et des protéines associées dans l’organisation et la...
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2007 THESE
Présentée en vue de l’obtention du
Doctorat à Label Européen de l’Université Paul Sabatier (Toulouse III)
Ecole Doctorale Biologie-Santé-Biotechnologies Spécialité : Biologie Cellulaire
par
CHRISTEL VEROLLET
Rôle de la tubuline γ et des protéines associées dans l’organisation
et la dynamique des microtubules
Soutenue le 28 Septembre 2007
JURY
Président : Mr Jean-Edouard GAIRIN Professeur, UPS, Toulouse Rapporteur : Mme Isabelle VERNOS Professeur, Barcelone Rapporteur : Mr Helder MAIATO Professeur, Porto Examinateur : Mr Alain DEBEC Maitre de conférences, Paris Directeurs de thèse :Mme Brigitte Raynaud-Messina Chargé de recherche, CNRS, Toulouse Mr Michel Wright Directeur de recherche, CNRS, Toulouse
Centre de Recherche en Pharmacologie-Santé (CRPS) UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre Institut de Sciences et des Technologies du Médicament de Toulouse (ISTMT)
3, Rue des satellites BP 94244, 31432 TOULOUSE Cedex 4
A mon papa …
RESUME
Les microtubules sont des polymères dynamiques essentiels à la division cellulaire. Ils sont nucléés par la tubuline γ au niveau du centrosome. La tubuline γ intervient dans deux complexes majeurs, le γ-TuRC et le γ-TuSC. Le γ-TuRC est composé de plusieurs γ-TuSCs et d’au moins quatre autres protéines. Mon objectif est de déterminer les rôles respectifs des deux complexes dans l’assemblage des microtubules. La stratégie a consisté à inhiber chacune des protéines du γ-TuRC par RNAi dans les cellules de drosophile, et à analyser les conséquences sur l’organisation et la dynamique du cytosquelette microtubulaire.
Les protéines du γ-TuSC sont essentielles. Elles sont nécessaires à l’organisation d’un fuseau mitotique bipolaire fonctionnel et à la localisation de la tubuline γ au centrosome. Les protéines spécifiques du γ-TuRC ne sont pas essentielles mais le γ-TuRC est le complexe optimal pour la progression en mitose. En absence de γ-TuRC, j’ai mis en évidence un mode alternatif de recrutement de la tubuline γ aux pôles du fuseau sous la forme de γ-TuSC.En interphase, le γ-TuRC se localise le long des microtubules. Il stabilise leur extrémité plus des microtubules cytoplasmiques via la régulation du recrutement des complexes protéiques spécifiquement localisés à l’extrémité plus.
L’ensemble de mes résultats permettent de proposer que le γ-TuSC joue un rôle crucial dans la nucléation et l’organisation des microtubules tout au long du cycle cellulaire. Le γ-TuRC assurerait des fonctions non-centrosomales, comme la régulation de la dynamique des microtubules.
Mots clés : organisation et dynamique des microtubules, tubuline γ, γ-TuSCs et γ-TuRCs, drosophile
ABSTRACT
Microtubules are highly dynamic polymers playing essential roles in cell division. γ-Tubulin, a centrosomal protein, acts within two main complexes, γ-TuSC and γ-TuRC. γ-TuRC, formed of γ-TuSCs with at least four additional proteins, is involved in microtubule nucleation at the centrosome. Nevertheless, the role of γ-TuRC components are not well defined in metazoa. I used RNAi depletion in Drosophila S2 cells to study γ-tubulin and associated proteins functions in microtubule organization and dynamics.
γ-TuSC proteins are essential. They are necessary for γ-tubulin centrosomal recruitment and for mitotic spindle organization. γ-TuRC specific proteins are non essential. γ-TuRC is the optimal complex for a fully functional mitosis, but assembly of this large complex is not essential for γ-tubulin centrosomal localization and function, as γ-TuSC can be targeted directly to the centrosome. γ-TuSC participates in interphase microtubule overall organization whereas γ-TuRC is dispensable for this process. γ-TuRC localize along microtubules and stabilize their plus-ends via the control of +TIPs complexes composition.
To conclude, γ-TuSC play a crucial role in microtubule nucleation and organization all along the cell cycle, while γ-TuRC promotes non-centrosome microtubule functions as microtubule dynamic regulation.
Key-words : microtubule organization and dynamics, γ tubulin, γ-TuSCs and γ-TuRCs, drosophila
SOMMAIRE
INTRODUCTION………………………………………………………...…………………..1
I-Du cytosquelette microtubulaire à la tubuline γ……………………...………………..….3
1) Structure et dynamique des microtubules…………………………………………...…..…3
2) La mitose…………………………………………………………………………...………5
3) Centres organisateurs des microtubules ……………………………….…………...……...7
II-La tubuline γ …………………………………………………………………………….…9
1) Découverte et conservation de la tubuline γ……………………….……………………….9
2) Localisations de la tubuline γ…………………………………………………………......11
3) Fonctions de la tubuline γ…………………………………………………………………12
4) Régulation des fonctions de la tubuline γ………………………………………………...21
III-De la tubuline γ aux complexes d’organisation des microtubules………………....…23
1) Caractérisation des complexes de tubuline γ……………………………………………...23
2) Structure des γ-TuSCs et des γ-TuRCs………………………………………………...…26
3) Fonctions des protéines associées à la tubuline γ…………………………………………31
RESULTATS………………………………………………………...……………………....39
I-Etude d’une protéine du γ-TuSC, Dgrip84, au cours de la division cellulaire………...39
Voir Colombié et al., Mol. Biol. Cell., 2006.
II-Etude du rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC en mitose……………………...…43
Voir Vérollet et al., J. Cell. Biol., 2006.
III-Etude du rôle des protéines du γ-TuRC en interphase………………………………..47
1) Rôle du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules en interphase………………...….48
2) Rôle du γ-TuRC dans la dynamique des microtubules en interphase…………………….49
Voir Vérollet et al., soumis, 2007.
IV-Etude de la régulation des protéines des complexes γ…………………………………53
1) Régulation des protéines du γ-TuSC……………………………………………………...53
2) Mécanismes de régulation des protéines du γ-TuSC…………………………………..…54
3) Régulation des protéines du γ-TuRC…………………………...……………………...…55
DISCUSSION ET PERSPECTIVES…………………………………………………….…57
I-Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules en interphase….………….57
II-Localisation de la tubuline γ sur les microtubules en interphase ………………..…....60
III-Rôle des γ-TuSCs et γ-TuRCs dans l’organisation des microtubules………..………63
1) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en interphase………………………………….……...64
2) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en mitose ………………………………………….…65
3) Co-régulation des protéines du γ-TuSC……………………...………………………...…73
IV-Perspectives…………………………………………………………………………..….74
1) Protéines impliquées dans la localisation de la tubuline γ sur les microtubules……….…74
2) Conséquences du rôle de la tubuline γ sur la dynamique des microtubules…………..….76
REFERENCES………………………………………………………………………………83
ANNEXES……………………………………………………………………………………95
Annexe 1 : Table des figures
Annexe 2 : Localisation de la tubuline γ et MTOCs
Annexe 3 : Fonctions des protéines des complexes de tubuline γ (littérature)
1
INTRODUCTION
Le cytosquelette microtubulaire est une structure dynamique impliquée dans le
transport intracellulaire, la formation des cils et flagelles mais aussi la mobilité cellulaire et
la division cellulaire. Par exemple, le fuseau mitotique permet l’alignement des
chromosomes sur la plaque centrale puis la répartition équitable du matériel génétique dans
les deux cellules filles. Des anomalies dans l’organisation du fuseau peuvent conduire à une
mauvaise ségrégation des chromosomes, générant de l’instabilité génétique qui peut être à
l’origine d’une transformation oncogénique de la cellule. Par conséquent, l’étude des
mécanismes et des molécules qui déterminent la nucléation, la dynamique et l’organisation
des microtubules est de première importance en biologie et s’inscrit également dans
l’équipe « pharmacologie et dynamique du cytosquelette microtubulaire » au sein du Centre
de Recherche en Pharmacologie~Santé (Unité Mixte de Recherche 2587 CNRS-Pierre
Fabre) à Toulouse. Les objectifs de l’unité portent sur la proposition de nouvelles cibles, de
nouveaux essais de criblage et la compréhension de nouveaux mécanismes d’action à partir
de la caractérisation et de l’analyse fonctionnelle de protéines impliquées dans la mitose.
Dans les cellules animales, le cytosquelette microtubulaire est organisé à partir du
centrosome où est recrutée la tubuline γ, une protéine essentielle pour la nucléation des
microtubules. La tubuline γ est présente dans le cytoplasme sous la forme de deux
complexes majeurs : un complexe de ~300KDa, le γ-TuSC (γ-Tubuline Small Complex),
composé de tubuline γ et de deux autres protéines et un complexe de ~2000KDa, le γ-
TuRC (γ-Tubuline Ring Complex), qui résulte de l’association de plusieurs γ-TuSCs avec
au moins quatre autres protéines.
Mon projet de thèse a porté sur le rôle de la tubuline γ et des protéines qui lui sont
associées dans l’organisation et la dynamique des microtubules au cours du cycle
2
cellulaire. Les deux complexes, γ-TuSC et γ-TuRC, sont bien caractérisés chez Drosophila
melanogaster qui constitue un organisme métazoaire particulièrement adapté aux études
fonctionnelles. L’inhibition de la synthèse des protéines par ARN interférent (RNAi) est
beaucoup plus efficace dans les cellules de drosophile que dans les cellules de mammifères
et cette analyse par RNAi peut être complétée par une approche in vivo grâce aux mutants
disponibles. La stratégie suivie a consisté à inhiber la synthèse de la tubuline γ et des
protéines qui lui sont associées par RNAi dans les cellules S2 de drosophile en culture, et
d’en analyser les conséquences sur le déroulement de la mitose, l’organisation du
cytosquelette microtubulaire et la dynamique des microtubules en interphase.
Dans l’introduction, je présenterai les différents facteurs qui régulent la fonction des
microtubules dans la cellule et je résumerai les travaux concernant la tubuline γ depuis sa
découverte en 1989. J’aborderai ensuite la caractérisation des complexes γ-TuSC et γ-
TuRC, puis les données fonctionnelles concernant les protéines associées à la tubuline γ.
3
I- Du cytosquelette microtubulaire à la tubuline γ
1) Structure et dynamique des microtubules
Les microtubules sont des cylindres creux de 25 nm de diamètre formés par
l’assemblage de 13 protofilaments. Les protofilaments sont constitués par une succession
linéaire d’hétérodimères de tubulines α et β. Ils sont disposés parallèlement et établissent
des contacts latéraux, légèrement décalés les uns des autres (Evans et al., 1985; Nogales et
al., 1999) (Figure 1A). Les sous-unités de tubulines α et β ont une masse de 50KDa et
présentent environ 50% d’identité au niveau de leur séquence en acides aminés.
L’assemblage des microtubules est un processus en deux étapes qui comprend une étape
limitante d’initiation, la nucléation, suivie d’une étape rapide d’élongation. L’addition et
l’élimination des hétérodimères se produit essentiellement aux extrémités des microtubules.
L’asymétrie et le mode d’assemblage des dimères de tubuline définissent la polarité des
microtubules ainsi que les propriétés de leurs extrémités. In vitro, les microtubules se
désassemblent environ 100 fois plus vite à partir de l’extrémité plus caractérisée par la
présence de tubuline β que de l’extrémité moins correspondant à la tubuline α (Nogales et
al., 1999). Cette dissymétrie d’assemblage permet un flux de sous-unités à l’intérieur du
microtubule appelé « treadmilling ».
Chaque monomère de tubuline possède un site de liaison pour une molécule de GTP
(Figure 1A). Le GTP lié au monomère de tubuline α est physiquement piégé à l’interface
du dimère, tandis que le GTP lié à la tubuline β échangeable et est hydrolysable en GDP
(Mitchison, 1993). L’extrémité plus des microtubules possède des sous-unités β porteuses
de GTP qui constituent une « coiffe » de tubuline GTP. Elle stabilise cette extrémité et
permet l’assemblage d’autres hétérodimères de tubulines. Lorsque la « coiffe » de tubuline
GTP disparaît par hydrolyse, le microtubule se désassemble très rapidement. Cette
hydrolyse est associée à un changement de conformation de la tubuline β qui induit la
dissociation des protofilaments appelée « peeling » du microtubule (Figure 1B) (Nogales
Tubuline α
Tubuline β
α
β
(−)
(+)
B C
Lumière
Microtubule (a) (b) (c) (d)
Protofilament
Polymérisation Dépolymérisation
Coiffe GTP
croissance rapide avec une coiffe GTP
perte accidentelle de la coiffe GTP CATASTROPHE
décroissance rapide
récupération d'une coiffe GTP SAUVETAGE
croissance rapide avec une coiffe GTP
Figure 1 : A. Structure d'un microtubule et de ses sous-unités. (a) La sous-unité de chaque proto-filament est un hétérodimère de tubuline, formé à partir d'une paire de monomères de tubuline α et β reliés par des liaisons non covalentes. Le GTP est montré en rouge. (b) Représentation schémati-que d'un hétérodimère et d'un protofilament. (c) Le microtubule est un tube creux rigide formé de 13 protofilaments alignés parallèlement. (d) Court segment de microtubule vu en microscopie électro-nique. (e) Photographie en microscopie électronique d'une coupe transversale d'un microtubule mon-trant un anneau de 13 protofilaments distincts. B-C. L'instabilité dynamique. B. Dans un microtu-bule, les protofilaments formés à partir de sous-unités contenant du GTP sont placés dans une conformation linéaire par de nombreuses liaisons latérales, donnant ainsi une "coiffe" stable de sous-unités contenant du GTP. La perte du GTP conduit à une rupture progressive du microtubule ou "peeling". Au dessus des schémas sont représentées les photographies en microscopie électronique correspondantes. C. A une certaine concentration de tubuline libre, une seule extrémité peut subir une transition entre l'état de croissance et de décroissance. Un microtubule en croissance présente des sous-unités pourvues de GTP à son extrémité qui forment une "coiffe". Si l'hydrolyse des nucléo-tides s'effectue plus rapidement que l'addition des sous-unités, cette coiffe est perdue, le microtubule commence à décroître, c'est le phénomène de catastrophe. Si des sous-unités contenant du GTP s'ajoutent en assez grand nombre pour reformer une "coiffe", alors le microtubule recommence à croître, c'est le sauvetage. Les boules vertes sont des tubulines-GDP alors que les carré verts sont des tubulines-GTP (Biologie de la cellule, 4ième édition, Alberts et al.).
(e)
A Hétérodimère
β
α
4
and Wang, 2006). Ainsi, les extrémités plus des microtubules oscillent en permanence entre
une période de croissance et une période de désassemblage. Ce phénomène est appelé
« instabilité dynamique » (Mitchison and Kirschner, 1984a). La décroissance rapide du
microtubule est qualifiée de catastrophe, tandis que la reprise de la croissance est appelée
sauvetage (Figure 1C) (Walker et al., 1988). Le « treadmilling » et l’ « instabilité
dynamique » confèrent aux microtubules un caractère très dynamique.
Ces deux mécanismes initialement caractérisés in vitro sont également observés in
vivo. Dans une cellule animale en interphase, les microtubules ont une organisation radiaire
avec les extrémités plus dynamiques, dirigées vers le cortex cellulaire, et les extrémités
moins ancrées au centrosome. Différents paramètres permettent de quantifier la dynamique
de l’extrémité plus des microtubules : les vitesses d’assemblage et de désassemblage, les
transitions entre les différents états dynamiques, en particulier les fréquences de catastrophe
et de sauvetage et le temps passé dans chacun de ces états (Cassimeris et al., 1988; Sammak
and Borisy, 1988). En supplément des phases d’assemblage/désassemblage, l’état de pause
a été défini comme la période pendant laquelle l’extrémité du microtubule reste stable
(Tran et al., 1997).
Dans la cellule, la dynamique de l’extrémité plus des microtubules est modifiée par
un ensemble de protéines qui les stabilisent ou les déstabilisent. Parmi elles, la stathmine
est une protéine cytoplasmique qui déstabilise les microtubules d’une part en séquestrant
les dimères de tubuline α/β et d’autre part, en s’associant à l’extrémité plus et en favorisant
l’activité GTPase de la tubuline β (Howell et al., 1999). La katanine est une enzyme à
activité ATPase qui fragmente les microtubules et les déstabilise en générant des extrémités
dépourvues d’une « coiffe » GTP (McNally and Vale, 1993 ; McNally et al., 2006; Roll-
Mecak and Vale, 2006). D’autres protéines, appelées MAPs (Microtubule Associated
Proteins), sont directement associées aux microtubules et interviennent dans la régulation
de leur dynamique. Initialement, les MAPs ont été isolées in vitro par co-purification avec
les tubulines α/β au cours de cycles répétés d’assemblage/désassemblage (Maiato et al.,
2004b). Parmi ces protéines, les MAPs telles que Tau ou MAP4 se lient à la surface des
microtubules et renforcent les liaisons entre les tubulines induisant la stabilisation des
microtubules (Heald and Nogales, 2002).
Figure 2 : La mitose. A-B. Le fuseau mitotique. A. Les trois classes de microtubules du fuseau mitotique : microtubules astraux, chevauchants (ou interpolaires) et kinétochoriens. Les extrémités moins des microtubules sont le plus souvent ancrées aux pôles du fuseau, alors que les extrémités plus s'en éloignent, soit vers les chromoso-mes pour les microtubules kinétochoriens, soit vers le cortex cellulaire. B. Les étapes de la mitose. Photographies de cellules épithéliales de cochon d'inde en mitose (LLC PK). Les chromosomes sont marqués en rouge (DAPI) et les microtubules en vert. En interphase, les microtubules de ces cellules ne sont pas organisés de façon radiaire, tout comme dans les cellules S2 de drosophile. En prophase, les chromosomes se condensent et il se forme deux asters de microtubules. Entre la prophase et la métaphase l'enveloppe nucléaire se rompt et permet aux microtubules d'intéragir avec les chromosomes. A la métaphase, la structure bipolaire du fuseau est en place et tous les chromosomes sont alignés sur la plaque équatoriale. En début d' anaphase A, les chromatides soeurs se séparent de façon synchrone, et les deux lots sont "tirés" par les microtubules kinétochoriens vers les pôles. A la fin de l'anaphase B, les deux pôles se sont complètement éloignés. En télophase puis cytocinèse, un fuseau central de microtubules se forme et l'invagina-tion entre les deux futures cellules a lieu pour permettre leur séparation (Laboratoire de Bill Earnshaw)..
A Kinétochore pole du fuseau
centrosome
microtubules microtubules kinétochoriens
microtubuleschevauchants
microtubulesastraux polaires
astraux équatoriaux
B
5
Caractérisées plus récemment, les « plus-end TrackIng Proteins » (+TIPs) se
localisent spécifiquement à l’extrémité plus des microtubules où elles régulent leur
dynamique. Cette classe comprend des protéines telles que les CLIPs (Cytoplasmic LInker
Proteins), les CLASPs (CLIP- ASsociated Proteins), APC (Adenomous Polyposis Coli) et
EB1 qui vont se lier à divers facteurs protéiques et agir sur des voies de signalisation
encore mal comprises (Galjart, 2005).
Les protéines de la famille KinI (superfamille des kinésines), comprenant MCAK
chez les mammifères ou KLP10A et KlP59C chez la drosophile, ne sont pas responsables
du transport des protéines et des organelles comme les autres kinésines « motrices» (Sharp
et al., 2000; Wittmann et al., 2001 ). Elles sont localisées à l’extrémité plus et déstabilisent
les microtubules en modifiant la conformation des dimères de tubulines α/β, induisant le
phénomène de « peeling ». Contrairement à la majorité des +TIPs qui stabilisent l’extrémité
plus des microtubules, la famille KinI fait partie des +TIPs qui induisent des catastrophes
(Howard and Hyman, 2007). En accord avec leur localisation, les +TIPs interviennent dans
le mouvement des chromosomes en mitose en régulant les interactions
microtubules/kinétochores (Maiato et al., 2004b). Elles contrôlent aussi les interactions
entre les microtubules et le cortex cellulaire à la fois en interphase et en mitose
(Lansbergen and Akhmanova, 2006).
La régulation de la dynamique des microtubules dépend de l’action coordonnée et de
l’interaction entre ces protéines qui ont des effets opposés ou synergiques.
2) La mitose
La dynamique des microtubules est régulée au cours du cycle cellulaire. En
prophase, la dynamique de l’extrémité plus des microtubules est augmentée (Cassimeris,
1999; Rusan et al., 2001). Dans des extraits mitotiques d’œufs de xénope, la fréquence de
catastrophes augmente globalement de 10 fois par rapport aux extraits interphasiques
(Belmont et al., 1990) et dans des cellules de mammifères, le pourcentage de temps que le
microtubule passe en pause passe de 73% en interphase à 11% en mitose (Rusan et al.,
2001). La dynamique élevée des microtubules mitotiques s’accompagne d’une
Figure 3 : Mécanismes de formation du fuseau mitotique. A. Cellules fixées avec les microtubules en vert et l'ADN en bleu. Pour passer de deux asters de microtubules émanant des pôles à un fuseau mitotique, il est nécessaire que des connections s'établissent avec les chromosomes. Pour celà, au moins deux méca-nismes se mettent en place. B. Modèle du "search and capture". Les chromoso-mes sont passifs (gris) et les microtubules (rouge) nucléés par le centrosome (centrioles en vert) vont capturer un kinétochore (1). Cela conduit à la biorienta-tion des chromatides soeurs d'un chromosome (2). C. Modèle de nucléation par la chromatine. Les fibres kinétochoriennes composées de plusieurs microtubu-les, sont formés au niveau des kinétochores. Le gradient de GTPase Ran (bleu) permet l'activation de protéines nécessaires à la formation de microtubules à proximité des kinétochores. Ces microtubules s'allongent jusqu'au pôles du fuseau ou jusqu'à un microtubule astral et sont incorporés dans le fuseau grâce à leur transport par la dynéine (3). (O'Connel et Khodjakov, 2007)
6
augmentation de la nucléation de nouveaux microtubules qui entraînent la réorganisation
du cytosquelette microtubulaire et l’établissement d’un fuseau bipolaire (Mitchison and
Salmon, 2001).
Pour former le fuseau métaphasique, les microtubules, émanant des deux pôles
capturent les chromosomes (« search and capture ») (Figures 2 et 3). La chromatine
intervient aussi dans la formation du fuseau (Heald et al., 1996; Karsenti and Vernos, 2001;
O'Connell and Khodjakov, 2007; Wadsworth and Khodjakov, 2004; Wilde and Zheng,
1999). La petite GTPase Ran et le facteur d’échange de guanine associé aux chromosomes
RCC1 créent un gradient favorable au relargage de TPX2. Cette protéine favorise la
nucléation des microtubules autour de billes de chromatine dans des extraits d’œufs de
xénope, et à proximité des chromosomes dans les cellules Hela (Gruss et al., 2001; Gruss et
al., 2002). Des protéines motrices telles que Eg5 et Klp1 vont permettre l’organisation et la
capture des petits microtubules ainsi formés au voisinage des kinétochores tandis que la
dynéine permet la focalisation des microtubules aux pôles du fuseau (Gruss and Vernos,
2004; Karsenti and Vernos, 2001) (Figure 3). Ce processus a été également caractérisé dans
les cellules S2 de drosophile (Maiato et al., 2004a). D’autres mécanismes indépendants des
pôles du fuseau et des chromosomes interviennent dans la formation du fuseau : la
nucléation de nouveaux microtubules à partir de ceux du fuseau et la « ré-utilisation » des
microtubules interphasiques (Mahoney et al., 2006).
Lors de la prométaphase, un point de contrôle est mis en place et reste activé tant
que les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque équatoriale (Logarinho
et al., 2004). L’anaphase ne se produit que lors de la désactivation du point de contrôle
mitotique. Au cours de l’anaphase A, les chromosomes se séparent et chaque chromatide
sœur migre vers les pôles. Deux phénomènes rentrent en jeu lors de cette ségrégation. Le
premier, appelé « flux » vers le pôle, consiste en la perte de sous-unités de tubuline à
l’extrémité moins et le second est l’activité « Pac-Man » qui permet le désassemblage des
microtubules à l’extrémité plus au niveau des kinétochores (Khodjakov and Kapoor, 2005;
Rogers et al., 2005). Au cours de l’anaphase B, les pôles s’éloignent. La division cellulaire
7
se termine par la formation du fuseau central en début de télophase, permettant la division
du cytoplasme ou cytocinèse qui génère les deux cellules filles (Figure 2B.).
3) Centres organisateurs des microtubules
In vivo, l’extrémité moins des microtubules, moins dynamique que l’extrémité plus,
est généralement attachée au niveau des centres organisateurs. Les Centres Organisateurs
des MicroTubules (MicroTubule Organizing Centers ou MTOCs) constituent des sites
d’ancrage et de nucléation des microtubules (Luders and Stearns, 2007). Le centrosome
constitue le MTOC majeur des cellules animales (Kirschner, 1986). Son nom lui a été
donné par T. Boveri, pour sa position centrale près du noyau (Wilson, 1925). Le
centrosome est composé de deux centrioles entourés de matériel péricentriolaire
(PeriCentriolar Material ou PCM) qui est un nuage de matériel amorphe dense aux
électrons en microscopie électronique (Figure 4). Le PCM est le site principal de nucléation
et d’organisation des microtubules (Mitchison and Kirschner, 1984b). Il n’est pas délimité
par une membrane, ce qui entraîne des difficultés pour définir sa morphologie et sa
composition protéique. L’analyse par spectrométrie de masse de centrosomes isolés de
cellules humaines a montré la présence de plus de 200 protéines dans le PCM (Andersen et
al., 2003). Dans les cellules en prolifération, les centrosomes se dupliquent une fois par
cycle. Au cours de la phase S, chaque centriole père initie la formation d’un centriole fils
dont la maturation est achevée en fin de phase G2. Chaque paire de centrioles est ensuite
ségrégée, de façon synchrone avec le matériel génétique, lors de la division cellulaire
(Doxsey, 2001).
Dans des organismes phylogénétiquement éloignés tels que les champignons et les
plantes, les MTOCs peuvent présenter des morphologies différentes. Chez les levures, le
MTOC principal est le Spindle Pole Body (SPB). Il assure les fonctions de nucléation et
d’organisation des microtubules. Chez Saccharomyces cerevisiae, le SPB constitué par une
structure trilaminaire insérée dans l’enveloppe nucléaire est le seul responsable de la
nucléation des microtubules (Figure 5A). Par contre, chez Schizosaccharomyces pombe,
Figure 4 : Le centrosome. (a) Représentation schématique simplifiée d'un centrosome de vertébré. Les deux centrioles (en vert foncé) sont perpendiculaires et mesurent, chez les mammifères, ~0,2 μm de diamètre et ~0,5 μm de long. Le matériel péricentriolaire (en mauve) s'accumule autour des deux centrioles. Dans la majorité des cellules animales, les centrioles sont formés de neuf triplets de microtubules. Chez la drosophile, les centrioles sont plus courts (~0,2 μm) que chez les vertébrés, et présentent des différences de structure au cours du dévelop-pement. Les microtubules sont nucléés à partir des complexes contenant la tubuline γ (en rose) dans le matériel péricentriolaire à proximité des centrioles. Les extrémités moins des microtubules sont ancrées au centrosome. (b) Micrographie électronique d'un centrosome dans une cellule de mammifère (Rieder et al., 2001). PCM : matériel péricentriolaire. Barre d'échelle, 0,2 μm.
(a) (b)
centriole
centriole PCM
matériel péricentriolaire
centrioles
microtubules
+
+
+
+
++
+
+
--
-- -
--
-COMPLEXES TUBULINE γ
8
deux autres MTOCs, les iMTOCs (MTOCs interphasiques) et les eMTOCs (MTOCs
équatoriaux), dont les structures sont mal connues, interviennent dans la nucléation des
microtubules (Figure 5B) (Sawin and Tran, 2006). Les microtubules dans les plantes
supérieures ne possèdent pas de MTOCs typiques avec un structure définie. Dans ces
organismes, en interphase, certains microtubules sont nucléés de façon radiaire à partir de
l’enveloppe nucléaire et d’autres au niveau de la zone corticale (Bartolini and Gundersen,
2006; Schmit, 2002). Récemment, il a été montré dans des cellules de tabac en culture et
chez Arabidopsis que les microtubules du réseau cortical sont assemblés à partir de
microtubules pré-existants (Murata and Hasebe, 2007; Murata et al., 2005).
Il existe également des sites non-centrosomaux d’organisation des microtubules dans
certains types de cellules différenciées. Dans les cellules musculaires, épithéliales,
neuronales et ciliées le centrosome existe mais cesse d’être le centre organisateur principal
(Figure 5C) (Bartolini and Gundersen, 2006). Par exemple dans les cellules musculaires, la
nucléation ne se fait plus via le centrosome mais majoritairement à partir de l’enveloppe
nucléaire (Bugnard et al., 2005; Tassin et al., 1985). D’autre part, dans des ovocytes de
souris ou de drosophile à certains stades du développement, les MTOCs sont totalement
dépourvus de centrioles (Gueth-Hallonet et al., 1993; Raff, 2004) mais génèrent des
microtubules capables de former un fuseau mitotique bipolaire. Il en est de même pour une
lignée de cellules de drosophile acentriolaires d’origine embryonnaire (Debec et al., 1995).
Quels que soient le type cellulaire et l’organisme, une caractéristique commune aux
MTOCs de différents types morphlogiques est la présence de tubuline γ [Voir ANNEXE
2 : Localisations de la tubuline γ et MTOCs].
Figure 5 : A. Le Spindle Pole Body (SPB). (a) Représentation schématique d'un SPB. Les complexes contenant la tubuline γ sont présents au niveau des plaques externes (en rouge) et internes (en rose). Les extrémités moins des microtubules sont ancrées au SPB. (b) Micrographie électronique d'une section de SPB. Pext : plaque externe, Pcent : plaque centrale, Pint : plaque interne. Barre d'échelle, 0,1 μm. (Adams et al., 2000).B. Organisation des microtubules chez S. pombe. Les microtubules sont verts, les MTOCs rouges et l'envel-lope nucléaire bleue. (a) En interphase, les iMTOCs ancrent l'extrémité moins des microtubules à l'enveloppe nucléaire ou au niveau de microtubules existants, parfois les iMTOCs peuvent être libres dans le cytoplasme. Les extrémités "plus" sont souvent vers le cortex de la cellule. (b) En mitose, les microtubules du fuseau à l'intérieur du noyau et les microtubules astraux à l'extérieur sont nucléés à partir du SPB. (c) A la fin de la mitose, les eMTOCs se forment dans la zone équatoriale et nucléent un nouveau réseau de microtubules (Sawin et Tran, 2006). C. Organisation non-centrosomale des microtubules. Représentation schématique de l'organisation des microtubules dans des systèmes où l'organisation est non-centrosomale : les cellules différenciées de type épithé-liales, neuronales et musculaires, les cellules de plante, et la levure S. Pombe (Bartolini et Gundersen, 2006).
A
(a) (b)
cellule épithéliale neurone plante supérieure
myotube S. Pombe
noyau
microtubules
centrioles
matériel péricentriolaire
protéines d’ancrage
SPBmatériel nucléant
B(a)
(b)
(c)
C
+
plaque externe
plaque interne
enveloppe nucléaire
plaque centrale
microtubules chromosomaux
microtubules polaires
microtubules cytoplasmiques
γ-TUBULIN COMPLEXES
γ-TUBULIN COMPLEXES
NOYAU
CYTOPLASME
++ +
+ +
microtubulesnucléaires
Pext
Pint
Pcent
+ +
9
II- La tubuline γ
1) Découverte et conservation de la tubuline γ
En 1989, un crible génétique chez Aspergillus nidulans destiné à rechercher des
gènes suppresseurs d’une mutation dans le gène benA de la tubuline β, qui conduit à une
hyperstabilisation des microtubules, a permis d’isoler le suppresseur mipA (microtubule
interacting protein) (Oakley and Oakley, 1989). Ce gène code une protéine de 454 acides
aminés appelée tubuline γ qui présente environ 30% d’identité en acides aminés avec les
tubulines α et β et qui constitue ainsi une troisième famille dans la superfamille des
tubulines. La détermination de la structure de la tubuline γ lié à un GTP non échangeable
avec une résolution de 2.7 Å en 2005 par Aldaz et al. a confirmé une structure similaire à
celle des tubulines α et β (Aldaz et al., 2005; Nogales et al., 1998). Les ADNc de ce gène
ont été clonés chez de nombreux eucaryotes. La tubuline γ est très conservée dans des
organismes évolutivement éloignés, tels que les plantes supérieures (Arabidopsis, maïs)
(Liu et al., 1994; Lopez et al., 1995), le champignon S. pombe (Horio et al., 1991), les
animaux (drosophile, xénope et homme) (Stearns et al., 1991; Zheng et al., 1991), mais
aussi les protistes comme Physarum, Trypanosoma ou Paramecium (Lajoie-Mazenc et al.,
1996; Liang et al., 1996; Scott et al., 1997). Les tubulines γ possèdent plus de 65%
d’identité en acides aminés entre elles (Joshi, 1994). Par exemple, la tubuline γ humaine
possède 78% d’identité avec la tubuline γ de drosophile et 98% avec celle du xénope
(Zheng et al., 1991). Cette conservation de séquence s’accompagne d’une conservation
fonctionnelle puisque l’expression de la tubuline γ humaine dans un mutant deleté pour la
tubuline γ chez S. pombe restaure le phénotype sauvage (Horio and Oakley, 1994). Deux
organismes ont des tubulines γ divergentes par rapport aux tubulines γ dites « classiques »
ou « conventionnelles », Caenorhabditis elegans et S. cerevisae (Tub4p). Leur tubuline γ
ne présentent respectivement que 40 et 36% d’identité avec les autres tubulines γ et
10
seulement 30% d’identité entre elles (Bobinnec et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995). Les
données concernant la fonction de ces deux tubulines dans l’organisation des microtubules
et leur localisation aux MTOCs suggèrent qu’elles appartiennent à la même famille.
Cependant, les mutations dans le gène TUB4 de S. cerevisiae ne sont pas complémentées
par les gènes de tubuline γ humaines ou de xénope. Ces divergences peuvent être dues à des
différences dans le nombre ou la nature de leurs partenaires protéiques.
Il existe aussi une hétérogénéités de tubulines γ au sein d’un même organisme dues à
l’existence de plusieurs gènes et aux modifications post-traductionnelles.
Chez Paramecium, Arabidopsis, la drosophile, la souris et l’homme, deux gènes
codant la tubuline γ ont été caractérisés (Liu et al., 1994; Ruiz et al., 1999; Wise and
Oakley, 1997; Yuba-Kubo et al., 2005 ; Zheng et al., 1991). Trois gènes codent la tubuline
γ chez le maïs (Lopez et al., 1995). Les différents gènes de tubuline γ au sein d’un
organisme présentent plus de 95% d’identité en acides aminés, excepté chez la drosophile
où les deux tubulines γ, γ23C et γ37CD, ne partagent que 83% d’identité (Raynaud-
Messina et al., 2001; Tavosanis et al., 1997; Wilson et al., 1997). Ces deux protéines ont un
profil d’expression différent au cours du développement. La tubuline γ23C est ubiquitaire
alors que la tubuline γ37CD est spécifiquement exprimée au cours de l’ovogenèse et dans
les embryons précoces (Tavosanis et al., 1997; Wilson et al., 1997). Dans les cellules S2 de
drosophile en culture, la tubuline γ37CD est très minoritaire et présente dans la fraction
centrosomale. Contrairement à la tubuline γ23C recrutée au centrosome en mitose, la
quantité de la tubuline γ37CD au centrosome ne varie pas au cours du cycle cellulaire
(Raynaud-Messina et al., 2001).
Des analyses par électrophorèse mono et bidimensionnelle à partir d’extraits de
cellules de mammifères ou de drosophile ont permis la détection de 6 à 8 polypeptides
correspondant à la tubuline γ suggérant l’existence de modifications post-traductionnelles
(Détraves et al., 1997; Lajoie-Mazenc et al., 1996). La tubuline γ est mono-ubiquitinylée
dans les cellules humaines et phosphorylée in vivo chez S. cerevisiae (Starita et al., 2004;
Vogel et al., 2001). Ces modifications post-traductionnelles de la tubuline γ suggèrent une
régulation de la fonction de cette protéine au cours du cycle cellulaire.
11
2) Localisations de la tubuline γ
La tubuline γ est une protéine majoritairement cytoplasmique qui ne correspond qu’à
0.01% des protéines solubles alors que les tubulines α et β représentent 1% des protéines
solubles. Dès 1990, Oakley et Oakley ont montré que la tubuline γ était localisée au SPB
pendant tout le cycle cellulaire chez Aspergillus (Oakley et al., 1990). Cette localisation a
été retrouvée dans l’ensemble des organismes eucaryotes ayant un MTOC bien défini
(Horio et al., 1991; Sobel and Snyder, 1995). Dans les cellules humaines, de souris, de
xénope et de drosophile, la tubuline γ est présente dans les PCMs (Joshi et al., 1992;
Raynaud-Messina et al., 2001; Stearns et al., 1991; Zheng et al., 1991). De plus, une
fraction mineure de la tubuline γ est associée aux centrioles (Fuller et al., 1995).
Des expériences de photo-blanchissement réalisées sur des lignées stables de
cellules épithéliales de rein de rat kangourou exprimant la tubuline γ en fusion avec la GFP
(Green Fluorescent Protein) ont mis en évidence deux populations centrosomales qui n’ont
pas le même taux d’échange avec la tubuline γ cytoplasmique. La population liée aux
centrioles pourrait correspondre à la population de tubuline γ la plus stable (Khodjakov and
Rieder, 1999). La quantité de tubuline γ présente au centrosome varie au cours du cycle
cellulaire : elle augmente en début de mitose, diminue dans les phases post-métaphasiques
pour atteindre le niveau basal de l’interphase. Le recrutement de la tubuline γ au
centrosome pendant la mitose est indépendant de microtubules (Khodjakov and Rieder,
1999; Lajoie-Mazenc et al., 1994; Marschall et al., 1996). Contrairement à la majorité des
cellules eucaryotes, la tubuline γ n’est pas détectée au niveau d’une structure centrosomale
dans les cellules S2 en interphase, malgré la présence de centrioles (Martinez-Campos et
al., 2004) (données non publiées) (Figure 6). Par contre, comme dans les autres cellules
animales, elle est recrutée aux pôles du fuseau en mitose quelque soit leur morphologie.
Elle se localise aux pôles des fuseaux acentriolaires d’ovocytes de souris en méiose II et
d’une lignée de cellules somatiques acentriolaires issue d’embryons de drosophile (Debec
et al., 1995; Gueth-Hallonet et al., 1993; Raff, 2004).
Figure 6 : Localisation de la tubuline γ au cours du cycle cellulaire dans les cellules S2 de Droso-phile en culture. Les cellules ont été étalées sur des lamelles de verre traitées avec de la concanava-line A, puis fixées et immunomarquées. Les microtubules sont marqués en rouge, la tubuline γ en vert (anticorps polyclonal de lapin R62 dirigé contre la tubuline de drosophile) et l'ADN en bleu (DAPI). Dans ce type cellulaire, la tubuline γ est répartie dans tout le cytoplasme en interphase. Elle est locali-sée aux centrosomes en fin de G2, et aux pôles du fuseau tout au long de la mitose. La tubuline γ est aussi présente le long des microtubules du fuseau et au niveau du fuseau central en fin de mitose. Photos prises au laboratoire avec un microscope Olympus couplé au sytème Deltavision RT. Barre d'échelle, 5 μm.
interphase fin de phase G2 prophase
métaphase début d’anaphase fin d’anaphase
tubuline γ, MTs, DNA
tubuline γ
télo
phas
e
12
La tubuline γ est également détectée le long des microtubules. En mitose, elle est
localisée sur les microtubules du fuseau dans les cellules de mammifères, les cellules de
drosophile et chez les plantes supérieures (Drykova et al., 2003; Khodjakov and Rieder,
1999; Lajoie-Mazenc et al., 1994; Liu et al., 1993; Raynaud-Messina et al., 2001; Raynaud-
Messina et al., 2004 ), préférentiellement associée aux microtubules kinétochoriens
(Drykova et al., 2003; Lajoie-Mazenc et al., 1994). De plus, elle s’accumule aux extrémités
moins des microtubules du fuseau central dans la zone de séparation des deux cellules filles
en télophase (Julian et al., 1993) (Figure 6). En interphase, la tubuline γ se localise sur les
microtubules chez S. pombe et chez les plantes. En microscopie, la tubuline γ ou les
protéines qui lui sont associées sont observées à des sites de branchements des
microtubules qui pourraient correspondre à des MTOCs secondaires (c’est à dire des sites
de nucléation/ancrage des microtubules tels que les iMTOCs chez S. pombe) (Liu et al.,
1993; Murata et al., 2005; Sawin and Tran, 2006 ). De manière comparable, dans les
cellules épithéliales polarisées humaines, la tubuline γ se localise le long des microtubules
cytoplasmiques dans des zones sous-corticales (Meads and Schroer, 1995; Raynaud-
Messina and Merdes, 2007; Reilein et al., 2005).
Les localisations de la tubuline γ sur différents éléments du cytosquelette
microtubulaire suggèrent une diversité de fonctions. De plus, dans des cellules de
mammifères, elle a été détectée au niveau de l’appareil de Golgi et dans des foci nucléaires
(Lesca et al., 2005; Rios et al., 2004). Ces localisations subcellulaires de la tubuline γ mises
en évidence récemment suggèrent qu’elle pourrait avoir des rôles dans des processus
indépendants des microtubules.
3) Fonctions de la tubuline γ
La tubuline γ est une protéine essentielle à la viabilité. Les mutants nuls des gènes
de la tubuline γ chez les champignons (Aspergillus, S. pombe et S. cerevisiae) et chez la
souris ne sont pas viables (Horio et al., 1991; Oakley et al., 1990; Paluh et al., 2000; Sobel
13
and Snyder, 1995; Yuba-Kubo et al., 2005). Chez la drosophile qui possède deux tubulines
γ, les mutations du gène codant la protéine γ37CD ne sont pas létales mais entraînent la
stérilité des femelles (Schnorrer et al., 2002; Sunkel et al., 1995; Tavosanis and Gonzalez,
2003; Tavosanis et al., 1997). Au cours de l’ovogenèse, la localisation de déterminants
maternels est affectée dans le mutant de tubuline γ37CD, suggérant que la tubuline γ37CD
est impliquée dans l’organisation de sous-réseaux de microtubules (Schnorrer et al., 2002;
Tavosanis and Gonzalez, 2003). L’étude de la fonction de la tubuline γ37CD dans les
cellules S2, dans lesquelles cette protéine est minoritaire, s’est avérée impossible car sa
déplétion par RNAi est inefficace (Raynaud-Messina et al., 2001; Raynaud-Messina et al.,
2004). Au contraire, le gène γ23C auquel je m’intéresserai est essentiel (Sunkel et al.,
1995). La déplétion et la surexpression de la tubuline γ dans des lignées cellulaires
humaines ou des cellules de drosophile en culture sont létales (Joshi et al., 1992; Raynaud-
Messina et al., 2004; Shu and Joshi, 1995). De nombreux travaux réalisés sur la tubuline γ
ont permis d’aborder sa fonction. Elle est essentielle pour la nucléation et l’organisation des
microtubules, en particulier en mitose où une réorganisation complète des microtubules et
une nucléation de nouveaux microtubules est indispensable à la formation du fuseau.
• Rôle de la tubuline γ dans la nucléation des microtubules
La tubuline γ humaine traduite in vitro a la capacité de se lier avec l’extrémité moins
des microtubules. Elle co-sédimente avec les microtubules de façon proportionnelle au
nombre d’extrémités présentes (Li and Joshi, 1995). La localisation de la tubuline γ à
l’extrémité moins suggère une fonction de nucléation des microtubules. In vitro, les
tubulines α et β sont capables de s’assembler en microtubules, cependant la tubuline γ
monomérique, purifiée à partir de lysats de réticulocytes, favorise la nucléation en
diminuant le temps de latence et la concentration critique de tubulines α/β permettant
l’initiation de l’assemblage (Leguy et al., 2000). Le rôle de la tubuline γ dans la nucléation
des microtubules a également été démontré par deux essais de nucléation in vitro dans des
extraits d’œufs de xénope. Dans les embryons de xénope, les centrosomes dérivent des
centrioles apportés par les têtes de spermatozoïdes. Ces centrioles deviennent des
centrosomes fonctionnels permettant la formation d’asters de microtubules une fois que les
14
protéines maternelles présentes dans l’œuf, telle que la tubuline γ, sont recrutées. In vitro,
l’appauvrissement en tubuline γ par incubation des extraits avec des anticorps, empêche les
centrioles des spermatozoïdes démembranés de devenir des centrosomes fonctionnels pour
la nucléation (Félix et al., 1994; Stearns and Kirschner, 1994).
Des expériences comparables ont été réalisées sur des centrosomes isolés de
drosophile. Un traitement à l’iodure de potassium (KI) permet l’extraction de protéines du
PCM dont la tubuline γ et réduit l’activité de nucléation des microtubules. Après incubation
des centrosomes isolés traités au KI avec des extraits d’embryons, le recrutement de la
tubuline γ est restauré, ainsi que la capacité à nucléer les microtubules. Après
immunodéplétion des complexes contenant la tubuline γ, l’extrait n’est plus capable de
réactiver les centrosomes (Moritz et al., 1998). Ainsi, la formation d’un centrosome
fonctionnel pour la nucléation des microtubules nécessite la tubuline γ.
Le rôle de la tubuline γ dans la nucléation des microtubules a été confirmé par un
ensemble d’expériences in cellulo et in vivo.
Dans des cellules humaines ou de souris, la microinjection d’anticorps dirigés contre
la tubuline γ, après désassemblage des microtubules par le nocodazole ou par le froid,
réduit fortement la re-formation d’un réseau microtubulaire interphasique (Joshi et al.,
1992). Des cellules humaines microinjectées avec les mêmes anticorps avant et pendant la
mitose ne sont pas capables d’établir un fuseau fonctionnel (Joshi et al., 1992; Julian et al.,
1993). La tubuline γ est donc nécessaire à la nucléation des microtubules tout au long du
cycle cellulaire chez les mammifères. L’inhibition par RNAi de 98% du niveau
d’expression de la tubuline γ dans des embryons de Caenorhabditis elegans diminue la
densité des microtubules et la re-nucléation après désassemblage par le froid est fortement
ralentie (Hannak et al., 2002; Strome et al., 2001). Bien que l’assemblage spontané de
tubulines α/β puisse permettre la formation partielle d’un réseau microtubulaire, le
mécanisme dépendant de la tubuline γ au centrosome est cinétiquement et quantitativement
dominant (Raynaud-Messina et al., 2004; Strome et al., 2001).
De plus, la surexpression de la tubuline γ d’un facteur 100 dans les cellules animales
entraîne une augmentation du nombre de microtubules nucléés de manière ectopique (Shu
15
and Joshi, 1995). Dans 20% des cellules transfectées, la tubuline γ s’assemble en une
structure tubulaire de 50nm de diamètre résistante au désassemblage par le froid et le
nocodazole. Par contre, la surexpression de la protéine Tub4p d’un facteur 300 chez S.
cerevisiae n’affecte pas le nombre et l’organisation des microtubules (Marschall et al.,
1996). Cela peut s’expliquer par les divergences au niveau de la séquence en acides aminés
entre la tubuline γ humaine et celle de S. cerevisiae.
In vivo, dans la plupart des organismes étudiés, tels que les champignons
(Aspergillus, S. pombe et S. cerevisiae) ou la drosophile, la densité des microtubules est
réduite lorsque le niveau tubuline γ est diminué (Horio et al., 1991; Marschall et al., 1996;
Martin et al., 1997; Oakley et al., 1990; Spang et al., 1996; Sunkel et al., 1995), ce qui est
en accord avec un rôle de la tubuline γ dans la nucléation des microtubules in vivo.
La tubuline γ intervient aussi lors de la nucléation des microtubules à des sites non-
centrosomaux dans certaines organismes ou types cellulaires. Par exemple, une fraction de
tubuline γ se localise le long des microtubules cytoplasmiques chez S. pombe et des
microtubules du réseau sous-cortical dans les cellules végétales. Elle est observée au niveau
de branchements des microtubules et interviendrait dans la nucléation de nouveaux
microtubules (Janson et al., 2005; Murata and Hasebe, 2007; Murata et al., 2005; Sawin
and Tran, 2006). Contrairement aux cellules sauvages, dans des cellules S. pombe mutantes
pour la protéine mto1p associée à la tubuline γ, aucun nouveau microtubule cytoplasmique
n’est observé après le retrait du Méthyl-Benzidazole-Carbamate (MBC), une substance qui
désassemble les microtubules (Janson et al., 2005). Des membranes isolées de cellules de
tabac contenant les microtubules corticaux incubées avec des extraits cytosoliques
contenant la tubuline γ fixent celle-ci au niveau des microtubules et permet la nucléation de
nouveaux microtubules. L’immunodéplétion de la tubuline γ dans ces extraits inhibe
l’activité de nucléation de 4 fois (Murata et al., 2005). D’autre part, l’incubation
d’anticorps dirigés contre la tubuline γ ou ses partenaires avec des noyaux isolés de cellules
de tabac inhibe l’assemblage des microtubules au niveau de l’enveloppe nucléaire (Erhardt
et al., 2002).
16
Dans certaines cellules différenciées, la tubuline γ nuclée des microtubules à des
sites atypiques. Par exemple dans les myoblastes de souris en cours de différenciation, la
tubuline γ du centrosome se relocalise au niveau de l’enveloppe nucléaire. L’injection
d’anticorps dirigés contre la tubuline γ dans les myotubes (myoblastes différenciés) après
désassemblage des microtubules par le froid, affecte la re-nucléation à partir de l’enveloppe
nucléaire (Bugnard et al., 2005; Tassin et al., 1985).
• Rôle de la tubuline γ dans l’organisation du fuseau de division cellulaire
De nombreuses observations in vivo ont montré le rôle de la tubuline γ lors de la
formation du fuseau mitotique.
L’inhibition de la synthèse de la tubuline γ par RNAi dans des cellules de drosophile
et chez Caenorhabditis, ainsi que sa perte de fonction in vivo chez la drosophile, la souris et
les champignons (S. pombe, S. cerevisiae, Aspergillus) conduit à une augmentation de
l’index mitotique d’au moins 3 fois due à une accumulation des cellules en mitose
présentant des anomalies dans l’organisation des fuseaux (Horio et al., 1991; Martin et al.,
1997; Paluh et al., 2000; Raynaud-Messina et al., 2004; Sobel and Snyder, 1995; Spang et
al., 1996; Strome et al., 2001; Sunkel et al., 1995; Yuba-Kubo et al., 2005). Dans les
cellules S2 de drosophile en culture pour lesquelles plus de 95% de la tubuline γ est
déplétée, 60% des fuseaux sont monopolaires. Les 40% restants sont des fuseaux bipolaires
allongés ou en forme de « tonneau » c’est à dire avec des pôles mal focalisés. Ces fuseaux
sont toujours dépourvus de microtubules astraux (Raynaud-Messina et al., 2004) (Figure 7).
L’absence ou le dysfonctionnement des microtubules interpolaires peut rendre compte de la
non séparation des pôles conduisant à des fuseaux monopolaires. Dans les cellules
accumulées en prométaphase/métaphase après déplétion de la tubuline γ et dans les
neuroblastes mutants, les chromosomes ne sont pas correctement alignés sur la plaque
métaphasique. La présence aux kinétochores de marqueurs de l’activation du point de
contrôle, tel que BubR1, montre que le point de contrôle mitotique reste activé (Raynaud-
Messina et al., 2004; Sunkel et al., 1995). Chez Aspergillus et S. pombe, la perte de
fonction de la tubuline γ affecte également l’alignement et la ségrégation des chromosomes,
Figure 7 : Défauts d'organisation des fuseaux mitotiques observés après déplétion de la tubu-line γ 23C par RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. A. Cellules contrôles. B-D. Cellules traitées par RNAi contre la tubuline γ. A -C. Les microtubules sont marqués en rouge, la tubuline γ en vert et les chromosomes en bleu. Les fuseaux dans les cellules contrôles sont bipo-laires et possèdent des microtubules astraux (têtes de flèche blanches). La tubuline γ est présente aux pôles et sur les microtubules du fuseau. Après déplétion de la tubuline γ, les fuseaux sont mono-polaires (B) ou bipolaires avec des pôles non focalisés (C). Les microtubules astraux sont absents (C). D. Les cellules traitées s'accumulent en prométaphase avec un marquage fort du marqueur du point de contrôle mitotique BubR1. Les microtubules sont marqués en rouge et BuBR1 en vert (Raynaud et al., 2004).
BA
C D
17
suggérant que les microtubules kinétochoriens pourraient être affectés (Paluh et al., 2000;
Prigozhina et al., 2004; Raynaud-Messina et al., 2004; Sunkel et al., 1995).
Ces anomalies engendrent une mauvaise séparation des chromosomes, induisant de
l’aneuploïdie dans les différents mutants de tubuline γ (Horio et al., 1991; Marschall et al.,
1996; Spang et al., 1996; Sunkel et al., 1995).
Bien que les phénotypes mitotiques observés en absence de tubuline γ soient sévères,
des microtubules sont toujours présents, soit grâce à la présence d’une fraction résiduelle de
tubuline γ au centrosome, soit grâce à d’autres mécanismes de nucléation des microtubules
indépendants de la tubuline γ. Différents mécanismes d’assemblage des microtubules ont
été décrits [Voir I-3) et ANNEXE 2 : Localisations de la tubuline γ et MTOCs]. Cependant,
il n’est pas exclu que ces mécanismes nécessitent aussi la tubuline γ.
La déplétion par RNAi de la tubuline γ dans les cellules S2 de drosophile a permis
de mettre en évidence un nouveau mécanisme d’assemblage des microtubules via
l’élongation des microtubules centriolaires (Figure 8). Ce mécanisme pourrait être présent
dans des conditions normales et révélé en absence de tubuline γ (Raynaud-Messina et al.,
2004). L’incapacité du PCM à nucléer des microtubules et l’implication de ce mécanisme
alternatif d’assemblage unidirectionnel est en accord avec l’observation de fuseaux
monopolaires et l’absence de microtubules astraux. Une fraction plus stable de tubuline γ
localisée au centriole pourrait résister au traitement RNAi et être responsable de la
nucléation par élongation des microtubules centriolaires (Fuller et al., 1995; Khodjakov and
Rieder, 1999).
Mahoney et al. ont analysé en temps réel les mécanismes de nucléation à l’aide de
lignées de cellules de drosophile en culture exprimant la +TIP EB1 couplée à la GFP. La
déplétion par RNAi de la tubuline γ dans les cellules S2, qui affecte toutes les localisations
de la tubuline γ en mitose (pôles et microtubules du fuseau), diminue la densité
d’extrémités plus marquées par EB1-GFP de microtubules provenant des microtubules du
fuseau et de la chromatide (Mahoney et al., 2006). D’une part, ces expériences suggèrent
que la tubuline γ associée aux microtubules du fuseau pourrait permettre la nucléation de
Figure 8 : Elongation des microtubules centriolaires après déplétion de la tubuline γ 23C par RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. Photo de microscopie électronique des pôles de fuseaux monopolaires en absence de tubuline γ. Les têtes de flèche noires montrent l'élongation des microtubules à partir du centriole. Barre d'échelle, 0.2 μm (Raynaud et al., 2004).
18
microtubules. D’autre part, plusieurs autres expériences suggèrent un rôle de la tubuline γ
dans l’assemblage des microtubules à proximité des chromosomes. L’immunodéplétion de
la tubuline γ empêche la nucléation des microtubules via Ran et TPX2 dans des extraits
d’œufs de xénope et in vitro dans un essai d’assemblage à partir de tubuline α/β pure
(Groen et al., 2004; Wilde and Zheng, 1999). La tubuline γ et TPX2 co-précipitent et co-
localisent avec XRHAMM, une MAP nécessaire à la formation du fuseau à partir des
chromosomes (Groen et al., 2004). TPX2 pourrait activer la tubuline γ afin de nucléer les
microtubules. De plus, la déplétion de Nedd1, une protéine associée à la tubuline γ et
nécessaire à son recrutement au centrosome et le long des microtubules du fuseau dans des
cellules de mammifères, retarde la re-nucléation des microtubules après désassemblage au
froid non seulement à partir du centrosome mais aussi à partir de l’ADN (Haren et al.,
2006; Luders et al., 2006). La tubuline γ pourrait donc intervenir de manière directe ou
indirecte dans tous les mécanismes connus d’assemblage des microtubules pour la
formation du fuseau mitotique.
La fonction de la tubuline γ dans les phases post-métaphasiques est difficile à
analyser car sa déplétion entraîne des défauts qui activent le point de contrôle mitotique.
Elle n’a pu être analysée que dans les cellules de mammifères et in vivo chez la drosophile.
Dans les cellules humaines, l’injection d’anticorps contre la tubuline γ en anaphase ou la
déplétion partielle par injection d’ARN antisens, empêche la formation du fuseau central
entre les deux cellules filles (Julian et al., 1993; Shu et al., 1995). La tubuline γ localisée au
niveau du fuseau central pourrait participer à la nucléation ou à l’organisation des
microtubules nécessaires à la formation de cette structure. L’analyse des spermatocytes de
drosophile pour lesquels le point de contrôle mitotique est peu stringent a permis d’étudier
le rôle de la tubuline γ dans les phases post-métaphasiques in vivo. Dans les spermatocytes
des mutants de tubuline γ23C, le fuseau central en télophase est mal organisé, et la
cytocinèse est abortive ou très asymétrique (Sampaio et al., 2001). Ces défauts pourraient
résulter d’une implication directe de la tubuline γ dans le processus de cytocinèse mais
aussi d’anomalies plus précoces dans l’organisation du fuseau de division
19
• Rôle de la tubuline γ dans la maturation/duplication des centrosomes
Dans les cellules S2 de drosophile et in vivo dans les mutants drosophile, la tubuline
γ est essentielle pour la maturation du PCM en mitose (Raynaud-Messina et al., 2004;
Sunkel et al., 1995). La protéine CP190 est nucléaire en interphase. Elle se relocalise au
centrosome en mitose mais est absente des pôles des fuseaux dans des cellules
acentriolaires (Debec et al., 1995; Whitfield et al., 1988). Après déplétion de la tubuline γ
in vivo et in cellulo, CP190 est toujours recrutée aux pôles du fuseau mais le marquage est
anormal : 50% des fuseaux bipolaires sont marqués à un seul pôle et les fuseaux
monopolaires présentent un nombre variable de points CP190 allant jusqu’à 4. Comme
pour CP190, la forme, la taille et la symétrie du marquage centrosomine (Cnn), une autre
protéine recrutée aux pôles des fuseaux, sont anormales (Megraw et al., 1999) (Figure 9).
De plus, dans les neuroblastes de drosophile dont la tubuline γ est mutée ou dans les
cellules traitées par RNAi, un seul centriole ou plus de deux centrioles sont présents à un
même pôle en microscopie électronique (Raynaud-Messina et al., 2004; Sunkel et al.,
1995). Les centrioles sont plus courts que dans les cellules contrôles (Raynaud-Messina et
al., 2004). Ceci suggère un rôle de la tubuline γ dans la biogenèse, la séparation ou la
duplication des centrosomes.
Le rôle de la tubuline γ dans la duplication des centrioles a été bien caractérisé chez
Paramecium, un organisme caractérisé par un nombre très important de corps basaux
morphologiquement similaires aux centrioles. L’inactivation du gène codant la tubuline γ
induit un arrêt de la croissance cellulaire et un blocage de la duplication des corps basaux
(Ruiz et al., 1999). Ces données peuvent être mises en rapport avec la localisation de la
tubuline γ au niveau des centrioles et des corps basaux dans les cellules ciliées épithéliales
et chez Paramecium (Fuller et al., 1995; Muresan et al., 1993; Ruiz et al., 1999).
Enfin, chez Caenorhabditis, la tubuline γ joue non seulement un rôle dans la stabilité
des centrioles mais aussi dans l’assemblage du centriole fils lors de la duplication
(Dammermann et al., 2004).
Figure 9: Caractérisation des pôles avec différents marqueurs après déplétion de la tubuline γ 23C par RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. A. Fuseaux monopolaires. B. Fuseaux bipolaires anormaux. Les microtubules sont marqués en rouge, les chromosomes en bleu et les protéines du pôle en vert. Les marquages verts correspondent aux protéines Asp, CP190 et CNN. En absence de tubuline γ, le marquage Asp est diffus ou ponctué, le marquage CP190 est affaibli (par rapport aux contrôles non représentés) et le marquage CNN est asymétrique ou/et ponctué. Barre d'échelle, 5 μm (Raynaud et al., 2004).
BA
20
• Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules
In vitro, la tubuline γ monomérique ou sous forme de complexe se lie à l’extrémité
moins des microtubules et réduit la dynamique d’assemblage/réassemblage à cette
extrémité (Keating and Borisy, 2000; Leguy et al., 2000; Moritz et al., 2000; Wiese and
Zheng, 2000; Zheng et al., 1995). D’autres analyses suggèrent que la tubuline γ pourrait
réguler également la dynamique de l’extrémité plus des microtubules. In vivo, la perte de
fonction par mutation de la tubuline γ chez S. cerevisiae et S. pombe entraîne un
allongement des microtubules cytoplasmiques qui se courbent en arrivant au cortex
cellulaire (Marschall et al., 1996; Paluh et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995; Spang et al.,
1996). En mitose dans des mutants S. pombe, les microtubules astraux sont anormalement
longs (Paluh et al., 2000). In vivo, des cellules de S. pombe exprimant la tubuline α couplée
à la GFP et mutantes pour la tubuline γ montrent des microtubules cytoplasmiques en
interphase et des microtubules astraux lors de la mitose moins dynamiques (Paluh et al.,
2000). Des études plus récentes chez S. cerevisiae montrent que la tubuline γ serait un
facteur de déstabilisation des extrémités plus des microtubules astraux en mitose (Cuschieri
et al., 2006). Dans des cellules mutantes pour la tubuline γ, les microtubules passent 3 fois
plus de temps en pause que dans des cellules sauvages. Ceci pourrait s’expliquer par la
présence d’une fraction de tubuline γ le long des microtubules, comme c’est le cas chez S.
pombe (Sawin and Tran, 2006).
• Rôle de la tubuline γ dans le point de contrôle mitotique
Des travaux montrent que la tubuline γ pourrait réguler le point de contrôle
mitotique indépendamment des microtubules. Chez Aspergillus, des cellules mutantes pour
la tubuline γ ne sont pas totalement bloquées en mitose, bien que l’organisation des fuseaux
soient anomale, et ce même lorsque les microtubules sont déassemblés par le MBC
(Prigozhina et al., 2004). De plus, l’expression d’un mutant de la tubuline γ humaine dans
des cellules de S. pombe dont le gène endogène est inactivé n’affecte pas le passage de la
mitose malgré la présence de fuseaux anormaux (Hendrickson et al., 2001).
21
4) Régulation des fonctions de la tubuline γ
L’existence de différents isotypes et de modifications post-traductionnelles de la
tubuline γ suggèrent une régulation des fonctions de la tubuline γ au cours du
développement et du cycle cellulaire.
Par exemple chez la drosophile, il existe deux gènes codant la tubuline γ. Le gène
γ23C est essentiel à la viabilité et à l’organisation d’un fuseau mitotique fonctionnel tandis
que le deuxième isotype de tubuline γ, la tubuline γ37CD, est non essentiel et son
expression est contrôlée au cours du développement. Les études au cours de l’ovogenèse
ont montré que les femelles mutantes pour la tubuline γ37CD sont stériles et qu’il n’existe
qu’une redondance partielle entre les deux isotypes à ce stade du développement
(Tavosanis and Gonzalez, 2003).
La migration de la tubuline γ sur gel 2D montre des spots différents dans la partie
soluble et dans la partie liée à la fraction du cytosquelette suggérant des modifications post-
traductionnelles différentes (Détraves et al., 1997; Lajoie-Mazenc, 1994; Moudjou et al.,
1996). La tubuline γ est phosphorylée in vivo (Vogel et al., 2001). Chez S. cerevisiae, elle
est phosphorylée pendant la phase G1 et déphosphorylée en mitose sur la tyrosine 445 dans
la région C-terminale de la protéine. Une délétion phospho-mimétique de ce résidu entraîne
une augmentation du nombre et de la stabilité des microtubules. Ainsi, la phosphorylation
régulerait la fonction de la tubuline γ dans la nucléation et/ou la dynamique des
microtubules. Cette tyrosine étant très conservée entre les organismes, cela pourrait
indiquer un mécanisme de régulation des fonctions de la tubuline γ très conservé au cours
de l’évolution (Vogel et al., 2001; Vogel and Snyder, 2000). D’autre part, la tubuline γ est
mono-ubiquitinylée sur les lysines 48 et 344 par le complexe BRCA1/BARD1 dans les
cellules de mammifères. Cette ubiquitination contrôlerait plutôt le rôle de la tubuline γ dans
la duplication des centrosomes en phase S (Starita et al., 2004).
22
Environ 80% de la tubuline γ totale existe sous forme soluble dans le cytoplasme et
sa sédimentation sur gradient de sucrose montre qu’elle n’est jamais monomérique mais
toujours dans des complexes multiprotéiques (Moudjou et al., 1996; Stearns and Kirschner,
1994; Zheng et al., 1995). La fonction de la tubuline γ pourrait donc être régulée par ses
différents partenaires et l’hétérogénéité des complexes dans lesquels elle se trouve.
23
III- De la tubuline γ aux complexes d’organisation des
microtubules
1) Caractérisation des complexes de tubuline γ
Le premier complexe de tubuline γ (γ-TuRC) a été isolé par immunoaffinité à partir
d’extraits de xénope (Zheng et al., 1995). Des complexes similaires ont été retrouvés dans
de nombreuses espèces. Une approche génétique chez S. cerevisiae a permis d’identifier les
premiers partenaires de la tubuline γ (Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997). Puis, des
approches essentiellement biochimiques ont mené à l’identification des protéines associées
à la tubuline γ chez les animaux. Les γ-TuRCs de drosophile sont les mieux caractérisés et
servent aujourd’hui de référence.
• γ-TuSCs et γ-TuRCs chez la drosophile
Dans le cytoplasme, la tubuline γ n’est pas détectée sous forme monomérique. Chez
la drosophile, elle se trouve sous la forme de deux complexes majeurs qui sont définis selon
leur coefficient de sédimentation en gradient de sucrose et leur composition protéique, le γ-
TuSC et le γ-TuRC (Figure 10). Le γ-TuSC possède un coefficient de sédimentation de 10S
et une masse d’environ 300KDa et le γ-TuRC est un complexe de 30S correspondant à une
masse d’environ 2200KDa. Des expériences biochimiques ont permis d’identifier les
protéines de ces complexes (Gunawardane et al., 2000; Gunawardane et al., 2003; Oegema
et al., 1999). L’approche a consisté à purifier les complexes par affinité avec des anticorps
dirigés contre la tubuline γ et à séparer les différentes protéines par électrophorèse sur gel
dénaturant. Les bandes ont été microséquencées ou utilisées pour produire des anticorps qui
ont permis de cribler des banques d’expression (Gunawardane et al., 2000; Oegema et al.,
1999). Le γ-TuSC est composé de deux molécules de tubuline γ associées à deux autres
protéines : Dgrip84 et Dgrip91. Le γ-TuRC contient plusieurs sous-unités de γ-TuSCs et au
moins 4 autres protéines caractérisées : Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et Dgp71WD. Les
Dgrip163Dgrip128Dgrip91Dgrip84Dgrip75 + Dgp71WD
Tubuline γ
KDa205
112876956
38.5
5% 40%
Dgrip75, Dgrip128, Dgrip1
Dgp71WDγγ γγDgrip84, Dgrip91
Tubuline γ
Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163
Dgp71WD
Figure 10 : γ-TuSC et γ-TuRC chez la drosophile. A. Les γ-TuSCs et γ-TuRCs sont carac-tésirés par leur coefficient de sédimentation et leur composition protéique. Les complexes contenant la tubuline γ ont été immunopurifiés avec un anticorps dirigé spécifiquement contre la tubuline γ et fractionnés sur un gradient de sucrose (de 5 à 40%) dans 100mM de NaCl. 75μL de chaque fraction ont été analysés par SDS-PAGE et colorés au Bleu de Coomassie. (Oegema et al., 1999). Le γ-TuSC (10S) sédimente principalement dans les fractions 4 à 6, le γ-TuRC (30S) sédimente majoritairement dans les fractions 10 à 13. Au moins deux protéines sont détectables sous la bande correspondant à Dgrip84 (Dgrip75 et Dgp71WD). Les trois sous-unités du γ-TuSC, Dgrip84, Dgrip91 et la tubuline γ sont les plus abondantes dans le γ-TuRC. B. Modèle de représentation du γ-TuRC. Le complexe est représenté souvent dans cette forme en anneau au vu des expériences de microscopie électronique (Zheng et al., 1995). Ce modèle postule que 6 à 7 γ-TuSCs forment l'anneau et que les protéines Dgrip75, 128, 163 et Dgp71WD forment une coiffe.
24
trois protéines du γ-TuSC sont les protéines les plus abondantes dans le γ-TuRC (Figure
10).
Le γ-TuRC possède en microscopie électronique une forme en anneau qui lui
confère son nom de « ring complex » (Zheng et al., 1995).
• Identifications des protéines associées à la tubuline γ dans les autres
organismes (Figure 11)
Des complexes contenant la tubuline γ ont été caractérisés dans la plupart des
organismes (S. pombe, S. cerevisiae, plantes, xénope, mammifères). Les premières
protéines identifiées ont été Spc98 et Spc97 (pour Spindle pole components), les
homologues respectivement de Dgrip91 et Dgrip84 chez la levure S. cerevisiae. Le gène
SPC98 a été isolé par un crible d’interaction génétique avec le gène TUB4 de la tubuline γ
(Tub4p), et SPC97 par un crible d’interaction génétique avec SPC98 (Geissler et al., 1996;
Knop et al., 1997). Seul un complexe composé de Tub4p, Spc98 et Spc97 présentant les
caractéristiques du γ-TuSC a été mis en évidence chez S. cerevisiae.
Des analyses génétiques, par des cribles visant à rechercher des gènes qui altèrent la
polarité de croissance ou l’organisation des microtubules, ont permis l’identification de la
plupart des protéines associées à la tubuline γ chez S. pombe (Anders et al., 2006; Fujita et
al., 2002; Vardy and Toda, 2000). Certaines protéines sont très éloignées au niveau de leur
séquence primaire, en particulier mod21 qui présente moins de 20% de similarité avec
Dgrip128 de drosophile et GCP5 des mammifères (Anders et al., 2006).
Des expériences biochimiques similaires à celles réalisées chez la drosophile ou des
recherches d’homologies de séquences ont permis d’identifier la majorité des protéines
chez le xénope (Martin et al., 1998; Zhang et al., 2000), les mammifères (Fava et al., 1999;
Murphy et al., 2001; Murphy et al., 1998), les plantes supérieures (Arabidopsis), ainsi que
l’homologue de Dgrip75 chez S. Pombe (Venkatram et al., 2004) (Figure 11). Chez
Caenorhabditis, la seule séquence isolée, Cegrip-1, présente une grande divergence avec
les homologues Dgrip91 et GCP3 qui peut être corrélée avec la divergence existant entre la
tubuline γ de Caenorhabditis et celle des autres organismes. Cegrip-1 se localise au
Figure 11 : Protéines associées à la tubuline γ. Il existe une hétérogénéité dans la nomenclature utilisée pour les protéines associées à la tubuline γ. Le complexe γ-TuRC de drosophile est couramment utilisé comme référence car il est un des mieux caractérisés. Les complexes isolés d'embryons de drosophile (Oegema et al., 1999), d'oeufs de xénope (Zheng et al., 1995) et de cellules humaines (Murphy et al., 2001) forment des anneaux et sont appellés γ-TuRC pour "ring complex". Chez la drosophile et le xénope les noms sont Dgrip et Xgrip pour Drosophila et Xenopus suivi de leur poids moléculaire apparent ou calculé, sauf Dgp71WD qui n'appartient pas à la même famille. Chez les mammifères le nom vient de γ(G)-tubulin Complex Protein suivi d'un numéro dans l'ordre de leur identification. Pour les autres orga-nismes, le complexe est qualifié de γ-TuC. Tous les orthologues existent chez les plantes mais, mise à part AtSpc98p, leur interaction avec la tubuline γ n'a pas été démontrée (Εrhardt et al., 2002). Chez S. cerevisiae, Spc97 et Spc98 signi-fient Spindle Pole Body Component de masse moléculaire calculée 97 et 98 KDa. Chez S. pombe, les noms des protéi-nes viennent des cribles dans lesquels elles ont été découvertes (Vardy et Toda, 2000; Fujita et al., 2002; Anders et al., 2006). Pour Caenorhabditis, une seule protéine a été identifiée et la nomenclature est celle de la drosophile précédée de Ce pour l'espèce (Hannak, 2002). Les protéines du γ-TuSC sont en vert et les protéines du γ-TuRC en bleu (Wiese and Zheng, 2006).
Drosophile γ -TuSC γ -TuRC
Xénope γ-TuRC
Mammifères γ-TuRC
Plantes (Arabidopsis)
γ-TuC
S. Cerevisiae complexesTub4
S. Pombe γ-TuC
Caenorhabditis non
caractérisé
tubuline γ 23C tubuline γ 37CD tubuline γ
tubuline γ / GCP1
(2 gènes)tubuline γ (2 gènes)
Tub4p Tubg1/Gtb1 tbg-1
Dgrip84 Xgrip110 GCP2 AtSpc97p Spc97p Alp4
Dgrip91 Xgrip109 GCP3 AtSpc98p Spc98p Alp6
Dgrip75 Xgrip76 GCP4 AtGCP4 Gfh1p
Dgrip128 Xgrip133 GCP5 AtGCP5
Dgrip163 Xgrip210 GCP6 AtGCP6 Alp16
Dgp71WD X-Nedd1 GCP71WD/ Nedd1 At-Nedd1
(>5 isoformes)mod21
Ce-grip1
25
centrosome mais rien n’est connu sur l’existence d’un complexe contenant la tubuline γ
chez cet organisme (Hannak et al., 2002).
• Protéines à motifs « grip » et à motifs « WD »
Les comparaisons de séquences des protéines associées à la tubuline γ dans le γ-
TuRC ont permis de mettre en évidence des motifs communs appelés motifs « grip » (pour
gamma tubulin ring protein) qui définissent une nouvelle famille. L’alignement des
protéines « grip » de la drosophile (Figure 12), de Xgrip109 et 210 chez le xénope, des
GCP2 et GCP4 chez l’homme et des Spc97 et Spc98 chez S. cerevisiae a permis de
déterminer les séquences consensus de deux motifs communs constitués de résidus
hydrophobes, grip1 et grip2 d’environ 100 et 270 acides aminés respectivement
(Gunawardane et al., 2000; Wiese and Zheng, 2006). Chez la drosophile, parmi les cinq
protéines à motifs grip, seule Dgrip128 ne contient que le motif grip2 alors que toutes les
autres possèdent les deux motifs (Gunawardane et al., 2000). Chez cet organisme, l’identité
entre les différentes protéines de cette superfamille est relativement faible en dehors des
domaines « grip » : environ 20 à 30% sur la séquence complète. De plus, les homologues
d’une protéine dans des organismes différents présentent des conservations variables. Par
exemple, la protéine humaine GCP3 présente plus de 85% d’identité avec son orthologue
chez le xénope (Xgrip109) mais seulement 30% avec celui de la drosophile (Dgrip91). Par
contre, l’analyse des profils HCA (Hydrophobic Cluster Analysis) prédit des domaines
structuraux 2D (feuillets β et hélices α) très similaires entre les différentes protéines à
motifs grip chez la drosophile et l’homme (données non publiées, collaboration avec I.
Callebaud) (Callebaut et al., 2006). Les motifs grip retrouvés dans toutes les protéines
associées à la tubuline γ pourraient être des motifs d’interaction avec la tubuline γ.
Les recherches de séquence ont permis l’identification chez la drosophile de deux
protéines supplémentaires à motifs grip, Dgrip79 et Dgrip225. Les alignements de
séquence montrent que Dgrip79 est un membre de la famille proche de Dgrip84/CGP2
(Figure 12). La protéine Dgrip79 pourrait être une protéine qui migre au niveau de 75KDa
sur les gels colorés au Bleu de Coomassie (Figure 10) (Wiese and Zheng, 2006). Par contre,
aucune protéine ne migre au dessus de 163KDa. Dgrip225 doit être soit minoritaire dans les
Figure 12 : Alignement des séquences des protéines à motif grip. (a) La séquence complète montre deux régions en orange de très forte similarité qui ont été nommés grip1 et grip2 (La séquence de Dgrip163 a été tronquée à l'excep-tion des régions d'homologie avec les autres protéines). (b) Alignement de séquence pour le motif grip1. Dgrip128 est la seule protéine à ne pas posséder le motif grip1.(c) Alignement de séquence pour le motif grip2. Le code couleur représente les similarités entre acides aminés : bleu et vert = mauvais, jaune et orange clair = moyen et orange/rouge = bon (Wiese and Zheng, 2006).
a
b
c
26
embryons soit spécifique de certains stades du développement ou de tissus. Elle pourrait
aussi ne pas être associée à la tubuline γ.
Dgp71WD est la dernière protéine associée à la tubuline γ dans le γ-TuRC a avoir
été identifiée chez la drosophile. Elle ne possède pas de motif grip mais 5 répétitions d’un
motif structural de type « WD » dans sa partie N-terminale (Gunawardane et al., 2003). Les
motifs WD sont des séquences conservées d’environ 40 à 60 acides aminés qui se terminent
parfois par Tryptophane-Acide aspartique (WD) et qui peuvent être répétées dans la
séquence protéique de 4 à 16 fois (Smith et al., 1999). Des motifs WD sont présents dans
diverses protéines et ne sont pas associés à une fonction spécifique. La seule protéine à
motifs WD dont la structure cristallographique est connue est la sous-unité β des protéines
G. Cette structure a montré que les motifs WD confèrent aux protéines une forme en « β-
propeller » rigide qui leur permet de présenter trois surfaces d’interactions potentielles avec
d’autres protéines (Figure 13). Nedd1, l’orthologue de Dgp71WD chez les mammifères
possède 21% d’identité avec Dgp71WD, au delà des motifs WD (Gunawardane et al.,
2003). Les protéines Nedd1 et Dgp71WD pourraient avoir un rôle soit dans l’assemblage
du γ-TuRC, soit dans l’interaction avec des protéines activatrices ou des protéines
d’ancrage.
2) Structure des γ-TuSCs et des γ-TuRCs
• Structure et stœchiométrie des complexes de tubuline γ
Le γ-TuRC cytoplasmique purifié possède, en tomographie par microscopie
électronique et en cryomicroscopie électronique, une structure en anneau ouvert ou en
spirale dont une des faces est couverte par une « coiffe » (Moritz et al., 2000; Murphy et
al., 2001; Oegema et al., 1999; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al., 1995). Ces anneaux
ont un diamètre d’environ 25 nm, ce qui correspond au diamètre des microtubules.
L’anneau de γ-TuRC comporte environ six répétitions en forme de U qui pourraient
correspondre à l’estimation du nombre de γ-TuSCs présents au sein du γ-TuRC, d’après les
Figure 13 : Les motifs "WD". A. Alignement des répétitions WD de Dgp71WD, de Nedd1 (homologue humain) et de la chaine 1 de la transducine β. La prédiction à partir de la struc-ture 3D connue de la transducine β et par profil HCA a permis d'indentifier les 5 motifs WD dans Dgp71WD et les 7 dans Nedd1. La position prédite des feuillets β (A, B, C et D) sont indiqués au dessus des alignements. Les acide aminés hydrophobes et aromatiques conservés sont surlignés en vert et orange, respectivement. Les autres acides aminés retrouvés dans des motifs WD sont en jaune ou rouge. B. Structure 3D prédictive des domaines WD de Nedd1. L'alignement permet de prédire une structure en β-propeller composée de 7 domaines (I-VII), chacun formé de 4 feuillets β (A-D) en architecture 3+1 (Haren et al., 2006). C. Représentation schématique de la forme en β-propeller que peuvent adopter les protéines à motifs WD. Elle permet la présentation de trois grandes surfaces d'intéractions possibles (noire, rose et grise) (Smith et al., 1999).
A
B
C
27
masses respectives des deux complexes et des protéines qui les composent (Moritz and
Agard, 2001; Moritz et al., 2000; Oegema et al., 1999). Dans ce modèle, l’anneau serait
composé de 6 γ-TuSCs et la « coiffe » composée des autres protéines associées à la
tubuline γ spécifiques du γ-TuRC (Moritz and Agard, 2001; Moritz et al., 2000; Murphy et
al., 2001; Oegema et al., 1999; Wiese and Zheng, 1999) (Figure 14).
La stœchiométrie du petit complexe, le γ-TuSC, a été bien étudiée et est maintenant
admise. Chez la drosophile et les levures S. pombe et S. cerevisiae, des approches
génétiques et biochimiques (immunoprécipitation, double hybride, co-expression dans
bacculovirus) ont montré que les trois protéines du γ-TuSC interagissent deux à deux
(Geissler et al., 1996; Gunawardane et al., 2000; Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000;
Vinh et al., 2002). La co-expression des trois protéines dans des cellules d’insecte permet
de purifier un complexe avec un coefficient de sédimentation identique au γ-TuSC
endogène (Gunawardane et al., 2000; Vinh et al., 2002). Enfin, les études par densitométrie
sur gel coloré au Bleu de Coomassie et les études par co-immunoprécipitation des protéines
en fusion avec des étiquettes ont permis de déterminer une stœchiométrie tubuline γ :
Dgrip84 : Dgrip91 de 2 : 1 : 1 dans le γ-TuSC (Knop et al., 1997; Murphy et al., 1998;
Oegema et al., 1999; Vinh et al., 2002). L’ensemble de ces données a permis d’élaborer une
organisation du γ-TuSC dans lequel deux hétérodimères composés de tubuline γ-Dgrip84 et
tubuline γ-Dgrip91 interagissent latéralement par l’intermédiaire d’interactions tubuline γ-
tubuline γ et Dgrip84-Dgrip91 (Figure 14).
Par contre, la stœchiométrie du γ-TuRC est encore imprécise. Des analyses
densitométriques montrent que les protéines spécifiques du γ-TuRC sont minoritaires dans
le complexe par rapport aux protéines du γ-TuSC. Le nombre et les interactions entre ces
protéines sont controversés (Fava et al., 1999; Fujita et al., 2002; Moritz and Agard, 2001;
Murphy et al., 2001; Oegema et al., 1999). Par exemple, l’homologue de Dgrip75 a été
estimé à 1 ou 2 exemplaires dans le γ-TuRC en fonction de l’organisme étudié (Fava et al.,
1999; Gunawardane et al., 2000). Lorsqu’elles sont co-exprimées dans le système
bacculovirus, la tubuline γ et Dgp71WD interagissent directement avec l’ensemble des
autres protéines du complexe, sauf Dgrip75 pour laquelle l’étude n’a pas été réalisée
Figure 14 : Structure et modèle du γ-TuRC. (a) Vue latérale d'un complexe γ-TuRC isolé d'embryons de drosophile, obtenu par tomographie en microscopie électronique. On observe une paroi de l'anneau (crochet) composé de sous unités en forme de U (pointillés bleus) et d'une coiffe (pointe de flèche). (b-c) Modèle structural du γ-TuRC représentant le coté ouvert de l'anneau (b) et la face opposée (c). Les sous-unités en U correspondraient aux γ−TuSCs (tubuline γ en rose et protéines associées dans le γ−TuSC en vert). Les protéines grip spécifi-ques du γ-TuRC (gris) formeraient la coiffe. (Moritz et Agard, 2001).
(a) (b) (c)
Dgrip84
Dgrip91
Tubuline γ
28
(Gunawardane et al., 2003). Ceci est en accord avec la structure prédite de Dgp71WD qui
lui confère des surfaces d’interaction protéine/protéine. De plus, le γ-TuSC purifié ne
s’auto-assemble pas en un complexe de la taille du γ-TuRC in vitro, suggérant un rôle des
protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’assemblage du complexe (Oegema et al., 1999).
Ces informations fragmentaires et l’absence de données concernant la structure des
protéines associées à la tubuline γ ne permettent pas de proposer un modèle d’organisation
du γ-TuRC.
• Modèle de nucléation des microtubules
In vitro, des extraits d’œufs de xénope ou d’embryons de drosophile déplétés en γ-
TuRCs possèdent une activité de nucléation des microtubules réduite (Félix et al., 1994;
Moritz et al., 1998; Stearns and Kirschner, 1994). Les γ-TuRCs purifiés sont capables de
nucléer les microtubules en dessous de la concentration critique de tubulines α/β (Zheng et
al., 1995). De plus, ils ont la capacité de s’associer à l’extrémité moins de microtubules
préexistants et de bloquer la dynamique d’assemblage/désassemblage à cette extrémité
(Keating and Borisy, 2000; Moritz et al., 2000; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al.,
1995). Le γ-TuSC, purifié à partir d’extraits d’embryons de drosophile ou reconstitué à
partir du système d’expression bacculovirus, favorise également la nucléation des
microtubules, mais moins efficacement que le γ-TuRC (Figure 15). Les γ-TuSCs peuvent
également s’associer avec l’extrémité moins des microtubules et diminuer leur dynamique
mais plus faiblement que les γ-TuRCs (Gunawardane et al., 2000; Oegema et al., 1999;
Vinh et al., 2002). In vitro, la tubuline γ monomérique possède les mêmes propriétés de
nucléation des microtubules que les γ-TuRCs et les γ-TuSCs (Leguy et al., 2000) mais cette
forme n’a jamais été détectée dans des extraits cellulaires.
En microscopie électronique, des structures en forme d’anneau contenant de la
tubuline γ sont observées au niveau du PCM des centrosomes isolés de drosophile et
disparaissent après nucléation des microtubules (Moritz et al., 1995a; Moritz et al., 1995b).
Ces structures pourraient correspondre à des γ-TuRCs recrutés au centrosome interagissant
avec l’extrémité moins des microtubules. En accord avec cette hypothèse, toutes les
Figure 15 : Comparaison de l'activité de nucléation des γ-TuSCs et des γ-TuRCs. A-B. Champs représentatifs des tests de nucléation des microtubules in vitro. C. Quantification de la nucléation. L'activité de nucléation des γ-TuRC est 80-100 fois plus importante que l'activité de nucléation spontanée par la tubuline en solution. Dans ces conditions, l'activité de nucléation du γ-TuSC est seulement 2 à 3 fois plus importante que l'activité de nucléation spontanée (B). (Oegema et al., 1999).
γ-TuRC
γ-TuRC
Nom
bre
de m
icro
tubu
les
B
A
C
γ-TuSC
γ-TuSCContrôle Contrôle
29
protéines du γ-TuRC sont localisées au centrosome (Fava et al., 1999; Gunawardane et al.,
2000; Gunawardane et al., 2003; Martin et al., 1998; Murphy et al., 2001; Murphy et al.,
1998; Oegema et al., 1999; Zhang et al., 2000). D’après ces données, le γ-TuRC pourrait
être le complexe nécessaire à la nucléation et la stabilisation des microtubules au niveau
des centrosomes.
Deux modèles de nucléation des microtubules par le γ-TuRC ont été proposés
(Figure 16), le modèle du « moule » (Oakley, 1995; Zheng et al., 1995) et le modèle du
« protofilament » (Erickson, 2000; Erickson and Stoffler, 1996). Dans le premier cas,
l’anneau de γ-TuRC servirait de moule pour la nucléation des microtubules. Les tubulines γ
interagiraient latéralement entre elles et longitudinalement avec les dimères de tubulines
α/β à l’extrémité moins des microtubules. Dans le modèle « protofilament », l’anneau de
tubuline γ formerait un protofilament incurvé qui interagirait latéralement avec les
tubulines α/β, stabilisant une paire de protofilaments et conduisant à l’initiation de la
croissance du microtubule.
Aucune évidence expérimentale ne permet d’infirmer ou de confirmer ces modèles.
L’analyse par microscopie électronique de la localisation des protéines du γ-TuRC ou du γ-
TuRC complet par rapport à l’extrémité moins des microtubules serait en faveur du modèle
« moule » mais les résultats sont très contestables (Keating and Borisy, 2000; Moritz and
Agard, 2001; Moritz et al., 2000). Dans des extraits d’œufs de xénope, la tubuline γ se
localise à environ 4±10 nm de l’extrémité du microtubule alors que Xgrip109 (Dgrip91)
est détecté à 9±4 nm et Xgrip210 (Dgrip163) à 10±9 nm (Keating and Borisy, 2000 ; Zhang
et al., 2000). Dans des extraits d’embryons de drosophile, la visualisation de γ-TuRCs
purifiés en association avec des microtubules provenant d’extraits d’embryons, ainsi que la
reconstitution de l’extrémité moins de microtubules à partir de centrosomes intacts
montrent que le γ-TuRC apparaît comme une « coiffe » qui entoure l’extrémité du
microtubule sans s’étendre vers l’intérieur du microtubule (Moritz et al., 2000).
L’obtention récente de la structure de la tubuline γ humaine associée avec le GTP
par cristallisation et analyse aux rayons X n’a pas permis de vérifier un des deux modèles
de nucléation des microtubules. Cependant, il montre que les interactions entre les
Figure 16 : Les deux modèles de nucléation des microtubules par le γ-TuRC. A. Dans le modèle du "moule", les sous-unités tubuline γ adjacentes font des contacts latéraux. B. Dans le modèle du "protofilament", les unités de tubuline γ font des contacts tête à queue. La poche à GTP de la tubuline γ est marquée en rouge.(Wiese et Zheng, 2006).
Modèle du "moule" Modèle du "protofilament"
30
tubulines γ dans le cristal présentent des similarités avec les interactions entre les tubulines
α et β voisines, non pas dans un protofilament, mais latéralement dans le microtubule
(Aldaz et al., 2005). Les tubulines γ sont donc capables de former des contacts latéraux
dans le complexe qui sont les interactions prédites dans le modèle du « moule » (Figure
16). Contrairement aux tubulines α/β, le rôle du GDP/GTP associé à la tubuline γ n’est pas
clairement défini. Dans le modèle « protofilament », l’hydrolyse du GTP pourrait permettre
l’assemblage des tubulines γ du protofilament initial. Dans le modèle « moule », le γ-TuRC
présente un anneau de tubulines γ avec un GTP accessible. L’hydrolyse du GTP pourrait
fournir l’énergie nécessaire aux interactions des tubulines α/β avec les tubulines γ (Figure
16). La seule donnée in vitro disponible qui montre que la tubuline γ dans le γ-TuSC se lie
préférentiellement à la forme non hydrolysable (GDP) ne permet pas de conclure (Oegema
et al., 1999).
La composition protéique des γ-TuRCs est similaire chez la drosophile, le xénope et
les mammifères. Chez S. cerevisiae, un complexe soluble de 22S est détecté sur gradient de
sucrose (Vinh et al., 2002), mais son contenu protéique reste inconnu. Chez cet organisme,
les protéines spécifiques du γ-TuRC n’existent pas ou sont peut être trop divergentes pour
être identifiées à partir de leur séquence primaire. Ceci ne permet pas d’expliquer une
conservation des mécanismes de nucléation au cours de l’évolution (Geissler et al., 1996;
Knop et al., 1997; Vinh et al., 2002). Il est possible que le petit complexe Tub4 d’environ
6S, équivalent au γ-TuSC, soit suffisant pour nucléer le faible nombre de microtubules
présents chez les levures, par rapport aux eucaryotes supérieurs. Cependant, cela est en
contradiction avec l’existence de complexes de grande taille chez S. pombe (Vardy and
Toda, 2000). Une autre hypothèse serait que plusieurs complexes Tub4 s’assemblent pour
former un plus gros complexe soit dans le cytoplasme soit au niveau du SPB.
31
3) Fonctions des protéines associées à la tubuline γ
[Voir ANNEXE 3] Les fonctions des protéines associées à la tubuline γ sont moins bien caractérisées
que celles de la tubuline γ. Les partenaires de la tubuline γ les mieux étudiés sont les
protéines du γ-TuSC. Le rôle de ces protéines a été analysé chez les levures S. pombe et S.
cerevisiae, par des études génétiques. Les pertes de fonction des gènes codant les
homologues de Dgrip84 et Dgrip91 sont létales chez les deux levures (Geissler et al., 1996;
Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000; Venkatram et al., 2004), comme c’est le cas pour
la tubuline γ. Une mutation du gène Dgrip91 chez la drosophile est également létale
(Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000).
Seules deux protéines spécifiques du γ-TuRC, Dgrip75 et Dgrip163, ont été
étudiées. Contrairement aux protéines du γ-TuSC, ces protéines ne sont pas essentielles à la
viabilité chez la levure S. pombe (Fujita et al., 2002; Venkatram et al., 2004). Une mutation
de Dgrip75 a été identifiée au cours d’un crible de mutagenèse pour isoler des gènes
affectant la polarité de l’ovocyte de drosophile (Schnorrer et al., 2002). Cette mutation
n’engendre pas de mortalité précoce mais les mutants présentent une stérilité femelle.
• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans l’assemblage des complexes
de tubuline γ.
In vitro, les γ-TuRCs peuvent être désassemblés en γ-TuSCs en présence de
concentrations élevées de sel puis réassemblés par élimination des sels. Dans des extraits de
xénope, l’immunodéplétion de Xgrip109, l’homologue de Dgrip91, bloque le réassemblage
du γ-TuRC après élimination des sels (Martin et al., 1998). Par contre in vivo chez S.
pombe, Alp4 (Dgrip84) n’est pas nécessaire à la détection sur gradient de sucrose d’un
complexe γ-TuC de 2000KDa (Fujita et al., 2002; Vardy and Toda, 2000). Il existe donc
une contradiction pour le rôle des homologues de Dgrip84 et Dgrip91 dans l’assemblage
des complexes entre S. pombe et le xénope. La même contradiction a lieu pour les
homologues de Dgrip163 : Xgrip210 chez le xénope est essentielle à la formation d’un
complexe de grande taille in vitro (Figure 17) alors que Alp16 ne l’est pas chez S. pombe
Figure 17 : Xgrip210 (homologue de Dgrip163 chez le xénope) est nécessaire à l'assem-blage du γ-TuRC. Des extraits de xénope sont analysés sur gradient de sucrose 5 à 40%. Les fractions sont déposées sur un gel SDS/PAGE et immunoblotées avec des anticorps dirigés contre la tubuline γ, Xgrip109 et Xgrip210. Des extraits contrôles (a) ou immunodé-plétés avec des anticorps contre Xgrip210 (b) sont comparés (Zhang et al., 2000).
- Xgr
ip10
9 co
ntrô
les
a
b
32
(Fujita et al., 2002; Zhang et al., 2000). Ces différences peuvent être dues à la nature des
mutations chez S. pombe qui pourraient affecter la fonction de la protéine ciblée sans
affecter le domaine nécessaire aux interactions avec les autres composants des complexes.
D’autre part, la nature des complexes de 2000KDa chez S. pombe est encore mal définie et
il est possible que la fonction des protéines dans la formation des complexes tubuline γ soit
différente d’un organisme à l’autre.
• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans la nucléation des
microtubules
La re-nucléation des microtubules après traitement par le froid est bloquée par la
présence d’anticorps dirigés contre GCP3 (Dgrip91) à la fois in vitro sur des centrosomes
isolés et dans des cellules Hela microinjectées (Tassin et al., 1998). L’orthologue humain
de Dgrip91 serait nécessaire à la nucléation des microtubules, ce qui est en accord avec son
rôle essentiel dans l’assemblage des complexes chez le xénope (Martin et al., 1998).
Des mutations des gènes codant les homologues de Dgrip91 chez les levures (S.
pombe et S. cerevisiae) et la drosophile et de Dgrip84 chez les levures entraînent une
diminution de la densité de microtubules, comparable avec la diminution de la densité
observée après mutation du gène codant la tubuline γ (Barbosa et al., 2000; Geissler et al.,
1996; Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000; Zimmerman and Chang, 2005). De plus,
dans les mutants des homologues de Dgrip84 et Dgrip91 chez S. pombe, les analyses en
microscopie électronique montrent qu’un des SPBs possède peu ou pas de microtubules
(Vardy and Toda, 2000). Comme la tubuline γ, les protéines du γ-TuSC sont impliquées
dans la nucléation des microtubules in vivo. In vitro, dans des essais de reconstitution de
centrosome à partir d’extraits de xénope, les homologues de Dgrip75 et Dgrip163 sont
également nécessaires à la formation d’asters de microtubules (Fava et al., 1999; Zhang et
al., 2000).
L’hypothèse la plus probable est que l’ensemble des protéines du γ-TuRC soit
nécessaire à la formation du complexe et à la nucléation des microtubules. Cependant,
certaines protéines associées à la tubuline γ pourraient avoir des rôles spécifiques.
33
• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans l’organisation des
microtubules
Le rôle des protéines associées à la tubuline γ dans la nucléation suggère qu’elles
soient également impliquées dans l’organisation du fuseau de division.
Le rôle des protéines du γ-TuSC a été abordé lors de la mitose. La perte de fonction
des homologues de Dgrip84 et Dgrip91, chez les levures S. pombe et S. cerevisiae, et de
Dgrip91 chez la drosophile entraîne des anomalies dans la morphologie des fuseaux qui
sont similaires aux défauts induits par la déplétion de la tubuline γ. Les cellules ralentissent
en mitose. Les fuseaux, souvent monopolaires ou avec des pôles mal séparés, ne permettent
pas la ségrégation correcte des chromosomes (Barbosa et al., 2000; Geissler et al., 1996;
Knop et al., 1997; Vardy and Toda, 2000). Chez le mutant Dgrip91 de drosophile, cela se
traduit par une augmentation de l’aneuploïdie dans les neuroblastes et les spermatocytes
(Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000). Comme pour la tubuline γ, les fuseaux
monopolaires pourraient traduire des défauts dans la fonctionnalité des microtubules
responsables de la séparation des pôles.
Ainsi, les trois protéines du γ-TuSC (tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91) jouent un rôle
majeur dans l’organisation d’un fuseau de division fonctionnel. Il convient d’analyser la
fonction de Dgrip84 afin de pouvoir comparer le rôle des 3 protéines du γ-TuSC dans un
même organisme métazoaire comme la drosophile.
Le rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules
n’a été abordé que chez S. pombe où la fonction des protéines Gfh1p (Dgrip75) et Alp16
(Dgrip163) a été analysée. Les cellules mutantes pour Gfh1 (Dgrip75) présentent des
défauts de polarité de croissance mais l’organisation globale des fuseaux mitotiques est
normale. Seul un détachement des microtubules astraux est observé au niveau des SPBs au
cours de la mitose suggérant que Gfh1p est nécessaire à l’ancrage des microtubules astraux
(Venkatram et al., 2004). La surexpression des protéines Gfh1p (Dgrip75) ou Alp16
(Dgrip163) provoque des défauts d’organisation des fuseaux, comme des fuseaux
monopolaires, comparables à ceux induits par la perte de fonction des gènes codant les
protéines du γ-TuSC (Fujita et al., 2002; Vardy and Toda, 2000; Venkatram et al., 2004).
34
Par contre, la perte de fonction de Alp16 (Dgrip163) n’entraîne aucun défaut en mitose
(Fujita et al., 2002).
Le rôle des protéines associées à la tubuline γ dans les étapes post-métaphasiques
chez un métazoaire n’a été abordé que pour Dgrip91 lors de la méiose male chez la
drosophile. Comme pour les mutants de tubuline γ, l’analyse des spermatocytes du mutant
Dgrip91 a mis en évidence un fuseau central mal organisé et une cytocinèse abortive ou
asymétrique (Barbosa et al., 2003). Dgrip91 pourrait donc intervenir lors des phases
tardives de la division cellulaire.
• Rôle des protéines associées à la tubuline γ dans la maturation/duplication du
centrosome
Le recrutement de la tubuline γ aux pôles du fuseau est essentiel pour la formation
d’un fuseau mitotique fonctionnel. Les orthologues de Dgrip91 sont nécessaires à la
localisation de la tubuline γ au niveau des centrosomes reconstitués à partir du sperme et
d’extraits d’œufs des xénope in vitro, ainsi que chez la drosophile in vivo (Barbosa et al.,
2000; Martin et al., 1998; Vardy and Toda, 2000; Zhang et al., 2000). Chez S. pombe, Alp4
(Dgrip84) est aussi nécessaire à la localisation de la tubuline γ et de Alp6 (Dgrip91) au
SPB. Les deux protéines associées à la tubuline γ dans le γ-TuSC jouent un rôle dans le
recrutement ou l’ancrage de la tubuline γ aux MTOCs. Chez S. cerevisiae, les protéines à
domaine « coiled-coil » Spc110 et Spc72 sont respectivement impliquées dans l’ancrage
des γ-TuSCs aux plaques internes et externes du SPB (Knop et al., 1997; Knop and
Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998). L’analyse des interactions de Spc97 et Spc98 avec
Spc110 et Spc72 montre que l’ancrage du γ-TuSC à la plaque externe dépend des deux
protéines Spc97 et Spc98, alors que l’ancrage du γ-TuSC à la plaque interne dépend
principalement de Spc98 (Nguyen et al., 1998). Ainsi, les deux protéines du γ-TuSC jouent
des rôles différents dans l’ancrage de la tubuline γ à la plaque interne chez S. cerevisiae.
CGNAP/Kendrine/péricentrine et CP309 seraient des homologues de Spc110 chez les
mammifères et la drosophile, respectivement. Ces protéines sont impliquées dans l’ancrage
35
de la tubuline γ via leurs interactions avec les protéines du γ-TuSC (Takahashi et al., 2002;
Zimmerman et al., 2004). Ces données confirment le rôle des deux protéines du γ-TuSC
dans l’ancrage de la tubuline γ au centrosome.
Chez la levure S. pombe, les protéines spécifiques du γ-TuRC sont recrutées
normalement dans les mutants Alp4 (Dgri84) et Alp6 (Dgrip91) (Vardy and Toda, 2000;
Venkatram et al., 2004). D’autre part, la perte de fonction des protéines spécifiques du γ-
TuRC, Alp16 (Dgrip163) et Gfh1p (Dgrip75), n’affecte ni le recrutement de la tubuline γ,
ni celui des protéines Alp4 (Dgrip84) et Alp6 (Dgrip91) au SPB, ni la formation d’un
complexe γ-TuC de grande taille (Venkatram et al., 2004). Chez S. pombe, au moins une
fraction d’un complexe contenant les trois protéines tubuline γ-Alp4-Alp6, équivalent au γ-
TuSC, pourrait donc être recrutée au centrosome indépendamment des autres protéines du
complexe. Ces données sont en désaccord avec un modèle de recrutement de la tubuline γ
exclusivement via le γ-TuRC pour la nucléation des microtubules. L’analyse de la fonction
des protéines spécifiques du γ-TuRC chez un métazoaire n’a pas été réalisée. Elle pourrait
permettre une meilleure compréhension des mécanismes de nucléation.
Dans les neuroblastes de drosophile, la perte de fonction de Dgrip91 affecte le
recrutement de protéines nécessaires à la maturation du PCM (Barbosa et al., 2003;
Barbosa et al., 2000). Comme dans le mutant drosophile de tubuline γ et dans les cellules
de drosophile en culture traitées par RNAi contre la tubuline γ, Cnn est détectée sous la
forme de points de taille et d’aspect irréguliers, suggérant une cohésion anormale du PCM.
De plus, le recrutement de CP190 est réduit (Barbosa et al., 2000). En microscopie
électronique, une distribution anormale des centrioles est observées aux pôles. Certains
pôles présentent plus de deux centrioles et d’autres n’en ont aucun. Ces phénotypes sont
identiques à ceux induits par la perte de fonction de la tubuline γ. Ils démontrent
l’implication de Dgrip91 dans la séparation ou la duplication des centrosomes. Les
centrioles observés dans les neuroblastes mutants sont plus courts suggérant que Dgrip91
pourrait être impliquée dans la maturation des centrioles, comme la tubuline γ.
Les données obtenues chez S. cerevisiae rendent plus complexes l’interprétation des
données obtenues chez la drosophile. Les analyses en microscopie électronique montrent
36
que la perte de fonction de SPC97 (Dgrip84) induit des défauts à la fois dans la duplication
et dans la séparation des SPBs alors que dans les mutants SPC98 (Dgrip84) ces structures
sont correctement dupliquées et capables de se séparer (Geissler et al., 1996; Knop et al.,
1997). Par conséquent, les deux protéines du γ-TuSC jouent des rôles différents dans la
duplication du SPB chez S. cerevisiae.
• Rôle des protéines associées à la tubuline γ au cours de l’ovogenèse
Chez les métazoaires, très peu de données sont disponibles concernant la fonction
des protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules. Chez la
drosophile, seul le rôle de Dgrip75 a été étudié au cours de l’ovogenèse. Le mutant
Dgrip75 présente des défauts de localisation de l’ARN maternel bicoid qui est dépendante
des microtubules, alors que la localisation d’autres déterminants maternels n’est pas
affectée (Schnorrer et al., 2002). Dgrip75 serait impliquée dans la fonctionnalité de certains
réseaux de microtubules dans l’ovocyte. Ces résultats ainsi que les données chez la levure
S. pombe suggèrent que les protéines spécifiques du γ-TuRC ne sont pas nécessaires à
l’organisation globale du réseau microtubulaire mais paraissent plutôt impliquées dans
l’assemblage de sous réseaux.
• Rôle dans la dynamique des microtubules
In vitro, les γ-TuRC purifiés à partir d’extraits de xénope ou d’embryons de
drosophile se lient à l’extrémité moins des microtubules et réduisent sa dynamique
(Keating and Borisy, 2000; Moritz et al., 2000; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al.,
1995).
De manière comparable avec la tubuline γ, les protéines qui lui sont associées sont
impliquées dans la régulation de la dynamique des microtubules. L’analyse des mutants des
gènes codant les orthologues de Dgrip84, Dgrip91 et Dgrip163 chez les levures S. pombe et
S. cerevisiae a montré que les microtubules cytoplasmiques sont anormalement longs et
courbés, suggérant qu’ils sont stabilisés (Fujita et al., 2002; Geissler et al., 1996; Knop et
al., 1997; Vardy and Toda, 2000; Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005).
Ces phénotypes sont comparables à ceux observés dans des mutants de la tubuline γ chez
37
ces deux levures (Marschall et al., 1996; Paluh et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995; Spang
et al., 1996). De plus, des mutants Alp4 (Dgrip84), Alp6 (Dgrip91) et Alp16 (Dgrip163)
chez S. pombe montrent une hypersensibilité aux drogues déstabilisatrices des microtubules
(ThiaBendaZole ou TBZ) (Fujita et al., 2002; Vardy and Toda, 2000; Zimmerman and
Chang, 2005). Chez S. pombe, l’utilisation de lignées exprimant une tubuline α-GFP
comportant une mutation dans le gène Alp4 (Dgrip84) montre un rôle de cette protéine dans
la dynamique de l’extrémité plus des microtubules en interphase. Les microtubules sont
plus longs et présentent une diminution des taux de catastrophes à l’extrémité plus par
rapport aux cellules sauvages. Ils se courbent au niveau du cortex suggérant qu’ils sont
stabilisés (Zimmerman and Chang, 2005).
Ces expériences suggèrent un rôle des γ-TuRCs dans la dynamique de l’extrémité
plus des microtubules chez la levure. Les protéines du γ-TuRCs seraient nécessaires à la
déstabilisation de l’extrémité plus des microtubules en interphase et en mitose. Des
expériences complémentaires sont nécessaires à la compréhension de ces mécanismes de
régulation de la dynamique, en particulier chez les animaux.
38
Au début de mon travail de thèse, la fonction des protéines associées à la tubuline γ
dans les complexes γ-TuSC et γ-TuRC était très mal connue. Les principales analyses
avaient été réalisées en mitose chez les levures S. pombe et S. cerevisiae, et uniquement
Dgrip91 et Dgrip75 (uniquement lors de l’ovogenèse) avaient été étudiées chez un
métazoaire, la drosophile (Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000; Fujita et al., 2002;
Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997; Schnorrer et al., 2002; Vardy et al., 2002;
Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005). La transposition des fonctions
caractérisées chez les levures aux métazoaires présente plusieurs difficultés. Le centrosome
et le SPB sont des structures morphologiquement différentes. D’autre part, les protéines
associées à la tubuline γ chez les levures présentent peu d’homologies avec les protéines
dans d’autres organismes, comme les mammifères. Enfin, la nature des complexes de
tubuline γ est différente entre les levures et les animaux, en particulier chez S. cerevisae où
seul un petit complexe est présent. Mon projet a été d’étudier la fonction relative des deux
complexes, le γ-TuSC et le γ-TuRC, chez les animaux. La stratégie adoptée consiste à
analyser les conséquences de la déplétion par RNAi de la tubuline γ et des protéines
associées (protéines du γ-TuSC et du γ-TuRC) sur l’organisation et la dynamique des
microtubules au cours du cycle cellulaire, dans les cellules de drosophile en culture.
Le travail que j’ai réalisé a consisté en l’étude du :
(1) rôle des protéines du γ-TuSC dans l’organisation des microtubules en mitose, en
particulier de Dgrip84 dont la fonction n’avait jamais été abordée chez les
métazoaires.
(2) rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules en
mitose.
(3) rôle du γ-TuSC et du γ-TuRC dans l’organisation et la dynamique des microtubules
en interphase.
(4) mode de régulation des protéines associées à la tubuline γ
39
RESULTATS
I- Etude du rôle d’une protéine du γ-TuSC, Dgrip84, au cours
de la division cellulaire
Voir Colombié et al., Mol. Biol. Cell., 2006.
Les données sur la fonction des protéines associées à la tubuline γ dans le γ-TuSC
sont limitées aux levures S. pombe et S. cerevisiae et à une seule protéine, Dgrip91, chez la
drosophile. Chez les deux levures, les deux protéines associées à la tubuline γ dans le γ-
TuSC sont essentielles à la viabilité (Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997; Vardy and
Toda, 2000). Chez la drosophile, Dgrip91 est également essentielle à la viabilité des
individus (Barbosa et al., 2000). Chez S. cerevisiae, la comparaison des fonctions de Spc97
(Dgrip84) et Spc98 (Dgrip91) a montré des divergences. En effet, elles jouent des rôles
différents dans la duplication du SPB et l’ancrage de la tubuline γ à la plaque interne du
SPB (Geissler et al., 1996; Knop and Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998). Afin de
comparer la fonction des protéines du γ-TuSC chez un métazoaire, nous avons entrepris
l’étude de la protéine Dgrip84 au cours de la division cellulaire chez la drosophile. Trois
mutants du gène Dgrip84 chez la drosophile ont été générés et caractérisés par N.
Colombié. La mutation la plus faible ne permet l’éclosion que de 50% des adultes, alors
que les deux autres mutants dont le mutant nul (R20) sont létaux précocement (stades
larvaires L1-L2) au cours du développement. Dgrip84 est donc une protéine essentielle
chez la drosophile (N. C.). Les neuroblastes sont les cellules de larves L3 en division les
plus accessibles à ce stade qui permettent de réaliser une étude de l’organisation des
fuseaux mitotiques in vivo en s’affranchissant de la contribution maternelle. Cependant, ces
cellules présentent des tailles hétérogènes et des figures mitotiques souvent asymétriques
avec des microtubules astraux difficiles à discerner. L’analyse des mutants pouvant
présenter quelques limites d’interprétation, j’ai réalisé une analyse complémentaire des
40
phénotypes mitotiques induits après inhibition de l’expression de la protéine Dgrip84 par
RNAi dans des cellules S2 de drosophile en culture. L’analyse du réseau microtubulaire
peut être plus fine qu’in vivo et peut être complétée par des observations en microscopie
électronique.
Les mutations de Dgrip84 ainsi que le traitement RNAi entraînent une augmentation
de 2 à 3 fois de l’index mitotique avec une accumulation des cellules au stade
prométaphase/métaphase. Dans le mutant R20, les cellules présentent des chromosomes
hypercondensés et environ 25% d’aneuploïdie, avec un point de contrôle mitotique activé
(présence de BubR1 aux kinétochores). Cependant, le ralentissement en mitose est
étonnement modéré.
Nous avons voulu comprendre ce faible ralentissement en mitose en utilisant en tant
que contrôle un traitement à la colchicine qui augmente de 10 fois l’index mitotique dans
les cellules en culture. Lorsque ce traitement à la colchicine est précédé d’un traitement
RNAi contre Dgrip84, l’index mitotique augmente de seulement de 4,5 fois. Ces données
suggèrent un nouveau rôle de Dgrip84 dans la régulation du point de contrôle mitotique.
La déplétion de Dgrip84 après RNAi et dans les mutants entraîne la formation de
fuseaux majoritairement monopolaires ou bipolaires asymétriques mal focalisés. L’analyse
des cellules en culture a permis de mettre en évidence une absence de microtubules astraux
après traitement RNAi. In vivo et dans les cellules en culture, les autres protéines du γ-
TuSC, la tubuline γ et Dgrip91, ne sont plus détectables aux pôles des fuseaux, ainsi que le
long des microtubules du fuseau métaphasique ou au niveau du fuseau central en
cytocinèse.
La maturation des pôles est aussi affectée par l’absence de la protéine Dgrip84. Asp,
une protéine localisée à l’extrémité moins des microtubules en mitose (Riparbelli et al.,
2002; Wakefield et al., 2001), présente une localisation anormalement dispersée en accord
avec des défauts de focalisation des pôles. La protéine Cnn, qui est recrutée au centrosome
en mitose (Megraw et al., 1999), n’est parfois localisée qu’à un seul pôle du fuseau et sa
distribution est ponctuée, suggérant une distribution incorrecte des centrosomes. En
microscopie électronique, les cellules S2 traitées par RNAi présentent un nombre de
centrioles supérieur à 2 allant parfois jusqu’à 4 centrioles au même pôle. Le mécanisme de
41
nucléation des microtubules à partir des centrioles, et non plus à partir du PCM, révélé en
absence de tubuline γ (Raynaud-Messina et al., 2004), est également observé après
déplétion de Dgrip84. Afin de comprendre les défauts de ségrégation des chromosomes en
absence de Dgrip84, les cellules S2 ont été perméabilisées en présence de calcium afin de
conserver uniquement les microtubules kinétochoriens qui correspondent à des faisceaux de
microtubules plus stables que les autres microtubules du fuseau. Un marquage d’une
protéine des centromères (Cid) et des études en microscopie électronique ne permettent pas
de mettre en évidence des défauts dans les contacts microtubules/kinétochores. Cependant,
ces contacts ne seraient pas suffisants pour permettre une mitose fonctionnelle.
N. Colombié a montré que Dgrip84 intervient également lors de la division
méiotique mâle. Dans les spermatocytes des individus dépourvus de la protéine Dgrip84, le
fuseau central présente des défauts d’organisation et la cytocinèse est abortive ou
asymétrique.
En interphase, aucun défaut n’est observé dans les cellules S2 ou in vivo en absence
de Dgrip84. Par contre, des expériences de renucléation après désassemblage des
microtubules par le froid dans les cellules en culture montrent que la déplétion de Dgrip84
engendre une diminution du nombre de points de renucléation et les microtubules ainsi
nucléés semblent plus longs. Ces résultats suggèrent que Drip84 joue un rôle dans la
nucléation des microtubules interphasiques et qu’elle pourrait être impliquée dans la
dynamique du cytosquelette microtubulaire en interphase.
Nous avons caractérisé la fonction de la troisième et dernière protéine du γ-TuSC
lors de la division cellulaire chez un métazoaire. Les résultats montrent un rôle de Dgrip84
dans la maturation du centrosome en mitose et dans l’organisation d’un fuseau fonctionnel
à la fois en mitose et en méiose. Les phénotypes obtenus après déplétion de Dgrip84 sont
identiques à ceux obtenus après la perte de fonction des deux autres protéines du γ-TuSC :
la tubuline γ (Raynaud-Messina et al., 2004; Sunkel et al., 1995) et Dgrip91 (Barbosa et al.,
2003; Barbosa et al., 2000). Les trois protéines du γ-TuSC sont donc essentielles et non
redondantes. Ainsi, l’intégrité du complexe γ-TuSC serait nécessaire au recrutement de la
42
tubuline γ au centrosome et à sa fonction de nucléation et d’organisation des microtubules
au cours de la division cellulaire.
Molecular Biology of the CellVol. 17, 272–282, January 2006
The Drosophila �-Tubulin Small Complex SubunitDgrip84 Is Required for Structural and Functional Integrityof the Spindle Apparatus□D
Nathalie Colombie,* Christel Verollet,* Paula Sampaio,† Andre Moisand,‡Claudio Sunkel,†§ Henri-Marc Bourbon,� Michel Wright,* andBrigitte Raynaud-Messina*
*Centre de Recherche en Pharmacologie-Sante, Unite Mixte de Recherche 2587, Centre National de laRecherche Scientifique-Pierre Fabre, Institut de Sciences et Technologies du Medicament de Toulouse, 31400Toulouse, France; �Centre de Biologie du Developpement, Unite Mixte de Recherche 5547, Centre National dela Recherche Scientifique-Universite Paul Sabatier, Institut d’Exploration Fonctionnelle des Genomes, 31062Toulouse, France; †Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universitade do Porto, 4150-180 Porto, Portugal;§Instituto de Ciencias Biomedicas Abel Salazar, Universidade do Porto, 4099-003 Porto, Portugal; and ‡Institutde Pharmacologie et de Biologie Structurale, Unite Mixte de Recherche 5089, 31077 Toulouse, France
Submitted August 4, 2005; Accepted October 5, 2005Monitoring Editor: Tim Stearns
�-Tubulin, a protein critical for microtubule assembly, functions within multiprotein complexes. However, little is knownabout the respective role of �-tubulin partners in metazoans. For the first time in a multicellular organism, we haveinvestigated the function of Dgrip84, the Drosophila orthologue of the Saccharomyces cerevisiae �-tubulin-associatedprotein Spc97p. Mutant analysis shows that Dgrip84 is essential for viability. Its depletion promotes a moderate increasein the mitotic index, correlated with the appearance of monopolar or unpolarized spindles, impairment of centrosomematuration, and increase of polyploid nuclei. This in vivo study is strengthened by an RNA interference approach incultured S2 cells. Electron microscopy analysis suggests that monopolar spindles might result from a failure of centrosomeseparation and an unusual microtubule assembly pathway via centriolar triplets. Moreover, we point to an involvementof Dgrip84 in the spindle checkpoint regulation and in the maintenance of interphase microtubule dynamics. Dgrip84 alsoseems essential for male meiosis, ensuring spindle bipolarity and correct completion of cytokinesis. These data sustainthat Dgrip84 is required in some aspects of microtubule dynamics and organization both in interphase and mitosis. Thenature of a minimal �-tubulin complex necessary for proper microtubule organization in the metazoans is discussed.
INTRODUCTION
The mechanisms of microtubule nucleation remain unclear,although it has been demonstrated that �-tubulin, a univer-sal component of the microtubule-organizing centers, playsan essential role in microtubule nucleation. The moleculardetails of this process are still poorly understood (Oakleyand Oakley, 1989; Oakley et al., 1990; Erickson and Stoffler,1996; Gunawardane et al., 2003). In vitro, �-tubulin mono-mers enhance the assembly of �/� heterodimers and blockthe minus ends of microtubules (Li and Joshi, 1995; Leguy etal., 2000). However, in vivo, �-tubulin does not seem to act asa monomer, but rather in a variety of protein complexes(Murphy et al., 1998; Oegema et al., 1999; Fujita et al., 2002).The simplest one called �-tubulin small complex (�-TuSC)has been well characterized in Saccharomyces cerevisiae (Knop
et al., 1997), Drosophila melanogaster (Oegema et al., 1999), andvertebrates (Murphy et al., 1998). It is formed by �-tubulinand two associated proteins in a 2:1:1 stoichiometry (Knopand Schiebel, 1997; Oegema et al., 1999; Murphy et al., 2001).This small complex is recruited at the inner and outer spin-dle plaques of S. cerevisiae spindle pole bodies (SPB) where itis responsible for microtubule nucleation (Knop andSchiebel, 1997, 1998; Pereira et al., 1998). Besides �-TuSC,other larger �-tubulin-containing complexes have been de-scribed (Zheng et al., 1995; Fujita et al., 2002). One termed�-tubulin ring complex (�-TuRC) has been characterized inmulticellular organisms such as D. melanogaster, Xenopuslaevis, and Homo sapiens (Zheng et al., 1995; Oegema et al.,1999; Murphy et al., 2001). It is assumed that the �-TuRCresults from the association of several �-TuSCs with at leastfour other proteins. Three of them show sequence homolo-gies (grip motifs) with the two �-tubulin-associated proteinsin the �-TuSC, whereas the fourth exhibits five WD repeats(Fava et al., 1999; Gunawardane et al., 2000; Moritz et al.,2000; Murphy et al., 2001; Gunawardane et al., 2003). Thefunction of �-tubulin has been studied extensively in severalorganisms and in cultured cells using antibody microinjec-tion, mutants or gene silencing (Oakley et al., 1990; Horio etal., 1991; Joshi et al., 1992; Sunkel et al., 1995; Marschall et al.,1996; Spang et al., 1996; Wilson and Borisy, 1998; Llamazares
This article was published online ahead of print in MBC in Press(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E05–08–0722)on October 19, 2005.□D The online version of this article contains supplemental materialat MBC Online (http://www.molbiolcell.org).
Address correspondence to: Brigitte Raynaud-Messina ([email protected]).
272 © 2005 by The American Society for Cell Biology
et al., 1999; Ruiz et al., 1999; Bobinnec et al., 2000; Sampaio etal., 2001; Raynaud-Messina et al., 2004). For example, inDrosophila where two �-tubulin isotypes are expressed, ho-mozygous �-tub 23C mutants die during late larval stage,exhibiting atypical mitotic spindles and abnormal centroso-mal structures (Sunkel et al., 1995), whereas disruption of the�-tub 37CD gene results in abnormal female meiotic spindles(Tavosanis et al., 1997). However, our knowledge about thefunction of the �-tubulin-interacting proteins is limited. Therole of the two grip proteins associated with �-tubulin in the�-TuSC has been studied both in budding and fission yeasts(Geissler et al., 1996; Knop et al., 1997; Nguyen et al., 1998;Vardy and Toda, 2000; Vardy et al., 2002). Deletions of eachof these genes (SPC97 and SPC98 in S. cerevisiae, Alp4 andAlp6 in Schizosaccharamyces pombe) are lethal; they inducemitotic defects and abnormal long cytoplasmic microtu-bules. However conditional mutants show phenotypic dif-ferences (Geissler et al., 1996; Marschall et al., 1996; Spang etal., 1996; Knop et al., 1997). In S. cerevisiae, Spc98p seemscritical for �-tubulin anchorage to the inner spindle plaquevia direct interaction with Spc110p (Nguyen et al., 1998),whereas Spc97p seems essential for a correct SPB duplica-tion and separation (Knop et al., 1997). In fission yeast, Alp4mutations compromise �-tubulin localization to the SPB, butthey do not affect the assembly of the large �-tubulin com-plex (Vardy and Toda, 2000). These studies reveal discrep-ancies about the role of the two grip motif �-TuSC subunits,in particular in the SPB duplication/separation process andin the �-tubulin anchorage. Moreover, these results obtainedin yeasts are difficult to transfer to metazoans for severalreasons. First, the morphology of the microtubule-organiz-ing centers is different. Second, the amino acid sequences ofthese proteins are poorly conserved because Spc97p and itsDrosophila orthologue (Dgrip84) exhibit only 10% identityand 22% similarity. Third, in contrast with S. cerevisiaewhere�-tubulin relocalizes to the SPB as �-TuSC, in multicellularorganisms, it is assumed that �-tubulin is recruited to thecentrosome as �-TuRC. In metazoans, the silencing of �-tu-bulin-associated proteins (Dgrip91, the Spc98p orthologue,and Dgrip75) has been performed essentially in Drosophilaand does not induce similar phenotypes (Barbosa et al., 2000;Schnorrer et al., 2002). Dgrip91 is an essential protein, re-quired for correct bipolar spindle assembly during mitosisand male meiosis (Barbosa et al., 2000, 2003). In contrast,Dgrip75, a protein restricted to the large �-tubulin complex,is essential for female fertility, but not for viability. Muta-tions in Dgrip75 prevent the correct localization of somemorphogenetic determinants during oogenesis, suggesting arole in the organization/dynamics of some subsets of micro-tubules (Schnorrer et al., 2002).In this study, we have performed a functional analysis of
Dgrip84 during mitosis and male meiosis using two inde-pendent strategies (mutant strains and RNA interference[RNAi] in cultured cells). We have also approached the roleof this �-TuSC protein in the organization of microtubulecytoplasmic arrays. Dgrip84, as �-tubulin and Dgrip91, isessential for viability attesting that none of these three pro-teins is fully redundant.
MATERIALS AND METHODS
Cell Culture and RNA-mediated InterferenceRNA interference treatments were performed in S2 cells (Schneider, 1972)according to Clemens et al. (2000). Cells were treated twice with RNAi againstDgrip84 at days 1 and 5, and harvested on day 7 for immunoblotting andimmunofluorescence staining. Dgrip84 double-strand RNA (dsRNA) corre-sponding to positions 1–756 relative to the start of translation was used.
Comparable results have been obtained with dsRNA corresponding to posi-tions 885-1580 (our unpublished data). These dsRNAwere generated from thecDNA clone LD12257 as described in Raynaud-Messina et al. (2004). For coldmicrotubule depolymerization, cells were maintained for 2 h in melting ice.For drug depolymerization, colchicine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wasadded to culture medium to a final concentration of 25 �M and then incu-bated for 16 h.
Fly Strains and Generation of the R20 DeletionStrains y1w1118 and w1118 were used as controls, whereas strains l(1)tPG36(PG36/FM7) and l(1)tPG66 (PG36/FM7), carrying P-element insertions (Bour-bon et al., 2002), were named PG36 and PG66, respectively. To recoverexcision alleles, the PG66 element was mobilized by generating dysgenicfemales carrying the P[ry�, �2-3]99B Sb chromosome (Robertson et al., 1988),crossing them with w� FM7 males, and recovering w� Sb� FM7 balancerfemales. Male lethal strains were kept. One among these new Dgrip84 mutantlines, named R20 (R20/FM7), carries a genomic deletion that has been char-acterized by PCR on single whole third instar (L3) extracts (Gloor et al., 1993).For this purpose, we used gene-specific primers complementary to sequences(available upon request) localized between 1 kb 5� of the translation startcodon and the translation stop codon. Moreover, each of the mutant chromo-some, PG36, PG66, and R20 has been balanced over FM7, P[Kr:Gal4], P[UAS:GFP] (Casso et al., 2000). These strains were used to select the male mutantlarvae, which were not fluorescent under the stereomicroscope because theydid not possess the green fluorescent protein (GFP)-carrying balancer chro-mosome.
P-Element-mediated Germline Transformation and Testsfor Rescuing Dgrip84 LethalityThe cDNA clone RE10613 was sequenced using internal primers designedspecifically for that purpose. Compared with the genomic DNA sequenced bythe Berkeley Drosophila Genome Project, two point mutations were detected.Thus, the 4.7-kb NsiI/BglII fragment from RE10613 was subcloned into theLD12257 incomplete clone (digested by NsiI/BglII) to get a wild-type com-plete clone, termed RE84. A 2.7-kb EcoRI/XbaI fragment from the RE84 clonewas subcloned into the pUbHB1 vector (Calgaro et al., 2002) to yield thepUb84 construct. The 5.2-kb NotI/XmnI fragment from pUb84 was subclonedinto the NotI/StuI site of the transformation vector pCaSpeR (Thummel andPirrotta, 1992), to give rise to the final rescue construct, P[Ub84,w�]. W�
embryos were coinjected with P[Ub84,w�] and pUChs�2-3 (Mullins et al.,1989), by standard techniques (Rubin and Spradling, 1982). Emerging adultswere crossed individually to w� flies, and w� transformant progeny wasselected. More than 20 independent lines were recovered, chromosomal link-age was determined by crosses with a multiple balancer stock, and homozy-gous stocks were established. Three transformant lines carrying theP[Ub84,w�] construct on the second chromosome (lines 10, 12, and 17) weretested for rescuing the lethality of PG36, PG66, and R20 hemizygous males.Rescue was assessed by scoring for surviving male progeny with the geno-type w�, Dgrip84�/Y; P[Ub84,w�]/�.
AntibodiesThe mouse monoclonal antibodies T-5168 (Sigma-Aldrich) and 1501 (Chemi-con International, Temecula, CA) were used to stain for �-tubulin and actin,respectively. The following rabbit polyclonal antibodies were used: Rb3133against Asp (Saunders et al., 1997) and GM2 against Pav-KLP (Minestrini et al.,2003; gifts from Dr. Glover, University of Cambridge, Cambridge, UnitedKingdom), R19 against Cnn (Heuer et al., 1995; gift from Dr. Kaufman,Howard Hughes Medical Institute, Indiana University, Bloomington, IN), Cidagainst a H3-like protein used as a centromere identifier (Henikoff et al., 2000;gift from Dr. Henikoff, Howard Hughes Medical Institute, Seattle, WA),Rb666 against BubR1 (Logarinho et al., 2004), R62 against 23C �-tubulin(Raynaud-Messina et al., 2001), R522 against Dgrip84, and R7075 againstDgrip91. R522 was raised against the 15 carboxy-terminal amino acids ofDgrip84 and affinity purified on recombinant Dgrip84, produced in Esche-richia coli from the clone pRE84. Under the conditions used for Westernblotting of cultured S2 cells and L3 larval brain extracts, R522 antibodiesspecifically recognized a polypeptide with an apparent mass of 97 kDa. Thislabeling was abolished when antibodies were preincubated with the antigenicpeptide. R7075 was raised against the 414-917 amino acid region of Dgrip91.
Western BlottingProtein extracts from cultured S2 cells (Raynaud-Messina et al., 2001) andfrom total brains were subjected to Western blot analyses as described pre-viously. Total brain extracts were prepared from about 10 brains of eachgenotype, dissected in saline (0.7% NaCl), boiled for 3 min in 2� Laemmlisample buffer and diluted twice.
Cytological AnalysesThe percentages of the different mitotic phenotypes were determined withconfidence intervals calculated for a probability of 95%. For immunostaining,
Role of Dgrip84 during Cell Division
Vol. 17, January 2006 273
cultured S2 cells were fixed in DES culture medium (Invitrogen, CergyPontoise, France) containing 3.7% vol/vol paraformaldehyde (20 min forantibodies R62, R522, Rb666, and Rb3133; 2 min for antibodies Cid, R7075,and R19), permeabilized for 2 min in methanol (�20°C) (Raynaud-Messina etal., 2004), and then incubated with antibodies. For Cid staining, 1-min prein-cubation in DES medium containing 0.05% Triton X-100 and 0.1 mM CaCl2was performed. Mitotic indices were quantified after 4,6-diamidino-2-phe-nylindole (DAPI) staining and �-tubulin (or Centrosomin) immunofluores-cence analysis on fixed preparations or by mitotic spread of the whole cellularsuspension stained with DAPI. Immunostaining of semisquashed L3 larvalbrains was performed as described in Bonaccorsi et al. (2000). DAPI stainingof squashed L3 larval brains were made as described previously (Sunkel et al.,1995). Testes immunostaining was carried out as described in Pisano et al.(1993). For analysis of live testes by phase contrast microscopy, testes weredissected in 0.7% NaCl, transferred onto a clean slide in a drop of NaCl, andcut with tungsten needles near the apical tip to release the cysts through thetestes wall. The testes were gently squashed on the slide with a coverslip byapplying a small piece of blotting paper to one of the edges of the coverslip,while monitoring under a 40� phase contrast objective. Testes were obtainedfrom young dark pupae (PG36), young adults (PG36), or L3 larvae (PG66 andR20). For electron microscopy, cells were fixed and treated as described(Raynaud-Messina et al., 2004).
RESULTS
Characterization of Dgrip84 mutantsA screen carried out to generate recessive lethal P-elementinsertions within X-linked genes allowed the isolation of twoDgrip84 mutant alleles, PG66 and PG36 (Bourbon et al.,2002). These two insertions are located at positions�240 and�350 base pairs, respectively, from the translation initiationATG codon of the previously described Dgrip84 transcript(Oegema et al., 1999). To ensure that the lethality is due tothe insertion event, the PG66 element was remobilized, al-lowing the isolation of viable w� revertants, from which thew� transposon has been precisely excised. Among the gen-erated imprecise excisions of the P-element, we recovered anew lethal allele, R20, which bears a deletion covering alarge section of the coding sequence, including the initiationATG. Finally, three independent transgenic strains, express-ing the wild-type Dgrip84 protein under the control of theubiquitin-63E promoter (see Materials and Methods), are ableto complement the lethality induced by all three mutantalleles, demonstrating that Dgrip84 is essential for viability.Analysis of lethal phases indicates that R20 and PG66
mutants exhibit early lethality (Figure 1A), dying mainlyduring the first and second instars. In contrast, PG36 seems
to be semilethal (Figure 1A), allowing 50% of hemizygousmales to reach the adult stage after a 2-d delay. Thesemutant males show reduced viability (Figure 1A), are sterile,and exhibit abnormalities in the abdominal cuticle and thethoracic macrochaete pattern (our unpublished data), whichare common in mutations affecting mitosis. Together, theseobservations suggest an allelic series with the progressionPG36 � PG66 � R20.Dgrip84 protein level was determined for the different
alleles. Total protein extracts from wild-type L3 larval brainsas well as from hemizygous Dgrip84 mutant brains wereprobed with Dgrip84 antibodies (Figure 1B, top). Comparedwith the signal obtained in wild-type brain extracts, Dgrip84level is strongly reduced below the threshold of detection inthe three mutants. Immunofluorescence analysis shows thatin wild-type L3 larval brains Dgrip84 protein is undetectableduring interphase (our unpublished data) and is present atthe spindle poles throughout mitosis (Figure 1C). In con-trast, 99% of R20 mitotic cells are devoid of Dgrip84 signal(n � 468) (Figure 1C) consistently with the decrease ofDgrip84 levels on Western blots. Similar data were observedwith PG36 (our unpublished data). These results indicatethat Dgrip84 alleles are either null (R20) or severe hypomor-phic alleles (PG36 and PG66).
Dgrip84 Mutations Delay Progression through MitosisBecause �-tubulin complexes are necessary for cell division,mitotic phenotypes have been analyzed in L3 larval brains.For the three Dgrip84 mutants, the mitotic index is elevatedfour- to fivefold (Figure 2A), independently of the progres-sion of the allelic series. Cells accumulate in promet-aphases/metaphases, whereas the percentage of anaphases/telophases decreases (Figure 2B). In all prometaphase/metaphase mutant cells (98–100%, p � 95%), the mitoticcheckpoint is activated as evidenced by staining of kineto-chores with BubR1 antibodies (Figure 2B, inset). More thanhalf of the mutant cells exhibit overcondensed chromosomes(Figure 2C, b and c, and D), consistently with a delay in theprogression through prometaphase/metaphase stages. Mostof the mutant cells show disorganized metaphase plates(Figure 2C, c and d). The occurrence of 25% of cells withDNA content superior to 4N (Figure 2C, c and d, and E)
Figure 1. Characterization of Dgrip84 mu-tants. (A) The three Dgrip84 mutations inducedifferent patterns of lethality. One hundredfirst instars of each mutant genotype andwild-type (WT) were followed until adultstage. The percentage of live individuals—independently of the developmental stage—was determined. The PG66 and R20 allelesinduce an early lethality, whereas the PG36allele induces a belated lethality. (B) Dgrip84protein is not detectable in the brain of thethree mutants. Total protein extracts from L3larval brains (10 brains for each genotype)were submitted to Western blot analyses withaffinity-purified Dgrip84 antibodies (top). Ac-tin was used as an internal loading control(bottom). (C) Dgrip84 protein is recruited atthe centrosome during mitosis in wild-typelarval brains but was not detectable in larvalDgrip84 mutant neuroblasts. L3 larval brainswere probed with affinity-purified antibodies
against Dgrip84 protein (green). Wild-type neuroblasts showed Dgrip84 protein recruitment at the centrosome throughout mitosis, whereasDgrip84 is not detectable at the poles in R20 mutant neuroblasts at any mitotic stage. In all figures except Figure 6, the spindle is shown inred (anti-�-tubulin antibodies) and chromosomes in blue (DAPI staining). Bars, 5 �m.
N. Colombie et al.
Molecular Biology of the Cell274
suggests that these cells escaped the mitotic checkpoint with-out proper cytokinesis and progressed into a new cell cycle.The number of prometaphases/metaphases and the number offigures with overcondensed chromosomes are significantlylower (p � 95%) in PG36 (the weakest allele) than in R20 (thestrongest allele). Overall, these results suggest that Dgrip84 isrequired for cells to complete successfully mitosis.
Dgrip84 Mutant Cells Display Abnormal MicrotubuleOrganization in MitosisPrometaphase delays observed in theDgrip84mutants couldbe a consequence of defects in the mitotic apparatus. There-fore, we have studied the organization of the spindles in R20brains using microtubule staining. In comparison with wild-type brains, we observed a large frequency of cells (42%)with a monopolar or a highly abnormal microtubule orga-nization devoid of distinct polarity (Figure 3A; n � 1622).Conversely, there is a severe decrease in the frequency ofcells with normal bipolar spindles (Figure 3A; n � 1622). Alarge percentage (20%) of these bipolar spindles are asym-metrical as judged by microtubule density or/and polarfocalization. Mutant cells show abnormal distribution ofAbnormal spindle protein (Asp), a protein that accumulatesat the minus ends of microtubules (do Carmo Avides andGlover, 1999; Wakefield et al., 2001; Riparbelli et al., 2002). Inwild-type prometaphases, Asp occurs as a regular stainingon the side of the centrosome facing the spindle (Figure 3B,a). In R20 mutant brains, most cells with bipolar spindles(88%) show faint Asp signals at the poles (Figure 3B, b).Most monopolar spindles (60%) exhibit a single Asp dot atthe pole (Figure 3B, c), whereas the remaining shows abnor-mal Asp labeling at secondary sites. In cells devoid of mi-crotubule organization, Asp is detected but with an abnor-mal distribution (Figure 3B, d). In all cases, the signals seemweaker than in wild-type cells. These observations suggestthat Dgrip84 is necessary for proper organization of spindlemicrotubules.
Figure 3. Abnormal mitotic organization in R20 neuroblasts. (A)Percentage of bipolar spindles is decreased, whereas the percentage ofmonopolar and disorganized figures is increased. The percentage ofbipolar (BP), monopolar (MP), and disorganized (DIS) mitotic figureswas calculated using spindle labeling (�-tubulin antibodies) of nine L3larval brains for each genotype (WT, n � 910; and R20, n � 1622). (B)Mitotic cells exhibit Asp labeling at least at one pole. The Asp signal(green) is weaker in the mutant (b–d) than in the wild type (a). Mostbipolar (b; 97%), monopolar (c; 100%), and disorganized mitotic appa-ratus (d; 93%) exhibit a labeling with Asp antibodies (green). Disorga-nized microtubule figures exhibited two opposite dots (62%; d, arrow-heads), one dot (20%), or several dots (12%). Bars, 5 �m.
Figure 2. Mitotic phenotypes in Dgrip84mutants. Observations were made on L3 lar-val neuroblasts. (A) The mitotic index is in-creased in the three mutants. The percentageof mitotic figures was recorded on five brainsfor each genotype. Confidence intervals (inparentheses) are calculated for a probabilityof 95%. (B) Mutant neuroblasts accumulate inprometaphases/metaphases. For each geno-type, the different mitotic stages were re-corded in 250 cells undergoing mitosis(graph). The inset shows two typical controland mutant prometaphase figures, exhibitingBubR1 (in green) localized at the kineto-chores. (C) Abnormal chromosomal plates areobserved in R20mutant neuroblasts. L3 larvalbrains were squashed and stained with DAPI.a, Wild-type metaphase plate showing eight(4N) normally condensed chromosomes; b,mutant cell showing eight overcondensedchromosomes; c, aneuploid mutant cell withovercondensed chromosomes; and d, hyper-ploid mutant cell showing 32 chromosomes(16N). (D and E) Percentage of overcon-densed chromosomal figures (D) and the per-centage of hyperploid metaphase cells (E) areincreased in the three mutants. Five brainswere scored for each genotype. Chromosomeovercondensation was analyzed in 300 mi-totic cells. Bars, 5 �m.
Role of Dgrip84 during Cell Division
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Dgrip84 Mutant Cells Exhibit Abnormal CentrosomeMaturation�-Tubulin recruitment at the centrosome was analyzed inR20mitotic neuroblasts. Whereas �-tubulin is located at bothpoles of wild-type spindles, it is no longer detected at thepoles in mutant mitotic cells independently of their micro-tubule organization (Figure 4A). Defects at the spindle poleswere confirmed by centrosomin (Cnn) staining (Figure 4B).This centrosomal component, dispersed during interphase,is recruited to the pericentriolar matrix during mitosis (Liand Kaufman, 1996; Megraw et al., 1999). In wild-type neu-roblasts, spindle poles labeled with Cnn exhibit a sphericalsignal (Figure 4B, a) corresponding to functional centro-somes. In R20 mutant brains, one or two Cnn-containingbodies are detected in most mitotic cells (Figure 4B, b–d), incontrast to the complete absence of �-tubulin in these cells.Cnn-containing bodies show abnormal number, shape, orlocalization. Some cells contain only one dot, whereas othersexhibit two dots at the same pole (Figure 4B, c and d),suggesting that abnormalities in the duplication or/and inthe separation of centrosomes might have occurred. Among
these Cnn-containing bodies, a few have lost the sphericalshape and look large (Figure 4B, b, arrow) and/or irregular(Figure 4B, b, arrowhead). Cells with more than two dots arealso observed. Some of them exhibit a major fragmentedsignal or three to eight small Cnn bodies of various sizesdispersed within the mitotic apparatus, suggesting a frag-mentation of the pericentriolar material (our unpublisheddata). Hence, Dgrip84 is likely to be an essential element forthe correct maturation and organization of the pericentriolarmaterial during mitosis.
Mitotic Microtubule Organization after Depletion ofDgrip84 in Cultured S2 CellsIn Dgrip84 mutant strains, even when the maturation of thepericentriolar material is compromised, mitotic spindles, al-beit strongly abnormal, are present. To determine how thesespindles are generated, we carried out RNA-mediated inter-ference in cultured Drosophila S2 cells. Western blot analysisrevealed that Dgrip84 is undetectable after a 7-d treatment,whereas the level of actin is not altered.The mitotic index is increased (4% [3.4–4.6], n � 3771
compared with 1.2% [1–1.4], n � 10,020 in untreated cells).This mitotic arrest coincides with the maintenance of anactive mitotic checkpoint as judged by strong BubR1 signalsat kinetochores, whatever the spindle morphology (Supple-mental Figure A). Although both Dgrip84 mutation andRNAi treatment induce a significant mitotic accumulation,this increase is surprisingly moderate (3-fold). Three hy-potheses could explain this slight blockage: microtubuledefects after down-regulation of �-TuSC proteins are incom-petent to trigger an efficient spindle checkpoint; or theypromote another cell cycle checkpoint, preventing cells fromreaching mitosis; or the �-TuSC is involved in mitotic check-point regulation in a manner independent of microtubulenucleation and attachment functions. To discriminateamong these possibilities, we have determined mitotic indi-ces in Dgrip84-depleted cells exposed to a microtubule poi-son such as colchicine. We scored the mitotic index usingthree independent parameters: by monitoring chromosomecondensation on the whole cell population or on coverslip-fixed cells (data not shown) or by quantifying polar Cnnrecruitment (Table 1). Both criteria gave comparable results.Treatment with the anti-microtubule agent blocks cells inmitosis in an efficient manner (10-fold increase of the mi-totic index). Interestingly, this arrest is weakened when cellshave been previously submitted to Dgrip84 RNAi (only4-fold increase compared with control). Together with theincrease in aneuploidy in Dgrip84 mutants (see above), thesedata strongly suggest that Dgrip84 down-regulation induces
Figure 4. Abnormal centrosome organization in R20 mutants. (A)�-Tubulin is absent at the poles in mutant mitotic cells. Wild-typemitotic figures (a) show a �-tubulin signal (green) at both poles. Incontrast, in mutant brains, most mitotic cells are devoid of �-tubulinsignal, forming either bipolar spindles (BP, b), monopolar spindles(MP; c), or disorganized mitotic apparatus (DIS; d). A quantitativeview is underlying in the table. (B) Localization of Cnn is abnormalin Dgrip84 mutants. In wild type, the Cnn signal is detected as asingle dot at both poles in nearly all mitotic figures (a; table). Inmutant brains, the presence of two opposite Cnn dots (b) is ob-served only in a fraction of mitotic figures (table), whereas mitoticcells often exhibit one dot (c), two nonopposite dots (d), or morethan two dots. Besides these abnormalities, Cnn dots can be verylarge (b; arrow) or can exhibit an abnormal nonspherical shape (b;arrowhead). Bars, 5 �m.
Table 1. Quantification of mitotic indices after depletion of Dgrip84and/or colchicine treatment
% Cnn labeling
Control 2.5 (2–3)RNAi-Dgrip84 treated 6 (5–7)Control � colchicine 24 (20–28)RNAi-Dgrip84 treated � colchicine 10 (9–11)
Cells are treated twice with RNAi against Dgrip84, and 16 h beforeharvest they were exposed to 25 �M colchicine. Mitotic indices aredetermined after immunolabeling of the poles with Cnn whoserecruitment is insensitive to RNAi and colchicine treatments. Dataare representative of two independent experiments. n 100.
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an untimely exit of mitosis. It could explain, at least par-tially, why RNAi-treated cells fail to arrest efficiently theirmitotic progression. Accordingly with the analyses done inS. pombe and Aspergillus nidulans (Vardy and Toda, 2000;Hendrickson et al., 2001; Prigozhina et al., 2004), we supportthe hypothesis of a role of Dgrip84 in spindle checkpointregulation.Dgrip84 RNAi treatment affected the overall mitotic orga-
nization (Table 2). A main characteristic is a great increase inthe percentage of monopolar spindles (Table 2 and Figure5B, c, f, and i). Although the relative number of bipolarspindles remains unchanged, most are asymmetrical andabnormally elongated (Figure 5B, b, e, and h), often com-posed of large microtubule bundles with unfocused poles(Figure 5B, b). Interestingly, in contrast to control promet-
aphases, Dgrip84-depleted mitotic cells lack astral microtu-bules (Figure 5B, a–c, insets). Immunofluorescence analysisconfirmed that Dgrip84 protein is substantially depletedfrom the mitotic poles and along spindle microtubules (Sup-plemental Figure B and Table 3). The two other componentsof the �-TuSCs (�-tubulin and Dgrip91) also fail to be re-cruited to the poles in 95% of prometaphase figures (Sup-plemental Figure B and Table 3). Moreover, �-tubulin stain-ing is no longer detectable along spindle microtubules andto the midbody (our unpublished data). Therefore, the phe-notypes resulting from the depletion of Dgrip84 in culturedS2 cells are in all respects similar to the phenotypes observedin Dgrip84 mutants.Because Dgrip84 depletion affects microtubule organiza-
tion rather than their formation, we have next determinedwhether the poles retain some capacity to assemble micro-tubules. RNAi-treated cells still show a polar localization ofCnn (Figure 5B, b and c, and Table 3), but its recruitment isabnormal. Most cells containing bipolar spindles show twoCnn-labeled poles but with an asymmetrical distribution.When only one pole is stained, Cnn could occur as a singledot (Figure 5B, b), but in most cases three to four dots areobserved (Figure 5B, c). The distribution pattern of Cnnmight suggest an abnormal number of centriolar structuresat the pole(s). Immunostaining for the Asp protein inDgrip84-depleted cells gives strong support for this inter-pretation. This microtubule minus end marker is still clus-tered around the pole(s) (Table 3) but mostly occurs as oneor multiple irregular structures (Figure 5B, e and f). Thissuggests that most of the microtubules retain their normalorientation but are organized from several microtubule nu-cleation centers. Electron microscopy (EM) analysis supports
Table 2. Quantification of mitotic progression after depletion ofDgrip84
Mitotic stages Control % Treated %
Prophases 15 (8–22) 7 (2–12)PrometaphasesNo polarity 1 (0–3) 10 (5–15)Monopolar spindles 1 (0–3) 24(16–32)Bipolar spindles 53(43–63) 54(45–63)
Late stages 30(21–39) 5 (1–9)
Mitotic stages were determined after chromosome staining (DAPI)and immunolabeling of microtubules (�-tubulin antibodies). Dataare representative of three independent experiments. n 100.
Figure 5. Characterization of microtubulearrays after Dgrip84 depletion in culturedcells. (A) Dgrip84 level is strongly reducedafter RNAi treatment. A total protein extract(50 �g) of control cells (C) or of cells subjectedto RNAi treatment (T) was analyzed by im-munoblotting using affinity-purified Dgrip84antibody and antibody directed against actin(internal loading control). (B and C) Dgrip84is essential for the correct bipolar organiza-tion of the spindle. (B) Immunofluorescenceanalyses. The staining in green corresponds tothe mitotic polar markers, Cnn (a–c) and Asp(d–f), or to the centromeric marker Cid (g–i).For a–c, white and black insets represent mi-crotubule staining at the poles. For Cid stain-ing, calcium pretreatment was performed toselectively disassemble astral microtubules.Bars, 5 �m; For e, f, and h, same bar than in i.(C) Electron microscopy characterization of amonopolar spindle. Microtubules emanatefrom the centriolar microtubule triplets (ar-rows) at a polar region defined by a cluster ofsupernumerary centrioles. In this section, onemicrotubule (arrowheads) extends all the wayfrom the centrioles to the kinetochore surface(Kt; surrounded in black) of the chromosome(Ch). Bar, 0.2 �m. (D) Dgrip84 is required forthe organization and the maintenance of thedynamics of interphase microtubules. Inter-phase microtubule array (�-tubulin immuno-staining) is monitored after cold microtubuledepolymerization (2 h at 4°C) followed by2-min incubation at 22°C in control (a) or inDgrip84-depleted cells (b). Bars, 5 �m.
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the view that at least some poles possess supernumerarycentrioles (Figure 5C). Interestingly, we could not clearlydetect microtubules radiating from pericentriolar material,but numerous microtubules occur in continuity with thecentriolar microtubule triplets (Figure 5C, arrows). There-fore, these abnormal centrosome-like structures retain somemicrotubule nucleation/organization capacity, but mostlikely through an atypical assembly pathway.Because Dgrip84 mutants show defects in prometaphase
chromosome congression, we have next determinedwhether spindle microtubules in Dgrip84-depleted cells areable to establish stable end-on interactions with kinetochoresusing Cid as a centromere marker (Henikoff et al., 2000).Before immunostaining, cells were preincubated with buffercontaining calcium, which selectively dissociates nonkinet-ochore microtubules (compare Figure 5B, a with g). In cellsshowing either mono- or bipolar spindles, most kineto-chores occur in the vicinity of microtubule bundles (Figure5B, h–i), suggesting that kinetochores specifically associatewith the plus ends of microtubule bundles. However, incontrast to control cells, in Dgrip84-depleted conditions,chromosomes are often found not aligned, closely posi-tioned to the poles or distributed along the spindle. Similarresults have been obtained after immunolabeling with theBubR1 marker (Supplemental Figure A). EM analysis furthersupports this result. In cells depleted for Dgrip84, bundles ofmicrotubules running from the spindle pole made contactwith individual chromosomes at the kinetochores (Figure5C). Within these kinetochore-fibers, some microtubulesseem to be elongated from centriolar triplets (Figure 5C,arrowheads). Even though the spindles are not fully func-tional, our results show that without detectable �-TuSCcomponents at the poles, the mitotic microtubules are stillable to establish an interaction with the kinetochores. How-ever, we cannot determine whether these microtubules areelongated at kinetochores (Maiato et al., 2004), whether ki-netochores capture microtubules abnormally assembled atcentrosomal level, or whether both mechanisms contributeto kinetochore fiber assembly.
Dgrip84–RNAi Treatment Induces Subtle Effects onInterphase Microtubule NetworkDepletion of Dgrip84 does not induce obvious cytoskeletaldefects during interphase. Microtubule arrays do not radiatefrom a unique site but is organized into a dense networkemerging from multiple points. EM analysis shows the pres-ence of centrosome-like structure, from which emerge orconverge none or very few microtubules (our unpublished
data). All the pericentriolar markers we tested (�-tubulin,Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, Dgrip128, and Dgrip163) do notstain this structure (our unpublished data), suggesting acentrosome with little or none pericentriolar material. Theantibody against �37CD-tubulin, which exhibits biochemicalcharacteristics of a centriolar component, decorates a spot atthe periphery of the nuclear envelope only in late G2(Raynaud-Messina et al., 2004). Together, our results suggestthat interphase centrosomes are not fully competent formicrotubule organization in S2 cells. The same hypothesishas been drawn for interphase centrosomes in larval braincells (Martinez-Campos et al., 2004). The existence of variousfocalization points and the complexity of interphase cy-toskeleton organization could prevent the observation of aparticular phenotype after inhibition of Dgrip84. After colddisassembly, microtubule regrowth occurred from severalpoints without any preferential focalization, both in controland RNAi-treated cells (Figure 5D, a and b). However, adecrease in the number of regrowth points and the appear-ance of abnormally long cytoplasmic microtubules are no-ticed in Dgrip84-depleted cells (Figure 5D, b) compared withcontrol. This phenotype occurs from 1 min at 22°C andmaintained for longer regrowth times. These experimentspoint to a potential role of Dgrip84 in the organization andthe dynamics of the microtubules during interphase.
Dgrip84 Is Also Required for SpermatogenesisBesides its role during mitosis, Dgrip84 also seemed to berequired for spermatogenesis because the adult PG36 mu-tant males are sterile. Moreover, it is known that the spindleintegrity checkpoint is less stringent during meiotic divi-sions than during neuroblast mitosis (Giansanti et al., 2001).Therefore, this peculiarity has allowed us to gain someinformation on the evolution of mitotic figures in Dgrip84-silencing conditions. In wild-type, meiosis results in theformation of a cyst containing 64 spermatids. During the“onion stage,” each one consists of a single round phase-light haploid (N) nucleus associated with a phase-densespherical mitochondrial aggregate of similar size, called theNebenkern (Figure 6A, a). In adult mutant males, most ofthe scored cysts display only 16 spermatids, suggesting thatDgrip84 is necessary for the proper completion of the twomeiotic divisions. Moreover, almost all the spermatids showabnormalities in the number and/or size of Nebenkerns andnuclei. The most frequent abnormalities we noticed were 1)spermatids exhibiting a 1:1 ratio of nuclei to Nebenkern andnuclei with a size compatible with a tetraploid content (Fig-ure 6A, b); 2) spermatids showing many nuclei of the same
Table 3. Accumulation of centrosomal components in mitotic cells after depletion of Dgrip84 in cultured cells
Staining
Treated, %
Control, % Bipolar
One pole Both poles Monopolar One pole Both poles
Dgrip84 4 (1–7) 88 (82–94) 5(1–9) 4 (1–7) 6 (2–10)�-Tubulin 3 (0–6) 97(94–100) 0 0 10 (3–17)Dgrip91 7(2–12) 93 (88–98) 1(0–3) 2 (0–4) 0Asp 100 100 1 (0–2) 98(96–100)Cnn 5 (1–9) 95 (91–99) 100 35 (27–43) 65 (57–73)
Microtubules were stained with antibodies against �-tubulin and chromosomes with DAPI, whereas the spindle poles were immunostainedwith antibodies against Dgrip84, �-tubulin, Dgrip91, Asp, or Cnn. n 100.
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size or of various sizes but only one large Nebenkern (Figure6A, c); and 3) spermatids with many Nebenkerns and one orseveral nuclei. According to previous studies (Sunkel andGlover, 1988), these abnormalities could be the conse-quences of defects in mitochondria localization on the spin-dle, failure of cytokinesis, or defects in the fidelity of chro-mosome segregation and karyokinesis.To further investigate the organization of the microtubule
cytoskeleton in mutant meiosis, observations of live sper-matocytes by phase contrast microscopy and immunostain-ing of fixed preparations have been carried out. In wild-typeprimary spermatocytes, two asters are organized from theduplicated centrosomes and begin to separate at the onset ofmeiosis. In contrast, in mutant primary spermatocytes thesetwo microtubule asters are not clearly detectable. Very fewmutant meiotic cells seem to acquire a bipolar spindle orga-nization (Figure 6C, b, arrow). Most are highly abnormal.Some are devoid of any polarity (Figure 6C, b and c, arrow-heads); others exhibit monopolar-like structures, where mi-crotubules seemed to be organized mainly from one or two
close asters (Figure 6C, d, arrow, and D, c, white rectangles).Among monopolar-like figures, some exhibit microtubulesthat diverge in an umbrella shape (Figure 6C, d, arrow),whereas in others, microtubules converge to the apex of acone (Figure 6B, c, and C, c, arrows).In wild-type primary spermatocytes, the two centrioles of
each centrosome are always decorated by antibodies againstCnn (our unpublished data) (Li et al., 1998), even though atthis stage, only a small amount of pericentriolar material ispresent and closely associated to these structures (Martinez-Campos et al., 2004). As cells enter meiosis, Cnn is massivelyrecruited to the centrosome at the spindle poles of wild-typecells (Figure 6C, a). In mutant primary spermatocytes, Cnnstaining is faint but often occurs as more than four dots percell (our unpublished data), suggesting defects in centro-some segregation during the premeiotic mitosis. Duringmeiosis, Cnn antibodies stain zero to six dots per cell, al-though two (Figure 6C, b–d) or four dots are generallyobserved. In cells with a disorganized microtubule cytoskel-eton, these Cnn-containing bodies remained together or are
Figure 6. Meiotic phenotypes in PG36 mutants. (A and B) Onion stage spermatids (A, a–c) and spindle organization (B, a–c) are abnormalas viewed by phase contrast microscopy. (A, a) Wild type spermatids (nu, nucleus; nb, Nebenkern). (A, a and b) PG36 spermatids showabnormal phenotypes. (B, a and b) The dark band (pdm, phase dense material) outlining the equatorial region of the spindle corresponds toa system of parafusorial membranes and mitochondria that lines up along the nuclear membranes and microtubules. (B, a) Wild-typemetaphase. (B, b) Wild-type telophase. (B, c) Conical-shaped structure observed in mutant meiosis. (C) Organization of meiotic spindles andCnn localization are abnormal in PG36 mutants. Cnn is shown in red and microtubules in green. a, Wild-type bipolar spindles. b and c,arrowheads, Mutant disorganized figures. c, arrows, Mutant conical-shaped structures. d, arrow, Mutant umbrella-shaped structures. (D)Pav-KLP recruitment is abnormal. Pav-KLP (red) recruitment in the ring canals is shown by arrows (a–c, and f). Pav-KLP is recruited on thecentral spindle in wild-type anaphases and telophases (a and b, arrowheads). In mutant cells (c–f), Pav-KLP is not detectable at the putativeplus ends of microtubules in the umbrella-shaped structures (c, arrowhead), but it is recruited at the apex of the cones (f, arrowheads). d ande, To better visualize centrosomal Pav-KLP signal, the top- (d) and bottom (e)-selected regions of c have been 2.25-fold enlarged and signalenhanced. Bars, 10 �m.
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dispersed, whereas in most of the monopolar-like structures,they are located together at the asters. Moreover, the inten-sity of Cnn signals decreases in mutant meiotic cells. Thisobservation is consistent with the weak labeling of the cen-trioles in mutant primary spermatocytes and suggests thatCnn recruitment does not occur properly. To understandwhether mutant cells containing these monopolar-like mi-crotubule structures could evolve toward cytokinesis, wehave analyzed by immunostaining the recruitment of Pa-varotti-KLP (Pav-KLP), a kinesin-like protein related to themammalian MKLP-1, that is necessary for the completion ofcytokinesis (Adams et al., 1998) (Figure 6D). In wild-typemale meiosis, Pav-KLP localizes to the ring canals, remnantsof the contractile rings from earlier divisions, which occur assmall red rings or dots (Figure 6D, a and b, arrows). Itweakly labels the centrioles at the spindle poles. This proteinalso localizes to the central spindle in anaphase (Figure 6D,a, arrowhead) and concentrates in the midzone in telophase(Figure 6D, b, arrowhead). In mutant cells, the localization ofPav-KLP in the ring canals does not seem to be affected(Figure 6D, c and f, arrows), and its recruitment at thecentrosomes still occurs (Figure 6D, d and e). However,Pav-KLP dots often localize within the same aster (Figure6D, d and e) and an abnormal number of dots per cell can bedetected (our unpublished data). These results support thehypothesis that Dgrip84 is necessary for proper centrosomeseparation. In the umbrella-shaped microtubule structuresPav-KLP is never detected at the putative plus end of mi-crotubules (Figure 6D, c, arrowhead), whereas in cones Pav-KLP is associated with microtubules at the apex but never ina ring shape (Figure 6D, f, arrowheads). These observationssuggest that at least some of the abnormal meiotic spindlesin Dgrip84 mutant cells are able to recruit a cytokinesismarker but in a highly inappropriate way.
DISCUSSION
The function of the three constituents of the �-TuSC has beenexamined using genetic approaches only in unicellular or-ganisms. These analyses must be further investigated inanimals where �-tubulin is assumed to be recruited to thecentrosome as �-TuRC. Functional analysis of �-tubulin-associated proteins in metazoans has been mainly restrictedto Drosophila: Dgrip91, a �-TuSC protein, and Dgrip75, aprotein that specifically belongs to the large complex. Thestudy of Dgrip84, the third component of the small complexin D. melanogaster, completes the functional characterizationof the �-TuSC, allowing for the first time a comparison of thephenotypes resulting from the disruption of each �-TuSCcomponent in a same metazoan.Their depletion has no obvious effect on the cytoskeleton
organization during interphase. However, in Dgrip84- or�-tubulin-depleted cells, regrowth experiments allow theappearance of abnormally long and less numerous cytoplas-mic microtubules compared with control (this study; ourunpublished data). It could be indicative of a role of �-TuSCproteins in the assembly and the maintenance of the lengthof interphase microtubules. Long microtubules could alsoresult from an increase of the concentration of free tubulin inconsequence of low microtubule assembly. Similar pheno-types displaying long microtubules have been observed af-ter mutations in the �-tubulin encoding gene both in bud-ding yeast and A. nidulans and in �-TuSC components in S.pombe (Marschall et al., 1996; Spang et al., 1996; Vardy andToda, 2000; Jung et al., 2001). In S2 cells, this effect could behidden because of the density and the complexity of micro-tubule arrays. Whatever the outset of interphase microtu-
bules in Drosophila cells, functional �-TuSC seems requiredin some aspects of microtubule dynamics and organization.Disruption of each �-TuSC component promotes a mod-
erate increase of the mitotic index (Barbosa et al., 2000;Raynaud-Messina et al., 2004; this study). The arrest is weakcompared with the one induced after a microtubule poisontreatment. Moreover, Dgrip84–RNAi depletion previouslyto drug exposure reduces significantly the blockage extent,suggesting a deregulation of the spindle checkpoint or anactivation of another cell cycle checkpoint. Inactivation ofDrosophila �-tubulin, Dgrip84, or Dgrip91 results in largepolyploid nuclei (Sunkel et al., 1995; Barbosa et al., 2000; thisstudy). This observation strengthens the idea that when the�-TuSC integrity is affected, cells could escape prematurelyfrom the mitotic checkpoint. These results are consistentwith several sets of data. Human �-tubulin mutants ex-pressed in S. pombe allow cytokinesis to proceed in spite ofspindle abnormalities (Hendrickson et al., 2001). Some allelesof the A. nidulans �-tubulin gene exhibit a slight delay inmitosis and could enter interphase without correct division,even after a microtubule-destabilizing treatment (Prigozhinaet al., 2004). In S. pombe, mutations in genes encoding �-tu-bulin interacting proteins bypass the spindle assemblycheckpoint and cause the untimely activation of the septa-tion initiation network (Vardy and Toda, 2000; Vardy et al.,2002). Together, these results suggest a role of the �-TuSC inthe mitotic checkpoint control.Mitotic figures of Dgrip84-depleted cells exhibit monopo-
lar morphology or microtubule arrays that fail to defineorientated polar structures and correct chromosome con-gression. This is also a characteristic feature of cells lackingDgrip91 or �-tubulin (Sunkel et al., 1995; Barbosa et al., 2000;Raynaud-Messina et al., 2004). In monopolar spindles, Cnn-and Asp-labeling patterns are consistent with the presenceof supernumerary centrioles at the poles. Electron micros-copy analysis supports this view, suggesting that centro-somes fail to segregate. This abnormality has also beenobserved both in Dgrip91 mutant neuroblasts and after23C�-tubulin depletion in S2 cells (Barbosa et al., 2000;Raynaud-Messina et al., 2004). Moreover, Dgrip84 mutantspermatocytes exhibit monopolar structures. Similar figures,described in �-tub23C and Dgrip91 mutant spermatocytes(Sampaio et al., 2001; Barbosa et al., 2003), have been shownto be the consequence of the collapse of the two poles.Drosophila �-TuSC assembly seems necessary for the properseparation of the centrosomes. Similar observations wereobtained after �-tubulin depletion in Caenorhabditis elegans,where separated asters are reapproaching in late prophase(Strome et al., 2001). The simplest interpretation is that themicrotubule network involved in the maintenance of centro-some separation is defective either in its dynamics or itsdensity.Our studies emphasize that, after Dgrip84 depletion, some
assembly and organization of spindles still occur and pointto mechanisms of nucleation independent of �-tubulin com-plexes. Microtubule organization still takes place at thepoles. However, instead of emerging from pericentriolarmaterial, some microtubules occur in continuity with cent-riolar triplets. Although this mechanism is unlikely to bedominant in the wild-type spindle assembly, it could ac-count for the nucleation of some microtubules in Dgrip84-depleted cells that are characterized by anastral spindles.Some microtubules are able to establish contact with kinet-ochores showing that they retain some of their functionalproperties. Strong BubR1 signal in RNAi-treated cells isconsistent with kinetochore-microtubule occupancy but al-terations in microtubule tension (Logarinho et al., 2004).
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Depletion of Dgrip84 prevents both �-tubulin andDgrip91 localization at the poles. Moreover, �-tubulin de-pletion impairs Dgrip84 and Dgrip91 mitotic recruitment(Raynaud-Messina et al., 2004; our unpublished data). There-fore, it is likely that �-TuSC components must be assembledin complexes before relocalization to the poles or that�-TuSC proteins are required for �-tubulin polar attachment.This view, supported by studies in S. cerevisiae (Nguyen etal., 1998), has been recently extended to mammalian cells:the �-TuRCs could be anchored to the centrosome via inter-actions of GCP2 (Dgrip84 orthologue) and GCP3 (Dgrip91orthologue) with the centrosomal proteins CG-NAP andpericentrin (Takahashi et al., 2002; Zimmerman et al., 2004).In Drosophila, the calmodulin-binding protein CP309 hasbeen proposed to tether the �-TuRC to the centrosomethrough direct binding with �-TuSC components (Kawagu-chi and Zheng, 2004). So, the �-TuSC grip-motif proteinsseem essential, due to their critical role in the attachment of�-tubulin complexes to the pericentriolar matrix. In contrast,the proteins specific for the �-tubulin large complexes char-acterized so far, like Drosophila Dgrip75 and S. pombe Alp16p(Dgrip163 orthologue) or Gfh1p (Dgrip75 orthologue), arenot essential for cell viability (Fujita et al., 2002; Venkatram etal., 2004). It could be hypothesized that these �-tubulin part-ners play a role in the organization or in the dynamics of asubset of microtubules.Analysis of meiosis in mutant spermatocytes reveals that
Dgrip84, like Dgrip91 and �-tubulin (Sampaio et al., 2001;Barbosa et al., 2003), is required for completion of the twomeiotic divisions. In the absence of one of the �-TuSC com-ponents, abnormal mitotic spindles can evolve toward acentral spindle-like structure as viewed by the recruitmentof different markers (Polo Kinase, Klp3A [Sampaio et al.,2001], Asp [Barbosa et al., 2003], Pav-KLP [Barbosa et al.,2003]; this study). Nevertheless, these proteins exhibit ab-normal localization and cytokinesis is strongly asymmetricaland/or clearly abortive.In conclusion, we present the characterization of the third
and last component of a metazoan �-TuSC. Together withprevious studies, our data strongly suggest that the integrityof this complex must be maintained to ensure �-tubulinrecruitment, proper microtubule organization and an effi-cient mitotic checkpoint. In contrast, the depletion of�-TuRC-specific proteins does not impair viability and �-tu-bulin accumulation. We suggest that the �-TuSC could be auniversal and minimal subunit required for �-tubulin re-cruitment to the cytoskeleton structures and proper micro-tubule nucleation in eukaryotic cells.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Drs. D. Glover, T. Kaufman, and S. Henikoff for the gift of anti-bodies against Asp, Cnn, and Cid, respectively. We thank Dr. D. L. Cribbs forsupport and Dr. A. Merdes for critical comments on the manuscript. Thiswork was supported by a grant from the Association pour la Recherche sur leCancer and Feder Funds. N. C. is supported by the Ministere de la Rechercheand the Association pour la Recherche sur le Cancer.
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N. Colombie et al.
Molecular Biology of the Cell282
43
II- Etude du rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC en
mitose
Voir Vérollet et al., J. Cell. Biol., 2006.
Alors que la tubuline γ et les protéines qui lui sont associées dans le γ-TuSC sont des
protéines essentielles et nécessaires à la fonctionnalité du fuseau de division, très peu de
données sont disponibles sur le rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC dans
l’organisation du fuseau mitotique chez les métazoaires. Selon les modèles de nucléation
des microtubules [Voir INTRODUCTION III-2)], l’assemblage du γ-TuRC serait
nécessaire au recrutement et à la fonction de la tubuline γ au centrosome en mitose. Dans ce
cas, la déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC devrait engendrer les mêmes
anomalies mitotiques que la déplétion de la tubuline γ. Contrairement aux mutants des
protéines du γ-TuSC, les mutants des homologues de Dgrip75 et Dgrip163 chez la levure S.
pombe et le mutant Dgrip75 chez la drosophile sont viables (Fujita et al., 2002; Schnorrer
et al., 2002; Venkatram et al., 2004), ce qui est en désaccord avec les modèles de
nucléation par le γ-TuRC. Afin de préciser le rôle des quatre protéines spécifiques du γ-
TuRC en mitose, l’expression de ces protéines a été inhibée, soit par RNAi dans les cellules
en culture, soit par mutation ( N. Colombié et T. Daubon).
• Perte de fonction des protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC
Tout d’abord, les conséquences de la déplétion par RNAi de Dgrip75, une protéine à
motifs grip spécifique du γ-TuRC, sur l’assemblage du complexe et l’organisation des
microtubules en mitose ont été analysées. Dans les cellules traitées, seul un complexe
contenant la tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91 est détecté sur gradient de sucrose, suggérant
qu’il ne reste que des γ-TuSCs. Ainsi, Dgrip75 est essentielle à la formation ou à la stabilité
du complexe γ-TuRC. En absence de γ-TuRC, l’index mitotique augmente de l’ordre de 3
fois et les cellules s’accumulent en prométaphase avec un point de contrôle mitotique
activé (présence de BubR1 aux kinétochores). Les figures mitotiques dans les cellules
traitées par RNAi présentent des fuseaux bipolaires anormalement allongés avec des
44
chromosomes mal alignés et 16% des fuseaux sont monopolaires. Cependant, les défauts
engendrés sont moins sévères que ceux induits par la déplétion d’une protéine du γ-TuSC
car les fuseaux sont majoritairement bipolaires avec des pôles correctement focalisés
montrant des microtubules astraux. Contrairement au modèle admis, la tubuline γ et ses
partenaires dans le γ-TuSC (Dgrip84 et Dgrip91), sont recrutés aux pôles de plus de 95%
des fuseaux qu’ils soient bipolaires ou monopolaires. Par contre, la tubuline γ n’est plus
présente sur les microtubules du fuseau et sur le fuseau central de cytocinèse. Ainsi,
l’assemblage d’un γ-TuRC n’est pas nécessaire au recrutement de la tubuline γ aux pôles
des fuseaux. La tubuline γ pourrait être recrutée sous forme de γ-TuSCs. Par contre,
l’intégrité du γ-TuRC est indispensable pour les autres localisations mitotiques de la
tubuline γ : microtubules du fuseau métaphasique et du fuseau central en fin de télophase.
Dans les cellules traitées par RNAi, le recrutement aux pôles du fuseau des autres
protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC est fortement diminué. Parmi les protéines
spécifiques du γ-TuRC, seule Dgp71WD est présente aux pôles de tous les fuseaux mais
l’intensité du signal est réduite.
Des résultats similaires ont été obtenus in vivo (N. Colombié). Contrairement aux
mutants des gènes codant les protéines du γ-TuSC, un mutant nul Dgrip75 est viable
(Schnorrer et al., 2002). Dans ce mutant, les neuroblastes de larves L3 s’accumulent en
mitose (index mitotique augmenté de 4 fois) avec des chromosomes hypercondensés mais
très peu d’aneuploïdie est observée. Le recrutement des protéines du γ-TuSC n’est pas
affecté dans les neuroblastes du mutant Dgrip75. Contrairement aux résultats obtenus dans
les cellules en culture, les neuroblastes de ce mutant ne présentent pas de défaut visible
dans la morphologie des fuseaux mitotiques. Dgrip75 ne serait donc pas nécessaire au
recrutement du γ-TuSC in vivo.
Afin de savoir si les phénotypes induits par la déplétion de Dgrip75 sont spécifiques
de cette protéine, j’ai analysé les conséquences de la déplétion par RNAi des deux autres
protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC (Dgrip128 et Dgrip163), dans les cellules en
culture. Les phénotypes induits par l’inhibition de chacune des protéines du γ-TuRC à
motifs grip sont identiques (index mitotique augmenté, diminution des γ-TuRCs
45
cytoplasmiques, anomalies de la morphologie des fuseaux, recrutement des protéines du γ-
TuSC aux pôles). En conclusion, les trois protéines à motifs grip spécifiques du γ-TuRC
sont nécessaires à l’assemblage du γ-TuRC. Aucune de ces protéines n’est essentielle pour
le recrutement de la tubuline γ et de ses protéines associées dans le γ-TuSC au centrosome.
• Perte de fonction de Dgp71WD
Dgp71WD est la dernière protéine spécifique du γ-TuRC à avoir été découverte. Elle
ne possède pas de motif grip mais appartient à une autre famille structurale (Gunawardane
et al., 2003; Haren et al., 2006; Luders et al., 2006). Contrairement à l’inhibition par RNAi
de l’expression des protéines à motifs grip, celle de Dgp71WD n’a pas d’effet sur le
maintien de l’assemblage d’un complexe 30S observé sur gradient de sucrose. Les
protéines spécifiques du γ-TuRC peuvent avoir des rôles différents dans l’assemblage des
complexes au niveau du cytoplasme. Les phénotypes induits par la déplétion de Dgp71WD
montrent des similitudes avec ceux induits en absence de Dgrip75, 128 et 163 : l’index
mitotique est augmenté de 3 fois par rapport aux cellules contrôles et les fuseaux mitotiques
sont anormaux. Les protéines du γ-TuSC sont recrutées aux pôles des fuseaux. Par contre,
les protéines spécifiques du γ-TuRC à motifs grip sont également détectables aux pôles.
Dgp71WD n’est donc nécessaire ni à l’assemblage du γ-TuRC ni à son recrutement.
T. Daubon a analysé un mutant obtenu par insertion d’un élément P dans la partie 5’
non traduite du gène codant Dgp71WD (GenExel, Inc.), qui est au moins un hypomorphe
fort. Ce mutant est viable mais les adultes meurent prématurément et les femelles sont
stériles. 30% des fuseaux des neuroblastes mutants sont monopolaires et le mutant présente
12% d’aneuploïdie par rapport à 1% dans les sauvages. Ces résultats montrent que, en
absence de Dgp71WD, les fuseaux ne sont pas totalement fonctionnels. Ils sont cohérents
avec les résultats obtenus dans les cellules en culture.
• Perte de fonction simultanée des quatre protéines spécifiques du γ-TuRC
Pour s’assurer d’être dans des conditions où le γ-TuRC ne peut pas s’assembler, les
protéines spécifiques du γ-TuRC ont été déplétées simultanément par RNAi. La co-
déplétion de Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et Dgp71WD est efficace et induit une
46
augmentation de 4 fois de l’index mitotique, 70% de fuseaux monopolaires et l’apparition
de grosses cellules polyploïdes. Ces phénotypes sont plus sévères que ceux obtenus après
simple déplétion des protéines spécifiques du γ-TuRC. Les trois protéines du γ-TuSC sont
recrutées aux pôles des fuseaux mais sont absentes le long des microtubules. Ces résultats
confirment que, en absence de γ-TuRC, les γ-TuSCs sont recrutés aux pôles des fuseaux
mitotiques. Par contre, le recrutement des γ-TuSCs au centrosome est affaibli dans ces
conditions et n’est pas suffisant pour que la mitose soit fonctionnelle.
L’ensemble de ces résultats permet de conclure que le γ-TuRC est le complexe
optimal pour la progression en mitose. Toutefois, le γ-TuRC n’est pas indispensable au
recrutement et à la fonction de la tubuline γ au centrosome chez la drosophile. En absence
de γ-TuRC, le γ-TuSC peut être recruté aux pôles des fuseaux en mitose et nucléer des
microtubules. Ce mode de recrutement de la tubuline γ pourrait avoir lieu dans des
conditions physiologiques. Ceci remet en question les modèles établis pour la nucléation
des microtubules au centrosome via le γ-TuRC exclusivement. Par contre, le γ-TuRC est
nécessaire pour la localisation de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau en métaphase
et du fuseau central en cytocinèse, suggérant que le γ-TuRC pourrait être impliqué dans
des fonctions non-centrosomales de la tubuline γ.
THEJOURNALOFCELLBIOLOGY
JCB: ARTICLE
© The Rockefeller University Press $8.00The Journal of Cell Biology, Vol. 172, No. 4, February 13, 2006 517–528http://www.jcb.org/cgi/doi/10.1083/jcb.200511071 JCB 517
Introduction
In metazoans, the centrosome organizes the microtubule cyto-
skeleton. The molecular mechanisms responsible for the initia-
tion and the regulation of microtubule assembly remain unclear,
although γ-tubulin appears critical to these processes. In addi-
tion to a centrosomal fraction, γ-tubulin is present in cytosolic
high-order protein structures (Akashi et al., 1997; Murphy et al.,
1998; Oegema et al., 1999; Fujita et al., 2002). In Drosophila melanogaster, two main complexes have been characterized.
The simplest ones, called γ-tubulin small complexes (γ-TuSCs),
are salt-stable tetramers of ~10S that are composed of two
γ-tubulin molecules and two associated proteins, Dgrip84 and
Dgrip91 (Oegema et al., 1999). They represent the basic com-
ponents of the larger complexes, the γ-tubulin ring complexes
(γ-TuRCs). γ-TuRCs, whose sedimentation coeffi cients range
from 25 to 35S, contain at least four other proteins (Dgrip75,
Correspondence to Brigitte Raynaud-Messina: [email protected] used in this paper: Cnn, centrosomin; dsRNA, double-stranded RNA; γ-TuRC, γ-tubulin ring complex; γ-TuSC, γ-tubulin small complex; P95, probability of 95%; RNAi, RNA interference.The online version of this article contains supplemental material.
Correspondence to Brigitte Raynaud-Messina: [email protected] used in this paper: Cnn, centrosomin; dsRNA, double-stranded RNA; γ-TuRC, γ-tubulin ring complex; γ-TuSC, γ-tubulin small complex; P95, probability of 95%; RNAi, RNA interference.The online version of this article contains supplemental material.
Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD) in addition to the γ-TuSC
subunits, in a yet unknown stoichiometry. Dgrip75, Dgrip128,
and Dgrip163 exhibit sequence homologies called grip motifs,
with the two γ-tubulin–associated proteins of the γ-TuSC (Fava
et al., 1999; Gunawardane et al., 2000; Murphy et al., 2001). In
contrast, Dgp71WD does not posses any grip motifs, but con-
tains seven WD (tryptophan–aspartic acid) repeats (Haren et al.,
2006). In vitro, this protein directly interacts with the grip motif
containing γ-TuRC subunits, suggesting that it may play a scaf-
folding role in γ-TuRC organization (Gunawardane et al.,
2003). Current models suggest that γ-TuRCs that have been
previously assembled in the cytoplasm are recruited to the cen-
trosomes, where they play a role in microtubule nucleation and
stabilization (Stearns and Kirschner, 1994; Zheng et al., 1995;
Fava et al., 1999; Zhang et al., 2000).
The functions of γ-tubulin and its associated proteins in
the γ-TuSC have been extensively studied. Deletion of either
corresponding gene is lethal, resulting in an accumulation of
cells in mitosis. This is usually correlated with the appearance
of strong mitotic defects such as monopolar structures or bipo-
lar spindles exhibiting unfocused poles, impairment of pole
<doi>10.1083/jcb.200511071</doi><aid>200511071</aid>Drosophila melanogaster γ-TuRC is dispensable for targeting γ-tubulin to the centrosome and microtubule nucleation
Christel Vérollet,1 Nathalie Colombié,1 Thomas Daubon,1 Henri-Marc Bourbon,2 Michel Wright,1 and Brigitte Raynaud-Messina1
1Centre de Recherche en Pharmacologie, Santé, UMR 2587, Centre National de la Recherche Scientifi que-Pierre Fabre, Institut de Sciences et Technologies du Médicament de Toulouse, 31432 Toulouse, Cedex 4, France
2Centre de Biologie du Développement, UMR 5547, Centre National de la Recherche Scientifi que-Université Paul Sabatier, IFR109, 31062 Toulouse, Cedex 4, France
In metazoans, γ-tubulin acts within two main com-plexes, γ-tubulin small complexes (γ-TuSCs) and γ- tubulin ring complexes (γ-TuRCs). In higher eukaryotes, it is
assumed that microtubule nucleation at the centrosome depends on γ-TuRCs, but the role of γ-TuRC components remains undefi ned.
For the fi rst time, we analyzed the function of all four γ-TuRC–specifi c subunits in Drosophila melanogaster: Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. Grip-motif proteins, but not Dgp71WD, appear to be required for γ-TuRC assembly. Individual depletion of γ-TuRC com-
ponents, in cultured cells and in vivo, induces mitotic delay and abnormal spindles. Surprisingly, γ-TuSCs are recruited to the centrosomes. These defects are less severe than those resulting from the inhibition of γ-TuSC compo-nents and do not appear critical for viability. Simultane-ous cosilencing of all γ-TuRC proteins leads to stronger phenotypes and partial recruitment of γ-TuSC. In conclu-sion, γ-TuRCs are required for assembly of fully functional spindles, but we suggest that γ-TuSC could be targeted to the centrosomes, which is where basic microtubule assem-bly activities are maintained.
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maturation, and increase in aneuploidy (Oakley et al., 1990;
Sunkel et al., 1995; Geissler et al., 1996; Spang et al., 1996;
Knop et al., 1997; Barbosa et al., 2000; Paluh et al., 2000; Vardy
and Toda, 2000; Hannak et al., 2002; Colombie et al., 2006).
In contrast, our knowledge about the function of γ-TuRC– specifi c
components is limited. In D. melanogaster, Dgrip75 is essential
for fertility, but not for viability. Dgrip75 loss-of-function
mutants specifi cally affect localization of the maternal determi-
nant bicoid during oogenesis, suggesting a role in the organiza-
tion or in the dynamics of a subset of microtubules (Schnorrer
et al., 2002). In Schizosaccharomyces pombe, mutants in
Gfh1 (a Dgrip75 orthologue) and in Alp16 (a Dgrip163 ortho-
logue) exhibit defects associated with altered microtubule func-
tion, but without any effect on cell viability (Fujita et al., 2002;
Venkatram et al., 2004). Current models cannot explain these
data. Instead, they raise questions not only about the redun-
dancy or the specifi city of the γ-TuRC–specifi c proteins but
also about the respective functions of γ-TuSCs and γ-TuRCs. In
this work, we have tested whether γ-tubulin is only recruited to
the centrosome in the form of γ-TuRCs or if γ-TuSCs can be
recruited and subsequently matured into functional γ-tubulin
complexes by attracting additional components. To this aim, we
have developed two strategies: (1) RNA interference (RNAi) in
cultured cells involving individual or concomitant depletion of
γ-TuRC components, and (2) genetic analyses by taking advan-
tage of the availability of mutant strains (Dgrip75, Dgrip163,
and Dgp71WD). We demonstrate that the γ-TuRC–specifi c sub-
units display functional specifi cities and that the γ-TuSCs could
be targeted to the centrosome where basic microtubule assem-
bly functions are maintained.
Results
RNAi-directed depletion of Dgrip75 impairs
cytosolic 𝛄-TuRC assembly or stability
First, we characterized the consequences of the depletion of a
γ-TuRC–specifi c protein on the assembly of cytosolic γ-tubulin
complexes. Cultured D. melanogaster S2 cells were treated by
RNAi to deplete Dgrip75, a grip protein specifi cally present in
the γ-TuRC (Fava et al., 1999). The treatment led to a strong
decrease of the protein level (Fig. 1 A; >95% of the control
level, as judged by Western blot analysis). This effect was spe-
cifi c, as determined by examining the amount of the three
γ-TuSC proteins (γ-tubulin, Dgrip84, and Dgrip91) and actin
(Fig. 1, A and D). Immunofl uorescence analysis of control cells
showed that although Dgrip75 was undetectable at the inter-
phase centrosome, it localized to the poles at the onset of
mitosis, where it was maintained throughout cell division
Figure 1. Characterization of Dgrip75 depletion by RNAi. (A) Analysis of protein depletion by Western blot. Total protein extracts of control or treated cells (Dgrip75RNAi) were analyzed using Dgrip75 affi nity–purifi ed antibodies and antibodies against Dgrip84, γ-tubulin, or actin (internal loading control). (B) Analysis of protein depletion by immunofl uorescence. a and b, microtubules; c and d, Dgrip75 signal. A quantitative view is shown in Table I. (C) Analysis of γ-tubulin complexes after Dgrip75 depletion. Total protein extracts prepared from control or treated cells (Dgrip75RNAi) were centrifuged in a su-crose gradient. Soluble fractions were analyzed by immuno-blotting against γ-TuRC components. (D) Recruitment of γ-TuSC components into the cytoskeletal fraction after Dgrip75 deple-tion. Total protein extracts (T) of control or treated cells (Dgrip75RNAi) were centrifuged for 10 min at 10,000 g. Then, the supernatants (S) and the pellets (P) were analyzed by immunoblotting with antibodies against Dgrip91, Dgrip84, γ-tubulin, and Dgrip75. Bar, 5 μm.
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(Fig. 1 B, c). In marked contrast, the protein was absent from
the mitotic centrosomes in Dgrip75-depleted cells, consistent
with Western blot quantifi cation (Fig. 1 B, d; and Table I).
When extracts from treated cells were submitted to sucrose gra-
dient sedimentation, γ-TuRCs were severely reduced, as indi-
cated by immunoblotting of soluble fractions with antibodies
against γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip128, and Dgrip163
(Fig. 1 C). The main remaining complexes appeared to be
γ-TuSCs, as judged by their protein content and their sedimen-
tation coeffi cient. In addition, the total level, as well as the solu-
ble and cytoskeletal fractions of the three γ-TuSC proteins, are
unchanged in control and Dgrip75-depleted cells (Fig. 1 D),
suggesting a redistribution of these proteins in the different
complexes rather than a change in quantity. In contrast, after
Dgrip75-RNAi treatment, we noticed a decrease in the total
level of the two other grip-motif proteins of the γ-TuRC,
Dgrip128 and Dgrip163. The remaining Dgrip128 protein was
distributed on the gradient in the form of heterogeneous and un-
characterized complexes with apparent masses equal or slightly
higher than the mass of the γ-TuSC. Dgrip163 protein migrated
mainly in light fractions (<10S). One hypothesis could be that
this protein was present as a monomeric or dimeric form. Thus,
Dgrip75 appears to be required for effi cient assembly or stabil-
ity of cytoplasmic γ-TuRCs.
Impairment of 𝛄-TuRC assembly induces
moderate mitotic defects, but does not
preclude 𝛄-TuSC centrosomal recruitment
We next investigated whether Dgrip75 depletion, and thus the
subsequent decrease of γ-TuRCs, affected mitotic progression.
The mitotic index was signifi cantly increased by �2.6-fold
(2.9%; n = 4,766; probability of 95% [P95] = 2.5–3.3 in treated
cells, compared with 1.1%; n = 9,235; P95 = 0.9–1.3 in
control cells). This mitotic accumulation coincided with the
maintenance of an active mitotic checkpoint, as judged by a
strong BubR1 signal at kinetochores (not depicted), which was
indicative of a transient block in prometaphase. α-Tubulin
immunostaining analysis confi rmed an accumulation of cells in
premetaphase stages (increased 1.8-fold in frequency), whereas
postmetaphase fi gures exhibited a 2.6-fold decrease relative to
controls (Table II). Aberrant mitotic fi gures were observed,
mainly monopolar spindles and bipolar spindles that were either
elongated or with lagging chromosomes (Fig. 2 and Table II).
Approximately one third of prometaphases and metaphases
were still organized as bipolar structures, albeit with a longer
interpolar distance (average increase of 50%; 7.9 ± 0.9 in
treated cells vs. 5.3 ± 0.7 in controls) and a poor microtubule
density. However, treated bipolar spindles exhibited astral mi-
crotubules (Fig. 2 A, d, h, and l). Their poles were normally
focused, consistent with polar localization of Asp (Fig. 2 B, a),
a marker of the spindle microtubules minus ends (Wakefi eld
et al., 2001). They seemed to properly separate their centro-
some, as 97% (n = 112; P95 = 92–99) exhibited centrosomin
(Cnn) labeling at both poles (Fig. 2 B, b; Megraw et al., 1999).
Surprisingly, in Dgrip75-depleted cells, γ-tubulin was still re-
cruited to the poles at all stages of mitosis (Fig. 2 A, a–d; and
Table I). The maximal fl uorescence values raised by γ-tubulin
antibodies at the two poles of symmetrical spindles did not differ
between Dgrip75-treated and control cells (Fig. 2 C). The two
γ-tubulin partners in the γ-TuSC, Dgrip84, and Dgrip91 were
also targeted to the poles in an effi cient manner (Fig. 2 A, e–l;
and Table I). At the same time, pole localization of γ-TuRC–
specifi c proteins (Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD) was
signifi cantly inhibited, but not completely abolished (Fig. 2 D
and Table I). The reductions in Dgrip128 or Dgrip163 stainings
(Fig. 2 D, a–f, Table I) may result, at least partly, in the overall
decrease in the levels of these proteins after Dgrip75 depletion.
Dgp71WD staining was present, but reduced in intensity in
most of the cases (Fig. 2 D, g–i, insets). To illustrate these
changes, we performed double-labeling immunofl uorescence on
cells depleted of Dgrip75, showing colocalization of γ- tubulin
with γ-TuSC–associated proteins (Dgrip84 or Dgrip91) or
with Dgp71WD, whereas the γ-TuRC proteins Dgrip128 or
Dgrip163 were no longer detectable (Fig. S1, available at http://
www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1). The local-
ization of γ-tubulin along spindle microtubules, observed in
97% (n = 138; P95 = 93–99) of control cells, was detected in
Table I. Accumulation of centrosomal components in mitotic cells after Dgrip75 depletion in cultured cells
Staining Control Dgrip75RNAi
Bipolar Monopolar
% % %
γ-Tubulin 100 (n = 100) 100 (n = 124) 95 (n = 66)Dgrip84 99 (n = 186) 98 (n = 170) 98 (n = 50)Dgrip91 91 (n = 103) 100 (n = 55) 100 (n = 48)Dgrip75 100 (n = 95) 6 (n = 70) 0 (n = 52)Dgrip128 78 (n = 71) 3 (n = 93) ndDgrip163 98 (n = 132) 24 (n = 119) ndDgp71WD 95 (n = 109) 100 (n = 65) 100 (n = 43)
Microtubules were stained with antibodies against α-tubulin and chromosomes with DAPI, whereas the spindle poles were immunostained with antibodies against γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. For a correct interpretation, we need to keep in mind a decrease in the total amount of Dgrip128 and Dgrip163 in Dgrip75-depleted cells. n, number of prometaphases/metaphases analyzed. nd, not determined.
Table II. Distribution of the different mitotic stages after Dgrip75 depletion in cultured cells
Mitotic fi gures Controln = 100
Dgrip75RNAi
n = 244
% %
Unfocuseda 21 ± 8b 24 ± 6Prometaphases/metaphases Symmetrical bipolar 28 ± 9 20 ± 5 Abnormal bipolar 4 ± 4 22 ± 6 Monopolar 0 16 ± 4Postmetaphase stages 47 ± 10 18 ± 4
Mitotic stages were determined after chromosome staining (DAPI) and immuno-labeling of microtubules (α-tubulin antibodies). n, number of mitotic spindles analyzed. These results are representative of three independent experiments.aSpindles with no evident polarity, which represent mainly prophase stages or highly abnormal spindles.bConfi dence intervals calculated for P95.
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only 10% (n = 146; P95 = 5–15) of the depleted cells (Fig.
2 A, a–d). Similarly, the two γ-TuSC proteins, Dgrip84 and
Dgrip91, were no longer detected along spindle microtubules
(Fig. 2 A, e–l). Moreover, staining of γ-TuSC proteins at the
midbody was impaired in treated cells (not depicted). Hence,
the assembly of cytoplasmic γ-TuRCs does not appear as a pre-
requisite for centrosomal recruitment of the γ-TuSCs, but seems
essential for its localization along spindle microtubules and at
the midbody.
Dgrip75 loss-of-function mutant is delayed
in mitosis, but still recruits 𝛄-tubulin
to the centrosome
To examine the functional signifi cance of Dgrip75 in vivo, we
took advantage of the availability of the mutant allele 175–14
(Dgrip75175), which was either a null or a strong allele (Schnorrer
et al., 2002). Dgrip75175 mutant was viable, although adults of
both sexes exhibited a slight increase in lethality some days
after hatching. Moreover, they showed abnormalities in the
abdominal cuticle segmentation and the thoracic macrochaete
pattern (unpublished data), which were common in mutations
affecting mitosis. Finally, mutant females were sterile because
of a failure to undergo normal oogenesis.
Although Dgrip75 did not appear essential for viability,
the phenotypes observed after RNAi treatment of cultured cells
prompted us to study the mitotic processes in mutant L3 larval
brains. Western blot analysis showed that Dgrip75 levels were
reduced below the threshold of detection in Dgrip75175 brain ex-
tracts (Fig. 3 A). The mitotic index was elevated approximately
three-to fourfold (2.5%; n = 12,410; P95 = 2.2–2.8) com-
pared with wild-type cells (0.7%; n = 16,134; P95 = 0.6–0.8).
Mutant cells accumulated in prometaphase stages, whereas post-
metaphase fi gures were reduced (unpublished data). More than
half of the mutant cells exhibited overcondensed chromosomes
Figure 2. Immunofl uorescence analysis of phenotypes induced by Dgrip75 depletion in S2 cells. (A) Localization of γ-TuSC components in mitotic cells. Control or Dgrip75-treated cells (Dgrip75RNAi) were analyzed by staining with antibodies against γ-tubulin (a and c), Dgrip84 (e and g), and Dgrip91 (i and k). Merge (b, d, f, h, j, and l): blue, chromosomes; red, microtu-bules; green, γ-TuSC components. (B) Spindle pole focusing and localization of centrosomal markers. Dgrip75-depleted cells were stained with antibodies against Asp (a, green) or Cnn (b, green). Red, α-tubulin; blue, chromosomes. (C) Quantifi cation of polar γ-tubulin by immuno-fl uorescence. The maximal signal obtained after γ-tubulin staining was scored on each pole of bipolar spindles for control (closed bars) and Dgrip75-depleted cells (open bars). Correlations of 0.73 (n = 67; P95 = 0.62–0.84) and 0.72 (n = 69; P95 = 0.61–0.83), respectively, were observed between the maxi-mal fl uorescence measured at the two poles of control or treated cells. (D) Localization of γ-TuRC–specifi c components (Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD) in mitotic cells. Blue, chromosomes; red, microtubules; green, γ-TuRC–specifi c components. Insets represent a hemispindle stained with antibodies against Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. For A and D, a quantitative view is shown in Table I. Bars, 5 μm.
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(60%; n = 186; P95 = 53–67) compared with wild type (2%;
n = 211; P95 = 0–4; Fig. 3 B). These results were consistent
with prolonged prometaphase and metaphase stages. However,
only very few mutant cells showed an aneuploid phenotype (6%;
n = 112; P95 = 3–9) compared with wild type (1%; n = 116;
P95 = 0–3), and this low frequency was consistent with Dgrip75175
adult viability.
Transient prometaphase delays observed in the Dgrip75
mutant could be a consequence of defects in the mitotic
apparatus. Nevertheless, immunofl uorescence analysis revealed
neither a clear difference in spindle morphology nor a sig-
nifi cant decrease of cells stained positively for γ-tubulin or
Dgrip84 (Fig. 3 C). Given the limitations of immunofl uores-
cence in neuroblasts, we cannot exclude defects in micro tubule
organization, such as changes in microtubule density or inter-
polar distance.
These data suggest that in Dgrip75175 brains, most of the
cells complete cell division even though mitosis might be
slowed down, consistent with our observations in RNAi-treated
cultured cells. γ-TuSC components are still recruited to the cen-
trosomes and most of the mitotic apparatus are able to ensure
correct chromosome segregation.
Removal of Dgrip128 or Dgrip163
is not essential for centrosomal
𝛄-TuSC recruitment
To evaluate whether the phenotypes induced by Dgrip75 deple-
tion were specifi c of this grip-motif protein, we performed an
RNAi treatment against Dgrip128 or Dgrip163, the two other
grip-motif γ-TuRC–specifi c components. Depletion was effi -
cient in either case: after Dgrip128 RNAi, no poles (n = 142)
were labeled, and after Dgrip163 RNAi, <4% of the poles
(n = 150) were labeled with respective Dgrip128 and Dgrip163
antibodies (Fig. 4 A). Western blot analysis confi rmed this view
(not depicted). Sucrose gradient analysis of extracts depleted
for Dgrip128 or Dgrip163 showed a marked decrease in γ-TuRC
content (Fig. 4 B). These experiments show that these proteins,
like Dgrip75, appear involved in the assembly or stability of
γ-TuRCs. Moreover, silencing of either protein led to accumu-
lation of cells in mitosis (approximately three- to fourfold),
which resulted from a higher frequency of prometaphases con-
comitant with a decrease in postmetaphase stages (Fig. 4 C).
Mitotic phenotypes were mainly characterized by elongated bi-
polar spindles and less frequently by monopolar structures.
γ-Tubulin (Fig. 4 D) as well as Dgrip84 and Dgrip91 (not de-
picted) were effi ciently recruited to the centrosomes, even in
mitotic cells that exhibited severe phenotypes (i.e., monopolar
spindles). However, γ-tubulin labeling along spindle micro-
tubules was no longer observed (Fig. 4 D). It was striking that
these phenotypes were similar to the defects obtained after de-
pletion of Dgrip75.
Furthermore, we next performed an in vivo study using
a Dgrip163 P insertion mutant (Dgrip163GE27087) in which the
P transposable element was inserted into exon 4 (out of 5) between
codons 822 and 823. This mutant behaved genetically as a null
or strong allele (unpublished data). Dgrip163 mutants exhibited
reduced viability. The emerging homozygous or hemizygous
Dgrip163GE27087 adults displayed abdominal abnormalities, and
mutant females were sterile. Altogether, these studies reveal
that inhibition of each individual grip-motif protein specifi c of
the γ-TuRC leads to similar phenotypes in cultured cells and
in vivo.
Dgp71WD is neither essential for
𝛄-TuRC assembly nor for its recruitment
to the centrosome
In contrast to the other proteins specifi c of the γ-TuRCs,
Dgp71WD does not belong to the same structural family
(Gunawardane et al., 2003). RNAi treatment induced a strong
inhibition, as judged by Western blot analysis (Fig. 5 A).
In agreement with this quantifi cation, Dgp71WD centrosomal
Figure 3. In vivo phenotypes observed in Dgrip75 mutant brains. (A) Characterization of Dgrip75 depletion by Western blot. Total protein extracts from wild-type (WT) or Dgrip75 mutant (Dgrip75−/−) L3 larval brains were analyzed with affi nity-purifi ed Dgrip75 antibodies. Actin was used as an internal loading control. (B) Analysis of chromosomal fi gures. Wild-type or mutant L3 larval brains were stained with DAPI. Five brains were scored for each genotype. (C) Immunofl uorescence analysis of the mitotic fi gures in Dgrip75 mutant neuroblasts. Green, spindle; blue, chro-mosomes; red, γ-tubulin (a and b) and Dgrip84 (c and d). Bars, 5 μm.
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recruitment was severely impaired in treated cells (1%; n = 385;
P95 = 0–2) compared with control cells (95%; n = 296;
P95 = 93–97; Fig. 5 B). In treated cells, we noticed the system-
atic loss of Dgp71WD staining on other mitotic structures, such
as spindle microtubules (Fig. 5 B, inset) and midbodies (not
depicted). As Dgp71WD contains WD repeats and interacts
in vitro with the four grip-motif subunits Dgrip84, Dgrip91,
Dgrip128, and Dgrip163 (Gunawardane et al., 2003), it might
play a role as a scaffold for cytosolic γ-TuRC assembly. When
control extracts were subjected to sucrose gradient sedimenta-
tion, this protein appeared not only as part of γ-TuRCs but also
of smaller uncharacterized complexes (Fig. 5 C). In Dgp71WD-
depleted conditions (Fig. 5 C), no signifi cant modifi cation in the
quantity of �30S complexes is observed, as judged by γ- tubulin
or Dgrip75 labeling. This result suggests that Dgp71WD, in
contrast to Dgrip75, appears to be dispensable for the assembly
or the stability of large γ-tubulin complexes. However, we can-
not exclude the possibility that the assembly of these complexes
is mediated by residual amounts of Dgp71WD.
Studies of the mitotic phenotypes observed after Dgp71WD
down-regulation revealed similarities to the defects recorded
after the removal of Dgrip75, Dgrip128, or Dgrip163; an
increase of the mitotic index (2.7%; n = 7,970; P95 = 2.3–3.1)
compared with control cells (0.9%; n = 19,650; P95 = 0.8–1);
and an accumulation of cells in the prometaphase and meta-
phase stages (Fig. S2 A, available at http://www.jcb.org/cgi/
content/full/jcb.200511071/DC1). Dgp71WD-depleted cells
showed defects in spindle morphology, such as bipolar spindles
with unfocused poles or monopolar structures (Fig. 5, B and D;
and Fig. S2 B) with unseparated poles, as determined by
Cnn staining (not depicted). γ-TuSC components (γ-tubulin,
Dgrip84, and Dgrip91), as well as γ-TuRC–specifi c subunits
(Dgrip75 and Dgrip163), were still targeted to the mitotic cen-
trosomes, but often the stainings were weak (Fig. 5 D and Fig.
S2 C). These proteins were no longer detected at the spindles.
These results suggest that Dgp71WD is dispensable for γ-TuRC
assembly and recruitment, but is required for the effi cient func-
tion of this complex.
Figure 4. Phenotypes observed in Dgrip128- or Dgrip163-depleted cells. For morphological phenotype analyses, cells were immuno-stained against microtubules (red) and chromo-somes (blue). (A) Analysis of Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b) depletions. Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b) are shown in green. Insets repre-sent a hemispindle stained with antibodies against Dgrip128 and Dgrip163. (B) Pattern of γ-tubulin cytosolic complexes after Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b) depletions. Soluble frac-tions from a sucrose gradient were analyzed by immunoblotting against γ-tubulin. (C) Distri-bution of cells in the different stages of mitosis after depletion of Dgrip128 (a) or Dgrip163 (b). The different mitotic stages were scored over >100 cells undergoing mitosis. Error bars represent the confi dence interval calcu-lated for P95. (D) Analysis of localization of γ-tubulin in mitotic cells. γ-Tubulin is stained in green in merge (a–c) and in white in a’–c’. More than 97% of Dgrip128- (a) or Dgrip163-depleted (c) cells showed γ-tubulin at the poles (scored on >100 cells in the prometaphase/metaphase stages). Bars, 5 μm.
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ROLE OF γ-TURC–SPECIFIC PROTEINS DURING MITOSIS • VÉROLLET ET AL. 523
A genetic approach was performed to test this hypo-
thesis in vivo. We used a mutant strain that carried a P element
insertion (GE30807) in the 5′ untranslated mRNA region at
position 49 from the translation initiator ATG. As shown by
Western blot, the level of Dgp71WD was strongly reduced in
a mutant larval brain extract compared with a wild-type ex-
tract (Fig. 6 A). An immunofl uorescence analysis performed
in larval brains sustained that Dgp71WD was no longer detect-
able in mutants (n = 120), whereas 96% of wild-type poles
(n = 110; P95 = 92–100) exhibited a clear staining (Fig.
6 B). These results indicate that Dgp71WDGE30807 is at least a
strong allele. This was confi rmed by analysis of hemizygous
fl ies, using a chromosomal defi ciency that covers Dgp71WD.
Most of the homozygous or hemizygous mutants reached the
adult stage. However, they showed a shorter life, morphologi-
cal abnormalities, and female sterility. Mitotic phenotypes had
been analyzed in L3 larval brains confi rming RNAi-mediated
phenotypes. We observed a fourfold increase in the mitotic in-
dex, an accumulation in prometaphase stages associated with
a signifi cant hypercondensation of chromosomes and a high
incidence of disorganized or monopolar spindles (Fig. S3,
available at http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/
DC1). However, γ-tubulin is detected at all the centrosomes of
Dgp71WDGE30807 neuroblasts (n = 130; Fig. 6 C). Moreover,
mutant neuroblasts exhibited an increase in aneuploidy (12%;
n = 139; P95 = 7–17) versus wild-type brains (1%; n = 125;
P95 = 0–5), suggesting that spindles without Dgp71WD were
not fully functional.
𝛄-TuSC components are targeted
to the poles even after cosilencing
of the four 𝛄-TuRC subunits
Whatever their role in the assembly and recruitment of cytosolic
γ-tubulin complexes, the inhibition of each individual γ-TuRC
subunit allowed effi cient γ-TuSC anchoring to the centrosomes.
It was possible that some grip-motif proteins were in part re-
dundant and could complement each other to some extent.
Alternatively, the residual γ-TuRC–specifi c proteins could ac-
count for the formation of a γ-TuRC–like structure that was un-
stable in the cytoplasm, but stabilized upon assembly with the
pericentriolar matrix. Hence, we performed cosilencing of the
four proteins Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD.
The levels of the four proteins were dramatically reduced as
judged by Western blot (Fig. 7 A) and immunofl uorescence an-
alyses (Fig. 7 B and Table III). The mitotic index was increased
in treated cells (3.9%; n = 2,552; P95 = 3.4–4.4) compared
with control cells (1.1%; n = 8,567; P95 = 0.8–1.4). Most of
the mitotic structures consisted of monopolar prometaphases/
metaphases (70%; n = 80; P95 = 60–80) compared with con-
trol cells (1%; n = 104; P95 = 0–3; Fig. 7, B and C). A striking
feature of this treatment was the signifi cant accumulation of
polyploid cells and the appearance of very large interphase cells
Figure 5. Phenotypes induced by Dgp71WD depletion in cells. (A) Analysis of Dgp71WD depletion by Western blot. Total protein extracts of control or of treated cells (Dgp71WDRNAi) were analyzed using antibodies against Dgp71WD or actin (internal loading control). (B) Analysis of the protein depletion by immuno-fl uorescence. Control (a) or Dgp71WD-treated cells (b) were analyzed by staining with an-tibodies against Dgp71WD (insets). Merge: blue, chromosomes; red, microtubules; green, Dgp71WD. (C) Pattern of γ-tubulin cytosolic complexes after Dgp71WD depletion. Soluble fractions from a 5–40% sucrose gradient were analyzed by immunoblotting against γ-tubulin, Dgrip75, or Dgp71WD. (D) Localization of γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, and Dgrip163 in mitotic Dgp71WD-depleted cells. γ-TuRC components are shown in green (a–e) or in white (a’–e’). For D, a quantitative view is shown in Fig. S2 C, available at http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1. Bars, 5 μm.
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(9%; n = 281; P95 = 5–12), which appeared to account for
only 0.6% of control interphase cells (n = 320; P95 = 0–1.4)
(Fig. 7 D, left arrowhead). Most of the poles exhibited γ- tubulin,
Dgrip84, and Dgrip91 stainings (Fig. 7 C and Table III), but at
reduced intensities. Spindle labeling was no longer detectable
(Fig. 7 C). These parameters showed that codepletion of these
proteins induced more severe phenotypes than after any indi-
vidual down-regulation. This result was supported by the
synthetic lethality observed when the Dgp71WDGE30807- and
Dgrip163GE27087-viable alleles were combined in the same geno-
type (unpublished data). Altogether, these data confi rm that the
γ-TuSC assembled in the cytoplasm can, at least to some extent,
be directly targeted to the poles.
Discussion
The molecular mechanisms responsible for γ-tubulin recruit-
ment to nucleation centers and microtubule nucleation itself re-
main poorly understood. Several models have been proposed,
and all imply that the cytosolic assembly of γ-TuRCs is a criti-
cal step for γ-tubulin targeting to the centrosome. For the fi rst
time, we analyzed the function of all four γ-TuRC–specifi c sub-
units during mitosis, using either RNAi treatment in cultured
cells or genetic analyses in D. melanogaster.
𝛄-TuRC–specifi c proteins play a distinct
role in 𝛄-TuRC assembly
Individual depletion of Dgrip75, Dgrip128, or Dgrip163 in-
duced a strong decrease in cytoplasmic γ-TuRCs in cultured S2
cells. This is consistent with previous data obtained in vitro
showing that immunodepletion of Xgrip210, the Xenopus laevis
orthologue of Dgrip163, blocks the reassembly of purifi ed and
salt-treated γ-TuRCs (Zhang et al., 2000). In contrast to the
strong decrease of γ-TuRCs observed after the depletion of
grip-motif proteins, the down-regulation of Dgp71WD did not
produce a signifi cant effect on the ratio and the sedimentation
coeffi cients of the γ-tubulin complexes. However, we cannot
exclude the possibility that residual amounts of this protein are
suffi cient to maintain the overall structure of these complexes.
Dgp71WD is probably associated with the γ- TuRCs at a low
stoichiometry, explaining why no change in the sedimentation
coeffi cient could be detected after its depletion. Our data sug-
gest that although the grip-motif proteins are essential for the
assembly and stability of γ-TuRCs, Dgp71WD appears dis-
pensable for these processes.
The complete 𝛄-TuRC is necessary for an
effi cient progression through mitosis
In Dgp71WD-depleted cells, we observed no obvious effect on
the level of cytosolic γ-TuRCs and on the recruitment of the
different γ-TuRC components to the mitotic centrosomes, sug-
gesting that γ-TuRCs depleted of Dgp71WD had not completely
lost their ability to be targeted to the poles. However, γ-tubulin
localization along spindle microtubules was impaired and mo-
nopolar fi gures with poorly separated poles appeared with a
high occurrence. These monopolar phenotypes are similar to
those observed after depletion of Nedd1, the human Dgp71WD
orthologue (Haren et al., 2006). The mitotic defects could result
from a partial functionality of the γ-tubulin complexes recruited
to the centrosomes or from modifi cation in the properties of
microtubule arrays that were no longer decorated by γ-tubulin.
Thus, it appears that the complete γ-TuRC is required for nor-
mal mitotic progression.
𝛄-TuRC assembly is not a prerequisite
for the centrosomal targeting of 𝛄-tubulin
If one assumes that γ-tubulin is recruited to the centrosome in
the form of γ-TuRCs, depletion of γ-TuRCs and γ-tubulin
would be expected to lead to similar phenotypes. In fact, deple-
tion of grip-motif components of the γ-TuRCs, such as Dgrip75,
did not fully mimic the effects of depletion of γ-TuSC subunits
on mitotic progress (Sunkel et al., 1995; Barbosa et al., 2000;
Paluh et al., 2000; Vardy and Toda, 2000; Fujita et al., 2002;
Venkatram et al., 2004; Colombie et al., 2006). Less severe de-
fects were observed as indicated by the lower occurrence of mo-
nopolar spindles, the effi cient distribution of centrosomes to the
two poles, the maintenance of bipolar spindles with astral mi-
crotubules and focused poles. These phenotypes had been con-
fi rmed in vivo, using mutant larval neuroblasts. These moderate
defects were consistent with the viability of Dgrip75 mutants
and the weak percentage of aneuploidy. Surprisingly, despite
a signifi cant reduction of the cytosolic pool of γ-TuRCs, the
Figure 6. In vivo phenotypes observed in Dgp71WD mutant brains. (A) Analysis of Dgp71WD depletion in mutant brains by Western blot. Wild-type or Dgp71WD mutant (Dgp71WD−/−) brains were analyzed with Dgp71WD antibodies or actin (internal loading control). (B) Organization of spindles in mutant neuroblasts. (C) Localization of γ-tubulin to the spindle poles of mutant neuroblasts. green, microtubules; blue, chromosomes; red, Dgp71WD (B) or γ-tubulin (C). Bars, 5 μm.
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tethering of the three γ-TuSC proteins to the centrosomes was
not impaired, as judged by immunofl uorescence analyses both
in mutant neuroblasts and in cultured cells. Similar phenotypes
were observed after individual silencing of the two other grip-
motif proteins, Dgrip128 and Dgrip163. It was noteworthy that
after an RNAi treatment against any one of the three grip-motif
proteins specifi c of the γ-TuRCs, a decrease in the level of the
two others was noticed (unpublished data), suggesting some co-
regulation between this set of proteins. Altogether, these results
show that the complete γ-TuRC is not a prerequisite for the cen-
trosomal accumulation of γ-TuSC proteins.
𝛄-Tubulin can be recruited
to the centrosomes as 𝛄-TuSC
Because γ-tubulin could be recruited to the centrosomes
independently of the γ-TuRCs, we wanted to characterize the
complex that mediates its targeting. Sucrose gradient and im-
munofl uorescence analyses after depletion of individual
γ-TuRC components strongly suggest that γ-tubulin is recruited
to the centrosomes as γ-TuSC. Codepletion of the four γ-TuRC–
specifi c proteins still allowed the polar accumulation of the
γ-TuSC components in most of the cells. This latter experiment
supports the hypothesis that the γ-TuSC is a vector competent
for targeting γ-tubulin to the centrosome. However, as RNAi
treatments do not completely remove all protein, it is possible
that the residual γ-TuRC–specifi c proteins participate in the
formation of a γ-TuRC–like structure that is unstable in the cyto-
plasm, but stabilized upon assembly within the pericentriolar
matrix. The idea that γ-TuSC could be recruited to the poles is
consistent with data reported in Saccharomyces cerevisiae, in
which no orthologues of the γ-TuRC–specifi c proteins have
been reported. In this organism, the main interactions of γ-tubulin
with the microtubule-organizing centers are mediated by the
two γ-tubulin–associated proteins in the γ-TuSC (Knop and
Schiebel, 1997, 1998; Nguyen et al., 1998; Vinh et al., 2002).
Similarly, in mammals, the γ-TuRCs can be tethered to the cen-
trosomes via interactions of the orthologues of Dgrip84 and
Dgrip91 with the centrosomal anchoring proteins kendrin and
centrosome- and Golgi-localized protein kinase N–associated
protein (Takahashi et al., 2002; Zimmerman et al., 2004).
In D. melanogaster, the calmodulin-binding protein CP309 has
been proposed to anchor γ-TuRCs to the centrosome by direct
binding to the γ-TuSC (Kawaguchi and Zheng, 2004). However,
γ-tubulin recruitment to the centrosomes is probably a complex
process, as additional proteins, including ninein (Delgehyr
et al., 2005) and centrosomin (Terada et al., 2003), provide al-
ternative sites for γ-tubulin anchorage. Although evidence sug-
gests that γ-tubulin can be targeted to the centrosomes in the
form of γ-TuSCs, we cannot rule out that in D. melanogaster
other proteins at low abundance, previously uncharacterized
proteins such as the Dgrip79 and Dgrip223 identifi ed by in
silico analyses, or different combinations of known γ-tubulin
Figure 7. Phenotypes observed after cosilencing of all four specifi c components of the 𝛄-TuRC. (A) Analysis of the codepletion by Western blot. Total proteins extracts of control or cosilenced cells were analyzed using antibodies against Dgrip163, Dgrip128, Dgrip75, Dgp71WD, or γ-tubulin (internal loading control). (B) Analysis of the codepletion by immunofl uorescence. (C) Localization of γ-TuSC components in mitotically treated cells. Insets rep-resent a hemispindle stained with antibodies against γ-tubulin, Dgrip84, and Dgrip91. (D) Interphasic pheno-type observed after cosilencing. The left arrowhead indi-cates a large polyploid cell, whereas the right one shows a normal sized interphase cell. (B–D) Blue, chromosomes; red, microtubules; green, γ-TuRC components (B) or γ-TuSC components (C). For B and C, a quantitative view is shown in Table III. Bars, 5 μm.
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partners could be involved in this recruitment (Gunawardane
et al., 2003). Moreover, after concomitant depletion of all
γ-TuRC–specifi c proteins, spindles were nonfunctional and the
amount of γ-TuSC recruited to the mitotic centrosomes was
reduced. Because of the observation that the small complexes
are less active than γ-TuRCs in promoting nucleation (Oegema
et al., 1999; Gunawardane et al., 2000), we propose that the de-
crease in the amount of γ-TuSCs under a threshold can be criti-
cal for spindle functionality.
Interestingly, the transient association of γ-tubulin to the
spindle, as well as to the midbody (Julian et al., 1993; Lajoie-
Mazenc et al., 1994; Khodjakov and Rieder, 1999; Raynaud-
Messina et al., 2001, 2004), was no longer detectable after
individual or concomitant RNAi treatment against Dgrip75,
Dgrip128, Dgrip163, and/or Dgp71WD. Hence, mitotic γ-tubulin
localization to structures outside the pericentriolar material re-
quires the fully assembled γ-TuRCs, and Dgp71WD could play
an active role in this process. The absence of γ-tubulin recruit-
ment along the spindle microtubules and at the midbody can
also be explained by distinct properties of docking proteins at
centrosomes and at noncentrosomal sites. Actually, novel pro-
teins in charge of the recruitment of γ-tubulin complexes along
spindle microtubules have recently been identifi ed in fi ssion
yeast (Sawin et al., 2004; Janson et al., 2005).
Poles lacking complete 𝛄-TuRC fulfi ll basic
microtubule organization
In contrast with the impairment of microtubule assembly from
the pericentriolar material after removal of γ-TuSC components
(Barbosa et al., 2000; Raynaud-Messina et al., 2004; Colombie
et al., 2006), the pericentriolar material appears to remain active
as a microtubule-nucleating center after down-regulation of
specifi c γ-TuRC proteins, as shown by the presence of astral
microtubules identifi ed both by immunofl uorescence and elec-
tron microscopy (unpublished data). Moreover, microtubules
containing 13 protofi laments were still nucleated, challenging
the “template model” (Fig. S4, available at http://www.jcb.org/
cgi/content/full/jcb.200511071/DC1; Moritz and Agard, 2001).
This indicates that preassembly of cytosolic γ-TuRCs does
not seem required for the formation of canonical microtubules.
It is not excluded that a ringlike structure could be assembled
from γ-TuSCs alone or in combination with small amounts of
γ-TuRC–specifi c proteins at the pericentriolar level, although
the purifi ed γ-TuSC does not assemble into larger structures
in vitro (Oegema et al., 1999). In that case, such ringlike com-
plexes would exhibit stoichiometries and protein compositions
different from γ-TuRCs.
Our observations could reconcile the fi ndings of micro-
tubule nucleation in animal cells and in S. cerevisiae. Moreover,
after depletion of γ-TuRC–specifi c components, recruitment of
γ-TuSC appeared suffi cient, in most of the cases, to control the
formation of spindles competent for chromosome segregation.
However, mitotic processes were partly disrupted in cells lack-
ing γ-TuRCs, leading to a transient prometaphase accumulation
and a poor density of spindle microtubules. Several possibilities
could account for these defects, such as a lower effi ciency of
γ-TuSCs compared with γ-TuRCs in microtubule nucleation
(Oegema et al., 1999; Gunawardane et al., 2000), the presence
of distinct binding sites for γ-TuSCs and γ-TuRCs, or the loss
of γ-TuRC recruitment along spindle microtubules, which
would affect the organization or the dynamics of specifi c
microtubule arrays.
Collectively, our results strongly suggest that the assem-
bly of γ-TuRCs is not essential for γ-tubulin–dependent micro-
tubule nucleation at the centrosome, but instead is required for
other, noncentrosomal localization of γ-tubulin. In D. melano-gaster, γ-TuRCs may target a fully organized “nucleation ma-
chinery” to the sites of nucleation; γ-TuSC would act as a
functional unit, whereas γ-TuRC–specifi c proteins would rather
play a more refi ned role in regulating or optimizing of micro-
tubule arrays during mitosis. γ-Tubulin can be targeted to the
poles by the direct docking of γ-TuSCs that exert basic nucle-
ation activity (Fig. 8). This γ-TuSC recruitment could be a
“salvage pathway,” involved only when the dominant microtubule
Figure 8. Model for 𝛄-tubulin recruitment during mitosis in D. melanogaster. γ-Tubulin is targeted to the centrosome as γ-TuRC, but it appears that γ- tubulin complexes that are different from γ-TuRC, probably γ-TuSC, could be directly addressed to the poles.
Table III. Accumulation of centrosomal components in mitotic cells after cosilencing of Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD in cultured cells
Staining Control Cosilencing
Bipolar Monopolar
% % %γ-Tubulin 100 (n = 22) 100 (n = 88) 100 (n = 102)Dgrip84 98 ± 4a 99 ± 3 100 (n = 76)Dgrip91 98 ± 4 100 (n = 112) 98 ± 4Dgrip75 90 ± 6 14 ± 6 0 (n = 70)Dgrip128 88 ± 6 2 ± 2 0 (n = 62)Dgrip163 94 ± 5 0 (n = 61) 0 (n = 50)Dgp71WD 95 ± 2 0 (n = 45) 4 ± 6
Microtubules were stained with antibodies against α-tubulin and chromosomes with DAPI, whereas the spindle poles were immunostained with antibodies against γ-tubulin, Dgrip84, Dgrip91, Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163, and Dgp71WD. For a correct interpretation, we need to keep in mind a decrease in the total amount of γTuRC–specifi c components in-depleted cells. n, number of prometaphases/metaphases analyzed.aConfi dence intervals calculated for P95.
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assembly mechanism mediated by γ-TuRCs is impaired or as a
physiological pathway acting in parallel to γ-TuRC nucleation
activity. Altogether, our data should prompt the reexamination
of the current nucleation models.
Materials and methods
Cell culture and RNA-mediated interferenceRNAi was performed in S2 D. melanogaster cells (Schneider, 1972) ac-cording to Clemens et al., (2000). Cells were treated twice with RNAi at days one and fi ve and harvested on day seven for immunoblottting and immunofl uorescence staining. To perform cosilencing, cells were incubated in the same way, with the four double-stranded RNAs (dsRNAs) against Dgrip75, Dgrip128, and Dgrip163, and Dgp71WD together (20 mM each). The dsRNAs used correspond to positions 717–1,577, relative to start of translation, for Dgrip75 (cDNA clone LD 19773); 157–918, relative to the start position for Dgrip128 (clone GH 21414); 141–846, relative to the start position for Dgrip163 (clone RE 43571); and 145–849, relative to the start position for Dgp71WD (clone RE59956). These dsRNAs were generated from the cDNA plasmid clones as described in Raynaud-Messina et al. (2004).
Fly strainsStrains y1w118 or w118 were used as control strains, and mutant strains Dgrip75175 (Schnorrer et al., 2002), Dgrip163GE27087, and Dgp71WDGE30807 (GenExel, Inc.) were used for the study. Each mutant chromosome had been balanced over CyO, P[Kr:Gal4], P[UAS:GFP]or TM3,Sb,P[Kr:Gal4], P[UAS:GFP] (Casso et al., 2000). The GFP-balanced strains were used to select the homozygous mutant larvae. Viability of 100 selected larvae was studied during 28 d. The defi ciencies Df(2L)Exel7071 and Df(3L)Exel6115 uncovering Dgp71WD or Dgrip163, respectively, were used to produce hemizygous fl ies. Note that Dgp71WD is referred as Dgrip71 in the Fly-base database (http://fl ybase.bio.indiana.edu).
AntibodiesThe mouse monoclonal antibodies T-5168, GTU88 (Sigma-Aldrich), and 1501 (CHEMICON International, Inc.) were used to stain α-tubulin, γ-tubulin, and actin, respectively. The following rabbit antibodies were raised: R62 specifi cally directed against D. melanogaster 23C γ-tubulin (Raynaud- Messina et al., 2004); R403 against the COOH-terminal peptide of Dgrip91 (-C R L D F N E Y Y K K R D T N L S K ) for Western blot and R7075 against the recombinant COOH-terminal Dgrip91 (415–917 aa) for immuno-fl uorescence (Colombie et al., 2006); and R367 against the recombinant full-length Dgrip84. R300 was raised against recombinant full-length Dgrip75 and affi nity purifi ed on recombinant Dgrip75, which is produced in Escherichia coli, R267 was raised against the recombinant COOH- terminal Dgp71WD (486–647 aa), and R360 against the recombinant COOH- terminal Dgrip163 (1150–1352 aa) was used for Western blot. For γ-tubulin detection, we used GTU88 for Western blot analysis and R62 for immunofl uorescence experiments, except for double labeling, where mono-clonal GTU88 antibody was used instead of polyclonal R62 antibody.
We also used Rb666 against BubR1 (Logarinho et al., 2004; gift from C. Sunkel, Universidad do Porto, Porto, Portugal), Rb3133 against Asp (Saunders et al., 1997; gift from D. Glover, University of Cambridge, Cambridge, UK), R19 against Cnn (Heuer et al., 1995; gift from T.C. Kaufman, Howard Hughes Institute, Indiana University, Bloomington, IN), and antibodies against Dgrip128 and Dgrip163 (Gunawardane et al., 2000; gift from Y. Zheng, Howard Hughes Institute, Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD).
Sucrose gradients5–40% sucrose gradient was prepared as described previously (Oegema et al., 1999). Cell extracts (500 μg of protein) were overlaid onto the gra-dient and centrifuged for 4 h and 30 min at 4°C in a swinging rotor (SW55.1; Beckman Coulter) at 45,000 rpm (average 150,000 g). 10 0.5-ml fractions were collected and 250 μl of each fraction were precipitated with cold methanol (−20°C). The nine fractions corresponding to the solu-ble part of the extracts were analyzed by immunoblotting. The calibration of the gradient was determined by running in parallel 0–3-h D. melanogaster embryonic extracts that contain γ-TuSCs and γ-TuRCs.
Western blottingProtein extracts from cultured cells (Raynaud-Messina et al., 2004) and from total larval brains (Colombie et al., 2006) were prepared and sub-
jected to Western blot analyses (7.5% polyacrylamide gel and SDS [Sigma-Aldrich]). Apparent masses were determined by comparison with the SDS-PAGE molecular weight standards (broad range), which were ob-tained from Bio-Rad Laboratories.
Cytological analysis and microscopy techniquesFor immunostaining, S2 cultured cells and semisquashed L3 larval brains were fi xed and permeabilized as previously described (Colombie et al., 2006). DAPI staining of squashed third instar larvae was performed as described previously (Sunkel et al., 1995). For detection, secondary anti-bodies conjugated to Alexa Fluor 488 or 568 (Invitrogen) were used. Fluorescence microscopy was performed on a microscope (Axiovert; Carl Zeiss MicroImaging, Inc) equipped with a Z-motor, using 100×, 1.4 NA, objectives. Z-series images were acquired with a camera and software (Axiocam MRm and Axiovision; Carl Zeiss MicroImaging, Inc.). S2 cell or brain images were subsequently deconvolved using Axiovision, and Z-planes were projected onto a single view. The percentages of the different mitotic phenotypes were determined with confi dence intervals calculated for a P95. Usually, image processing and quantifi cation of fl uorescence were done using Photoshop (Adobe). For quantifi cation of polar γ-tubulin by im-munofl uorescence, we measured the maximal signal obtained after γ-tubulin staining. The signal of the camera was proportional to the fl uorescence in-tensity, and the background and the maximal fl uorescence values were ad-justed to 0 and 25, respectively (Lajoie-Mazenc et al., 1994).
Online supplemental materialFig. S1 shows colabeling of γ-tubulin with associated proteins in Dgrip75-depleted cells. Fig. S2 shows phenotypes observed after Dgp71WD deple-tion in S2 cells. Fig. S3 shows mitotic phenotypes in the Dgp71WD mutant. Fig. S4 shows the number of microtubule protofi laments in mitotic cells after Dgrip75 RNAi treatment. Online supplemental material is available at http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200511071/DC1.
We thank Dr. Y. Zheng for the gift of Dgrip128 and Dgrip163 antibodies, Dr. D. Glover for Asp antibodies, and Dr. T.C. Kaufman for Cnn antibodies. We would particularly like to thank A. Merdes and J-E. Gairin for their critical comments.
This work was supported by Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC; grant 4720XP0230F), Fonds Européen de Développement Régional, Action Concertée Incitative (grant 04 5 566), Centre National de la Recher-che Scientifi que (CNRS), and Pierre Fabre funds. C. Verollet was supported by the CNRS and the Laboratoires Pierre Fabre, and N. Colombié was supported by the Ministère de la Recherche and the ARC.
Submitted: 17 November 2005Accepted: 18 January 2006
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JCB • VOLUME 172 • NUMBER 4 • 2006 528
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ber 3, 2006 w
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47
III- Etude du rôle des protéines du γ-TuRC en interphase
Le rôle des protéines des complexes γ a majoritairement été abordé lors de la mitose,
stade du cycle cellulaire où a lieu une réorganisation complète du cytosquelette
microtubulaire. Peu d’études ont permis de caractériser un rôle de la tubuline γ et des
protéines associées en interphase.
Dans les cellules de mammifères, la fonction de nucléation des microtubules par la
tubuline γ en interphase a seulement été montrée par deux expériences de re-nucléation
après traitement par le froid (Joshi et al., 1992 ; Luders et al., 2006). La microinjection
d’anticorps dirigés contre GCP3, une protéine associée à la tubuline γ dans le γ-TuSC,
ralentit aussi la re-nucléation des microtubules dans les cellules Hela en interphase (Tassin
et al., 1998). Chez les levures, les protéines des complexes de tubuline γ régulent la
nucléation et la dynamique globale des microtubules (Fujita et al., 2002; Geissler et al.,
1996; Marschall et al., 1996; Paluh et al., 2000; Spang et al., 1996; Vardy and Toda, 2000;
Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005). La perte de fonction par mutation
de Alp4, l’homologue de Dgrip84 chez S. pombe, entraîne une stabilisation de l’extrémité
plus des microtubules interphasiques (Zimmerman and Chang, 2005).
J’ai caractérisé le rôle de la tubuline γ et des protéines associées en interphase, dans
l’organisation et la dynamique des microtubules, en inhibant leur expression par RNAi
dans les cellules S2 en culture. L’utilisation d’une lignée de cellules S2 qui expriment de
manière stable la tubuline α-GFP nous a permis d’analyser en temps réel d’une part la
recroissance des microtubules après désassemblage par le froid et d’autre part la dynamique
des microtubules individuels.
tubuline γ
Actine
Contrô
le
RNAi 4
jours
Contrô
le
RNAi 7jou
rs
RNAi 5jou
rs
76 91 94% de déplétion
A
C
B
anormalnormal
ba
tubuline γ, MTs, ADN
RNAi tubuline γ Contrôle
d ba c
tubuline γ
D
RN
Aitu
bulin
e γ
Con
trôl
e
0 min
6-8 min 10-15 min 40-50 min
a ed
fe
b
h j
c
g
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
9
8
51
91
92
90
49
% de cellules
10
Contrô
le
RNAi 4 jo
urs
RNAi 7
jour
sRNAi 5
jour
s
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0-2 2-4 4-6 6-8 8-10 10-15 15-20 20-25 25-30 30-40
Nb
de M
Ts p
ar c
ellu
le
40-50 min
ContrôleRNAi tubuline γ 7 jours
Figure 18 : Organisation et re-croissance des microtubules après déplétion de la tubuline γ (7 jours). A-B. Déplétion de la tubuline γ évaluée par Western Blot (A) et immunofluoresence (B). A. Des extraits de cellules S2 tubuline α-GFP sont analysés en utilisant des anticorps contre la tubuline γ (R62) et l'actine comme contrôle de charge. Les microtubules sont marqués en vert (GFP), l'ADN en bleu et la tubuline γ en rouge (R62).C. Organisation des microtubules après déplétion de la tubuline γ. Les microtubules peuvent s'étendre vers la périphérie (a-vert) ou s'enrouler autour du noyau (b-rose). Le graphique à droite montre l'analyse quantitative des deux phénotypes. D. Re-croissance des microtubules après traitement par le froid. Les cellules sont incubées 40 minutes à 4°C et la re-croissance des microtubules à 25°C est suivie pendant 50 minutes. L'analyse quantitative est représentée dans le graphe en dessous. Les lignes blanches sont les contours des cellules obtenus par microscopie en DIC. Echelle, 5 μM.
48
1) Rôle du γ-TuRC dans la nucléation et l’organisation des
microtubules en interphase
Les expériences d’immunofluorescence sur les cellules S2 fixées sur lame de verre
n’ont pas permis d’analyser l’organisation des microtubules en interphase (Colombie et al.,
2006). Le revêtement des lamelles par la concanavaline A permet une meilleure adhérence
des cellules et donc une meilleure visualisation du réseau microtubulaire interphasique
(Figure 18Ca) (Rogers et al., 2002).
Dans les cellules S2 exprimant la tubuline α-GFP, un traitement par RNAi de 4 ou 5
jours contre la tubuline γ induit une forte diminution du niveau de la protéine en Western
Blot et en immunofluorescence (Figure 18A-B). Dans ces conditions, l’organisation des
microtubules interphasiques n’est pas affectée. Comme dans les cellules contrôles, les
microtubules issus de point multiples autour du noyau ont leurs extrémités plus dirigées
vers la périphérie de la cellule (Figure 18Ca). Par contre, après un traitement de 7 jours
correspondant à un double traitement RNAi (inhibition de plus de 90% du niveau
d’expression de la tubuline γ), 50% des cellules présentent un réseau de microtubules
désorganisé. Les microtubules ne s’étendent plus avec leur extrémité plus vers le cortex
mais se courbent et s’enroulent autour du noyau (Figure 18Cb, phénotype « anormal »).
Après désassemblage des microtubules par le froid, nous avons suivi l’apparition des
microtubules nouvellement nucléés dans une zone sous-corticale de 7 μm après retour à
température ambiante. Certains microtubules atteignent cette zone sous-corticale en 4-6
minutes après le changement de température dans les cellules contrôles. Le nombre de
microtubules atteignant la zone définie augmente linéairement au cours des 50 minutes
suivantes. Dans les cellules traitées de manière prolongée (7 jours) par un RNAi, 10 à 15
minutes sont nécessaires pour voir apparaître les premiers microtubules dans la même zone
sous-corticale. L’absence de tubuline γ induit donc un retard de recroissance des
microtubules d’environ 10 minutes (Figure 18D). Ce retard peut être le reflet d’un retard de
renucléation des microtubules mais aussi de défauts de réorganisation ou de dynamique des
microtubules.
c
c
RN
Ai D
grip
75
0 min
6-8 min 10-15 min 40-50 min
Con
trôl
e
A
9 1 51 53 9 3 9 1 6 0 56
9 4 9 4 7 7 9 4 0 4 4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Contrôle
RNAi tub γ
RNAi Dgrip84
RNAi Dgrip75
% d
e ce
llule
s
anormal
normal
RNAi Dgp71WD
RNAitubγ+Dgrip75
B
a dca b
ef g hf
0
10
20
30
40
50
60
70
RNAi Dgrip75
Control
0-2 2-4 4-6 6-8 8-10 10-15 15-20 20-25 25-30 30-40 40-50 min
RNAi Dgrip84
Nb
de M
Ts p
ar c
ellu
le
RNAitubγ+Dgp71WD
RNAi Dgp71WD
Figure 19 : L'organisation et la re-croissance des microtubules dépend du γ-TuSC. A. Organisation des microtubules après déplétion à 7 jours des com-posants du γ-TuRC. Le graphique montre l'analyse quantitative des deux phéno-types ("normal" et "anormal"). B. Re-croissance des microtubules après déplé-tion à 7 jours des composants du γ-TuRC. La re-croissance des microtubules est suivie. L'analyse quantitative est représentée dans le graphe en dessous. (voir Figure 18 pour la légende) Les lignes blanches sont les contours des cellules obte-nus par microscopie en DIC. Echelle, 5 μM.
49
Pour déterminer quelles sont les protéines du γ-TuRC nécessaires à l’organisation
des microtubules en interphase, j’ai analysé les phénotypes à long terme induits par la
déplétion de Dgrip84, un partenaire de la tubuline γ dans le γ-TuSC, et de deux protéines
spécifiques du γ-TuRC, Dgrip75 et Dgp71WD. L’analyse directe de la fluorescence montre
que la déplétion de Dgrip84 entraîne des défauts d’organisation des microtubules similaires
à ceux induits par la déplétion de la tubuline γ (Figure 19A). Par contre, la déplétion de
Dgrip75 ou de Dgp71WD n’a aucun effet sur l’organisation globale des microtubules
(Figure 19A). Nous avons également vérifié que la déplétion par RNAi d’une des protéines
spécifiques du γ-TuRC et de la tubuline γ simultanément n’entraîne pas de phénotypes plus
forts que la simple déplétion de la tubuline γ (Figure 19A). Cette analyse a été complétée
par les expériences de recroissance des microtubules. Le traitement par RNAi contre
Dgrip84 provoque un retard de recroissance comparable à celui décrit après déplétion de la
tubuline γ. Au contraire, les cinétiques de recroissance ne sont pas affectées par l’absence
de Dgrip75 ou de Dgp71WD (Figure 19B).
De manière cohérente avec ce qui a été précédemment montré en mitose, le γ-TuSC
serait le complexe minimum nécessaire pour la nucléation et l’organisation des
microtubules en interphase.
2) Rôle du γ-TuRC dans la dynamique des microtubules en
interphase
Voir Vérollet et al., soumis , 2007
• Dynamique des microtubules en interphase en absence des protéines du γ-
TuRC
La lignée S2 exprimant la tubuline α en fusion avec la GFP cultivée sur
concanavaline A a permis d’analyser le rôle des protéines du γ-TuRC dans la dynamique de
l’extrémité plus des microtubules à la périphérie cellulaire. Après traitement par RNAi
50
contre la tubuline γ pendant 5 jours, le niveau de la protéine est réduit d’au moins 80% sans
affecter l’organisation globale ou la nucléation des microtubules (Figure 18A et C). J’ai
réalisé des films d’environ 3 minutes avec des prises toutes les 2 secondes, pour des
cellules contrôles et traitées par RNAi. L’analyse de ces films a permis de définir deux
classes de microtubules selon leur comportement près du cortex cellulaire : les
microtubules pouvant être suivis pendant les 3 minutes dans la zone sous-corticale de 6 μm
ont été qualifié de microtubules « stables », alors que les microtubules qui apparaissent ou
disparaissent de cette zone pendant la durée du film ont été appelé « instables ». Seulement
20% des microtubules sont « instables » dans les cellules contrôles, par contre, après
traitement par RNAi durant 5 jours contre la tubuline γ, plus de 75% des microtubules sont
« instables ». La mesure des paramètres dynamiques montre que le paramètre le plus
affecté par l’absence de la tubuline γ est le temps passé en pause par les microtubules. Il est
diminué de moitié dans les cellules traitées. De plus, la fréquence des phénomènes de
catastrophes est augmentée de 2 fois de manière significative. L’observation d’anomalies
de fluorescence dans les microtubules-GFP (« zones noires ») et leur suivi en temps réel a
permis de démontrer que l’extrémité affectée est principalement l’extrémité plus.
Ces résultats mettent en évidence un nouveau rôle de la tubuline γ dans la régulation
de la dynamique des microtubules dans des cellules animales, en tant que protéine
stabilisatrice de l’extrémité plus.
La déplétion de Dgrip84, une protéine du γ-TuSC ou des protéines spécifiques du γ-
TuRC entraîne un augmentation de la proportion de microtubules « instables » et les effets
sur les paramètre dynamiques sont comparables à la déplétion de la tubuline γ. La tubuline
γ contrôlerait donc la dynamique de l’extrémité plus des microtubules sous la forme de γ-
TuRC.
• Analyse de la localisation des protéines du γ-TuRC en interphase
La tubuline γ se localise à l’extrémité moins des microtubules et la stabilise (Wiese,
2000). Son nouveau rôle dans la régulation de la dynamique de l’extrémité plus a mené à
l’analyse fine de sa localisation en interphase. La majeure fraction de tubuline γ est soluble
51
dans le cytoplasme (Moudjou et al., 1996). Après élimination de la tubuline γ
cytoplasmique par perméabilisation des cellules avant fixation, j’ai montré qu’une fraction
de tubuline γ se localise le long des microtubules avec un marquage discontinu allant
jusqu’à l’extrémité plus. Ce marquage disparaît après traitement par RNAi contre la
tubuline γ. Il a été confirmé dans les cellules S2R+, un autre type de cellules de drosophile,
qui favorise la détection de la tubuline γ grâce à leur facilité à s’étaler naturellement et à
former des prolongements. Pour s’assurer que cette localisation n’était pas induite de
manière artificielle par la pré-perméabilisation, deux autres méthodes de fixation ont été
utilisées (MeOH et paraformaldéhyde). Le marquage de la tubuline γ le long des
microtubules disparaît après déassemblage des microtubules par le froid mais pas après
traitement à la latrunculine, qui déassemble le cytosquelette d’actine, indiquant que cette
localisation est spécifique aux microtubules. Cette localisation est dépendante de
l’assemblage du γ-TuRC puisque (1) Dgrip84 et Dgp71WD se localisent également sur les
microtubules cytoplasmiques et (2) la tubuline γ n’est plus recrutée sur les microtubules
après désassemblage du complexe par des traitement RNAi contre Dgrip75 ou Dgp71WD.
Dgp71WD n’est pas essentielle pour l’assemblage d’un complexe de grande taille sur
gradient de sucrose (Vérollet, 2006 ; Haren, 2006 ; Luders, 2006), par contre, elle est
indispensable pour la localisation de la tubuline γ sur les microtubules cytoplasmiques.
• Analyse des +TIPs impliquées dans la régulation de la dynamique des
microtubules par le γ-TuRC
Le γ-TuRC pourrait réguler la dynamique des microtubules indirectement en
affectant la fonction de protéines qui régulent l’extrémité plus des microtubules. Chez les
levures, la régulation de la dynamique des microtubules par les complexes de tubuline γ
met en jeu des +TIPs, telles que Tip1, une protéine de la famille CLIP chez S. pombe ou
Bim1 l’homologue de EB1 chez S. cerevisiae (Cuschieri et al., 2006; Zimmerman and
Chang, 2005). Le passage des +TIPs au centrosome pourrait être essentiel pour leur
fonction à l’extrémité plus (Cuschieri et al., 2006; Sawin and Tran, 2006). Afin de tester
notre hypothèse, nous avons analysé l’implication potentielle des +TIPs dans
l’augmentation de la dynamique des microtubules en absence de tubuline γ. Parmi les
52
+TIPs, les protéines de la famille CLASP stabilisent les microtubules interphasiques dans
divers organismes en générant des pauses (Mimori-Kiyosue et al., 2005; Sousa et al.,
2007). Ses rôles dans la dynamique des microtubules étant similaires à ceux de la tubuline
γ, je me suis tout d’abord intéressé à la seule CLASP identifiée chez la drosophile,
Mast/Orbit (Maiato et al., 2002). Comme précédemment décrit, la déplétion de Mast par
RNAi induit une augmentation du nombre de microtubules « instables » et une diminution
des temps en pause (Sousa et al., 2007). Ces effets sont identiques à ceux obtenus après
déplétion de la tubuline γ et ne sont pas amplifiés par la déplétion simultanée de Mast et de
la tubuline γ. Ces observations suggèrent que la tubuline γ et Mast pourraient être
impliquées dans un même mécanisme de régulation de la dynamique des microtubules.
Cependant, les localisations de Mast au centrosome en mitose et à l’extrémité plus des
microtubules ne sont pas affectées dans les cellules traitées par RNAi contre la tubuline γ.
Dans les cellules de mammifères, les CLASPs stabilisent les microtubules cytoplasmiques
via leur interaction avec EB1 (Mimori-Kiyosue et al., 2005). Cette dernière agit comme un
facteur déstabilisateur des microtubules dans les cellules S2 en diminuant les temps de
pause des microtubules en interphase (Rogers et al., 2002). Après co-déplétion de la
tubuline γ avec EB1, les microtubules présentent des paramètres dynamiques similaires aux
cellules contrôles. La déplétion de EB1 restaure donc les phénotypes induits par la
déplétion de la tubuline γ. D’autre part, après traitement par RNAi contre la tubuline γ,
Dgrip84 ou Dgrip75, EB1 s’accumule d’une manière anormale à l’extrémité plus des
microtubules contrairement à Mast dont la quantité à l’extrémité plus reste constante. Cette
accumulation d’une protéine déstabilisatrice est en accord avec l’augmentation de la
dynamique de l’extrémité plus des microtubules en absence de γ-TuRC.
En conclusion, ces résultats ont révélé un nouveau rôle pour la tubuline γ dans la
stabilisation de l’extrémité plus des microtubules en interphase, dépendant du γ-TuRC. Il
peut être corrélé à la localisation du γ-TuRC le long et à l’extrémité plus des microtubules.
Le γ-TuRC pourrait réguler la dynamique des microtubules et les interactions entre les
microtubules et le cortex en contrôlant la quantité de la +TIP EB1 par rapport à Mast/Orbit
à l’extrémité plus.
A novel role of the �-tubulin complex as a microtubule plus-end stabilizing factor in
Drosophila cells
Christel Vérollet1, Aureliana Sousa2, Paula Sampaio2, Michel Wright1, Andreas Merdes1
Claudio E. Sunkel2, 3and Brigitte Raynaud-Messina1 #.
1Centre de Recherche en Pharmacologie~Santé, UMR 2587 CNRS-Pierre Fabre, ISTMT, 3,
rue des Satellites BP 94244, 31432 Toulouse Cedex 4, France. 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, Rua do Campo
Alegre 823, 4150-180 Porto, Portugal.3ICBAS-Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar, Universidade do Porto, Porto,
Portugal
# to whom correspondence should be addressed
email : [email protected]
Fax : +33-5-34321350
Phone : +33-5-34321359
Running head: Role of γ-TuRC in microtubule plus-end dynamics.
Key-words: γ-tubulin, γ-TuRC, interphase, microtubule, Drosophila.
Summary
Microtubules are highly dynamic heteropolymers of α and β-tubulin involved in
many cellular processes. Nucleation of microtubules is supported by γ-tubulin[1, 2]. �-
Tubulin acts within two major complexes: the γ-Tubulin Ring Complex (γ-TuRC) and
its core subunit, the γ-Tubulin Small Complex (γ-TuSC)[3]. Proteins of the γ-TuSC are
highly conserved in all eukaryotes, and are essential for viability and assembly of
functional mitotic spindles[4-9] acting as the hub complex for microtubule nucleation
and organization. In contrast, γ-TuRC-specific components are non-essential but
required for efficient mitotic progression[10-14] and organization of cell type-specific
microtubule networks[15]. However, the specific functions of the γ-TuRC remain poorly
understood, especially during interphase. Using Drosophila cells, we show that the γ-
TuRC plays a role in microtubule dynamics acting as an anti-pause factor at the plus-
ends. Consistent with these data, we demonstrate that a fraction of γ-TuRCs localizes
along interphase microtubules and at their plus tips. Altered microtubule behavior after
γ-TuRC depletion correlates with an abnormal localization of the plus-end-tracking
protein, EB1.
We propose a novel role of γ-tubulin complexes in regulating microtubule
dynamics, by controlling the balanced activities of plus-end tracking proteins and thus
in this way the connections between microtubules and cortex.
Results and Discussion
Plus-end microtubule dynamic behavior is enhanced in γ-tubulin-depleted cells
To address the role of γ-tubulin during interphase, we performed a time-lapse
microscopy analysis in S2 Drosophila cells stably expressing GFP-α-tubulin. RNAi treatment
for four to five days against 23Cγ-tubulin, the major isotype expressed in these cells, induced
a significant decrease of the protein level (supplemental-figureA-B). This depletion prevented
the accumulation of γ-tubulin at the poles and along spindle microtubules (MT) during
mitosis[16]. Moreover, γ-tubulin during interphase was no longer detectable in RNAi-treated
cells (supplemental-figureB). Live analysis of control and γ-tubulin-depleted cells (movie1)
revealed that MTs could be classified into two classes dependent on their behavior near the
cell cortex: MTs followed during the whole duration of the movie in the sub-cortical area
(6μm) were defined as “stable MTs” while MTs which appeared or disappeared from this area
during the period of recording were defined as “dynamic MTs” (Fig. 1A-B). In control cells,
most MTs were rather stable (91%) but depletion of γ-tubulin resulted in a significant
decrease of stable MTs (53%) after 4 days of RNAi treatment reaching 25% after 5 days (Fig.
1B). To further explore the role of γ-tubulin on the behavior of MTs, we analyzed the
parameters of dynamic instability. In control cells, MTs alternated between growth and
shrinkage states, with characteristics consistent with published data in S2 cells[17, 18] (Fig.
1C). However, after depletion of γ-tubulin, both MT growth and especially shrinkage rates
were higher than in control cells (Fig 1C, left). The most striking difference was observed in
the times spent in the different states. After knock-down of γ-tubulin, MTs that reached the
periphery spent significantly less time in the pause state (20%) compared to controls (48%)
(Fig 1C, right). The analysis of the transitions between the three states showed a significant
increase in the frequencies of catastrophe while rescues were not noticeably affected (Fig.
1D). These quantitative changes reflect the most representative phenotype observed in which
half of the MTs were growing, reached the cell cortex area and, instead of pausing, started
rapid depolymerization and disappeared in the cell center. These results demonstrate that γ-
tubulin acts as a stabilizing factor in MT dynamics. The behavior of short free MTs, probably
resulting from severing activity, is consistent with this interpretation. In control cells, the
length of these short MTs was maintained or even elongated whereas in γ-tubulin treated
cells, after alternate phases of growing and shortening, these free MTs disappeared (movie2).
To determine whether the increased MT dynamics observed after γ-tubulin-depletion
were indeed due to altered plus-end dynamics rather than resulting from translocation and
movement of entire microtubules, we examined individual MT lattice at higher magnification,
showing uneven incorporation of GFP-α-tubulin in the form of ‘speckles’. In γ-tubulin
depleted cells, both speckle and plus-end displacements were tracked for 10 individual MTs
(Fig. 1E). While speckle positions oscillated around a constant arbitrary value, the MT plus-
end was growing (pink) or shortening (green) (movie3) suggesting that γ-tubulin plays a
specific role upon the dynamics of MT plus-ends.
Role of γ-tubulin on MT dynamics is dependent on γ-TuRC integrity.
We next investigated which γ-tubulin complex was necessary to regulate interphase
MT dynamics. In Drosophila, the γ-TuSC is composed of γ-tubulin and of the proteins
Dgrip84 and Dgrip91, in a 2/1/1 stoechiometry while the γ-TuRC result from the association
of multiple γ-TuSCs with at least three additional grip-motif-proteins (Dgrip75, Dgrip128 and
Dgrip163) and a WD-motif-protein (Dgp71WD)[3]. Grip-proteins appear to constitute the
core of the large complex, while Dgp71WD seems essential for the targeting or/and the
functionality of this complex[12, 19, 20]. We performed RNAi treatment against one partner
of γ-tubulin in the γ-TuSC (Dgrip84) or two representative proteins specific of the γ-TuRC
(Dgrip75 and Dgp71WD). Down-regulations were efficient, as verified by Western blot and
immunofluorescence analyses (not shown, [12]). After depletion of either γ-TuSC or γ-TuRC
specific subunits, the proportion of dynamic MTs increased significantly (Fig. 2A) and the
effects upon different dynamic parameters were identical to those obtained after depletion of
γ-tubulin alone (Fig. 2B-C). Disruption of the γ-TuRC produced a shift from the pause state
mainly towards the shrinkage state, giving rise to an increase in a dynamic MT subpopulation
(Fig. 2A-C). Hence, the role of γ-tubulin as a MT stabilizing factor appears to be mediated
through the complete γ-TuRC structure. Previous studies, conducted in fungi, have already
suggested that γ-tubulin and its associated proteins play an essential role in the regulation of
MT dynamics. γ-Tubulin was first characterized in Aspergillus nidulans as an extragenic
suppressor of a β-tubulin mutation, inducing MT hyperstabilization[4]. Moreover, mutants of
γ-TuRC genes in budding and fission yeasts showed abnormal MT length in interphase[6, 9,
10, 13] and several of these mutants in S. pombe were hypersensitive to MT-destabilizing
agents[13]. The first direct indications for a role of γ-tubulin complexes in MT dynamics were
obtained from experiments in fission yeast where mutations of the Dgrip84 orthologue Alp4
or overexpression of its C-terminal domain strongly affected dynamic behavior of MTs[21,
22]. In these studies, MTs were found to exhibit continuous growth, with less frequent
catastrophe events, suggesting that γ-tubulin complexes act as MT-destabilizing factors.
Different explanations could account for the discrepancy between the results obtained in yeast
and in Drosophila cells. First, wild-type fission yeast contains only 3-5 MT bundles in
interphase, and this number drops to 1-2 in Alp4 mutants. This results in an increase of the
soluble pool of α/β-tubulin that can indirectly affect the dynamics of the MTs. In contrast, in
Drosophila cells, we do not notice any significant change in soluble tubulin levels after γ-
tubulin depletion (not shown). A second reason could be the difference in the behavior of the
cortical MTs between the two organisms. In fission yeast, when growing interphase MTs
contact cell tips, they undergo catastrophe and shrink back to the nucleus[23]. In contrast in
Drosophila cells, a fraction of MTs is stabilized after contact with the cell cortex. Thus, MT
interactions with the cell cortex can affect MT dynamic behavior differently, depending on
the organism and on the localization of the cell contact. However, these apparently conflicting
results are nevertheless consistent with the proposal that γ-tubulin is involved in the control of
MT-cortex interactions via its function on MT dynamics.
γ-Tubulin is localized along cytoplasmic MTs in the form of γ-TuRCs.
The role of γ-tubulin in the regulation of MT plus-end dynamics in interphase appears
unexpected, as γ-tubulin has been described to localize to the centrosome and to bind MT
minus-ends[1, 2, 4]. Therefore, we further investigated the localization of γ-tubulin. To
improve detection of γ-tubulin, we reduced the large soluble cytoplasmic pool[16, 24] by
permeabilizing S2 cells before formaldehyde fixation (Fig. 3A). In contrast to many
mammalian cell lines, no accumulation of γ-tubulin was detected to the interphase centrosome
in Drosophila cells. This is consistent with the observation that MTs in these cells are
organized randomly in the cytoplasm, without any dominant organization center[8]. Detailed
analysis of the peripheral region of the cells showed that most of the insoluble γ-tubulin
localized along cytoplasmic MTs and in some cases near the plus-ends (Fig. 3A, white
arrowheads). To ensure that γ-tubulin localization along MTs was not artificially induced
during the preparation procedure, we applied different fixation methods, using cold methanol
or paraformaldehyde in S2 cells (not shown) as well as in SR2+ cells (Fig. 3B). The detection
of γ-tubulin was facilitated in SR2+ cells because of their natural ability to spread and form
extensions[25] (Fig. 3B-C). In these cells, γ-tubulin was clearly detected along the MTs,
including the distal ends (Fig. 3B-C, white arrowheads). γ-Tubulin labeling along MTs was
obtained using another independent antibody (supplemental-figureCa). This staining
disappeared after cold-induced MT depolymerization (supplemental-figureD). However, it
was resistant to treatment by latrunculin, indicating that the cytoplasmic localization of γ-
tubulin was independent of polymerized actin (not shown). Moreover, γ-tubulin RNAi
treatment abolished the cytoplasmic immunofluorescence signal (Fig. 3Cc-d compared to
control 3Ca-b), confirming the specificity of the staining. Antibodies directed against the γ-
tubulin associated proteins, Dgrip84 or Dgp71WD, also decorated interphase MTs
(supplemental-figureCb-c). These immunostainings strongly suggested that γ-tubulin
localized along MTs as the complete γ-TuRCs. In Dgrip75- or Dgp71WD-RNAi treated cells,
γ-tubulin staining along cytoplasmic MTs was strongly reduced (Fig. 3Ce-f and g-h, 3D for
quantification). Depletion of either protein did not affect the total amount of γ-tubulin but
modified the composition of the complexes involving γ-tubulin. Previous studies have shown
that γ-tubulin is mainly found in the form of γ-TuSCs after Dgrip75 treatment, and in the form
of γ-TuRC-like structures after Dgp71WD treatment[12]. Altogether, these results suggest
that the full γ-TuRC is necessary to insure recruitment of γ-tubulin along the MT lattice and at
the MT tips in interphase. This is the first report of γ-tubulin localization on interphase MTs
in animals. Other examples for localization of γ-tubulin along MTs include fission yeast and
higher plants in interphase, and animal and plant cells during mitosis. In fission yeast and
higher plants, interphase MTs are arranged in non-centrosomal arrays[26, 27], and γ-tubulin
complexes associated with MTs have been proposed to act as secondary MT organization
centers[28]. Similar principles may govern non-radial MT organization in cultured
Drosophila cells, because a few MT-bound γ-TuRCs could correspond to sites of MT
branching (Fig. 3A, red arrowhead). During mitosis in animal and plant cells, a part of γ-
tubulin localizes on the surface of spindle MTs with a preferential distribution along
kinetochore MTs[26, 29, 30]. Even though the significance of this localization is not entirely
understood, it may imply a role of γ-tubulin in stabilizing a subset of spindle MTs, such as the
kinetochore fibers known to have increased stability[29]. This idea is consistent with the
increased dynamics of interphase MTs after γ-tubulin depletion in S2 cells (this study).
γ-tubulin-dependent control of EB1 localization to MT tips is necessary to maintain
regular MT dynamics.
Because γ-tubulin both localizes along MTs and influences their dynamics in the form
of γ-TuRCs, one attractive possibility would be that the fraction of γ-TuRCs linked to MTs
participates in the regulation of plus-end MT dynamics. γ-TuRCs could act either directly, as
stabilizing microtubule-associated proteins, or indirectly, affecting the function of
microtubule-bound factors such as plus-end tracking proteins (+TIPs) as previously suggested
in yeast[21, 31]. To explore the second hypothesis, we analysed the potential involvement of
these proteins in the regulation of MT dynamics after γ-tubulin depletion. Among the +TIPs,
the Mast/Orbit/CLASP family was shown to be required for the stability of interphase MTs in
different organisms, by promoting pauses and restricting MT dynamics at the cell cortex[17,
32]. Because of the similarities between the roles of this protein family and γ-tubulin on MT
dynamic behavior, we analyzed whether Mast/Orbit, the single CLASP homologue identified
in Drosophila, was involved in mediating γ-tubulin dependent defects. Mast RNAi led to a
potent depletion of Mast protein level (supplemental-figureE-F). Consistent with previous
data[17], this treatment induced a decrease in MT density (supplemental-figureF), an increase
in the number of dynamic MTs (Fig. 4A), and a significant reduction of time spent in pause
(Fig. 4B). The extent of these effects was comparable to those described after depletion of γ-
tubulin or after co-silencing of γ-tubulin and Mast (Fig. 4A-B). The lack of additive effects
suggests that these two proteins act in a common pathway in regulating MT dynamics.
However, the localization of Mast at the growing MT plus-ends did not appear affected after
γ-tubulin depletion (Fig. 4C).
As CLASPs have an important role in the regulation of interphase MTs through their
interaction with EB1[32], we then analyzed the role of EB1 in γ-tubulin-dependent effects on
MT dynamics. In S2 cells, EB1 acts as a MT destabilization factor during interphase [18].
EB1 depletion was monitored by Western blot and immunofluorescence (supplemental-
figureG-H). As previously described[18], depleting EB1 for four days did not alter MT
organization (not shown). However, this treatment induced a stabilization of MTs as judged
by a significant decrease in the number of dynamic MTs, and prolonged time spent in pause
(Fig. 4D-E). Interestingly, after co-depletion of γ-tubulin and EB1, we found that MTs
exhibited dynamic properties that were similar to those of control cells (Fig. 4D-E).
Accordingly, EB1-depletion restores MT dynamics effects induced by γ-tubulin depletion. To
further explore how EB1 down-regulation could compensate MT instability caused by γ-
tubulin depletion, we analyzed the localization of EB1 in cells depleted of γ-tubulin. Although
γ-tubulin RNAi treatment did not affect the pool of EB1 (supplemental-figureG), it caused
abnormal accumulation of this destabilization factor at the MT plus-ends (Fig. 4F). While
control MTs exhibited an average of 2 dots of EB1 at their plus-ends, most of γ-tubulin
depleted MTs displayed more than 4 dots. Similar EB1 accumulation was observed after
individual depletion of Dgrip75 or Dgp71WD (not shown).
Taken together, these data suggest that γ-TuRCs regulate the dynamics of interphase
MTs at the cell cortex at least by controlling the balance between Mast-EB1 at MT plus-ends.
We propose that in wild-type cells, the balance of Mast-EB1 promotes MT local rescue at the
cell cortex by favoring Mast-dependent MT stabilizing activity. However, in γ-tubulin
depleted cells, EB1 recruitment is enhanced at the plus-ends while Mast signal remains
unchanged; therefore the ratio Mast/EB1 would now favor EB1-dependent MT destabilizing
activity. This could explain the increase in MT dynamics after γ-tubulin depletion. This model
is in agreement with the mechanism suggested in Hela cells in which MT dynamics at the cell
cortex can be regulated by CLASP, possibly through the association with EB1[32]. This
model may be an oversimplification as many additional +TIPs could interact and participate
in this mechanism.
Whereas the essential role of γ-TuSC proteins in MT nucleation is well established, the
function of γ-TuRC-specific proteins only starts to be unveiled. During mitosis in Drosophila
cells, γ-TuSCs appear sufficient for pole-dependent MT nucleation and organization, while γ-
TuRCs increase the efficiency of bipolar spindle formation[12]. Moreover, the grip-specific
components of the TuRC are not essential for viability of flies. At least two of them, Dgrip75
and Dgrip128, are required for the formation of distinct sets of MTs during germline
development[11]. Consistent with these studies in Drosophila, mutants in the genes encoding
the S. pombe orthologues of γ-TuRC-specific components are viable[10, 13, 14]. Altogether,
we propose that the γ-TuSCs function as the core units insuring MT nucleation, while the γ-
TuRCs may regulate specific processes such as mitotic progression, organization of cell-type-
specific MT networks or MT/cortex interactions through their role in MT dynamics.
Experimental procedures
Cell culture and RNA-mediated interference
Drosophila Schneider S2 cells, stably transfected with a plasmid encoding GFP-α-tubulin[18]
were used. RNA interference was performed as described[12]. The dsRNAs against
Mast/Orbit (CG32435) and EB1 (CG3265) were generated from the library of Drosophila
cDNA Openbiosystem[33]. For γ-tubulin depletion, live microscopy experiments were done 4
and 5 days after the addition of dsRNA for a kinetic analysis.
Western blotting and Cytological analysis
Protein extracts from cultured cells were prepared and subjected to Western blot analyses as
described[16]. For immunostaining, S2 and S2 GFP-α-tubulin cells were cultured on 0.5
mg/mL concanavalin A-coated coverslips for at least 2h. Cells were fixed with pre-cooled –
20°C methanol for 10 min and then immunostained[12]. To detect γ-tubulin, Dgrip84 and
Dgp71WD along MTs, S2 and S2R+ cells[25] were permeabilized 1 min in PEM ( 100mM
PIPES, 1 mM EGTA, 2mM MgCl2, pH 6.8) containing 0.5% v/v Triton X-100 and then fixed
in PEM containing 1% dimethyl sulfoxyde and 3.7% v/v paraformaldehyde[16] before
immunostaining. Fluorescence microscopy was performed with Deltavision RT equipment on
an Olympus IX71 microscope, using a 100x 1.4 NA objective. Images were obtained with a
CoolSnap camera, subsequently de-convolved, and optical sections were projected onto a
single view. Images were edited using Adobe Photoshop. Quantification of γ-tubulin
localization was performed using a home-made macro-command in Visilog 6.4 software.
The mouse monoclonal antibodies T-5168, GTU88 (Sigma-Aldrich) and 1501 (Chemicon
International, Temecula, CA) were used to stain α-tubulin, γ-tubulin and actin, respectively.
The following rabbit antibodies were used: R62 against Drosophila 23C γ-tubulin[16]; R367
against Dgrip84 and R267 against Dgp71WD[12]. The rabbit antibodies Rb276 against Mast
and the rabbit antibodies against EB1 (gift from Dr. Rogers, University of North Carolina,
USA) were used.
Live imaging of MTs
Drosophila S2 GFP-α-tubulin cells were grown in an aluminium culture chamber with
concanavalin A-coated coverslips for at least 2h before observation. Images were acquired at
2 s-intervals for 200 s and time-lapse movies were obtained with a Zeiss Axiovert microscope
using a 63x /1.4 NA objective and an AxioCam MRm camera/Axiovision software (Carl
Zeiss, Germany). MT plus-ends were tracked using ImageJ software and the results were
transferred into Excel spreadsheet (Microsoft). Pauses were defined as events lasting >2s in
which no statistically significant growth or shrinkage occurred. Catastrophes were defined as
transitions to shrinkage after a pause or a growth, and rescues as transitions to growth after a
pause or a shortening. Statistical analysis was performed using SPSS software as described
[17]. Means are significantly different for p<0.05 meaning a 95% confidence level. Only MTs
with plus-ends clearly resolved near the periphery of the cell were selected for analysis. In
each condition, at least 150 MTs were counted to define the “stable” or “dynamic” MT
population and 30 MTs for the calculation of dynamic parameters. For speckles experiments,
time-lapse images were acquired with Deltavision RT.
Acknowledgements. We thank Drs S. Rogers, R. Vale (University of California, San
Francisco), and H. Ohkura (University of Edinburgh) for the donation of GFP-tubulin cells
and antibodies. We thank J. Coppin and D. Rebérioux for help with computer analysis, and
Drs S. Carreno and J.E. Gairin for critical comments. This work was funded by grants from
“Association pour la Recherche sur le Cancer” (4720XP0230F), Centre National de la
Recherche Scientifique, and Pierre Fabre Laboratories, contributing support for research
expenses and salaries, and support for equipment by the Fonds Européen de Développement
Economique Régional and Action Concertée Incitative (04 5 566).
Figure legends
Figure 1: γ-Tubulin down-regulation enhances MT plus-end dynamics. A-B.
Observation of MT behavior by time-lapse microscopy and quantitative analysis. (A)
Left panel: Low magnification of a control GFP-α-tubulin cell: MTs that can be followed
during the entire length of the movie are called “stable MTs” (pink dot) while MTs that
appear or disappear during the movie are called “dynamic MTs” (green dot). Right panels:
High magnification of the two marked MTs showing their behavior over time. Bars, 5 μm. (B)
Proportion of stable (pink) and dynamic (green) MTs was quantified in control and γ-tubulin-
depleted cells after 4 or 5 days of RNAi treatment. The number of dynamic MTs significantly
increases after γ-tubulin depletion. Bars indicate ± standard deviation. This experiment is
representative of four independent experiments. See Supplemental-movie1. C-D. Dynamic
parameters. The life history of at least 30 individual MTs per condition was analyzed to
determine all the parameters that define MT dynamics in control GFP-α-tubulin cells (white),
and in cells depleted of γ-tubulin for 4 days (grey) or 5 days (green). (C) The strong decrease
of the time spent in pause indicates that MT dynamics are enhanced after γ-tubulin depletion.
Bars indicate ± standard deviation. (D) Likewise catastrophe frequencies significantly
increase in cells depleted of γ-tubulin for 5 days (red, P95%). E. MT plus-end dynamics.
High magnification after deconvolution of a growing MT (pink) and a shortening MT (green)
followed during 63s. White arrowheads indicate sites of uneven GFP-tubulin incorporation
into the MT walls (speckles). The graphs on the right indicate the position of the indicated
speckle (grey graph) and of the plus-end (colored graph) of the MT in μm. See Supplemental-
movie3 for the growing MT.
Figure 2: MT plus-end dynamics are enhanced in Dgrip84-, Dgrip75- or Dgp71WD-
depleted cells. A. Quantitative analysis of MT behavior. Graphs depicting the percentage
of stable (pink) and dynamic MTs (green) in S2 GFP-α-tubulin cells following 5 days of
RNAi treatments against γ-TuRC components as indicated (legend in Fig. 1B). B. Dynamic
parameters. Graphs depicting dynamic parameters of MTs in RNAi-treated GFP-α-tubulin
cells (grey: Dgrip84-RNAi, black: Dgrip75-RNAi and green: Dgp71WD-RNAi) and in
control cells (white) (legend in Fig. 1C). This experiment is representative of three
independent experiments. (C) Catastrophe frequencies significantly increase in cells depleted
of Dgrip84, Dgrip75 or Dgp71WD for 5 days (red, P95%).
Figure 3: γ-Tubulin localizes along interphase MTs and at the plus-ends. A-B.
Localization of γ-tubulin after two different immunofluorescence procedures in S2 and
S2R+ cells. (A) S2 cells permeabilized before fixation as in[16]. (B) S2R+ cells
permeabilized after fixation. (a) γ-Tubulin staining (R62 antibody). (b) Merge: MTs are
shown in red, γ-tubulin in green and chromosomes in blue. The insets are highly magnified in
the right and in the bottom panels. White arrowheads show dots of γ-tubulin along and at the
MT plus-ends, and red arrowhead shows γ-tubulin at a branched MT structure. C-D.
Localization of γ-tubulin after depletion of γ-TuRC in S2R+ cells pre-permeabilized
prior to fixation. (C) Cells treated with RNAi against γ-tubulin (c, d), Dgrip75 (e, f) and
Dgp71WD (g, h) show a decrease in γ-tubulin staining along cytoplasmic MTs. Merge (b, d, f,
h) : as in A. and B. (D) The number of γ-tubulin dots (in pink) on MT surface (limited by grey
lines) in control (a) and Dgrip75-depleted cells (b) is quantified automatically using Visilog®.
Graph ± standard deviation (10 cells per condition). Horizontal bars, 5 μm.
Figure 4: γ-Tubulin-dependent MT dynamics are regulated via plus-end tracking
proteins Mast and EB1. A-C. γ-Tubulin and Mast act in a common pathway. A.
Percentage of stable and dynamic MTs after depletion of Mast and γ-tubulin. B.
Dynamic parameters. Legend as in Fig. 1. Co-silencing of γ-tubulin and Mast induces an
increase in the number of dynamic MTs and a decrease in time spent in pause in a similar
manner as individual depletion of γ-tubulin or Mast. C. Localization of Mast in control (a)
and γ-tubulin-depleted cells (c). No obvious difference of Mast localization is observed in
S2 GFP-α-tubulin cells. D-F. γ-Tubulin depletion induces an accumulation of EB1 at MT
plus-ends. D. Percentage of stable and dynamic MTs after depletion of EB1 and γ-
tubulin. E. Dynamic parameters. Legend as in Fig. 1. EB1 depletion compensates the
phenotype induced by depletion of γ-tubulin. F. Localization of EB1 in control (a) and γ-
tubulin-depleted cells (c). EB1 accumulates at the MT plus-ends of γ-tubulin depleted S2
GFP-α-tubulin cells. The insets are highly magnified and white arrowheads show EB1
staining at the MT plus-ends. C and F. Control cells and cells treated with RNAi against γ-
tubulin for 5 days were stained with antibody against Mast or EB1 (a, c). Merge (b, d):
chromosomes are shown in blue, MTs in green (GFP) and Mast/EB1 in red. For quantification
of Mast or EB1-staining at MT plus-ends (tables), the number of Mast or EB1-dots within
2μm from the MT plus-extremity was counted for at least 200 MTs per condition. Bars, 5 μm.
Online supplemental material
Suplemental-movie1 : γ-Tubulin down-regulation enhances MT plus-end dynamics.
Movie showing the dynamics of MT plus-ends in a control cell (control-left) and after γ-
tubulin depletion (treated-right) in S2 GFP-α-tubulin cells (related to Fig. 1A-D).
Suplemental-movie2 : γ-Tubulin down-regulation destabilizes short MTs. Movie showing
the dynamic of a short MT in a control cell (control-left) and after γ-tubulin depletion
(treated-right) in S2 GFP-α-tubulin cells.
Suplemental-movie3 : MT plus-end dynamics are affected after γ-tubulin depletion.
Movie showing the dynamics of the plus-end and a speckle on a same growing MT after γ-
tubulin depletion in S2 GFP-α-tubulin cells (related to Fig. 1E).
All movies are 2 s-intervals for 200 s. Color dots show MT plus-ends or speckles tracked
using ImageJ software.
Suplemental-figure : A-B. γ-Tubulin depletion is efficient in S2 GFP-α-tubulin cells. A.
Western blot analysis of γ-tubulin depletion. Total protein extracts of control or treated (γ-
tubRNAi) S2 cells expressing GFP-α-tubulin were analyzed using antibodies against γ-tubulin
(R62) and actin (internal loading control). B. Immunofluorescence analysis of γ-tubulin
depletion. GFP-α-tubulin cells after four days of control and γ-tubulinRNAi treatment were
stained with antibody against γ-tubulin (a, c) and DAPI. Merge (b, d) : chromosomes are
shown in blue, MTs in green (GFP) and γ-tubulin in red. C. γ-TuRC components localize
along interphase MTs and at the plus-ends. S2R+ cells permeabilized prior to fixation were
stained in green using the monoclonal antibody GTU88 against γ-tubulin (a), the rabbit
antibody against Dgrip84 (b) and the rabbit antibody against Dgp71WD (c). Merge: MTs are
shown in red and chromosomes in blue. High magnification of an area of the cell is shown on
right panels. D. γ-Tubulin localization on MTs is affected after cold treatment. S2R+ cells
permeabilized prior to fixation were stained in green using the rabbit antibody R62 against γ-
tubulin. High magnification of half of the cell is shown on the bottom panels. Merge: MTs
are shown in red and chromosomes in blue. (a) control cells and (b) cold-treated cells for 40
min (including permeabilization) before fixation. E-H. Mast and EB1 depletion is efficient
after 4 days of RNAi treatment. E and G. Western blot analyses. F and H.
Immunofluorescence analyses. Control and treated S2 GFP-α-tubulin cells were stained
with antibody against Mast or EB1 (a, c) and DAPI. Merge (b, d) : chromosomes are shown
in blue, MTs in green (GFP) and Mast/EB1 in red. Bars, 5 μm.
References
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c
C
dynamic MTs stable MTs
0 20 40 60 80
γ-tubulin RNAi 4 days
γ-tubulin RNAi 5 days
Control
100 (%)
0
2
4
6
Control γ-tubulin RNAi 4 days γ-tubulin RNAi 5 days
8
27
36 37
0
10
20
30
40
50
25
43 44
1921
48
Growth rate
Shrinkage rate time in shortening
μm/min %
time in growth
A
Vérollet et al.-Fig1
0s 18s 36s 54s 72s 90s
108s 126s 144s 162s 180s 200 s
time in pause
D
γ-tubulin RNAi 5 days
γ-tubulin RNAi 4 days
catastrophe rescue
8.1 8.9
9.5
15.7
7.9
7.4Transition frequencies (events/s X100)
0s 7s 14s 21s 28s 35s 42s 49s 56s 63s
grow
ing
MT
shor
teni
ng M
T
012
3456
(μm)
-10
1
2
3
4
5
(μm)
(s)10 20 30 40 50 60
B
E
Control
A
c
Vérollet et al.-Fig2
B
Dgrip84 RNAi
Control
Dgrip75 RNAi
Dgp71WD RNAi
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100(%)
stable MTs
m/min
Control Dgrip84 RNAi Dgrip75 RNAi
27
36 38
0
10
20
30
40
50
25
46 45
1818
48%
Dgp71WD RNAi
0
2
4
6
8μ
Growth rate Shrinkage rate
36
46
17
time in shortening
time in growth
time in pause
Dgrip84 RNAi
catastrophe rescue8.1 8.9
10.5 7.6
Dgrip75 RNAi
Dgp71WD RNAi
7.7
6.8
13.1
10.6
Transition frequencies (events/s X100)
C
dynamic MTs
Control
Vérollet et al.-Fig3
C
A
D
B
γ-tu
bulin
RN
Ai
Dgr
ip75
RN
Ai
Con
trol
Dgp
71W
D R
NA
i
γ-tubulin, MTs, DNA γ-tubulin S2R+ permeabilized before fixation
ba dc
fe hg
0
2
4
6
8
10
12
Control RNAi Dgrip75
γ-tu
bulin
dot
s/μm
2
S2R+ permeabilized after fixation γ-tubulin γ-tubulin, MTs,
ba
Control Dgrip75RNAi
ba
γ-tubulin, MTs, γ-tubulin S2 permeabilized before fixation
a b
DNADNA
Vérollet et al.-Fig4
lstab e MTsγ-tub RNAi
Control
Mast RNAi γ-tub + Mast RNAi
100 (%)
0 20 40 60 80
A
B Control Mast RNAi
0
10
20
30
40
50 47
22 22
41
% 49
25
γ-tub RNAi γ-tub + Mast RNAi
3029 31 29 29
46
time in shortening
time in growth
time in pause
% 677 0
100 (%)
0 20 40 60 80
γ-tub RNAi
EB1 RNAi γ-tub +
EB1 RNAi
Controllstab e MTs
D
36
γ-tubRNAi(% of MTs)
Control(% of MTs)
0 dot1-3 dots
>4 dots
5
59
40 0 dot
1-3 dots >4 dots
4
56
F C
Con
trol
γ-tu
bulin
RN
Ai a b
dc
Mast, MTs, DNA Mast
Control EB1 RNAi
0
10
20
30
40
50 46
17
40
21
43
28
γ-tub RNAi γ-tub + EB1 RNAi
2730
33
16
32
60
E
time in shortening
time in growth
time in pause
b
c d
a
EB1, MTs, DNA EB1
γ-tu
bulin
RN
Ai
Con
trol
76
γ-tubRNAi(% of MTs)
Control(% of MTs)
0 dot1-3 dots
>4 dots
9
17
17 0 dot
1-3 dots >4 dots
3
80
dynamic MTs dynamic MTs
Verollet et al. Supplemental-figure
E
γ-tubulinActin
Contro
l
γ-tub
RNAi
Mas
t RNAi
γ-tub
+
Mast R
NAi
Mast
γ-tubulin
Actin
Contro
l
γ-tub
RNAi
EB1 R
NAi
γ-tub
+
EB1 RNAi
EB1
Mast RNAiControl
a b c d
EB1RNAiControl
F
a b c d
Mast, MTs, DNA Mast
EB1, MTs, DNA EB1
d bc
G H
A B
γ-tubulin
Actin
Contro
l
γ-tub
RNAi 4
d
γ-tub
RNAi 5
d
76 91% of depletion
γ-tubulin, MTs, DNA
γ-tubulin RNAi
a
γ-tubulin
Control
a b c d
γ-tubulin, MTs, DNA Dgrip84, MTs, DNA Dgp71WD, MTs, DNA
a b c
S2R+ permeabilized before fixation
D
C
S2R+ permeabilized before fixation COLD TREATMENT
S2R+ permeabilized before fixation CONTROL
a b
γ-tubulin, MTs, DNA γ-tubulin, MTs, DNA
53
IV- Etude de la régulation des protéines des complexes γ
Les études fonctionnelles ont permis de révéler des rôles différents pour les γ-TuSCs
et les γ-TuRCs. En particulier, le γ-TuSC serait le complexe essentiel pour les fonctions de
nucléation et d’organisation des microtubules de la tubuline γ. La déplétion de chacune des
protéines du γ-TuSC engendre des phénotypes identiques chez la drosophile, suggérant que
le γ-TuSC n’est plus fonctionnel. En mitose, elle empêche le recrutement des deux autres
partenaires aux pôles des fuseaux (Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000; Colombie et
al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004; Sampaio et al., 2001; Sunkel et al., 1995),
suggérant que le γ-TuSC ne serait plus assemblé si le niveau d’expression d’une des trois
protéines est affecté. Il est également possible d’imaginer la formation de complexes
incomplets non fonctionnels ou une co-régulation des protéines.
1) Régulation des protéines du γ-TuSC
Pour tester l’hypothèse d’une co-régulation, le niveau global des protéines du γ-
TuSC a été analysé par Western Blot après inhibition par RNAi de la tubuline γ et des
protéines associées. Un double traitement de 7 jours par RNAi contre chacune des trois
protéines du γ-TuSC induit l’inhibition de leur niveau d’expression d’au moins 90%
(figure 20A). La déplétion par RNAi d’une des protéines entraîne la diminution du niveau
des deux autres protéines du complexe d’environ 85%. Ce résultat démontre une co-
régulation du niveau global des trois protéines du γ-TuSC dans les cellules de drosophile.
Les traitements par RNAi contre Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et Dgp71WD sont
efficaces après 7 jours (Vérollet et al., 2006) (Figure 21). La déplétion de chacune des
protéines spécifiques du γ-TuRC, ainsi que l’inhibition simultanée de leur expression, n’a
aucun effet sur le niveau global des protéines du γ-TuSC (Figure 20A, co-silencing). Ces
γ-tubulin
Actin
Dgrip84
Dgrip91
Control
γ-Tubulin
RNAi
Dgrip84 RNAi
Dgrip91 RNAi
Dgrip75 RNAi
Dgrip12
8 RNAi
Dgrip16
3 RNAi
Dgp71WD RNAi
Control
Control
Co-silen
cing
WT
Dgrip84-/-
Dgrip75
-/-
Dgp71WD
-/-
γ-tubulinActin
Dgrip84
Actin
GCP2
γ-tubulin
Control
siRNAγ-T
ubulin
A
CB
siRNA G
CP4
Control
Control
γ-Tubulin
RNAi
γ-tubulin
Dgrip84
Dgrip163
D
Figure 20 : Régulation des protéines du γ-TuSC. A-C. Analyse en Western Blot. A. Des extraits totaux de cellules S2 contrôles et traitées par RNAi (7 jours) ont été révélées en utilisant des anticorps de lapin contre la tubuline γ de drosophile (R62), Dgrip84 (R367), Dgrip91 (R403) et un anticorps monoclonal de souris contre l'actine, servant de contrôle de charge. Le co-silencing correspond à la co-déplétion par RNAi des 4 protéines spécifiques du γ-TuRC. Les protéines du γ-TuSC sont co-régulées indépendamment des protéines spécifiques du γ-TuRC. B. Des extraits de cerveaux de larves L3 sauvages (WT) et mutantes Dgrip84, Dgrip91 et Dgp71WD ont été analysées. Les mêmes anticorps que pour A. ont été utilisés. La co-régulation de la tubuline γ et de Dgrip84 est confirmée in vivo indépendamment des protéines spécifiques du γ-TuRC, Dgrip75 et Dgp71WD. C. Des estraits de cellules Hela contrôles et transfectées avec des siRNAs contre la tubuline γ et GCP4 (Dgrip75) ont été analysés et révélés par un anticorps monoclonal de souris contre la tubuline γ (GTU88) et un anticorps lapin dirigé contre GCP2; un anticorps monoclonal de souris contre l'actine servant de contrôle de charge. D. Analyse par RT-PCR. Des extraits d'ARN ont été obtenus par extraction au Trizol à partir de cellules S2 contrôles et traitées par RNAi contre la tubuline γ. Le niveau des ARNm a été analysé par RT-PCR en utilisant des oligonucléotides spécifiques de chacune des séquences des gènes de la tubuline γ, de Dgrip84 et de Dgrip163 dans la partie N-terminale (taille autour de 700bp).
54
données montrent que la tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91 associées dans le γ-TuSC sont co-
régulées indépendamment des protéines spécifiques du γ-TuRC.
In vivo, le niveau de la tubuline γ a été analysé dans des extraits de cerveaux de
larves de drosophile au stade L3, sauvages et mutantes pour Dgrip84 (mutant nul R20),
Dgrip75 ou Dgp71WD (Colombie et al., 2006 ; Schnorrer et al., 2002; Vérollet et al.,
2006). Dans ces trois mutants, la protéine mutée n’est plus détectable. Dans le mutant
Dgrip84, la tubuline γ n’est pas détectée, alors que le niveau d’expression de Dgrip84 et de
la tubuline γ n’est pas altéré dans les mutants Dgrip75 ou Dgp71WD (Figure 20B). La
tubuline γ et Dgrip84 sont donc co-régulées in vivo chez la drosophile. Ainsi, la co-
régulation des trois protéines du γ-TuSC mise en évidence dans les cellules S2 de
drosophile en culture serait retrouvée in vivo.
Afin de déterminer si cette co-régulation est présente chez les mammifères, nous
avons adopté une approche comparable dans les cellules Hela. La tubuline γ et GCP4
(Dgrip75) ont été déplétées par double transfection de siRNAs (C. Boby). La déplétion de
la tubuline γ et de GCP4 est efficace dans les cellules Hela, comme le montre l’analyse en
Western Blot (figure 20C et donnée non montrée). La protéine GCP2 (Dgrip84) n’est plus
détectable en absence de tubuline γ. Par contre, son niveau d’expression n’est pas affecté en
absence de GCP4 (Dgrip75) (Figure 20C). Ces résultats permettent d’élargir aux
mammifères l’existence d’une co-régulation des protéines du γ-TuSC.
2) Mécanismes de régulation des protéines du γ-TuSC
La régulation du niveau de protéines peut avoir lieu au niveau de la traduction, de la
transcription et/ou de la stabilité des ARNm mais aussi au niveau de la stabilité des
protéines. Les mécanismes de régulation des tubulines α/β ont été étudiés. La quantité de
ces protéines dans la cellule est strictement contrôlée par une auto-régulation du « pool »
soluble. Les dimères de tubuline α/β en excès sont capables de se fixer sur un site
55
régulateur de l’ARNm codant la tubuline β et d’induire sa dégradation (Cleveland, 1983a;
Cleveland, 1981; Patcher et al., 1987).
Nous avons donc analysé par RT-PCR le niveau des ARNms codant la tubuline
γ et deux protéines associées, Dgrip84 et Dgrip163 (N. Roullet). Les ARNms des cellules
S2 de drosophile contrôles ou traitées par RNAi contre la tubuline γ ont été extraits au
Trizol® et des oligonucléotides spécifiques de la tubuline γ, Dgrip84 ou Dgrip163 ont été
utilisés. La quantité d’ARNm codant la tubuline γ diminue dans les cellules traitées par
RNAi contre la tubuline γ par rapport aux contrôles, validant l’efficacité du RNAi dans ces
cellules. Par contre, ni le niveau des ARNm codant Dgrip84 (protéine du γ-TuSC), ni celui
des ARNm codant Dgrip163 (protéine spécifique du γ-TuRC), ne sont affectés dans les
cellules déplétées en tubuline γ (Figure 20D).
Ces expériences montrent que la co-régulation des protéines du γ-TuSC n’est
contrôlée ni au niveau transcriptionnel, ni au niveau de la stabilité des ARNm. Divers
mécanismes de régulation pourraient intervenir pour contrôler le niveau des trois protéines
du γ-TuSC mais l’hypothèse la plus simple est que l’assemblage du complexe soit
nécessaire à la stabilité des protéines qui le composent.
3) Régulation des protéines spécifiques du γ-TuRC
Le niveau des protéines spécifiques du γ-TuRC a été analysé par Western Blot dans
les cellules S2 après déplétion par RNAi pendant 7 jours de chacune des protéines des
complexes tubuline γ (Figure 21). La déplétion d’une protéine du γ-TuSC ou des protéines
grip spécifiques du γ-TuRC diminue d’environ 50% le niveau d’expression des autres
protéines grip du complexe et de la tubuline γ, suggérant une co-régulation des protéines du
γ-TuRC (Figure 21). Cet effet est reproductible mais modéré. Un co-régulation entre la
tubuline γ et toutes les autres protéines grip du γ-TuRC existe mais elle est moins stringente
que celle qui existe entre les trois protéines du γ-TuSC.
Dgrip75
Actin
Dgrip128
Dgrip163
Control
γ-Tubulin
RNAi
Dgrip84 RNAi
Dgrip91 RNAi
Dgrip75 RNAi
Dgrip12
8 RNAi
Dgrip16
3 RNAi
Dgp71WD RNAi
Control
Dgp71WD
Figure 21 : Analyse de la régulation des protéines du γ-TuRC par Western Blot. Des extraits totaux de cellules S2 contrôles et traitées par RNAi (7 jours) ont été révélées en utilisant des anticorps de lapin contre Dgrip75 (R300), Dgrip128 (laboratoire de Y. Zheng), Dgrip163 (R360) et Dgp71WD (R267); un anticorps monoclonal de souris contre l'actine, servant de contrôle de charge. Une régula-tion partielle et assez complexe des protéines du γ-TuRC a été mise en évidence.
56
Par contre, la déplétion de Dgp71WD n’a aucun effet évident sur le niveau de
Dgrip163 ou de Dgrip75 (Figure 21). Dgp71WD n’étant pas essentielle à la formation du γ-
TuRC, il peut exister un γ-TuRC cytoplasmique dépourvu de Dgp71WD (Haren et al.,
2006; Luders et al., 2006; Vérollet et al., 2006 ). Ces données pourraient expliquer que
Dgp71WD se comporte différemment vis à vis de la régulation des protéines du γ-TuRC.
57
DISCUSSION/PERSPECTIVES
La tubuline γ est une protéine essentielle qui joue un rôle clé dans la nucléation et
l’organisation des microtubules. En mitose, elle est nécessaire à l’organisation du fuseau.
Elle se trouve au sein de deux complexes majeurs chez les eucaryotes supérieurs, le γ-
TuRC et une de ses sous-unités le γ-TuSC. Mon but était d’étudier la fonction de la
tubuline γ et de ses partenaires dans les γ-TuSCs et les γ-TuRCs. Pour cela, j’ai analysé les
conséquences de leur déplétion par RNAi dans les cellules de drosophile en culture
(cellules S2), sur l’organisation et la dynamique des microtubules au cours du cycle
cellulaire.
Nos travaux ont permis de mettre en évidence un nouveau rôle de la tubuline γ dans
la régulation de la dynamique des microtubules en interphase, ainsi qu’une nouvelle
localisation de la tubuline γ sur les microtubules cytoplasmiques dans des cellules animales.
L’analyse fonctionnelle des partenaires de la tubuline γ m’a permis de déterminer sous
quelle forme, γ-TuSC ou γ-TuRC, la tubuline γ exerce ses différentes fonctions. Mes
résultats montrent que les protéines du γ-TuSC sont essentielles à la viabilité et nécessaires
à l’organisation des microtubules tout au long du cycle cellulaire. Le γ-TuRC permet la
stabilisation des microtubules interphasiques et l’optimisation de la progression en mitose.
I- Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules en
interphase
Pour la première fois dans des cellules animales, nous avons analysé l’effet de la
déplétion de la tubuline γ sur la dynamique des microtubules en interphase, en utilisant des
cellules S2 dans lesquelles la tubuline α est en fusion avec la GFP. Ces cellules sont
58
cultivées sur concanavaline A pour favoriser l’étalement et permettre une bonne
visualisation des microtubules. Seules les zones périphériques du cytoplasme présentant
une densité réduite de microtubules peuvent être analysées. Le traitement des cellules par
RNAi contre la tubuline γ induit une augmentation du nombre de microtubules « instables »
c’est à dire des microtubules qui ne peuvent pas être suivis dans une zone sous-corticale de
6μm tout au long de la durée d’observation des cellules. Ces microtubules passent deux fois
moins de temps dans un état de pause que les microtubules des cellules contrôles. Ils se
déassemblent rapidement et fréquemment à l’extrémité plus (augmentation des vitesses de
déassemblage et des fréquences de catastrophe) et perdent le contact avec le cortex
cellulaire. Nos résultats, après déplétion par RNAi des partenaires de la tubuline γ, ont
montré que la tubuline γ stabilise les microtubules sous la forme de γ-TuRC.
Le γ-TuRC se lie à l’extrémité moins des microtubules où il favorise la nucléation et
permet la stabilisation de cette extrémité (Keating and Borisy, 2000; Leguy et al., 2000;
Moritz et al., 2000; Wiese and Zheng, 2000; Zheng et al., 1995). Après 5 jours de
traitement RNAi contre la tubuline γ ou Dgrip75, le rapport entre le « pool » de tubuline
α/β soluble et insoluble est inchangé suggérant que dans ces conditions l’effet de
l’inactivation du γ-TuRC sur la nucléation des microtubules est minoritaire. On ne peut pas
exclure un changement faible en faveur d’un augmentation du pool soluble de tubuline γ dû
à des défauts dans la nucléation. Dans ce cas, cela devrait minimiser l’effet de la tubuline γ
en tant que facteur de stabilisation des microtubules. Une étude récente chez S. pombe a
également montré un rôle des γ-TuCs dans l’ancrage des microtubules au SPB
indépendamment de sa fonction de nucléation (Toya et al., 2007). Nous avons vérifié en
suivant des anomalies de fluorescence dans les microtubules-GFP (« zones noires ») que la
dynamique des microtubules était principalement affectée à l’extrémité plus. Ce résultat a
permis d’exclure la possibilité d’un effet indirect de la tubuline γ sur la dynamique de
l’extrémité plus des microtubules qui serait dû à ses rôles dans la nucléation, la stabilisation
ou l’ancrage de l’extrémité moins. Ces données montrent une nouvelle fonction du γ-TuRC
dans la stabilisation de l’extrémité plus des microtubules interphasiques dans les cellules de
drosophile.
59
Chez les levures, des expériences suggéraient déjà une fonction des protéines des
complexes de tubuline γ dans la régulation de la dynamique des microtubules. Initialement,
la tubuline γ a été découverte chez Aspergillus dans un crible destiné à rechercher des gènes
suppresseurs d’une mutation dans le gène codant la tubuline β, qui conduit à une
hyperstabilisation des microtubules (Oakley and Oakley, 1989). Dans des mutants pour les
protéines des complexes de tubuline γ chez S. pombe et S. cerevisiae, les microtubules sont
plus longs et courbés, suggérant qu’ils sont hyperstabilisés (Fujita et al., 2002; Marschall et
al., 1996; Paluh et al., 2000; Sobel and Snyder, 1995; Spang et al., 1996; Vardy and Toda,
2000; Venkatram et al., 2004; Zimmerman and Chang, 2005). Plus récemment, des
expériences en temps réel ont montré que la mutation de Alp4 (Dgrip84) ou la
surexpression de son domaine C-terminal induit une diminution des taux de catastrophe à
l’extrémité plus des microtubules interphasiques, qui continuent de croître jusqu’au cortex
où ils se courbent (Masuda et al., 2006a; Masuda et al., 2006b; Zimmerman and Chang,
2005). Nos données sont en contradiction avec le rôle des complexes de tubuline γ dans la
déstabilisation des microtubules chez la levure, mais les cellules de drosophile et la levure
S. pombe sont difficilement comparables. La levure S. pombe possède un nombre inférieur
de microtubules (4-5 faisceaux de microtubules cytoplasmiques) par rapport aux eucaryotes
supérieurs. Ce nombre diminuant de moitié dans le mutant Alp4 suite aux défauts générés
dans le processus de nucléation, la quantité de tubuline α/β soluble disponible pour
l’assemblage à l’extrémité plus est fortement augmentée. Ceci peut expliquer la diminution
du taux de catastrophes dans ce mutant. Dans les cellules de drosophile, ce changement
dans le rapport tubuline libre/tubuline assemblée n’a pas lieu après déplétion de la tubuline
γ. D’autre part, le comportement des microtubules pris en compte dans ces deux études est
différent. Les microtubules qui atteignent le cortex dans les cellules de drosophile semblent
stabilisés alors que chez S. pombe, ils sont l’objet de phénomènes de catastrophes afin de
positionner correctement le noyau (Tran et al., 2001).
Nous avons analysé l’implication potentielle de deux +TIPs, Mast/Orbit et EB1,
dans la stabilisation des microtubules interphasiques par la tubuline γ. Chez la drosophile,
ces deux protéines ont des rôles opposés concernant la dynamique des microtubules
interphasiques : Mast stabilise l’extrémité plus des microtubules en favorisant les pauses
60
alors que EB1 les déstabilise principalement en diminuant les pauses et favorisant les
catastrophes (Rogers et al., 2002; Sousa et al., 2007). Les effets de la déplétion de Mast
sont identiques à ceux obtenus après déplétion de la tubuline γ. Ils ne sont pas amplifiés
après déplétion simultanée des deux protéines, suggérant que les deux protéines agissent
dans une même voie de signalisation. A l’inverse, la déplétion par RNAi de EB1 induit une
augmentation des temps de pause qui est reversée par la déplétion simultanée de EB1 et de
la tubuline γ. Après déplétion de la tubuline γ, nous observons une accumulation de EB1 à
l’extrémité plus des microtubules, sans modification de la localisation de Mast. Le ratio
Mast/EB1 à l’extrémité plus est perturbé en faveur de EB1, ce qui favoriserait la
déstabilisation des microtubules en induisant des catastrophes. Par conséquent, les
microtubules seraient plus dynamiques et leur interaction avec le cortex serait perturbée.
Un modèle comparable a été proposé dans les cellules de mammifères. Dans les cellules
Hela en interphase, le complexe CLASP (homologue humain de Mast)/EB1 contrôle les
interactions entre les extrémités plus des microtubules et l’actine au niveau du cortex
(Lansbergen and Akhmanova, 2006; Mimori-Kiyosue et al., 2005; Tsvetkov et al., 2007).
Ce modèle élémentaire est peut être plus complexe car d’autres +TIPs agissant de manière
coordonnée ou opposée peuvent être impliquées [Voir INTRODUCTION I-1)].
II- Localisation de la tubuline γ sur les microtubules en
interphase
En interphase, j’ai montré qu’une fraction minoritaire de la tubuline γ se localise de
façon ponctuée le long des microtubules jusqu’à l’extrémité plus. Dans les cellules de
drosophile comme dans les cellules de mammifères, au moins 80% de la tubuline γ totale
est soluble (Moudjou et al., 1996 ; Raynaud-Messina et al., 2001). L’élimination de
ce « pool » de tubuline γ cytoplasmique favorise la mise en évidence de sa localisation sur
les microtubules. Diverses expériences ont permis de contrôler que ce marquage le long des
microtubules est spécifique. Deux types cellulaires de drosophile et deux anticorps
61
différents dirigés contre la tubuline γ ont été testés. Comme la méthode de perméabilisation
avant la fixation que nous avons utilisée peut induire des relocalisations artéfactuelles, nous
avons reproduit les résultats avec deux méthodes de fixation différentes sans
perméabilisation préalable. De plus, nous avons vérifié que la méthode utilisée pour
favoriser la visualisation de la tubuline γ sur les microtubules n’induit pas une
relocalisation systématique de gros complexes protéiques solubles sur le cytosquelette.
Après traitement par RNAi contre une protéine spécifique du γ-TuRC, le niveau global de
tubuline γ n’est pas affecté mais la composition des complexes cytosoliques présents
contenant de la tubuline γ est différente. Après déplétion de Dgrip75 et Dgp71WD, les
complexes sont respectivement des γ-TuSCs et des complexes de coefficient de
sédimentation 30S (Vérollet et al., 2006). Dans ces deux conditions expérimentales, la
tubuline γ n’est plus localisée le long des microtubules interphasiques. De plus, la
localisation sur les microtubules de deux partenaires de la tubuline γ dans le γ-TuRC, dont
Dgp71WD, montrent que la tubuline γ doit être sous forme de γ-TuRCs complets pour
s’associer avec les microtubules interphasiques.
L’utilisation d’une lignée de cellules exprimant de façon transitoire une tubuline γ
couplée à la GFP permettrait peut être de s’affranchir complètement des méthodes de
fixation.
Aucune donnée ne nous permet de conclure sur le rôle de la tubuline γ sous forme de
γ-TuRC sur les microtubules en interphase dans les cellules de drosophile. D’après les
données publiées, deux fonctions sont envisageables : un rôle de nucléation de nouveaux
microtubules ou de stabilisation des microtubules.
La tubuline γ et les protéines associées colocalisent avec les microtubules
interphasiques chez la levure S. pombe (au niveau des iMTOCs), mais aussi dans les
cellules épithéliales polarisées et dans les cellules de plantes supérieures sur les
microtubules corticaux. Dans ces trois exemples, elle se trouve à des sites de jonction de
microtubules et permettrait la nucléation de nouveaux microtubules à des sites non-
centrosomaux (Bartolini and Gundersen, 2006; Janson et al., 2005; Murata and Hasebe,
2007; Murata et al., 2005; Reilein et al., 2005) (Voir ANNEXE 2). Ce phénomène pourrait
62
avoir lieu dans les cellules de drosophile où les microtubules interphasiques ne sont pas
organisés de façon radiaire à partir d’un point unique et où le centrosome ne semble pas
être fonctionnel pour la nucléation des microtubules (Raff, 2004). En effet, la tubuline γ
décore certaines intersections de microtubules (cette étude). Chez la drosophile, cette
organisation non-centrosomale pourrait exiger des centres de nucléation secondaires, par
exemple localisés sur le long des microtubules. Il ne m’a pas été possible de mettre en
évidence la présence de tubuline γ sur les microtubules interphasiques dans les cellules
Hela. Dans des cellules de mammifères, parmi les 20% de tubuline γ soluble, la proportion
de tubuline γ au centrosome est largement majoritaire (Moudjou et al., 1996). La
localisation de la tubuline γ sur les microtubules interphasiques est peut être minoritaire ou
inexistante dans des cellules avec un centrosome fonctionnel contenant de la tubuline γ et
présentant une organisation radiaire des microtubules. Il serait intéressant d’analyser la
localisation de la tubuline γ dans des cellules différenciées comme les neurones ou les
myotubes qui présentent une organisation non-centrosomale des microtubules.
La fonction de la tubuline γ dans la stabilisation des extrémités plus des
microtubules en interphase et sa localisation le long des microtubules est dépendante de
l’association de la tubuline γ en γ-TuRC. Une possibilité est que la tubuline γ, sous forme
de γ-TuRC, agissent en tant que MAP stabilisatrice. Dans les cellules végétales et animales
en mitose, la tubuline γ est associée aux microtubules kinétochoriens qui sont très stables et
résistants (Drykova et al., 2003; Ehrhardt and Shaw, 2006; Lajoie-Mazenc et al., 1994)
(cette étude). Les premières interprétations de cette localisation ont été de proposer un rôle
stabilisateur de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau. Des expériences plus récentes
confirment cette idée dans des cellules de mammifères et de drosophile. L’absence de la
tubuline γ ou de protéines nécessaires à son ancrage spécifiquement sur les microtubules du
fuseau induit une diminution de la densité des microtubules du fuseau sans effet sur
l’activité de nucléation associée aux pôles (Goshima et al., 2007; Luders et al., 2006). Nous
avons observé un phénotype comparable après déplétion d’une protéine spécifique du γ-
TuRC telle que Dgrip75, qui induit une perte de la tubuline γ sur le fuseau (Vérollet et al.,
2006).
63
Une fonction de stabilisation des microtubules par les complexes de tubuline γ avait
déjà été proposée. En microscopie électronique, les cellules présentent des centrioles plus
courts après perte de fonction de la tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91 chez la drosophile et
Caenorhabditis (Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Dammermann et al., 2004;
Raynaud-Messina et al., 2004). Ces résultats suggèrent que le γ-TuRC pourrait être
impliqué dans la formation, l’élongation ou le maintien de la longueur des centrioles. La
fraction de tubuline γ présente au cœur des centrioles permettrait la stabilisation des
microtubules centriolaires (Fuller et al., 1995).
III- Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs dans la nucléation et
l’organisation des microtubules
La tubuline γ est une protéine essentielle dans tous les organismes (Horio et al.,
1991; Oakley and Oakley, 1989; Sobel and Snyder, 1995; Sunkel et al., 1995; Yuba-Kubo
et al., 2005). Chez la drosophile, Dgrip91 est essentielle (Barbosa et al., 2003; Barbosa et
al., 2000). Nous avons montré que la perte de fonction de Dgrip84 est létale chez la
drosophile (Colombie et al., 2006). Ainsi, comme chez les levures (Geissler et al., 1996;
Knop et al., 1997; Knop and Schiebel, 1997; Vardy and Toda, 2000), les trois protéines du
γ-TuSC, tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91, sont essentielles à la viabilité chez la drosophile.
Les mutants des protéines spécifiques du γ-TuRC (Dgrip75, Dgrip128, Dgrip163 et
Dgp71WD) atteignent le stade adulte mais présentent pour la plupart une stérilité male
et/ou femelle (Schnorrer et al., 2002; Vérollet et al., 2006; Vogt et al., 2006). Lors de
l’ovogénèse, Dgrip75 et Dgrip128, sont nécessaires à la localisation de certains
déterminants maternels suggérant un rôle dans la formation de sous-réseaux de
microtubules mais non dans l’organisation globale des microtubules (Schnorrer et al., 2002;
Vogt et al., 2006). En complément de ces données chez la drosophile, des mutations dans
les gènes codant pour les homologues de Dgrip75, 128, et 163 chez S. pombe montrent
64
également que ces gènes ne sont pas essentiels pour la viabilité (Anders et al., 2006; Fujita
et al., 2002; Venkatram et al., 2004).
En conclusion, les protéines du γ-TuSC sont essentielles alors que les protéines
spécifiques du γ-TuRC ne le sont pas.
1) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en interphase
Dans les cellules S2 cultivées sur concanavaline A, la déplétion prolongée par RNAi
de la tubuline γ induit un réarrangement des microtubules interphasiques. Contrairement
aux microtubules des cellules contrôles qui sont en contact avec le cortex cellulaire, la
majorité des microtubules des cellules traitées s’enroulent autour du noyau et très peu
atteignent le cortex. Ce phénotype peut être le reflet de défauts dans la nucléation et/ou la
dynamique des microtubules.
In vitro, la tubuline γ est un élément essentiel pour la nucléation des microtubules
(Félix et al., 1994; Leguy et al., 2000; Moritz et al., 1998; Stearns and Kirschner, 1994;
Zheng et al., 1995). Le rôle de tubuline γ dans la nucléation des microtubules
interphasiques est difficile à étudier in vivo. Dans tous les organismes étudiés, les mutants
de la tubuline γ présentent une diminution de la densité de microtubules (Horio et al., 1991;
Marschall et al., 1996; Martin et al., 1997; Oakley et al., 1990; Oakley and Oakley, 1989;
Spang et al., 1996; Sunkel et al., 1995). Deux expériences montrent directement des défauts
de cinétique de renucléation en absence de tubuline γ (injection d’anticorps et RNAi) dans
des cellules de mammifères après traitement au nocodazole ou au froid (Joshi et al., 1992;
Luders et al., 2006). Les expériences de renucléation sont difficiles à interpréter car le
retard est de l’ordre d’une minute. Les cellules de drosophile exprimant la tubuline α-GFP
ne permettent pas de quantifier directement la capacité de re-nucléation après traitement au
froid car celle ci a lieu à partir de points multiples dans le cytoplasme. C’est pourquoi nous
avons suivi la cinétique de re-croissance des microtubules par analyse du nombre de
microtubules atteignant la zone sous-corticale après retour à température ambiante. Dans
les cellules déplétées en tubuline γ un retard de re-croissance des microtubules d’environ 10
65
minutes est observé. Ce retard peut être dû à une cinétique plus lente de ré-assemblage des
microtubules en absence de tubuline γ ou à une modification de la dynamique des
microtubules. En interphase, la tubuline γ, qui joue donc un rôle dans la dynamique et la
nucléation des microtubules, est essentielle pour une organisation correcte des
microtubules. L’utilisation d’une lignée S2 exprimant la +TIP EB1-GFP, qui ne se localise
que sur les extrémité plus croissantes, pourrait permettre de quantifier plus précisément
l’activité de nucléation et donc de discriminer entre les conséquences de l’absence de la
tubuline γ sur la nucléation et la dynamique des microtubules.
Les phénotypes observés après déplétion prolongée par RNAi de Dgrip84 en
interphase sont similaires à ceux obtenus après déplétion de la tubuline γ. Par contre, la
déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC, qui modifie la dynamique des
microtubules, n’a aucun effet sur leur organisation globale et leur recroissance après
traitement au froid. La modification de la dynamique n’est donc pas suffisante pour induire
des défauts dans l’organisation globale des microtubules. Un exemple similaire est observé
dans les cellules de drosophile en culture après traitement par RNAi contre EB1. La
déplétion de cette +TIP entraîne des défauts de dynamique des microtubules sans affecter
de manière globale le réseau (Rogers et al., 2002).
Nos résultats suggèrent que la tubuline γ participe à l’organisation des microtubules
interphasiques sous la forme de γ-TuSC et que le γ-TuRC ne serait pas essentiel dans ce
processus.
2) Rôle des γ-TuSCs et des γ-TuRCs en mitose
La tubuline γ est essentielle à la formation d’un fuseau mitotique bipolaire
fonctionnel (Horio et al., 1991; Marschall et al., 1996; Martin et al., 1997; Paluh et al.,
2000; Raynaud-Messina et al., 2004; Sobel and Snyder, 1995; Spang et al., 1996; Strome et
al., 2001; Sunkel et al., 1995). Nous avons étudié le rôle de Dgrip84 dans l’organisation du
fuseau mitotique chez la drosophile. Cela a permis de comparer les phénotypes induits par
la déplétion des trois protéines du γ-TuSC (tubuline γ, Dgrip84 et Dgrip91) dans un même
66
organisme métazoaire (Barbosa et al., 2003; Barbosa et al., 2000; Raynaud-Messina et al.,
2004; Sampaio et al., 2001; Sunkel et al., 1995). Puis, nous avons analysé, pour la première
fois dans des cellules animales, le rôle des protéines spécifiques du γ-TuRC en mitose.
• Le TuSC est essentiel pour l’organisation d’un fuseau bipolaire fonctionnel
La déplétion de Dgrip84 par RNAi dans les cellules S2 provoque un ralentissement
en prométaphase corrélé à des défauts dans l’organisation des fuseaux (fuseaux
majoritairement monopolaires) et une mauvaise séparation des chromosomes. En accord
avec ces observations dans les cellules en culture, le mutant drosophile Dgrip84 présente
25% d’aneuploïdie (Colombie et al., 2006). Chez la drosophile, l’analyse des pôles en
microscopie électronique dans les cellules en mitose après déplétion de Dgrip84, de
Dgrip91 ou de la tubuline γ montre la présence de plus de deux centrioles au même pôle
(Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004). Ceci suggère
une mauvaise séparation ou duplication des centrosomes. Des défauts de séparation des
pôles, conduisant à des fuseaux monopolaires, pourraient être dû à des défauts dans la
nucléation ou la dynamique des microtubules interpolaires, comme cela a été suggéré chez
Caenorhabditis ou S. cerevisiae (Knop et al., 1997; Marschall et al., 1996; Strome et al.,
2001). Chez la drosophile, les protéines du γ-TuSCs pourraient aussi être impliquées dans
la duplication des centrioles, comme c’est le cas pour la tubuline γ chez Ceanorabditis et
Paramecium ainsi que pour Spc97 (Dgrip84) chez S. cerevisiae (Dammermann et al., 2004;
Knop et al., 1997; Ruiz et al., 1999). Cependant, il est difficile de certifier le nombre de
centrioles du fait de la limite de la technique de microscopie électronique qui ne permet pas
une exploration exhaustive des cellules.
Les défauts en mitose sont identiques lorsque l’expression d’une des trois protéines
du γ-TuSC (Dgrip84, Dgrip91 et la tubuline γ) est inhibée dans les cellules de drosophile en
culture ou in vivo (Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al.,
2004; Sunkel et al., 1995 ). L’ensemble de ces données démontre que les trois protéines du
γ-TuSC ne sont pas redondantes et sont nécessaires à l’organisation d’un fuseau bipolaire
fonctionnel.
67
Curieusement, les microtubules persistent en absence de tubuline γ. Pourtant, la
tubuline γ interviendrait dans les autres mécanismes d’assemblage du fuseau indépendants
du centrosome [Voir INTRODUCTION II-3)-p16]. La fraction restante de tubuline γ après
traitement RNAi pourrait être suffisante pour générer des microtubules. Les études en
microscopie électronique ont montré que les cellules de drosophile déplétées en Dgrip84 ou
en tubuline γ sont capables d’assembler des microtubules, non plus à partir du PCM, mais
par élongation des microtubules centriolaires (Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et
al., 2004). Ces microtubules forment des faisceaux mono-orientés qui peuvent expliquer
d’une part la formation de fuseaux monopolaires et d’autre part l’absence de microtubules
astraux dans les cellules dépourvues en protéines du γ-TuSC (Barbosa et al., 2000;
Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004). Ce mode d’assemblage pourrait
constituer un mécanisme alternatif mis en place lorsque la tubuline γ est absente.
Cependant, la présence d’une fraction minoritaire mais très stable de tubuline γ au niveau
des centrioles suggère qu’elle pourrait intervenir dans l’élongation des microtubules
centriolaires dans des conditions normales (Fuller et al., 1995; Khodjakov and Rieder,
1999).
• Les protéines du γ-TuRC ne sont pas essentielles pour une mitose
fonctionnelle et présentent des spécificités fonctionnelles
La perte de fonction par RNAi d’une protéine spécifique du γ-TuRC dans les
cellules de drosophile, comme par exemple Dgrip75, induit une accumulation des cellules
en prométaphase mais les défauts d’organisation des fuseaux sont moins sévères qu’après
déplétion des protéines du γ-TuSC (Vérollet et al., 2006). Les fuseaux monopolaires sont
moins fréquents et on peut observer des fuseaux bipolaires présentant des pôles
normalement focalisés et des microtubules astraux. Cependant, les fuseaux bipolaires
présentent une distance interpolaire plus grande et une densité de microtubules plus faible.
Aucune anomalie détectable dans l’organisation du cytosquelette microtubulaire en mitose
des neuroblastes de mutant Dgrip75. Ceci peut s’expliquer par la difficulté à définir la
morphologie exacte des fuseaux dans les neuroblastes au sein du cerveau ou par une perte
de fonction partielle dans le mutant.
68
Les mutants des gènes codant les protéines spécifiques du γ-TuRC présentent peu ou
pas d’aneuploïdie, suggérant que les mitoses sont fonctionnelles (Vérollet et al., 2006). Ces
résultats sont en accord avec la viabilité de ces mutants (Schnorrer et al., 2002; Vérollet et
al., 2006; Vogt et al., 2006). Par contre, ils ne sont pas en accord avec le mode de
recrutement de la tubuline γ via le γ-TuRC au centrosome (Fava et al., 1999; Stearns and
Kirschner, 1994; Zhang et al., 2000; Zheng et al., 1995). Dans un tel modèle, les
phénotypes induits par la déplétion de chaque composant du γ-TuRC auraient du être
similaires.
Les protéines spécifiques du γ-TuRC présentent des spécificités quant à leur rôle
dans l’assemblage des complexes γ (Vérollet et al., 2006). Contrairement aux protéines à
motifs grip, la protéine Dgp71WD n’est pas nécessaire à l’assemblage d’un complexe dont
le coefficient de sédimentation est comparable à celui du γ-TuRC. Le γ-TuRC étant défini
notamment par sa composition protéique, ces complexes 30S assemblés dans le cytosol ne
sont pas des γ-TuRCs. Toutes les autres protéines à motifs grip étant présentes dans ces
complexes, ils pourraient correspondre à des complexes de composition similaire aux γ-
TuRCs mais dépourvus de Dgp71WD. Après déplétion de Dgp71WD par RNAi et dans le
mutant, la tubuline γ ainsi que les protéines qui lui sont associées dans le γ-TuRC sont
recrutées aux pôles des fuseaux. (Vérollet et al., 2006). Cependant, ces fuseaux sont
majoritairement monopolaires suggérant que les complexes recrutés ne sont pas
fonctionnels. Des fuseaux monopolaires sont aussi obtenus dans les cellules de mammifères
transfectées avec des siRNAs contre Nedd1, l’homologue humain de Dgp71WD (Haren et
al., 2006; Luders et al., 2006). La caractérisation fonctionnelle de Nedd1, l’homologue de
Dgp71WD chez les mammifères, a montré que Nedd1 est nécessaire à la localisation de la
tubuline γ au centrosome et le long des microtubules du fuseau (Haren et al., 2006; Luders
et al., 2006). Ces données sont en contradiction avec les données obtenues chez la
drosophile (Vérollet et al., 2006). La faible homologie entre les protéines associées à la
tubuline γ pourrait être à l’origine des différences fonctionnelles dans des organismes
différents.
69
• Modèle de recrutement de la tubuline γ au centrosome via le γ-TuSC
La déplétion d’un des composants du γ-TuSC empêche le recrutement des deux
autres aux pôles, sur les microtubules du fuseau et au fuseau central en fin de mitose
(Barbosa et al., 2000; Colombie et al., 2006; Raynaud-Messina et al., 2004). La présence
des trois protéines du γ-TuSC et leur assemblage en complexe est donc nécessaire pour le
recrutement de la tubuline γ à ces différentes localisations en mitose. Par contre, après
déplétion par RNAi de chaque protéine à motifs grip spécifiques du γ-TuRC dans les
cellules S2, la tubuline γ et les deux protéines qui lui sont associées dans le γ-TuSC sont
recrutées aux pôles en mitose (Vérollet et al., 2006). Ces résultats ont été retrouvés in vivo
par l’analyse des mutants Dgrip75 et Dgp71WD. Ils sont aussi en accord avec les données
chez la levure S. pombe. Dans cet organisme, les mutations de Gfh1p (Dgrip75), Alp16
(Dgrip163) et mod21 (Dgrip128) entraînent des défauts mineurs dans l’organisation des
fuseaux et les protéines du γ-TuSC sont correctement recrutées au SPB (Anders et al.,
2006; Fujita et al., 2002; Venkatram et al., 2004). L’assemblage des γ-TuRCs dans le
cytoplasme n’est donc pas indispensable pour le recrutement de la tubuline γ au
centrosome. Des expériences complémentaires de déplétion simultanées des quatre
protéines spécifiques du γ-TuRC ont permis de renforcer le fait que la tubuline γ peut être
recrutée aux pôles sous forme de γ-TuSCs (Vérollet et al., 2006) (Figure 22). Cette idée est
en accord avec les données chez la levure S. cerevisiae où seul un complexe de petite taille
contenant les trois homologues des protéines du γ-TuSC existe (Knop et al., 1997 ; Knop
and Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998; Vinh et al., 2002). Le modèle de recrutement de la
tubuline γ en absence de γ-TuRC, via le γ-TuSC, pourrait être une voie physiologique de
recrutement de la tubuline γ. Il est aussi concevable que les modes de recrutement soient
plus complexes. Deux autres protéines à motifs grip, appelées Dgrip79 et 223 (Wiese and
Zheng, 2006), sont présentes dans le génome de la drosophile mais rien n’est connu. Ces
deux protéines ou d’autres partenaires non identifiés de la tubuline γ pourraient aussi
participer à la formation et au recrutement des complexes de tubuline γ au centrosome.
Les deux protéines grip du γ-TuSC pourraient être directement impliquées dans le
recrutement ou/et l’ancrage de la tubuline γ au niveau des MTOCs. Ceci est cohérent avec
les données biochimiques et génétiques qui ont montré que ces protéines interagissent avec
γ-TuSC
γ-TuRC
matériel péricentriolaire centrioles
MICROTUBULES DU FUSEAU MITOTIQUE CENTROSOME = PÔLES DU FUSEAU MITOTIQUE
Figure 22 : Mécanismes de recrutement de la tubuline γ en mitose dans les cellules de drosophile. Le γ-TuSC s'associe à au moins 4 autres protéines pour former le γ-TuRC dans le cytoplasme, puis le γ-TuRC est récruté au centrosome en début de mitose pour nucléer des microtubules (flèches noires). En absence de γ-TuRC, nous avons montré que le γ-TuSC pouvait être recruté au centrosome (fléche rose) et nucléer partiellement des microtubules. Par contre, le recrutement de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau se fait via le γ-TuRC exclusivement (flèche mauve).
70
des composants du SPB et du PCM. Les protéines Spc110 et Spc72 qui sont nécessaires à
l’ancrage des complexes de tubuline γ au SPB chez S. cerevisiae interagissent
génétiquement avec Spc98 (Dgrip91) (Knop and Schiebel, 1997; Nguyen et al., 1998). Les
homologues de Spc110 chez les mammifères seraient CG-NAP (centrosome and Golgi
localized PKN-associated protein) et la kendrine/péricentrine. Ces protéines sont
essentielles à la localisation de la tubuline γ au centrosome en mitose et interagissent
spécifiquement avec GCP2 (Dgrip84) et GCP3 (Dgrip91) (Kawaguchi and Zheng, 2004;
Takahashi et al., 2002; Zimmerman et al., 2004). Chez la drosophile, l’orthologue de ces
protéines, CP309/D-PLP (Drosophila-pericentrine like protein) interagit également avec le
γ-TuSC et est nécessaire à la localisation de la tubuline γ aux pôles des fuseaux
(Kawaguchi and Zheng, 2004; Martinez-Campos et al., 2004). Il pourrait exister une
certaine conservation entre les protéines d’ancrage des complexes tubuline γ chez les
levures et les animaux malgré les différences concernant la structure des complexes. Il est
aussi probable que de nombreuses protéines non identifiées participent au recrutement de la
tubuline γ au centrosome et forment une « plate-forme » d’ancrage.
Chez la drosophile, nous proposons que le γ-TuSC peut être recruté au centrosome
en début de mitose, indépendamment du γ-TuRC, et permet la nucléation de microtubules
nécessaires à la formation d’un fuseau bipolaire fonctionnel pour la ségrégation des
chromosomes. La présence de microtubules astraux après perte de fonction des protéines
spécifiques du γ-TuRC suggère que le PCM reste actif pour la nucléation. Dans ces
conditions, les microtubules assemblés possèdent une structure « normale » à 13
protofilaments en microscopie électronique (Vérollet et al., 2006). Cette observation peut
paraître en contradiction avec le modèle de nucléation proposé par Oakley dans lequel
l’anneau de tubuline γ formé par le γ-TuRC servirait de moule pour la nucléation des
microtubules à 13 protofilaments (Oakley, 1995). Il est possible d’imaginer que plusieurs
γ-TuSCs puissent s’assembler au niveau du PCM pour former une structure en anneau
comparable au γ-TuRC. Cependant, le γ-TuSC n’est pas capable de former un complexe
multimérique in vitro (Oegema et al., 1999). Cette hypothèse nécessiterait donc la présence
d’autres protéines du PCM. Par exemple, les deux protéines grip non caractérisées, Dgrip79
71
et Dgrip225 pourraient participer à la formation d’un complexe en forme d’anneau. Il n’est
toutefois pas possible d’exclure totalement que, dans nos conditions de déplétion, la
fraction restante de protéines spécifiques du γ-TuRC soit suffisante pour former des γ-
TuRCs.
• le γ-TuRC est le complexe optimal pour le déroulement de la mitose
La co-déplétion des protéines spécifiques du γ-TuRC engendre une diminution de la
quantité de γ-TuSCs recrutés aux pôles, la formation de fuseaux monopolaires et une forte
polyploïdie (Vérollet et al., 2006). Dans ces conditions, la quantité de γ-TuSCs aux pôles
est diminuée. Il est possible que les fuseaux ne soient fonctionnels que si le niveau de γ-
TuSCs aux pôles dépasse un « seuil critique ».
In vitro, le γ-TuSC favorise l’assemblage des microtubules et stabilise l’extrémité
moins mais de manière moins efficace que le γ-TuRC (Oegema et al., 1999).
L’accumulation des cellules en mitose, en absence de γ-TuRC, peut donc s’expliquer par
une cinétique plus lente de nucléation des microtubules nécessaires à la formation du
fuseau.
La déplétion des protéines spécifiques du γ-TuRC par RNAi dans les cellules de
drosophile n’empêche pas le recrutement de la tubuline γ aux pôles mais le marquage le
long des microtubules du fuseau n’est plus détectable (Vérollet et al., 2006). La localisation
de la tubuline γ sur les microtubules du fuseau est donc dépendant de l’assemblage en γ-
TuRC. D’après les expériences de Mahoney et al. dans les cellules S2, la déplétion par
RNAi de la tubuline γ réduit le nombre de microtubules provenant de façon aléatoire de
points à l’intérieur fuseau. L’absence de tubuline γ le long des microtubules du fuseau
pourrait diminuer le nombre de microtubules nucléés et/ou affecter leur fonctionnalité
(Mahoney et al., 2006). De plus, le γ-TuRC est nécessaire pour réguler la dynamique des
microtubules en interphase (cette étude). Des défauts de dynamique de certains
microtubules en mitose pourraient expliquer le retard dans la formation des fuseaux après
déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC.
72
En fin de mitose, le γ-TuRC serait nécessaire pour le déroulement correct de la
cytocinèse. Les analyses des spermatocytes du mutant Dgrip84 a mis en évidence que
Drip84, comme la tubuline γ et Dgrip91, est nécessaire pour l’accomplissement des deux
divisions méiotiques (Barbosa et al., 2003; Colombie et al., 2006; Sampaio et al., 2001).
Des résultats similaires ont été obtenus dans des mutants Dgrip75 et Dgrip128 (Vogt et al.,
2006). Dans ces mutants, la cytocinèse est très asymétrique voir abortive. Les défauts post-
métaphasiques peuvent être observés du fait de la faible stringence du point de contrôle
dans les spermatocytes. Il est tout de même difficile de conclure sur un rôle direct des
protéines du γ-TuRC en fin de mitose car cela peut être la conséquence de défauts dans
l’organisation et la fonction du fuseau au cours de étapes précédentes. Certaines données
sont en faveur d’un rôle du γ-TuRC dans l’organisation des microtubules du fuseau central.
La tubuline γ est présente sous forme de γ-TuRC au niveau du fuseau central dans les
cellules animales (Julian et al., 1993; Raynaud-Messina et al., 2004; Vérollet et al., 2006).
De plus, des expériences d’injection d’anticorps contre la tubuline γ en anaphase empêche
la formation du fuseau central dans les cellules de mammifères (Julian et al., 1993).
En conclusion, le γ-TuSC serait l’unité minimale pour assurer une ségrégation
correcte des chromosomes lors de la mitose et une organisation normale des microtubules
en interphase. Le γ-TuRC n’est pas indispensable pour le recrutement des γ-TuSCs aux
pôles du fuseau mitotique. Son assemblage permet la localisation de la tubuline γ le long
des microtubules du fuseau et l’optimisation de la progression en mitose. Il favorise aussi la
localisation de la tubuline le long des microtubules cytoplasmiques et stabilise les deux
extrémités des microtubules.
73
3) Co-régulation des protéines du γ-TuSC
Le niveau d’expression des trois protéines du γ-TuSC est co-régulé (données non
publiées), ce qui explique les fortes similitudes entre les phénotypes obtenus après leur
perte de fonction. Cette régulation croisée des protéines du γ-TuSC a lieu aussi bien dans
les cellules de drosophile et humaines qu’ in vivo chez la drosophile. Elle est indépendante
des protéines spécifiques du γ-TuRC. Le niveau de tubuline γ n’étant pas affecté dans des
mutants Alp4 (Dgrip84) chez S. pombe, une telle co-régulation n’aurait pas lieu dans tous
les organismes(Vardy and Toda, 2000). Cependant, il serait nécessaire d’analyser le niveau
de Alp6 (Dgrip91) dans ce mutant pour conclure.
La tubuline γ monomérique est capable d’assembler des microtubules in vitro
(Leguy et al., 2000) et sa surexpression dans les cellules de mammifères induit une
nucléation ectopique (Shu and Joshi, 1995). De plus, l’inhibition de l’expression de la
tubuline γ induit des défauts de nucléation. Le contrôle du niveau de tubuline γ et des
protéines du γ-TuSC dans la cellules pourrait permettre de réguler l’activité de nucléation
des microtubules.
Nous avons montré que la régulation des protéines du γ-TuSC n’est pas dépendante
du niveau des ARNm comme cela avait déjà été décrit pour les tubulines α/β (Cleveland,
1983a; Cleveland, 1983b; Patcher et al., 1987). L’hypothèse la plus probable est que
l’assemblage du γ-TuSC soit nécessaire à la stabilité des protéines qui le composent. Afin
de valider cette hypothèse, il serait nécessaire de comparer la demi-vie des protéines du γ-
TuSC dans des cellules contrôles ou après déplétion d’un des composants du γ-TuSC.
Certaines données suggèrent que le protéasome pourrait réguler le niveau de tubuline γ au
centrosome. Des expériences dans les cellules de mammifères ont montré que la tubuline γ
s’accumule au centrosome en présence d’inhibiteurs du protéasome (Fabunmi et al., 2000).
D’autre part, le protéasome joue un rôle dans la maturation du PCM et la tubuline γ
humaine peut être ubiquitinylée au centrosome par le complexe BRCA1/BARD1 (Starita et
al., 2004). Il serait donc judicieux d’analyser l’effet d’inhibiteurs du protéasome, tel que
l’époxomycine ou le MG115, combinés à des traitements RNAi contre la tubuline γ ou à sa
surexpression, sur le niveau de ces partenaires dans le γ-TuSC.
74
IV- Perspectives
1) Protéines impliquées dans la localisation de la tubuline γ
sur les microtubules
Dans les cellules de drosophile en mitose, la tubuline γ est recrutée au centrosome et
se localise le long des microtubules du fuseau, en particulier sur les microtubules
kinétochoriens. En interphase, elle est très majoritairement cytoplasmique et une fraction
est présente le long des microtubules jusqu’à leur extrémité plus. Nous avons montré que la
localisation de la tubuline γ le long des microtubules, en interphase et en mitose, est
dépendante de son assemblage en γ-TuRC (cette étude). Par contre, cet assemblage n’est
pas nécessaire à sa localisation centrosomale en mitose. Ces données suggèrent que les
protéines responsables de ces diverses localisations peuvent être de nature différente. Le γ-
TuRC peut être soit transporté sur les microtubules par des protéines motrices, soit ancré ou
« capturé » par des protéines d’ancrage sur les microtubules (Figure 23).
L’ efficacité du RNAi dans les cellules de drosophile en culture peut nous permettre
d’identifier des protéines nécessaires à la localisation de la tubuline γ sur les microtubules
interphasiques. L’expérience consiste à analyser si la déplétion (4, 5 et double RNAi à 7
jours) de protéines candidates empêche la présence de tubuline γ sur les microtubules en
immunofluorescence dans des cellules S2R+ (perméabilisées ou non avant fixation).
• Identification des protéines nécessaires à l’ancrage des γ-TuRCs sur les
microtubules en interphase
Chez S. pombe, deux protéines d’ancrage des complexes de tubuline γ ont été
identifiées récemment, mto1 et mto2 (Carazo-Salas and Nurse, 2006; Janson et al., 2005;
Samejima et al., 2005; Sawin et al., 2004) [Voir ANNEXE 2 : Localisations de la tubuline γ
et MTOCs]. L’homologue de mto1 chez la drosophile serait Cnn. Aucun homologue n’a été
γ-TuRC
Figure 23 : Identification des protéines de transport ou d'ancrage de la tubuline γ (sous forme de γ-TuRC) sur les microtubules en interphase.
protéine
d'ancrage?protéines motrices?
γ-TuRC
75
identifié pour mto2. Dans les cellules de drosophile en mitose, la Cnn permettrait l’ancrage
de la tubuline γ spécifiquement au centrosome (Terada et al., 2003). Un traitement RNAi
contre la Cnn conserve uniquement la localisation de la tubuline γ sur les microtubules du
fuseau (Goshima et al., 2007; Mahoney et al., 2006; Muller et al., 2006; Terada et al.,
2003). En interphase, Cnn est dispersée dans le cytoplasme des cellules S2 et n’est pas
associée aux microtubules (données non publiées). Pour ces raisons, il est peu probable que
Cnn exerce des fonctions similaires à mto1 chez la drosophile.
Un « crible RNAi » sur le génome complet de la drosophile basé sur la recherche de
nouveaux gènes nécessaires à l’assemblage du fuseau, a permis de mettre en évidence 4
nouvelles protéines, Dgt3-6, spécifiquement nécessaires à la localisation de la tubuline γ le
long des microtubules du fuseau (Goshima et al., 2007). La déplétion par RNAi de ces
protéines induit des phénotypes comparables à ceux obtenus après déplétion de Dgrip75,
Dgrip128 et Dgrip163. Ces protéines en fusion avec la GFP se localisent uniformément sur
les microtubules du fuseau et le marquage disparaît après désassemblage des microtubules.
La forme étiquetée de ces protéines ne localise pas sur les microtubules en interphase. Il est
nécessaire d’analyser plus en détail la localisation de ces nouvelles protéines en interphase
en utilisant des anticorps. D’une part, la GFP peut empêcher certaines localisations et
d’autre part, Dgt3-6 peuvent être, comme la tubuline γ, très majoritairement
cytoplasmiques.
Les premières études seront réalisées après RNAi contre les protéines Dgt3 à Dgt6
qui pourraient être de bons candidats au vu de leur rôle spécifique dans le recrutement de la
tubuline γ le long des microtubules en mitose. Dans un deuxième temps, l’effet de
l’inhibition de deux protéines responsables de l’ancrage de la tubuline γ au centrosome sera
analysée (CP309/D-PLP et Cnn).
• Identification des protéines motrices nécessaires au transport des γ-TuRCs
sur les microtubules en interphase
In vitro dans des extraits de xénope, la tubuline γ-GFP surexprimée est capable de se
déplacer le long des microtubules de manière dynéine dépendante pour atteindre le centre
76
des asters (Kotani and Yamashita, 2005). A l’inverse, il est possible d’imaginer le transport
de la tubuline γ du centrosome vers l’extrémité plus des microtubules par des kinésines.
Un « crible RNAi » ciblé sur les 26 protéines motrices chez la drosophile (25
kinésines et la dynéine) (Goshima and Vale, 2003) permettront d’identifier celle(s) qui
pourraient être responsable(s) du transport de la tubuline γ le long des microtubules.
Lors de la cytocinèse, les protéines indispensables au recrutement de la tubuline γ
sur le fuseau central ne sont pas connues. Par une approche comparable, nous pourrons
rechercher les protéines impliquées dans la localisation non centrosomale de la tubuline γ
au niveau du fuseau central.
2) Conséquences du rôle de la tubuline γ sur la dynamique
des microtubules
Mes travaux ont permis la mise en évidence d’une nouvelle fonction de la tubuline γ
dans la stabilisation des microtubules en interphase. Cette fonction est exercée par la
tubuline γ sous forme de γ-TuRCs. Elle met en jeu la régulation de protéines de l’extrémité
plus des microtubules et par conséquent, elle contrôle les contacts entre les microtubules et
le cortex cellulaire (cette étude). De nombreuses fonctions cellulaires telles que la
migration et la division sont contrôlées par la dynamique des microtubules. Nous allons
nous intéresser aux conséquences du rôle de la tubuline γ sur la dynamique des
microtubules en particulier lors de la mitose et dans le dialogue entre les microtubules et
l’actine en interphase nécessaire à la migration cellulaire.
• Projet 1 : Rôle de la tubuline γ dans la dynamique des microtubules au cours
de la division cellulaire
Le γ-TuRC permet l’optimisation de la progression en mitose et stabilise les
microtubules en interphase. Il pourrait réguler la dynamique de certains microtubules du
fuseau mitotique. De manière schématique, trois sous-types de microtubules dans le fuseau
77
participent à la progression dans les différentes étapes de la mitose : (1) Les microtubules
interpolaires ou chevauchants permettent la séparation des pôles en début de mitose puis
l’éloignement des pôles lors de l’anaphase B ainsi que la formation du fuseau central, (2)
Les microtubules astraux polaires contrôlent le positionnement et la taille du fuseau, les
microtubules astraux équatoriaux sont responsables en partie de l’invagination du cortex en
début de cytocinèse (Glotzer, 2004) et (3) Les microtubules kinétochoriens capturent les
chromosomes, les alignent en métaphase et les séparent de manière coordonnée en
anaphase A (Figure 24).
Lors de la déplétion d’une protéine spécifique du γ-TuRC, comme Dgrip75, les
phénotypes obtenus peuvent être réinterprétés en prenant en compte le rôle du γ-TuRC dans
la dynamique des microtubules (Vérollet et al., 2006). La dynamique des trois sous-types
de microtubules du fuseau peut être affectée. Certains fuseaux sont monopolaires suggérant
une mauvaise séparation des pôles en prophase et donc une dynamique des microtubules
interpolaires affectée. Les fuseaux bipolaires sont anormalement allongés mais possèdent
des microtubules astraux. La dynamique et/ou l’interaction avec le cortex des microtubules
astraux peut être altérée. D’autre part, la présence de la protéine BubR1 aux kinétochores
dans les cellules bloquées en prométaphase suggère que la tension exercée entre les
microtubules et les kinétochores est anormale, même s’ils semblent attachés (Colombie et
al., 2006; Logarinho et al., 2004). Des études complémentaires dans les cellules S2 ont
montré que le γ-TuRC interagit avec les protéines BubR1 et Cdc20 et joue un rôle dans la
régulation du point de contrôle mitotique indépendant du centrosome (Muller et al., 2006).
Sachant qu’un seul microtubule non attaché au kinétochore suffit pour activer le point de
contrôle en mitose, il est possible que le rôle du γ-TuRC dans ce processus soit indirect.
L’activation du point de contrôle peut aussi provenir de perturbations de la dynamique des
microtubules kinétochoriens qui modifieraient les forces exercées entre ces microtubules et
les kinétochores (Taylor et al., 2007; Weaver and Cleveland, 2007). La présence de γ-
TuRC sur les microtubules kinétochoriens est en accord avec cette idée (Lajoie-Mazenc et
al., 1994). L’absence de la tubuline γ sur les microtubules kinétochoriens dans les cellules
déplétées en protéines spécifiques du γ-TuRC pourrait augmenter la dynamique de ces
microtubules comme en interphase (cette étude).
PROPHASE PROMETAPHASE
METAPHASE
ANAPHASE- DEBUT DE CYTOCINESE
TELOPHASE- CYTOCINESE CYTOCINESE TARDIVE
centrosome/pôles noyau
chromosome kinétochores/centromère (Cid)
microtubules interpolaires
fibres kinétochoriennes microtubules astraux polaires
microtubules astraux équatoriaux
fuseau central midbody
Figure 24 : Dynamique des microtubules en mitose. A. Photographies de cellules épithéliales de cochon d'inde en mitose (LLC PK). Les chromosomes sont marqués en rouge (DAPI) et les microtubules en vert. B. Schéma des différentes étapes de la mitose et types de microtubules impliqués : les microtubules interpolaires permettent la séparation des pôles en prophase; les microtubules kinétochoriens capturent, alignent et séparent les chromosomes; les microtubules astraux polaires position-nent le fuseau; les microtubules astraux équatoriaux et le fuseau central guident l'invagination du cortex lors de la cytocinèse.
BA
78
- Identification des sous-populations de microtubules en mitose décorées par la
tubuline γ.
En immunofluorescence et en microscopie électronique, la tubuline γ est localisée
préférentiellement sur les fibres kinétochoriennes (Lajoie-Mazenc et al., 1994) qui assurent
l’attache aux chromosomes. Ces fibres constituées de 15 à 30 microtubules peuvent
permettre une meilleure visualisation de la tubuline γ le long des faisceaux de microtubules,
en comparaison avec des microtubules individuels. Cependant, il est possible que la
tubuline γ soit présente en faible quantité sur l’ensemble ou des sous-types de microtubules.
Nous analyserons la localisation de la tubuline γ sur les microtubules en mitose par
différentes méthodes de fixation, dans différents types cellulaires de drosophile et en
utilisant une lignée exprimant la tubuline γ-GFP. Des premières expériences ont permis de
mettre en évidence une fraction de la tubuline γ sur les microtubules astraux dans certaines
conditions (données non publiées).
- Etude du déroulement de la mitose en temps réel
Grâce à la lignée de cellules S2 exprimant la tubuline α-GFP cultivées sur lames de
verre, nous pourrons analyser le déroulement de la mitose en absence d’une protéine
spécifique du γ-TuRC telle que Dgrip75, afin de visualiser les anomalies en mitose
spécifiquement dues à des défauts de dynamique des microtubules. Une première étude
sera effectuée sur des temps longs (12h avec prise de photos toutes les 15 minutes) pour
optimiser le nombre de mitoses analysables. Nous pourrons mesurer certains paramètres :
la durée globale de la mitose, la rotation des fuseaux, les anomalies du cortex au niveau du
sillon de cytocinèse. Dans un deuxième temps des films plus courts (2h avec prise de
photos toutes les 5 minutes) permettront d’affiner les résultats, en particulier, nous pourrons
préciser les anomalies des fuseaux et analyser quelles phases de la mitose sont
préférentiellement ralenties.
- Etude de la dynamique des microtubules en temps réel
Les défauts mis en évidence nous permettront de proposer quel sous-type de
microtubules mitotiques pourrait présenter une modification de dynamique. Des défauts de
79
taille, de rotation ou de symétrie des fuseaux peuvent être la conséquence d’une altération
de la dynamique des microtubules astraux polaires. Des défauts de « timing » ou de
mauvais placement du sillon de clivage pourraient être dus à une altération des
microtubules astraux équatoriaux. Des retards de la mitose peuvent également être dus à
une altération de la dynamique des microtubules kinétochoriens.
Des premières expériences sur concanavaline A ont montré que nous sommes
capables de suivre la dynamique de certains microtubules individuels (prise de photos
toutes les 0.5 s) : les microtubules astraux au niveau des pôles en métaphase et les
microtubules équatoriaux en anaphase qui vont au contact du cortex à l’équateur de la
cellule. Dans des cellules contrôles, ces derniers sont stabilisés lorsqu’ils atteignent le
cortex pour permettre la contraction du cortex. Nous mesurerons les paramètres
dynamiques de ces microtubules individuels dans des cellules contrôles et traitées par
RNAi contre Dgrip75.
Cid est une protéine présente aux kinétochores tout le long de la mitose (Henikoff et
al., 2000). Une analyse indirecte de la dynamique des microtubules kinétochoriens sera
possible grâce à des expériences en temps réel sur des lignées S2 tubuline-GFP/Cid-RFP
(en construction dans le laboratoire de S. Carreno) après traitement par RNAi contre
Dgrip75. Nous pourrons mesurer les durées de capture des microtubules, d’alignement et
de séparation des chromosomes en réalisant des films très courts (100s avec prise de photos
toutes les 1 à 2 secondes). Cette étude peut être complétée par une analyse directe de la
dynamique des fibres kinétochoriennes. En effet, la visualisation des microtubules
kinétochoriens peut être améliorée lorsque les cellules S2 sont placées sous une couche
d’agarose (Maiato et al., 2004a). Des expériences de coupure ou de photoblanchiment de
courtes régions des fibres kinétochoriens dans le fuseau seront utilisées pour analyser les
effets de la déplétion des protéines du γTuRC sur la dynamique des microtubules
kinétochoriens.
• Projet 2 : Rôle de la dynamique des microtubules contrôlée par les γ-TuRCs
dans la formation du lamellipode en interphase
La migration cellulaire est un mécanisme en plusieurs étapes impliquant la
polarisation de la cellule avec la formation d’un lamellipode qui définira le bord avant, sa
80
contraction, sa propulsion et le relâchement des points d’adhésion du bord arrière (Ridley et
al., 2003; Wehrle-Haller and Imhof, 2003). L’actine est l’élément clé dans l’ensemble de
ces processus, mais les différentes étapes de la migration requièrent également un dialogue
entre l’actine et le cytosquelette microtubulaire. Des expériences dans des fibroblastes ont
montré que la dynamique, et non pas la densité, des microtubules est importante pour la
vitesse de migration. Des « poisons » des microtubules à faible concentration, qui
n’affectent que la dynamique, réduisent jusqu’à 60% le taux de locomotion des fibroblastes
(Honore et al., 2005).
Les γ-TuRCs étant impliqués dans la régulation de la dynamique des microtubules
en interphase, nous testerons le rôle de la tubuline γ et des protéines associées dans le
dialogue entre les microtubules et l’actine dans des cellules S2. Nous nous placerons dans
des conditions où seule la dynamique des microtubules est affectée (RNAi Dgrip75) pour
analyser la formation du lamellipode.
Les cellules S2 sur concanavaline A s’étalent et forment un lamellipode symétrique
qui est capable de se contracter (Rogers et al., 2003). Des doubles marquages
microtubule/actine permettront de vérifier le nombre de microtubules qui atteignent le
lamellipode dans des cellules traitées par RNAi contre Dgrip75. La formation de ce
lamellipode étant nécessaire pour la migration, la morphologie et l’épaisseur du
lamellipode seront analysées. Les lignées S2 exprimant de façon stable l’actine-GFP de S.
Rogers pourront être utilisées, ainsi que des lignées tubuline-GFP/actine-RFP (Red
Fluorescent Protein) en construction dans l’équipe de S. Carréno (communication
personnelle). Les expériences en temps réel offrent la possibilité d’analyser si les
contractions de l’actine du lamellipode sont perturbées dans les cellules traitées. Parmi les
90 protéines en liaison avec l’actine analysées par RNAi par S. Rogers pour leur rôle dans
la formation du lamellipode (Rogers et al., 2003), la localisation de celles qui induisent des
phénotypes comparables après déplétion à ceux induits par la déplétion de Dgrip75 sera
étudiée.
Nous avons montré que la tubuline γ régule la localisation de la +TIP EB1. Les
conséquences de cette régulation sur les protéines associées à EB1 pourront être étudiées,
en particulier les protéines qui sont impliquées dans le dialogue microtubule/actine, comme
81
les spectraplakines ou directement des activateurs de l’actine. Dans les cellules S2,
RhoGEF2, qui active des GTPasess de la famille Rho et contrôle donc le cytosquelette
d’actine, interagit avec l’extrémité plus des microtubules par l’intermédiaire de EB1
(Rogers et al., 2004). EB1 interagit aussi directement avec Shot, la seule spectraplakine ou
MACF (microtubule actin cross-linking factors) qui existe chez la drosophile (Slep et al.,
2005). Les première études pourront consister à évaluer la localisation de RhoGEF2 et Shot
en absence de γ-TuRC. Ces derniers pourraient réguler RhoGEF2 à l’extrémité plus des
microtubules mais aussi lors de son passage par le centrosome (Rogers et al., 2004).
A plus long terme, le rôle de la stabilisation des microtubules par la tubuline γ sera
évalué dans le processus de migration. En collaboration avec le laboratoire de S. Carréno,
la mise au point d’un test de migration à travers une membrane semi-perméable dans des
conditions invasives et non invasives sur cellules de drosophile sera réalisée. Les résultats
les plus significatifs seront ensuite explorés et développés dans des modèles de cellules
humaines. Les cellules endothéliales HMEC-1 exprimant la tubuline α-GFP de façon
transitoire pourront être utilisées car elles permettent une analyse aisée de la dynamique des
microtubules individuels (Pourroy et al., 2006). Nous confirmerons, dans des cellules
endothéliales humaines, le rôle stabilisateur de l’extrémité plus des microtubules par la
tubuline γ à l’aide de siRNAs dirigés contre la tubuline γ dont l’efficacité a été démontrée
au laboratoire dans des cellules Hela. Les cellules HMEC-1 sont utilisées dans des tests de
migration (Pourroy et al., 2006). D. Rebérioux (Laboratoires Pierre Fabre) met en place une
automatisation du suivi des cellules en mouvement que nous pourrons utiliser avec les
HMEC-1 déplétées en tubuline γ ou protéines associées.
82
L’ensemble de ces travaux permettront de progresser dans la compréhension des
fonctions de la tubuline γ et des protéines associées dans les γ-TuRCs au cours de différents
processus dépendants des microtubules, en particulier la division cellulaire et la migration
cellulaire. Cependant, la détermination de la structure et de la stœchiométrie du γ-TuRC
ainsi que les interactions entre les protéines qui le composent restent des questions
essentielles auxquelles il sera nécessaire de répondre dans l’avenir.
D’autre part, le rôle de la tubuline γ dans la régulation de la dynamique des microtubules
ainsi que d’autres études montrent que la fonction de cette est protéines est plus complexe
et quelle est impliquée dans des processus indépendants du centrosome. Il a par exemple
été montré que la tubuline γ interagit avec des protéines impliquées dans la réparation de
l’ADN comme Rad51 ou BRCA1 dans des cellules de mammifères (Lesca et al., 2005;
Starita et al., 2004).
Dans le contexte de la recherche de nouvelles cibles et de nouveaux essais de
criblage en pharmacologie anticancéreuse, l’intérêt potentiel de protéines impliquées dans
la mitose et plus spécifiquement dans la régulation de la dynamique des microtubules est un
point à développer. Pour cela, les études sur les protéines du γ-TuRC menées chez la
drosophile devront donc être validées dans des cellules humaines. L’objectif étant
d’approfondir les conséquences de la modification de la dynamique des microtubules sur la
division cellulaire, la polarité et la migration cellulaire, étapes critiques dans les processus
de prolifération et d’invasion tumorale. La similarité dans la composition des complexes et
la fonction des protéines qui les constituent entre la drosophile et l’homme permettront,
dans un premier temps, de déterminer quelles sont les protéines du γ-TuRC les plus
pertinentes à caractériser fonctionnellement dans les cellules humaines, puis, d’orienter la
sélection des protéines-candidates pour des essais pharmacologiques.
83
REFERENCES
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ANNEXE 1 :Table des figures
Les figures sont en vis à vis des pages indiquées
Figure 1 : Structure d’un microtubule et de ses sous-unités………………..………….3
Figure 2 : La mitose………………………………………………………………...….4
Figure 3 : Mécanismes de formation d’un fuseau bipolaire………………………..….5
Figure 4 : Le centrosome……………………………………………………...……….6
Figure 5 : Le SPB et l’organisation des microtubules non-centrosomale ………...….7
Figure 6 : Localisations de la tubuline γ dans les cellules S2…………………….….10
Figure 7 : Organisation des fuseaux en absence de tubuline γ (cellules S2)……...….15
Figure 8 : Elongation des microtubules centriolaires en absence de tubuline γ ….….16
Figure 9 : Caractérisation des pôles en absence de tubuline γ (cellules S2)………….18
Figure 10 : γ-TuSCs et γ-TuRCs chez la drosophile…………………………………22
Figure 11 : Protéines associées à la tubuline γ dans divers organismes…………..….23
Figure 12 : Alignement des séquences (motifs grip)…………………………..…….24
Figure 13 : Les motifs « WD »……………………………………………………….25
Figure 14 : Structure et modèle du γ-TuRC………………………………………….26
Figure 15 : Activité de nucléation des γ-TuSCs et des γ-TuRCs…………………….27
Figure 16 : Les deux modèles de nucléation des microtubules par le γ-TuRC…...….28
Figure 17 : Xgrip210 (Dgrip163) est nécessaire à l’assemblage du γ-TuRC………...30
Figure 18 : Organisation et re-croissance des microtubules en absence de tubuline γ.46
Figure 19 : L’organisation et la re-croissance des microtubules dépend du γ-TuSC...47
Figure 20 : Régulation des protéines du γ-TuSC……………………………………..52
Figure 21 : Régulation des protéines du γ-TuRC …………………………………....53
Figure 22 : Mécanismes de recrutement de la tubuline γ en mitose………………….67
Figure 23 : Protéines d’ancrage ou de transport de la tubuline γ sur les microtubules72
Figure 24 : Dynamique des microtubules en mitose……………………………...….75
AN
NEXE 2 : Localsiations de la tubuline γ et M
TOC
s
Interphase/M
itoseN
ucléation des M
Ts Présence de tubuline γ
Corrélation
Protéines d'ancrage/m
écanismes
Références principales
cellules somatiques
PCM
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UI
H : N
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Droso : C
P309, D
-PLP
, Cnn
Haren et al., 2006; Luders et al., 2006; Takahashi et al.,
2002; Zimm
erman et al., 2004; K
awaguchi et al., 2004;
Martinez-C
ampos et al., 2004; Terada et al., 2003
Centrioles
MO
UI
OU
IO
UI
Ninéine
Delgehyre et al., 2005
MTs du fuseau m
étaphasiqueM
OU
IO
UI
NO
Nnucléation + capture des M
Ts H
: Nedd1 P
Lajoie-Mazenc et al., 1994; M
ahoney et al., 2006; Luders et al., 2006
MTs du fuseau central (cytokinèse)
M_
OU
I_
_P
iehl et al., 2004
Chrom
osomes
MO
UI
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UI
Gradient de R
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par dynéineW
ilde et Zheng., 1999; Karsenti et V
ernos., 2001
Appareil de golgi
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ios et al., 2004
Foci nucléairesI
NO
NO
UI
__
Lesca et al., 2004
plantesM
Ts du fuseau mitotique
MO
UI
Liu et al., 1993; Hoffm
an et al.,1994; Mahoney et al., 2006
Phragm
oplaste (fuseau central cytokinèse)
M_
OU
I_
_H
offman et al.,1994
MTs de la zone apicale
IO
UI
OU
IO
UI
capture des MTs
Murata et al., 2005
S, cerevisiaeS
PB
I+MO
UI
OU
IO
UI
Spc110
Nguyen ert al,, 1998
S, pombe
SP
BI+M
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UI
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Ipcp1/m
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enkatram et al., 2004; Flory et al., 2002
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awin, 2006
iMTO
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UI
mto1/m
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awin et al., 2004; Janson et al., 2005; S
amejim
a et al., 2005
iMTO
Cs cytoplasm
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UI
OU
Im
to1/mto2 + capture des M
TsS
awin et al., 2004; Janson et al., 2005; S
amejim
a et al., 2005
cellules différenciéesE
nvelope nucléaire (musculaires)
IO
UI
OU
ITassin et al., 1985; B
ugnard et al., 2005M
Ts de la zone apicale (épithéliales)
IO
UI
OU
IO
UI
Ninéine+capture des M
TsM
ogensen et al., 2000; Reinlein et al., 2005
Corps basaux (cilliées)
IO
UI?
Ninéine
Hagiw
ara et al., 2000C
ellules neuronalesI
NO
NN
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capture des MTs
Baas et al., 1992; Y
u et al., 1993
Gruss et al., 2002; G
russ et Vernos., 2004
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NEXE 3 : Fonctions des protéines des com
plexes de tubuline γ (littérature)
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