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Estudos de Associação de Módulo Gênico (GMAS)

José Francisco Diogo da Silva Junior – Mestrando CMANS/UECE

Estudo de Associação de Módulo Gênico (GMAS)

▪ Difícil análise genética de fenótipos multifatoriais

▪ Expressão gênica

▪ Variantes polimórficas (SNPs e CNVs) dos genes de interesse

▪ Frequências alélicas

▪ Anormalidades cromossômicas

▪ Dieta e fatores ambientais e comportamentais

▪ Alterações epigenéticas (metilação de DNA)

DAI et al., 2013; MOORE et al., 2013

Estudo de Associação de Módulo Gênico (GMAS)

▪ GWAS vs. GMAS

▪ Métodos reducionistas da complexidade e do volume

▪ Módulos Eigengenes

▪ Representam grupos gênicos baseados em redes de interação

▪ Combinação linear normalizada de genes com a maior variância em

uma população

LANGFELDER et al., 2007; WEISS et al., 2012

Análise de coexpressão gênica

▪ O objetivo é entender o sistema ao invés de relatar uma lista de

partes individuais

▪ Focado nos módulos gênicos: “clusters” ao invés de genes

individuais

▪ Módulos tendem a representar pathways – genes que são

corregulados

▪ O sinal dessas vias tendem a ser mais fortes que o sinal de um único

gene

GMAS – Gene Module Association Study

▪ Ampliação de estudos do tipo GWAS

▪ Cenário de como os grupos de genes funcionam em conjunto

▪ “Soluções boas o suficiente”

▪ Suscetibilidade às doenças comuns pode ser bem mais relacionada à

maneira pela qual os genes normais interagem uns com os outros do

que com efeitos adicionais de múltiplas mutações gênicas

WEISS et al., 2012

Por que os módulos são tão importantes?

▪ Funcionais: espera-se que agrupem junto os genes diretamente

responsáveis por dadas vias metabólicas, processos biológicos, etc.

▪ Úteis do ponto de vista da biologia de sistemas: como ponte entre

os genes individuais e uma visão sistêmica do organismo

▪ Ajudam a minimizar o problema da testagem múltipla

(ambiguidade) de se encontrar genes significativamente

correlacionados com os fenótipos

MAGE – Microarray Gene Expression

▪ Expressão relativa de milhares de genes simultaneamente

▪ Usando o padrão de mudanças na expressão entre dois genes de

interesse, a similaridade da expressão (daí chamada de

“coexpressão gênica") pode ser definida.

▪ Visão geral de toda a atividade transcricional numa amostra

biológica

OBAYASHI et al., 2013

Eigengenes

▪ Representam as expressões características de módulos

▪ Associações ponderadas representam as relações entre os

módulos

▪ Redes eigengenes fornecem um quadro natural de relações entre

módulos gênicos e traços clínicos

LANGFELDER; HORVATH, 2007; WEISS et al., 2012

Redes ponderadas

▪ Nós representam os genes

▪ Bordas representam coexpressão direta entre dois genes

▪ Um nó é conectado a outro se os genes que eles representam

estiverem significativamente coexpressos.

Nó/Gene

Conexão/Coexpressão

Coexpressão gênica

▪ Comparação entre tecidos, linhagens, indivíduos, amostras

▪ Coeficiente da correlação de Pearson (-1 até 1)

▪ Base da construção da rede ponderada

Figura 2. Modelo de forte co-expresão entre dois genes (A e B) Fonte: ATTED v7.1(http://atted.jp/overview.shtml)

Rede de coexpressão gênica

▪ Uma rede de coexpressão pode ser representada por uma matriz

de adjacência, 𝑨 = 𝒂𝒊𝒋 , que identifica se e como um par de nós

estão conectados

▪ 𝑨 é uma matriz simétrica com entradas em 𝟏, 𝟎

▪ Assinalar um peso para cada conexão que represente a conectividade

da coexpressão gênica

▪ Intervalo natural de pesos: 1 (conexão perfeita) ou 0 (sem conexão)

▪ Para redes ponderadas, a matriz de adjacência relata a força da

conexão entre pares de nós

HORVATH, 2011

Rede de coexpressão gênica ponderada

▪ onde 𝒙𝒊 representa o perfil de expressão para o gene 𝒊

▪ Matematicamente, é um vetor de valores de expressão em várias

amostras

▪ Todos os genes estão conectados

▪ Para determinar 𝜷, utiliza-se o critério de topologia “scale free”

RANOLA et al., 2013

Conectividade

▪ Conectividade do nó: soma das linhas da matriz de adjacência

▪ A conectividade de um nó é o número de conexões que o liga ao

resto da rede

▪ A conectividade de todos os nós da rede forma a distribuição da

conectividade

▪ A distribuição da conectividade em redes ponderadas é a soma das

forças de conexão com outros nós

HORVATH, 2011

Densidade

▪ Densidade: média da adjacência

▪ Altamente relacionada à media da conectividade

▪ Onde 𝒏 é o número de módulos da rede

HORVATH, 2011

Detecção de módulo

▪ Há vários métodos que definem uma medida adequada de

dissimilaridade gene-gene e usam técnicas computacionais de

clustering.

▪ A dissimilaridade se baseia na sobreposição topológica

▪ Método de Clustering: agrupamento hierárquico de associação

média

▪ Os ramos do dendrograma são os módulos

Matriz de Sobreposição Topológica (TOM)

▪ A TOM mede a sobreposição do conjunto de vizinhos mais

próximos dos nós 𝒊 e 𝒋

▪ 𝒌 (conectividade): soma das linhas de adjacência

▪ Normalizada para 𝟎, 𝟏 onde 0 = sem sobreposição, 1 =

sobreposição perfeita

LANGFELDER et al., 2013

Relação entre gene 𝒙𝒊 e 𝒙𝒋 em uma rede

▪ Matriz de adjacência 𝑨: rede, onde cada entrada 𝒂𝒊𝒋 fornece a

força de conexão entre 𝒙𝒊 e 𝒙𝒋

▪ Conectividade do gene 𝒙𝒊 𝒌𝒊 = 𝒋𝒂𝒊𝒋 : soma das linhas da força

de conexão dos genes 𝒙𝒊

▪ Sobreposição topológica entre 𝒙𝒊 e 𝒙𝒋: medida do clustering

onde 𝒖𝒂𝒊𝒖𝒂𝒊𝒋 é o número de genes conectados com 𝒙𝒊 e 𝒙𝒋

RAVASZ et al., 2002

Figura 3. Visualização gráfica de redes de coexpressão de genes humanos. A figurainclui 615 genes-nós e 2190 ramos de coexpressão numa rede produzida no formatoCytoscape com anotações completas sobre os 615 genes Fonte: PRIETO et al., 2008

Redes Ponderadas de Eigengenes

▪ Maneira de reduzir a complexidade da análise gênica

▪ A ideia é tratar da relação entre os eigengenes no lugar de todos os

genes

▪ Maior facilidade para testar a associação dos eigengenes com os

fenótipos de interesse

▪ O padrão eigengene deve ser capaz de predizer uma resposta

fenotípica

WEISS et al., 2012

Construir a redeFerramentas: correlação de Pearson, limiar frouxoJustificativa: usar os padrões de interação entre genes

Identificar os módulosFerramentas: TOM, clustering hierárquicoJustificativa: análise baseada em módulo ou pathway

Achar o representativo de cada móduloFerramentas: eigengene (1o Componente Principal)Justificativa: Condensar cada módulo num só perfil

Análise Posterior

módulo de relações, módulo de significância de traços, análise causal

Construindo uma rede de coexpressão

▪ Gerar/obter dados de expressão por microarray

▪ Fazer filtração preliminar

▪ Mensurar a concordância dos perfis de expressão de genes pela

correlação de Pearson

▪ A matriz de correlação de Pearson deve ser continuamente

considerando a função de adjacência → rede ponderada

Construindo uma rede de coexpressão

HORVATH, 2011

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Gene_co-epression_network_construction_steps.png

Redes consensuais eigengene

Módulos individuais

Módulos Consensuais

Eigengenes Consenso

Redes eigengene

consensuais

Redes consensuais eigengene

▪ Módulos: grupos de genes densamente interconectados

▪ Não o mesmo dos genes intimamente relacionados

▪ Uma classe de padrões hiper-representados

▪ Fato empírico: redes de co-expressão gênica exibem estrutura

modular

Por que os módulos são tão importantes?

▪ Funcionais: espera-se que agrupem junto os genes diretamente

responsáveis por dadas vias metabólicas, processos biológicos, etc.

▪ Úteis do ponto de vista da biologia de sistemas: como ponte entre

os genes individuais e uma visão sistêmica do organismo

▪ Para certas aplicações, os módulos são os blocos naturais

formadores da descrição, p.ex., estudo das relações de co-

regulação entre as vias metabólicas ou fenômenos biológicos

▪ Ajudam a minimizar o problema da testagem múltipla

(ambiguidade) de se encontrar genes significantivamente

correlacionados com os fenótipos

Construção das redes ponderadas de coexpressão

KOLACZYK & CSÁRDI, 2014


▪ Pareamento por dissimilaridade entre os objetos

▪ Achar clusters de objetos que estão mais relacionados de acordo

com a medida de (dissimilaridade)


▪ Exemplo: agrupamento de 10 objetos (perfil de expressão gênica)

▪ Iniciar com uma matriz de

similaridade

▪ Cor branca: objetos distantes

(dissimilares)

▪ Cor vermelha: objetos próximos

(similares)


▪ Encontrar dois objetos mais próximos (aqui Gene.1 e Gene.2)


▪ Encontrar dois objetos mais próximos (aqui Gene.1 e Gene.2)

▪ Agrupá-los


▪ Encontrar os próximos objetos mais próximos


▪ Encontrar os próximos objetos mais próximos

▪ Agrupá-los


▪ Outros dois objetos próximos: Gene.7 e o cluster 5-6


▪ Agrupar o Gene.7 com o ramo 5-6


▪ Próximo agrupamento: Gene.3 e cluster 1-2


▪ Próximo: Gene.8 e cluster 5-6-7


▪ Gene.8 e cluster 5-6-7


▪ Próximo agrupamento: Gene.4 e cluster 1-2-3


▪ Agrupar Gene.4 e cluster 1-2-3


▪ Próximo: Gene.10 e cluster 1-2-3-4


▪ Agrupar Gene.10 e cluster 1-2-3-4


▪ Próximo: clusters 1-2-3-4-10 e 5-6-7-8


▪ Agrupar clusters 1-2-3-4-10 e 5-6-7-8


▪ Próximo agrupamento Gene.9 e o cluster maior (1-2-3-4-5-6-7-8-

10)


▪ Agrupar Gene.9 e o cluster maior (1-2-3-4-5-6-7-8-10)

▪ O agrupamento termina, a árvore está completa


▪ Árvore de agrupamento hierárquico (dendograma)


▪ Construir uma árvore de

agrupamento hierárquico

(dendograma) que fornece

informações sobre como os

objetos são agrupados

▪ Identificar os ramos que

correspondem aos clusters

▪ Identificar os ramos por números

ou cores


▪ Matriz de Sobreposição Topológica (TOM) para agrupar genes

YIP & HORVATH, 2007


▪ Definindo módulos de rede

▪ Agrupamento hierárquico das medidas de sobreposição resulta em

uma árvore de cluster (dendograma)



▪ Definindo módulos de rede

▪ Corte dinâmico de árvore (Dynamic tree cutting)



▪ Módulo eigengene-0

.10.

00.

10.

20.

30.

4

brown

123456789101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354555657585960616263646566676869707172737475767778798081828384858687888990919293949596979899100101102103104105106107108109110111112113114115116117118119120121122123124125126127128129130131132133134135136137138139140141142143144145146147148149150151152153154155156157158159160161162163164165166167168169170171172173174175176177178179180181182183184185

LANGFELDER & HORVATH, 2007

Análise Diferencial de Eigengenes na Etiologia Combinada DOISm

(Diabetes, Obesidade, Inflamação e Síndrome Metabólica)

Amostra do Estudo

Amostra do Estudo

▪ Estudo E-MTAB-62:

▪ 5372 amostras, 369 grupos biológicos em 206 experimentos

▪ 22285 genes

▪ Dataset DOISm:

▪ 1439 genes humanos

▪ Amostra final:

▪ 1292 genes em 312 amostras

BEZERRA, 2013

• Carregamento dos dados de expressão

• Identificação e remoção de outliers

Entrada dos dados e pré-processamento

• Escolha do limiar frouxo: análise da topologia de rede

• Similaridade e adjacência da rede de coexpressão

• Plotagem da topologia livre de escala

• Matriz de sobreposição topológica (TOM)

• Definição dos módulos da rede

• Agrupamento dos módulos com perfil de expressão similares

Construção da rede, detecção dos módulos

• Visualização da rede de interação gênica

Visualização da rede, diagnóstico e verificação da integridade

• Identificação da significância gênica

• Identificação dos módulos eigengene

Identificação dos módulos eigengene

• Identificação dos genes com valores altos de significância gênica

• Definição da conectividade intramodular

• Identificação dos genes mais relevantes (hub genes)

Seleção dos Componentes Principais (PC) do módulo eigengene

• Análise do enriquecimento gênico dos módulos eigengene

• Composição de listas de ontologia gênica relacionada com os eigengenes

Ontologia Gênica e Enriquecimento funcional

• Exportação dos módulos para o software Cytoscape

• Visualização e identificação dos genes relevantes em cada módulo eigenene

Exportação para software de visualização externa e análise

Entrada de dados e pré-processamento

▪ Carregamento dos Dados de Expressão e Verificação da Integridade

▪ Identificação de outliers

▪ Análise da topologia de rede

dim(DOISm)[1] 1292 324

clust = cutreeStatic(sampleTree, cutHeight = 50, minSize = 10)table(clust)Clust0 111 312

powers = c(c(1:10), seq(from = 12, to=20, by=2))sft = pickSoftThreshold(dadosExpr, powerVector = powers,verbose = 5)

Entrada de dados e pré-processamento

Análise da topologia da rede


▪ A matriz de sobreposição topológica combina a adjacência de dois

genes e as forças de conexão que esses genes compartilham com

outros genes

▪ Agrupamento hierárquico para produzir um dendograma

TOM = TOMsimilarity(adjacency);dissTOM = 1-TOM

library(flashClust)geneTree = flashClust(as.dist(dissTOM), method = "average");

Detecção dos módulos

▪ Determinação da matriz de adjacência; matriz de sobreposição

topológica baseada na matriz de adjacência; agrupamento com a

matriz de sobreposição topológica.

▪ Seleção dos ramos do dendograma de agrupamento hierárquico

para a identificação dos módulos (Dynamic Tree Cutting)

beta1 = 7;adjacency = adjacency(dadosExpr, power = beta1);TOM = TOMsimilarity(adjacency);dissTOM = 1-TOM

dynamicMods = cutreeDynamic(dendro = geneTree, distM = dissTOM,deepSplit = 2, pamRespectsDendro = FALSE,minClusterSize = minModuleSize);


▪ Alocação dos módulos de coexpressão gênica e o número de genes

pertencentes a cada módulo

▪ Criação de um vetor de cores que representam os módulos de

genes coexpressos.

0 1 2 3 4 5

590 307 129 121 106 39

Azul Marrom Verde Cinza Turquesa Amarelo

129 121 39 590 307 106

Visualização da rede de interação

Visualização da Rede de Eigengenes

▪ O corte dinâmico de árvore pode identificar os módulos cujos

perfis de expressão são bastante similares.

▪ É também interessante analisar a relação entre esses módulos.

▪ Utilização dos eigengenes como perfis representativos.

MEList = moduleEigengenes(dadosExpr, colors = dynamicColors)MEs = MEList$eigengenessignif(cor(MEs, use="p"), 2)MEdata = moduleEigengenes(datExpr, moduleColors, softPower =softPower)varExpl = t(MEList$varExplained)

Visualização da Rede de Eigengenes

Pontuação do PCA1 de cada módulo.

MEVerde 0,5186791096

MEAzul 0,3970414690

MEAmarelo 0,3775949185

MEMarrom 0,3710511885

METurquesa 0,2986502064

MECinza 0,1790059003

▪ PCA1: primeiro componente principal.


▪ http://doism-network.dasilva.xyz/#/

http://doism-network.dasilva.xyz/#/

Identificação dos Membros dos Módulos

▪ A conectividade intramodular baseada no módulo eigengene pode

ser definida como a correlação do gene dentro do módulo

eigengene que ele faz parte.

▪ Para cada módulo nós definimos uma medida quantitativa dos

module membership (membros dos módulos – MM), para medir a

correlação do módulo eigengene e o perfil de expressão gênica.

▪ Isso permite a quantificação da similaridade de todos os genes do

microarray a todos os módulos. Os hub genes seriam, portanto,

aqueles genes altamente conectados e possuem altos valores de

module membership em seu módulo.

Identificação dos Membros dos Módulos# Gene Conectividade Módulo

01 ATP1A2 0,84868949 Turquesa

02 RCAN2 0,84580071 Turquesa

03 SORBS1 0,83849012 Turquesa

04 AKAP6 0,83765917 Turquesa

# Gene Conectividade Módulo

01 TIMP1 0,87824053 Azul

02 FN1 0,87228181 Azul

03 TGFBI 0,86790049 Azul

04 SERPINE1 0,86364934 Azul


01 ALDOB 0,94756071 Amarelo

02 CUBN 0,94659234 Amarelo

03 PLG 0,92073756 Amarelo

04 ANGPTL3 0,91910282 Amarelo


01 PTPRC 0,95029690 Marrom

02 ITGB2 0,90189204 Marrom

03 PRKCB 0,87288518 Marrom

04 PSTPIP1 0,86282818 Marrom


01 APOA2 0,95865251 Verde

02 IGFBP1 0,94510007 Verde

03 FGG 0,93657334 Verde

04 FGA 0,92784630 Verde

Anotação Funcional e Ontologia Gênica

▪ Para facilitar a interpretação biológica entre os módulos, procurou-

se investigar a ontologia gênica dos genes nos módulos, para saber

se eles são significativamente enriquecidos em alguma categoria

funcional.

▪ GO.db, AnnotationDBI e um pacote de anotação específica para

seres humanos – org.Hs.eg.db, versão 3.1

GOenr = GOenrichmentAnalysis(moduleColors, allLLIDs,organism = "human", nBestP = 30);

Anotação Funcional e Ontologia GênicaMódulo enrichmentP ID TO Descrição

Azul 1 3,62 x 10-5 GO:0031012 CC extracellular matrix

Azul 2 7,29 x 10-5 GO:0010955 BP negative regulation of protein processing

Azul 3 0,000117772 GO:0005578 CC proteinaceous extracellular matrix

Marrom 1 5,44 x 10-13 GO:0006955 BP immune response

Marrom 2 6,64 x 10-11 GO:0045087 BP innate immune response

Marrom 3 1,58 x 10-10 GO:0050776 BP regulation of immune response

Verde 1 2,18 x 10-7 GO:0065005 BP protein-lipid complex assembly

Verde 2 4,46 x 10-6 GO:0034361 CC very-low-density lipoprotein particle

Verde 3 5,38 x 10-6 GO:0072562 CC blood microparticle

Turquesa 1 2,87 x 10-5 GO:0015980 BP energy derivation by oxidation of organic compounds

Turquesa 2 4,48 x 10-5 GO:0030315 CC T-tubule

Turquesa 3 7,92 x 10-5 GO:0005759 CC mitochondrial matrix

Amarelo 1 5,27 x 10-5 GO:0070062 CC extracellular vesicular exosome

Amarelo 2 0,000204155 GO:0031982 CC Vesicle

Amarelo 3 0,000219234 GO:0031988 CC membrane-bounded vesicle

enrichmentP: valor de P para cada termo em cada módulo

ID: identificador do termo da ontologia

Anotação Funcional e Ontologia Gênica da Etiologia Combinada DOISm

GO-ID p-value x N Descrição

GO:0032101 9,23 x 10-16 16 191 Regulação da resposta a estímulo externo

GO:0048583 3,90 x 10-15 22 524 Regulação da resposta a estímulo

GO:0009611 7,54 x 10-15 22 541 Resposta a lesão

GO:0042221 4,63 x 10-14 32 1464 Resposta a estímulo químico

GO:0023033 1,37 x 10-13 37 2099 Via de sinalização

GO:0010033 1,92 x 10-13 25 869 Resposta a substrato orgânico

GO:0048518 6,75 x 10-13 37 2208 Regulação positive de processo biológico

GO:0006950 1,45 x 10-12 33 1772 Resposta ao estresse

GO:0080134 2,75 x 10-12 16 319 Regulação da resposta ao estresse

GO:0007166 3,50 x 10-12 28 1279 Via de sinalização ligada ao receptor da superfície celular

x: número de genes DOISm associados diferencialmente coexpressos pertencente à ontologia

N: número total de genes pertencentes à ontologia

Conectividade dos genes DOISm associados relacionados com a resposta a lesão e cicatrização

Gene Módulo Gene ID DMT2 SM INFLAM OBESIDADE Conectividade

FN1 AZUL 2335 X X X 114

SERPINE1 AZUL 5054 X X X X 72

CD36 TURQUESA 948 X X X 41

IGFBP1 VERDE 3484 X X X 30

CCR2 MARROM 729230 X X X 29

IL6R AZUL 3570 X X X X 29

APOA2 VERDE 336 X X X X 26

C1QB MARROM 713 X X X 26

CX3CR1 VERDE 1524 X X X 18

TF VERDE 7018 X X X 18

CD14 TURQUESA 929 X X X 13

APOE AMARELO 348 X X X 11

NOD1 TURQUESA 10392 X X X 11

Interação entre as comorbidades relacionadas com a etiologia combinada DOISm e os hub genes

[email protected]

https://diogojrnutrigenomica.wordpress.com

Obrigado!

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