GSEC - GENETIC SUSCEPTIBILITY TO ENVIRONMENTAL CARCINOGENSUNIVERSITY OF PITTSBURGH

European Commette for Genetic Cancer Research

Dr. Francesco GrazianoMedical Oncology Hospital of Pesaro

Biotecnologie ed Evoluzione della Terapia Medica dei Tumori Solidi

Terapia dei tumori

chirurgia

Stadio I-II

chemioterapiaprimaria

chirurgia

Stadio III

chemioterapiadella malattia metastatica

radioterapia chirurgia

Stadio IV

guarigione

guarigioneprolungamento

della sopravvivenza

prolungamento della sopravvivenza

palliazione

Obiettivi dellachemioterapiaantitumorale neglistadi avanzati(stadio IV)

Riduzione dellamassa tumorale

Aumento della sopravvivenza

Beneficio suisintomi

Sviluppo storico della chemioterapia antineoplastica

1945

1950

1955

1960

1965

1970

Mecloretamina

Metotrexato6-MercaptopurinaBusulfan

ClorambucilCiclofosfamide

Vinblastina, vincristinaFluorouracile, actinomicina DMelfalan

Procarbazina, 6-tioguaninaCitosina arabinosideAdriamicina

• Prima chemioterapia adiuvante con actinomicina D nel tumore di Wilms

da G. Bonadonna, 1999 (modificata)

Bleomicina, dacarbazina

Sviluppo storico della chemioterapia antineoplastica (II)

1975

1980

1985

1990

1995

CCNU, BCNU, cisplatino

Etoposide, mitoxantrone

CarboplatinoIfofosfamide + MESNA

Paclitaxel, docetaxelTopotecan, irinotecanGemcitabinaOxaliplatino

• Trapianto autologo con GM-CSF• Espansione chemioterapia primaria

da G. Bonadonna, 1999 (modificata)

• CMF adiuvante nel ca. mammario• Terapia adiuvante nell’osteosarcoma• Trapianto di midollo osseo• PVB nei tumori del testicolo

• Inizio chemioterapia primaria in vari tumori solidi resecabili

2000

• Terapia antiemetica

Targettherapy

ACIDO FOSFONACETIL-L-ASPARTICOACIDO FOSFONACETIL-L-ASPARTICO•Inibisce la biosintesi purinica

5-FLUOROURACILE5-FLUOROURACILE•Inibisce la sintesi dell’acido timidilico

PENTOSTATINAPENTOSTATINA•Inibisce l’adenosina deaminasi

6-MERCAPTOPURINA6-MERCAPTOPURINA6-TIOGUANINA6-TIOGUANINA

•Inibisce la biosintesidell’anello purinico

•Inibiscono le intercorversioninucleotidiche

DACTINOMICINADACTINOMICINADAUNORUBICINADAUNORUBICINADOXORUBICINADOXORUBICINAMITOXANTRONEMITOXANTRONE

•Si intercalano nel DNA•Inibiscono la sintesi dell’RNA

METOTREXATOMETOTREXATO•Inibisce la riduzionedell’acido diidrofolico

•Blocca la sintesi purinicae dell’acido timidilico

BLEOMICINABLEOMICINAETOPOSIDEETOPOSIDETENIPOSIDETENIPOSIDE

•Danneggiano il DNA e ne impediscono il riparo

IDROXIUREAIDROXIUREA•Inibisce la ribonucleotide reduttasi

CITARABINACITARABINAFLUDARABINAFLUDARABINA

2-CLORODEOXIADENINOSINA2-CLORODEOXIADENINOSINA•Inibiscono la sintesi del

DNA

AGENTI ALCHILANTIAGENTI ALCHILANTIMITOMICINA CMITOMICINA CCISPLATINOCISPLATINO

PROCARBAZINAPROCARBAZINADACARBAZINADACARBAZINA

•Formano addotti con il DNA

L-ASPARAGINASIL-ASPARAGINASI•Deamina l’asparagina

•Inibisce la sintesi proteicaPACLITAXELPACLITAXEL

ALCALOIDI DELLA VINCAALCALOIDI DELLA VINCACOLCHICINACOLCHICINA

•Inibiscono le funzioni dei microtubuli

Sintesipurinica

Sintesipirimidinica

ribonucleotidi

desossiribonucleotidi

DNA

RNA(transfer, messaggero,

ribosomiale)

proteine

enzimi (ecc.) microtubuli

Tossicità arigenerativa dei chemioterapici antitumorali

•Amenorrea, azoospermiaGONADI

•Alopecia CUTE ED ANNESSI CUTANEI

•Stomatite•Enterite arigenerativa•Colite mucosa-membranosa•Diarrea

MUCOSA GASTRO-INTESTINALE

•Leucopenia, immunodepressione, •Piastrinopenia •Anemia

MIDOLLO OSSEO EMATOPOIETICO

Farmaci NON target!

Changing of the Guard

A Paradigm Shift in the Treatment of Cancer

• Conventional cytotoxic drugs interact with DNA to prevent cell replication but are not specific to cancer cells

• We are moving to targeted therapies which specifically target cancer cells

Target therapy:1) Identificazione del bersaglio

2) Sopravvivenza e crescita delle cellula tumorale dipendono dal bersaglio

…. la comparsa degli “inib” e degli “umab” ...

Targeted Therapies

• Monoclonal antibodies: proteine che si legano a recettore o altra molecola di segnale extracellulare

• Tyrosine Kinase Inhibitors: molecola che lega e inibisce attività enzimatiche intracellulari

• Gli “umab

• Gli “inib”

Dalla biologia alla biotecnologia ai nuovi farmaci

From JB Gibbs, 2000, modified

umab

umab

Second messanger……….inib

Transcription Translation Proteolysis

I

I

I

I

I

I

Lo sviluppo degli “umab” e degli “inib” segue quello dei

chemioterapici antitumoraliAcquisizione

Screening

Produzione e Formulazione

Studi clinici di fase I

Studi clinici di fase II

Studi clinici di fase III

Pratica medica

Valutazione farmacologico-clinica dei chemioterapici

antitumorali (I)FASE I TOLLERABILITA’

•Dose massima tollerata •Tipo della tossicità limitante

•Schema di somministrazione ottimale•Dose consigliata per la fase II

FARMACOCINETICA

FASE II ATTIVITA’ ANTITUMORALE•Spettro di attività•Relazione dose-risposta

Valutazione farmacologico-clinica dei chemioterapici

antitumorali (II)

FASE III-IV EFFICACIA TERAPEUTICA•Valutazione comparativa con terapia standard •Integrazione della chemioterapia nel trattamento primario

•Monitoraggio farmacocinetico

TOLLERABILITA’•Farmacovigilanza •Monitoraggio farmacocinetico

Drug Development Timeline

2-4 yrs 3-6 yrs

Anticorpi monoclonali….gli “umab”

Inibitori della trasduzione del segnale…” gli “inib”

Rituximab (CD20) Imatinib mesilato ( bcr-abl -, c-kit-, PDGF-TKs)

Trastuzumab (HER2) Gefitinib ( EGFR-TK)

Erlotinib ( EGFR-TK)

Cetuximab (EGFR) Bortezomib ( proteasoma)Sorafenib, Sunitinib

Bevacizumab (VEGF)

Farmaci a Berasglio Molecolare

Targeted Therapies

Carcinoma Renale

The Von-Hippel Lindau Gene

• Located in the short arm of chromosome 3

• Tumor suppressor function

• Found in up to 80% of sporadic (non-hereditary) renal cell cancers

Sporadic Renal Cell Cancer: VHL Two-Hit Hypothesis

At birth First Hit Second Hit:

Cancer

Inactivation of VHL: An Early Step in Kidney Carcinogenesis

VHL (+/-) VHL (-/-):

Cysts

VHL (-/-):

Tumor

Loss of remaining VHL allele

Mutation/s at non-VHL loci

Consequences of Consequences of VHL GeneVHL GeneMutationMutation

UbiquitinLigase ComplexDisrupted

HIFAccumulation

VEGF, PDGF Glut-1,

Erythropoietin TGF-, CXCR4

Angiogenesis Increased Metabolism Autocrine GrowthMetastasis

Elongin B/CCul2Rbx1

pVHL-E pVHL-AX XHIF HIF HIF HIF HIF HIF

Sunitinib

Inhibition of RCC pathogenesis and progression

↑ VEGF ↑ PDGF

Vascularpermeability

Cell survival, proliferation, migration

Vascularformation, maturation

VEGFR PDGFRVEGFVEGF PDGFPDGF

Vascular Endothelial CellVascular Endothelial Cell Pericyte/Fibroblast/Vascular Smooth Muscle

Pericyte/Fibroblast/Vascular Smooth Muscle

SunitinibSunitinib

Horizontal “Targeted” Strategy

pVHLHIF

VEGF PDGF TGF

KDR PDGFR EGFR

TARGETsSingle, Planned Progression-Free Survival* Analysis

Pro

po

rtio

n o

f p

atie

nts

pro

gre

ssio

n f

ree

0

0.25

0.50

0.75

1.00

Time from randomization (weeks)

0 6 12 18 24 36 48 60 66

Median PFS**

Sorafenib = 24 weeks

Placebo = 12 weeks

Hazard ratio = 0.44

p-value <0.000001

54

Censored observation

Placebo

Sorafenib

Escudier B et al. Oral presentation, ASCO, 2005 *Independently assessed **PFS analysis performed March, 2005 (data cut-off Jan 28, 2005)

TK Intracellular Domain

Transmembrane Domain

Extracellular Domain

EGFR

Epidermal Growth Factor Receptor

TK TKTK

erbB1HER1EGFR

erbB2HER2neu

erbB3HER3

erbB4HER4

No specific ligands - often acts as dimer partner Heregulins

NRG2NRG3

Heregulinsβ-cellulin

EGF, TGF Cellulin

Amphiregulin, HB-EGF

Human Epidermal Growth Factor Receptor Family

Normal Cell Cancer Cell

Epidermal Growth Factor Receptor

EGFR expression in solid tumors

LungLung(NSCLC)(NSCLC)

ColorectalColorectal

Head & NeckHead & Neck(SCC)(SCC)

Colorectal cancer (advanced)

75-82%

Lung cancer (NSCLC) 40-91%

Head & neck cancer (SCCHN)

90-100%

Gastric cancer 33-74%

Ovarian cancer 35-70%

EGFR is expressed in a variety

of solid tumors

Extracellulardomain

Tyrosine kinase domain

C-terminusdomain

P

P

P

P

P

P

ATPATP

Cell membrane

Ligand(e.g. EGF, TGF)

1. receptor dimerization

2. tyrosine kinase domain activation

Cytoplasmaticregion

• signal transduction

• transphosphorylation

• phosphorylation of substrate tyrosines

Inactive monomers

EGFRHER2HER3HER4

Structure of the EGF receptor and its mechanism of activation

From E. Raymond et al., 2000 (modified)

PP

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA

Una delle principali vie molecolari attivate dall’EGFR è quella di ras. Ras viene reclutata attraverso il legame con la molecola SOS.

A sua volta, ras determina l’attivazione della serina/treonina chinasi raf, delle MAPKK 1 e 2 e delle MAPK ERK 1 e 2.

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA

Il risultato dell’attivazione di questa via molecolare è l’espressione di varie proteine nucleari, inclusa la ciclina D1 (necessaria per il passaggio G1-S nel ciclo cellulare).

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA

Un altro target di EGFR è il PI3K

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA

Il reclutamento di PI3K porta all’attivazione di Akt, una serina/treonina kinasi con forte attività antiapoptotica.

N.B. la via di segnale di Akt svolge un ruolo nel determinare la chemioresistenza/ sensibilità della cellula neoplastica.

EGFR: FUNZIONE FISIOLGICA

N U C L E U S

Targeting Cellular Signal Pathways

Ras

Raf MEKK

ERK sek

MAP kinase

jnk/sapkC-myc

C-jun

PI3K

Akt

intermediates

Apoptosis

YEGFR

PP

Rho-B

Ki-67

inib

umab

Anti-EGFRCetuximab Panitumumab

cetuximab matuzumab panitumumab100% Mouse 34% Mouse 10% Mouse 100% Human

Mouse Fully HumanHumanizedChimeric

Anti EGFR antibody

Colorectal cancer: cetuximab BOND Trial

• Cunningham et al. ASCO 2003– Randomized trial in 329/577 pts screened for

EGFR+ tumors refractory to 5-FU/CPT-11

CPT-11+cetuximab

cetuximab

R

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12

MONTHS

PR

OP

OR

TIO

N

Mono ComboN 111 218

No. events 92 152Median 1.5 4.1

HR (95% CI): 0.54 (0.42; 0.71)

log rank p-value < 0.0001

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 2 4 6 8 10 12 14 16

MONTHS

PR

OP

OR

TIO

N

Mono ComboN 111 218

No. events 75 140Median 6.9 8.6

HR (95% CI): 0.91 (0.68; 1.21)

log rank p-value = 0.48

Cetuximab vs. CPT-11+Cetuximab in CPT-11 refractory CRC

Pati

en

ts s

urv

ivin

g (

%)

Pati

en

ts f

ree o

f p

rog

ressio

n (

%)

KRAS Mutations As an Independent Prognostic Factor in Patients With Advanced Colorectal Cancer Treated With Cetuximab

Monoclonal antibodies

R

K

K-ras mutato è sfavorevole

TKTK

Survival(anti-apoptosis)

PI3-K

STAT3

AKTPTEN

MEK

Gene transcriptionMAPK

Proliferation/maturation

Chemotherapy /radiotherapyresistance

Angiogenesis Metastasis

pYpY

RAS RAFSOS

GRB2pY

G1

SM

G2

Anticorpi monoclonali

Piccole molecole anti-TK

Strategie anti-EGFR

Gefitinib (piccola molecola anti-EGFR TK) Gefitinib (piccola molecola anti-EGFR TK)

Farmaco studiato nei carcinomi Farmaco studiato nei carcinomi polmonari non a piccole cellule polmonari non a piccole cellule

(esprimono EGFR) (esprimono EGFR) Small molecule

TKIs

R

K

Differenze di risposta al gefitinib

Group Response p value Study

Women vs men

19% vs 3% 0.001 IDEAL 21

Japanese vs caucasian

27.5% vs 10.4%

0.0023 IDEAL 12

Adenocarcinoma vs others

13% vs 4% 0.046 IDEAL 21

Non-smokers vs former/current

36% vs 8% < 0.001 MSKCC3

1Fukuoka et al., JCO 2003; 2Kris et al., JAMA 2003; 3Miller et al., JCO 2004

Normal Cell Cancer Cell

Overexpression+

mutation

• l’effetto delle mutazioni di EGFR sulla funzione della proteina è ancora oggetto di ricerca;

• le cellule che presentano forme mutanti di EGFR, vanno incontro a massiva apoptosi sotto l’azione di farmaci inibitori della via di segnale Akt e STAT-mediata.

MUTAZIONI DI EGFR

85% circadi queste mutazioni

delezioni multinucleotidiche “in-frame” (ESONE 19)

mutazioni puntiformi (ESONE 21)

MUTAZIONI DI EGFR

MUTAZIONI DI EGFR

• > frequenza nel sesso femminile;

• > frequenza nei non fumatori;

• > frequenza nel tipo istologico adenocarcinoma.

• > frequenza nelle popolazioni dell’est asiatico;

2 classi differenti di molecole anti-EGFR

Small molecule TKIs

Monoclonal antibodies

R

K

R

K

K-ras mutato è sfavorevole

Carcinoma del colonCarcinoma del polmone (NSCLC)

EGFR mutato è favorevole

Drug-related adverse events in >5% of patients: IDEAL 1 (250 mg/day)

0

10

20

30

40

50All grades

Grade 3

Patients(%)

No grade 4 drug-related adverse events were recorded

Fukuoka et al 2003a

Rash Diarrhoea

Pruritus Dry skin Acne Nausea

Tossicità dei farmaci anti-EGFR

Adverse skin effects after gefitinib (ZD1839) treatmentA

A. Mild (grade 1) acne-like rash in the breast area of a 52-year-old patient treated with 225 mg/d

B. More severe (grade 2) facial acne-like rash in a patient treated with 1,000 mg/d for 8 months

Normal tissue Tumor tissue

Jain: Science; 307: 58-62, 2005

Neo-angiogenesi tumorale

ANGIOGENESI:formazione di nuovi vasi sanguigninuovi vasi sanguigni

a partire da pre-esistentivasi capillari normali

aggressività della malattia

esito clinico sfavorevole

ridotta sopravvivenza globale

Il controllo dello switch angiogenetico dipende dall’equilibrio tra fattori PRO- ed ANTI-ANGIOGENETICI

VEGF

• è il più potente e specifico fattore mitogeno per le cellule endoteliali;

• è un fattore di sopravvivenza per le cellule dei vasi neoformati;

• induce un aumento della permeabilità vasale, facilitando l’immissione delle cellule neoplastiche

nel torrente circolatorio.

Bevacizumab (Avastin™): rhuMAb VEGF

• Recombinant Humanized Monoclonal Antibody to VEGF

• 93% human, 7% murine

• Recognizes all isoforms of VEGF, Kd = 8 x 10-10 M

• Terminal half life 17-21 days

Bevacizumab (Avastin™): rhuMAb VEGF

• Somministrato e.v. insieme a chemioterapci

• Approvato per il trattamento dei pazienti con carcinoma del colon-retto avanzato

Sopravvivenza libera da progressione: IFL + placebo, 6,2 mesi; IFL + bevacizumab, 10,6 mesi (p<0,001)Risposta obiettiva: IFL + placebo, 34,8%; IFL + bevacizumab, 44,8% (p=0,004)

Bevacizumab + chemioterapia vs. Placebo + chemioterapia

Hurwitz e coll. New Engl J Med, 2004

GIST: Gastrointestinal Stromal Tumors

• GI sarcoma

• Highest incidence in the 40-60 year age group

• Expression of c-KIT (CD117) in ~95% of cases

ATP

ProliferationSurvival

AdhesionInvasion

MetastasisAngiogenesis

ADP

+

P

Kit Receptor Phenotype

ATP

= imanitib contact point

ProliferationSurvival

AdhesionInvasion

MetastasisAngiogenesis

Imatinib

Kit Receptor Phenotype

Formula: C30H35N7SO4

MW: 589.7

Imatinib Mesylate

CH3SO3H

N

N

N

NH NH

O

N

N

Inhibitor of selective tyrosine kinasesbcr-ablPDGF-Rc-kit

Potent (IC50 0.1M)

(STI 571: Glivec)

PET Before and after Glivec for GIST

7/12/007/12/00 9/1/019/1/01

Verweij, et al 2004

EORTC study: Imatinib for Advanced GISTSurvival Benefit

Extracellular Domain (exon 9, 10.2%)

Juxtamembrane Domain (exon 11, 66.1%)

Tyrosine Kinase Domain I (exon 13/14, 1.2%)

Tyrosine Kinase Domain II (exon 17, 0.6%)

= common mutation site

ATP

c-Kit Receptor Structure

Overall Survival by Genotype

Exon 11

Exon 9

No Mutation

Median Survival

Exon 11 Not reached

Exon 9 1347 days

No mut 250 days

0 250 500 750 1000 1250 15000

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Exon 9 23 22 18 14 11 11No Mutation 9 5 3 3 3 3

Exon 11 86 82 81 73 64 53

P-value = 0.0012

Survival Number at Risk Days 0 250 500 750 1000 1250

Days

Ove

rall

Sur

viva

l (%

)

Exon 11

Target therapy”? ….quale bersaglio?