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UNIVERSIDAD TECNICA PARTICULAR DE LOJAESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
“EVALUACIÓN DEL EFECTO GENOTÓXICO DE LA ARGENTATINA B MEDIANTE EL ENSAYO DE CBMN EN CÉLULAS MCF-7 (CÁNCER DE MAMA)”
Previo a la obtención del título de Bioquímico Farmacéutico
AUTORIA:Lorena Elizabeth Palacios Arrobo
DIRECTORA: Dra. Natalia Bailón Moscoso
Loja – Ecuador2009
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Grupo de más de 100 enfermedades.
Crecimiento descontrolado de las células debido a cambios en los mecanismos de proliferación, diferenciación y muerte celular.
CÁNCER
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Ecuador 12.000
1.615
American Cancer Society 2007
CÁNCER
Yépez, 2006
Garrido et al., 2003
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CA Cancer J Clin 2006;56:106–130
CÁNCER
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CÁNCER
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Cirugía Radioterapia Quimioterapia
ANTINEOPLASICOS
TRATAMIENTO DEL CÁNCER
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De los agentes aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer, aproximadamente el 65% son metabolitos secundarios o análagos semi-sintéticos o sintéticos basados en farmacóforos obtenidos de metabolitos secundarios.
Newman, D.J. and Cragg, G.M. Natural Products as Sources of New Drugs over the Last 25 Years. J. Nat. Prod., 70, 3, 461 - 477, 2007
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Triterpenos
Alcaloides de la vinca Epipodofilotoxinas Taxanos
Se han descrito más de 100 triterpenos con actividad citotóxica.
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Parthenium argentatum.
ARGENTATINA B
Parra, 2005 Evaluation of the cytoticity, cytostaticity and genotoxicity of Argentatina A and Argentatina B from Partheniium argentatum (Gray). Life Sciences 77, 2844-2865.
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ARGENTATINA B: estudios realizados en LINFOCITOS HUMANOS
• Fig. 3. Nuclear división index, calculated for argentatin B tested at 5, 15 and 25 uM and mitomycin C at 1 uM. (P<0.001)
Parra, 2005 Evaluation of the cytoticity, cytostaticity and genotoxicity of Argentatina A and Argentatina B from Partheniium argentatum (Gray). Life Sciences 77, 2844-2865.
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ENSAYO DE MICRONUCLEOS CON BLOQUEO DE CITOCINESIS
Citocalasina B (impide citocinesis celular)
Efecto genotoxico (clastogénico y aneugénico)
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EN UNA DE LAS LINEAS CELULARES EN QUE LA ARGENTATINA B TIENE ACTIVIDAD CITOTOXICA, PROBABLEMENTE NO PRESENTE ACTIVIDAD GENOTÓXICA.
HIPÓTESIS
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• Evaluar el efecto genotóxico de la Argentatina B mediante el ensayo de CBMN en células MCF-7 (cáncer de mama).
• Establecer las dosis subtóxicas a probar en el ensayo de micronúcleos con bloqueo de citoquinesis
•Determinar los efectos citostáticos de la Argentatina B mediante la determinación del Índice de División Nuclear en células MCF-7
• Determinar los efectos genotóxicos de la Argentatina B mediante la evaluación de Micronúcleos en células MCF-7.
GENERAL
ESPECÍFICOS
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Argentatina B
Viabilidad (FDA)
CBMN5, 15 y 25 uM
MCF-7
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37ºC 5% de CO2
24 horas
37ºC 5% de CO2
24 horas
3x105
células
Células MCF-7
Argentatina B
DMSO 5 uM 15 uM 25 uM DOX
DOXORUCINA
DMSO 0.05 uM 0.1uM0.075 uM
3 REPETICIONES
54 PLACAS
PBSRPMI
FDAPBSEtBr
Células +
200 CÉLULAS
VIVASMUERTAS
ESQUEMA VIABILIDAD (FDA)
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37ºC 5% de CO2
24 horas
Fijador de Carnoi 3:1
Tinción
37ºC 5% de CO2
24 horas
3x105
células
Células MCF-7
ARGENTATINA B
DMSO 5 uM 15 uM 25 uM DOX
DOX
DMSO 0.05 uM 0.1uM0.075 uM
3 REPETICIONES 54 PLACAS
ESQUEMA CBMN
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CITOSTACIDAD
GENOTOXICIDAD
200 células mono, bi y tetraIDN = {CMN + 2 (CBN) + 3 (CPN)} / N
Frecuencia de MN en 1000 CBN
54 PLACAS
ESQUEMA CBMN
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Gráfica No. 1 Porcentaje de viabilidad (FDA) de MCF-7 tratados con Doxorubicina. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes que se realizaron por duplicado. P < 0.001
ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LA DOX
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Gráfica No. 2 Índice de división nuclear calculado para la Doxorubicina. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. P<0,05.
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Gráfica No. 3 Efecto de la Doxorubicina en relación al control negativo (DMSO 0.1%) sobre la frecuencia de CBN con MN. Las barras representan la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado.P >0,001
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Gráfico No. 4 Porcentaje de viabilidad de MCF-7 tratadas con Argentatina B y DOX (0.1uM). Cada barra representa la media de tres experimentos independientes con su respectivo error estándar cada uno por duplicado. p < 0,001
ACTIVIDAD CITOTÓXICA DE LA ARGENTATINA B
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Gráfica No. 5 Índice de división nuclear calculado para las células MCF-7 tratados con Argentatina B. La doxorubicina se empleó como control (DOX) a 1 μM. Cada barra representa la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. P<0.001
• Fig. 3. Nuclear división index, calculated for argentatin B tested at 5, 15 and 25 uM and mitomycin C at 1 uM. (P<0.001)
Parra, 2005.
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Gráfica No. 6 Efecto de la Argentatina B (5, 15, y 25 uM) y DOX (0.1 Um) sobre la frecuencia de CBN con MN. Las barras representan la media ± EE de tres experimentos independientes por duplicado. P > 0,001
Parra, 2005.
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Las concentraciones probadas de Argentatina B no afectan la viabilidad de las células MCF-7, puesto que presentó una supervivencia mayor al 70%.
La Argentatina B no tiene actividad citostática en la línea celular MCF-7 evaluado mediante el IDN.
La Argentatina B no produce daño genotóxico in vitro a concentraciones de 5, 15 y 25 uM en células MCF-7 evaluado mediante MN.
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GRACIAS…