ESTUDO DO ENVELHECIMENTO DE ESTUDO DO ENVELHECIMENTO DE AGLUTINANTES EM TÊMPERAS AGLUTINANTES EM TÊMPERAS

PROTEICAS POR CROMATOGRAFIA PROTEICAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ELEVADA EFICIÊNCIALÍQUIDA DE ELEVADA EFICIÊNCIA

DiuliDiuli

TacianeTaciane

RosangelaRosangela

Pelotas, janeiro de 2014Pelotas, janeiro de 2014

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASUNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS HUMANASINSTITUTO DE CIÊNCIAS HUMANAS

CURSO DE CONSERVAÇÃO E RESTAURO DE BENS CULTURAIS CURSO DE CONSERVAÇÃO E RESTAURO DE BENS CULTURAIS MÓVEISMÓVEIS

Pintura à têmpera

O termo têmpera é usado para é usado para definir um meio de pintura que consiste numa mistura de pigmento e aglutinante.

Conhecer a composição química dos materiais

que constituem uma pintura permite aos

profissionais da área:

• Dar indicações sobre a proveniência dos

objetos

• Auxiliar o estudo da técnica do artista

•Aprimorar a conservação/restauração

Na preparação das tintas são usados muitas vezes aglutinantes proteicos, numa técnica conhecida por têmpera.A identificação dos aglutinantes proteicos como a têmpera de ovo, cola ou gelatina e caseína, aplicadas em camadas ou como misturas, pode, revelar a intenção do artista, facultando a compreensão de sua técnica ou proporcionar o entendimento do porquê às superfícies são afetadas diferentemente ao longo do tempo.

Para a identificação do tipo de aglutinante usado existem técnicas de coloração e métodos espectroscópicos que permitem a identificação de proteínas, mas são específicas para cada tipo de proteína. Assim, as técnicas adequadas para identificação de têmperas proteicas são as técnicas cromatrográficas, como cromatografia gasosa (GC) ou líquida de elevada eficiência (HPLC)

No laboratório de Conservação e Restauro José de Figueiredo foi implementada para o estudo em questão a metodologia PICO-TAC e Cromatografia Líquida de Elevada Eficiência (HPLC).

TÊMPERA: O termo têmpera é usado para definir um meio de pintura que consiste numa mistura de pigmento e aglutinante, onde este mantém as partículas de pigmento em suspensão numa tinta.

AGLUTINANTES PROTEICOS: Os aglutinantes são substâncias capazes de:• Cobrir cada partícula de pigmento e mantê-la em suspensão; • Aderir a camada de tinta ao substrato; • Conceder propriedades ópticas que intensificam a cor natural ;• Proteger as partículas de pigmentos de eventuais danos ambientais.

PROTEÍNAS: são polímeros de aminoácidos, unidos por ligações peptídicas. Os aminoácidos são formados por cadeias carbonadas com uma função ácido carboxílico unida a uma função amina, conforme esquema abaixo:

COLA ANIMAL: a cola animal, provavelmente o aglutinante mais utilizado historicamente, tem sido usada como aglutinante da pintura a têmpera e como adesivo e consolidante, sozinha ou misturada com amidos.

GELATINA: é muito semelhante à cola, porém um material mais puro, pois sua fabricação sofre condições de processamento e controle mais rigoroso que as colas .

GEMA DE OVO: o termo têmpera é um termo geral para tintas à base de água, mas normalmente refere-se a tintas cujo aglutinante é a gema de ovo (têmpera de ovo)

CASEÍNA: refere-se a um grupo de várias proteínas que se encontram no leite, 80% das quais são realmente caseína.

PIGMENTOS: são substâncias orgânicas ou inorgânicas, de origem natural ou artificial, insolúveis no aglutinante, com o qual formam a tinta.

O principal objetivo deste estudo era analisar a influência dos pigmentos nos aglutinantes proteicos. Sendo assim,foram escolhidos 12 pigmentos naturais no Laboratório de Conservação e Restauro José Figueiredo

ENVELHECIMENTO ACELERADO x NATURAL

O objetivo principal nas ações de conservação e restauro é preservar as características originais da obra e para isso é necessário o conhecimento detalhado da degradação física e química dos materiais.A degradação dos materiais pode ser causada por agentes intrínsecos, extrínsecos, impostos e antropológicos.O envelhecimento natural é um processo muito lento que, no caso de obras de arte, pode levar centenas de anos, sendo impossível de estudar um tempo de vida útil.

OS FATORES QUE PODEM INFLUENCIAR A OCORRÊNCIA DE ALTERAÇÕES NA ESTRUTURA DAS PROTEÍNAS SÃO:

Processo de secagem- durante o processo de secagem a proteína perde água continuamente até atingir um equilíbrio de umidade, rearranjando a sua estrutura, podendo desnaturar total ou parcialmente.

Oxidação Induzida pela radiação- os aglutinantes aplicados numa obra de arte estão sujeitos à oxidação induzida pela luz visível e ultravioleta e este mecanismo de oxidação envolve a formação de radicais livres.

Reações entre proteínas e os outros componentes da mistura de têmpera- as proteínas, numa têmpera, podem reagir com outros componentes da mistura como lipídios ou hidratos de carbono.

Efeitos deteriorantes dos agentes químicos - agentes químicos como solventes e ácidos podem também acelerar a degradação das proteínas.

* Em algumas condições de umidade, as proteínas são vulneráveis ao ataque de microorganismos que utilizam os aminoácidos ou outros constituintes da tinta.

Caracterização de aglutinantes proteicos em obras de arte

A identificação de constituintes orgânicos em pintura, particularmente aglutinantes proteicos, continua a ser um desafio para os químicos pelos seguintes motivos:

❏são normalmente materiais complexos;❏com o envelhecimento;❏várias substâncias orgânicas naturais ou sintéticas; ❏podem estar presentes também compostos de degradação, formados durante o envelhecimento, tratamentos de restauro ou poluição;❏nas amostras heterogêneas de pinturas.

Cromaticidade

A cor de uma superfície é resultado da reflexão seletiva da luz por partículas de pigmentos na superfície, sendo a cromaticidade uma medida da qualidade colorimética.

A Colorimetria é a ciência e a tecnologia usada para quantificar e descrever fisicamente a percepção humana da cor.

O método mais completo de medir a cor é a reflexão da superfície como função do comprimento de onda, é com o auxilio de um espectofotómetro.

O espectrofotómetro usado para determinar a cor de um objeto é um instrumento constituído por três partes principais: fonte de luz, sistema monocromador, e detector e medidor. A fonte de luz para comprimentos de onda da região do visível é, normalmente, uma lâmpada de tungsténio ou halogénio tungsténio, ou uma lâmpada flash-tube de xénon.

A medição efetuada por um espectrofotómetro de absorção é a razão entre a luz refletida, ou transmitida, pela amostra e a refletida, ou transmitida, por um padrão de referência.

Cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC)

A cromatografia engloba um conjunto de métodos cujo objetivo é separar componentes de uma mistura, distribuindo-os em duas fases (estacionária e móvel).

A separação é conseguida se os componentes de uma amostra apresentarem diferentes coeficientes de distribuição, o que se traduz em diferenças na velocidade de arrastamento ao longo da fase estacionária.

A cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC) apresenta uma resolução elevada relativamente à cromatografia tradicional pelo fato de utilizarem partículas de dimensão reduzida. Como este tipo de fase estacionária oferece grande resistência à passagem da fase móvel, é necessário aplicar pressão elevada para que o eluente passe na coluna com um caudal razoável. Quando a coluna utilizada é menos polar que os eluentes denomina-se HPLC por fase reversa (RP-HPLC).

O cromatograma permite a análise qualitativa e quantitativa dos solutos, sendo que na primeira se determinam os tempos de retenção (tR), e na segunda as áreas dos picos.

O esquema do cromatógrafo para HPLC é constituído por um sistema de bombas ligado a um reservatório de fase móvel, um injetor de amostra, uma coluna e, finalmente, um detector e um registador.

Esquema de um sistema básico de HPLC.

Análise de aminoácidos pelo método Pico-Tag®

A análise de aminoácidos refere-se à metodologia usada para determinar a composição em aminoácidos ou o conteúdo de proteínas ou péptidos, e pode ser usada para:

quantificar proteínas e péptidos; identificar proteínas ou péptidos com base na sua composição em

aminoácidos; suportar a análise estrutural de proteínas e péptidos; avaliar estratégias de fragmentação para o mapping dos péptidos; detectar aminoácidos atípicos que possam estar presentes numa

proteína oupéptido.

Com este método é possível analisar a quantidade relativa de cada aminoácido e obter os vários tipos de aglutinantes proteicos. Os resultados obtidos com este método, para os várias tipos de têmperas (gelatina ou cola animal, caseína e gema de ovo)

Cromatograma obtido por HPLC de 40 ml de padrão de aminoácidos (2,4 mmol/ml de cada aminoácido) antes da hidrólise. A composição de amostras desconhecidas é posteriormente comparada com amostras conhecidas.

Diferenças na quantidade relativa dos aminoácidos para as proteínas dos diversos aglutinantes proteicos (Quantidades relativas de aminoácidos obtidas pelo método Pico-Tag®+HPLC)

Aglutinantes Ovo Gelatina e Cola Caseína

Proteína Albumina Colagénio Caseína

Quantidaderelativa dosaminoácidos

- 2:1 serina: glicina- 2:1 alanina:prolina- 1:1 ác.glutâmico:ác. aspártico- grandes quantidades de ác. glutâmico e ác. spártico, valina, leucina, isoleucina e fenilalanina- baixa quantidade de glicina e prolina

- Presença de hidroxiprolina- > 30% de glicina- >10% de prolina- 3:1glicina:hidroxiprolina- 1:8 serina:glicina- 1:1 alanina:prolina- baixa quantidade de valina, fenilalanina e leucina

- 3:1 ác. glutâmico:ác.aspártico- grandes quantidades de ácido glutâmico, prolina, leucina e lisina

Esquema básico de identificação de aglutinantes proteicos.

Este método não é, no entanto, sempre fácil de aplicar, principalmente na distinção entre caseína e ovo. Implantou-se estão outro esquema para identificação de proteínas. Este novo esquema incorpora tabelas de concentração (composição, em aminoácidos, de cada proteína) publicadas e matrizes de correlação.

Com esta ferramenta é possível correlacionar valores padrão e experimentais de têmperas proteicas e avaliar o seu grau de correlação: quanto mais próximo de 1 é a correlação entre os valoresexperimentais e os valores padrão para uma determinada proteína, maior a probabilidade de ambasserem o mesmo tipo de proteína.

Parte experimental

❏ Preparo de filmes e têmperas com diferentes aglutinantes.(Secos)

❏ Pico-Tag®; ❏ Preparo de proteínas teste de vários tipos

de envelhecimento;❏ Estudo da possibilidade de utilização do

EDTA como inibidor da influencia dos pigmentos nas têmperas.

Preparo de filmes de têmperas com vários

aglutinantes

•Elaboração de filmeso Tintaso Preparações

Foram depositados em placa de acrílico com pincel.

35 filmes 4 aglutinantes: gema de ovo, têmpera de gema de ovo, têmpera de

gelatina e têmpera de caseína; 2 preparações: têmpera de cola com gesso e cré. 12 tintas de têmpera de gema de ovo: Têmpera de gema de ovo com os

pigmentos branco de chumbo, bindheimite, hematite, ouropigmento, goetite, realgar, vermelhão, azurite, ultramarino, malaquite, terra verde e crisocola;

12 tintas de têmpera de gelatina: Têmpera de gelatina com os pigmentos branco de chumbo, bindheimite, hematite, ouropigmento, goetite, realgar, vermelhão, azurite, ultramarino, malaquite, terra verde e crisocola;

5 filmes de tintas de têmpera de caseína: Têmpera de caseína com os pigmentos azurite, ultramarino, malaquite, terra verde e crisocola. Na têmpera de caseína só se usaram os pigmentos azuis e verdes porque são os mais usados neste tipo de aglutinante, em pintura mural.

Foram feitos 4 filmes de cada tinta ou preparação, para os vários tipos de envelhecimento. Deixou-se estes filmes secarem durante 22 dias no escuro antes de serem sujeitos aos diversos tipos de envelhecimento.

Implementação da técnica Pico-Tag têmperas proteicas +HPLC para identificação de têmperas proteicas

• As amostras são hidrolisadas em ácido e derivatizadas com fenilisotiocianato (PITC).

• A hidrólise dos aminoácidos leva a que os grupos amino fiquem menos reativos ao PITC.

• Antes da derivatização, é necessário secar as amostras após adição da solução de secagem, seguido de vácuo para remover o líquido.

• Resultando em aminas desprotonadas que reagem rapidamente com o PITC da solução.

Reagentes•Foram usados os seguintes padrões:

o Solução de padrões de aminoácidos H da Pierce17

o coleção de 24 padrões de aminoácidos para cromatografia de papel e camada fina da BDH

o Aminoácidos para fins comparativos cromatográficos da Merck.

Aparelhos

Cromatógrafo 600E da Waters (módulos Controlador 600E, Bombas 600E, desgaseificador In-Line Degasser da Waters e Injector de amostras 717 plus Autosampler).

Cromatógrafo Alliance 2795 da Waters e forno de coluna da Waters.

Procedimentos experimentais•Soluções•Hidrólise•Secagem•Derivatização•Análise do HPLC•Apresentação dos resultados

Envelhecimento acelerado de filmes e têmperas proteicas

• Temperatura ambiente• Câmara UV-Visível• Câmara climática• Câmaras UV-Visível e temperatura umidade

Câmara UV visível

Câmara temperatura e

umidade

Utilização do EDTA

Utilização da Técnica Pico-Tag + Cromatografia líquida de elevada eficiência (HPLC) para identificação de têmperas

Inicialmente foi efetuada a análise de têmperas proteicas puras, não envelhecidas artificialmente, onde foi obtido os seguintes resultados :

5.Apresentação e Discussão dos Resultados

É possível verificar que o aminoácido hidroxiprolina só aparece na têmpera de gelatina, tornando fácil e rápida a identificação de tintas à base de gelatina ou preparações à base de cola (assinalado na Figura 14 b) . A distinção entre têmperas à base de ovo ou caseína não é tão rápida, mas é possível com ferramentas como o coeficiente de correlação. Assim, começou-se a correlação entre estas amostras (cuja composição foi determinada no LCR) e amostras cuja composição se encontra publicada (Anexo 1), obtendo-se os resultados apresentados na Tabela 5.

Como seria de esperar, a correlação de dados é maior quando se verifica o mesmo tipo de têmpera (áreas sombreadas na tabela anterior). A correlação para as têmperas à base de cola é excelente, (r>0,97); no entanto a correlação para as têmperas à base de gema de ovo e caseína, apesar de ser razoável, não é tão boa. Isto deve-se, provavelmente, ao fato da resolução de alguns picos, nomeadamente Arg, Thr, Ala e Pro não ser muito boa, o que perturba a determinação da quantidade relativa dos aminoácidos e, consequentemente, os valores do coeficiente de correlação.

O ideal seria utilizar este método em amostras reais, extraídas de pinturas. No entanto, a maioria das amostras que são extraídas de pinturas provêm de tons verde e azul, contendo pigmentos azurite e malaquite que contêm cobre. Este metal influencia a identificação dos aglutinantes proteicos pelo método implementado , pelo que se verificou não ser possível testar este método em amostras reais. No entanto, no LCR existe um conjunto de filmes, preparados em 1976, pela Eng. Isabel Ribeiro cuja composição é conhecida, e onde não existem pigmentos à base de cobre. Assim, decidiu-se testar o método Pico-tag +HPLC implementado neste conjunto de amostras. Os cromatogramas obtidos e a composição em aminoácidos podem ser consultados no Anexo 3. A correlação destes valores com os padrões pode ser analisada na Tabela 6.

Como é possível verificar pela análise dos dados anteriores, em todos os casos há uma correspondência entre a têmpera usada no filme e a identificada pelo método Pico-Tag +HPLC, independentemente dos padrões de têmperas escolhidos .Nota-se ainda que este método não permite a distinção entre têmperas de gema de ovo e têmperas de clara de ovo, visto a proteína detectada (albumina) ser a mesma em ambos os casos. Caso se pretenda diferenciar estes dois tipos de têmperas será necessário recorrer a outros métodos, chamados de identificação de ácidos graxos. Na gema de ovo verifica-se a presença de palmitato e estearato e a ausência de azelato enquanto que na clara de ovo não há ácidos graxos.

5.2 Estudo do envelhecimento de aglutinantes de têmperas proteicas

No decorrer dos diferentes tipos de envelhecimento, foi estudada avariação da cor e da composição em aminoácidos para os váriosfilmes:

envelhecimento das têmperas puras; envelhecimento das preparações de cré e gesso;envelhecimento das tintas;

Os cromatogramas obtidos na análise de aminoácidos pelo método Pico-Tag®+HPLC

Variação da quantidade relativa dos aminoácidos ao longo de cada tipo de envelhecimento para os filmes “Gema de ovo”

a) na câmara de UV-Visível;b) na câmara climática;c) nas câmaras UV-Visível e climática.

Nestes gráficos é possível verificar que não há uma variação homogênea em qualquer um dos aminoácidos, qualquer que seja o tipo de envelhecimento. No entanto, numa análise mais minuciosa verifica-se, uma diminuição progressiva da quantidade relativa de alguns aminoácidos

No caso dos filmes “têmpera de gema de ovo” verifica-se um comportamento parecido ao dos filmes “Gema de ovo” mas não tão acentuado, continuando a verificar-se uma ligeira diminuição na correlação entre os valores experimentais e padrão, principalmente nas primeiras horas após a utilização da câmara climática.

a)na câmara de UV-Visível;b) na câmara climática;c) nas câmaras UV-Visível e climática.

Têmpera gelatina

Indicam que esta têmpera é muito estável, visto estes valores serem praticamente constantes.

Têmpera Caseína

Indica que esta preparação é muito estável.

Preparação Cola + Gesso

Indica que esta preparação é muitoEstável.

Tintas

a)Tinta de branco de chumbo + têmpera de gema de ovo.b)Tinta de branco de chumbo + têmpera de gelatina c)Tinta de bindheimite + têmpera de gema de ovo.d)Tinta de bindheimite + têmpera de gelatina.e)Tinta de hematite + têmpera de gema de ovo.f)Tinta de ouropigmento + têmpera de gelatinag)Tinta de goetite + têmpera de gema de ovoh)Tinta de realgar + têmpera de gema de ovo

i) Tinta de realgar + têmpera de gelatina

j) Tinta de vermelhão + têmpera de gema de ovo.

k) Tinta de azurite + têmpera de gema de ovo.

l) Tinta de azurite + têmpera de gelatina.

m) Tinta de azurite + têmpera de caseína

n) Tinta de malaquite + têmpera de gema de ovo

o) Tinta de malaquite + têmpera de gelatina

p) Tinta de malaquite + têmpera de caseína

Pigmentos branco de chumbo e realgar e para estudar a sua influência no envelhecimento das

têmperas proteicas.

Tinta de tempera de gema de ovo + branco de chumbo

Conclui-se que o branco de chumbo dificulta a identificação de têmperas à base de gema de ovo.

Tinta de tempera de gema de ovo + Realgar

Ao longo do envelhecimento da têmpera de gema de ovo, na presença de realgar, verifica-se, no entanto, uma ligeira diminuição da quantidade de Ser, Lys, His e Arg.

5.3 Utilização do EDTA como inibidor de pigmentos sob têmpera proteica

• “Tinta de branco de chumbo + têmpera de gema de ovo”

• “Tinta de azurite + têmpera de gema de ovo”. • Foram adicionadas diversas quantidades de solução

de EDTA 0,2 M e em várias etapas do processo.

ConclusãoHouveram mudanças cromáticas nos testes de envelhecimento, tais como: esmaecimento da cor, amarelamento e escurecimento.Têmperas de cola e caseína parecem ser mais estáveis que as de gema de ovo sob condições de envelhecimento acelerado idênticas. As têmperas de gelatina e caseína não verifica-se alterações significativas comparando com as temperas à base de ovo que mostraram ligeiras alterações, porém não muito significativas. Alguns pigmentos, como o branco de chumbo, podem dificultar a identificação das têmperas, especialmente têmperas envelhecidas, pois o pigmento acelera a degradação de alguns aminoácidos.Em suma os resultados não foram satisfatórios devido as baixas variações cromáticas entre as têmperas e tintas durante os procedimentos pelo motivo que a têmpera a ovo foi a única a passar pela analise da câmara de UV-Visível, o restante passou só pela câmara climática.

RefêrenciaVARGAS, Helena V. Estudo do envelhecimento de aglutinantes em têmperas proteicas por cromatografia líquida de elevada eficiência. Dissertação. Instituto Superior Técnico, Universidade Técnica de Lisboa. 2008