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“EVALUACIÓN DE LOS NANOTUBOS DE CARBONO SOBRE EL RECEPTOR NEURONAL MEMBRANAL
DOPAMINÉRGICO DE HELIX ASPERSA” TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIA DE MATERIALES
PRESENTA:
ESTEFANÍA EILEEN MENDOZA ORTEGA
DIRECTOR DE TESIS: DR. ERASMO ORRANTIA BORUNDA DIRECTOR EXTERNO: DR. JUAN BERNAL MARTÍNEZ
CHIHUAHUA, CHIH. FEBRERO, 2016
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN MATERIALES AVANZADOS S.C.
DEPARTAMENTO DE ESTUDIOS DE POSGRADO
2
TABLA DE CONTENIDO RESUMEN ........................................................................................................................................... 5
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................................... 7
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................................. 8
LISTA DE TABLAS .............................................................................................................................. 10
AGRADECIMIENTOS .......................................................................................................................... 11
RECONOCIMIENTOS ......................................................................................................................... 12
1. ANTECEDENTES ........................................................................................................................ 13
1.1 Carbono y materiales de carbono ................................................................................... 13
1.1.1 Generalidades del carbono y familias ..................................................................... 13
1.1.2 Generalidades sobre nanotubos de carbono ......................................................... 14
1.1.3 Métodos de síntesis de nanotubos de carbono ..................................................... 15
1.1.4 Métodos y objetivos de funcionalización de nanotubos de carbono .................... 16
1.1.5 Usos y aplicaciones biomédicas de nanotubos de carbono .................................. 17
1.1.6 Nanotubos de carbono como moduladores de canales iónicos en células ......... 19
1.2 Modelos Biológicos .......................................................................................................... 19
1.2.1 Modelos para estudios neurológicos ...................................................................... 19
1.2.2 Generalidades del caracol Helix aspersa ............................................................... 20
1.2.3 Neuronas de Helix aspersa ..................................................................................... 20
1.3 Fundamentos fisiológicos: neuronas .............................................................................. 21
1.3.1 Generalidades de membrana plasmática y canales neuronales .......................... 21
1.3.2 Potenciales de membrana y potenciales de acción .............................................. 21
1.3.3 Sustancias Agonistas y Antagonistas ...................................................................... 23
1.3.4 Agonistas de receptores membranales dopaminérgicos ...................................... 24
1.3.5 Antagonistas de receptores membranales dopaminérgicos ................................. 25
1.3.6 Agonistas de receptor colinérgico muscarínico ...................................................... 25
1.4 Técnicas de caracterización ............................................................................................ 25
1.4.1 Microscopia electrónica de barrido ......................................................................... 25
1.4.2 Microscopia confocal ............................................................................................... 26
1.4.3 Espectrometría RAMAN ............................................................................................ 27
1.4.4 Espectrometría de Infrarrojo.................................................................................... 28
2. JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................... 28
3
3. HIPÓTESIS ................................................................................................................................. 29
4. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 29
4.1 Objetivo General ............................................................................................................... 29
4.2 Objetivos Específicos ....................................................................................................... 29
5. METODOLOGÍA .......................................................................................................................... 29
5.1 Síntesis de nanotubos de carbono de pared múltiple ................................................... 29
5.2 Funcionalización de nanotubos de carbono de pared múltiple .................................... 30
5.3 Caracterización de nanotubos de carbono de pared múltiple ...................................... 31
5.3.1 Microscopía electrónica de barrido ......................................................................... 31
5.3.2 Microscopía electrónica de barrido de alta resolución .......................................... 31
5.3.3 Espectrometría RAMAN ............................................................................................ 31
5.3.4 Espectrometría de infrarrojo .................................................................................... 31
5.4 Disección y aislamiento de ganglios cerebrales de Helix aspersa ............................... 32
5.5 Dispersión y caracterización de nanotubos de carbono de pared múltiple en SRC .... 32
5.5.1 Microscopía electrónica de barrido de emisión de campo .................................... 32
5.5.2 Microscopía confocal ............................................................................................... 32
5.6 Evaluación de distribución topográfica de nanotubos de carbono sobre la membrana
neuronal ........................................................................................................................................ 33
5.6.1 Microscopia electrónica de barrido de emisión de campo .................................... 33
5.7 Estudio de propiedades electrofisiológicas y farmacológicas del receptor a Dopamina
en neuronas .................................................................................................................................. 33
5.7.1 Arreglo experimental ................................................................................................ 33
5.7.2 Cámara de registro ................................................................................................... 34
5.7.3 Microelectrodos de registro y de referencia ........................................................... 34
5.7.4 Implementación de conexiones eléctricas previo a experimentación .................. 35
5.7.5 Sistema de Perfusión ............................................................................................... 36
5.7.6 Experimento: Actividad eléctrica espontánea de la célula 1F .............................. 37
5.7.7 Experimento: Efecto del Carbachol sobre el potencial de membrana de la célula
1F 37
5.7.8 Experimento: Efecto de la Dopamina sobre el potencial de membrana de la
célula 1F 37
5.7.9 Experimento: Efecto de antagonistas de receptor a Dopamina en célula 1F ..... 38
5.7.10 Experimento: Efecto de NTCPM en receptor a Dopamina en célula 1F .............. 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................................... 40
6.1 Caracterización estructural y composicional de nanotubos de carbono ...................... 40
4
6.2 Distribución topográfica de NTCPM ................................................................................ 44
6.3 Propiedades electrofisiológicas y farmacológicas del receptor a dopamina en neurona
1F 46
7. CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 54
8. ANEXOS ..................................................................................................................................... 55
I. MATERIAL Y EQUIPO ............................................................................................................. 55
i. Material Biológico ............................................................................................................. 55
ii. Equipos ............................................................................................................................. 55
iii. Material de Laboratorio ................................................................................................... 55
iv. Reactivos .......................................................................................................................... 55
II. Tablas de Soluciones Experimentales ................................................................................ 56
III. Disección, microdisección y aislamiento de Ganglios D, E y F de Helix Aspersa ......... 58
IV. Preparación de Paraformaldehído al 4% ........................................................................ 60
V. Conexiones para registro y almacenamiento de señales eléctricas ................................. 60
i. Conexiones del Amplificador DAGAN 8500 y la interfaz Digidata 1200 A/D
(Configuración Current-Clamp) ................................................................................................ 60
ii. Conexiones del Amplificador DAGAN 8500 y el convertidor analógico-digital DAQ
MODELO USB1208FS. ............................................................................................................. 61
iii. Adquisición de señales con el sistema DAQ ................................................................... 62
9. REFERENCIAS ........................................................................................................................... 63
5
RESUMEN
Desde su descubrimiento, los nanotubos de carbono (NTC) han tenido muchas aplicaciones en
diversas áreas del conocimiento debido a sus propiedades intrínsecas que presentan, tales
como alta conductividad eléctrica, buena resistencia mecánica, estructura macroporosa y
mesoporosa, entre otras. Estas propiedades han favorecido su uso en sistemas biológicos
como biosensores y como andamios para cultivo de distintas estirpes celulares, en particular
de cultivo y crecimiento de tejidos neurales. En estos abordajes, los nanotubos están
dispuestos en monocapas sobre cámaras de cultivo o sobre sistemas de registro eléctrico
múltiple (MEA-S, por sus siglas en inglés) y han mostrado características de biocompatibilidad
y aparente baja toxicidad. Sin embargo, existen distintos resultados controversiales acerca de
la toxicidad de NTC cuando estos son aplicados en el medio extracelular que baña a las
neuronas. En algunos casos se ha reportado alta toxicidad de NTC y el bloqueo específico de
canales iónicos presentes en la membrana neuronal como son canales de potasio y calcio
dependientes de voltaje. Al parecer dicha toxicidad está relacionada con contaminantes
presentes en los nanotubos y con el tamaño de dichos nanotubos, es decir a menor tamaño
del nanotubo, mayor toxicidad. Aun así, no se ha estudiado si los NTC son capaces de
bloquear o afectar las permeabilidades iónicas activadas por agonistas químicos a su receptor
membranal (canales iónicos dependientes de ligando) tales como Acetilcolina, Dopamina y
Glutamato.
El objetivo del presente trabajo fue evaluar los posibles efectos tóxicos de nanotubos de
carbono de pared múltiple (NTCPM) sobre la permeabilidad iónica del canal-receptor activado
por la unión a Dopamina en células nerviosas del invertebrado Helix aspersa.
Se sintetizaron nanotubos de carbono de pared múltiple por el método de spray pirólisis,
posteriormente estos nanotubos de carbono fueron funcionalizados con tratamiento ácido. La
caracterización de NTCPM se llevó a cabo antes y después de la funcionalización por los
métodos de microscopia electrónica de barrido de alta resolución (FESEM), espectroscopia
RAMAN y espectroscopia infrarroja. Además, se llevaron a cabo estudios con microscopia
confocal y FESEM para evaluar el grado de dispersión de los NTCPM funcionalizados.
El material biológico utilizado en el este trabajo fueron neuronas identificadas del caracol de
jardín Helix aspersa. En específico, se utilizó la neurona 1F en estos experimentos.
Los nanotubos de carbono de pared múltiple fueron aplicados a las neuronas, dispersándolos
en solución Ringer de caracol a concentraciones de 10 -100 mM y se evaluó su distribución
topográfica sobre la membrana celular de neuronas de caracol utilizando la técnica de
microscopia electrónica de barrido de alta resolución y microscopia confocal.
Para los experimentos de registro intracelular, se utilizó la técnica convencional de fijación de
corriente para evaluar las propiedades electrofisiológicas del receptor membranal activado por
Dopamina en la neurona 1F. Esta misma técnica se utilizó para evaluar los posibles efectos
tóxicos de NTCPM sobre el receptor dopaminérgico de la neurona 1F de Helix aspersa.
6
Se llevó a cabo la síntesis, funcionalización y caracterización de nanotubos de carbono de
pared múltiple de una manera eficiente, obteniendo NTCPM con altos grados de pureza. Se
comprobó por microscopia electrónica de barrido y microscopia confocal que los nanotubos de
carbono debidamente sintetizados y funcionalizados, se pueden dispersar en soluciones
acuosas como lo es la solución Ringer de caracol. A su vez, se comprobó por FESEM que los
NTCPM dispersos en esta solución, se unen o adhieren con alta afinidad a la membrana
celular de neuronas del caracol Helix aspersa.
Además, se lograron caracterizar los receptores dopaminérgicos dependientes de ligando en la
neurona 1F del invertebrado Helix aspersa. Se realizaron diversos experimentos con los
fármacos Metoclopramida y Ergometrina. Del primero, no se tenía registro alguno sobre la
respuesta que produce en los receptores dopaminérgicos y se le logró identificar como
antagonista. Del segundo fármaco, se descubrió que actúa como antagonista dopaminérgico
con efecto irreversible. Se trabajó con reactivos comerciales obteniéndose respuestas
favorables, lo que demuestra la compatibilidad de los fármacos utilizados en seres humanos
con el modelo biológico Helix aspersa.
Y por último, se demostró que los nanotubos de carbono de pared múltiple no bloquean las
señales bioeléctricas. Por el contrario, se observó un aumento en la actividad eléctrica y una
mayor permeabilidad en los canales de Na+ y K+ activados por el neurotransmisor Dopamina.
7
LISTA DE ABREVIATURAS
°C Grados centígrados
µM Micromolar
mM Milimolar
M Molar
Ar Argón
Fe Hierro
HNO3 Ácido nítrico
H2SO4 Ácido sulfúrico
KCl Cloruro de potasio
NaOH Hidróxido de sodio
NTC Nanotubos de carbono
NTCPM Nanotubos de carbono de pared múltiple
NTCPS Nanotubos de carbono de pared simple
SRC Solución Ringer de Caracol
ml/min Mililitros por minuto
nm Nanómetros
MΩ Mega ohms
A Amperes
V Volts
g Gramos
FESEM Microscopía electrónica de barrido de emisión de campo
SEM Microscopía electrónica de barrido
EDS Espectroscopia de energía dispersiva
PVP Poli-vinil-pirrolidona
SNC Sistema nervioso central
SNP Sistema nervioso periférico
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Enlaces C-C formando hidrocarbonos………………………………………………………………….13
Figura 2. Familias de carbono…………………………………………………………………………………………...14
Figura 3. Nanotubos de carbono de pared simple y de pared múltiple .……………….………….….14
Figura 4. Diagrama esquemático técnica de pirólisis de aspersión ……………………..………….….16
Figura 5. Diagrama esquemático de masa periesofágica de H. aspersa ………………………....….20
Figura 6. Diagrama esquemático de masa subesofágica de H. aspersa ……………………………..20
Figura 7. Diagrama esquemático de un potencial de acción ………………………………………………22
Figura 8. Diagrama esquemático de cambios de conductancia membranal ……………..……..…22
Figura 9. Diagrama esquemático de receptores membranales y ligandos ….……………………….24
Figura 10. Espectros característicos de nanotubos de carbono …………………………..………..……27
Figura 11 Arreglo experimental para síntesis de nanotubos de carbono …………………………….30
Figura 12. Arreglo experimental para funcionalización de nanotubos de carbono ……………….31
Figura 13. Diagrama esquemático de set up para registro de señales bioeléctricas .…………..33
Figura 14. Cámara de registro intracelular ………………………………………………………………………..34
Figura 15. Estirador vertical de micropipetas ……………….…………………………………………………...35
Figura 16. Cámara de registro, holder y electrodo de referencia ………………………………………..35
Figura 17. Puente de Wheatstone …………………………………………………………………………………….36
Figura 18. Sistema de perfusión ……………………………………………………………………………………....36
Figura 19. Micrografías de NTCPM prístinos y análisis EDS …………………………………………….…41
Figura 20. Micrografías de NTCPM funcionalizados y análisis EDS ………………………………….….42
Figura 21. Espectro IR de NTCPM prístinos y funcionalizados …………………………………………….43
Figura 22. Espectros RAMAN de NTCPM prístinos y funcionalizados …………………………….......43
Figura 23. Micrografías FESEM de NTCPM dispersos en PVP y SRC ……………………………........44
9
Figura 24. Micrografías de NTCPM dispersos en PVP y SRC …………………………….....................45
Figura 25. Micrografías FESEM de ganglios de H. aspersa y NTCPM ………………………………....45
Figura 26. Actividad eléctrica espontánea normal de la neurona 1F.…………………………….......46
Figura 27. Respuesta de la neurona 1F a Carbachol ……………………………................................47
Figura 28. Actividad eléctrica espontánea y respuesta a Dopamina …………………………….......48
Figura 29. Curva dosis-respuesta de la neurona 1F con pulsos de hiperpolarización …….…...48
Figura 30. Ampliación de zona de la Figura 29…………………………………………………………….......49
Figura 31. Control y efecto de Dopamina en presencia de Metoclopramida ……………………….50
Figura 32. Control y efecto de Dopamina en presencia de Metoclopramida ……………………….51
Figura 33. Control y efecto de Dopamina en presencia de Ergometrina ……………………………..52
Figura 34. Efecto irreversible de Ergometrina en receptores dopaminérgicos …………………....52
Figura 35. Efecto de Dopamina en presencia de NTCPM funcionalizados ………………………...53
10
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Diseño de experimentos para caracterizar el receptor dopaminérgico …………………. 39
Tabla 2. Solución Ringer de Caracol Normal …………………………………………………………………... 56
Tabla 3. Solución Ringer de Caracol Alto Calcio ………………………………………………………………. 56
Tabla 4. Soluciones para preparación de microelectrodos …..…………………………………………... 56
Tabla 5. Fármacos para receptor dopaminérgico ….…………..………………………………………….... 56
Tabla 6. Fármacos para receptor dopaminérgico (comerciales)………………………………………… 57
Tabla 7. Fármacos para receptor muscarínico………………..……………………………………………….. 57
Tabla 8. Fármacos para receptor a Glutamato………………..……………………………………………….. 57
Tabla 9. Fármacos bloqueadores de canales de Calcio……..…………………………………………….. 57
11
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios primeramente por tantas bendiciones, por mi esposo, familia, amigos y la
oportunidad de crecimiento profesional e integral que me ha brindado, por guiarme por el
hermoso camino de la búsqueda de la verdad. Mi amado Señor, el que me ha dado fortaleza
para continuar cuando a punto de caer he estado, por ello con toda la humildad de mi corazón
le dedico este trabajo.
Quiero agradecer a mis padres que me dieron la vida y han estado conmigo en todo momento.
Gracias mamá por haberme motivado siempre a dar lo mejor de mí, a luchar por mis sueños e
ideales y no dejarme vencer por las tribulaciones del camino. Gracias hermana por apoyarme
en los momentos que no me encontraba en casa o necesitaba ayuda por algún contratiempo.
A mis compañeras de la maestría, Gris y Denisse, les agradezco por esta bella amistad, por los
desvelos, tardes de estudio y tanto aprendizaje y experiencias que adquirimos en el paso de
estos 2 años; les deseo el mayor de los éxitos en la vida.
Y quiero agradecer especialmente a mi amado esposo, Alejandro, por su apoyo incondicional,
por escucharme platicarle de este proyecto del cual me enamoré, por las veces que estuve
ausente, estresada o desanimada y siempre supo motivarme y sacar lo mejor de mí. Gracias
por tanto amor, gracias por creer en mí.
12
RECONOCIMIENTOS
Al Centro de Investigación en Materiales Avanzados S.C. le agradezco la oportunidad de
enriquecer mis conocimientos y el haberme integrado a un proyecto de investigación que
superó mis expectativas de un estudio de posgrado.
Le agradezco a su vez, al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada, ya
que sin ella no hubiera sido posible realizar este sueño.
Me gustaría agradecer sinceramente a mi asesor de Tesis, el Dr. Erasmo Orrantia Borunda, por
su esfuerzo y dedicación. Sus conocimientos, sus orientaciones y su rápida respuesta a las
distintas dificultades durante el proyecto fueron de gran ayuda para poder concluirlo de
manera satisfactoria.
De la misma forma, quiero agradecer también a mi asesor externo, el Dr. Juan Bernal Martínez
por su persistencia, paciencia, motivación y pasión por la investigación, cualidades que han
sido fundamentales para mi formación como investigadora.
Ellos han inculcado en mí un sentido de seriedad, responsabilidad y rigor académico sin los
cuales no podría tener una formación completa como investigadora.
Por último, quisiera agradecer a los estudiantes, al cuerpo técnico, académico y administrativo
del Centro de Investigación en Materiales Avanzados S.C. que formaron parte de este proyecto
de investigación. El aporte de su tiempo, esfuerzo y conocimientos es invaluable. Gracias Dra.
Hilda Piñón por todos sus consejos, apoyo y guía en el proceso. Gracias Dr. Antonino Pérez,
Dra. Antonia Luna, Dr. Martín Herrera, Dr. Daniel Lardizabal, Kathy Ramírez, Adriana Chávez,
Olga Zacarías, Rocío Landeros, Sandra Beltrán, Nicté Ortiz, Manuel Román, Karla Campos y
Wilber Antúnez.
13
1. ANTECEDENTES
1.1 Carbono y materiales de carbono
1.1.1 Generalidades del carbono y familias
El carbón o carbono (C) es uno de los elementos más abundantes en la tierra, casi todo
material orgánico está compuesto de redes de carbono [6]. Los átomos de carbono pueden
tener 3 diferentes orbitales híbridos, sp3, sp2 y sp, así resultando una variedad de
combinaciones de enlaces químicos. En la Figura 1, se ilustra cómo estos 3 orbitales híbridos
de átomos de carbono forman una gran familia de moléculas orgánicas y a su vez, cómo estos
materiales inorgánicos: diamante, grafito, fulerenos y carbinos, resultan de la extensión a
moléculas gigantes de materiales orgánicos. Esta variedad en enlaces químicos produce un
enorme número de
materiales orgánicos [6].
Basándonos en la extensión
por repetición de 3 tipos de
enlaces C-C a moléculas
infinitas, se puede definir a
una familia de materiales de
carbono inorgánicos, una
“familia de carbono”,
consistiendo de diamante,
grafito, fulereno y carbino.
En la Figura 2 se muestran
las características
estructurales y la diversidad
estructural de cada familia.
La familia del carbono con
enlaces sp2 es representada
por el grafito, en donde
capas planas de hexágonos
de átomos de carbono
unidos por orbitales sp2 se
apilan paralelamente al
utilizar nubes de electrones-
π con una regularidad ABAB. Figura 1 | Enlaces C-C formando un gran número de hidrocarbonos y su
extensión a familias de carbono. [2]
14
Por otra parte, a la producción de
diferentes materiales de carbono,
tomando como base gases de
hidrocarburos se le llama “proceso
de carbonización de fase gaseosa”,
porque las moléculas de
hidrocarburo se descomponen en
fase gaseosa para depositarse como
carbono sólido. Dependiendo
principalmente de la concentración
de hidrocarburos, una variedad de
materiales de carbono son producidos: negros de humo, carbonos pirolíticos, nanofibras,
fulerenos y nanotubos de carbono.
1.1.2 Generalidades sobre nanotubos de carbono
Los nanotubos de carbono (NTC) fueron descubiertos en 1991 por Sumio Iijima [7], quien
trabajando con grafito en un microscopio electrónico observó la existencia de moléculas
tubulares en el hollín formado a partir de las descargas de arco eléctrico. Éstos, son tubos de
carbono grafítico con diámetros externos de 2-100 nm y de longitudes de 1 a varios
micrómetros. Los nanotubos de carbono de pared simple (NTCPS) o (SWCNT) por sus siglas en
inglés, son aquellos que están formados por una sola capa de grafeno enrollado en forma de
tubo. Dependiendo de la dirección de los hexágonos, los nanotubos se pueden clasificar como
“zigzag”, “armchair” o “chiral”, como se muestra en la Figura 3.
Figura 3 | Nanotubos de carbono de pared simple y pared múltiple. Direcciones de los hexágonos. [5]
Figura 2 | Familias de carbono. [2]
15
Por otra parte, los nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM) o (MWCNT), consisten en
2 o más cilindros coaxiales de grafeno orientados concéntricamente alrededor de un hueco
cilíndrico, con un diámetro interno entre 1 y 3 nm [7]. Los NTCPM se pueden dividir en 2
categorías basadas en los arreglos de las capas de grafito, siendo la más común: cilindros
concéntricos y la otra, consiste en el modelo Parchment que hace referencia a una sola capa
de grafito enrollada en sí misma. [5]
Desde su descubrimiento, los nanotubos de carbono han suscitado un interés excepcional
dado a sus propiedades estructurales, electrónicas, mecánicas y químicas únicas. Ha habido
una intensa actividad científica relacionada a la síntesis y propiedades de los NTC, así como
también de sus aplicaciones en varias áreas de la ciencia. Estas aplicaciones van desde una
amplia gama de componentes electrónicos (transistores de electrones individuales y de efecto
de campo, diodos fotovoltaicos), reforzamiento de materiales (conductividad eléctrica y
resistencia mecánica), almacenamiento de gases, sobre todo y de manera sobresaliente el
hidrógeno y su utilización como soportes catalíticos. [8]
1.1.3 Métodos de síntesis de nanotubos de carbono
Existen varios métodos para sintetizar nanotubos y nanofibras de carbono[5]:
a) Arco de descarga eléctrica. En este método el carbono contenido en el electrodo
negativo se sublima debido a las altas temperaturas de descarga (grafito a 3000° C).
El rendimiento es de alrededor de 30% en peso y produce NTCPM y NTCPS con
longitudes de hasta 50 μm con pocos defectos estructurales.
b) Ablación o erosión láser. En esta técnica un láser pulsado evapora el blanco de grafito
en un reactor de alta temperatura (1200° C) mientras un gas inerte es purgado en la
cámara. Los nanotubos se desarrollan en las superficies más frías del reactor, dando
un rendimiento del 70% produciendo principalmente NTCPS. Sin embargo, es más
costoso este método que arco descarga y CVD.
c) Antorcha de plasma. Este método hace uso de una mezcla de los gases argón y
etileno; el ferroceno es introducido en una antorcha de plasma de microondas, donde
es atomizado por la presión atmosférica del plasma que tiene la forma de una intensa
flama. Los humos creados por la flama contienen NTCPS, nanopartículas de metal y
carbón amorfo.
d) Deposición química en fase vapor (CVD por sus siglas en inglés, Chemical Vapor
Deposition). Para este método, se prepara un sustrato con una capa de níquel, cobalto
y partículas de hierro. El sustrato se calienta ~700°C y se hacen fluir en el reactor 2
gases: un gas de proceso (amonio, nitrógeno o hidrógeno) y un gas que contiene
carbono (acetileno, etileno, etanol o metano). Los nanotubos crecen en los sitios del
catalizador metálico. Este método parece ser de los más prometedores para su
producción a gran escala debido a la relación precio/unidad. [9]
e) Spray pirólisis (Pirólisis de aspersión). Se hace uso de un horno tubular que se calienta
a una temperatura estable de ~800°C, donde se encuentra un tubo de cuarzo por
donde se hace pasar el gas argón como gas de arrastre y una mezcla de una fuente de
carbono y un catalizador. Los nanotubos que se obtienen de este método de síntesis
son de pared múltiple y se forman en las paredes del tubo de cuarzo. Esta técnica de
16
síntesis y producción de nanotubos de carbono es la que se utiliza en este proyecto de
investigación, en base al trabajo de Aguilar-Elguezabal y colaboradores [4], haciendo
algunas modificaciones. A continuación se muestra un diagrama esquemático de la
configuración utilizada en este método de síntesis de nanotubos de carbono.
1.1.4 Métodos y objetivos de funcionalización de nanotubos de carbono
La funcionalización de los nanotubos de carbono contiene en sí varios objetivos. En el caso del
comportamiento métalico o semi conductor, la modificación de la capa más externa de los
NTCPM por medio de una funcionalización covalente o no covalente optimiza su potencial al
máximo.
Por otra parte, uno de los objetivos principales de la funcionalización es el volver al material
biodegradable y biocompatible. Se ha observado en varios estudios que la aglomeración y baja
dispersabilidad, así como el uso de NTC prístinos son factores que contribuyen a una alta
toxicidad. En este sentido resaltan los trabajos de Kostarelos y col. [10, 11] en donde se
demuestra que los NTC pueden ser degradados por enzimas oxidativas, así como los distintos
factores que afectan la toxicocinética y acumulación de NTC en tejidos. La funcionalización de
los NTC representa una poderosa herramienta para diseñar andamios basados en NTC con un
mejor desempeño en promover el crecimiento neuronal y alargamiento de neuritas. Por
ejemplo, Hu y col. [12] demuestran en su estudio que es posible controlar el crecimiento y
ramificación de neuritas al modificar químicamente los NTC. En otro estudio, Jin y col. [13]
Figura 4 | Diagrama esquemático de la configuración utilizada en la técnica de pirólisis de
aspersión para producción de nanotubos de carbono de pared múltiple [4]
17
funcionalizaron NTCPM por un método de ionización, con el cual lograron hacer que los
nanotubos fueran solubles en agua.
Adicionalmente, otro objetivo de la funcionalización de NTC es la creación de grupos
funcionales. En el trabajo de Kumar y colaboradores [14] se llevaron a cabo 3 experimentos
para controlar la localización y densidad de los grupos carboxílicos en la superficie de los
NTCPM. El tratamiento con HNO3 solamente atacó las puntas resultando mínima o nula
oxidación de las paredes. Por otra parte, el tratamiento con “ácido áspero” (HNO3/H2SO4)
provocó oxidación no sólo en las puntas sino también en las paredes laterales de los
nanotubos. El aumento en el tiempo de reacción durante el segundo tratamiento logró un
incremento en la cantidad de grupos carboxílicos formados. Sin embargo, en el trabajo de
Bardi y col. [15] se observaron mejores resultados de los NTCPM funcionalizados con la
adición de grupos amino solamente, es decir, sin haber pasado por el proceso de oxidación,
mostrando una mayor tolerancia y una menor respuesta inflamatoria. Zhang y col. [16]
determinaron un método eficiente de caracterización de grupos funcionales formados en
NTCPM que han sido funcionalizados por algún método oxidativo. Para dicho trabajo,
primeramente funcionalizaron NTCPM con 3 métodos distintos: HNO3, H2O2 y H2SO4/HNO3 3:1
y se llevó a cabo una valoración ácido-base. Ellos resaltaban la importancia de caracterizar los
grupos funcionales para poder potencializar el uso de estos NTCPM en distintas aplicaciones,
principalmente como soportes catalíticos.
El método de funcionalización utilizado en el presente proyecto, se basa en una combinación
de los métodos utilizados por Chen y colaboradores [17] y Zhang y col. [16], con algunas
modificaciones, en donde se lleva a cabo un ataque ácido con HNO3 3 M.
1.1.5 Usos y aplicaciones biomédicas de nanotubos de carbono
Tomando en cuenta las propiedades de baja resistencia, alta conductividad eléctrica, gran
área superficial, fuerza mecánica y poca toxicidad que tienen los nanotubos de carbono,
diversos investigadores han realizado experimentos usando estos nanomateriales como
medios o interfaces para estimulación y registro de células nerviosas [18]. Los nanotubos de
carbono tanto de pared simple como de pared múltiple se han usado como andamios o
“scaffolds” para el cultivo y crecimiento de células similares a osteoblastos como en el trabajo
de Aoki y col. [19] y de células de tejido neuronal como en el trabajo de Fabbro y col. [20], así
como para cultivo de células nerviosas aisladas o tejido nervioso de cerebro y médula espinal
[12, 21-25]. El primer estudio in vitro que reportó la biocompatiblidad de nanotubos de
carbono para crecimiento neuronal fueron Mattson y col. [26] .Por otra parte, los estudios
realizados por Vladimir Parpura y col. [27, 28], y previamente por Matsumoto y col. [29]
demostraron que existe crecimiento neuronal con nanotubos de carbono de pared múltiple
funcionalizados [30]. También resaltan los trabajos realizados por Laura Ballerini y col. [21,
31, 32], quienes cultivaron explantes de médula espinal y circuitos neuronales, demostrando
que los nanotubos de carbono pueden ser adecuados para favorecer el crecimiento neuronal y
el fortalecimiento de circuitos sinápticos entre neuronas con un impacto a largo plazo.
Las propiedades de bio-compatibilidad y baja toxicidad de los nanotubos de carbono han sido
ampliamente aprovechadas para el cultivo de células, encaminando este abordaje
18
experimental a la terapia regenerativa, ingeniería de tejidos y como posibles nanovectores
para terapia genética [20, 33]. Los NTC solos o en distintas compostas han permitido el cultivo
y diferenciación de células troncales neuronales humanas [34, 35]; la diferenciación y
proliferación de células troncales pluripotentes y el desarrollo y absorción de células troncales
mesenquimales - células troncales neurales corticales. [20, 36] En otros estudios, Sung Ung
Moon y col. [37] realizaron experimentos in vivo, en donde demostraron que los NTC pueden
mejorar la diferenciación de células troncales para sanar células dañadas por un accidente
cerebrovascular.
Además de la capacidad que tienen los nanotubos de carbono de favorecer el crecimiento
neuronal, diversos abordajes y arreglos experimentales han hecho uso de estos materiales
para el monitoreo y biosensado de células vivas. Por ejemplo, nanotubos de carbono de pared
múltiple se utilizaron en la configuración de micro-arreglos de multi-electrodos para el estudio
de las propiedades eléctricas y químicas de neuronas [38]. Electrodos hechos a base de
nanotubos de carbono de pared simple o múltiple en forma de placa, colocados en la base de
cámaras de cultivo de tejidos, se utilizaron para el registro extracelular de células neuronales
en cultivo [23, 24]. Por último, electrodos convencionales de registro extracelular hechos a
base de platino o tungsteno, han sido recubiertos con nanotubos de carbono. Destacan
además, algunos trabajos en los que se utilizaron nanopipetas de carbono y pipetas
conductoras de NTCPM para inyección de sustancias y registro celular [38-40]. Raffa y col.
[41] realizaron la permeabilización de células sin uso de cables, usando nanotubos de carbono
como administradores de fármacos [42] y captura de material genético. Más recientemente,
se ha reportado el uso de nanotubos de carbono como recubrimientos de electrodos para uso
neurológico [43], resultando electrodos con mayor capacidad de almacenaje de carga y menor
impedancia. Se mencionan además aplicaciones en el tratamiento de cáncer, como material
base para uso dental y en procedimientos de vacunación [5].
Por otra parte, es importante mencionar que los nanotubos de carbono no son materiales
completamente inertes y pueden presentar efectos citotóxicos en algunos tejidos [44].
Lamberti y col. [5], nos presentan algunos estudios en los que factores como tamaño, cantidad
[43], diámetro, pureza, tejido a tratar, agregación, dispersión, método de síntesis y
funcionalización determinan la citotoxicidad de los NTC. Muchos de estos estudios se han
realizado in vitro y en animales [45], por lo que es difícil traducir estos resultados de estudio a
humanos, dado que la dosis de exposición es mucho mayor, entre otros factores. Además, es
importante recalcar que la experimentación se ha realizado en diferentes situaciones y cada
grupo de investigadores ha utilizado sus propios materiales, modificado y preparado de
manera específica según su metodología, lo que hace de cada reporte específico, también
para los materiales usados [46]. Mostafalou y col. [47] recomiendan tener un método basado
en un modelo animal o cultivo celular normal, haciendo hincapié en la necesidad de un
sistema que recolecte información sobre las relaciones entre estructura-tamaño-eficacia-
toxicidad de los distintos nanomateriales. Se concluye que se requieren más estudios para
poder tener una visión asertiva sobre el uso de los NTC en medicina y biología.
19
1.1.6 Nanotubos de carbono como moduladores de canales iónicos en células
Se ha planteado que los nanotubos de carbono pueden ser bloqueadores específicos de
canales iónicos membranales. Jakubek y col.[48] reportaron que las soluciones fisiológicas
que contenían nanotubos de carbono de pared simple, inhibieron la corriente de Ca++ a través
del canal de calcio dependiente de voltaje. Sin embargo, dicho bloqueo se demostró que es
debido no a la acción misma de los nanotubos, sino a la presencia del material contaminante
Itrio que competía por los sitios de unión; dicho elemento fue liberado en el medio por el
catalizador de crecimiento de los nanotubos.
En otro interesante trabajo, Xu y col. [49] mostraron que los nanotubos de carbono de pared
múltiple suprimen las corrientes de canales de K+ tipo IK0, IK e IK1, presentes en células PC -
12.
1.2 Modelos Biológicos
1.2.1 Modelos para estudios neurológicos
En el estudio del sistema nervioso central y periférico se han utilizado como modelos
biológicos, invertebrados y mamíferos que presentan actividad neuronal similar a la del ser
humano. Se reportan varios estudios de biocompatibilidad de nanotubos de carbono con estos
modelos biológicos. En los trabajos de Alessandra Fabbro y col. [22] se utilizaron ratas Wistar
neonatales para estudiar los efectos de NTC en neuronas de la médula espinal. Bokara y col.
[37] a su vez, utilizaron ratas Sprague-Dawley para sus estudios in vivo, en donde se demostró
que células impregnadas con nanotubos de carbono a las cuales se les provocó un daño grave
se recuperaron. Por otra parte, muchos de los estudios llevados a cabo en esta área utilizan
neuronas aisladas y cultivadas para estudiar su comportamiento al ser estimuladas por
distintos factores, como en el trabajo de Cao y col. [49] en el cual se utilizaron células
derivadas de Rattus norvegicus. Para la realización de estos estudios es necesario seguir
estrictos protocolos de ética y la adquisición de dichos especímenes suele ser complicada y
costosa para los centros de investigación. En contraste, en diversos estudios se utilizan
invertebrados, los cuales son de fácil adquisición y presentan además actividad neuronal muy
similar a la de los mamíferos. Cottrell y col. [50] en sus trabajos clásicos utilizan el Planorbis
Corneus mejor conocido como caracol diablo para medir los potenciales sinápticos de las
neuronas de este invertebrado. Por otro lado, R.J. Walker, G.A. Kerkut y colaboradores, son
quienes iniciaron los estudios con el caracol de jardín Helix aspersa [3, 51-53]. Lograron
identificar morfológicamente y fisiológicamente los ganglios y neuronas, así como distintos
receptores y canales iónicos presentes en dicho invertebrado; éstos presentaban actividad
muy similar a las neuronas de mamíferos, lo cual convirtió a este invertebrado en un modelo
biológico confiable.
20
1.2.2 Generalidades del caracol Helix aspersa
El caracol de jardín Helix aspersa se origina en Europa, Norte América o el Pacífico y es
utilizado en comercio gastronómico, de salud y belleza y en distintas áreas de investigación.
Algunos estudios han utilizado a este invertebrado como biomonitor para la contaminación del
medio ambiente debido a su fácil aclimatación y manipulación en el laboratorio, así como
sensibilidad a ensayos de genotoxicidad. En el trabajo de Melissa de Souza y col. [54] se utilizó
para evaluar el potencial genotóxico de suelo contaminado. Por otra parte, se han realizado
estudios neurológicos con este invertebrado debido a la fácil localización de sus neuronas,
patrón de despolarización que muestran algunas de las neuronas, entre otras características.
[55, 56]
1.2.3 Neuronas de Helix aspersa
Las neuronas del caracol Helix Aspersa presentan propiedades bio-eléctricas y canales iónicos
similares a los que se expresan en neuronas de mamífero, por lo que se utilizan como modelos
biológicos en múltiples estudios en el campo de las neurociencias.
Las neuronas identificadas de los ganglios de Helix aspersa presentan distintas ventajas para
el desarrollo de este proyecto:
i. Existen mapas de estudios clásicos, como el de las Figuras 5 y 6 que permiten
identificar topográfica, morfológica y electrofisiológicamente el tipo de célula con el
que se desea trabajar. [3]
ii. La neurona que se utilizó en esta investigación (1F) es de las más grandes de la masa
ganglionar. Estas neuronas llegan a medir hasta 250
m de diámetro (tamaño similar a las neuronas
humanas), por lo que resulta fácil identificarlas y
lograr penetrar con un microelectrodo para su
estudio electrofisiológico.
iii. Se conocen las concentraciones libres de los
diversos iones tanto extracelular como
intracelularmente, así como la naturaleza y cinética
de las corrientes iónicas, como lo son sodio, potasio
y calcio.
iv. Además, se han identificado la presencia de
distintos receptores transmembranales del tipo
colinérgico y dopaminérgico.
v. La mayoría de las células tienen actividad eléctrica
espontánea, es decir, tiene actividad eléctrica tipo
marcapaso con generación de potenciales de acción
en forma de trenes o ráfagas.
vi. Estas neuronas no requieren de mantenimiento y
control de temperatura, así como de oxigenación,
cuando son estudiadas a temperatura ambiente.
Figura 5 | Diagrama esquemático de
la masa ganglionar periesofágica de
Helix aspersa [3]
Figura 6 | Diagrama esquemático de la masa ganglionar
subesofágica de Helix aspersa vista del lado derecho [3]
21
1.3 Fundamentos fisiológicos: neuronas
1.3.1 Generalidades de membrana plasmática y canales neuronales
La membrana plasmática forma el límite externo continuo del cuerpo celular y sus
prolongaciones y en la neurona es el sitio de iniciación y conducción del impulso nervioso. La
membrana plasmática y la cubierta celular forman una membrana semipermeable que permite
la difusión de ciertos iones a través de ella pero restringe la de otros. En estado de reposo
(estado no estimulado) algunos iones se difunden a través de la membrana plasmática desde
el citoplasma celular hasta el líquido tisular. Para los demás iones es necesario algún estimulo
eléctrico, mecánico o químico que produzca un cambio rápido de la permeabilidad de la
membrana y permita que estos iones se difundan a través de ella.
Los canales iónicos, (como los de sodio y potasio), a través de los cuales se difunden estos
iones por la membrana plasmática están formados por moléculas proteicas que se extienden
en todo el espesor de la membrana plasmática. Las proteínas de los canales iónicos son
relativamente estables, pero existen a lo menos dos estados de conformación que representan
un estado funcional abierto y un estado funcional cerrado. El mecanismo responsable de la
apertura y el cierre de un canal se desconoce pero puede ser comparado con una puerta que
se abre y se cierra. El mecanismo de compuerta puede consistir en la torsión y la distorsión del
canal, lo que aumenta o estrecha la luz. La apertura y el cierre de la compuerta parece ocurrir
en respuesta a estímulos tales como un cambio de voltaje, la presencia de un ligando o el
estiramiento o la presión. [57]
1.3.2 Potenciales de membrana y potenciales de acción
El potencial de membrana es la diferencia de voltaje eléctrico a ambos lados de la membrana,
producto de la distribución asimétrica de iones. Como resultado de la permeabilidad selectiva
de la membrana plasmática, la presencia de moléculas con carga negativa que no se difunden
dentro de la célula y la acción de varias unidades de bomba sodio-potasio; hay una distribución
desigual de cargas a través de la membrana. Como consecuencia, el interior de la célula tiene
mayor cantidad de cargas negativas en comparación con el exterior. Esta diferencia de carga,
o diferencia de potencial, se conoce como el potencial de membrana.
Los iones sodio, potasio y cloruro son los iones más importantes que participan en la
generación de los potenciales de membrana en las fibras nerviosas y musculares, así como en
las células neuronales del sistema nervioso. Na y K son iones positivos univalentes, Cl es un
ion negativo univalente. El gradiente de concentración de cada uno de estos iones a través de
la membrana ayuda a determinar el voltaje del potencial de membrana. La permeabilidad de
los canales de Na y de K experimenta cambios rápidos durante la transmisión de un impulso
nervioso, mientras que la permeabilidad de los canales de Cl no se modifica mucho durante
este proceso. Por tanto, los cambios rápidos de la permeabilidad al sodio y el potasio son los
principales responsables de la transmisión de las señales en los nervios.
22
El potencial de membrana en reposo de las fibras nerviosas grandes cuando no transmiten
señales nerviosas es de aproximadamente -90 mV. Los factores principales que establecen
este potencial de membrana son: contribución del potencial de difusión de potasio,
contribución de la difusión de sodio a través de la membrana nerviosa y la contribución de la
bomba Na+ - K+. En la fibra nerviosa normal la permeabilidad de la membrana al potasio es
aproximadamente 100 veces mayor que la permeabilidad al sodio, por lo tanto, la difusión del
potasio contribuye mucho más al potencial de membrana que la difusión del sodio.
Las señales nerviosas se transmiten mediante potenciales de acción que son cambios rápidos
del potencial de membrana que se extienden
rápidamente a lo largo de la membrana de la fibra
nerviosa. Cada potencial de acción comienza con
un cambio súbito desde el potencial de membrana
negativo en reposo normal hasta un potencial
positivo y después termina con un cambio casi igual
de rápido de nuevo hacia el potencial negativo.
Para conducir una señal nerviosa el potencial de
acción se desplaza a lo largo de la fibra nerviosa
hasta que llega al extremo de la misma. La Figura 7
muestra gráficamente los cambios que se producen
en la membrana durante el potencial de acción, con
transferencia de las cargas positivas hacia el
interior de la fibra en el momento de su inicio y el
regreso de las cargas positivas al exterior al final del
mismo. Las sucesivas fases del potencial de acción son las siguientes: fase de reposo, fase de
despolarización y fase de repolarización.
Además de estos factores que producen los potenciales de acción, es importante mencionar a
los canales de Na+ y K+ activados por el voltaje.
La Figura 8 muestra los cambios de la conductancia de la membrana a los iones sodio y
potasio. Durante el estado de reposo, antes de que comience el potencial de acción, la
conductancia a los iones potasio es 50 a 100 veces
mayor que la conductancia a los iones sodio. Esto se
debe a una fuga mucho mayor de iones potasio que
sodio a través de los canales de fuga. Sin embargo, al
inicio del potencial de acción se activan
instantáneamente los canales de sodio y dan lugar a
un aumento de la conductancia al sodio de 5000
veces. Después, el proceso de inactivación cierra los
canales de sodio en otra fracción de milisegundo. El
inicio del potencial de acción también produce
activación por el voltaje de los canales de potasio,
haciendo que empiecen a abrirse más lentamente una
fracción de milisegundo después de que se abran los
canales de sodio. Al final del potencial de acción, el
Figura 7 | Diagrama esquemático de un
potencial de acción [1]
Figura 8 | Diagrama esquemático de
cambios de conductancia membranal [1]
celular
23
retorno del potencial de membrana al estado negativo hace que se cierren de nuevo los
canales de potasio hasta su estado original, pero una vez más sólo después de una demora de
1 milisegundo o más. [1]
Por último, según el tipo de estímulo que recibe la neurona, la diferencia de potencial puede
aumentar que es a lo que se le llama “hiperpolarización” (se hace más negativo el interior de
la neurona), o puede disminuir que es lo que se llama “despolarización”, como se vio
previamente, (se hace menos negativo el interior de la neurona). Si el estímulo supera un
umbral, la despolarización dispara el potencial de acción. La ley del todo o nada indica que la
neurona genera un impulso si se supera el umbral y no lo genera si no se supera.
1.3.3 Sustancias Agonistas y Antagonistas
El uso de los términos agonista y antagonista se usa en bioquímica y podemos verlo escrito
muchas veces en la posología del prospecto de los medicamentos. Un agonista y un
antagonista son los opuestos si se produce una acción o agonista, el antagonista reaccionara y
se opondrá a esa acción.
Se llama agonista a un compuesto químico capaz de simular el efecto de una sustancia
producida por nuestro propio cuerpo. El agonista no es la sustancia original de nuestro cuerpo
pero actúa de forma parecida, la imita. Las sustancias que produce nuestro cuerpo actúan
sobre los receptores. Si un agonista imita a la sustancia producida de forma natural, estimula
al receptor y se logran los efectos que esa sustancia natural produce en las células. Tenemos
un claro ejemplo en la Dopamina, una sustancia producida por nuestro cuerpo pero que
también está presente en muchos medicamentos como los antidepresivos. Las sustancias
químicas producidas de forma artificial como la apomorfina, el pramipexole, las anfetaminas y
las bromocriptinas imitan esta composición natural de la dopamina, “engañan” al receptor y lo
estimulan, luego producen efectos similares a la dopamina en el cuerpo humano.
Una sustancia puede ser agonista pleno, si logra una respuesta plena tal como se obtendría
con la sustancia producida por nuestro cuerpo. O puede ser agonista de forma parcial, cuando
logra una respuesta apreciable pero no completa tal como la propia sustancia producida de
forma natural.
Antagonista es una sustancia que imita a la sustancia natural para poder ocupar su lugar en el
receptor bloqueándolo sin producir efecto. El antagonista “engaña” al receptor simulando ser
la sustancia natural sin serlo. De esta forma la sustancia original no podrá actuar ya que su
“sitio” está ocupado por ese antagonista. En el ejemplo de la Dopamina, son antagonistas
sustancias como los neurolépticos, los tiaxantenos y butiferononas. Podemos encontrar
diferentes tipos de antagonistas, por ejemplo:
Antagonista competitivo. Es un tipo de opiáceo que actúa sobre el receptor evitando
que el agonista produzca el efecto, dependiendo, eso sí, de la concentración del
agonista. También se suele llamar antagonista reversible.
24
Antagonista no competitivo. Es un tipo de opiáceo que también actúa sobre el receptor
evitando que produzca sus efectos, pero en este caso su eficacia no está delimitada
por la concentración de agonistas, es decir, cumple su cometido sea cual sea la
concentración de agonistas.
Antagonista adrenérgico. Bloquean las acciones de los agonistas adrenérgicos, tales
como la epinefrina. Se dividen en dos grandes grupos, antagonistas α - bloqueantes y
antagonistas β - bloqueantes.
Antagonista químico: Se podría definir como una reacción química entre varias
sustancias que bloquea el efecto de otra sustancia. También se denomina
antagonismo por neutralización. [2]
En la Figura 9, se muestra un esquema de las distintas respuestas de los receptores a un
ligando endógeno, una sustancia agonista y una sustancia antagonista.
1.3.4 Agonistas de receptores membranales dopaminérgicos
La Dopamina, neurotransmisor importante para la función motora del organismo, puede ser
una sustancia central transmisora, adicionalmente de ser un precursor de la noradrenalina. En
muchos sistemas nerviosos de invertebrados se localiza la dopamina en neuronas particulares
y se manejan altas concentraciones de esta. Bolshakov y col.[58] trabajando con glutamato,
dopamina y el agonista muscarínico F-2268 obtuvieron como resultado hiperpolarizaciones
equivalentes con amplitudes entre 10-15 mV que llevaron a la inhibición de la actividad
neuronal. La aplicación de agonistas durante periodos largos llevó al decrecimiento de la
amplitud de la corriente. De los diferentes tipos de receptores dopaminérgicos, se identificó el
receptor D1 [58] y la apomorfina como agonista de éste. Dentro del mismo trabajo de
Bolshakov, se observó la activación de los canales de potasio mejorados por la aplicación de
un baño de glutamato, dopamina o F-2268. La mejora se basaba en aumentar la probabilidad
de apertura de los canales de potasio activos.
Figura 9 | Diagrama esquemático de receptores membranales y ligandos: endógeno,
agonista y antagonista [2]
25
1.3.5 Antagonistas de receptores membranales dopaminérgicos
En los trabajos clásicos de investigación de Berry y col. [50], se ha demostrado que la
ergometrina, tubocurarina, bromuro de hexametonio entre otros compuestos, trabajan como
antagonistas de la Dopamina y la Acetilcolina. En estos mismos estudios realizados con el
caracol Planorbis Corneus se utilizaron 8 sustancias transmisoras, de las cuales sólo la
Dopamina produjo un cambio de potencial. La Dopamina demostró ser por lo menos 10 veces
más potente que la noradrenalina en estas células.
En la actualidad existen varios fármacos comerciales que son conocidos como antagonistas de
los receptores dopaminérgicos. Tal es el caso de la Domperidona que actúa como antagonista
del receptor D2 a nivel del SNP, la Metoclopramida que actúa como antagonista del receptor
D2 a nivel del SNP y SNC, Haloperidol que actúa sobre el receptor D2 a nivel SNC y la
Ergometrina, como se mencionó anteriormente, actúa como antagonista de los receptores D1
y D2 en moluscos.
1.3.6 Agonistas de receptor colinérgico muscarínico
Otro receptor de importancia es el receptor colinérgico muscarínico. Para dicho receptor se
encuentra perfectamente identificado como sustancia agonista al cloruro de carbamilcolina,
comúnmente conocido como Carbachol. En el trabajo de Kerkut y col. [3] se observa la
respuesta de la neurona 1F del caracol Helix aspersa como despolarizaciones al ser
estimuladas por distintas dosis de Carbachol.
En Anexos, se encuentran tablas con agonistas y antagonistas a receptores dopaminérgicos,
colinérgicos, glutámicos y bloqueadores de calcio.
1.4 Técnicas de caracterización
1.4.1 Microscopia electrónica de barrido
La microscopía electrónica de barrido (SEM - Scanning Electron Microscope), se basa en el
principio de la microscopía óptica en la que se sustituye el haz de luz por un haz de electrones.
Con esto se puede conseguir hasta los 100 Ǻ, resolución muy superior a cualquier instrumento
óptico.
Su funcionamiento consiste en hacer incidir un barrido de haz de electrones sobre la muestra.
La muestra (salvo que ya sea conductora) está generalmente recubierta con una capa fina de
oro, plata o carbón, lo que le otorga propiedades conductoras. La técnica de preparación de
las muestras se denomina sputtering o pulverización catódica.
Al alcanzar el haz la superficie de la muestra se generan principalmente las siguientes
partículas: electrones retrodispersados (ER) y electrones secundarios (ES). Además de
radiación electromagnética (rayos X) y otras partículas.
26
El microscopio se encuentra internamente equipado con unos detectores que recogen la
energía y la transforman en las siguientes imágenes y datos:
Detector de electrones secundarios (SEI – Secondary Electron Image) con los que se
obtiene las imágenes de alta resolución.
Detector de electrones retrodispersados (BEI – Backscattered Electron Image), que
tiene una menor resolución de imagen pero ofrece un mayor contraste para obtener la
topografía de la superficie de la muestra.
Detector de energía dispersiva (EDS – Energy Dispersive Spectrometer) detecta los
rayos X generados y permite realizar un análisis espectrográfico de la composición de
la muestra. [59]
La microscopia electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM – Field Emission Scanning
Electron Microscope) se diferencia del SEM principalmente en el cañón de electrones. El SEM
tiene un cañón termoiónico y el FESEM un cañón de emisión de campo, lo que lo hace un
microscopio de alta resolución que a su vez puede manejar bajos voltajes para analizar
muestras no conductoras sin la necesidad de una preparación especial.
1.4.2 Microscopia confocal
La Microscopía Confocal es una tecnología que permite observaciones a una resolución
mayor que la que se puede lograr con la microscopía óptica convencional.
Emplea un sistema láser que aplica el haz de luz en forma de barrido, en una pequeña parte
del espécimen. El láser aplicado a una longitud de onda determinada en la muestra, hace que
moléculas excitadas de la misma, emitan fluorescencia a una longitud de onda mayor a la
aplicada. La fluorescencia en una muestra puede ser debida a moléculas que se encuentran
de forma natural (autofluorescencia como en el caso de la clorofila) o puede ser producida por
moléculas aplicadas artificialmente a la muestra llamadas fluorocromos. Hay una gran
cantidad de fluorocromos específicos en el mercado usados para diferentes estructuras
celulares y para diferente emisión de fluorescencia. El uso de varias combinaciones de
láser capaces de detectar y producir fluorescencia a diferentes longitudes de onda, permite
un escaneo de la muestra en un amplio rango del espectro de luz, permitiendo la observación
de estructuras teñidas con gran detalle. Debido a que penetra fácilmente la muestra, el
microscopio confocal logra imágenes en diferentes planos focales que ligados a un
programa de computo, puede reproducir una imagen tridimensional del material observado.
Las siguientes características han hecho de la microscopia confocal una de las herramientas
de trabajo predilectas por científicos de las ciencias biológicas médicas y de materiales de
todo el mundo:
Alta sensibilidad en la observación
27
Especificidad en la emisión de la fluorescencia
Mayor Resolución
Tridimensionalidad de las imágenes [60]
1.4.3 Espectrometría RAMAN
La espectrometría Raman es una técnica espectroscópica utilizada para el estudio de los
modos vibracionales, rotacionales y otros de baja frecuencia en un sistema. Se basa en la
dispersión inelástica, o dispersión Raman, de la luz monocromática, que por lo general
procede de un láser en el rango visible, infrarrojo cercano, o ultravioleta cercano. La luz láser
interactúa con fonones u otras excitaciones en el sistema, por lo que la energía de los fotones
láser se desplaza hacia arriba o hacia abajo. Normalmente, la muestra se ilumina con un rayo
láser. La luz del punto iluminado se recoge con una lente y se envía a través de un
monocromador. Las longitudes de onda cercanas a la línea láser, debidas a la dispersión
elástica de Rayleigh, son filtradas, mientras que el resto de la luz recogida se dispersa en un
detector. [61]
Las principales características en el espectro Raman de nanotubos de carbono se presentan
en la figura 10 y son:
1. El modo de respiración radial RBM también conocida como banda RBM (100 - 300 cm-
1) que es característica de los nanotubos de pared sencilla
2. La banda G (1590 cm-1) característica de carbón ordenado según la configuración sp2
3. La banda D (1350 cm-1) la cual hace referencia a carbono amorfo con estructura sp3
4. La banda G’ la cual indica si tendrá un carácter semiconductor o conductor.
El cociente de las intensidades IG/ID de las bandas G y D, respectivamente, suministran
información de la proporción de nanotubos de carbono sintetizados frente a carbón amorfo
Figura 10 | Espectros característicos de nanotubos de carbono
28
generado, y es considerado un índice de la calidad de dichos nanotubos. Valores de IG/ID
superiores a la unidad indican una elevada calidad del material sintetizado (nanotubos de
carbono).
1.4.4 Espectrometría de Infrarrojo
La espectrometría de infrarrojo es un tipo de espectrometría de absorción que utiliza la región
infrarroja del espectro electromagnético. Como las demás técnicas espectroscópicas, puede
ser utilizada para identificar un compuesto o investigar la composición de una muestra.
La espectrometría infrarroja se basa en el hecho de que los enlaces químicos de las
sustancias tienen frecuencias de vibración específicas, que corresponden a los niveles de
energía de la molécula. Estas frecuencias dependen de la forma de la superficie de energía
potencial de la molécula, la geometría molecular, las masas atómicas y, posiblemente, el
acoplamiento vibracional. Si la molécula recibe luz con la misma energía de esa vibración,
entonces la luz será absorbida si se dan ciertas condiciones.
Para que una vibración aparezca en el espectro infrarrojo, la molécula debe someterse a un
cambio en su momento dipolar durante la vibración. En particular, una aproximación de Born-
Oppenheimer y aproximaciones armónicas; es decir, cuando el hamiltoniano molecular
correspondiente al estado electrónico estándar puede ser aproximado por un oscilador
armónico cuántico en las cercanías de la geometría molecular de equilibrio, las frecuencias
vibracionales de resonancia son determinadas por los modos normales correspondientes a la
superficie de energía potencial del estado electrónico estándar. No obstante, las frecuencias
de resonancia pueden estar, en una primera aproximación, en relación con la longitud del
enlace y las masas de los átomos en cada extremo del mismo. Los enlaces pueden vibrar de
seis maneras: estiramiento simétrico, estiramiento asimétrico, tijeras, rotación, giro y wag.
Con el fin de hacer medidas en una muestra, se transmite un rayo monocromo de luz infrarroja
a través de la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida. Repitiendo esta
operación en un rango de longitudes de onda de interés (por lo general, 4000-400 cm-1) se
puede construir un gráfico. Esta técnica funciona casi exclusivamente en enlaces covalentes, y
se usa habitualmente para la identificación de mezclas complejas. [62]
2. JUSTIFICACIÓN
Se ha planteado que los nanotubos de carbono pueden usarse en la construcción de
electrodos que permitan registrar y crear una interfaz con el tejido neuronal con dispositivos de
estimulación y registro de señales. El proceso de adquirir y transmitir señales bio-eléctricas de
estos nanotubos se fundamenta en sus dimensiones nanométricas, su alta capacidad de
conducción eléctrica y su capacidad de adherirse a las membranas celulares. Ya se han usado
distintos nanotubos de carbono de pared múltiple y de pared simple, como andamios o
“scaffolds” para cultivo de células nerviosas, reportando resultados controversiales de
sobrevida y crecimiento neuronal. Sin embargo, no se ha demostrado si estos materiales
pueden sensar y conducir adecuadamente las señales bio-eléctricas de las neuronas.
Tampoco se ha demostrado si los nanotubos de carbono bloquean la actividad de canales
29
iónicos (dependientes de voltaje y dependientes de ligando) que subyacen a las señales bio-
eléctricas neuronales. Falta por resolver si los nanotubos de carbono, dadas sus propiedades
físicas y electro-conductivas, pueden lograr una continuidad morfológica y eléctrica entre dos
neuronas.
3. HIPÓTESIS
Los nanotubos de carbono de pared múltiple no modifican la conductancia de entrada y las
corrientes iónicas activadas por agonistas dopaminérgicos en neuronas de Helix aspersa, y
pueden actuar como puente eléctrico entre dos neuronas.
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Evaluar los posibles efectos tóxicos de nanotubos de carbono de pared múltiple (NTCPM)
sobre la permeabilidad iónica del canal-receptor activado por la unión a Dopamina en células
nerviosas de Helix aspersa.
4.2 Objetivos Específicos
Evaluar la distribución topográfica de nanotubos de carbono de pared múltiple sobre la
membrana de neuronas de Helix aspersa
Estudiar las propiedades electrofisiológicas y farmacológicas del receptor a Dopamina
en neuronas de Helix aspersa
Evaluar los efectos de nanotubos de carbono de pared múltiple sobre la permeabilidad
iónica activada por el receptor a Dopamina en neuronas de caracol
5. METODOLOGÍA
5.1 Síntesis de nanotubos de carbono de pared múltiple
Para la síntesis de nanotubos de carbono de pared múltiple se hizo uso de la técnica de
dispersión pirolítica desarrollada por Aguilar y col. [4] con algunas modificaciones. Se utilizó
un horno tubular Thermo Scientific a 800°C. Se usó Ar como gas de arrastre a un flujo de 320
ccm (céntimetros cúbicos estándar por minuto) haciéndolo pasar por un termopar que se
encontraba a una temperatura de 180°C. Se inyectó una solución de 0.25 g de ferroceno
diluidos en 25 ml de tolueno a un flujo de 2 ml/min utilizando el principio de carbonización de
fase gaseosa, en el que las moléculas de hidrocarburo se descomponen para depositarse
30
como carbono sólido, así formando los nanotubos de carbono. En dicho proceso, el tolueno
actúa como fuente de carbono (precursor de carbono) y el ferroceno como catalizador. Tanto el
argón, como la solución fueron guiados hacia un tubo de cuarzo que funcionó como sustrato
para la formación de dichos nanotubos. Al finalizar el tiempo de síntesis, se apagó el termopar,
dejando solamente activo el flujo de argón para evitar que los nanotubos de carbono se
oxidaran. Una vez que se enfrió el tubo de cuarzo, se procedió a extraer los nanotubos de
carbono raspando el tubo por la parte interior con una espátula delgada y alargada. La figura
11 muestra el arreglo experimental utilizado para este método de síntesis.
5.2 Funcionalización de nanotubos de carbono de pared múltiple
Para la funcionalización de los NTCPM se emplearon las condiciones basadas en el trabajo de
Chen y col. [17], con algunas modificaciones. La solución ácida que se utilizó fue HNO3 3 M
diluido en 500 ml de agua destilada. A esta solución se le adicionaron 0.228 g de nanotubos
de carbono de pared múltiple prístinos. La mezcla se dejó en reflujo durante 12 horas a 90°C,
en agitación constante. Se dejó enfriar la mezcla a temperatura ambiente, se centrifugó y
eliminó el sobrenadante, llevándose a cabo 18 lavados hasta neutralizar el pH. Finalmente, se
secaron los NTCPM en un horno de convección a 100°C durante 4 horas.
Figura 11 | Arreglo experimental para síntesis de nanotubos de carbono. A: controlador de flujo de Ar,
B: termopar, C: controlador de flujo de soluciones, D: jeringa con solución, E: tubo de cuarzo con
NTCPM sintetizados, F: horno tubular
31
La figura 12 muestra el instrumental utilizado para dicho proceso de
funcionalización. La flecha indica el flujo del agua a través del
refrigerante.
5.3 Caracterización de nanotubos de carbono de pared múltiple
5.3.1 Microscopía electrónica de barrido
Se utilizó la técnica de microscopía electrónica de barrido (SEM) para realizar un análisis
morfológico de los nanotubos de carbono de pared múltiple “prístinos”, es decir, después de
haber sido sintetizados y sin haber pasado por ningún método de purificación. El microscopio
utilizado fue HITACHI modelo SU3500. También se realizó un análisis composicional de estas
muestras por medio del espectrómetro EDS (Espectroscopia de energía dispersiva) con el que
cuenta el microscopio. Los NTCPM se encontraban en forma de polvo, por lo que para su
preparación sólo fue necesario dispersarlos en isopropanol y colocarlos en un soporte metálico
para ser analizados.
5.3.2 Microscopía electrónica de barrido de alta resolución
Se realizaron además pruebas de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo
(FESEM), en la cual se realizó un análisis de composición elemental y análisis morfológico de
los NTCPM funcionalizados. El microscopio utilizado fue JEOL modelo JSM-7401F.No fue
necesario el preparar a los NTC para el análisis, ya que se encontraban en estado sólido en
forma de polvo. Se colocaron en un soporte de cobre y se aplicó una capa de esmalte de plata
para fijarlos al soporte, mejorar su conducción y evitar su desprendimiento durante las
pruebas.
5.3.3 Espectrometría RAMAN
Para el análisis de espectrometría RAMAN, se utilizó el espectrómetro Micro RAMAN modelo
Labram VIS-63. Para su análisis, no fue necesaria una preparación de la muestra, ya que se
encontraban en estado sólido en forma de polvo, solamente se colocaron en una base de
aluminio.
5.3.4 Espectrometría de infrarrojo
Figura 12 | Arreglo experimental para funcionalización
de nanotubos de carbono. A: condensador, B: matraz
redondo de fondo plano, C: parrilla eléctrica
32
Se utilizó el espectrómetro infrarrojo Perkin Elmer instruments modelo Spectrum GX para el
análisis de los NTCPM prístinos y funcionalizados. Las muestras se encontraban en estado
sólido en forma de polvo, por lo que no fue necesaria una preparación previa a su análisis.
5.4 Disección y aislamiento de ganglios cerebrales de Helix aspersa
Previo a la disección, se preparó 1 litro de solución Ringer de Caracol Normal, utilizando las
siguientes concentraciones: NaCl 75 mM, KCl 4 mM, CaCl2 10 mM, MgCl2 5 mM, Glucosa
5mM, HEPES 5 mM y se ajustó a un pH de 7.5 utilizando NaOH 1 M. Una vez realizada la
disección del cerebro de caracol, se colocó en una caja Petri con Sylgard 184 como base y
bañada en SRC. Se hizo uso de “minucias” o pines de acero inoxidable, así como de
instrumental para micro disección de la marca Fine Science Tools para poder aislar los
ganglios cerebrales de interés: D, E y F. Una vez aislados, se utilizó la enzima Proteasa Tipo XVI
en una concentración de 10 mg/10 ml para poder retirar la última capa de tejido conectivo y
poder dejar las neuronas expuestas, listas para experimentación y registro de señales
bioeléctricas.
La metodología para la disección, microdisección y aislamiento de los ganglios cerebrales de
Helix aspersa se detalla en los Anexos.
5.5 Dispersión y caracterización de nanotubos de carbono de pared
múltiple en SRC
Se utilizó Poli-vinil-pirrolidona (PVP-40) de Sigma-Aldrich como dispersante para los NTCPM. Se
agregó 1 g de PVP a un matraz que contenía 20 ml de agua desionizada. Se mantuvo en
agitación magnética durante 30 minutos, después se agregaron 100 mg de NTCPM
funcionalizados y se continuó la agitación magnética durante otros 30 minutos. El siguiente
paso consistió en sonicar el matraz que contenía los NTCPM dispersos en PVP durante 1 hora
utilizando un sonicador de barra Hielscher Ultrasound Technology modelo UP400S. Por último,
se resuspendieron los nanotubos de carbono en SRC, haciendo uso de la técnica de dilución
seriada para obtener las concentraciones finales de 0.5, 0.05 y 0.005 mg/ml. Todos estos
experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente.
5.5.1 Microscopía electrónica de barrido de emisión de campo
Las muestras de distintas diluciones de NTCPM dispersos en SRC: 1:10, 1:100 y 1:1000, se
depositaron en soportes de cobre. Se secaron en un horno de convección a 60 °C durante 1
hora de este modo dejándolos preparados para observación por medio del microscopio
electrónico de emisión de campo JEOL modelo JSM-7401F.
5.5.2 Microscopía confocal
33
Las muestras de distintas diluciones de NTCPM dispersos en SRC: 1:10, 1:100 y 1:1000, se
depositaron en portaobjetos de vidrio. Se secaron en un horno de convección a 60°C durante
1 hora y se fijaron haciendo uso de un cubreobjetos y barniz transparente. Se utilizó el
microscopio confocal ZEISS modelo LSM 710 con el láser de 405, en modo reflexión para
observar los NTCPM. Se realizaron pruebas con aumentos de 40X y 63X, utilizando aceite de
inmersión para ambos casos.
5.6 Evaluación de distribución topográfica de nanotubos de carbono
sobre la membrana neuronal
5.6.1 Microscopia electrónica de barrido de emisión de campo
Se realizaron 5 disecciones de ganglio cerebral F del caracol de jardín Helix aspersa. Se
prepararon 2 cajas Petri con 3 y 2 ganglios cada una. Se eliminó la SRC y se agregaron 5 ml de
solución conteniendo NTCPM funcionalizados (100 μg/ml en SRC) y se dejó incubar y reposar
durante 2 horas a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y se aplicó el
Paraformaldehido al 4% en SRC (pH 7.5) y se dejó incubando durante 1 hora a temperatura
ambiente. Se lavó la preparación con SRC normal y se dejó secar a temperatura ambiente en
un portaobjetos. La metodología para la preparación del Paraformaldehido al 4% se detalla en
anexos.
Se recubrieron las muestras con esmalte de plata y se observaron por la técnica de FESEM
utilizando el microscopio JEOL modelo JSM-7401F.
5.7 Estudio de propiedades electrofisiológicas y farmacológicas del
receptor a Dopamina en neuronas
5.7.1 Arreglo experimental
El arreglo experimental o set up consiste de un preamplificador Dagan modelo 8500, en
donde se conecta un microelectrodo de borosilicato, que se utiliza como electrodo de registro
intracelular, a través de un “holder” o soporte de lucita, a la punta de prueba. Dicho electrodo
permite pasar corriente y registrar el potencial transmembranal. Las señales que se obtienen
Figura 13 | Diagrama esquemático de dispositivo experimental para registro de señales bioeléctricas
34
del amplificador de ganancia unitaria (X1), son enviadas a un osciloscopio HITACHI modelo V-
212 de 20MHz, y a un registrador General Scanning Inc. modelo RS2-59. Las señales de
corriente y voltaje son conectados a una Interface Digidata 2000 de Axon Instruments y a una
unidad de captura y digitalización DAQ para registro y adquisición de señales bioeléctricas de
neuronas. Finalmente, se utiliza el programa Pclamp 5 para el procesamiento de información.
Este arreglo experimental, también incluye un estimulador de señales eléctricas S5 Stymulador
que se utiliza para medir resistencia, entre otras pruebas. A continuación, se muestra un
diagrama esquemático de la configuración utilizada. La descripción detallada de las
conexiones eléctricas se encuentra en Anexos.
5.7.2 Cámara de registro
Se utiliza una cámara de registro de plexiglass y lucita, conteniendo en su superficie Sylgard
184. Dicha cámara consta de 3 fosas: A, B y C. La fosa A se utiliza como entrada o “input” de
las sustancias experimentales. En la fosa B se coloca el ganglio F de Helix aspersa a utilizar en
cada experimento, así como el micro electrodo de registro. Por último, se utiliza la fosa C para
cerrar el circuito con el electrodo de referencia y se conecta además a la bomba de vacío para
que haya un flujo constante de soluciones de izquierda a derecha, como lo marcan la flecha
color negro de la figura 14, donde se muestra la cámara de registro con sus respectivas fosas.
5.7.3 Microelectrodos de registro y de referencia
Los microelectrodos para registro intracelular son pipetas capilares de vidrio de borosilicato,
conteniendo en su luz un filamento interno que permite su fácil llenado. Para obtener pipetas
de resistencia y forma óptimas, se utilizó un estirador vertical Vertical Pipette Puller modelo
DKI 700-C. El método de obtención de dichos microelectrodos consiste en fijar el tubo original
en ambos extremos a modo que quede la resistencia en la parte central del tubo. Al calentarse
la resistencia y jalar los extremos, se logra obtener 2 electrodos con puntas nanométricas. En
la figura 15 a) se muestra el tubo original fijo y en b) la resistencia calentando la parte central
del tubo. El paso siguiente consistió en hidratar las microelectrodos. Se colocaron los
microelectrodos en una caja Petri con un Filtro Whatman No. 40 en la parte inferior el cual se
humedeció con agua destilada y se dejaron en reposo durante 5 minutos a -4°C. Este proceso
de hidratación es fundamental ya que favorece el llenado de la punta de los electrodos al
Figura 14 | Cámara de registro de plexiglass y lucita.
I: input, O: output, A, B,C: fosas
35
abatir la tensión superficial. Después, se pone una gota de KCl 1M en la parte posterior de
cada electrodo y se deja en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Por
capilaridad, esta gota pasa a la parte anterior (punta) del electrodo. Por último, se llenan los
electrodos con solución KCl 1M de la parte anterior a la posterior, dejando aproximadamente
1.5 cm de la parte posterior libre, que es donde se conectará al holder y de ahí al resto del
arreglo experimental. Para el llenado de los electrodos se utilizó una aguja Microfil 34 Gauge
de 67 mm de longitud de World Precision Instruments (WPI) con un filtro Corning 20 CA de .22
μm, todo esto acoplado a una jeringa de 5 ml. La figura 15 c) muestra los microelectrodos
siendo llenados con sustancia KCl 1M.
El electrodo de referencia utilizado en los experimentos de
registro intracelular consiste en una pastilla o pellet de Ag-AgCl3.
Dicho electrodo se conectó a la parte posterior del
microelectrodo de boroslicato con KCl 1M y del otro lado, a
través de un cable tipo BNC a la entrada de tierra o “ground” del
preamplificador Dagan 8500. La figura 16 muestra el electrodo
de referencia en la fosa C de la cámara de registro.
5.7.4 Implementación de conexiones eléctricas
previo a experimentación
Antes de llevarse a cabo los distintos experimentos, se
realizaron pruebas para optimizar las condiciones
experimentales para registro intracelular. Estas pruebas consistieron en utilizar un circuito
Figura 15 | Estirador vertical de pipetas. En a) se observa el tubo fijo y b) la resistencia
calentando la parte central de la pipeta c) micropipetas de borosilicato siendo llenadas
con KCl 1 M
Figura 16 | a) cámara de registro, b)
holder c) microelectrodo de
borosilicato, d) electrodo de referencia
36
electrónico RC en paralelo denominado “dummy cell” como modelo electrónico que simula una
célula. El input o entrada se conectó al “probe” de registro del amplificador DAGAN 8500. El
output se conectó a la tierra de todo el sistema denominada “ground chamber”. Lo que se
buscó medir primeramente es la resistencia de membrana, para lo cual se hizo uso de la Ley
de Ohm (V = IR). Se aplicó una corriente conocida y se observó el voltaje resultante, de esa
manera solo se sustituyeron estos valores y se obtuvo la resistencia.
En el momento de realizar las pruebas de registro intracelular es necesario saber la resistencia
que presenta el electrodo de registro. Es necesario saber esto, para poder restar este valor a
los valores normales de resistencia de membrana que a medir, para poder obtener finalmente
los valores reales. La manera correcta de poder restar esta resistencia del electrodo es por
medio de un “Balance de puente de Wheatstone”. La función de este balance consiste en
nulificar la resistencia problema (resistencia desconocida) balanceando el puente, resultando
finalmente igualar mi resistencia variable con mi resistencia problema. Para lograr esto se
aplicó un pulso de corriente al preamplificador con el
estimulador de voltaje S5 Stymulator de Grass
Medical Instruments. Al aplicar el pulso se observó en
el osciloscopio una caída de voltaje que correspondía
al estímulo que se estaba aplicando. Finalmente se
ajustó la señal con el DC Offset del Preamplificador
Dagan 8500 y eso dio la resistencia resultante. En la
Figura 17 se muestra la configuración del puente de
Wheatstone.
5.7.5 Sistema de Perfusión
El sistema de perfusión consiste de 4 jeringas de plástico de 60
ml, desechables y sus respectivos equipos de venoclisis y
normogotero sin aguja, además de una llave de perfusión de 6
vías. En la primera jeringa se colocó la solución Ringer de Caracol
Normal, que actuó como solución control en los experimentos y
para realizar los “lavados” después de haber trabajado con las
distintas sustancias agonistas y antagonistas. Las jeringas
restantes se llenaron de las sustancias con las que se trabajó en
cada experimento. La figura 18 muestra este sistema. La letra K
señala la llave de 6 vías en donde 2 de ellas se clausuraron. La
jeringa 2 se llenó con Metoclopramida - SRC (0.13mM), la jeringa
3 con Ergometrina - SRC (1μg/ml) y la jeringa 4 con NTCPM –
SRC (0.05 mg/ml) para las primeras pruebas y con NTCPM – SRC
(0.005 mg/ml) para las segundas.
Figura 17 | Puente de Wheatstone
Figura 18 | Sistema de perfusión.
K: llave de 6 vías, 1-4 jeringas
37
5.7.6 Experimento: Actividad eléctrica espontánea de la célula 1F
En este primer experimento se realizó un registro intracelular de la neurona 1F para observar
la actividad eléctrica espontánea de la misma. Se perfundió la célula con solución Ringer de
caracol normal para mantenerla viable durante la prueba. No se estimuló de ninguna manera
a dicha célula y sólo se registró su actividad durante 10 minutos.
5.7.7 Experimento: Efecto del Carbachol sobre el potencial de membrana de la
célula 1F
Para este experimento se realizaron 2 pruebas las cuales se repitieron 4 veces cada una, en
todo momento se perfundió la célula 1 F con SRC normal para mantener su viabilidad. A
continuación se describen dichas pruebas.
a) Este experimento consistió en la aplicación de pulsos de hiperpolarización de duración de
500 ms cada segundo y la aplicación de 2 dosis de 50 ul de Carbachol 1mM en los tiempos:
40 segundos y 1:40 minutos. Se buscaba con este experimento observar la respuesta normal
de la célula 1 F al Carbachol, esperando observar “bursts” (aumento en frecuencia e
intensidad repentina) de despolarizaciones.
b) Este experimento consistió en la caracterización del efecto dosis-respuesta del Carbachol en
la célula 1 F. Se aplicaron 15, 30 y 45 ul de Carbachol 10 mM en los tiempos: 30 segundos,
1:30 y 2:30 minutos.
5.7.8 Experimento: Efecto de la Dopamina sobre el potencial de membrana de
la célula 1F
En este experimento se realizaron 3 pruebas las cuales se repitieron 4 veces cada una. En
todas las pruebas se realizó un registro intracelular, en el cual el Ganglio F se perfundió
contantemente con SRC, así manteniendo viable las células. La jeringa 1 se llenó con SRC
como control y se clausuraron las demás vías de entrada. El experimento a) se enfocó al efecto
de la Dopamina en la actividad eléctrica espontánea, potencial de membrana y resistencia de
entrada. Los experimentos b) y c) se enfocaron a caracterizar el efecto dosis-respuesta de la
Dopamina sobre la hiperpolarización y resistencia de entrada de la célula.
a) En estas condiciones en las cuales el potencial de membrana es normal, se aplicaron
30 μl de Dopamina 10 mM en la Fosa A de la cámara de registro a los 40 segundos.
b) En esta prueba se utilizaron 3 dosis de Dopamina con la misma concentración pero
distinto volumen. La concentración fue de 10 mM y las dosis de 15, 30 y 45 μl. Se
aplicaron estas dosis a los 30 segundos, 1:30 y 2:30 minutos.
c) Esta última prueba consistió en repetir el experimento anterior, pero aplicando pulsos
de hiperpolarización de duración de 500 ms cada segundo haciendo uso del
estimulador de señales Grass S5E modelo S5 Stymulator. Se aplicaron estas dosis a
los 30 segundos, 1:30 y 2:30 minutos.
38
5.7.9 Experimento: Efecto de antagonistas de receptor a Dopamina en célula 1F
En este experimento se realizaron 4 pruebas las cuales se repitieron 3 veces cada una. En
todas las pruebas se realizó un registro intracelular, en el cual el Ganglio F se perfundió
contantemente con SRC para los controles y lavados previos a los experimentos. La jeringa 1
se llenó con SRC normal. La jeringa 2 se llenó con una mezcla de 200 μl de Metoclopramida
10 mM en 15 ml de SRC normal obteniéndose una concentración final de 0.13 mM. La jeringa
3 se llenó con 500 μl de Ergometrina (concentración: 100 μg/ml) en 50 ml de SRC normal
obteniéndose una concentración final de 1 μg/ml. A continuación se describen las pruebas
realizadas.
a) Se perfundió el ganglio F con SRC normal durante 3 minutos y se aplicó una dosis de
30 μl de Dopamina 10 mM a los 40 segundos, para registrar el control. Después, se
perfundió el ganglio F durante 10 minutos con la mezcla de Metoclopramida y SRC
normal. Finalmente, se aplicó una dosis de 30 μl de Dopamina 10 mM a los 40
segundos.
b) Se perfundió el ganglio F con SRC normal durante 5 minutos y se aplicaron tres dosis
de 10, 20 y 50 μl de Dopamina 10mM a los 40 segundos, 1:40 y 2:40 minutos para
registrar el control. Después, se perfundió el ganglio F durante 10 minutos con la
mezcla de Metoclopramida y SRC normal. Finalmente, se aplicaron dos dosis de 40 μl
de Dopamina 10 mM a los 40 segundos y 2:40 minutos.
c) Se perfundió el ganglio F con SRC normal durante 5 minutos y se aplicaron dos dosis
de 20 μl de Dopamina 10 mM a los 40 segundos y 1:40 minutos para registrar el
control. Después, se perfundió el ganglio F durante 10 minutos con la mezcla de
Ergometrina y SRC normal. Finalmente, se aplicaron dos dosis de 20 μl de Dopamina
10 mM a los 40 segundos y 1:40 minutos.
d) Se realizó un lavado con SRC normal durante 20 minutos después de los experimentos
con Ergometrina y se repitió el control de Dopamina.
5.7.10 Experimento: Efecto de NTCPM en receptor a Dopamina en célula 1F
En este experimento se realizaron 2 pruebas las cuales se repitieron 3 veces cada una. En
ambas pruebas se realizó un registro intracelular, en el cual el Ganglio F se perfundió
contantemente con SRC para los controles y lavados previos a los experimentos. La jeringa 1
se llenó con SRC normal. Se adicionaron 500 μl de solución Stock de nanotubos de carbono de
pared múltiple funcionalizados (concentración: 5mg/ml) y se mezclaron en 50 ml de SRC
normal. De esa solución se tomaron 5 ml y se diluyeron nuevamente en otros 50 ml de SRC
normal, lo que dio como resultado las concentraciones: 0.05mg/ml (dilución 1:100) y
0.005mg/ml (dilución 1:1000). La jeringa 2 se llenó con la mezcla de NTCPM y SRC dilución
1:1000 y la jeringa 3 con la solución de dilución 1:100. A continuación se describen las
pruebas realizadas.
39
a) Se perfundió el ganglio F con SRC normal durante 5 minutos y se aplicaron dos dosis
de 40 μl de Dopamina 10mM a los 40 segundos y 2:00 minutos para registrar el
control. Después, se perfundió el ganglio F durante 10 minutos con la mezcla de
NTCPM y SRC 1:1000. Finalmente, se aplicaron dos dosis de 40 μl de Dopamina 10
mM a los 40 segundos y 2:00 minutos.
b) Se perfundió el ganglio F con SRC normal durante 5 minutos y se aplicaron dos dosis
de 40 μl de Dopamina 10mM a los 40 segundos y 2:00 minutos para registrar el
control. Después, se perfundió el ganglio F durante 10 minutos con la mezcla de
NTCPM y SRC 1:100. Finalmente, se aplicaron dos dosis de 40 μl de Dopamina 10 mM
a los 40 segundos y 2:00 minutos.
La siguiente tabla muestra el diseño de los experimentos anteriores para caracterizar el
receptor a Dopamina sobre la neurona 1F de Helix aspersa.
TABLA 1. DISEÑO DE EXPERIMENTOS PARA CARACTERIZAR EL RECEPTOR A DOPAMINA SOBRE LA NEURONA 1F DE HELIX ASPERSA
EXPERIMENTO DISEÑO DE EXPERIMENTO 5.8.6
5.8.7 a)
5.8.7 b)
5.8.8 a)
5.8.8 b) y c)
5.8.9 a)
40
5.8.9 b)
5.8.9 c)
5.8.9 d)
5.8.10 a)
5.8.10 b)
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Caracterización estructural y composicional de nanotubos de
carbono
En la Figura 19 se observan tres micrografías y un análisis composicional, todos estos
obtenidos por la técnica de microscopia electrónica de barrido con el microscopio HITACHI
modelo SU3500, utilizando un voltaje de 15 kV. En estas micrografías podemos observar los
NTCPM prístinos, es decir, después de haber sido sintetizados y sin haber pasado por ningún
proceso de purificación o funcionalización. En a) se puede apreciar la longitud de los
nanotubos de carbono siendo ésta de ~75μm. En b) se observan los nanotubos de carbono
con restos de carbono amorfo en su diámetro interno, observándose como una mancha de
color más claro en comparación con el resto del nanotubo. Y c) nos muestra el diámetro
externo de los nanotubos de carbono que va de 33 – 51 nm aproximadamente. Además, en
esta última micrografía podemos observar nuevamente algunos restos de carbono amorfo en
el diámetro interno de algunos de los nanotubos.
41
Finalmente, d) nos muestra el análisis EDS de los NTCPM. En dicho análisis se muestran las
altas concentraciones de carbono, así como la presencia de Hierro, comprobando lo observado
en las micrografías.
En la Figura 20, se observan dos micrografías obtenidas por la técnica de microscopia
electrónica de barrido de emisión de campo con el microscopio JEOL modelo JSM-7401F y el
análisis composicional de la misma. Dichas micrografías muestran a los nanotubos de carbono
de pared múltiple funcionalizados. Se puede observar en estas micrografías que ya no hay
residuos de carbono amorfo. Además, en a) es posible ver el diámetro externo de los
nanotubos que va de un rango de 38 – 76 nm, lo que nos indica un ensanchamiento al
compararlos con los nanotubos de carbono prístinos. En b) podemos observar los nanotubos
como fibras apiladas unas sobre otras, sin restos de Fe en el diámetro interno. Y c) nos
muestra el análisis EDS en el cual se confirma la eliminación del hierro y la creación de
distintos grupos funcionales, al ver el gran aumento en los elementos Carbono y Oxígeno.
Figura 19 | Micrografías de NTCPM prístinos y análisis EDS. a) Se muestra la longitud promedio de los
NTC utilizando un aumento de 500x b) Se muestran los restos de carbono amorfo en el diámetro
interno de los NTC, aumento de 20x. c) Se muestra el diámetro externo promedio de los NTC que va de
33-51nm, aumento x50 d) Análisis EDS que muestra los porcentajes atómicos y en peso molecular de
C y Fe
42
Además de estas 2 bandas que representan al C y O2, hay 2 bandas pronunciadas en el rango
de 300-350, que corresponden al esmalte de plata que se utilizó para fijar los nanotubos de
carbono para su análisis.
La figura 21 representa el espectro IR de los nanotubos de carbono. Se hace uso de esta
técnica ya que brinda información acerca de los grupos funcionales presentes en la estructura.
Como se puede observar en la figura 21, existe la presencia de una banda a 1731 cm-1 que se
puede asociar a grupos carboxilo (1725 - 1765 cm-1) o grupos éster junto con la banda de
1265 cm-1. Las demás bandas en el rango de 1750 - 1550 pueden ser asignadas a grupos
carbonilo y a anillos aromáticos C=C, mientras que las bandas en el rango de 1300-950 cm-1
prueban la presencia de enlaces C-O.
Figura 20 | Micrografías de NTCPM funcionalizados y análisis EDS. a) Se puede observar el diámetro
externo de los NTC que va de 25 - 60 nm, utilizando un aumento de 50,000x. En b) se observan tiras
completas de NTC lo que nos permite medir el largo de ~85μm, utilizando un aumento de 500x c) muestra
los NTC apilados unos sobre otros sin restos de carbono amorfo en el diámetro interno, se utiliza un
aumento de 10,000x d) Muestra el análisis EDS de los NTCPM funcionalizados, en donde se observa la
eliminación de Fe y el aumento en carbono y oxígeno
43
En la figura 22 se presentan los espectros RAMAN de los nanotubos de carbono de pared
múltiple antes y después de ser funcionalizados con el ataque ácido. En a) y b) se observan los
picos D, G y G’ característicos de un espectro RAMAN de nanotubos de carbono, así como la
ausencia de la banda RBM lo que nos indica le presencia de nanotubos de carbono de pared
múltiple.
Se calculó el cociente de las bandas IG/ID obteniendo valores mayores a la unidad en ambos
casos, lo que nos indica un alto índice de calidad. En a) nos da un índice de calidad de 1.88 y
Figura 21 | Espectro IR de NTCPM prístinos y funcionalizados. Las distintas bandas que se observan de
1731-1265 confirman la creación de grupos funcionales por el proceso de oxidación.
Figura 22 | Espectros RAMAN de NTCPM. a) Muestra el espectro RAMAN de los NTCMP prístinos con un índice IG/ID
= 1.88. En b) se muestra el espectro RAMAN de los NTCPM funcionalizados con un índice IG/ID = 1.38
44
en b) de 1.38; esta disminución nos indica que se generaron defectos en la superficie de los
nanotubos de carbono funcionalizados, así confirmando la generación de grupos funcionales.
6.2 Distribución topográfica de NTCPM
En la figura 23 se pueden observar las micrografías del microscopio electrónico de barrido de
emisión de campo (FESEM) JEOL modelo JSM-7401F. En a) se observa la dilución 1:10 con
una concentración de 0.5 mg/ml y en b) la dilución 1:1000 con una concentración de 0.05
mg/ml. En ambas micrografías se aprecia una adecuada dispersión de los nanotubos de
carbono de pared múltiple funcionalizados en solución Ringer de caracol.
La figura 24 muestra las micrografías del microscopio confocal Carl Zeiss modelo LSM 710. En
ambas micrografías se utilizó el lente de aumento de 63x con aceite de inmersión y se
observaron los nanotubos en el modo reflexión. Se buscó con estas muestras demostrar una
correcta dispersión de los nanotubos de carbono en distintas diluciones y en distintos niveles
de profundidad de la muestra. Es importante recordar que los nanotubos de carbono de pared
múltiple funcionalizados, fueron dispersados primeramente en agua desionizada, haciendo
uso de PVP (Polivinil-Pirrolidona) y posteriormente se dispersaron y resuspendieron en SRC. En
a) se muestra la dilución 1:10 (0.5mg/ml) y en b) se puede observar la dilución 1:100 (0.05
mg/ml). En estas pruebas de caracterización se demostró que los nanotubos de carbono de
pared múltiple se dispersan adecuadamente en soluciones acuosas; de mayor interés el
demostrar su dispersión en la solución Ringer de caracol, ya que es la que se utiliza en todos
los estudios morfológicos y fisiológicos donde se involucra el estudio de las neuronas del
caracol Helix aspersa.
Figura 23 | Micrografías FESEM de NTCPM dispersos en PVP y SRC. a) dilución 1:10 (0.5mg/ml) con aumento
5,000x b) dilución 1:100 (0.05 mg/ml) con aumento 20,000x
45
En la figura 25 se observan las micrografías de ganglios cerebrales en contacto con nanotubos
de carbono de pared múltiple. Estas micrografías fueron obtenidas por la técnica de
microscopia electrónica de barrido de emisión de campo. En a) se utilizó un aumento de
2,000x y se muestran 2 neuronas siendo unidas físicamente por nanotubos de carbono. En b)
se observa una neurona rodeada por nanotubos de carbono, el aumento utilizado fue de
3,000x. Lo que se buscaba demostrar con estas micrografías era la correcta dispersión y
adhesión de los nanotubos de carbono a la membrana celular de las neuronas. En a) se logró
observar además, que los nanotubos de carbono pudieran funcionar como puentes físicos
entre 2 neuronas.
Figura 24 | Micrografías (Microscopio Confocal Carl Zeiss LSM 710) de NTCPM dispersos en PVP y SRC,
aumento 63x en modo reflexión. a) dilución 1:10 (0.5mg/ml) b) dilución 1:100 (0.05 mg/ml)
Figura 25 | Micrografías (FESEM) de ganglios de H. aspersa y NTCPM a) dilución 1:10 (0.5mg/ml) b)
dilución 1:100 (0.05 mg/ml)
46
6.3 Propiedades electrofisiológicas y farmacológicas del receptor a
dopamina en neurona 1F
La Figura 26 muestra la actividad eléctrica espontánea típica de la neurona 1F del caracol
Helix aspersa; actividad que le llaman “tipo marcapasos” por sus constantes
despolarizaciones. En esta figura se pueden observar además de las despolarizaciones,
algunas hiperpolarizaciones cada determinado tiempo, lo cual es normal dentro del
comportamiento eléctrico de la célula. Esta prueba se llevó a cabo durante 10 minutos
durante los cuales los ganglios fueron perfundidos con solución Ringer de caracol normal para
mantener viables las células. No se llevó a cabo ningún tipo de estimulación durante esta
prueba y se realizó a temperatura ambiente.
En la Figura 27 se muestra la respuesta de la neurona 1F al agonista colinérgico muscarínico
Carbachol. Para la prueba a) se estimuló la célula con pulsos de hiperpolarización de 500 ms
cada segundo con el propósito de evaluar cambios en la conductancia de entrada. Se
aplicaron 2 dosis de 50 μl de Carbachol 1mM, y efectivamente se puede observar la respuesta
esperada, una serie de despolarizaciones comúnmente llamado “burst” o ráfaga. En la
segunda aplicación de Carbachol no se muestra una respuesta tan clara, además de que ésta
es tardía debido a que los receptores se encontraban aún saturados y no fue suficiente el
tiempo de recuperación. En b) se observa una curva dosis-respuesta de la neurona 1 F a
Carbachol 10 mM. Las dosis que se aplicaron fueron de 15, 30 y 45 μl de Carbachol. En la
primera aplicación se puede observar una respuesta débil al Carbachol, pero en la segunda
aplicación (20 μl) se observa una respuesta mucho más pronunciada. En la tercera aplicación
ya no se ve una respuesta debido a que los receptores se encontraban saturados, ni siquiera
se pueden observar los pulsos típicos de la célula ya que el tiempo de recuperación fue muy
corto. Se decidió realizar estas pruebas con el neurotransmisor Carbachol, ya que la respuesta
Figura 26 | Actividad eléctrica espontánea normal de la neurona 1F de Helix aspersa.
47
esperada, es muy conocida, así como los receptores presentes y de esta forma se puede
asegurar que efectivamente se está trabajando con la neurona 1F.
En la figura 28 se muestra la actividad eléctrica espontánea normal de la neurona 1F de Helix
aspersa y la respuesta al ser estimulada por Dopamina. En a) se puede observar una
aplicación de 30 μl de Dopamina 10 mM y como respuesta una hiperpolarización, la cual es la
respuesta esperada para este tipo de neurotransmisor. Esta prueba y las repeticiones de la
misma sirvieron como control previo a distintos experimentos. En b) por otra parte, se muestra
una curva dosis-respuesta de la neurona 1F al ser estimulada por 15, 30 y 45 μl de Dopamina
10 mM. En las 3 aplicaciones se pueden observar como respuestas: hiperpolarizaciones. Estas
pruebas sirven como blanco o control, ya que nos muestran las respuestas esperadas al
utilizar Dopamina, neurotransmisor de suma importancia para este proyecto de investigación.
Se comprueba además que se está trabajando con la neurona 1F y la viabilidad celular de la
misma.
Figura 27 | Respuesta de la neurona 1F a Carbachol. a) Aplicación de 2 dosis de 50 μl de
Carbachol 1mM y pulsos de hiperpolarización (500 ms c/s). b) Curva dosis-respuesta: 15, 30
y 45 μl de Carbachol 1mM
48
La figura 29 por otra parte, muestra una curva dosis-respuesta de la neurona 1F al ser
estimulada con pulsos de hiperpolarización, para medir la resistencia de entrada, además de 3
aplicaciones de Dopamina de 15, 30 y 45 μl de Dopamina 10 mM.
Figura 28 | Actividad eléctrica espontánea y respuesta a Dopamina. a) Respuesta a una dosis de
30 μl de Dopamina 10 mM. b) Curva dosis-respuesta: 15, 30 y 45 μl de Dopamina 10 mM
Figura 29 | Curva dosis-respuesta de la neurona 1F con pulsos de hiperpolarización (500 ms c/s).
Dosis: 10, 20 y 50μl de Dopamina 10 mM.
49
En las 3 aplicaciones se puede observar la respuesta esperada de hiperpolarización por
estimulación de Dopamina, siendo esta más pronunciada en la segunda aplicación, a la cual
se le hizo una ampliación para poder observarla mejor. La siguiente figura muestra dicha
ampliación.
Como se puede observar en la Figura 30, al comparar los insertos a y b se puede ver que la
resistencia de entrada disminuye al momento de la aplicación de la Dopamina. Esta
disminución es una respuesta de gran importancia ya que nos indica que como consecuencia,
al disminuir la resistencia, se aumenta la conductancia de entrada.
Por otro lado, en la figura 31 se muestra el control y el efecto de la Dopamina en presencia del
fármaco Metoclopramida. En a) se puede observar el control previo al experimento con
Metoclopramida, en donde se aplicaron 30 μl de Dopamina 10 mM a los 30 segundos de
haber iniciado la prueba. En esta primera gráfica se puede observar como respuesta una
hiperpolarización, una vez más, la respuesta esperada a Dopamina. Después, la célula se
perfundió con una mezcla de 200 μl de Metoclopramida 10 mM en 15 ml de SRC normal
durante 10 minutos y se continuó con esta perfusión durante 5 minutos más para realizar la
prueba. En b) se muestra la falta de respuesta después de la aplicación de 30 μl de Dopamina
10 mM a los 30 segundos de haber iniciado la prueba. Con este experimento se puede
comprobar que la Metoclopramida actúa como antagonista de los receptores dopaminérgicos
al bloquear la apertura de los canales e impedir una respuesta. Se repitió este experimento 4
veces más después de realizar lavados de 10 minutos con SRC y se observó la misma
respuesta. Este experimento es de gran importancia ya que representa un aporte científico en
el área de las neuronciencias. A la fecha, no se había caracterizado la respuesta al fármaco
Metoclopramida en los receptores dopaminérgicos dependientes de ligando en las neuronas
del caracol Helix aspersa. Al caracterizar como antagonista dopaminérgico a la
Metoclopramida, se pueden realizar diversos estudios relacionados a la utilización de este
fármaco para el tratamiento de distintas enfermedades.
Figura 30 | Ampliación de zona de la Figura 29. La comparación de los
insertos a y b muestran la disminución en la resistencia de entrada
50
La figura 32 muestra en a) una curva dosis – respuesta en donde se utilizaron 10, 20 y 50 μl
de Dopamina 10 mM, la cual se utilizó como control. Después, se realizó un lavado durante
10 minutos con una solución de Metoclopramida (0.13 mM) y SRC; b) muestra la aplicación
de 2 dosis de 40 μl de Dopamina 10 mM después del lavado. Estas segundas pruebas se
llevaron a cabo para nuevamente confirmar que la Metoclopramida actúa como antagonista de
los receptores dopaminérgicos. Se aplicaron dosis más altas de Dopamina y aun así no se
observó una respuesta, lo cual indica que los receptores dopaminérgicos ya se encontraban
ocupados por este fármaco y evitaron la unión y acción de la Dopamina.
Se llevaron a cabo pruebas muy similares a las de la Metoclopramida pero utilizando el
fármaco Ergometrina. La figura 33 muestra el control y efecto de Dopamina en presencia de
Ergometrina. En ambas pruebas (control y experimento) se aplicaron 2 dosis de 20 μl de
Dopamina 10 mM. Una vez más, entre el control y el experimento se llevó a cabo un lavado de
10 min con la mezcla del fármaco en solución Ringer de Caracol. La concentración utilizada
Figura 31 | Control y efecto de Dopamina en presencia de Metoclopramida. a) Control: 30 μl de Dopamina
10 mM. b) Aplicación de 30 μl de Dopamina 10 mM durante perfusión de Metoclopramida
51
fue de 1 μg/ml. Lo interesante de estas pruebas es que ya se tenía conocimiento de la
Ergometrina como un posible antagonista de los receptores dopaminérgicos, pero solamente
se habían llevado a cabo pruebas con reactivos de laboratorio. Para estas pruebas se
utilizaron fármacos comerciales, es decir, se adquirieron 3 ampolletas de 2 ml de Ergometrina
y se llevaron a cabo las distintas diluciones. En a) de la Figura 33 se muestra el control y en b)
el experimento con Ergometrina.
Todas las pruebas realizadas en este estudio se repitieron 4 veces, pero en el caso de la
Ergometrina fue necesario cambiar de ganglio de estudio, ya que se descubrió que tiene un
efecto irreversible en los receptores dopaminérgicos. Entre cada prueba con los distintos
fármacos, se llevó a cabo un lavado de 10 minutos con SRC normal. En el caso de la
Ergometrina se realizaron lavados de hasta 20 minutos y se comprobó que los receptores
dopaminérgicos quedaron bloqueados completamente.
Figura 32 | Control y efecto de Dopamina en presencia de Metoclopramida. a) Curva dosis-respuesta:10, 20
y 50 μl de Dopamina 10 mM. b) Dos aplicaciones de 40 μl de Dopamina 10 mM después de lavado de 10
minutos de Metoclopramida – SRC y durante la perfusión de esta mezcla
52
La figura 34 muestra el efecto irreversible de la Ergometrina en estos receptores, ya que
después de los lavados de 20 minutos con SRC se siguió observando el efecto bloqueador de
respuesta a Dopamina.
Figura 33 | Control y efecto de Dopamina en presencia de Ergometrina. a) Control: dos aplicaciones de
20 μl de Dopamina 10 mM. b) Dos aplicaciones de 20 μl de Dopamina 10 mM después del lavado de 10
minutos de Ergometrina – SRC y durante la perfusión de esta mezcla
Figura 34 | Efecto irreversible de Ergometrina en receptores dopaminérgicos. Aplicación de 2 dosis
de 30 μl de Dopamina 10 mM
53
Por último, se llevaron a cabo las pruebas con los nanotubos de carbono, las cuales se
muestran en la Figura 35. En a) se muestra la aplicación de 2 dosis de 40 μl de Dopamina 10
mM, la cual se utilizó como control. En b) se observa la aplicación de 2 dosis de 40 μl de
Dopamina 10 mM en perfusión de NTCPM – SRC normal con una concentración de 0.005
mg/ml. Y c) muestra la aplicación de 2 dosis de 40 μl de Dopamina 10 mM en perfusión de
NTCPM – SRC normal con una concentración de 0.05 mg/ml.
Una vez más se observa en el control la respuesta esperada a Dopamina, respuestas de
hiperpolarización. En estas pruebas se aplicaron 40 μl de Dopamina en todos los casos para
Figura 35 | Efecto de Dopamina en presencia de NTCPM funcionalizados. a) Control: aplicación de 2
dosis de 40 μl de Dopamina 10 mM b) Aplicación de 2 dosis de 40 μl de Dopamina 10 mM en
perfusión de NTCPM – SRC normal (0.005 mg/ml) c) Aplicación de 2 dosis de 40 μl de Dopamina 10
mM en perfusión de NTCPM – SRC normal (0.05 mg/ml)
54
que las respuestas fueran lo más precisas entre ellas. En ambas diluciones se observó que los
nanotubos de carbono de pared múltiple no bloquean los receptores dopaminérgicos. Sin
embargo, las distintas concentraciones si provocan resultados distintos. En b) se utilizó una
menor concentración de NTCPM (dilución 1:1000) y es donde se observa la mejor respuesta.
Los nanotubos no sólo no bloquean la señal, si no que potencializan la señal. Es decir, se
observa al comparar con el control que la respuesta es más prolongada, lo que significa que
disminuyó mayormente la resistencia de entrada y aumentó la conductividad eléctrica. En c) se
observan también las respuestas hiperpolarizantes a la Dopamina pero en menor medida. Esta
respuesta pudiera ser debido a que los nanotubos de carbono en mayor cantidad bloquean
físicamente algunos de los receptores dopaminérgicos.
7. CONCLUSIONES
Se logró la síntesis y producción sistemática y reproducible de nanotubos de carbono de pared
múltiple con forma y dimensiones similares. Los nanotubos de carbono a pesar de tener
propiedades hidrofóbicas, gracias a una funcionalización adecuada, fue posible dispersarlos
fácilmente en soluciones acuosas como la solución Ringer de caracol.
Se caracterizó los receptores dopaminérgicos dependientes de ligando presentes en la
neurona 1F del caracol Helix aspersa. No se tenía registro sobre la respuesta al fármaco
Metoclopramida en estos receptores y se le logró identificar como antagonista del receptor
dopaminérgico. Además, las pruebas realizadas con Ergometrina demostraron que actúa como
antagonista dopaminérgico con efecto irreversible. La Ergometrina utilizada fue de tipo
comercial, lo que enriquece este estudio ya que se demostró la compatibilidad de fármacos
utilizados en seres humanos con el modelo biológico Helix aspersa.
Se logró además, que estos nanotubos de carbono de pared múltiple funcionalizados pudieran
adherirse a membranas neuronales. Al adherirse a membranas neuronales, específicamente
la célula 1F, estos nanotubos no modificaron las propiedades electrofisiológicas del receptor
dopaminérgico en las neuronas. Por el contrario, al utilizar concentraciones pequeñas de
NTCPM funcionalizados disueltos en solución Ringer de Caracol normal (0.005 mg/ml) se
observó la potencialización de las respuestas.
De esta manera, se comprobó la hipótesis planteada y se obtuvieron resultados muy
favorables que representan grandes aportaciones a la ciencia.
Queda por determinar, si los nanotubos de carbono, dadas sus propiedades físicas y electro-
conductivas, pueden lograr una continuidad morfológica y eléctrica a la vez entre dos neuronas
y fuera posible usarlos como conductores entre neuronas.
55
8. ANEXOS
I. MATERIAL Y EQUIPO
i. Material Biológico Caracol de jardín Helix aspersa
ii. Equipos Balanza analítica marca Monobloc
Parrilla eléctrica marca Corning Stirrer/Hot plate
Microscopio electrónico de barrido de emisión de campo JEOL modelo JSM-7401F
Microscopio confocal ZEISS modelo LSM 710
Microscopio estereoscópico ZEISS modelo Stemi DV4
Espectrómetro Micro RAMAN Labram VIS-63
Espectrómetro Infrarrojo Perkin Elmer
Horno tubular Carbolite STF-1500
Estirador electrónico de pipetas
Preamplificador DAGAN 8500
Osciloscopio HITACHI modelo V-212
Registrador General Scanning Inc. modelo RS2-59
Interface Digidata 2000 de Axon Instruments
Sistema de micro inyección a presión Picotzpritzer
Potenciómetro Thermo Scientific
iii. Material de Laboratorio Vasos de precipitado Espátulas
Probetas Filtro Whatman No. 2
Cajas Petri Soporte metálico para SEM
Tubos de cuarzo de 1 cm de diámetro Pipetas Peltier
Refrigerante Matraz redondo de 3 entradas
Soporte universal Pinzas de nuez
Soporte de lucita Micropipetas de borosilicato
Instrumental para microcirugía Pizeta
Tabla de corcho Pines metálicos
iv. Reactivos Agua desionizada Cloruro de Magnesio (MgCl2)
Hidróxido de Sodio (NaOH) Cloruro de Cesio (CsCl)
Ferroceno HEPES
Tolueno Glucosa
Isopropanol Ácido Nítrico (HNO3)
Cloruro de Sodio (NaCl) Ácido Sulfúrico (H2SO4)
Cloruro de Potasio (KCl) Compuesto: Sylgard 184
Cloruro de Calcio (CaCl2) Proteasa tipo XIV
56
Paraformaldehido Dopamina
Poli-vinil-pirrolidona Ergometrina
Metoclopramida Carbachol
II. Tablas de Soluciones Experimentales
TABLA 2. Solución Ringer de Caracol Normal Compuesto Peso
Molecular Concentración
(mM/lt) Cantidad (g)
Para 1 lt Cantidad (g)
Para 2 lt Cantidad (g)
Para 10 lt
NaCl 58.44 75 4.38 8.77 43.83 KCl 74.55 5 0.37 0.75 3.73
CaCl2 147.0 10 1.47 2.94 14.70
MgCl2 203.33 5 1.02 2.04 10.20
Glucosa 180.2 5 0.901 1.802 9.01
HEPES 238.30 5 1.192 2.38 11.92
Osmolaridad Total 215
TABLA 2. Solución Ringer de Caracol Alto Calcio
Compuesto Peso Molecular
Concentración (mM/lt)
Cantidad (g) Para 1 lt
Cantidad (g) Para 2 lt
Cantidad (g) Para 10 lt
TEA-Cl 165.70 70 11.59 23.20 115.90
CsCl 168.36 5 0.84 1.68 8.42
4 AP 94.11 5 0.47 .94 4.70
CaCl2 147.0 20 2.94 5.88 29.40
Glucosa 180.2 5 0.901 1.802 9.01 HEPES 238.30 5 1.192 2.38 11.92
Osmolaridad Total 225
TABLA 3. Soluciones para preparación de microelectrodos Compuesto Peso Molecular Concentración (M/lt) Cantidad en g
KCl 74.557 3 4.4734 (para 20 ml) CsCl 168.4 2 3.368 (para 10 ml)
TABLA 4. Fármacos para receptor dopaminérgico Compuesto Acción
farmacológica Peso
Molecular Concentración
(mM/lt) Cantidad (g) para 10 ml
Domperidona Antagonista D2 (SNP)
425.91 10 0.0426
Hidrocloruro de Metoclopramide
Antagonista D2 (SNP y SNC)
336.26 10 0.0336
Dopamina Agonista 189.64 10 0.0189
57
TABLA 5. Fármacos para receptor dopaminérgico (comerciales) Compuesto Acción
farmacológica Concentración
(comercial) Concentración
(μl/ml) Cantidad (ml)
para 10 ml
Domperidona Antagonista D2 (SNP)
1 ml/ml 100 1
Ergometrina Antagonista D1-D2 (moluscos)
0.2 mg/ml 100 5
Metoclopramida Antagonista D2 (SNP y SNC)
5 mg/ml 100 .2
Haloperidol Antagonista D2 (SNC)
50 mg/ml 100 .02
Dopamina Agonista 40 mg/ml 100 0.025
TABLA 6. Fármacos para receptor colinérgico muscarínico Compuesto Acción
farmacológica Peso
Molecular Concentración
(mM/lt) Cantidad (g) para 10 ml
Sulfato de Atropina
Antagonista 289.4 10 0.0289
Pirenzepina Antagonista 442.35 10 0.0442 MCN-A-343 Agonista 317.2 10 0.0317
Carbachol Agonista 182.6 10 0.0183
Carbamil-β-Metil Agonista 196.7 10 0.0197
Oxotremorina Agonista 206.3 10 0.0206
TABLA 7. Fármacos para receptor a Glutamato Compuesto Acción
farmacológica Peso
Molecular Concentración
(mM/lt) Cantidad (g) para 10 ml
MK - 801 Antagonista 337.4 10 0.0337 L- Glutamato Agonista 185.2 10 0.0185
Ketamina Antagonista 10
Ácido Quinurénico
Antagonista 189.2 10 0.0189
TABLA 8. Fármacos bloqueadores de canales de Calcio Compuesto Acción
farmacológica Peso
Molecular Concentración
(mM/lt) Cantidad (g) para 10 ml
NiCl2 Bloquea: Canal T 237.7 10 0.0238
Verapamil Bloquea: Canal L 491.1 10 0.0491 CdCl2 Bloquea: Canal L 183.3 10 0.0183
Nicardipino Bloquea: Canales N y L
516.0 10 0.0516
Diltiazen Bloquea: Canales N y L
450.98 10 0.0451
58
III. Disección, microdisección y aislamiento de Ganglios D, E y F de
Helix Aspersa
Previo a la disección, se prepara 1 litro de solución Ringer de Caracol Normal, utilizando las
concentraciones de la Tabla 2, así como cajas Petri con Sylgard 184 como base.
Los pasos a llevar a cabo son los siguientes:
1. Se retira el caparazón casi completamente siguiendo la línea natural del mismo. (Fig.
a)
2. Se coloca al espécimen en una plataforma de corcho, se estira y se clava un alfiler
entre los ojos.
3. Se colocan además de 2-3 alfileres sobre la línea media cerca del caparazón para
mantenerlo lo más estirado posible.
4. Se realiza un corte de piel en forma horizontal en la zona dorsal del caracol, cerca del
caparazón y después un corte longitudinal siguiendo la línea media. (Fig. b)
5. Se abre la piel de la zona dorsal “como un libro” y se clava 1 alfiler en cada lado para
que queden los tejidos expuestos. (Fig. c)
6. Con ayuda de un microscopio estereoscópico se localiza el esófago (tejido rayado y
amarillento), se corta y se retrae rápidamente.
7. Se baña con SRC los tejidos restantes para evitar que las enzimas provenientes del
esófago dañen el tejido neuronal.
8. Se toma el tejido neuronal y se jala, a la vez que se cortan los tejidos vecinos para
poder liberarlo.
9. Una vez que se extrae la masa ganglionar, se lava rápidamente con SRC y se coloca en
una caja Petri previamente preparada con Sylgard 184 y SRC. (Fig. d)
10. Con la cara ventral hacia arriba (se ve como una “Medusa” de nervios y tejido
conectivo) se estiran los ganglios A y B, se clavan los pines en estos ganglios y en la
parte inferior de la aorta. (Fig. e)
11. Se corta la aorta transversalmente, cerca de los ganglios I y H, y luego
longitudinalmente se hace un corte hacia arriba hasta atravesar todos los ganglios y
llegar a la parte superior de la aorta que está entre los ganglios A-B y D-F. (Fig. f)
12. Se abren los ganglios I & H como un libro y se corta primero uno y luego el otro.
13. Se voltea la masa ganglionar, dejando la cara dorsal de frente.
14. Se fija la aorta en la parte superior y se sujetan los cordones de los ganglios A y B.
15. Se cortan los ganglios A y B. (Fig. g)
16. Se sujeta la preparación de los demás nervios (nervios 1, 2, 3 y 4) y se estira y aplana
lo más posible el tejido ganglionar restante. Por último, se fija la parte restante de la
aorta posterior que estaba entre los ganglios A-B y D-F.
17. Para la disección fina de la membrana que cubre a los ganglios D,E y F, se hace una
incisión en el borde izquierdo del ganglio D. Se hace un corte circular a la orilla de los
ganglios D, E y F con la finalidad de quitar la mayor cantidad de tejido conectivo que los
rodea, dejando desnudos dichos ganglios. (Fig. h)
18. Se enjuaga con solución Ringer de Caracol.
59
19. Se aplica Proteasa tipo XIV de concentración 10 mg/ml por un tiempo de 10-12 min,
con el propósito de remover la membrana fina que está adosada directamente sobre
las neuronas.
20. Se retira mecánicamente, con pinzas de disección de punta muy fina, la última capa
fina de tejido conectivo que tiene la apariencia de un velo y que cubre directamente a
las neuronas del ganglio F.
21. Se enjuaga 3 veces con SRC.
22. Finalmente, han quedado las neuronas expuestas. (Fig. i)
Las siguientes imágenes representan algunos de los pasos anteriores.
a) Paso 1
b) Pasos 2 – 4
c) Paso 5
d) Paso 9
e) Paso 10
f) Paso11
g) Paso 15
h) Paso 17
i) Paso 22
60
El instrumental utilizado de la marca Fine Science Tools fue:
IV. Preparación de Paraformaldehído al 4%
1. Calentar 60-70 ml de agua desionizada a 60°C en un matraz con un agitador
magnético.
2. Añadir 4 g de Paraformaldehído.
3. Añadir tres o cuatro gotas de NaOH 5 N.
4. Esperar a que la solución se vuelva transparente.
5. Filtrar.
6. Añadir 25 ml de HEPES 0.4 M pH 7.5
7. Aforar con SRC hasta 100 ml.
8. Enfriar 4-10°C antes de usar.
V. Conexiones para registro y almacenamiento de señales eléctricas
i. Conexiones del Amplificador DAGAN 8500 y la interfaz Digidata 1200
A/D (Configuración Current-Clamp)
1. En la parte posterior del amplificador Dagan 8500 (Amp) se encuentra la salida de
Voltaje x10 la cual transmite la señal de potencial de membrana de la célula, esta
conexión es llevada al canal 1 del osciloscopio, al canal 1 del graficador y al
61
convertidor analógico digital (A/D Digidata 1200) en el canal 1 de la entrada “Analog
in”.
2. El monitor de corriente del Amp tiene conexiones BNC para los estímulos de corriente.
Una de ellas se encuentra en la parte frontal del Amp denominada “stimulus input” la
cual se conecta a un estimulador de voltaje Grass S5E. La segunda conexión
denominada “stimulus monitor” es la salida del monitor de corriente y se conecta al
canal 0 del convertidor A/D de la entrada “Analog in” y al canal 2 del osciloscopio
3. Por otro lado, en la parte trasera del Amp se encuentra una entrada analógica de
corriente que es conectada al canal 0 del “Analog out” de la Digidata 1200.
4. El propósito de estas conexiones entre el amplificador Dagan 8500 y el convertidor
A/D Digidata 1200 es favorecer estimulación pulsos de corriente y monitorear los
cambios de corriente y voltaje de la célula, utilizando el programa Pclamp 5.7.1
ii. Conexiones del Amplificador DAGAN 8500 y el convertidor analógico-
digital DAQ MODELO USB1208FS.
El uso del convertidor A/D DAQ modelo USB-1208FS permite un mayor tiempo de adquisición
de datos, mayor a 1KHz que lo hace la Digidata 1200, lo cual es conveniente para registros en
los que se requiera analizar por largos periodos de tiempo el efecto de un fármaco sobre una
muestra biológica.
1. Para el uso de esta tarjeta es necesario calibrar el sistema. Esto se hace conectando el
puerto USB de la tarjeta a la PC. Posteriormente, de forma manual se prosigue a abrir
el programa “Instacal”. Se selecciona la tarjeta que se está utilizando y se da click en
el opción “Calibrate” (se encuentra en la parte superior de la ventanilla). Allí se de
nuevamente click en A/D y esperamos un minuto a que el programa reconozca la
tarjeta.
2. Una vez que se han seguido los pasos del punto 1, se abrirá una nueva ventana en
donde sólo se seleccionaran el canal 0 y el canal 1 (sólo esos dos), una vez hecho esto
se le dará click en la opción Ok y seguirá las instrucciones que la ventana le dice. Es
necesario tener a la mano un protoboard y cables para ser usados en el proceso de
calibración.
3. Una vez calibrada la tarjeta se deben cerrar todas las ventanas y abrir el programa
“TracerDAQ”. Inmediatamente se abrirá una ventana en donde se marcará la opción
“Strip Chart” y posteriormente “Run”.
4. Se abrirá la ventana en donde se visualizará el registro de datos. Vaya al menú “Edit” y
de click en la opción “DAQ Hardware Settings” en donde seleccionará el canal 0 y 1
(también los otros dos si se lo solicita: para 2 células) para activarlos y también
seleccione el rango de voltaje (± 10 V) que sea necesario. En la opción “DAQ Selection
Filter” dar click y seleccionar “Analog in only” y finalmente Ok.
5. Vaya al menú “Edit”y de click en la opción “Channel Settings” en donde podrá cambiar
el color del canal 0,1,2 o 3. También puede hacer que alguno de estos canales sea
invisible al momento de adquirir los datos. Por lo general, los canales 2 y 3 son
invisibles, si no es así debe realizarse mediante esta opción.
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6. Por último, vaya al menú “Edit” y de click en la opción “Scan Rate/Trigger Settings”. En
esta opción podrá modificar la frecuencia de muestreo, así como el tiempo de
adquisición de los datos. Recuerde que al incrementar el tiempo de adquisición, la
frecuencia de muestreo es menor y por lo tanto menor número de muestras; eso
afecta la calidad del registro y se debe de jugar con el tiempo y la frecuencia de
muestreo. El programa le avisa por medio de una nota en color rojo, si el tiempo es
muy largo para la frecuencia de muestreo seleccionada.
Nota: para una frecuencia de muestreo de 1KHz usted podrá adquirir 32 seg, lo cual es
muy bueno, ya que en la tarjeta Digidata para una frecuencia de 1KHz, sólo puede adquirir
1 segundo.
iii. Adquisición de señales con el sistema DAQ
Los pasos a seguir son los siguientes:
1. Encender la computadora. Se requiere que al encender la computadora el sistema DAQ
se encuentre conectado por una de las entradas USB de la computadora.
2. Configuración. Abrir el programa InstaCal e ir al menú y en la opción install dar click en
la pestaña No. of Channels, dar click y seleccionar la opción 8 single ended,
posteriormente ir a la pestaña External Clock Type y seleccionar Continuou. Aceptar y
cerrar InstaCal.
3. Visualizar las señales. Abrir el programa TracerDAQ, seleccionar opción Strip Chart y
Run.
4. Configuración. En el menú de Strip Chart, dar click en Edit, seleccionar DAQ hardware
settings, seleccionar el sistema de adquisición DAQ, el número de canales a muestrear
se selecciona desde cannel settings.
5. Editar. En la opción de Edit, Scan Rate/Trigger Settings, se modifica la frecuencia de
muestreo y el tiempo de adquisición de señal.
6. Pantalla. En la vista preliminar del sistema TracerDAQ, se puede controlar el momento
en que inicia la adquisición, así como también la resolución de los datos. Este se
realiza en el icono de play y el icono A.
7. Espacio temporal. La resolución espacial temporal puede ser modificada al mismo
tiempo que los datos son adquiridos, en la parte superior izquierda se encuentra la
opción TimeBase, en donde se puede manipular esta opción con un par de botones, ya
sea para incrementar la resolución del tiempo o disminuirla.
8. Ejes. Existen dos ejes en la pantalla con los cuales se puede realizar una medición
para tiempo o voltaje. Al abrir el programa TracerDAQ en la pantalla aparecen estos
ejes todo el tiempo, incluso durante la adquisición de datos; normalmente se
encuentran de forma vertical, pero pueden ser cambiados a forma horizontal dando
doble click sobre cada uno de ellos.
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