EVALUACIÓN DEL POTENCIAL BIOFERTILIZANTE DE TRES CONSORCIOS DE CIANOBACTERIAS EN EL CRECIMIENTO Y VALOR NUTRICIONAL DE PASTO RYEGRASS ANUAL (Lolium multiflorum) A NIVEL DE CÁMARA DE INVERNADERO

Formulación del Problema

Fertilizantes Químicos

• Uso de fertilizantes de forma desmesurada

• Perjuicios al suelo, la atmósfera y agua de

consumo

Ambiental• Contaminación de

acuíferos subterráneos por lixiviación

• Desbalance del ecosistema e infertilidad de suelos (Blanco, 1999).

• Reducción de la diversidad microbiana y nutrientes naturales del suelo (Sanchez & Mass,

2009)

Salud humana*Agua contaminada con

nitratos

* La transformación de nitratos a nitritos desemboca en compuestos cancerígenos conocidas como Nitrosaminas (Suquilanda, 2003).

Justificación del problema

Aumento del

rendimiento de las

Pasturas

• Uso de fertilizantes que suplan el nitrógeno que demandan las plantas

• El uso continuo e inadecuado de químicos es más nocivo que beneficioso

Implementación de

biofertilizantes

• Mantener la fertilidad del suelo, promover los rendimientos de cultivos, cuidar el ambiente y reducir costos

• Uso de abonos orgánicos como fuente de vida bacteriana para e suelo y para la nutrición de las plantas (Anesín et al., 2003).

Desarrrollo

biotecnológico

Producción Agraria

• Empleo de microorganismos fotosintéticos con capacidad para fijar nitrógeno atmosférico

Objetivos de la Investigación

Objetivo general

• Evaluar el potencial biofertilizante de tres consorcios de cianobacterias en el crecimiento y valor nutricional de pasto Ryegrass annual (Lolium multiflorum) a nivel de cámara de invernadero.

 

  Objetivos específicos• Obtener consorcios de cianobacterias a partir de diferentes

muestras de suelo, biofilms y cortezas de árboles tomadas en las faldas del volcán Pasochoa.

• Producir biomasa en medio líquido a partir de consorcios de cianobacterias mantenidos en medio sólido.

• Preparar los biofertilizantes que serán empleados como tratamientos.

• Evaluar bajo biofertilización la evolución del crecimiento del Raygrass en masetas.

• Determinar la materia seca, humedad, proteína, fibra bruta, grasa y ceniza del Raygrass anual.

• Comprobar la sobreviviencia de cianobacterias en el Raygrass anual.

Hipótesis de la InvestigaciónHipótesis nula• Los tres consorcios microbianos con cianobacterias presentan similares efectos fertilizantes en el Raygrass.• Los consorcios microbianos con cianobacterias, como los fertilizantes orgánicos tienen el mismo efecto sobre las

plántulas de Raygrass en crecimiento y valor nutricional.• Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias tienen el mismo efecto que un fertilizante

químico Hipótesis alternativa• Los tres consorcios de cianobacterias presentan diferentes efectos sobre las plántulas de Raygrass. • Los consorcios de cianobacterias y los fertilizantes orgánicos muestran diferentes efectos en el crecimiento y valor

nutricional del Raygrass.• Los tratamientos que constan de consorcios microbianos con cianobacterias, no presentan el mismo efecto que los

fertilizantes químicos.

BiofertilizantesProducto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicosSu aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo.Favorece la aireación y oxigenación del sueloSon fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998).Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos

Cianobacterias

Procariotas fotosintéticos, su tamaño varía de 0,5 a 70um de diámetro, carece de núcleo y organelosAislado de muestras ambientales, clínicas , animales y plantas.Amplia distribución desde climas fríos, tropicales hasta los más extremosEn el área agrícola han sido empleadas como biofertilizante en forma libre y simbiosisTienen la capacidad de llevar a cabo la diferenciación celular Generan celular especializadas (Heterocistos) donde se produce la fijación de nitrógeno mediada por la enzima nitrogenasa (luden, 2000).

Fijación biológica de Nitrógeno por cianobacteriasProducto que se obtiene de la degradación y mineralización de materiales orgánicosSu aplicación mejor la estructura, textura y permeabilidad del suelo.Favorece la aireación y oxigenación del sueloSon fuente de fósforo, nitrógeno y carbono para el crecimiento de cultivos (Benedetti et al., 1998).Comercialización de productos que contienen únicamente microorganismos

Metodología

Recolección de muestras Lupinus spp. Cantón SaquísiliCánton Pujilí

Cantón Guamote

Muestras

RizosferaRaices

HojasCampos Silvestres

Campos Cultivados

1.- Provincia de Cotopaxi

Localidades muestreadas

2.- Provincia de Chimborazo

Campos muestreados

Cantón SaquísiliCánton Pujilí

Cantón Guamote

Muestras

RizosferaRaices

Hojas

Diseño experimental empleado en el muestreo

Proceso de aleatorización simple de campo Número de hileras Número de plantas por hileras

Localidades muestreadas

Decantación

CVP (Diluciones seriadas en caldo

peptona)

10-1 10-4

0,1 ml

Siembra Agar Cetrimida

Conteo UFC/g

Cultivo Puros

16 S 956 pbPAGS-FPAGS-R

(Spilker et al, 2004)

(+)

ETA 396 pbETA 1ETA 2

(Ashraf y Carl, 1994)

Secuenciación amplicón

16SPseudomona aeruginosa y ETA

Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas

90 ml y 95 ml Caldo Peptona

% Humedad, Temperatura, Ph y Análisis Físico- Químico del

Suelo

Identificación Fenotípica de posibles cepas

Pseudomonas aeruginosa

1.- % Humedad, Temperatura (superficial, media y baja) y

pH

3.- Análisis Físico –Químico muestra compuesta por campo

(500g) : 6 submuestras

2.- Se pesarón 10 g de rizosfera y 5 g de hojas

90 ml y 95 ml Caldo Peptona

MUESTREO

Decantación

CVP (Diluciones seriadas en caldo

peptona)

10-1 10-4

0,1 ml

Siembra Agar Cetrimida

PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

Conteo UFC/g.s

Cultivo Puros

1

Identificación Fenotípica

Tinción GRAM (-)

Oxidasa (+)

Identificación de pigmentos

King A King B

Pruebas Bioquímicas

No fermentadores TSI

O-F Medio Hugh Leifson

Acetamida

Reducción de Nitratos

Gelatinasa

Crecimiento a 4°C y 42°C.

Control -

21

MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICAExtracción de ADN

Identificación Genotípica DO260/DO280= 1,5 – 2

ng/uL= 5

PCR 16s Pseudomonas aeruginosa

16 S 956 pbPAGS-FPAGS-R

(Spilker et al, 2004)

(+) P. aeruginosa Pseudomonas spp.

ETA 396 pbETA 1ETA 2

(Ashraf y Carl, 1994)

MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA

Secuenciación amplicón 16S Pseudomonas aeruginosa y ETA

Secuencia consenso

MUESTREO PROCESAMIENTO DE MUESTRAS

IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA

IDENTIFICACIÓN GENOTÍPICA

SECUENCIACIÓN

Resultados y Discusión 1.- Análisis Físico- Químico:

FACTOR MICROBIOLÓGICO

0,00E+00

1,00E+05

2,00E+05

3,00E+05

4,00E+05

5,00E+05

6,00E+05

7,00E+05

8,00E+05

Cachapamba S. J C.

cultivado

Cachapamba S. J C.

silvestre

Chaloapamba C. cultivado

Chaloapamba C. silvestre

Hojas 1,92E+04 3,97E+04 1,69E+04 6,77E+04

Rizosfera 4,90E+05 2,26E+05 2,63E+05 3,15E+04

Total 2,55E+05 1,33E+05 1,40E+05 4,96E+04

2,55E+05

1,33E+05 1,40E+05

4,96E+04

4,90E+05

2,26E+052,63E+05

3,15E+04

1,92E+04

3,97E+041,69E+04

6,77E+04

UFC

/gra

mo

de

sue

lo

Densidad bacteriana de la Provincia de Cotopaxi

0,00E+00

5,00E+04

1,00E+05

1,50E+05

2,00E+05

2,50E+05

3,00E+05

3,50E+05

4,00E+05

M Pacari C. cultivado

S. M. de Pumachaca C. silvestre

San Pedro C. cultivado

Sacaguan C. silvestre

Hojas 1,70E+03 1,13E+04 3,57E+04 2,46E+03

Rizosfera 1,72E+03 2,37E+05 6,65E+04 3,10E+04

Total 1,71E+03 1,24E+05 5,11E+04 1,67E+04

1,71E+03

1,24E+05

5,11E+041,67E+04

1,72E+03

2,37E+05

6,65E+04

3,10E+041,70E+03

1,13E+04

3,57E+04

2,46E+03

UFC

/gra

mo

de

suel

o se

co

Densidad bacteriana en la Provincia de Chimborazo

Figura 1 -2 . Densidad bacteriana de Pseudomonas spp (UFC/g.s) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

Hojas RizosferaMuestras

1.50E+04

4.43E+04

7.36E+04

1.03E+05

1.32E+05

1.61E+05

1.91E+05

2.20E+05

Den

sida

d B

acte

riana

UFC

/g.s

A

B

A

B

Densidad bacteriana Pronvincias de Cotopaxi y Chimborazo

Figura 3 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en las muestras de rizosfera y hoja de los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

Silvestre CultivadoTipo

7.66E+04

8.99E+04

1.03E+05

1.17E+05

1.30E+05

1.43E+05

1.57E+05

1.70E+05

Den

sida

d B

acte

riana

(UF

C/g

.s)

A

A

A

A

Densidad Bacteriana Provincias de Cotopaxi y Chimborazo

Figura 4 Densidad Bacteriana Pseudomonas spp, (UFC/g.s) en los campos cultivados y silvestres de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

Tabla 2 Descripción de los lugares, campos, coordenadas geográficas e historia agrícola de los cultivos .

FACTORES FÍSICOS

Figura 5. Factores Físicos: Clase Textural, Humedad(%) y Temperatura (°C) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

FACTORES QUÍMICOS1.-pH

2.- % Materia orgánica

Figura 6 Factores Químicos: pH y Materia Orgánica (MO %) en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

FACTORES QUÍMICOS

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

M, Pacari C, Cultivado

S, M de Pumachaca C, Silvestre

San Pedro C, Cultivado

Sacaguan C, Silvestre

Cachapamba C, Cultivado

Cachapamba C, Silvestre

Chaloapamba C, Cultivado

Chaloapamba C, Silvestre

2,97

6,515,22

3,79

6,046,93

3,89 4,260,03

0,08

0,02

0,02

0,02

0,04

0,020,02

2,30

1,10

1,30

1,90

1,801,50

1,201,30

0,010,11

0,080,12

0,250,30

0,150,23

CA

MPO

S

B (meq/100ml)

Zn (meq/100ml)

Mn (meq/100ml)

Na (meq/100ml)

Ca (meq/100ml)

Figura 7 Elementos inorgánicos B, Na, Ca, Mn y Zn en los diferentes campos muestreados de las Provincias de Cotopaxi y Chimborazo.

2.- Caracterización fenotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa

Cepa Comunidad Campo Muestra Morfología celularMorfología de

la colonia

Pigmentos

Pioverdina Piocianina Piorrubina

ATCC 10145 ______ ______ ______Bacilos Gram

Negativos B + + +

58SCRCachapamba San José Cultivado Rizosfera A + - -

30PCCR Chaloapamba Cultivado Rizosfera B + + -

26SCR Chaloapamba Cultivado Rizosfera A + - -

32PCH Chaloapamba Cultivado HojasBacilos Gram

Negativos D + - -

23SCR Chaloapamba Cultivado RizosferaBacilos Gram

Negativos A + - -

47PPCR Chaloapamba Cultivado RizosferaBacilos Gram

Negativos C + + -

17CSSR Sacaguan Silvestre RizosferaBacilos Gram

Negativos A + - -

A: Colonias grandes de color crema, consistencia mucosa y halo amarillo verdoso

B: Colonias grandes e irregulares con centro mucoso y halos azul verdoso - amarillo verdoso

C: Colonias medianas transparentes con halos azul verdoso - amarillo verdoso

D: Colonia mediana redonda y consistencia mucosa con halo amarillo verdoso

Tabla 3 Características fenotípicas de posibles cepas de Pseudomonas aeruginosa encontradas en los campos muestreados.

3.- Caracterización genotípicamente los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA

Tabla 4 Aislados positivos a la amplificación del gen 16S y ETA mediante el ensayo de PCR .

Cultivado Cachapamba

San José

Silvestre Cachapamba

San JoséCultivado

ChaloapambaSilvestre

ChaloapambaCultivado M Pacari

Silvestre S. M.

PumachacaCultivado

San PedroSilvestre

Sacaguan TotalPresente 1 0 2 0 0 0 0 0 3Ausente 5 6 4 6 6 6 6 6 45(a): Puntos muestreados donde esta presente o ausente P. aeruginosa 48X2 exp= 11 < X2 teo = 14,06 con un nivel de confianza del 95% se acepta la Ho

Pseudomonas aeruginosa

Campo / Comunidad (a)

Tabla 5. Frecuencia de Pseudomonas aeruginosa en campos cultivados y silvestres en Lupinus spp. Prueba de contraste de independencia de variables cualitativas Chi – cuadrado X2.

4.- Caracterización molecular de los amplicones los posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa y presencia del gen ETA

Tabla 6 Resultados de secuenciación del amplicón 16s DNAr y amplicón ETA

Los suelos rizósfericos de Lupinus spp, presentaron características texturales de suelos arenosos; valores bajos de temperatura a excepción de la comunidad de Musuk Pacarí y bajos porcentajes de humedad.

 Entre los factores químicos de los suelos rizósfericos estudiados, el pH dio valores

neutros, característica asociada a los suelos arenosos. La variación de las cantidades de micronutrientes, Ca, Mn Na Zn y B está relacionado

a los bajos valores de materia orgánica y baja capacidad de intercambio catiónico.  La densidad bacteriana de Pseudomonas spp 103-5 UFC/g.s de los suelos Lupinus spp

fue menor en comparación con otros estudios que reportan valores de 10 6-7 . La densidad bacteriana de Pseudomonas spp, fue significativamente diferente de

acuerdo al tipo de muestras, existiendo una mayor cantidad en la rizosfera de las dos provincias.

 

Conclusiones

 La caracterización fenotípica permitió identificar siete posibles aislados de Pseudomonas aeruginosa, sin embargo estos resultados presentaron ambigüedad en las pruebas de crecimiento a 42°C y utilización de acetamida.  La caracterización molecular del los aislados que amplificaron el gen 16s DNAr de Pseudomonas aeruginosa y Exotoxina a través de PCR y secuenciación dieron como resultados tres aislados de P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR y 6 que poseen el fragmento de 396pb del gen ETA: 4 P. aeruginosa 58SCR, 47PCCR, 30PCCR, 42 y 2 P. fluorencens 11 y 19.

 La cantidad de aislamientos de Pseudomonas aeruginosa depende del tipo de campo encontrándose con mayor frecuencia en campos cultivados que silvestres, las zonas de donde se aisló P. aeruginosa corresponden a las comunidades de Cachapamba San José y Chaloapamba caracterizados por ser un terreno de pastoreo y uso de abono orgánico gallinaza con rotación de cultivos de papa y zanahoria respectivamente. 

La presencia de Pseudomonas aeruginosa en los campos cultivados permitieron advertir que la rizosfera es un potencial reservorio de este microorganismo.

 La presencia del gen ETA en los aislados de Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens presumió la trasferencia de genes de virulencia entre microorganismo habitantes de un mismo nicho ecológico.  

Relacionar factores bioquímicos como respiración microbiana recuento de poblaciones microbianas, coeficiente metabólico e índices de mineralización para entender los cambios de parámetros microbiológicos calidad y salud del suelo.

 

cultivo de enriquecimiento como el caldo Acetamida que permita una selección previa de Pseudomonas aeruginosa.

Observar los pigmentos después del tiempo de incubación a 37°C se coloque las cajas a temperatura ambiente durante 24 horas para una mejor visualizan de los pigmentos.

Estudiar nuevas zonas geográficas donde se utilice sistemas de riego, abonos orgánicos.

Recomendaciones

A nivel molecular, realizar una identificación de otros factores de virulencia en Pseudomonas aeruginosa como Exoenzima S presentes en aislados ambientales y clínicos.

 

Utilizar otro tipos de genes como marcadores taxonómicos en la identificación de P. aeruginosa. gyrB, exoA, y algD; y primers específicos diseñados para la amplificación y secuenciación (Osayande, et al., 2009) que podrían ser utilizados en futuros proyectos.

Ensayos in vitro mediante la inoculación de cepas de Pseudomonas aeruginosa provenientes de muestras ambientales y clínicas donde hayan sido identificados factores de virulencia, para determinar y comparar el grado de virulencia de las diferentes P. aeruginosa y la respuesta del huésped.

 

Se recomienda el control de la carga microbial en sistemas de riego y abonos de animales de granja así como un análisis microbiológico de los indicadores de calidad de agua y abonos orgánicos.