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MÉTODOS MOLECULARES PARA DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS CONTAMINANTES DE PROCESSOS
INDUSTRIAIS
Felippe Buck Campana Mestrando
Laboratório de Biologia Celular e Molecular – Profa. Siu Mui Tsai
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MICRORGANISMOS
Benígnos (fermentadores)
Bactérias Leveduras
INTRODUÇÃO
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MICRORGANISMOS
“Malígnos”
Patogênicos
Listeria monocytogenes
Bacillus cereus
Clostridium perfringens
Contaminantes de processos industriais
- Diminuem o rendimento do processo;
- Competem com microrganismos benéficos pela fonte de alimentos;
- Produzem substratos indesejáveis;
Lactobacillus fermentum (contaminante mais comum do processo de produção de bioetanol)
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MICRORGANISMOS NA INDÚSTRIA
• Processos industriais nutrientes e condições para o crescimento de microrganismos;
• Presença de microrganismos biolfilmes e células planctônicas;
• Passo importante identificar a fonte do contaminante e o contaminante;
• Distribuição: varia na densidade e na composição, de acordo com mudanças no sistema (ambiente dinâmico);
• Medidas de saneamento para cessar a contaminação.
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MÉTODOS DE IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS
Cultivo microbiológico
• Dependente de reprodução de condições para crescimento ideal do organismo (meios seletivos e diferentes condições de crescimento);
• Análise fenotípica;
• Detecção apenas de organismos cultiváveis;
• Não crescimento de organismos VBNC;
• Alternativa: métodos moleculares.
• Detecção de apenas 1% do total de espécies da amostra;
• Demora para obtenção dos resultados;
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Técnicas moleculares
• Baseadas em análises de moléculas como DNA e RNA;
• “Imagem” da comunidade microbiana da amostra;
• Detecção de número baixo de microrganismos;
• Análise genotípica;
• Resultados mais rápido e preciso.
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PROCEDIMENTO PARA IDENTIFICAÇÃO
Metodos independentes de cultivo: caracterização de todo o sistema e identificação de muitas espécies;
Diferenciação entre DNA de organismos vivos e mortos não ocorre RNA.
Métodos de extração interferem no rendimento e fidelidade de representação da amostra inicial.
• Protocolos de extração; • Mecanismos de lise; • Reagentes; • Kits.
Escolha da região alvo (gene alvo) para as análises;
Escolha da técnica a se utilizar.
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ESCOLHA DO GENE ALVO 16S E 28S rRNA
• Bactérias genes de síntese da subunidade ribossomal 16S.
• Eucariotos genes de síntese da subunidade ribossomal 28S.
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16S rRNA
• Essencial na síntese se ribossomos presentes em todos os organismos;
• Composto de regiões conservadas (desenho de “primers”) e variáveis (identificação);
• Ótimo cronômetro evolutivo.
• Região ITS (Intergenic Transcribed Spacer) também utilizada.
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OPERON RIBOSSÔMICO BACTERIANO
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OUTROS GENES ALVO UTILIZADOS
rpoA – subunidade β RNA polimerase
gyrB – proteína girase
pheS – Phenylalanine tRNA synthase
Marcadores grupo funcionais: • nifH (fixação de N2) • nirK e nirS (nitrito redutase) • amoA (amônio oxigenase) • dsrB (redução de sulfato)
Problema: uso de genes
codificantes de proteínas!
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TÉCNICAS MOLECULARES PARA IDENTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS
BASEADAS EM PCR HIBRIDIZAÇÃO
Denaturing or Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis - DGGE/TGGE
Single Stranded Conformation Polymorphisms – SSCP
(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis – RISA/ARISA
Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism – T-RFLP
Bibliotecas genômicas Fluorescent in situ hibridization - FISH
Microarray
Entre outras...
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PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
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BIBLIOTECA GENÔMICA
• Baseada na criação de DNA recombinante, transformação bacteriana e clonagem;
PASSO 1: amplificação de 16S (“primers” universais) por PCR a partir do DNA total da amostra (população);
DNA total amostra
ambiental
Genôma de diferentes org.
Genes 16S
PCR
Múltiplas cópias apenas dos 16S
• Coleção de bactérias que contém individualmente representantes de apenas uma sequencia nucleotídica;
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BIBLIOTECA GENÔMICA
PASSO 2: ligação dos fragmentos gerados em vetores (plasmídeos);
Múltiplas cópias apenas dos 16S
Plasmídeos: moléculas de DNA circular que se replicam independentemente em células bacterianas
Vetores plasmidiais Moléculas de DNA recombinante
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BIBLIOTECA GENÔMICA
PASSO 3: transformação de E. coli com os plasmídeos recombinantes.
PASSO 4: multiplicação das bactérias transformadas.
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BIBLIOTECA GENÔMICA
PASSO 5: espalhamento em meio de cultivo sólido;
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BIBLIOTECA GENÔMICA
PASSO 6: seleção das bactérias transformantes em meio seletivo (antibiótico) e indicador;
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BIBLIOTECA GENÔMICA
PASSO 7: extração do DNA plasmidial de cada colônia de clones idênticos
Extração DNA
Passo 8: SEQUENCIAMENTO
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DGGE / TGGE
• Migração mais lenta de DNA fita simples;
• Matriz: gel de poliacrilamida;
• Gradiente químico (DGGE – formamida e uréia) ou temperatura (TGGE);
• Princípio: separação de fragmentos desnaturados de DNA de acordo com sua composição nucleotídica (% GC).
• “CG clamp” no primer-F: impede a dissociação completa das fitas.
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DGGE / TGGE
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DGGE / TGGE
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DGGE / TGGE
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VANTAGENS
• Trabalhar com amostras desconhecidas;
• Comparação com padrões identificação;
• Sequenciamento de bandas identificação;
• Identificação gera informação para quantificação.
• Não exige cultura de bactérias;
DESVANTAGEM
• Somente população predominante representada (acima de 1%) uso de “primers” grupo-específicos
DGGE / TGGE
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• Princípio: separação de fragmentos de DNA de fita simples em conformação secundária em gel não desnaturante.
• Conformação secundária DNA fita simples dependente de sua composição nucleotídica.
SSCP
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SSCP
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VANTAGENS
• Mais simples que DGGE/TGGE;
DESVANTAGENS
• Mesmo fragmento pode formar diferentes bandas;
• Renaturação de moléculas de DNA durante a eletroforese;
• Uma única alteração nucleotídica pode alterar posição da banda (estudo de alelos);
•Apenas bactérias dominantes retratadas.
• Adaptável para identificação de bactérias gram-negativas e gram-positivas em nível de gênero e espécie.
SSCP
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T-RFLP
• Princípio: separação de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes marcados com fluoróforos (na extremidade).
• “Primer” marcado na extremidade 5’ com fluoróforo;
• Digestão de fragmentos amplificados (PCR) com enzimas de restrição;
• Separação mais comum: aparelho sequenciador;
F
F
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T-RFLP
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T-RFLP
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• Organismos diferentes apresentam variação ou não do T-RF para a mesma enzima;
• Fator discriminatório: sítio de restrição para cada enzima;
T-RFLP
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T-RFLP - IDENTIFICAÇÃO
• Geração de padrões de picos uso de isolados;
• Comparação com amostras industriais.
ISOLADO
AMOSTRA
Fragmento em comum entre isolado e amostra.
Necessidade de uso de DIVERSAS enzimas para
confirmação.
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T-RFLP - IDENTIFICAÇÃO
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T-RFLP - IDENTIFICAÇÃO
Organismos possivelmente presentes: Lactobacillus sunkii
Lactobacillus parabuchneri
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VANTAGENS
DESVANTAGENS
• Digestão incompleta geração de fragmentos falsamente relacionados a organismos;
• Necessidade de equipamento sequenciador;
• Mede riqueza e uniformidade de população;
• Geração de fragmentos idênticos para organismos diferentes uso de várias enzimas.
T-RFLP
• Não exige cultura de bactérias (exceto para análise de isolados);
• Possibilita identificação de organismos presentes nas amostras.
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RISA / ARISA (AUTOMATED RISA)
• Muito parecido com T-RFLP não usa restrição;
• Diferenças organismos apresentam diferentes tamanhos de ITS.
• Princípio: separação de fragmentos de DNA de tamanhos diferentes marcados com fluoróforos (na extremidade);
• Baseado na região ITS (entre 16S e 23S);
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RISA / ARISA (AUTOMATED RISA)
RISA ARISA
Maior sensibilidade e detecção de fragmentos. Identificação: Comparação com padrões
(isolados) e/ou recorte de banda, clonagem e sequenciamento.
Identificação: comparação com banco de dados de sequencias (in silico).
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SEQUENCIAMENTO E IDENTIFICAÇÃO
• Obtenção da sequência nucleotídica do fragmento analisado.
Comparação da sequência com banco de dados:
cromatograma
sequência FASTA
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FISH
• Princípio: hibridização de uma sonda de DNA (de sequência conhecida) marcada com fluoróforo em moléculas de rRNA localizadas dentro de células nos ribossomos.
F
Sonda de DNA (sequência conhecida)
Célula contendo ribossômo e rRNA
• Identifica bactérias em amostras ambientais;
• Células devem estar fixadas e permeáveis às sondas;
• rRNAs: presentes em muitas cópias aumento do sinal de detecção;
• Sinal da sonda (emissão de intensidade de fluorescência) proporcional a quantidade de alvo;
• Uso de microscópio de epifluorescência.
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FISH
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FISH
• FISH: mais difícil realizar com bactérias Gram-positivas devido a permeabilidade dessas células.
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FISH
VANTAGENS
DESVANTAGENS
• Preparação complexa;
• Localização in situ;
• Estudo de organização das células em seu habitat natural;
• Não requer cultivo de células antes da análise;
• Não necessita de células vivas;
• Não há necessidade de realização de PCR;
• Sequências alvo devem ser conhecidas;
• Dificuldade na contagem de células agrupadas;
• Comunidade de bactérias minoritárias pode não ser detectada;
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MICROARRANJOS
• Chips contém pontos microscópicos com sondas de ácidos nucléicos imobilizadas;
• Amostra contendo moléculas de ácidos nucléicos desconhecidas é posta em contato com o chip;
• A hibridização entre moléculas desconhecidas e suas respectivas moléculas complementares marcadas com sondas emite fluorescência captadas por um laser.
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MICROARRANJOS
Phylochip (Affymetrix)
• 500.000 sondas com uma cobertura redundante de aproximadamente 9.000 grupos filogenéticos
VANTAGENS
• Processo rápido e relativamente de baixo custo.
• Espécies não representadas nas sondas.
LIMITAÇÕES
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OUTRAS TÉCNICAS DE DESTAQUE
Real-time PCR - qPCR SIP (Stable Isotope Probing)
MLST (Multilocus Sequence Typing)
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MONITORAMENTO TEMPORAL E ESPACIAL DE CONTAMINAÇÕES
BACTERIANAS NA PRODUÇÃO DE BIOETANOL: CARACTERIZAÇÃO
MOLECULAR POR T-RFLP E DETECÇÃO QUANTITATIVA POR QPCR DE
COMUNIDADES FORMADORAS DE BIOFILMES
Felippe Buck Campana Mestrando
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INTRODUÇÃO
• Bactérias comuns contaminantes do processo de produção de bioetanol;
• Competição pela fonte de alimento (açúcar) queda no rendimento;
• Floculação;
• Lactobacillus, Bacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Enterococcus, Weisella, Acetobacter: frequêntes contaminantes;
• Biofilmes: reservatórios resistentes de bactérias que podem continuamente reintroduzir contaminantes;
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TECNICAS UTILIZADAS
T-RFLP estudar a estrutura e a composição de comunidades bacterianas presentes em diversos ambientes (sem necessitar de bibliotecas 16s);
qPCR quantificar organismos responsáveis pelo desenvolvimento dos biofilmes.
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Materiais coletados: • Água • Melaço (MEL) • Mosto (MST) • Pé-de-cuba (PC) • Vinho (VIN) • Biofilme da tubulação de água (BH2O) • Biofilme do trocador de calor (BT) • Biofilme da parede da dorna (BD) • Biofilme do prato da centrífuga (BCEN)
Coleta e extração de DNA de amostras da Usina da Pedra (Serrana/SP).
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T-RFLP
• Geração de T-RFLP de isolados comuns na contaminação;
Accession Organism AluI (AG^CT) HaeIII (GG^CC) HinfI (G^ANTC)
MICA FT EXP. MICA FT EXP. MICA FT EXP.
FT531 Acetobacter pasteurianus
74 / 210 210 210.01 39 / 70 / 233 / 311 71 67.56 123 / 300 / 338 300 299.93
FT485 Bacillus subtilis
73 73 70.48 179 / 233 / 309 309 305.25 128 / 188 / 336 / 361 336 334.49
FT127 Bacillus subtilis-amyloliquefaciens
73 73 70.51 179 / 233 / 309 309 307.23 128 / 188 / 336 / 361 336 332.31
FT243 Lactobacillus casei
232 / 265 232 231.42 328 328 325.67 93 / 380 93
FT260 Lactobacillus casei-paracasei
232 232 231.68 328 328 325.67 93 / 380 93
FT421 Lactobacillus fermentum
273 273 272.19 67 67 64.69 388 388 381.88
FT502 Lactobacillus fermentum
273 273 271.96 67 67 64.71 388 388 384.3
FT025 Lactobacillus plantarum
213 / 264 213 211.03 327 327 327.47 379 379 375.37
FT530 Lactobacillus plantarum
213 / 264 264 266.19 327 327 328.32 379 379 376.11
FT044 Leuconostoc mesenteroides
455 455 447.03 266 266 265.24 362 362 359.35
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T-RFLP
Com 6 enzimas de restrição diferentes!
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T-RFLP
• Cruzamento de dados (Excel);
• Identificação para cada amostra.
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QPCR
• Uso de informações do T-RFLP para construção de “primers” gênero-específicos;
• Desenho: gene 16S;
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QPCR
• Testes de PCR com diferentes gêneros especificidade do primer;
Lactobacillus Lcbc-625f + Lcbc-708r (83pb) (58°C) (35 ciclos)
FT2
43
– L.
cas
ei
FT2
60
– L.
cas
ei/p
arac
asei
FT4
21
– L.
fer
men
tum
FT5
02
- L.
fer
men
tum
FT5
31
- A
. pas
teu
rian
us
Alic
yclo
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illu
s ac
ido
ter.
FT1
27
- B
su
bti
lis/a
myl
oliq
.
Bu
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old
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cep
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FT0
25
– L.
pla
nta
rum
FT5
30
– L.
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nta
rum
FT0
44
– L.
mes
ente
roid
es
Pse
ud
om
on
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uti
da
Bra
nco
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QPCR
• Quantificação das amostras número de cópias do 16S por unidade (ml ou g) de amostra;
• Estimativa aproximada do número de unidades formadoras de colônia de cada gênero; sem precisar de cultivo de células (método tradicional);
• Conjunto de medidas a serem tomadas para evitar predominância de contaminação;
• Principal fonte contaminante: biofilmes ou fonte de açúcar;
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Cocolin, L.; Ercolini, D. Molecular Techniques in the Microbial Ecology of Fermented Foods. 2008. Food Microbiology and Food Safety
• Osborn, A. M.; Smith, C. J. Molecular Microbial Ecology. 2005. Bios Advanced Methods.
• Maukonen J, Mättö J, Wirtanen G, Raaska L, Mattila-Sandholm T, Saarela M. Methodologies for the characterization of microbes in industrial environments: a review. J Ind Microbiol Biotechnol. 2003 Jun;30(6):327-56. Epub 2003 May 23.
• Quigley L, O'Sullivan O, Beresford TP, Ross RP, Fitzgerald GF, Cotter PD. Molecular approaches to analysing the microbial composition of raw milk and raw milk cheese. Int J Food Microbiol. 2011 Nov 1;150(2-3):81-94. Epub 2011 Aug 8.
• Griffiths. Intridução a Genética. 2006. Oitava Edição. Guanabara Koogan.
• Figuras retiradas de site de domínio publico: www.google.com
• Brown, T.A. Genomes. 2002. Segunda edição. Bios.