a simple vi sta.

6.5.5. Viabilidad y Proliferación Celular

Mediante ensayos con MTT, azul de tripán, CFDA-SE y 7AAD, se conoce la tasa de proliferación y la

viabilidad celular en cultivo.

6.5.5.1 Azul de Tripán

Para conocer la tasa de proliferación y la viabilid ad de las células, se hacen conteos con un

hemocitómetro por medio del ensayo de exclusión Azu l de Tripan. Este colorante tiñe únicamente

26

células muertas, pues la integridad de la membrana de estas células se pierde y por ende ingresa al

interior de las células y las tiñe de color azul. P or el contrario, las células vivas no permiten su e ntrada,

ya que conservan su integridad y la membrana actúa como barrera evitando que el colorante entre y

permanezca dentro de ellas. De esta forma, en el he mocitómetro se cuentan todas las células viables

evitando sobreestimar la densidad celular con el co nteo de células muertas. Los recuentos celulares

solo se podrán llevar a cabo en un período comprend ido entre 10-14 días, cuando se realicen los

subcultivos o pases de las células, dados por el po rcentaje de confluencia de las cajas de cultivo, qu e

deberán estar entre un 75-80% de confluencia.

6.5.5.2. MTT

En ocasiones, los recuentos con azul de tripán no d ieron muy exactos, por esta razón la cuantificación

del número de células vivas, se intento corroborar y comparar por medio del ensayo colorimétrico de

MTT (3(4,5- dimetiltiazol -2-il)-2,5-difenil bromuro de tetrazolio). Una enzima mitocondrial (succinil

deshidrogenasa) tiene la capacidad de reducir sales de tetrazolio (solubles en agua), a cristales de

formazán (insolubles en agua), que luego serán solu bilizados para medir absorbancia de cada uno de

los ensayos. Ya que la formación de cristales de fo rmazán y su cantidad depende de células vivas y

de su cantidad, es un muy buen indicativo de la den sidad celular activa. (Roa, 2007).

Curvas de crecimiento con MTT:

Habiendo seleccionado el pase en el que se van a an alizar las células en cultivo: Pase 1, Pase 2,

Pase 3, Pase 4, dependiendo del número de células y de la disponibilidad de los frascos de cultivo

para el ensayo, se sembrarán en placas de 24 pozos, el número de células óptimo para esta

superficie de cultivo, que puede oscilar desde 7.6 x 103 a 1.5 x 10 4 células por pozo. Se sembrarán el

número de ensayos correspondientes para ser analiza dos por día, entre 10-14 días, que corresponde

al intervalo de tiempo en que la muestra requiere s ea tripsinizada y subcultivada. Los ensayos deben

ser por triplicado. Los conteos se realizaran todos los días a la misma hora, para determinar la

proliferación celular diaria.

Brevemente: Se escogen tres pozos para realizar la coloración con MTT, se les retirará el medio de

cultivo, para adicionarles posteriormente el reacti vo MTT a una concentración final de 1mg/ml. Se deja

incubando durante dos horas en la incubadora con C0 2 a 37ºC protegidas de la luz. La coloración de

la solución en los pozos es amarilla y los cristale s se ven de color púrpura. Pasado este tiempo, se

retira cuidadosamente el MTT, y se verifica con obs ervación directa en el microscopio invertido, la

formación de cristales intracelulares. Se adiciona a cada pozo, 200µL el disolvente de los cristales

27

SDS + Dimetilformamida. Se pone la placa de cultivo sobre un agitador, para que el reactivo actúe

homogéneamente en toda la superficie y se debe obse rvar el cambio de color de la solución de azul a

púrpura. El tiempo de incubación con el disolvente es de 30 minutos. Pasado este tiempo, se toma el

contenido de los pozos ensayados, y se sirven en un a placa de 96 pozos, para leer su absorbancia en

el espectrofotómetro con un filtro para una longitu d de onda de 595 nm. Los datos que arroja el

equipo, permiten correlacionar la absorbancia con e l número de células presentes en cada pozo .

6.5.5.3. 7AAD y CFDA-SE

La proliferación y viabilidad celular fue medida ta mbién con dos marcadores disponibles en el

mercado para citometría: CFDA-SE y 7AAD, donde el p rimero de ellos se usa para conocer la

proliferación y el segundo para medir viabilidad. E stos parámetros se medirán por medio del citómetro

de flujo FACS Calibur de Becton Dickinson de 4 colo res.

Viabilidad con 7AAD: (BD Pharmingen TM, Cat. 559925)

La citometría de flujo, una técnica que permite ide ntificar antígenos de superficie mediante anticuerp os

monoclonales marcados con diferentes fluorocromos, facilitan la caracterización y clasificación de las

células. Sin embargo, mediante esta técnica, tambié n se puede conocer la viabilidad y proliferación de

estas células. Para medir viabilidad, se utiliza el 7-Amino-Actinomicina D (7AAD), un fluorocromo que

identifica células no viables por fluorescencia (Fe tterhoff, T. J. et. al. 1993). Este fluorocromo, se

intercala entre las bases de citosina y guanina de la cadena de ADN1. Las células no viables pueden

identificarse y excluirse a partir del marcaje 7-AA D (presentarán fluorescencia), ya que la integridad de

la membrana se ha perdido y el 7AAD puede ingresar a la célula; por otro lado, las células viables, no

se marcan (no tendrán fluorescencia), pues en este caso, la integridad de la membrana se mantiene

intacta y no permite que este fluorocromo entre a la célula2. Esta técnica tiene muchas ventajas,

entre ellas se destacan, que es sensible, específic a y sencilla. El uso de 7AAD permite identificar

células necróticas, apoptóticas y/o dañadas, elimin ando así, esta fuente de interferencia en el anális is

por citometría de flujo. Además, el uso de este flu orocromo, permite ser usado en conjunto con la

1 Tomado de http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630IV%202007-06-01_ES.pdf 2 Tomado de http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630IV%202007-06-01_ES.pdf

ficoeritrina (PE) y el isotiocianato de fluoresceína (FITC) ya que los can ales de fluorescencia donde se

detectan estos fluorocromos no son los mismos Figur a 6

La longitud de onda de excitación del 7AAD correspo nde a la región verde del espectro visible (488

nm), mientras que la longitud de onda de emisión de fluorescencia esta en el rojo profundo (635 a 675

nm4) (Schmid, I. et. al. 1992)

Figura 6 Espectro de emisión de la fluoresceína (FITC

Figura 6. Espectro de emisión de la fluoresceína (FITC,

propidio (PI, λ em max : 625 nm) y 7 amino actinomicina D (7

nm, Las alturas de los picos fueron ajustadas y no representan las intensidades de fluorescencia actua les.

Los pasos a seguir para la tinción de estas células con

1. Las células a evaluar, se resuspenden en 300 µL de buffer de citometría (idealmente una

concentración de células no mayor a 5 millones de c élulas).

2. Se agregan 10 µL del 7 AAD puro, protegiendo el

laminar.

3. Se deja incubando 10 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz.

4. Se pasa directamente al citómetro

5. El 7AAD se lee en el canal de fluorescencia FL3, la s células negativas para el marcador

corresponden a las células viables.

3 Tomado de http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630IV%2020074 Tomado de http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630I

isotiocianato de fluoresceína (FITC) ya que los can ales de fluorescencia donde se

detectan estos fluorocromos no son los mismos Figur a 63.



Espectro de emisión de la fluoresceína (FITC , PE, PI y 7AAD)

Tomado y modificado de Schmid

Espectro de emisión de la fluoresceína (FITC, λ em max : 517 nm), Ficoeritrina (PE, λ em max

: 625 nm) y 7 amino actinomicina D (7 -AAD, λ em max : 655 nm). Longitud de onda de excitación: 488


asos a seguir para la tinción de estas células con 7AAD son:

Las células a evaluar, se resuspenden en 300 µL de buffer de citometría (idealmente una

concentración de células no mayor a 5 millones de c élulas).

Se agregan 10 µL del 7 AAD puro, protegiendo el anticuerpo de la luz, en la cámara de flujo

Se deja incubando 10 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz.

Se pasa directamente al citómetro

El 7AAD se lee en el canal de fluorescencia FL3, la s células negativas para el marcador

Tomado de http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630IV%202007-06-01_ES.pdfTomado de http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630IV%202007-06-01_ES.pdf

28

isotiocianato de fluoresceína (FITC) ya que los can ales de fluorescencia donde se



Tomado y modificado de Schmid et. al. 1992

max : 578 nm), yoduro de

: 655 nm). Longitud de onda de excitación: 488


Las células a evaluar, se resuspenden en 300 µL de buffer de citometría (idealmente una

anticuerpo de la luz, en la cámara de flujo

El 7AAD se lee en el canal de fluorescencia FL3, la s células negativas para el marcador

01_ES.pdf 01_ES.pdf

29

Proliferación con CFDA-SE: (Invitrogen.Molecular Probes. Cat V12883):

La proliferación se medirá con Carboxifluoresceindi acetato, Succinimidyl Ester (CFDA-SE), una

sustancia lipofílica, que entra a la célula por dif usión, y que una vez adentro, las esterasas

intracelulares clivan sus grupos acetato, volviéndo se CFSE, el cual se une irreversiblemente a

proteínas intracelulares y de membrana produciendo fluorescencia. Los beneficios de usar esta

prueba, es que se puede rastrear la división celula r, ya que la marca fluorescente es heredada por las

células hijas (Figura 7). Se ha visto que la fluore scencia dura aproximadamente más de 8 semanas,

las células se marcan de forma brillante y homogéne a, lo cual facilita la lectura de esta prueba.

Además de ser un procedimiento rápido y sencillo y las células a teñir, no requieren ningún

tratamiento en particular antes de marcarlas (Ploix , C., 2008). Este parámetro es indispensable para

saber si después de cualquier tratamiento que se la haga al cultivo celular, las células mantienen su

integridad y viabilidad.

Figura 7. Diagrama de disminución de la fluorescencia del CF DA-SE a la mitad.

Tomado y modificado de Mansilla, S. (2005)

Figura 7 . Cuando la célula se divide, el marcaje con CFSE s e distribuye por igual entre las células hijas, las cuales por

consiguiente son la mitad de fluorescentes que las células parentales. El dividir en dos la intensidad de fluorescencia original,

determina cada generación sucesiva en una población de células que está proliferando, estas divisiones pueden seguirse

fácilmente por citometría de flujo.

Los pasos a seguir para la tinción de estas células con CFDA-SE son:

Las CMM a teñir con CFDA-SE deben estar en pase 2:

1. El procedimiento descrito a continuación, debe h acerse a temperatura ambiente y con la menor

cantidad de luz posible (no prender la luz de la ca bina de flujo laminar).

2. Antes de abrir el microvial de CFDA-SE, se debe dejar “calentar” hasta alcanzar la temperatura

ambiente

30

3. El stock de 10mM (un micorvial) se disuelve en 9 0 µL de DMSO. Esta solución, (CFDA-SE +

DMSO), se debe diluir en PBS 1X estéril hasta obten er una concentración final de: 16 µM (esta

concentración es el doble de la que se va a usar, y a que más adelante se mezcla 1ml de la

suspensión celular con 1 ml de la solución con CFDA -SE y la concentración se divida a la mitad) *

solo se prepara en el momento en el que se vaya a u sar.

4. Con la solución de CFDA-SE + DMSO, (sin PBS), se almacenan alícuotas de 10µL a 20°C,

cubiertos con papel aluminio para que no les llegue luz, y no se degrade el CFDA-SE

5. A las células en cultivo se les retira el medio, y se desprenden de la placa de cultivo con

tripsina/EDTA 0.5%, y se lavan dos veces con PBS 1X a 1400 rpm durante 10 minutos.

6. Se resuspenden las células a teñir (hasta 5 mill ones) en 1 ml de PBS 1X estéril, se mezcla bien

para que no queden grumos.

7. Al mililitro de la suspensión celular se le agre ga 1 ml de la dilución de CFDA-SE que estaba a

16µM, de esta forma, la concentración de este fluor ocromo en la suspensión celular, quedará a 8µM.

8. Las células re suspendidas, se tiñen con CFDA-SE en PBS 1X estéril, para lograr una

concentración final de 8 µM: Agregar lentamente 1 m l de la mezcla PBS 1X/CFSE 16 µM, para que al

agregarlo al ml de células quede a una concentració n final de 8uM. (Para preparar 5 ml: adicionar 2 µl

de solución stock 10mM de CFSE a 5ml de PBS 1x). Tr abajar con el CFSE en cabina de flujo, sin luz.

Preparar el CFSE inmediatamente antes de usar y tra bajar rápido.

9. Mezclar muy bien (volumen final de trabajo 2ml) y dejar incubando por 8 minutos a temperatura

ambiente y cubierto con papel aluminio, mezclar sua vemente periódicamente.

10. Cuando pase ese tiempo, se detiene la reacción agregando 2 ml de Suero Fetal Bovino (SFB)

puro, estéril y decomplementado a 57 grados C por 3 0 min. Esto permite que el CFSE que no fue

clivado por esterasas al interior de la célula se p egue a las proteínas del suero y salga en el

sobrenadante al ser centrifugado, para que se pueda retirar el exceso de CFSE. Deje actuar al SFB

durante 3 minutos antes de centrifugar de nuevo.

11. Las células se centrifugan a 1400 rpm por 10 mi nutos y se lava 1 vez con PBS 1X a 1400 rpm por

10 minutos.

12. Se resuspenden las células centrifugadas en med io de cultivo (DMEM, suplementado con 10% de

SFB decomplementado) y se siembran en pozos de una placa de 24

13. Las células de un pozo, se tripsinizan al día 6 o 7 de cultivo (como se nombró anteriormente en el

punto 5), se lavan con Buffer de Citometría (PBS/BS A/AZIDA) frío y se resuspenden en 300 µL de

PBS 1X cuando vayan a ser analizadas.

Una vez se obtengan un número suficiente de células en P2 se procederá a realizar los cultivos sobre

la SIS.

31

6.6 Segunda Fase: Co-cultivos sobre Submucosa Intes tinal Porcina (SIS)

Se realizaron los mismos ensayos nombrados anterior mente, pero sobre placas de cultivos en cuya

superficie se puso la SIS, para comparar si el uso de esta matriz de colágeno optimiza la expansión y

viabilidad in vitro de las CMMs.

6.6.1 Preparación de la SIS

La Submucosa intestinal Porcina (Matrigel ®) fue d onada por el Grupo de Ingeniería Biomédica de la

Universidad de Los Andes, la cual viene estéril y d eshidratada. Figura 8. De acuerdo a la placa de

cultivo en la cual se vaya a sembrar y según el diá metro, se recorta la submucosa sin hidratar, en la

cabina de flujo laminar, con todo el material previ amente esterilizado.

Figura 8. SIS deshidratada.

Fotografía de la autora

La submucosa se hidrató según la metodologías plant eada por Ángela Amórtegui en el 2005, que

utilizó co-cultivos de queratinocitos y SIS. La úni ca diferencia es que se usará el medio de cultivo

específico para las CMMs, el DMEM-LG.

Las láminas de SIS se hidrataron durante 24 horas c on 500 µl de SFB y antibiótico al 5% por pozo.

Esta mezcla se aspiró antes de agregar la suspensió n celular. (Amórtegui, 2005)

Se monitorearon diariamente mediante observación di recta con el microscopio invertido las

características morfológicas.

32

6.6.2 Expansión de las CMMs sobre SIS

Todos los cultivos se hacen en pozos de placas de 2 4: se recortan círculos de SIS, con un diámetro

de 1.56 cm, que caben en estos pozos. Para que las células no se caigan debajo de la SIS, y se corra

el riesgo de que se peguen a la placa de cultivo, e s necesario sellar los bordes de la SIS con un anil lo.

Este anillo es una parte de un falcon de 15 ml que se corta donde está la marca de 1ml y el otro

extremo se corta donde está la marca de 3 ml. Se pu eden cortar con segueta o con un bisturí caliente.

Luego la superficie del lado donde dice 1ml, se lij a para que quede lo mas liso posible, pues ese es e l

lado que va a estar en contacto con la SIS. Si no q ueda bien liso, se corre el riesgo, que las células al

ser sembradas, se caigan unas y crezcan pegadas a l a placa de cultivo y no sobre la SIS.

En cada pozo se siembra la cantidad de células dese adas, con un volumen final de 1 ml de medio.

6.6.3 Verificación de que las CMMs se están adhirie ndo a la SIS

Para comprobar que las células si se estaban pegand o en la SIS, se decidió hacer tinciones sobre

esta, con 3 diferentes colorantes: Hematoxilina Eos ina, Cristal Violeta y Giemsa Wright.

6.6.3.1 Hematoxilina Eosina

La Hematoxilina es un colorante que tiñe componente s de carácter acido de color violeta. Colorea el

núcleo pues el ADN está cargado negativamente. La E osina es un colorante acido que se enlaza a los

componentes celulares de carga positiva pues su pol aridad es negativa. Colorea solamente los

componentes citoplasmáticos mas no los nucleares.

Metodología: La SIS se lava con agua corriente, luego se agrega la hematoxilina, (la suficiente

cantidad como para que el tejido quede totalmente c ubierto) por 45 segundos. Luego se lava con agua

amoniacal y finalmente se agrega la eosina, y se de ja 20 segundos. Nuevamente se lava el tejido, y

se observa al microscopio.

6.6.3.2 Cristal Violeta

Es un colorante catiónico que reacciona con radical es ácidos y forma sales con los ácidos nucleicos.

33

Metodología: Se retira la SIS del pozo de cultivo y se pone sob re un portaobjetos. Se hacen 3

lavados PBS 1X, con cuidado de no dejar caer la SIS . Se fijan las células que están en la SIS con

metanol al 1% en PBS 1X durante 5 minutos, luego es to se descarta. En seguida se agregan unas

gotas que cubran la SIS con Cristal Violeta, se esp eran 5 minutos y se retira el colorante lavando con

agua destilada

6.6.3.3 Giemsa Wright:

Colorante constituido por una mezcla de azul de met ileno y eosina, que es captada por la célula.

Este, ingresa al núcleo y allí se une a los grupos fosfatos del ADN en las regiones donde hay grandes

cantidades de puentes Adenina-Timina, y colorea el núcleo de rosado o magenta, el nucleolo en azul

oscuro y el citoplasma de gris-azul pálido.

Metodología: Se retira la SIS del pozo de cultivo y se pone sob re un portaobjetos. Se hacen 3

lavados PBS 1X, con cuidado de no dejar caer la SIS . Se fijan las células que están en la SIS con

metanol al 1% en PBS 1X durante 5 minutos, luego es to se descarta. En seguida se agregan unas

gotas que cubran la SIS de Giemsa, se esperan 5 min utos y se retira el colorante lavando con agua

destilada

6.6.4 Viabilidad y Proliferación

Se hacen las mismas pruebas que se realizaron con l os cultivos sin SIS

7. RESULTADOS

7.1 Obtención de Células Madre Mesenquimales (CMM)

Las CMM, fueron obtenidas a partir de 13 muestras d e medula ósea, de individuos sanos entre los 15

y 33 años. El volumen de aspirado de medula ósea os ciló entre 7 y 22 ml. Estas muestras fueron

recogidas entre Octubre de 2007 y Mayo de 2008 (ver tabla 1).

34

Tabla 1 Datos iniciales de las 13 muestras obtenida s

Tabla construida por la autora

El protocolo de obtención de CMM a partir del aspir ado de medula ósea, fue el mismo estandarizado

por Angélica Roa, en el 2007 (Ver anexo) para las m uestras 1 hasta la 10. Para las siguientes

muestras (11, 12 y 13), se agregó un paso: antes de agregar el aspirado de medula, sobre el Ficoll,

éste es diluido con PBS 1X estéril a una dilución 1 :1, para luego si agregar esta solución sobre el

Ficoll. Este procedimiento permite obtener una mejo r separación de las diferentes células de la

medula, permitiendo así una mejor obtención de las células mononucleares (ver Figura 9).

Figura 9. Separación de los componentes de la medula ósea po r medio de Ficoll

Tomado por la autora

Figura 9. Separación de los componentes de la medula ósea lu ego del gradiente de densidad con Ficoll Hipaque

Muestra Fecha de Recolección

Paciente (Genero/Edad)

Volumen Obtenido (ml)

Número de Células Mononucleares

1 Octubre 29 07 M - 25 18.5 29'500.000 2 Octubre 29 07 M - 33 7 34'500.000 3 Noviembre 11 07 M - 16 20 648'000.000 4 Noviembre 11 07 M - 31 17 22'500.000 5 Noviembre 7 07 M - 15 19 65'000.000 6 Noviembre 14 07 M - 27 22 119´200.000 7 Febrero 6 08 M - 30 17 49'000.000 8 Febrero 13 08 M - 25 13.5 40'000.000 9 Abril 2 08 M - 26 14 19'140.000

10 Abril 9 08 M - 23 15 31'500.000 11 Abril 30 08 M -17 19 23'700.000 12 Mayo 3 08 M - 26 15 37'000.000 13 Mayo 9 08 M - 18 20 9'800.000

35

a) Sin diluir la medula ósea en PBS y b) diluyendo la medula ósea en PBS, antes de agregarl a sobre el Ficoll

De las 13 muestras que se recogieron, las 6 primera s se murieron en diciembre al congelarlas. De

estas 6 muestras, para estandarizar el uso del MTT se usaron células de las muestras 3 y 6, mientras

que al resto de esos ensayos no se les alcanzó a ha cer ninguna prueba. Las muestras 7, 9 y 13

murieron entre los 8 y 25 días de cultivo. Con las células de la muestra 8, se estandarizaron las

concentraciones tanto de CFDA-SE como de 7AAD a usa r para las CMM además de usarlas para

conocer su inmunofenotipo. Por último, las muestras 10 y 11 fueron a las únicas a las que se les pudo

realizar las pruebas de citometría con CFDA-SE y 7A AD, para ver proliferación y viabilidad con las

CMM sobre la Submucosa y sobre la superficie plásti ca de las placas de cultivo.

7.2 Caracterización Morfológica de las Células Madr e Mesenquimales

Al ser sembradas en P0, y por los siguientes 3 o 4 días en promedio, las células mantienen una

morfología redondeada (Figura 10.a). Luego de este tiempo, se empiezan a observar células que se

empiezan a adherir y a alargar en la placa de culti vo, más o menos hasta los 9 días (Figura 10.b).

Después de aproximadamente 29 días en promedio, cua ndo las células están alcanzando la

confluencia para pasar a P1, las células empiezan a formar colonias. (Figura 13). La morfología de las

células cuando están muy confluentes, es mas pequeñ a y mas alargada, de tipo fibroblastoide,

mientras que las células tiene una baja confluencia (Figura 10.c), son un poco mas grandes y

presentan morfología más variada, como por ejemplo, con una, dos, 3 o más prolongaciones (Figura

11). Cuando las células ya no se dividían, y estaba n durante más tiempo en la placa de cultivo, sin se r

tripsinizadas, la morfología de las células cambiab a, estas empezaban a aplanarse y a aumentar el

número de prolongaciones cortas. (Figura 10.e).

La mayoría de las veces, las células en P0 formaban colonias (Figura 13), y en los siguientes pases el

cultivo se homogenizaba, y no se volvían a agrupar (Figura 10.d). Sin embargo las células de algunas

muestras, nunca formaron colonias en P0, y menos en los siguientes pases.

36

Figura 10. Cambio de la morfología de las CMMs a medida que pa saba el tiempo de cultivo


Figura 10. Tipo de morfologías de las CMMs a medida que aument aban los días de cultivo a) células redondeadas en P0,

donde todavía no se han adherido a la placa de cult ivo, b) Células que empiezan a pegarse y a alargarse luego de

aproximadamente 4 días, c) Colonias de tipo fibroblastoide formadas por las C MM, d) Diferentes morfologías celulares

cuando están en bajas densidades, e) Células muy aplanadas en la placa de cultivo con v arias prolongaciones cortas.

Figura 11. Diferentes morfologías de las CMMs.


37

Figura 11. Estas fueron las morfologías que se observaron dura nte la expansión in vitro de las CMMs. Las morfolog ías de la

a) a la g) se encuentran en cultivos activos, mient ras que las morfologías h) e i), se encuentran en c ultivos que ya casi no

proliferan.

El seguimiento de la morfología de las CMM cultivad as sobre la SIS, no se pudo llevar a cabo ya que

al observar por el microscopio invertido, no se pod ían evidenciar las células, solo la matriz Figura 1 2

Figura 12. CMMs cultivadas sobre superficie plástica y sobre SIS.


Figura 12. CMM vistas por medio del microscopio invertido: a) cultivadas sobre una superficie plástica y b) culti vada sobre la

submucosa intestinal porcina.

7.3. Identificación de Unidades Formadoras de Colon ias Fibroblastoides (UFC-F)

Este ensayo solo se hizo con una muestra, ya que pa ra realizarlo, se necesita utilizar todo el frasco de

cultivo, y no se disponían de suficientes células p ara hacer el ensayo con más muestras, dado que las

células que son teñidas con Giemsa, ya no se pueden continuar en cultivo. Estas fueron las mismas

limitantes que tuvo el trabajo de Angélica Roa, 200 7. Sin embargo el ensayo que se hizo, muestra

claramente la formación de colonias al día 12 de cultivo en P0. Figura 13 Este ensayo se realizo uno

de los frascos de la muestra 3. La densidad inicial de siembra fue de 10 millones de células

mononucleares. Se contaron macroscópicamente, 30 co lonias en el frasco. Lo cual coincide con lo

que Angélica Roa en el 2007 estandarizó (Roa, 20007 ).

38

Figura 13. Colonias vistas macroscópicamente.


Figura 13. Las colonias pueden ser observadas a simple vista, en este caso se contaron 30 colonias macroscópicam ente

Con la SIS no se realizo este ensayo ya que no se h abía estandarizado el cultivo de las CMMs sobre

este material, además se hubiera tenido que hacer e n un frasco de 25, y no teníamos el número de

muestras suficientes como para hacer ese ensayo sin saber cómo las íbamos a cultivar

satisfactoriamente. El proceso de estandarización d el cultivo de estas células fue lento, y no hubo

tiempo para probar si se formaban colonias. Además, las células no podían verse a simple vista como

si se podía ver en la superficie plástica de los fr ascos de cultivo. Por estas razones, no se hicieron

ensayos de UFC-F sobre la SIS.

7.4 Estandarización del cultivo de CMMs sobre la SI S.

Ya que los cultivos de CMMs sobre la SIS se llevaro n a cabo sobre placas de 24 pozos, se cortó la

matriz en círculos que encajaran perfectamente en e stos pozos, tal como lo hizo María Ximena Borras

en el 2005 pero en una placa de 96 pozos. La metodo logía de hidratación de la SIS, estandarizada

por Ángela Amórtegui en el 2005, proponía dejar la SIS con el SFB durante 18 a 24 horas, sin

embargo en este estudio se decidió dejarla siempre 24 horas, ya que se observaba que al dejarla 24 y

no 18 horas, era más fácil su manipulación, pues la SIS tenía una consistencia más suave.

Una vez transcurrían las 24 horas de hidratación, e l SFB era retirado por completo de cada pozo, y se

agregaban las células resuspendidas en 1 ml de medi o DMEM-LG. Las células se dejaban en cultivo,

y se revisaban a las 24 horas de haber sido sembrad as.

39

En las primeras siembras, se notaba que las células crecían muy bien debajo de la SIS, adheridas a la

placa de cultivo. Al agregar medio sobre la SIS, es ta flotaba un poco y cuando se agregaban las

células, algunas de ellas lograban llegar a la part e baja del pozo, y no se quedaban sobre la SIS. Est o

hacía imposible poder medir su viabilidad y prolife ración, pues no se tenía seguridad de la cantidad

inicial de células que quedaba sobre la matriz. Por esta razón, para evitar que las células se cayeran

al ser sembradas, se cortaron unos anillos a partir de tubos falcón de 15 ml. Los anillos se ponían

dentro de cada pozo, sobre la SIS hidratada, esto a justaba la matriz en sus bordes, manteniendo las

células sembradas, sobre el área de la SIS. De esta forma nos asegurábamos que esas se

mantuvieran sobre la SIS y no debajo de ella. Figur a 14

Figura 14. Anillos usados para cultivar las CMMs sobre la SIS.


Aun cuando se cortaron estos anillos, todavía había unas pocas células que se salían, y esto se debía

a que sobre el borde del anillo que estaban en cont acto con la SIS, tenia pequeñas ondulaciones que

permitían el paso de unas pocas células, de esta fo rma, se decidió lijar los bordes de los anillos par a

evitar filtraciones. Otra de las razones por las cu ales no era posible ajustar perfectamente la SIS co n

los anillos, era que siempre eran puestos después d e quitar el SFB (después de las 24 horas) de la

SIS, y cuando esta quedaba sin líquido, se pegaba a l piso del pozo de forma irregular y su

manipulación para alisarla no es tan fácil. De esta manera cuando los anillos se ponían, muchas

veces la SIS estaba desplazada y por ahí podían fil trarse.

Tener la superficie del borde de los anillos comple tamente lisos para que no se salieran las células,

era muy complicado y siempre se corría el riesgo de perder células, por esta razón se realizó una

nueva metodología para poner en los pozos, la SIS y los anillos. Para esta metodología, los círculos

40

de SIS deshidratados se recortan con el diámetro 6 mm más grandes que los anteriores y se ponen

sobre el anillo. Sobre los bordes del anillo que es tán en contacto con la SIS se agregan unas góticas

de SFB, y este se deja secar por aproximadamente 20 minutos. Figura 15 De esta forma, la SIS

queda pegada al anillo y así se introduce en los po zos. El procedimiento de hidratación y cultivo se

sigue como fue nombrado anteriormente.

Figura 15 . Anillos con la SIS adherida a ellos por medio de SFB.


7.5 Estandarización del Uso de MTT para Medir Prol iferación y Viabilidad de CMM Cultivadas con y sin SIS

El proceso de estandarización se llevo a cabo con f ibroblastos ya que se derivan de las CMMs,

comparten la morfología, y el patrón de crecimiento , siendo comparables los resultados que se

obtendrían. Además el número de CMMs obtenido entre los diferentes ensayos fue muy bajo lo que

impedía utilizar concentraciones altas de células d urante la estandarización, a diferencia de los

fibroblastos de los cuales se disponía un buen núm ero de células dado su rápido patrón de

proliferación y expansión in Vitro.

Al iniciar el proceso de estandarización del uso de MTT sobre la SIS, se usó el procedimiento descrito

por Angélica Roa en el 2007, y luego se fue modific ando.

Cuando se usaba el MTT sobre las células cultivadas en las placas de cultivo (superficie plástica) era

fácil visualizar los cristales de formazán, sin emb argo no era posible verlas cuando se cultivaban

sobre la SIS (ver Figura 16.).

41

Figura 16. Cristales de Formazán en células cultivadas con y sin SIS


Figura 16. a) Cristales de Formazán en células cultivadas sobre la superficie plástica, luego de agregar el MTT y b) así se ve

la SIS (con células cultivadas en ella) luego de se r teñida con MTT.

Luego de retirar la solución de MTT, se agrega el S DS y se deja media hora. Después de este tiempo,

el líquido se torna de color morado, más oscuro o m as claro, según la cantidad de células que estén

sembradas en el pozo. En los pozos donde estaban la s CMMs sembradas sin SIS, el líquido si se

tornaba morado, pero en los pozos con células sembr adas sobre la SIS, el líquido permanecía de

color amarillo oscuro y no se veía morado (ver Figu ra 17.a).

Al ver que no había color en la solución de los poz os que tenían SIS, se pensó que podría ser el

disolvente el que no estaba actuando bien, ya que m uchos casos, la SIS presentaba manchas de

color morado que no se disolvían (ver Figura 18). P or esta razón se decidió probar con Isopropanol,

un alcohol que funciona también como disolvente, el cual sí hizo que el líquido en los pozos con SIS,

se volviera morado (ver Figura 17. b).

42

Figura 17. MTT con y sin SIS usando Isopropanol y SDS


Figura 17. a) Placa de 96 donde se ve en los pozos de la izquier da, (donde se sembraron los fibroblastos sobre la S IS), que

la solución no es morada, si no de color amarillo o scuro. Por otro lado, en los pozos de la derecha, ( donde se sembraron las

células sin SIS) si se ve el liquido morado, más os curo, donde se sembraron mas células y más claro do nde hay menos

células. b) En los pozos donde había SIS, ya se ve la solución de color morado cuando se utiliza Isopropanol en v ez de SDS.

Figura 18. SIS con manchas moradas


Figura 18. Después de retirar el SDS de los pozos con Isopropa nol, se podía ver que la SIS se ponía de color mora do

A pesar de haber obtenido estos resultados, se quer ía estandarizar el disolvente más apropiado para

este tipo de pruebas, y la cantidad de tiempo exact a que este se debía dejar.

Se diseño una metodología para poder conocer cuál e ra el disolvente que daba mejores resultados y

mejoraba la lectura en el Tecan. Las células sembra das tanto en la S

de los pozos, se analizaron a las 31 horas de haber sido sembradas. Unos pozos se dejaron 30

minutos con el disolvente (tanto el Isopropanol com o el SDS), otros 1 hora y otros 2 horas (Figura 19) .

Esto, con el fin de ver, si realmente funciona más uno de los dos disolvente s, y si el tiempo que se

deja cada uno de ellos influye en la lectura de la

Figura 19. Metodología para MTT con y sin SIS, con Isopropanol y SDS

Figura 19. Se sembraron dos placas de 24 pozos, una de ellas t enía células sembradas sobre la SIS, y la otra teni a células

sembradas sobre la superficie plástica de la placa de cultivo. La mitad de cada una de las dos placas, se usaba SDS y

otra mitad de cada una, se usaba Isopropanol. Unos pozos se dejaban con el disolvente 30 minutos (recu adro rosado), otros

1 hora (recuadro amarillo) y otros 2 horas (recuadr o azul).

Para las células sembradas sin SIS, los mejores res ultados se prese

Figura 20.a y para las células sembradas con SIS, l os mejores resultados se presentaron cuando se

uso Isopropanol Figura 20.b. También se puede ver q ue las barras más altas se presentan cuando se

deja solamente media hora el disol vente, y no 1 o 2 horas.


mejoraba la lectura en el Tecan. Las células sembra das tanto en la SIS como en la superficie plástica



si realmente funciona más uno de los dos disolvente s, y si el tiempo que se

deja cada uno de ellos influye en la lectura de la absorbencia en el Tecan.

Metodología para MTT con y sin SIS, con Isopropanol y SDS

Se sembraron dos placas de 24 pozos, una de ellas t enía células sembradas sobre la SIS, y la otra teni a células

sembradas sobre la superficie plástica de la placa de cultivo. La mitad de cada una de las dos placas, se usaba SDS y


1 hora (recuadro amarillo) y otros 2 horas (recuadr o azul).

Para las células sembradas sin SIS, los mejores res ultados se presentaron cuando se uso SDS,



vente, y no 1 o 2 horas.

43


IS como en la superficie plástica



si realmente funciona más uno de los dos disolvente s, y si el tiempo que se


Se sembraron dos placas de 24 pozos, una de ellas t enía células sembradas sobre la SIS, y la otra teni a células

sembradas sobre la superficie plástica de la placa de cultivo. La mitad de cada una de las dos placas, se usaba SDS y en la


ntaron cuando se uso SDS,



44

Figura 20. Resultado del MTT con y sin SIS, con Isopropanol y SDS

Realizado por la autora

Figura 20. En este ensayo con MTT se realizó a las 31 horas d e haber sembrado las células. Se probo dejar el dis olvente

con las células, 30 minutos, 1 hora y 2 horas, tant o en a) pozos sin como en b) pozos con SIS. Los recuadros amarillos

resalta el mejor resultado en cada caso.

Como se observó que aparentemente para la SIS era m ejor usar Isopropanol, y para pozos sin SIS,

era mejor usar SDS, el siguiente ensayo se realizó de igual forma que el anterior, pero ahora se

quería rectificar cuanto tiempo debía dejarse el di solvente. Además de esto, el ensayo de MTT se

realiza a las 31, 48, y 72 horas de haber sembrado las células. Esto se hizo con el fin de ver si con

esta prueba se podía ver el aumento del número de c élulas (reflejado en el aumento de la

absorbancia), a medida que pasaba el tiempo (ver Fi gura 21).

45

Figura 21. Resultado del MTT con y sin SIS a las 31, 48 y 72 horas de cultivo.


Figura 21. Ensayos realizados a las 31, 48 y 72 horas, para p ozos a) con SIS y b) sin SIS, dejando el disolvente 30 minutos,

1 hora y 2 horas.

En estas gráficas se puede confirmar que dan mejore s resultados dejando el disolvente respectivo

solo 30 minutos y no 1 hora o 2 horas, pues la abso rbancia, medida dejando el disolvente 30 minutos,

aumenta a medida que pasan las horas (recuadros ama rillos). Cuando se dejaba el disolvente más

tiempo (1 o 2 horas), los resultados no eran consis tentes con el principio de aumento de la

absorbancia a medida que aumenta el número de célul as. En las graficas también se puede observar

que en general a medida que aumenta el tiempo de cu ltivo, las células si aumentan en su número, lo

cual se ve reflejado en el aumento de la absorbanci a a medida que las horas de cultivo aumentan.

7.6 Tinciones sobre la SIS

Para poder saber si sí se estaban pegando las célul as sobre la SIS, se decidió, teñir la submucosa

con 3 colorantes diferentes: Hematoxilina Eosina, Giemsa Wright y Cristal Violeta (Figura 22).

Tanto en la tinción con Hematoxilina Eosina como co n el Cristal Violeta, la SIS absorbe el colorante,

que no se ve el contraste entre la SIS y las célula s que están cultivadas en ella. Sin embargo, el

colorante Giemsa Wright, no lo absorbe tanto y se v e el contraste entre las células y la matriz (ver

46

Figura 22). Las flechas señalan puntos rosados sobr e la SIS en el recuadro de Giemsa Wright). Esta

tinción comprobó, que si se están pegando las célul as en la SIS.

Figura 22. Tinciones sobre la SIS con Hematoxilina Eosina, Cr istal Violeta y Giemsa Wright.


Figura 22. En cada uno de estos recuadros se ve la SIS teñida con Hematoxilina Eosina, Giemsa Wright y Cristal Viole ta.

Solo con Giemsa Wright, se ve diferencia entre la S IS que tenía células, de la que no tenía células cu ltivadas sobre ella.

Cuando hay células, se ven unos pequeños puntos ro sados.

7.7 Tripsinización y Desprendimiento Mecánico de la s CMM cultivadas sobre la SIS

Ya que con los procedimientos anteriores no se podí a cuantificar la proliferación y la viabilidad de l as

células cultivadas sobre la SIS, se decidió intenta r despegar las células de esta matriz por dos

47

métodos. Uno de los procedimientos propuestos, fue usar una espátula en polietileno (Cell Lifter

Polyethylene Sterile ®) que se tuvo que cortar por la mitad pues no cabía en los pozos de la placa de

24. Figura 23.a. para raspar la SIS y desprender la s células que estaban adheridas a ella. Lo que se

hacía era que se cambiaba de pozo la SIS (para evit ar contar células que estaban despegadas y

flotando en el medio, o que se hubieran desprendido de la SIS y crecieran células sobre la superficie

plástica, que podrían ser removidas con el rastrill o) para solo contar las células que estaban sobre

esta. Se agregaban 500 µL de tripsina 0.5% y se ra spaba la SIS con la espátula de forma homogénea

(por toda la SIS) durante aproximadamente 2 minutos . Luego se contaban las células del

sobrenadante.

En el otro método propuesto, se despegaron las célu las que estaban sobre la SIS, como se hace

normalmente con las células que están sobre la plac a de cultivo, con tripsina al 0,5%.Figura 23.b. Lo

que se hizo fue cambiar la SIS de pozo (por lo ante riormente nombrado) y agregar 500 µL de Tripsina

al 0.5%. Esta se dejo aproximadamente 2 minutos mie ntras se pipeteaba suavemente. Luego se

contaban las células del sobrenadante, que eran las que se habían despegado.

Figura 23. Espátula para raspar la SIS y tripsina


Figura 23. a) Esta es la espátula que se usó para raspar la SIS y despegar las células. También se usó b) tripsina al 0,5%

para despegar las células de la SIS

Con los dos métodos, las células se desprendieron d e la SIS (Figura 24). Sin embargo, después de

llevar a cabo los dos procedimientos, se pudo obser var que al despegar las células con el rastrillo,

había más células muertas que cuando se despegaban con tripsina (datos no mostrados). Se decidió

seguir solo con el procedimiento de tripsinizar las células, ya que es un proceso donde no hay tanto

daño mecánico de las células y es una forma más fác il de llevar a cabo homogéneamente.

48

Figura 24. Células despegadas con tripsina y con la espátula.


Figura 24. En ambos casos, se corrió hacia un lado la SIS (lad o derecho), para ver las células que flotaban (punt os) luego

de despegarlas con a) la tripsina y con b) la espátula.

Con ensayos posteriores, se pudo observar que se es taban adhiriendo la misma cantidad de células y

a una misma velocidad, tanto a la superficie plásti ca de la placa de cultivo, como a la SIS, ya que el

número de células en el sobrenadante era muy simila r. Figura 25.a). También se pudo observar que

se despegaban más células de los pozos donde no est aban sembradas sobre la SIS, que en los

pozos donde sí estaban sembradas con la SIS, aun cu ando la densidad celular de siembra en ambos

ensayos era el mismo. (ver Figura 25.a).

Ya que la viabilidad de estas pocas células que si se podían despegar de la SIS era casi tan alta como

la de las células que se despegaban totalmente de l a superficie pastica de la placa de cultivo Figura

25.b), se decidió tripsinizar por mas tiempo pero sin correr el riesgo de disminuir la viabilidad cel ular,

por esta razón el procedimiento a seguir fue: adici ón de tripsina que se dejó sobre la SIS 2 minutos,

mientras se pipeteaba suevamente sobre esta para ac elerar el proceso de desprendimiento. Pasado

este tiempo, se inactivó la tripsina con medio DMEM suplementado, y se retiró esta solución. Una vez

se había retirado, se volvió a llevar a cabo el pro cedimiento nombrado anteriormente, unas 2 veces

más para despegar CMMs. De esta forma se obtuvieron más células sin disminuir su viabilidad.

49

Figura 25. Número de células y su viabilidad al ser tripsiniza das.


Figura 25. Después de sembrar 10.000 células en cada pozo, y d e esperar 16 horas, para que se pegaran pero no se

dividieran, se pudo observar que a) se pegan más o menos la misma cantidad de células a la SIS y a la placa de cultivo, sin

embargo se desprenden más fácil de la superficie pl ástica que de la SIS. b) Las células que quedan en el sobrenadante la

mayoría son células muertas pues la viabilidad es d e un poco más del 40%, mientras que la viabilidad d e las células

tripsinizadas si es alta, más o menos del 80%, tant o en las células con SIS como en las que no tenían SIS.

Ya que se estandarizó la forma de despegar las célu las de la SIS para tenerlas en suspensión, se

pudo cuantificar su proliferación y su viabilidad p or medio de una técnica muy confiable, la citometrí a

de flujo.

7.8 Citometría de Flujo para medir Viabilidad y Pro liferación

Antes de usar el 7AAD para medir la viabilidad de l as CMM, se debe estandarizar la concentración a

la cual será usado, pues en bajas concentraciones s e corre el riesgo que no tiña el total de las célul as,

por el contrario, en altas concentraciones, llega a ser toxico. Por esta razón se lleva a cabo la

titulación de este fluorocromo:

50

7.8.1. Titulación 7AAD:

Los resultados de los análisis que se obtienen a pa rtir del citómetro de flujo, son diagramas de punto s,

que se distribuyen a lo largo del eje Y según la gr anularidad citoplasmática, y a lo largo del eje X,

según si están vivas (7AAD -) o muertas (7AAD +). E n estas gráficas, el rango entre 10 0 y 101, se

considera negativa, para la fluorescencia de las cé lulas, por esta razón, los puntos situados en este

rango se consideran células vivas pues no fluorescen ya q ue no adquirieron el 7AAD, indicando que la

integridad de su membrana esta intacta y no permiti ó la entrada del fluorocromo a la célula. Por el

contrario, las células que se encuentren después de 101 se consideran células muertas ya que

presentan fluorescencia.

Para conocer cual era la concentración óptima a usa r de este reactivo para estas células se llevo a

acabo una titulación del 7AAD. Se utilizaron volúme nes desde 2 µL (0.1 µg/test), hasta 10 µL (0.5

µg/test), y se pudo observar que cuando se utilizab an bajas concentraciones no todas las células se

teñían dando como resultado la difícil diferenciaci ón entre la población de células vivas y de la

población de las células muertas (Figura 26.a). Por el contrario, al utilizar 10 µL, la dosis más alta

usada en este estudio y la recomendada por la casa comercial, se separaron claramente las dos

poblaciones haciendo mucho más fácil identificar co n que células se van a llevar a cabo todos los

análisis posteriores (Figura 26.b).

Figura 26. Tinción con dos dosis de 7AAD: 2 µL y con 10 µL.


Figura 26. Tinción con dos dosis de 7AAD: 2 µL (a) y con 10 µL (b)

51

En la Figura 27, se puede ver que a medida que la d osis de 7AAD aumenta, un mayor número de

células se tiñen, y por esto aumenta la intensidad de fluorescencia de la muestra.

Figura 27. Titulación del 7AAD.


Figura 27. Titulación del 7AAD, a medida que aumenta la conce ntración de 7AAD en la suspensión celular, un mayor

número de células se tiñen. “Test” se refiere a 1X1 06 células. En volumen de reactivo: 0.1µg = 2µL; 0.2 5 µg = 5 µL; 0.5 µg =

10 µL

7.8.2. Titulación CFDA-SE Los resultados que se obtienen a partir de un análi sis por Citometría de flujo, se representan en

gráficos mediante el programa CellQuest Pro. Inicia lmente se seleccionan las células viables (7AAD -)

y posteriormente los resultados se representan en h istogramas, en donde se observa el número de

células en estudio en el eje Y y la intensidad de l a fluorescencia correspondiente al marcador que se

va a analizar en el eje X, como se muestra en las g ráficas de la Figura 28. El citómetro analiza las

células, y otorga una intensidad de fluorescencia d e mayor a menor para el marcador en cada célula

individual, de esta forma se ubican los picos en el eje X. Las células que se encuentran en el rango

de 100 a 101 se consideran negativas para el CFDA-SE.

Para la titulación del CFDA-SE, se agregaron difere ntes concentraciones del marcador a las células

así: 0.5 µM, 1 µM, 2.5 µM y 5 µM Figura 29. Esto, c on el fin de ver, que concentración se ajustaba

mejor a las condiciones del experimento y que permi tiera calcular el porcentaje de células que

0

10

20

30

40

50

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6Inte

nsis

dad

de F

luor

esce

ncia

del

7A

AD

Dosis (µg/test)

Titulacion del 7AAD

52

proliferaban. Al realizar la prueba con las diferen tes concentraciones de CFDA-SE se observó que con

bajas concentraciones las células no se teñían toda s, dando como resultado una baja fluorescencia

inicial (pico cercano al rango de 10 0 a 101) Figura 28.b. Si esto pasa cuando las células prol iferen, los

picos de fluorescencia se van a correr en pocos día s hasta el rango de células negativas para CFDA-

SE, y una vez allí, no se puede diferenciar si esta s células ya perdieron toda su fluorescencia o

simplemente siguen proliferando y mostrando fluores cencia que ya no se puede medir y analizar por

estar dentro del rango de células negativas para CF DA-SE. Por el contrario, si el pico inicial de

fluorescencia se encuentra cercano a 10 4, las células van a poder proliferar durante mas dí as y se va

a poder llevar a cabo una medición más completa sob re la proliferación de estas células como se

observa en la Figura 28.a.

Figura 28. Histograma de proliferación celular con CFDA-SE.


La titulación de este fluorocromo muestra que para una optima tinción de estas células, una dosis de

0.5 µM, es muy baja y no tiñe todas las células. La concentración más alta usada para la titulación fu e

de 5 µM, sin embargo, como el pico inicial todavía estaba corrido hacia la izquierda, se decidió hacer lo

con 8 µM y el pico que se presentó en los análisis estaba más hacia a la derecha de 10 3 (datos no

mostrados), por esta razón, se decidió que la dosis optima para marcar estas células es la de 8 µM

pues tiñe la mayoría de las células y permite tener un pico inicial optimo para medir la proliferación de

estas células. También se probó con una dosis de 10 µM, pero la mayoría de las células que

a.

CFDA-SE

Núm

ero

de C

élul

as

b.

CFDA-SE

Núm

ero

de C

élul

as

53

adquirieron el CFDA-SE murieron, lo cual puede esta r indicando, que esa dosis, ya es toxica para las

CMM (datos no mostrados).

Figura 29. Titulación CFDA-SE.


Figura 29. Titulación CFDA-SE. A medida que la dosis de CFDA- SE aumenta, más células se tiñen, y aumenta la inte nsidad

de fluorescencia

7.8.3. Análisis de viabilidad y proliferación con 7 AAD y CFDA-SE

Este análisis solo se pudo llevar a cabo con una mu estra, la 11. Al marcar las células con CFDA-SE y

dejarlas en cultivo por 3, 5, 7 y 9 días, se pudo o bservar la proliferación de estas células sobre la SIS

y sobre las placas de cultivo de superficie plástic a, además de su viabilidad en cada uno de estos

tratamientos.

Las células marcadas y cultivadas, al ser tripsiniz adas se marcaban con 7 AAD y se pasaban en el

citómetro de flujo. Una de las primeras diferencia s que se observaron a simple vista en los resultado s

arrojados por el clitómetro, entre las células cult ivadas sobre la SIS con respecto a las cultivadas

sobre la superficie plástica de los frascos, es que el total de células obtenidas de la matriz es much o

mayor al número de células que se obtienen al trips inizar las células de la placa de cultivo (ver Figu ra

30).

0

200

400

600

800

1000

0 2 4 6

Inte

nsid

ad d

e Fl

uore

scen

cia

del C

FDA

-SE

Dosis (µM)

Titulacion de CFDA-SE

54

En la Figura 30 las dos gráficas de la izquierda, r epresentan la población de células vivas (células a l

lado izquierdo del valor 10 1, en el eje X, pues no fluorescen) y la población d e células muertas

(Células al lado derecho del valor 10 1, en el eje X, pues presentan fluorescencia).

Por otro lado, las graficas de la derecha, represen tan las células vivas, pero separadas en

subpoblaciones poblaciones según su tamaño celular y la granularidad citoplasmática. En este caso,

las células en la ventana grande, son llamadas célu las madre Mesenquimales maduras (mMSC, de

ingles mature Mesenchymal Stem Cells), las cuales son de gran tamaño, alta granularidad

citoplasmática y baja capacidad de proliferación. L as células en las ventanas pequeñas, son llamadas

RS-1, y son células pequeñas, con baja granularidad citoplasmática y alta capacidad de proliferación.

En la grafica b. de la izquierda, podemos ver que e sta marcada otra población celular, las RS-2, son

células pequeñas pero con una alta granularidad cit oplasmática, sin embargo, en este estudio no se

analiza esta subpoblacion celular. (Colter et. al. 2000)

55

Figura 30. Diagrama de puntos: Viabilidad celular, tamaño y gr anularidad.


Figura 30. Estas figuras muestran la diferencia, a simple vis ta, en el número de células que se obtienen al cult ivarlas sobre

una a) superficie plástica y sobre la b) SIS, en la cual se obtienen claramente más células después de 3 días de haber sido

sembradas.

Se llevó a cabo la cinética de crecimiento de las C MMs desde el día 3 hasta el día 7 de cultivo, sin

embargo las graficas que se presentan a continuació n, están hasta el día 9, esto se debe a que con la

misma muestra, se hicieron dos experimentos indepen dientes, el primero se observo solamente hasta

el día 9 de cultivo, y se vio que las mayoría de la s células sobre la SIS ya habían proliferado, por e sta

razón se decidió llevar a cabo otro experimento (co n la misma muestra) en el que se midió su

proliferación durante toda una semana, a los días 3 , 5 y 7. Se decidió unir los resultados, para poder

a.

b.

Intensidad de Fluorescencia del 7AAD

Tamaño Celular

Tamaño y Granularidad Celular de las Células sembr adas sobre la SIS

Muertas

Muertas

Vivas

Vivas

mMSC

mMSC

RS-1

RS-1

RS-2

56

ver como se comportaban, sin embargo no se pueden o btener conclusiones acertadas sobre la

cinética completa incluyendo este día, ya que como se dijo anteriormente, es de un experimento

independiente.

El número total de células obtenidas, en general, f ue mayor cuando las células se cultivaban sobre la

SIS (línea roja). Sin embargo la tendencia del núme ro de células a medida que aumentan los días de

cultivo, es extraña, y posiblemente se debe a la fa lta de estandarización del proceso de tripsinizació n,

lo cual hace que no sea homogéneo todo el tiempo (v er Figura 31).

Figura 31. Número de células teñidas y no teñidas cultivadas c on y sin SIS


Figura 31. Número total de células que se obtuvieron después d e tripsinizar cada pozo de cultivo, tanto teñidas c omo no

teñidas, con y sin SIS. Siempre se obtuvieron más c élulas cuando eran cultivadas sobre esta matriz que cuando eran

cultivadas sobre la superficie plástica de las plac as de cultivo.

En cuanto a la viabilidad celular, no se ve mucha d iferencia entre los porcentajes de células muertas

que se están obteniendo, sin embargo, el porcentaje de células muertas si es menor cuando se

cultivan sobre la SIS (Figura 32) También se observ a que en los dos tratamientos, la viabilidad tiende

a aumentar a medida que pasan los días de cultivo, sin embargo parece como si hasta el día 5 de

cultivo, la viabilidad se mantienen más o menos igu al, mientras que desde el día 7, esta empieza a

aumentar has aun que después del día 8 tienden a es tabilizarse

57

Figura 32. Viabilidad celular de CMMs sembradas con y sin SIS .


Figura 32 . Viabilidad Celular de las CMMs sembradas en la S IS y en las placas de superficie de plástico. Es le vemente

mayor la viabilidad de las células cultivadas sobre la SIS, sin embargo son valores cercanos.

En los análisis de Citometría de flujo, se observan las 3 subpoblaciones de CMMs reportadas por

Colter et. al. 2000, las células maduras (mMSC), las RS-1 y las R S-2, sin embargo, en este estudio

solo se evaluaron las dos primeras. En la Figura 33 se muestra tanto el porcentaje de células que

están todavía proliferando (M1), como el porcentaje de células que ya proliferaron (M2). Las barras

rojas y moradas representan el porcentaje de célula s mMSC y RS-1, respectivamente, que ya

proliferaron; mientras que las barras azules y verd es representan el porcentaje de células mMSC y

RS-1, respectivamente, que todavía están proliferan do. A simple vista se puede observar que la

grafica que representa las células cultivadas sobre la SIS, tiene las barras moradas y rojas mucho

más altas que las azules y verdes, es decir que la mayoría de las células ya proliferaron, (barras roj as

y moradas más altas), y que al parecer, sobre la SI S, no hay mucha diferencia entre la velocidad de

proliferación de las mMSC con respecto a las RS-1 p ues se puede observar que las barras están más

o menos con una altura similar. Por el contrario, s obre la placa de cultivo de superficie plástica, no

todas las células han proliferado, todavía se ven b arras azules y verdes, que disminuyen en el tiempo,

mientras que las barras rojas y moradas aumentan. C uando se cultivan las células sobre esta

superficie plástica, si se observan diferencias ent re la velocidad de proliferación de las mMSC y las

RS-1, pues se ve que las barras verdes (% de RS-1 q ue están proliferando) disminuyen más rápido

que las barras azules (% de mMSC que están prolifer ando).

84

86

88

90

92

94

96

98

0 2 4 6 8 10

% d

e V

iabi

lidad

Días de Cultivo

Viabilidad Celular

SIS

58

Figura 33. Proliferación celular de CMMs sembradas con y sin SIS.


Figura 33. El en grafico a) se observa que la mayoría de las células ya proliferaron (barras rojas y moradas), m ientras que

las células que todavía están proliferando activame nte quedan pocas. Por el contrario, en la grafica b ) se observa que las

tanto las barras azules como las verdes (células qu e todavía están proliferando) van disminuyendo, es decir que las células

que están proliferando a medida que pasa el tiempo, van siendo cada vez menos. Esto se observa con el aumento de las

barras rojas y moradas, a diferencia de las barras rojas y moradas que van aumentando.

8. DISCUSIÓN

El gran potencial de diferenciación y de regeneraci ón celular, hacen de las Células Madre, una

herramienta muy útil para enfrentar enfermedades qu e surgen a raíz de procesos fisiopatológicos que

impiden una adecuada regeneración tisular. Las Célu las Madre Mesenquimales, un grupo de Células

Madre Adultas, han despertado un gran interés en el ámbito científico y clínico, ya que se encuentran

en diversos tejidos, y pueden diferenciarse a vario s linajes celulares, entre ellos: osteoblastos,

adipocitos, condrocitos, miocitos (Short B et al, 2 003), células cardiacas (Xu W et al, 2004; Shim WS

et. al., 2004; Makino S et. al., 1999), y neuronas (Wislet-Gendebien S et. al., 2005).

En 1927 Fiedestein et. al., aislaron por primeras vez CMM a partir de medula ósea, y probaron, que

podían diferenciarse a hueso y a cartílago. En estu dios posteriores de Kuznetsov et al. en el 97,

encontraron que esta población de células estromale s, formaban colonias en respuesta a factores de

crecimiento tales como el de transformación, el der ivado de plaquetas y el fibroblastoide. Más

adelante, Pittenger et al., en el 99 comprobaron que estas células estromale s adheridas a la placa de

cultivo, tenían un alto potencial de diferenciación , no solo a los dos linajes nombrados anteriormente si

59

no a tejido adipogénico también. En ese mismo año, Digirolamo et. al., encontró que las células con

alta eficiencia formadora de colonias, eran las que exhibían el mayor potencial replicativo, y de

diferenciación a células de linaje adipogénico y os teogénico. (Tuan R., et. al., 2002)

El gran potencial de diferenciación de estas célula s, las hace excelentes candidatas para resolver

diversas enfermedades, sin embargo todavía existen muchas limitaciones para su uso clínico. Algunas

de estas limitaciones, y que es muy importante reso lverlas, es que no están completamente

caracterizadas, y que a pesar de tener diversas fu entes de obtención, la densidad de las CMMs en

cada una de ellas es muy baja. Por eso es important e estandarizar protocolos que optimicen su

número en el momento de aislarlas y expandirlas en cultivo. De esta forma, se podrá garantizar un

número adecuado de estas células para que puedan se r estudiadas más a fondo, procesadas y

diferenciadas in vitro hacia la población de células de interés en el cam po de las ciencias

regenerativas. Por esta razón es muy importante ten er protocolos que permitan definir condiciones

que sean óptimas y reproducibles para su expansión y estudio en el laboratorio.

La estandarización de las condiciones optimas para expandir las CMMs in vitro fue realizada por

Angélica Roa en el 2007, y se obtuvieron resultados satisfactorios en el proceso de aislamiento,

expansión y caracterización de las CMMs, que coinci den con lo reportado en la literatura. Sin

embargo, aunque los resultados fueron positivos, se deben mejorar algunas condiciones para

garantizar una alta viabilidad y proliferación celu lar. Para hacer esto, lo óptimo es tratar de reprod ucir

las condiciones in vivo de las CMM, en este cao el estroma medular. Se han usado diversos soportes

para cultivar las CMMs, y se sabe que la SIS, prove e a las células de muchas ventajas para su

supervivencia y proliferación. Además de esto, pod er estandarizar los cultivos sobre este soporte,

permite que se puedan realizar bioimplantes con las células que se necesitan.

En esta fase del estudio, se estandarizó el cultivo de las CMMs sobre la SIS, y se dieron los primeros

resultados comparativos entre la viabilidad y proli feración tanto en SIS como sobre la superficie

plástica de las placas de cultivo.

Para empezar, tanto la recolección de la muestra, c omo su procesamiento en el laboratorio y cultivo,

se hicieron a partir de la metodología estandarizad a por Angélica Roa en el 2007. La recolección de la

muestra siempre se hizo en tubos de heparina, y se procesaban el mismo día de su recolección. Los

cultivos se hacían a partir de la densidad inicial de siembra establecida anteriormente también. Sin

embargo, aun cuando el procesamiento en el laborato rio, también se llevó a cabo de la misma

60

manera, se agregó un paso. Según varios artículos, la muestra de medula ósea era diluida, antes de

agregarla sobre el Ficoll, en un volumen igual de P BS 1 X estéril. Este procedimiento se implementó

en la metodología a partir de la muestra 11, hasta la 13. El gradiente de densidad de Ficoll de estas

últimas 3 muestras, fue mucho más nítido, lo cual f acilitaba la recuperación de las células

mononucleares. Esto se debe a que al diluir la medu la ósea en el PBS, las células están más

separadas, y se evita conglomeración, lo cual las h ace más fácil la recuperación de las células

mononucleares, y evitan que las células de interés no queden en la franja de células mononucleares,

haciendo más difícil su recuperación. Tener más def inida la fase de Células Mononucleares, permite

recuperarlas más fácilmente tomando la mínima canti dad de Ficoll, que es tóxico, o de otros tipos de

células que pueden interferir con el aislamiento de las células mononucleares de la medula ósea.

Aun cuando los recuentos de estas células no daban mayores a los que no se les adicionó este paso,

si se veía más claro el anillo de células mononucle ares, y se podía observar un número mucho mayor

de células tanto en el pellet, como cuando se sembr aban en P0 y se observaban con el microscopio

invertido. En varias ocasiones era tal la cantidad de células que se sembraban en P0, que el medio se

veía muy turbio y tocaba dividir estas células en o tro frasco.

La razón por la cual los conteos no cambiaron mucho con respecto a las muestras que no se

diluyeron en PBS, puede deberse a la técnica de con teo, con Azul de Tripán. Estos conteos no son

muy confiables en este caso, ya que siempre daba un número menor de células, y no coincidía con lo

visto en el frasco de cultivo con el microscopio in vertido.

Con estos cultivos, se pudo comprobar, que hay una variabilidad biológica inherente a cada muestra,

y que la morfología de las células en cultivo, era muy variada (Muraglia, A., et. al. 2000). Al principio

en los cultivos, se observaban células con prolifer ación activa, pequeñas y alargadas, todas con

diferentes morfologías: con una, dos prolongaciones o mas (estrelladas), que se veían bien definidas.

Sin embargo, a medida que pasaban los días de culti vo se observaba una tendencia de las células a

volverse más grandes y aplanadas. Era difícil la vi sualización de estas células ya que se aplanaban

mucho y tenían más prolongaciones con bordes irregu lares, que era difícil distinguirlas entre ellas

mismas. En el momento en que estas células empezaba n a aplanarse y a volverse más grandes,

empezaban también a disminuir su proliferación. (Co lter et. al. 2000; Urbani et. al. 2006). También se

pudo observar que las muestras de los pacientes jóv enes, (15 y 16 años) duraban menos días en

llegar al siguiente pase en comparación con muestra s de pacientes de 26 a 33 años).

61

El seguimiento de los cultivos por medio del micros copio invertido, sobre la superficie plástica de la

placa de cultivo, se pudo llevar a cabo sin ningún problema, sin embargo, sobre la SIS, no es posible

observar las células, por esta razón se usaron méto dos para saber si las células estaban creciendo

sobre la SIS, que no necesitaran evidenciarlas (ver Figura 12).

El ensayo de UFC-F solo se llevó a cabo en una sola muestra (3), ya que para realizarlo, se necesita

utilizar todo el frasco de cultivo, y no se disponí an de suficientes células para hacer el ensayo con más

muestras, las mismas limitantes que tuvo el trabajo de Angélica Roa en el 2007. Sin embargo este

ensayo se realizó con la densidad inicial de siembr a estandarizada por Angélica Roa, 2007 (400.000

células mononucleares/cm2) la cual daba la mayor cantidad de colonias, y efe ctivamente se contaron

macroscópicamente 30 colonias en el frasco. Sobre l a SIS, no se realizo este ensayo, ya que no se

había estandarizado el cultivo de las CMMs sobre es te material, y además no teníamos el número de

muestras suficientes como para hacer ese ensayo sin saber cómo iban a ser cultivadas

satisfactoriamente.

Para la hidratación de la SIS, se había estandariza do por Ángela Amórtegui en el 2005, que la SIS

debía dejarse entre 18 y 24 horas hidratándose. Sin embargo, se encontró que es mejor dejarla 24

horas y no menos, ya que la SIS se vuelve más suave , y pierde esa textura inicial que es dura como

un papel.

Para los cultivos de CMMs y de cualquier otro tipo de células, sobre SIS, es muy importante

asegurarse que el número de células que se están se mbrando tengan la oportunidad de adherirse a

esta matriz, y no que una parte de ellas se caiga d e la matriz y se peguen en la placa de cultivo (pla ca

de 24 pozos). Por esta razón, al estandarizar esta metodología, inicialmente se usaron círculos del

mismo tamaño del fondo del pozo, pero cuando se agr egaba la suspensión celular, esta flotaba y las

células se adherían a la superficie plástica. En un segundo intento, se probaron círculos más grandes

que el fondo del pozo, para que esta cubriera las p aredes del pozo, y así evitar que las células

cayeran al fondo del pozo, pero igual la suspensión celular se salía de la SIS y las células se adherí an

al fondo del pozo. Luego se intento poner la SIS so bre la boquilla de un falcon y de un eppendorf, par a

sellarla con la tapa. Sin embargo era difícil manej ar la SIS una vez hidratada par aponerla sobre la

boquilla de estos, además quedaban los bordes de la SIS hidratada con SFB por fuera lo cual

aumentaba el riesgo de contaminación. Se probó esta misma metodología con la SIS sin hidratar,

pero esta se rompía en el momento de cerrar la tapa . Finalmente gracias a la colaboración de Janet

Reing, una investigadora del Laboratorio de Investi gacion Badylak, en el Instituto McGowan de

62

Medicina Regenerativa de la Universidad de Pittsbur gh, se usaron unos anillos que se cortaron a partir

de tubos falcon de 15 ml para sellar los bordes de la matriz. Estos anillos funcionaron muy bien pues

evitaron que la gran mayoría de las células sembrad as se salieran del círculo recortado de SIS. Sin

embargo, seguían saliéndose pues los bordes de los anillos no eran suficientemente lisos (aun

cuando eran lijados), por esta razón, se decidió e n el último ensayo, sellar la SIS sobre los bordes del

anillo con SFB, ya que una vez seco, este se pone m uy duro y es difícil separar la membrana del

anillo. Aunque esta metodología dio mejores resulta dos, se sugiere probarlo más veces ya que solo se

llevo a cabo una vez.

Una vez se estandarizaron los cultivos de CMMs sobr e la SIS, se pudo proceder a realizar diferentes

pruebas para estandarizar la medición de la viabili dad y proliferación de estos cultivos tanto sobre l a

SIS como sobre la superficie plástica.

Si bien es cierto que el MTT permite identificar pr oliferación y viabilidad, en este caso, no permitió

tener resultados que mostraran si había o no difere ncias claras sobre la proliferación y viabilidad de

las CMMs tanto sobre la SIS y la superficie plástic a. Usar MTT sobre la SIS para medir viabilidad y

proliferación, no es la metodología más adecuada, y a que no se puede saber con claridad si cuando

se obtenían valores de absorbancia más bajos, las c élulas no estaban creciendo, o si sí crecieron

pero ya se están muriendo, o si ya crecieron tan rá pido, que están empezando a morir por no tener

espacio y nutrientes. Además si de pronto en alguna de las dos superficies las células si están

creciendo más, pero la viabilidad no se ve afectada , con esta prueba no se podría distinguir entre eso s

dos resultados, y estaríamos perdiendo información.

Otra razón por la cual no se puede asegurar que por medio del MTT se puede medir la viabilidad y la

proliferación de las células cultivadas sobre la SI S, es que siempre daban valores de absorbancia

muy bajos (desde valores negativos, hasta 0,17) pue s muchas veces los blancos daban valores

mayores. Se tuvo problemas con los disolventes pues , el SDS no disolvía los cristales cuando las

células eran cultivadas sobre la SIS, y cuando se u saba Isopropanol, se formaba algunas veces un

precipitado blanco que interfería con la lectura de la absorbancia, pues este se despegaba de forma

heterogénea y generaba interferencia y errores en l a medición de la absorbancia.

Aunque del proceso de estandarización, no se pudier on obtener resultados sobre la viabilidad y la

proliferación de estas células, si se pudieron cono cer algunos detalles importantes, como por ejemplo

que dejar el disolvente solo 30 minutos si es lo op timo, y que a diferencia de lo que inicialmente se

pensaba, dejar el disolvente durante más tiempo, no da buenos resultados, solo inconsistencias pues

63

posiblemente este empieza a degradar todo lo que se encuentra en la suspensión dentro del pozo.

También se identificó, que el SDS no es el mejor di solvente a usar cuando se trabaja con SIS, pues a

pesar de ver algunas veces la SIS con manchas morad as, el liquido no se tornaba de este color y a la

SIS tampoco se le disolvían estas manchitas. Sin em bargo, esto si se logro más adelante con el

Isopropanol. Por otro lado, para las células sembra das directamente sobre la placa de cultivo, si

funcionó el SDS y no el Isopropanol.

Se inició con la prueba del MTT, ya que era una met odología sencilla, y se pensó que la SIS no

interferiría con la adquisición del MTT por parte d e las células, o con la formación de los cristales, o

con el detergente que disuelve los cristales. Según los resultados de este estudio, no se pudo

comprobar que esta metodología es la más apropiada, pues tiene varios inconvenientes.

Esta prueba ayudó a comprobar que las células si se estaban adhiriendo a la SIS, y mostraba que

estaban proliferando (ver Figura 34) , pues a las pocas horas de cultivo, no se veía nada, posiblemente

por la poca cantidad de células que había, sin emba rgo al ver las células luego de 72 horas, podemos

ver a simple vista que los cristales de formazán si se formaban, indicando la presencia de células

creciendo sobre la SIS.

Figura 34. Células sembradas sobre la SIS analizadas con MTT a las 8 y 72 horas de cultivo.

Figura 34. Células sembradas sobre la SIS analizadas con MTT a las a) 8 horas y a las b) 72 horas de cultivo

Inicialmente se pensó que no era un problema no pod er ver las células cultivadas sobre la SIS, ya que

el principio de la prueba de MTT era que si había c élulas, se formarían los cristales, y que el

detergente usado las rompería y disolvería los cris tales, permitiéndonos ver el liquido de color morad o

más oscuro, si había más células y más claro y habí a menos células, pero no. Es difícil llegar a

conclusiones acertadas cuando no son reproducibles los ensayos que se hacen en el laboratorio, y

64

además no se obtuvieron resultados con los que se p ueda comparar la viabilidad y la proliferación de

las CMM cultivadas sobre superficies plásticas y la s cultivadas sobre SIS.

Durante la estandarización del MTT, no estábamos se guros que las células se estuvieran adhiriendo a

la matriz, por esta razón se decidió llevar a cabo tinciones que permitieran visualizar las células si las

había. Las tinciones se hicieron con Cristal Violet a, Hematoxilina Eosina y Giemsa Wright. Al principi o

se realizaron para ver si las células se podían con tar para ver si estaban proliferando sobre la SIS, sin

embargo con los dos primeros colorantes, no se pudo ver nada ya que la SIS absorbía mucho el

colorante y no se distinguía entre las células y la matriz. Por el contrario si se vieron las células de

color rosado (citoplasma) cuando se tiñeron con Gie msa, sin embargo contando las células que se

ven sobre la SIS, no es la metodología más apropiad a y sencilla para ver proliferación celular. Por

esta razón solo se uso para corroborar que las célu las si se estaban adhiriendo a la SIS.

Ya que no se encontró una metodología sencilla para medir la proliferación y viabilidad de las células

estando éstas adheridas a la placa de cultivo direc tamente, se decidió intentar despegar las células d e

esta matriz para poder llevar a cabo otro procedimi ento. Inicialmente, se probaron dos metodologías,

una de ellas era usar una espátula de polietileno, con la que se raspaba la SIS. El otro método era

usando tripsina sobre la SIS. Los dos métodos despe gaban las células, sin embargo había más daño

mecánico con la espátula, por esta razón había un m ayor número de células muertas, en comparación

con las células que eran tripsinizadas. Gracias a e stos resultados, se tomó la decisión de no usar el

rastrillo, y tratar de mejorar el procedimiento de tripsinizar la SIS, porque aun cuando no se estaban

obteniendo la mayoría de las células que se habían sembrado, la viabilidad de estas era mayor con

esta técnica que con la espátula. Al parecer las cé lulas se estaban quedando adheridas a esta

membrana, por esto se decidió tripsinizar 3 veces c ada membrana, neutralizando la tripsina con medio

DMEM-LG suplementado cada vez que se agregaban 500µ L de tripsina. Se decidió neutralizar 3

veces también, pues si simplemente se deja la trips ina más tiempo, posiblemente las células que ya

se despegaron pueden morir, por esto se decide saca r estas células y neutralizar, para volver a

agregar tripsina sobre las células que realmente si guen adheridas a la matriz.

Con estos ensayos, se pudo ver que la cantidad de c élulas que hay en el sobrenadante en pozos con

SIS y sin SIS, son muy similares (1400 y 1100 célul as respectivamente) lo cual puede indicar que

posiblemente no existe diferencias entre la velocid ad con la que se adhieren las células a la SIS y a la

superficie plástica. Sin embargo esto no se puede a segurar ya que por tener pocos ensayos, no se

pueden hacer análisis estadísticos que aseguren que no hay diferencias significativas entre la

65

velocidad de adherencia de las células estas dos co ndiciones, solo se puede mostrar una tendencia a

pegarse más o menos en la misma cantidad de tiempo. El hecho de tener un sobrenadante con

células que tienen una viabilidad del 40% puede est ar indicando que la mayoría de células que están

flotando, son células muertas que no se adhirieron, y que hay unas pocas que no se han terminado de

pegar.

Para los análisis de citometría que se hicieron con células sembradas en la SIS, se tripsinizaba 3

veces cada matriz, y se obtenían un buen número de células en comparación cuando se hacia una

sola vez. La estandarización de tripsinizar las cél ulas, es indispensable y debe terminar de realizars e

con cuidado para poder saber cuándo se están obteni endo, si no todas, la mayoría de las células, ya

que en este estudio, se escogió arbitrariamente tri psinizar 3 veces y como se obtuvo un buen

resultado y no había más tiempo, se dejo esa metodo logía. Sin embargo se estandarizará esta

metodología en la continuación de este estudio, ya que no se sabe si se están despegando mas las

células que ya proliferaron y que ya casi no están adheridas a la matriz, o que se despegan primero

las células que están en la parte más externa de la membrana y se están quedando células en el

interior de esta matriz tridimensional.

Una vez se pudieron despegar las células de la SIS, se llevó a cabo el análisis de la viabilidad de

estas células con 7AAD y de proliferación con CFDA- SE, por medio de citometría de flujo. En las

graficas, se podía ver claramente que se obtenían m as células cuando eran cultivadas sobre la SIS

que cuando eran cultivadas sobre la superficie plás tica, y se debe tener en cuenta, que no esta

completamente estandarizada la técnica de tripsiniz arlas, y por esta razón no se sabe si se están

despegando completamente, y aun así se obtienen más células con respecto a las cultivadas sobre

las placas de cultivo sin SIS. Aunque en las dos g ráficas, el número de células es mayor cuando

fueron sembradas sobre la SIS, la tendencia de las líneas no corresponde a lo que debería pasar:

aumentar el número de células a medida que pasan lo s días, y esto puede deberse a problemas en la

tripsinización. Posiblemente hubo errores y no se l levo a cabo de manera homogénea en todos los

pozos. Todavía no se puede asegurar que la cantidad de células que se obtuvieron son

significativamente diferentes, pues n se pueden lle var a cabo análisis estadísticos que lo aseguren,

solo se puede sugerir.

En cuanto a la viabilidad celular, se puede decir q ue mejora levemente cuando las células son

cultivadas sobre la SIS. Sin embargo estos valores son muy similares, presentando la posibilidad de

66

que la viabilidad no se esté mejorando significativ amente al cultivarlas sobre esta matriz. Esto no se

puede asegurar ya que no hay análisis estadísticos.

La proliferación celular tuvo resultados muy intere santes, pues sugieren que la proliferación sobre la

SIS se da de manera mucho más rápida que sobre la s uperficie plástica, pues al tercer día de cultivo,

el 86.75% de las mMSC y el 96.56% de las RS-1 ya ha bían proliferado, mientras que sobre la

superficie plástica en ese mismo día, tan solo el 4 1.67% de las mMSC y el 51.49% de las RS-1 ya

habían proliferado. Sobre la SIS ya había prolifera do más o menos el doble de las células que estaban

sobre la superficie plástica.

Al parecer, sobre la SIS, se promueve la proliferac ión de las células maduras, pues los porcentajes de

células que ya proliferaron son más o menos similar es. Por el contrario, sobre la superficie plástica, se

comporta como lo dice la literatura, las RS-1 proli feran más rápido que las mMSC (Colter, D., et. al.,

2000; Minguell, J.J. et. al. 2001; Urbani, S., et. al. 2006). Es como si sobre la SIS se homogenizaran

las propiedades proliferativas de las subpoblacione s celulares.

Con este estudio, se lograron estandarizar las cond iciones de cultivo de las CMM sobre submucosa

intestinal porcina en placas de 24 pozos. Se corrob oró que usr MTT no es lo óptimo para hacer

estudios comparativos de viabilidad y proliferación con y sin SIS, seguramente la técnica no es muy

sensible para el bajo número de células que manejam os, un inconveniente que se resuelve con la

citometría de flujo. Sin embargo, aun si esta prueb a llegara a estandarizarse bien, no la volvería a

usar ya que no permite diferenciar simultáneamente los parámetros de proliferación y viabilidad. LA

citometría de flujo es una herramienta que permite estudiar varias características de las células al

tiempo, como por ejemplo su tamaño, granularidad (l o que nos permite conocer cuantas células hay

en cada subpoblacion, algo que no permite el MTT) s i están vivas, si están proliferando, su ya lo

hicieron, etc. Es una prueba muy sensible que da má s información que un ensayo colorimétrico como

el MTT. Seria optimo poder estandarizarlo pero para poder llevar a cabo ensayos de toxicidad por

ejemplo, con las CMMs cultivadas sobre la SIS, pero no para lo que se necesitaba conocer en este

estudio.

La tendencia que se pudo observar en el experimento que se hizo con una sola muestra, es que la

submucosa sí favorece la proliferación de las CMM. Sin embargo una tendencia menos evidente es la

de mejoría en la viabilidad. Se debe mejorar la téc nica de despegar las células de la SIS, se

recomienda intentar tripsinizar más veces, y tambié n usar colagenasa.

67

Para poder llegar a hace análisis estadísticos, se necesitan mínimo 5 muestras, y 3 replicas para cada

día (2, 3, 5, 7 y 9) tanto para SIS como para la su perficie plástica. Esto se hará en los próximos

meses.

A pesar de que estos resultados no tienen soporte e stadístico, nos abren las puertas para pensar que

sobre la SIS, la proliferación de las CMMs aumenta, mientras se mantiene una buena viabilidad, y que

si se siguen haciendo estos ensayos, se van a poder corroborar lo obtenido en este estudio. Si es

cierto lo que se presume con estos resultados preli minares, estamos un poco más cerca a optimizar

las condiciones de cultivo de estas células, garant izando que se tendrán más células para su futuro

estudio y más adelante aplicación clínica.

9. PROYECCIONES

o Analizar si la cinética de crecimiento de aquellas muestras procesadas con el paso

anteriormente mencionado, se favorece en comparació n con aquellas muestran que no lo incluyeron.

o Estandarizar condiciones en frascos de 25 y de 75 para poder hacer ensayos de UFC.F sobre

la SIS, ya que esta metodología solo funciona para placas de 24 pozos, en caso que se quisieran

sembrar estas células en un frasco de 25, se sugeri ría que no solo se recortara la SIS con la forma de l

frasco, si no que sería importante que fuera más gr ande que el frasco donde serán sembradas, para

que los bordes de esta queden un poco levantados so bre las paredes del frasco y que sobresalgan

del medio de cultivo para que la suspensión celular al ser agregada al frasco no se pueda salir por lo s

bordes de la SIS, si no por el contrario quede rete nida por los bordes levantados. Esta metodología

debe ser estandarizada, y una vez se haga podría ha cerse la prueba para UFC-F para luego teñir la

SIS y las células con Giemsa para ver si cuando las CMM son cultivadas sobre esta matriz, forman

colonias como en la placa de cultivo.

o Se debe volver a repetir el ensayo de MTT para me jorar las absorbancias probando densidad

celular y tiempo de cultivo y se sugiere probar otr os disolventes como el DMSO, para ver si mejora la

lectura.

o Probar si tripsinizando más veces la SIS, se obtie nen más células, sin perder viabilidad.

68

o Se deben recoger más muestras para hace mas ensayo s de viabilidad y proliferación con

citometría de flujo, para poder llegar a tener un t amaño de muestra que permita realizar análisis

estadísticos y poder concluir que hay o no diferenc ias significativas en la proliferación y viabilidad de

las CMMs cultivadas sobre la SIS con respecto a cua ndo son cultivadas sobre la superficie plástica.

o Tener más muestras para poder llegar a tener un N que permita realizar análisis estadísticos y

poder concluir que hay o no diferencias significati vas.

o Realizar la cinética de proliferación de las CMMs con CFSE de manera aún más temprana a lo

reportado en esta tesis (Día 2 por ejemplo) pues p ara el cultivo en la SIS, las células ya han

proliferado en su mayoría para el día 3.

o Queda también por definir el estado de diferenciac ión de las CMMs luego de ser cultivadas en

la SIS, ya que este hecho puede estar favoreciendo su pronta diferenciación hacia un linaje celular

particular.

69

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alhadlaq, A. & Mao J. J. (2004) Mesenchymal Stem Ce lls: Isolation and Therapeutics. Stem Cells and Development, 13:436-448

Amórtegui, A. X. Obtención de un cultivo primario d e queratinocitos humanos sembrados en

soportes de submucosa intestinal porcina. Bogotá 20 05. Tesis (Magister en Ciencias Biomédicas) Universidad de los Andes y Universidad del Rosario, Facultades de Ingeniería y de Medicina.

Badylak, S., Liang, A., Record, R., Tullius, R. y H odde, J. (1999) Endothelial cell adherence to

small intestinal submucosa: an acellular bioscaffol d. Biomaterials 20: 2257-2263 Baksh, D., Song, L., & Tuan, R.S. (2004). Adult mes enchymal stem cells: characterization,

differentiation, and application in cell and gene t herapy. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 8: 301-316.

Barry, F. P. & Murphy, J. M. (2004) Mesenchymal ste m cells: clinical applications and biological

characterization. The International Journal of Biochemistry & Cell Bi ology 36, 568–584 Beckman Coulter: Stem Kit Reagents [En línea] (2007 ) [consultado el 8 de Abril del 2008]

Disponible en <http://www.beckmancoulter.com/CustomerSupport/IFU/ivdd/IM3630IV%202007-06-01_ES.pdf>

Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S. & Robey P. G (2001) Bone Marrow Stromal Stem Cells:

Nature, Biology, and Potential Applications. Stem Cells19:180-192 Blau, H.M., Brazelton, T.R., & Weimann, J.M. (2001) . The Evolving Concept of a Stem Cell:

Entity or Function? Cell, 105: 829–841 Borras, M. X. (2005) Microcultivo por capas de subm ucosa intestinal de pocino (SIS) para

crecimiento tridimensional de fibroblastos. Tesis d e maestría no publicada. Universidad de los Andes y Universidad del Rosario, Bogotá, Colomb ia.

Bruder, S. P., Kurth, A. A., Shea, M., Hayes, W. C. , Jaiswal, N., & Kadiyala, S. (1998) Bone

Regeneration by Implantation of Purified, Culture-E xpanded Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Orthopedic Research, 16:155-162

Caplan, A. I., & Bruder, S. P. 2001. Mesenchymal st em cells: building blocks for molecular

medicine in the 21st century. TRENDS in Molecular M edicine Vol.7 No.6 Castro-Malaspina, G., Gay, R.E., Resnick, G., Kapoo r, N., Meyers, P., Chiarieri, D., et al.

(1980). Characterization of human bone marrow fibro blast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood, 56: 289-301.

Chen, M.K. & Badylak, S.F. (2001) Small Bowel Tissu e Engineering Using Small Intestinal

Submucosa as a Scaffold. Journal of Surgical Research, 99 (2): 352-358

70

Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B. & Middelton, J . Mesenchymal Stem Cells: Their Fenotype,

Differentiation Capacity, Immunological Features and Potencial for Homing. Stem Cells [En Linea] (2007) [Consultado el 10 de junio de 2008] D isponible en <http://www.StemCells.com DOI: 10.1634/stemcells.2007-0197>

Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Johnsto n, D. E. & Rogers, K. A. (2005) Dermal

fibroblasts cultured on small intestinal submucosa: Conditions for the formation of a neotissue. Journal of Biomedical Materials Research 75A: 895–906.

Colter, D., Class, R., Digirolamo, C. & Prockop, D. (2000) Rapid Expansion of Recycling Stem

Cells in Cultures of Plastic-Adherent Cells from Hu man Bone Marrow. PNAS 97 (7): 3213-3218

Deans R. J. & Moseley A. B. 2000. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical

uses. Experimental Hematology 28: 875–884 Dominici, M., Le Blanc, K., Mueller, I., Slaper-Cor tenbach, I., Marini, FC., Krause, DS., Deans,

RJ., Keating, A., Prockop, DJ. & Horwitz, EM. (200 6) POSITION PAPER: Minimal Criteria for Defining Multipotent Mesenchymal Stromal Cells. The International Society for Cellular Therapy Position Statement. Cytotherapy 8 (4): 315-317

Dorotkaa, R., Windbergerb, U., Macfeldab, K., Bindr eitera, U., Tomaa, C. & Nehrera, S. (2005)

Repair of articular cartilage defects treated by mi crofracture and a three-dimensional collagen matrix. Biomaterials, 26: 3617–3629

Fetterhoff, T. J. Holland, S.P. & Wile, K. J. (1993 ). Boehringer Mannheim Corp., Research &

Development, Indianapolis, IN, USA. Cytometry Supplement 6: 27 Fuentes-Boquete, I., Arufe, M. C. & Díaz, S. M. ( 2007) Tratamiento de Lesiones del Cartílago

Articular con Terapia Celular. Reumatología Clinica. 3 (3): 63-69 Gimble, JM & Guilak, F. 2003. Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and

differentiation potential. Cytotherapy 5 (5): 362-369 Gonzalez, R., Maki, C.B., Pacchiarotti, J., Csontos , S., Pham, J.K., Slepko, N., Patel, A., Silva,

F. (2007). Pluripotent marker expression and differ entiation of human second trimester Mesenchymal Stem Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 362: 491–497

Gokhale, P. J. & Andrews, P. W. (2006). A Prospecti ve on Stem Cell Research. Seminars In

Reproductive Medicine. 24 (5): 289–297 Gronthos, S. and Simmons, P. J. (1996). The biology and application of human bone marrow

stromal cell precursors. Journal of Hematotherapy, 5: 15-23. Gronthos, S., Zannettino, A.C.W., Hay, S.J., Shi, S ., Graves, S.E., Kortesidis, A., & Simmons,

P.J. (2003). Molecular and cellular characterisatio n of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. Journal of Cell Science, 116: 1827-1835.

71

Hee Ahn H et al. (2007) Porcine small intestinal submucosa sheets as a scaffold for human bone marrow stem cells. International Journal of Biological Macromolecules, 41: 590-596.

Hui, J.H.P., Ouyang, H.W., Hutmacher, D.W., Goh, J. C.H. & Lee, E.H. (2005) Mesenchymal

Stem Cells in Musculoskeletal Tissue Engineering: A Review of Recent Advances in National University of Singapore. Annals Academy of Medicine, 34:206-12

Ishii , M., Koike , C., Igarashi, A., Yamanaka, K., Pan, H., Higashi, Y., Kawaguchi, H.,

Sugiyama, M., Kamata, N., Iwata, T., Matsubara, T. , Nakamura, K., Kurihara, H., Tsuji , K. & Kato, Y. (2005) Molecular markers distinguish bon e marrow mesenchymal stem cells from fibroblasts. Biochemical and Biophysical Research Communications 332 297–303

Izadpanah, R., Trygg, C., Patel, B., Kriedt, C., Du four, J., Gimble, J. M. & Bunnell, B. A. (2006)

Biologic Properties of Mesenchymal Stem Cells Deriv ed From Bone Marrow and Adipose Tissue. Journal of Cellular Biochemistry 99:1285–1297

Kolf C, Cho E, Tuan R. Biology of adult mesenchymal stem cells: regulation of niche, self-

renewal and differentiation. (2007) Arthritis Research & Therapy. 9: 204. 1-10 Kotobuki, N., Hirose, M., Takakura, Y., & Ohgushi, H. (2004). Cultured Autologous Human Cells

for Hard Tissue Regeneration: Preparation and Chara cterization of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow. Artificial Organs, 28(1):33–39

Kulterer, B., Friedl, G., Jandrositz, A., Sanchez-C abo, F., Prokesch, A., Paar, C., Sheideler, M.,

Windhager, R., Preisegger, K. & Trajanoski, Z. (200 7). Gene expression profiling of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow dur ing expansion and osteoblast differentiation. BMC Genomics. 8: 1471-2164.

Lindberg, K., & Badylak , S. F. (2001) Porcine sma ll intestinal submucosa (SIS): a bioscaffold

supporting in vitro primary human epidermal cell differentiation and s ynthesis of basement membrane proteins. Burns 27: 254–266

Mansilla, S. (2005) Análisis de la expresión génica y de los mecanismos de muerte celular

Inducidos por la Bisantraciclina WP631 en células t umorales humanas. Tesis Doctoral. Universidad de Barcelona, Departamento de Genética.

Makino, S., Fukuda, K., Miyoshi, S., Konishi, F., K odama, H., Pan, J., Sano, M., Takahashi, T.,

Hori, S., Abe, H., Hata, J., Umezawa A. & Ogawa S. (1999) Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. Journal of Cliniclal Investigation 103: 697-705

Mareschi, K., Ferrero, I., Rusticelli, D., Aschero, S., Gammaitoni, L., Aglietta, M., Madon, E. &

Fagioli, F. 2006. Expansion of Mesenchymal Stem Cel ls Isolated from Pediatric and Adult Donor Bone Marrow. Journal of Cellular Biochemestry 97:744-754

Mera, C. Evaluación del inmunofenotipo, proteínas r elacionadas con apoptosis y contenido en

ADN en células madre hematopoyéticas CD34+ derivada s de sangre de cordón umbilical expandidas in vitro. Bogotá, 2006. Tesis (Magister en Ciencias Biomédi cas) Universidad de los Andes y Universidad del Rosario, Facultades de Ingenieria y de Medicina.

72

Minguell, J.J., Erices, A. & Conmguet, P. (2001) Me senchymal Stem Cells. Experimental Biology and Medicine 226 (6): 507-520

Muraglia, A., Cancedda, R. & Quarto, R. (2000) Clon al Mesenchymal Progenitors from Human

Bone Marrow Diferentiate in vitro According to a Hierarchical Model. Journal of Cell Science 113: 1161-1166

Odorico, J.S., Kaufman, D.S., Thomsonc, J. A. (2001 ) Multilineage Differentiation from Human

Embryonic Stem Cell Lines. Stem Cells 19:193-204 Ploix C. Molecular Probes' Vybrant CFDA SE Cell Tra cer Kit: Full Product Review. The Scripps

Research Institute, San Diego [En linea] [Consulta do el 11 de Febrero de 2008]. Disponible en <http://www.biocompare.com/prorev.asp?profrevid=45>

Roa, A., Análisis de la expresión de marcadores de inmunofenotipo de Células Madre

Mesequimales. Bogotá, 2007. Tesis (Magister en Cien cias Biomédicas) Universidad de los Andes y Universidad del Rosario, Facultades de Inge niería y de Medicina.

Rosenstrauch, D., Poglajen, G., Zidar, N. & Gregori c, I. D. (2005) Stem Cell Therapy for

Ischemic Heart Failure. Texas Heart Institute Journal 32: 339-47 Roufosse, C.A., Direkze, N.C., Otto, W.R., & Wright , N.A. (2004). Circulating mesenchymal

stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Bi ology. 36: 585-597. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T . (2005). Comparison of human stem cells

derived from various mesenchymal tissues: superiori ty of synovium as a cell source. Artritis and Rheumatism, 52: 2521-9.

Shim, W. S. N., Jiang, S., P. Wong, Tan, J., Chua, Y. L., Tan, Y. S., Sin, Y. K., Lim, C. H.,

Chua, T., Teh, M., Liu T. C., & Sim, E. (2004) Ex v ivo differentiation of human adult bone marrow stem cells into cardiomyocyte-like cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 324(2):481-488

Short, B., Brouard, N., Occhiodoro-Scott, T., Ramak rishnan, A., & Simmons, P.J. (2003).

Mesenchymal Stem Cells. Achives of Medical Research, 34: 565-571. Schmid, I., Krall, W. J., Uittenbogaart, C. H., Bra un, J. & Giorgi, J. V. (1992) Dead Cell

Discrimination With 7-Amino-Actinomycin D in Combin ation With Dual Color Immunofluorescence in Single Laser Flow Cytometry‘. Cytometry 13:204-208

Sotriropoulou, P.A., Perez, S.A., Salagianni, M., B axevanis, C.N., & Papamichail, M. (2006).

Characterization of the Optimal Culture Conditions for Clinical Scale Production of Human Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells, 24: 462-471

Tabima, D.M. Desarrollo de una metodología para la preparación y evaluación de matrices

biodegradables usadas para el crecimiento de fibrob lastos. Bogotá, 2003. Tesis (Magister en Ciencias Biomédicas) Universidad de los Andes y Universidad del Rosario, Facultades de Ingeniería y de Medicina.

73

Tuan, R., Boland, G. & Tuli R. (2002) Adult Mesench ymal Stem Cells and Cell-Based Tissue Engineering. Arthritis Research and Therapy, 5 (1): 32-45

Urbani, S., Caporale. R., Lombardini, L., Bosi, A. & Saccardi, R. (2006) Use of CFDA-SE for

evaluating the in vitro proliferation pattern of hu man mesenchymal stem cells. Cytotherapy, 8: 3, 243-253

Wagner, W., Wein, F., Seckinger, A., Frankhauser, M ., Wirkner, U., Krause, U., Blake, J.,

Schwager, C., Eckstein, V., Ansorge, W. & Ho, A. D. (2005) Comparative Characteristics of Mesenchymal Stem Cells from Human Bone Marrow, Adip ose Tissue, and Umbilical Cord Blood. Experimental Hematology 33 1402–1416

Weir, C., Morel-Kopp, MC., Gill, A., Tinworth, K., Ladd, L., Hunyor, SN., & Ward, C. 2008.

Mesenchymal Stem Cells: Isolation, Characterisation and in vivo Fluorescent Dye Tracking. Heart, Lung and Circulation. Doi:10.1016/j.hlc.2008.01.006

Wexler, S.A., Donaldson, C., Denning-Kendall, P., R ice, C., Bradley, B., & Hows, J.M. (2002).

Adult bone marrow is a rich source of human mesench ymal 'stem' cells but umbilical cord and mobilized adult blood are not. British Journal of Haematology, 121: 368-374.

Wislet-Gendebien S, Hans G, Leprince P, Rigo JM, Mo onen G, Rogister B. (2005) Plasticity of

cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin -positive to excitable neuron-like phenotype. Stem Cells, 23: 392-40

Xu, M., Wani, M., Dai, Y., Wang, J., Yan, M., Ayub, A. & Ashraf, M. Differentiation of Bone

Marrow Stromal Cells Into the Cardiac Phenotype Req uires Intercellular Communication With Myocytes. Circulation. [En línea] (2008) [Cons ultado el 5 de Mayo de 2008] Disponible en <http://circ.ahajournals.org/cgi/content/full/110/17/2658> DOI: 10.1161/01.CIR.0000145609.20435.36

74

ANEXO 1: CONSENTIMIENTO INFORMADO

COLEGIO MAYOR DE NUESTRA SEÑORA DEL ROSARIO

FACULTAD DE MEDICINA INSTITUTO DE CIENCIAS BASICAS

LABORATORIO DE BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR

CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA TOMA DE MUESTRAS B IOLÓGICAS CON EL OBJETO DE REALIZAR UN TRABAJO DE INVESTIGACIÓN

Estudio:

EXPANSIÓN IN VITRO DE CARDIOMICITOS HUMANOS SOBRE SUBMUCOSA INTESTINAL PORCINA A PARTIR DE CÉLULAS MADRE MESENQ UIMALES

Usted (o su pariente) está invitado a participar en un estudio de investigación propuesto por los grup os de investigación: Ciencias Básicas Médicas de la Un iversidad del Rosario e Ingeniería Biomédica de la Universidad de los Andes, con la participación de: Claudia Mera Reina, Sandra Ramírez Clavijo, Juan Ca rlos Briceño, Lina María Quijano y Sally Lorena Prieto. Es muy importante que usted lea y entienda ciertos puntos importantes en la realización de este estudi o: a) La participación en este estudio es totalmente v oluntaria. b) La naturaleza de esta investigación, su propósit o, sus limitaciones, sus riesgos, sus inconveniente s,

incomodidades y cualquier información pertinente al resultado de este, le será explicada por el equipo de atención clínica.

c) Si tiene algún interrogante sobre el estudio por favor no dude en manifestarlo a alguno de los investigadores, quien con mucho gusto, le contestar á sus preguntas.

d) CONFIDENCIALIDAD: Los registros médicos de cada individuo permanecer án archivados en el Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la u niversidad del Rosario. Las historias médicas, los resultados de exámenes y la información que usted n os ha dado son de carácter absolutamente confidencial, de manera que, solamente usted y el e quipo de atención clínica tendrá acceso a estos datos. Por ningún motivo se divulgará esta informac ión sin su consentimiento. Cuando los Resultados de este estudio sean reportados en revis tas médicas científicas o en congresos científicos, los nombres de todos aquellos que toma ron parte en el estudio serán omitidos y permanecerán en el anonimato.

e) De acuerdo con lo establecido en la resolución 0 08430 de 1993 (“Normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud”), e ste estudio puede ser clasificado como una “Investigación con riesgo mayor que el mínimo”. Se cumplirá con lo establecido por el Ministerio de Protección Social colombiano (antiguo Ministerio de Salud), la ley 84 de 1989 y la ley 2381 de 1993.

Cualquier información adicional usted puede obtener la directamente con: Dras. Sandra Ramírez, Claudia Mera o Lina Quijano. Laboratorio de Biología Celular y Molecular. Tel (57-1) 3474570 (Ext 270, 241, 503) Dr. Alberto Velez Van Meerbeke. Presidente Comité d e Ética. Tel (57-1) 3474570 (Ext 236)

Departamento de Ciencias Básicas de la Facultad de Medicina de la Universidad del Rosario

75

EXPLICACIÓN DEL PROYECTO DE INVESTIGACIÓN AL INDIVI DUO

JUSTIFICACIÓN : La posible aplicación de las células Madre para e l tratamiento de enfermedades, es de gran interés aunque por ahora tiene poco éxito. De ahí la necesidad de conocer mejor la biología básic a y el comportamiento de estas células, usando modelo s celulares que faciliten su estudio. Las Células Madre Mesenquimales (CMMs) pueden ser obtenidas de diversas fuentes en el individuo adulto, tales como hueso trabecular, tejido adiposo, líquido sino vial, células perivasculares de cordón umbilical de la gelatina de Wharton, músculo esquelético, dientes, sangre periférica y médula ósea (MO) (Baksh, D.et. al. 2004; Roufosse, C.A et al. 2004; Kolf C., et al . 2007). En la MO de humano se encuentran en bajas frecuencias y oscila entre 1-20 CMMs por 105 célula s mononucleares (Short, B.,2003; Gronthos, S. & Simmons, P. J. 1996 ) Por este motivo se han llevado a cabo desde hace v arios años estudios que permitan diseñar protocolos de expansión en el laboratorio, para obtener un ade cuado número de estas células y que de esta manera puedan ser estudiadas, manipuladas y diferen ciadas hacia diversos linajes de interés en el campo de las ciencias regenerativas. Una primera fase del estudio de cultivos de CMMs fu e llevado a cabo en el Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Universidad del Rosario d urante el primer semestre del año en curso, donde s e estandarizaron condiciones de cultivo para expandir estas células en placas y frascos de cultivo, segú n parámetros establecidos y documentados en la liter atura internacional. Sin embargo, a pesar de ser una población de célula s madre adultas que ha generado tanto interés científico por su posible aplicación clínica en un futuro como una alternativa terapéutica para terapi as regenerativas, es preciso optimizar las condiciones de cultivo en el laboratorio, tratando de reproduc ir su proceso de proliferación y crecimiento al que se co noce in vivo, y una de las maneras es tratando de reproducir el micro ambiente o “nicho” presente en la médula ósea. Por esta razón, es necesario cultivar las CMMs sobre una matriz de colágeno acel ular, como lo es la Submucosa Intestinal Porcina (SIS, Matrigel ®) que sirva de soporte para el crec imiento celular, ya que puede proveer de factores d e crecimiento y señales necesarias para la adecuada p roliferación celular. Este estudio permitirá generar en un futuro alterna tivas terapéuticas de regeneración de tejidos, para diversas enfermedades. OBJETIVO GENERAL: Cultivar in vitro Células Madre Mesenquimales obte nidas a partir de médula ósea humana diferenciadas a cardiomiocitos sobre un a matriz acelular, para mejorar su patrón de proliferación y viabilidad. PROCEDIMIENTO: Se realizará una entrevista clínica con usted prev ia a la obtención de la muestra y con el adulto responsable del menor. La médula es el tejido que fabrica las células sang uíneas y se encuentra en la parte hueca de la mayor ía de los huesos. Este examen se hace para succionar p arte de esta médula con el fin de recolectar esas células sanguíneas, dentro de las cuales está la g ran población de células mononucleares, que contienen a su vez, en pequeño número a una subpob lación de células madre, las Células Madre Mesenquimales. Para la toma de muestra, se limpia el área de la p unción con una solución antiséptica y se aplica anestesia local en el sitio donde se va a realizar dicha punción. Se sentirá un pinchazo y una sensaci ón de ardor con la anestesia local. El sitio puede ser el hueso pélvico o el esternón, aunque ocasionalme nte se selecciona otro hueso. Al insertar la aguja en e l hueso, se sentirá presión y hay una sensación fue rte de succión a medida que se aspira la médula ósea, l a cual dura sólo unos pocos momentos. Después, se inserta una aguja de aspiración delgada (una aguja con una jeringa adjunta que crea succión) y se extrae una pequeña muestra de médula ósea. El líquido se coloca en tubos que contengan

76

anticoagulante para preservar la muestra, la cual s erá mantenida a temperatura ambiente protegida de l a luz, mientras es trasladada al Laboratorio de Biolo gía celular y Molecular de la Universidad del Rosar io. DERECHO A NEGARSE A PARTICIPAR Y A RETIRARSE: La participación en este estudio es totalmente voluntaria y solo podrán ingresar al est udio aquellos pacientes que hayan firmado el consentimiento informado, previa reunión con los mé dicos tratantes para una respectiva explicación del estudio y la toma de muestra. El deseo de no partic ipar en el estudio no cambiará en nada las condiciones y el manejo por parte del equipo médico e investigador. CRITERIOS DE INCLUSION: Pacientes sanos cuyo rango de edad oscile entre los 2 y 35 años. Ausencia de antecedentes de enfermedades hematológi cas. Pacientes que no hayan recibido quimioterapia. CRITERIOS DE EXCLUSION: Pacientes mayores de 35 años. Pacientes con antecedentes de enfermedades hematoló gicas que hayan requerido o estén recibiendo tratamiento farmacológico. RIESGOS E INCOMODIDADES: La participación en este estudio no representa un riesgo adicional al de ser intervenido quirúrgicamente dependiendo de la p atología por la cual será intervenido. Pacientes q ue sean programados para artroscopia quirúrgica, el ri esgo adicional local, son procesos infecciosos loca les en el sitio de punción y hematoma local, este riesg o se puede considerar menor al 1 %. MANEJO DE LA MUESTRA: La muestra de médula ósea será recolectada en un t ubo con anticoagulante heparina, con el apoyo del ortopedis ta responsable del procedimiento quirúrgico. Una ve z recogida la muestra, ésta será trasladada al Labora torio de Biología Celular y Molecular de la Universidad del Rosario para ser procesada bajo con diciones de extrema esterilidad. La totalidad de la muestra será procesada, no se almacenará ningún rem anente. MANEJO DE RESULTADOS: Los resultados que se obtengan de la investigación se entregaran en una charla informativa al final del estudio. AUTORIZACION: La utilización de la muestra en estudios posterior es nos podría ayudar en el futuro a entender la biología básica de las Células Madre Me senquimales y/o el comportamiento de estas células al ser manipuladas en el laboratorio. Por lo tanto, por favor marque su decisión con respecto al almacenamiento de la muestra y su utilización en es tudios de investigación posteriores: A continuación, por favor manifieste su deseo según las diferentes opciones: Deseo que la muestra que me fue extraída sea DESECH ADA una vez completado el estudio.

Si � No � Autorizo conservar la muestra que me fue extraída c on la posibilidad de emplearla junto con el resultado del estudio, en las situaciones señaladas a continuación:

Si � No � a) En estudios de investigación colaborativos con o tras instituciones nacionales y/o internacionales,

enviando la muestra al exterior a el(los) laborator io(s) de el(los) instituto(s) antes mencionado(s). Si � No �

b) En estudios de investigación específicos para la (s) entidad(es), objeto de esta toma de muestra,

siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación. Si � No �

c) En estudios de investigación de entidades distin tas a la(s) entidad(es) objeto de esta toma de

muestra, siempre y cuando se conserve en anonimato mis datos de identificación. Si � No �

77

d) En estudios de investigación colaborativos con o tras instituciones nacionales y/o internacionales,

siempre y cuando exista acuerdo interinstitucional previo, aprobación del comité de ética y se conserve en anonimato mis datos de identificación.

Si � No �

AUTORIZACION PARA LA TOMA DE MUESTRAS E INCLUSION V OLUNTARIA EN EL ESTUDIO: “ANÁLISIS DEL POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉ LULAS MADRE

MESENQUIMALES DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA A CARDIOMIOC ITOS Y NEURONAS DOPAMINÉRGICAS”

Habiendo sido enterada(o) del contenido del present e estudio, informada(o) que no tendré ningún beneficio directo en el mismo y que se han resuelto todas mis dudas acerca de la investigación Yo,________________________________________ con documento de identificación número: _____________________ de ________________, acepto voluntariamente que se me tome una muestra de médula ósea por medio de un aspirado, con el fin de realizar análisis de Células Madre Mesenquimales derivadas de médula ósea cultivadas e n el laboratorio. Así mismo, declaro que se me ha explicado la presencia de los riesgos y el manejo q ue se le dará al material de muestra.

Fecha: ________________________________ ______________________________________

Firma Participante

Índice derecho

Nombre___________________________ Nombre _________________________

Dirección__________________________ Dirección ________________________

Teléfono__________________________ Teléfono _________________________

Parentesco________________________ Parentesco_______________________

Firma____________________________ Firma___________________________

CC. CC.

Testigo 1 Testigo 2

Claudia Mera Reina Gamal Zayed

__________________ ____________________ Investigador principal Co-investigador

Bogotá DC., Fecha ________________________________

78

ANEXO 2. HOJA DE REGISTRO

ANÁLISIS DEL POTENCIAL DE DIFERENCIACIÓN DE LAS CÉL ULAS MADRE MESENQUIMALES DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA A CARDIOMIOC ITOS Y NEURONAS

DOPAMINÉRGICAS Nº_________

expansiÓn in vitro de cÉlulas madre mesenquimales …

Documents