Posibilidades y aspectos bioéticos en la investigación con células madre

•“A new year and a new era”. M. Pera Nature, 451, 2008, 135-136.Manipulating cells from adult human tissue, scientists (Yamanaka y Thomson) have generated cells with the same developmental potential as embryonic stem cells. Year 2008 promises to be very exciting for researchers interested in pluripotent stem-cell biology. Thomson comenta en The New York Times, probablemente "dentro de una década la guerra de las células madre será solo una nota al pie de una página curiosa de la historia de la ciencia".

•La Terapia Regenerativa con las células madre de adulto avanza con un mayor conocimiento de cómo se crean y se guardan en reserva en el organismo las diferentes células madre.

Granada, 22 de abril de 2008

El punto de mira se centra hoy en esta cuestión: ¿ES por transferencia nuclear o inducción de pluripotencialidad a las células de adulto, iPS?

¿Para investigación biomédica? ¿Para uso terapéutico? ¿Otros usos?

Toda investigación, máxime la biomédica, exige la objeción de ciencia.

NO ES NEUTRA:

-métodos diversos para alcanzar el fin, fuentes diversas para investigación, para tratamientos y para productos biotecnológicos; se requieren productos para pruebas, modelos animales.

-toda investigación tiene una normas éticas que van desde el respeto a las fases de las pruebas previas, a la honradez de no mentir para crear expectativas..

LIBERTAD DE INVESTIGACIÓN es liberación de los intereses de los poderes político-ideológicos-económicos.

Requiere el conocimiento de qué tengo entre manos: Función natural. ES construcción AS regeneración.

Desde ese conocimiento se puede plantear con rigor y honradez qué debo y que no debo hacer de todo aquello se puede técnicamente, sin falsos debates ni falsos atajos.

La realidad (el cuerpo vivo) es muy terca. Siempre es el investigador el que tiene que girar sus proyectos y reconocer que no era el camino correcto, o simplemente hay otro mejor, cuando lo inició erróneamente.

Células madre y su posible utilidad terapéutica :

3. Qué son naturalmente

2. Cómo se crean en el organismo desde la célula totipotencial:

- qué requiere para el paso a pluripotentenciales, multipotenciales, progenitoras y diferenciadas.

3. Cómo , cuando y para qué se guardan en el organismo: - qué necesitan para cumplir su función regenerativa.

LA LIBERTAD DE INVESTIGACIÓN EXIGE PENSAR LOS CONOCIMIENTOS, BUSCARLOS Y ASUMIRLOS

LA MEJOR MEDICINA ES LA MENOS INVASIVA, LA QUE MENOS SUSTITUYE Y MÁS HACE QUE FUNCIONE POR SÍ

Célula madreSufren divisiones múltiples y secuenciales autorrenovadoras, que mantienen la población. Células hijas provenientes de una sola célula madre se diferencia en más de un tipo celular.Pueden repoblar el tejido de origen dañado cuando se trasplantan. In vivo forman, EN EL ENTORNO DE la lesión, progenitoras de diversos órganos

Quimerismo in vivo: Corazón de mujer transplantado a varón: menor tamaño y estrés al inicio

Las células de la médula ósea acuden a reparar el corazón

En el hipocampo de una mujer que sufrió un transplante de médula de un varón se observaron células con cromosoma Y. Hay pues una neosintesis de células cerebrales: neuronas, astrocitos y microglía transdiferenciadas de las células madre de la sangre. Transplantable human haemopoietic cells could serve as a therapeutic source for long-term regenerative neuropoiesis.

C.R. Cogle, A.T. Yachnis, E.D Laywell, D.S. Zander, J.R. Wingard, D. A. Steindler, E.W. Scott. (2004) Bone marrow transdifferentiation in brain after transplantation: a retrospective study Lancet, 363, 1432–1437.

XX XY XX XY XX XXCD34+

Cardiomicitos quimera (Y rojo)

rojo

XY (rojo) XX XY

Hepatocitos hepatitis embarazo

Bianchi. DW. Fetomaternal cell trafficking: a story that begins with prenatal diagnosis and may end with stem cell therapy.

J Pediatr. Surg. 2007;42:12–18

Totipotente

TS (diferenciada) ES Pluripotente

XEN, ES* Pluripotente

Pluripotentes

Multipotentes -Multipotentes- Multipootentes

Tercera semana

Copyright ©2005 by the National Academy of Sciences

The relationship between embryonic-precursor gestational age and growth potential is schematicallypresented. Higado. Páncreas. Pulmón.

Eventov-Friedman, Smadar et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2928-2933

Hay una ventana de tiempo para cada órgano en que se controla laproliferación y comienza la diferenciación ligada a la organogénesis.

Hay células madre en todos los tejidos:

Pluripotentes

Multipotentes

Progenitoras

NICHO

SEÑALES DESDE EL NICHO

REGULAN LA EXPRESIÓN DE LOS GENES

Genes de la pluripotencialidad y genes específicos de tejido

EXISTEN EN EL ADULTO CÉLULAS PLURIPOTENCIALES: genes de la pluripotenciadad y específicos.

Pluripotentes

Multipotentes

v

Hemangioblastos

Angioblastos +Hemocitoblastos

Endoteliales+ HSC

Kenneth J. M. Umbilical Cord Stem Cells. Obstet Gynecol 2005;106, 1393–1407.

Hay células madre muy versátiles en la sangre del cordón umbilical que no presentan fuerte rechazo (Navneet Majhail. Nature 2007; 450: 819-824).

En la sangre de la menstruación (ERC)

Meng X., Ichim, T.E.J., Zhong, A., Rogers, Z.,YinJackson, J., Wang, H., Ge ,W., Bogin, V., Chan, K.W., Thebaud, B., Riordan, N.H (2007) Endometrial regenerative cells: A novel stem cell population. J. Transl. Medicine, 5 , 7.

Isolation of amniotic stem cell lines with potentialfor therapy.

P. De Coppi, G. Bartsch, Jr, M M. Siddiqui, Tao Xu, C. C. Santos, L. Perin, G. Mostoslavsky, A. C Serre, E. Y Snyder, J. J Yoo, M. E. Furth, S.Soker, A. Atala

CONDICIONES INDISPENSABLES PARA TERAPIA:

2. LLEGUEN A SU SITIO. CUMPLAN SU FUNCIÓN

3. NO INVADAN y formen tumores. NO SEAN RECHAZADAS

4. PERMANEZCAN SIN ENVEJECIMIENTO PREMATURO

TRES TIPOS DE CELULAS MADRE HUMANAS DIFERENTES:

EMBRIONARIAS: del embrión de unos 5-6 días. PLURIPOTENTES

FETALES: de diversos órganos fetales. MULTIPOTENTES

ADULTO: PLURIPOTENTES, MULTIPOTENTES, PROGENITORAS

SEGÚN EL ORGANO DAÑADO Y EL TIPO DE ENFERMEDAD EL PROTOCOLO ES DIFERENTE:

-Transferirlas una vez crecidas e incluso modificadas

-Instarlas a madurar y sustituir las dañadas e incluso migrar

-Ingeniería de tejidos

LAS CELULAS MADRE EMBRIONARIAS EN TERAPIALas células madre embrionarias pluripotentes son las células de la masa interna

del blastocisto, embrión de 5 días.

Neurona Corazón Riñón Intestino Tiroides EspermioPiel Pigmentada Músculo Glóbulo rojo Páncreas Pulmón Óvulo___________________________El CIGOTO formado en la fecundación es la célula totipotente capaz de dar el organismocompleto. El embrión, después de las primeras divisiones, se reorganiza y en su interior comienza aformarse una cavidad; las células del embrión, que entonces se llama BLASTOCISTO, empiezan adiferenciarse en dos tipos: el trofoblasto que forma una envuelta externa, y un grupo compacto decélulas en la parte interna, que recibe el nombre de MASA CELULAR INTERNA y de las que sederivarán todas las células del embrión, del feto y del organismo adulto. Desde los estados másprecoces comienza el proceso de diferenciación celular de forma que las células de cualquierorganismo recorren trayectorias biológicas diversas que las hacen células “diferenciadas”; esto es,con características morfológicas y funcionales especializadas

PARA INVESTIGACIÓN

Miodrag Stojkovic, Majlinda Lako Tom Strachan and Alison Murdoch (2004) Derivation,stem cells growth and applications of human embryonic. Reproduction 128, 259–267. Más embriones, mejor calidad y más. equipos probando

Xin Zhang, Petra Stojkovic, Stefan Przyborski, Michael Cooke, Lyle Armstrong, Majlinda Lako and Miodrag Stojkovic. Derivation of human embryonic stem cells from developing and arrested embryos. Published online Sep 21, 2006; Stem Cells. DOI: 10.1634/stemcells.2006-0377.

PLURIPOTENTES

MULTIPOTENTES

Progenitoras

In vitro como in vivo

FDA to vet embryonic stem cells’ safety (Nature, 452, 10 April 2008, 670). Geron plans to use human embryonic stem cells to treat patients with acute spinal-cord injury.

Evitar el rechazo Clonación

Progress in Human Somatic-Cell Nuclear Transfer. A. C.F. Perry.

Between 0.3 and 5% (J. Schenker, D.Weinstein, Fertil. Steril. 30, 255 (1978) or up to 10% (A. Golan, R. Ron-El, A. Herman, Obstet. Gynecol. Surv. 44, 430 (1989) of women who undergo ovarian stimulation to procure oocytes experience severe ovarian hyperstimulation syndrome, which can cause pain, and occasionally leads to hospitalization, renal failure, potential future infertility, and even death

CLONACIÓN: Transferencia a un oocito desnucleado del núcleo de células de un adulto.

BARRERAS BIOLÓGICAS1) Reprogramación de la información genética, para eliminar la impronta de DNA propia de una célula especializada de adulto.2) Expresión de genes propia del estado de cigoto hacia blastocisto: Oct-4.3) El núcleo de una célula adulta carece de las proteínas que median la formación del huso mitótico de la primera división.

CUESTIÓN DE LOS HIBRIDOS: DNA de dos especies

El punto de mira se centra hoy en esta cuestión: NO ES ( transferencia nuclear) sino inducción de pluripotencialidad a las de adulto, iPS?

¿Para investigación biomédica? Sí: experimentación animal y cultivos para pruebas de fármacos

The magic brew. Janet Rossant. NATURE 448|19July 2007Researchers have engineered embryonic stem-like cells from normal mouse skin cells.

M.Wernig, A. M. R. Foreman, T. Brambrink, M.Ku,K. Hochedlinger, B. E. Bernstein. R. Jaenisch. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like. Nature 448, 318–324 (2007).

QUIMERA

Yamanaka ya ha mostrado en un trabajo en Nature Biotechnology que se puede eliminar el controvertido gen de su cóctel reprogramador (Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. M.Nakagawa, M. Koyanagi, K. Tanabe, K. Takahashi, T.Ichisaka,T. Aoi, K. Okita, Y. Mochiduki, N. Takizawa, S.YamanakaNATURE BIOTECHNOLOGY . 26, 2008, 101-106.

Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin. J. Hanna, M. Wernig, S. Markoulaki, Chiao-Wang Sun, A. Meissner, J. P. Cassady,C. Beard, T. Brambrink, Li-Chen

Wu, Tim M. Townes, R. Jaenisch.

-Permiten probar sustancias que sean posibles fármacos (Daley GQ, Scadden DT. “Prospects for Stem Cell-

Based Therapy”. Cell, 132, 544-548, 2008), capaces de actuar de forma exógena al nicho de la célula AS, o de activarla de forma endógena, como modelos de la enfermedad , y estudios de toxicidad( Rubin LL.

“Stem Cells and Drug Discovery: The Beginning of a New Era?” Cell, 132 (4), 549-552, 2008). El control de la expresión de los genes es esencial, y se van identificando los factores de trascripción específicos y reguladores, como citoquinas y factores de crecimiento, y se trata de identificar los elementos intracelulares de las vías de señalización (Feng GS “Shp2-mediated molecular

signaling in control of embryonic stem cell self-renewal and differentiation”. Cell Research, 17, 37-41, 2007).

- Es posible que en el futuro pueda usarse en el caso de enfermedades causadas por mutación de un solo gen un reemplazamiento de las células afectadas por células autólogas corregidas; se han realizados con éxito pruebas en animales (Hanna J, Wernig M, Markoulaki S, Sun CW, Meissner A, Cassady JP, Beard C, Brambrink T, Wu LC, Townes TM, Jaenisch R. “Treatment of Sickle Cell Anemia Mouse Model with iPS Cells Generated from Autologous Skin”. Science, 318, 1920-1923, 2007) y por otra parte se ha conseguido introducir genes y que se expresen en líneas de células humanas pluripotenciales procedentes de embriones, que de suyo tienen capacidad de diferenciarse a los tipos celulares de las tres capas germinales (Thyagarajan B, Liu Y, Shin S, Lakshmipathy U, Scheyhing K, Xue H, Ellerström C, Strehl R, Hyllner J, Rao MS, Chesnut JD. “Creation of Engineered Human Embryonic Stem Cell Lines Using phiC31 Integrase”. Stem Cells, 26 (1), 119-126, 2008 ).

- Se han conseguido modelos animales para el estudio de enfermedades mediante la técnica de quimeras (Rossant J. “Stem Cells: the magic brew”. Nature, 448, 260-262, 2007).

Tecnología de inducción de pluripotencialidad aplicable la investigación biomédica.

Las iPS que pueden obtenerse de biopsias de diferentes tejidos, permiten hallar y validar vías terapéuticas, al poder estudiar los mecanismos de la enfermedad

ESTRATEGIAS SEGÚN ÓRGANO, SEGÚN ACCESIBILIDAD DE LA FUENTE Y SEGÚN CAUSA DE ENFERMEDAD

Implantación de células madre de la grasa para el tratamiento de fístulas complejas en pacientes con enfermedad de Crohn. Cornea.

No solo los hepatocitos pueden dar lugar a hepatocitos

Human hepatic stem cells

Human mesenchymal stem cells: del tejido adiposo o de médula ósea. Human MAPCs

Human monocytes

Cord blood

Pancreas

Skin fibroblast

Pluripotent stem cells from adult fibroblast

Generation of neuronal variabilityand complexity A.R. Muotri, F. H. Gage NATURE, 441. 2006.1087-1093

En el cerebro del feto en desarrollo y en el del adulto existen zonas de reserva de células madre neuronales. Estas células son capaces de migrar y diferenciarse a neuronas específicas (productoras de dopamina, por ejemplo) inducida, tanto la migración como la maduración, por factores específicos

O. Lindvall, Z. Kokaia. Stem cells for the treatment of neurological disorders. NATURE, 441 2006,1094-97.

Perdida gradual de neuronas dopaminergicas y degeneración. Glia.

El tratamiento don dopamina no para la progresión de la enfermedad. Neuronas dopaminergicas y células de la glia pueden conseguirse in vitro.

Pero los ensayos con animales no son claros.

Parkinson

Los esfuerzos ahora en: 1) estimular la formación de neuronas y glia endogenas.

2) prevenir su muerte con el transplante de células madre manipuladas para expresar moléculas neuroprotectoras como GDNF (Behrstock, S. et al. Human neural progenitors deliver glial cell line-derived neurotrophic factor to parkinsonian rodents and aged primates. Gene Ther. 13, 379-388 (2006).

TRANSFERENCIA DE CÉLULAS MADRE DE FETOS A ENFERMOS DE PARKINSON

MILLER G.

Signs of Disease in Fetal Transplants SCIENCE, 320, 11 APRIL 2008, 167

En los 1990 se probó un tratamiento consistente en extraer neuronas productoras de dopamina de fetos abortados e inyectarlas en el cerebro para reemplazar las neuronas destruidas por la enfermedad. No

dio resultado: no solo poco beneficio sino consecuencias adversas. Tres grupos independientes de investigadores describen on line en abril de 2008 en Nature Medicine los hallazgos del examenpostmortem de un total de 6 cerebros de enfermos de Parkinson que habian recibido 9 y 16 años antes

transplantes fetales. Encuentran que las células transplantadas estaban bien integradas en el cerebro de los enfermos, pero parte de las células supervivientes presentaban una patología Parkinsoniana.

1. Clonación terapeútica en RATÓN.V. Tabar et al. Therapeutic cloning in individual parkinsonian mice NATURE MEDICINE, 14, 4 APRIL, 2008 380-381.Derivation of 187 ntES cell lines from 24 parkinsonian mice, dopaminergic differentiation, and transplantation into individually matched host mice showed therapeutic efficacy and lack of immunological response.2. Células adultas reprogramadas en RATÓN. M.Wernig….Rudolf Jaenisch. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci USA 99:2344–2349, 2008.

Ensayos con animales

iPS cell-derived neurons integrate into the striatum of hemiparkinsonianrats and improve behavioral deficits.

Lesiones médula espinalTienen como resultado la perdida de oligodendrocitos, perdida de la mielinización de axones. La mielinización espontánea es limitada. Se trata de reemplazar las células para que lo hagan de nuevo, principalmente por aportar factores tróficos que remielinicen los axones .En definitiva activan la función de los oligodendrocitos endógenos.

1. Con precursores neuronales Oligodendrocitos derivados de NPC

A-C. Sección longitudinal de una médula a las 8 semanas del transplante de NPC (verde). Aparecen con MBP (rojas) que las rodean.

D-G: triple marcaje longitudinal y sección (H-K), mostrando que rodean los axones (azul) y los mielinizan.

.

Lesión en la médula espinal a nivel cervicales.

B-D. Las MSC migran hacia el epicentro de la lesión y sirven de andamio para que las células nerviosas proyecten sus terminaciones.

E. Las fibras nerviosas se encuentran en la interfase entre MSC y el tejido

BB

D

E

Interrumpen las vías axonales ascendentes y descendentes con perdidas de neuronas y glia, inflamación y desmielinación.

Verde MSC. NestinaRojo astrocitos

Bernd Fleischmann. Nature Biotechnology DOI: 10.1038/nbt1374. Diciembre 2007.El injerto de cardiomiocitos con conexina 43 reduce el riesgo de arritmia ventricular. Se analiza el efecto de esta terapia en la arritmia cardiaca. La eficacia de este injerto celular en el control de la arritmia se consigue gracias a que los cardiomiocitos expresan una proteína llamada conexina 43. La proteína también se encuentra en los mioblastos, por lo que el científico apunta a los mioblastos que, además de regenerar el tejido cardiaco dañado por el infarto, ayudarían a prevenir la arritmia.

A. Aislamiento y proliferación de células troncales hepáticas (oval)

- C. Ovales prsentes en higado de rata 13 días despuésde tratamiento acetilaminofluoreno.

-Enriquecidas por FACS hasta pureza >95% (Thy1.1 +).

-Cultivo primario teñidas con alfa-fetoproteína

-Después de cultivo con factores de crecimiento

B.Trandiferenciación a endocrinas

- El cultivo en medio con glucosa cambia el fenotipo aproductoras de insulina y las asocia en grupos.

- El tamaño de dichas asociaciones aumenta con el tiempo

Activación crónica hacia los del tipo TH1

Célula presentadora profesional activada

El TNF-alfa destruye los T autoreactivos

Reeducar los T:nuevas presentadoraso nuevos linfocitos dedonante sano

Science 2003; 302, 1223-1227.

Islet Regenera

tion During

the Reversal

of Autoimm

une Diabetes in NOD Mice.

S. Kodama, W.Kühtreiber, S. Fujimura, E. A. Dale, D.L.Faustman

1. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD scid mice. R. Hwa Lee, Min Jeong Seo, Roxanne L. Reger, Jeffrey L. Spees, Andrey A. Pulin, Scott D. Olson, Darwin J. Prockop. PNAS 2006, 103, 17438–17443

Las células humanas de la médula ósea ayudan por aportar factores a las células beta para segregar INSULINA. En el riñón si forman parte de los glomerulos al diferenciarse en endoteliales . Podrían en diabéticos aumentar la secreción de insulina y corregir las lesiones renales.

2. beta Cells Can Be Generated from Endogenous Progenitors in Injured Adult Mouse Pancreas X.Xu,J. D’Hoker, G. Stange S. Bonne N. De Leu, X. Xiao, M. Van De Casteele, G. Mellitzer, Z. Ling,

D. Pipeleers, L. Bouwens,R. Scharfmann, G. Gradwohl, H. Heimberg. Cell 132, 197–207, January 25, 2008, 197-207

Novel strategies in diabetes therapy would obviously benefit from the use of beta (b) cell stem/progenitor cells. Guided by the expression of transcription factor Neurogenin 3 (Ngn3), we show that b cell progenitors can be activated in injured adult mouse pancreas and are located in the ductal lining. .

Multipotent progenitor cells thus exist in the pancreas of adult miceand can be activated cell autonomously to increase the functional b cell mass by differentiation and proliferation rather than by self-duplication of pre-existing b cells only.

New Islet Cells Derive from Hormone Progenitors among the Lining of Ducts in PDL Pancreas. Sham-treated and PDL D7 pancreas were stained simultaneously for Pdx1 and Ngn3 showing coexpression in cells lining the duct of PDL pancreas (I)

.Now we have the technology that can make a cloned child' By Steve Connor, Science Editor Monday, 14 April 2008

Ni una quimera es un clon, ni lo que se puede hacer con un ratón se puede hacer con un primate.

Se requiere represión de los genes para la correcta especificación: señales del nicho regulan la proliferación y diferenciación en gameto. De esta forma este proceso muy conservado en la naturaleza necesita factores específicos de estado para la formación de la línea germinal, y su posterior diferenciación. Los factores de trascripción de la pluripotencialidad como Oct4, Sox2 y Nanog se expresan y se producen cambios en la organización de la cromataina..

Germ Cells Are Forever. R.M. Cinalli, P.Rangan, R.Lehmann1,560-562 Cell 132, 2008

Los espermios se originan desde una pequeña población de células madre espermatogonias (SSCs), se dividen infinitamente y mantienen la espermatogénesis . Han establecido líneas SSC desde ES capaces de sufrir meiosis, dar gametos in vitro, que son funcionales y

fecundan los oocitos de ratón

Ni lo que se haría en un primate debe hacerse en un hombre: La Técnica en si misma es ambivalente.

Yamanaka señala que esta tecnología puede emplearse para otras aplicaciones con serios problemas éticos, como derivar ambos gametos, femenino y masculino, de iPS de un hombre. Cabe pensar que se pidieran gametos generados de iPS para tratamientos de infertilidad. Y que alguien intentara hacer quimera de dos seres humanos, mediante la incorporación de iPS de una persona a un blastocisto obtenido in vitro.

Es alentador que precisamente el mismo científico que crea la tecnología se presente, consciente y preocupado, frente a otros usos que imprudentemente pudieran hacerse. Yamanaka ha asumido, él mismo, la dirección ética del grupo regulador del gobierno del Japón. El 21 de Febrero el ministro de Ciencia japonés envió a todas las universidades y centros de investigación una notificación que específicamente prohíbe “la implantación de embriones hechos con iPS en úteros humanos o de animales, la producción de un individuo a partir de iPS, la introducción de células iPS en un embrión o un feto y la producción de células germinales desde iPS”.