CUADINVEST BIOL (BILBAO), VOL 20: 565-568. (1998). ISSN 0211 - 5700

Evaluación Genotóxica de Productos Naturales con Actividad Biológica.

Ana GUADAÑO LARRAURI, Eduardo DE LA PEÑA DE TORRES

Centro de Ciencias Medioambientales, CSIC. Serrano 1 15 dpdo. Madrid

IntroducciónLa toxicología genética ha evolucionado en respuesta a una preocupación creciente de que

químicos que se ha visto inducen mutaciones en sistemas experimentales pueden afectar laincidencia de enfermedades hereditarias en el hombre. Los datos científicos disponibles apoyanla hipótesis que daños en el ADN de células somáticas son un evento crítico en la iniciación delcáncer. Este daño puede resultar en mutaciones, por lo que ensayos que detectan actividadmutagénica pueden también identificar químicos con potencial para inducir carcinogénesis.

La clasificación de los ensayos de genotoxicidad de la OCDE se hace en base a doscriterios:atendiendo al tipo de alteración genética detectada y a su aplicación y utilidad.

Se recogen los requerimientos de distintas organizaciones nacionales e internacionales para laaplicación de baterías de ensayos de genotoxicidad. Estas baterías constan de ensayos tanto encélulas procariotas como eucariotas.

Como ejemplo de la aplicación de ensayos de genotoxicidad se presenta la valoración detres productos naturales con actividad biológica (annonacina, squamocina y rotenona)mediante los dos ensayos requeridos a nivel legislativo en un primer screening (test de Amesy ensayo citogenético en cultivos de linfocitos in vitro).

Las acetogeninas annonaceas constituyen un conjunto de metabolitos secundarios, aisladosde la familia Annonaceae. El interés de estos compuestos radica en su alta actividad biológicacomo insecticidas, antitumorales, citotóxicos, etc. Recientes trabajos han demostrado que elmodo de acción de estos productos es a través de la inhibición del complejo I de la respiraciónmitocondrial (1). Junto a dos acetogeninas se valora la actividad genotóxica del insecticidarotenona, un inhibidor clásico del complejo I.

Materiales y MétodosEl ensayo de Salmonella/microsoma. se realizó en tres cepas TA98 . TAI00 y TA102.

según el método descrito en (2) en ausencia y presencia de activación metabólica (fracciónS9)

En el ensayo citogenético de cultivo de linfocitos se determinaron tres parámetros:aberraciones cromosómicas, intercambio de cromátidas hermanas y frecuencia demicronúcleos según (3).

ResultadosSe obsevó que ninguno de los compuestos presenta actividad mutagénica a las dosis

ensayadas en el ensayo de Sa/m0ne//a/microsoma. Sin embargo las dos acetogeninaspresentan un marcado efecto tóxico en ambas cepas en ausencia de S9, siendo la squamocinamás potente que la annonacina. En presencia de S9 este efecto se suprime indicando una

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posible detoxificación de estos productos que daría lugar a metabolitos inactivos. En la TablaI, se presenta como ejemplo el efecto de la squamocma en la cepa TA100. La rotenona nopresenta efectos tóxicos hasta una concentración de Img/ml en n i n g u n a de las tres cepasempleadas.

Tabla I. Eva luac ión mutaséniea cíe la squamocma con TAI00a) Sin S9 mix

Q

N M

NM

NM

10 68.7±7."?7 ü l±0.02 T

MS

DMSO

MMS

;! i Con S9 mix

(mg/plaea)

0.0!

0.1

1

10

MS

DMSO

2AA

MS. mutación espontánea; DMSO. MMS. 2AA. mutación en respuesta a DMSO. metiimetanosultanato y 2-aminoantraceno. respectivamente.NM. no mutage'nico. T. tóxico.

La valoración genotóxica de la rotenona en linfocitos dio como resultado que esteinsecticida no produce aberraciones cromosómicas (Tabla II) ni intercambio de cromátidashermanas (Tabla III), pero sin embargo produce alteraciones en el ciclo celular (disminucióndel índice de proliferación celular) y un aumento en la frecuencia de MN (Tablas IV y V),ambos efectos dependientes de la dosis, y referidos a sus respectivos controles.

DiscusiónLa mayor actividad de las acetogeninas annonaceas sobre la rotenona observada en nuestro

sistema, ha sido descrita previamente en sistemas de mamíferos. Existen muy pocos trabajosacerca de las relaciones estructura-acüvidad (SAR) de las acetogeninas. Nuestros resultadosindican que la squamocina es más potente que la annonacina, lo que está en concordancia conlo descrito en (5,6). Sería interesante el estudio de la estructura de los productos dedetoxificación de las dos acetogeninas para obtener más información de la SAR de estosproductos,

La disminución en el índice de proliferación celular observada en presencia de rotenona,parece indicar un efecto citotóxico. Sin embargo, si esto fuera así se vería acompañado por undescenso en los valores del índice mitótico. La falta de efecto sobre el IM de la rotenonapodría ser explicado si el insecticida arrestará las células en metafase. Esto daría lugar a unaumento en las células en primera metafase junto a un retardo en el ciclo celular que, a su vez,afectaría los valores del índice de proliferación celular. La capacidad de la rotenona paraarrestar células en metafase ha sido descrita anteriormente (7).

Este efecto, sugiere que la rotenona podría actuar en la síntesis o ensamblaje de losmicrotúbulos y/o en la formación del huso mitótico, lo que daría lugar, bien a pérdida ecromosomas en la anafase o a no disyunción de cromosomas, si las dos cromátidas hermanasmigran al núcleo de una misma célula hija.

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El que la rctenona no produzca aberraciones cromosómicas que explique el aumento en lafrecuencia de micronúcleos observada, apunta la posibilidad de que este efecto seaconsecuancia de una pérdida de cromosomas durante la mitosis.

Tabln II. Inducción de aberraciones cromosómicas estructurales en lintocitos tratados con rotenona

Tratamiento Concentración Aberraciones cromatícicasvuc mil G R E T

48 h Í-S9) 0 3 3 0 6

0 1 4 4 1 9

0.2? 3 2 0 5

0 . 5 0 6 1 7

1 1 5 0 6

EN'.S 1 1.5 mMl 7 14 1 22

2h( -S9) 0 2 3 0 5

0.1 3 2 0 5

0 2 5 2 2 0 4

0 5 3 4 0 7

! 1 5 1 7

E M S d . 5 m M ) 6 18 0 24

2h(+S°l 0 3 4 0 7

0 1 4 5 0 9

0.25 4 o 1 1 1

0 5 5 2 0 7

1 2 7 Q 9

Cri3uc/mll 9 16 1 26

G. gaps: B. brcaks; E. exchanses; T. total: MI. mitotic índex. " f<0.01

Tabla I I I . Intercambio de cromátidas hermanas v efecto enTratamiento Concentración SCE/ce!l ± SE

ipg/mn4 8 h < - S ° i 0 5.I4±0.86

0.1 4.94±l.ll

0.25 551±1.06

0.5 537±1.18

1 482±1.09

M M C ( 0 . 2 ( i M ) 36.63=2.14*

21K-S1» t> 600±U2

0.1 5.82±1.05

0.25 6.10=1.07

0.5 5.94=1.05

1 535=1.23

MMC (0.2 (J.Mi 1 5 4 1 = 1.58*

2hl+S"i o 7.35=1.36

0.1 6 9 1 = 1.41

0.25 -04=1.35

0.5 7 4 1 ± L 4 4

1 7.69=1.31

CIM3 uu/mh 2) . 06=2.47*

Aberraciones cromosómicas Aberraciones totalesG tt E T -G -G

0 1 ( i | 4 7

1 0 1 2 6 1 1

2 2 0 4 4 9

0 0 0 0 7 7

2 0 0 2 5 8

0 5 0 5 20;iiS 27"*

1 1 0 2 4 7

1 0 0 1 2 6

3 1 0 4 3 8

2 2 0 4 6 1 1

4 1 0 5 7 1 2

1 6 0 7 24-* 31**

0 2 0 2 6 9

0 3 0 3 8 12

2 3 0 5 10 16

1 4 0 5 6 1 2

2 2 1 5 1 0 14

2 7 0 9 24** 35"

(Fisher's exact test).

el ciclo delular de la rotenonaP R I '

~* "> ">

, y|:1,

1.95a"

l.64!

1.40*"

1.90

2.14

1.85-

1.70—

1.44""

1.20—

1.97

2.17

2.09::;

1.99. '

1.8?

1.70*"

I 97-

MI

66

4 . 1

5.2

7.5

7.5

5.9

7.1

6.9

5.8

5.9-7 -)

6.7

7.4

7.1

7 ">

6.8

7.0

6.9

Se anal i /a ion 50 metalases por cada concentraciónPKI. uulicc tic proliferación celular.l'< 0.05. ' l'< 0.01 f f - t e s t para SCE: // íesi para P R I i

568

Tabla IV. Inducción de micronúclcos en lintbcitos tratados con rotenonaTratamiento Concentración

(Ltg/ml!48 h (-S9) 0

0.1

0.25

0.5

1

MMC (0.2 uMl2 h ( - . S 9 > 0

().!

0.25

0.51

EMS (15 m M j

2 h ( + S9i 0

0.1

0.25

05

1

C P ( O . l m M )

ccls BN (9r)

46. S41.1

30.1

23.7

i 6. 2

45.9

45.2

45.0

38.6

26.4

19.6

37.244.0

41.4

39.2

35.2

30.0

39.0

1

2

5

9

12

16

35

4

7

10

16

19

54

5

6

S

10

12

3S

MN in

0

0

12

0

3

0

0

1

0

1

12

0

0

10

0-i

BN>2

0

0

!

02

00

00

0

0

2

0

0

0

0

0

1

MN totales

25

14

16

22

41

4

7

12

16

21

84S

6

10

101 -)

45

B N M N Totales

2

5

1 114= 'I X '

38=

4

7

1 1 •

I6 :-

20 : : '

68-

5

6

9

10

12

41-

BN. binucleadas; MN. micronucleos: BNMN. células binucleadas micronucleadas.~ P< 0.05: " P< 0.01 (test exacto de Fisher).

Bibliografíal.ZAFRA-POLO, M.C.. M.C. GONZÁLEZ. E. ESTORNELL. S. SAHPAZ Y D. CORTÉS (1996)

Acetogenins trom annonaceae. inhlbitors ot' mitochondrial complex I. Phytochemistry. 42, 253-271.2. MARÓN. D.M. AND B.N. AMES (1983) Revised methods oí Salmonella mmagenicity test. Mutation. Res..

1 13. 173-215.3. GUADAÑO, A. A. GONZÁLEZ-COLOMA Y DE LA PEÑA E (1998) Genotoxicity ot' the insectiaUc

rotenone in cultured human lymphocytes. Mutat. Res (en prensa).4. DEGLI ESPOSTI. M.. A. GHELLI, M. RATTA, D. CORTÉS AND E. ESTORNELL (1994) Natural

substances (acetogenins) from the family Annonaceae are powerful inhibitors ot" mitochondrial NADHdehydrogenase (complex I). Biochem. J., 301, 161-167.

5. HOLLIÑGWORTH, R.M.. K.I. AHAMMADSAHIB, G. GADELHAK. AND J.L. MCLAUGHLIN ( I W - J )New inhibitors of complex I of the mitochondrial electrón transpon chain with activity as pesticidevBiochem. Soc. Trans.. 22. 230-233.

6.HE. K... L. ZENG, Q. YE, G. SHI. N.H. OBERLIES, G.X. ZHAO, J. NJOKU AND J.L. MCLAUGHLIN(1997) Comparative SAR evaluations of annonaceous acetogenins tbr pesticidal activity. Pestic. Sci.. 4v.372-378.

7. MEISNER, H.M. AND L. SORENSEN (1966) Metaphase arrest of chínese hámster cells with rotenone.Exp.Cell.Res., 42. 291-295.