Ethanol Exposure Alters Protein Expression in a Mouse Model ofFetal Alcohol Spectrum Disorders

Stephen MasonBruce Anthony

Natalia Zapata ZuluagaSteven Olaya Ramírez

Tercer Semestre MedicinaUniversidad Pontificia Bolivariana

INTRODUCTION

• Ethanol: Ethanol is the systematic name defined by the IUPAC nomenclature of organic chemistry for a molecule with two carbon atoms (prefix "eth-"), having a single bond between them (suffix "-ane"), and an attached -OH group (suffix "-ol"). Ethanol is produced both as a petrochemical, through the hydration of ethylene and, via biological processes, by fermenting sugars with yeast.

INTRODUCTION

• Animal model (The Mouse): The Mice (Mus Musculus) are the perfect animal model for this research for some reasons: primarily because they are mammals, and also because they share a high degree of homology with humans, and virtually all mouse genes have human homologs. Mice are small, inexpensive, easily maintained, and can reproduce quickly; several generations of mice can be observed in a relatively short period of time. Mice have the same organs in the same places than humans, just different proportions.

INTRODUCTION

Disorders with alcohol (Ethanol):

• Alcohol exposure during development can result in variable growth retardation and facial dysmorphology known as fetal alcohol spectrum disorders (FASD).

• Aberrant changes in gene expression and in the epigenome of embryos. • The teratology induced in the embryos is expressed in the neurulation process. • Alteration of proteins with roles in cellular function, cell cycle, and the ubiquitin-

proteasome pathway was induced by alcohol. • Researchers have found aberrant DNA methylation results in the misexpression of

neurospecification genes Ngn and Sox5.

INTRODUCTION• Relationship about all

This research was made about the disorders that ethanol can cause in the development of the embryo. Because the components of ethanol, this can be dangerous to the genome of the embryo by causes such as DNA methylation and the shackles of neurogenesis, to study the above, an animal model was selected that met certain characteristics mentioned above, the mouse (mus musculus) is a specimen easy to handle and gives very good results for such projects.

OVERALL OBJECTIVE

• Recognize the obvious and not obvious alterations phenotypically that ethanol can cause in embryogenesis (especially FASD) to certain proteins using different tests to analyze and compare proteic features; in addition to confirm the alterations already nominated and hypotheses proposed by other researchers.

MATERIALES Y MÉTODOSCultivo Embrionario

• El útero grávido se separó y se colocó en un buffer que contiene solución salina (PBS) a 37°C.

• Tres embriones que llevan de 3 a 6 somitas fueron colocados en un frasco de cultivo (20 ml) conteniendo el cultivo medio.

• Después del período de precultivo (2-4 horas; máximo, 4 horas), la exposición al alcohol se inició mediante la transferencia de los embriones en el medio que contiene 6 μl/ml de 95% etanol (aproximadamente 400 mg / dl).

• La concentración de etanol en 24h fue medida en 0, 12 y 22h.

MATERIALES Y MÉTODOSAnálisis Gel 2D

• Permite la separación de cientos o miles de proteínas (“spots”) en un único gel, mostrando un patrón característico.

• Se provoca la desnaturalización de las proteínas por ruptura de puentes de hidrógeno y disulfuro.

• Isoelectroenfoque Punto Isoeléctrico, pH.

• Peso Molecular Electroforesis en gel de acrilamida con SDS.

• Coloración con Coomasie Blue.

• Evaluación de Imágenes.

MATERIALES Y MÉTODOSIngenuity Pathways Analysis (IPA)

• IPA se basa en redes basadas en la información extraída de la literatura científica y se deposita en el Ingenuity Knowledge Base. IPA proporciona una evaluación de la señalización y las rutas metabólicas, redes moleculares y procesos biológicos que están más significativamente perturbados en la condición experimental.

MATERIALES Y MÉTODOSWestern Blot

• Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular en este caso. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (nitrocelulosa) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia.

MATERIALES Y MÉTODOSAnálisis Inmunohistoquímico

• En este análisis las muestras de tejido se seccionan en pequeñísimas partes (en este caso de 40 micras). Todas las secciones se lavan con PBS y se incuban en peróxido de hidrógeno, además de los anticuerpos 1 para las proteínas a evaluar. Luego se incuban con anticuerpos 2, seguido por un complejo de peroxidasa; se deben lavar las muestras con PBS entre las incubaciones 1 y 2. En el caso de esta investigación, se dio una coloración marrón producida por una solución añadida que reveló la actividad peroxidasa.

• La aplicación directa de anticuerpos sobre secciones tisulares permite la localización microanatómica de su expresión y su correlación con los parámetros morfológicos.

Retardo del crecimiento

embrionario y anormalidades.

Solo los embriones cultivados que mantuvieron activos los latidos del corazón y la circulación activa (95%) fueron utilizados para los análisis.

En los embriones que se encontraron expuestos al alcohol, se observo un cambio grande en su desarrollo, en comparación con los embriones de control.

- Retraso en el crecimiento- Anomalías del cerebro- Anomalías en el corazón- Defectos del tubo neural- Ojos pequeños - Morfología anormal- Cola sin giro- Reducido sistema vascular

RESULTADOS

Figura 1: El alcohol inducida dismorfología del desarrollo embrionario.-FB: Cerebro anterior

-MB: Cerebro medio

-HB: Romboencéfalo

-H: Anomalías del corazón

-Flechas negras: Ojos pequeños en comparación con el de la derecha.

-Menor coloración roja: Reducido sistema vascular

-Alcohol-NTC: Tubo neural cerrado pero con retrazo en el desarrollo

- Alcohol-NTO: Tubo neural abierto (Flechas Rojas)

Análisis en gel 2D

Se muestran las proteínas y los genes implicados en la proliferación, diferenciación, apoptosis, el crecimiento del tejido, remodelación, crecimiento neuronal y supervivencia, que sufrieron cambios a causa de la exposición al alcohol.

-El número total de puntos de gel detectado fueron 2.050. Cuarenta puntos de gel con un peso significativo (P < 0,01)

-De los restantes 32 puntos, 24 fueron downregulated y 8 upregulated en los embriones expuestos a alcohol.

-Para dar prioridad a el estudio, sólo los puntos con una parte muy significativa (p < 0,007) fueron seleccionados para análisis.

- 5 upregulated y 4 downregulated se les aplico LC-MS/MS (cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas) para evaluar la toxicidad causada por el tratamiento con alcohol.

En la siguiente tabla se muestran las proteínas expresadas a partir del análisis 2D, están

agrupadas en up- or downregulated.

Nueve proteínas con una expresión diferente debido al tratamiento con alcohol se destacan con una "x" blancay están marcados con el nombre de los genes.

Análisis de Western Blot

Técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee y posteriormente se buscan con anticuerpos específicos para ella.

Las proteínas que marcaron un upregulation fueron:- Serotransferrina (Tf) ( Transporte de hierro)- Triosa fosfato isomerasa (TPI1) ( Implicada en la glucolisis )

Las proteínas que marcaron downregulation fueron: - Proteína de unión 1 (Pcbp1) - Ubiquitina-conjugación (Ube2N) ( dirige el reciclaje de proteínas )

Pero estas ultimas no fueron estadísticamente significativas.

En esta grafica se comprueba que la serotransferrina (Tf) y triosa fosfato isomerasa (TPI1) tuvieron un upregulation significativo (P ≤ 0,05), mientras que la proteína de unión 1 (Pcbp1) y la ubiquitina-conjugación (Ube2N) tuvieron un downregulation pero no muy significativo.

Los genes que expresaron upregulation fueron:

-Tf : El cual esta localizado en el corazón, los arcos branquiales y somitas de los embriones tratados con alcohol.

-Tpi1 : Se incrementó de manera difusa.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica (IHQ) es un estudio histopatológico utilizado para demostrar la presencia o no de un determinado antígeno (Ag) en una muestra de tejido.Este estudio nos permite identificar con exactitud los tipos celulares presentes en una muestra, ya que existen multitud de Ag diferentes que son característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular.La IHQ se basa en la utilización de anticuerpos (Ac) específicos frente al Ag cuya presencia se quiere probar, y los cuales, los Ac, han sido previamente marcado.

Análisis de Ingenuity Pathways

Las nueve proteínas identificadas por LC-MS/MS (cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas) se presentaron a la API para evaluar los cambios biológicos causados por la exposición al alcohol.

El mayor reporte de cambios en ciclos se dio en : el ciclo celular, muerte celular, la expresión de genes y el desarrollo del aparato reproductor.

El mayor reporte de cambios en las funciones biológicas se dio en: el ciclo celular, señalización celular, la función celular, el mantenimiento de la hematopoyesis, y el tráfico de células inmunes.

El mayor reporte de cambio en las vías principales se dio en: la endocitosis medida por clatrina y clathrin endocitosis mediada por la señalización y la vía proteasomal ( Encargada de degradar proteínas innecesarias por proteólisis)

DISCUSSION

I agree

Author What does he/she said Yes No

Y. Liu The effects on protein regulation may parallel the growth delay and developmental abnormalities including brain, neural tube, eye, heart, blood cells, and embryonic vascularization.

x

Y. Peng, B. M. Altura, M. J. Druse, P.

Mandrekar

The transcription factor NF- κB (Tumor necrosis Fractor) protects cells against DNA damage-induced cell death and may play a role in the immune response. Alcohol differentially regulates NF-κB activity in various tissues Ethanol activates NF-κB in cerebral vascular muscle cells, in contrast, ethanol diminishes NF-κB target gene expression in fetal rhombencephalic neurons via a 5-HT(1A) (serotonin) mediated pathway [42]. Ethanol also interferes with inflammatory cytokine production by downregulating NF-κB in monocytes, resulting in impaired immunity

x

I agree

Author What does he/she said Yes No

D. R. Armant and D. E. Saunders.

Ethanol can induce release of intracellular calcium that stimulates the cell cycle and the expression of Myc proteins associated with cell proliferation. Increased proliferation is advantageous during reimplantation, but ethanol interference with terminal differentiation during organogenesis may underlie alcohol teratogenicity

x

J. R. Connor, T. D. Tran et al.

Tf transports iron from tissue sites of absorption to sites of storage or utilization and has a role in stimulating cell proliferation . Because iron is an essential cofactor in neurotransmitter synthesis and myelination, maternal iron status is an important modulator of fetal alcohol-induced neurobehavioral damage

x

As alcohol affects the embryos of mice, can also affect human embryos, causing damage to the genome.

Alcohol is a major cause of methylation of DNA and proteins responsible for the cell cycle regulation, one of the leading causes of mutation.

The different tests that were performed for proteins, were essential to compare embryos exposed to ethanol and the controls, to so identify the alterations.

In embryo culture is very important to take good care to pregnant mice, both at the time to care it, and at the time of removal off the embryo, so that it can make a good testing.

CONCLUSIONS

Natalia Zapata Zuluaga

Steven Olaya Ramírez

Gracias