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Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do IV Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
23 e 24 de setembro de 2014
ESTUDO DA BIODISTRIBUIÇÃO DO RESVERATROL E DO
LICOPENO EM RATOS: INTERFERÊNCIAS RELACIONADAS À
LESÃO HEPATICA POR PARACETAMOL
Matheus Arnosti Landi Pontifícia Universidade Católica de Campinas
Centro de Ciências da Vida [email protected]
Gisele Mara Silva Gonçalves Obtenção e aplicação de insumos de origem vegetal e animal em alimentos, fitoterápicos e
cosméticos Centro de Ciências da Vida
Resumo: o fígado é o maior e mais pesado órgão
interno e possui funções endócrinas e exócrinas, sendo
o hepatócito a célula responsável por estas funções,
além de converter substâncias nocivas em materiais
não-tóxicos que serão excretados. A hepatite tóxica é a
lesão hepática causada por inalação, ingestão ou
administração parentérica de agentes farmacológicos
ou químicos. O Paracetamol é facilmente destoxificado
pela fase II do sistema de metabilização hepática de
drogas, porém, em doses elevadas, provoca produção
maciça de um metabólito altamente lesivo aos
hepatócitos. Utilizando o paracetamol como modelo
experimental de lesão hepática, o objetivo do presente
projeto foi determinar a biodistribuição do licopeno e do
resveratrol nos principais tecidos orgânicos de ratos
com elevada dosagem de paracetamol. O licopeno e o
resveratrol são compostos de origem vegetal com
propriedades antioxidantes que apresentam indicação
terapêutica em distúrbios hepáticos. Para realização do
experimento foram utilizados 40 animais, subdivididos
em 08 grupos (tratados e não tratados), sendo que os
animas dos grupos “tratados” serão submetidos à pré-
tratamento de 8 dias com as substâncias ativas e no 8°
dia sofrerão intoxicação com elevada dose de
paracetamol. Após 24 h e 72 h, serão eutanasiados
para coleta de amostras de sangue e tecidos. Para
análise da biodistribuição, os órgãos/fluido coletados
(soro, fígado, rins, pulmão e coração) serão macerados
e o resveratrol e o licopeno serão quantificados por
Cromatografia Líquida de Alta Performance (CLAE) e
Espectrofotômetro de UV visível. Como base nos
resultados obtidos, pode-se concluir que o resveratrol
se apresentou em quantidades mais elevadas no
fígado do que em outros órgãos/fluido. Esse padrão de
distribuição se justifica pela fisiologia destes
órgãos/fluido e o paracetamol provocou redução
significativa na concentração de resveratrol no tecido
hepático, indicando que a atividade antioxidante deste
está relacionada à sua ação hepatoprotetora.
Palavras-chave: paracetamol, licopeno, resveratrol.
Área de conhecimento: farmácia
1. INTRODUÇÃO
Define-se hepatite tóxica como a lesão
hepática causada por inalação, ingestão ou
administração parentérica de agentes farmacológicos
ou químicos [12].
Para a lesão celular metabólica dos
hepatócitos vários são os mecanismos de agressão:
ligação covalente a estruturas celulares, peroxidação
lipídica, reações de oxidação, depleção de glutationa,
sendo que estas agressões celulares podem resultar
alterações mitocondriais, alterações no citoesqueleto
celular ou alterações da homeostase iônica. Como
continuidade do processo, os hepatócitos lesados
podem liberar produtos de peroxidação lipídica,
intermediários reativos de oxigênio e IL 8, ativando por
estes meios as células de Kupffer. Estas liberam
diversas citocinas tais como TNF, IL 1, IL 8 e
incremento na quantidade de intermediários reativos de
oxigênio, que podem lesar diretamente os hepatócitos
[2].
O Paracetamol é facilmente destoxificado pela
fase II do sistema de metabolização hepática de drogas
mediado por glucuronidação e sulfatação, com uma
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pequena porção passando pelo Citocromo P-450, e
sofrendo N-hidroxilação com fomação do intermediário
toxico, a N-acetil-p-benzoquinonaimina (NAPQI), que
inicialmente é conjugado à glutationa e é excretado. Na
administração de doses tóxicas de paracetamol, as vias
de glicuronização e sulfatação se saturam e a via do
citocromo P-450 adquire importância para a
biotransformação da droga, ocasionando com isso uma
maior formação da NAPQI [6].
O licopeno atualmente é tido como um dos
mais potentes antioxidantes, protetor da camada
celular; devido à reação com os radicais peróxidos e
com o oxigênio molecular [14; 17]. O licopeno é tido
como o carotenóide que possui a maior capacidade
sequestrante de radicais livres de oxigênio
possivelmente devido à presença das duas ligações
duplas não conjugadas, o que lhe oferece maior
reatividade [11].
O resveratrol (3,5,4 trihidroxiestilbeno) é um
polifenol natural encontrado em mais de 70 espécies de
plantas. Desde a observação original de que o
resveratrol prolonga a vida de organismos inferiores,
simulando os efeitos antienvelhecimento da restrição
calórica [21]. É neutralizador de radicais livres e um
potente antioxidante devido à sua capacidade de
promover as atividades de uma variedade de enzimas
antioxidantes [5]. Apresenta três mecanismos
antioxidantes diferentes: (a) mecanismos de
competição com coenzima Q para diminuir o complexo
da cadeia oxidativa, local de produção de espécies
reativas de oxigênio, (ii) neutralização de adicais O2-
formados nas mitocôndrias e (iii) inibição da
peroxidação lipídica induzida por produtos da reação
de Fenton [22].
2. OBJETIVOS
O objetivo do presente trabalho foi verificar a
biodistribuição do licopeno e do resveratrol nos
principais órgãos para se conhecer melhor a
farmacocinética e avaliar a interferência da into-
xicação por paracetamol na biodistribuição destas.
3. METODOLOGIA
Foram utilizados 40 ratos albinos, machos, da linhagem Wistar, não isogênicos com 60 dias de idade
fornecidos pelo Biotério do Campus II da PUC Campinas. Em todo o período do experimento os animais não foram submetidos a condições de estresse ou qualquer tipo de sofrimento. Não houve restrição de água ou alimento. Foram observados e cumpridos os "Princípios éticos para uso de animais de laboratório" da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório.
O experimento foi conduzido dividindo-se os animais em 2 grupos, licopeno e resveratrol, e 08 subgrupos com 5 animais cada, onde foram escolhidos de forma aleatória, e em seguida pesados para calculo de volume de paracetamol, licopeno e resveratrol administrado.O grupo Licopeno foi dividido em: Licopeno 24 e 72h; Licopeno + paracetamol 24 e 72h. Onde o grupo licopeno recebia durante 8 dias suspensão de licopeno uma vez ao dia na dose de 4 mg/Kg v.o sendo eutanasiados após 24 e 72 h da ultima administração. Já o outro subgrupo após a ultima administração, recebia uma dose toxica de paracetamol de 3 mg/Kg v.o e era eutanasiado após 24 e 72h.
O grupo Resveratrol foi dividido em: Resveratrol 24 e 72h; Resveratrol + paracetamol 24 e 72h. Onde o grupo resveratrol recebia durante 8 dias suspensão de resveratrol uma vez ao dia na dose de 10 mg/Kg v.o sendo eutanasiados após 24 e 72 h da ultima administração. Já o outro subgrupo após a ultima administração, recebia uma dose toxica de paracetamol de 3 mg/Kg v.o e era eutanasiado após 24 e 72h.
3.1 Eutanásia dos animais e coleta do material biológico
Para eutanásia os animais cereberam uma associação de ketamina e xilaziina em dose letal. Em seguida foi realizada uma incisão do abdômen ao tórax do animal expondo seus órgãos internos, podendo assim retirar por meio de uma punção do coração sangue, para obtenção do soro. Em seguida foi coletado fragmentos de fígado, pulmão, rim e coração e pesados.
3.2 Extração do princio ativo do tecido/fluido
Para quantificação foi posto em contato o tecido/fluido com solvente especifico para cada composto, sobre maceração e centrifugação. Para o resveratrol foi utilizado álcool etílico absoluto e para o licopeno éter de petróleo.
3.3 Padronização das amostras
Todas amostras após o processo de extração foram postas em uma câmara de vidro contendo sílica,
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e aquecida em banho-maria a 50oC e com aplicação de vácuo, por período suficiente para secar as amostras. Todas as amostras foram ressuspendidas no momento da analise com 500 µL do solvente e filtradas em membrana-filtro de 45 µm.
3.4 Análise das amostras
Para analise das concentrações de resveratrol
foi utilizado um cromatógrafo liquido de alta eficiência
(HPLC/CLAE), e para o licopeno um espectrofotômetro
de UV visível. Nos dois casos foi realizada uma curva
de calibração como podemos observar na figura 1 para
o resveratrol (concentração de 2, 6, 10 e 20 ppm) e na
figura 2 para o licopeno (concentrações de 10, 30, 50 e
100 ppm).
Figura 1:Curva de calibração de resveratrol para HPLC/CLAE
Figura 2: Curva de calibração de licopeno para espectrofotômetro (comprimento de onda 470 nm)
4. RESULTADOS
4.1 Resveratrol
A tabela 01 exibe os dados utilizados para o
cálculo do resveratrol sendo que a concentração
detectada em cada amostra foi utilizada para definir a
concentração em ppm de resveratrol por grama de
tecido/fluido. Os dados foram compilados, e após
analise estatística, foram representadas graficamente
na figura 03.
Tabela 1: dados referentes ao peso do tecido/fluido (g), concentração de resveratrol (mg/mL) encontrada por tecido/fluido, seguida da relação massa de resveratrol/peso (ppm/g). F: fígado; R: rim; P: pulmão; C: coração; S: soro.
Peso (g)
Conc (mg/mL)
ppm/g Peso (g)
Conc (mg/mL)
ppm/g
CR24 CR24 CRP24 CRP24
F 0.413 0.0011 2.663438 0.403 0.0006 1.488834
0.463 0.0008 1.727862 0.44 0.0006 1.363636
0.444 0.0007 1.576577 0.425 0.0017 4
0.449 0.0006 1.336303 0.412 0.0005 1.213592
0.437 0.0007 1.601831 0.45 0.0007 1.555556
R 0.423 0.0002 0.472813 0.463 0.0002 0.431965
0.408 0.0001 0.245098 0.452 0.0009 1.99115
0.413 0.0003 0.726392 0.449 0.0001 0.222717
0.438 0.0005 1.141553 0.425 0 0
0.438 0.0006 1.369863 0.42 0.0003 0.714286
P 0.41 0.0004 0.97561 0.392 0 0
0.407 0.0002 0.4914 0.405 0.0006 1.481481
0.42 0.0001 0.238095 0.446 0.0004 0.896861
0.406 0.0001 0.246305 0.419 0.0002 0.477327
0.439 0.0002 0.455581 0.421 0 0
C 0.4638 0.0002 0.43122 0.423 0.0003 0.70922
0.443 0.0001 0.225734 0.447 0 0
0.412 0.0001 0.242718 0.466 0 0
0.43 0 0 0.466 0 0
0.46 0 0 0.413 0 0
S 0.5 0.0001 0.2 0.5 0 0
0.5 0 0 0.5 0 0
0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2
0.5 0 0 0.5 0 0
0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2
CR72 CR72 ppm/g CRP72 CRP72 ppm/g
F 0.422 0.0011 2.606635 0.463 0.0004 0.863931
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0.419 0.0012 2.863962 0.38 0.0007 1.842105
0.451 0.0026 5.764967 0.483 0 0
0.439 0.0008 1.822323 0.431 0.0009 2.088167
0.442 0.001 2.262443 0.431 0.0006 1.392111
R 0.466 0.0005 1.072961 0.436 0.0002 0.458716
0.467 0.0001 0.214133 0.42 0.0003 0.714286
0.466 0.0003 0.643777 0.393 0.0003 0.763359
0.421 0.0002 0.475059 0.379 0.0001 0.263852
0.422 0.0002 0.473934 0.453 0 0
P 0.455 0 0 0.403 0.0001 0.248139
0.422 0.0003 0.7109 0.454 0.0002 0.440529
0.459 0.0007 1.525054 0.453 0 0
0.481 0.0003 0.623701 0.402 0 0
0.487 0.0002 0.410678 0.475 0.001 2.105263
C 0.466 0 0 0.462 0.0002 0.4329
0.417 0.0002 0.479616 0.401 0.0002 0.498753
0.464 0 0 0.475 0 0
0.456 0.0002 0.438596 0.391 0 0
0.432 0 0 0.461 0.0001 0.21692
S 0.5 0.0001 0.2 0.5 0 0
0.5 0 0 0.5 0 0
0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2
0.5 0 0 0.5 0 0
0.5 0 0 0.5 0.0001 0.2
Figure 3: Biodistribuição do resveratrol. Observar existência de diferença significativa (*p<0.05, pós-teste de Tukey) em relação ao grupo CR72.
4.2 Licopeno
No presente estudo a analise do licopeno ficou comprometida por diversos fatores relacionados a capacidade de quantificação desse. Na preparação da curva de calibração do licopeno em HPLC, a coluna de separação ficou saturada pelo licopeno, pois as características do filme cromatográfico da coluna se mostraram apolares, tendo então uma forte ligação com o licopeno, e apresentando um tempo de retenção inviável e impreciso para separação. Embora em outros estudos com licopeno, como feito por Nunes e Mercadante, 2004 foram utilizados uma coluna cromatográfica com característica parecida, mas outros fatores como concentração e fase móvel devem ser levados em conta; pois o detector disponível para analise nesse estudo era um detector de UV-vis, ou seja, leitura por absorbância, já nos estudos citados o detector utilizado era de arranjo de diodos, logo, com uma sensibilidade maior, necessitando de concentrações menores para calibração. Em uma tentativa de quantificação em espectrofotômetro de UV visível, como visto na figura 2, uma curva de calibração foi realizada no limite de quantificação do espectrofotômetro. Quando analisados as amostras, pode ser visto apenas ruídos de absorbância, e em alguns casos a detecção do licopeno pode ser vista, mas como estava abaixo da curva, a quantificação seria imprecisa e pouco relevante, pois não haveria dados posteriores para comparação.
5. DISCUSSÃO
Após a realização os cálculos de concentração
(ppm/g), e realização de analise estatística, foi possível
observar a diferença de concentrações nos tecidos
estudados (fígado, rim, pulmão, coração e soro) como
era esperado, porém havendo pouca diferença das
concentrações de resveratrol entre o grupo de 24h e de
72h. A diferença mais evidente ocorreu no fígado, onde
é possível verificar um aumento da concentração da
droga me 72 horas (CR72).
Poucos são os relatos encontrados na
literatura sobre a biodistribuiçao do resveratrol. Walle e
colaboradores (2004) observaram níveis plasmáticos
de trans-resveratrol e seus metabolitos de 491 ± 90
ng/ml após 1 hora de administração oral. A utilização
de radiomarcadores possibilitou o estudo da
biodistribuição após administração oral, sendo
detectado em maiores concentrações em órgãos
relacionados à absorção e eliminação, tais como
estomago, intestino, fígado e rins e em menores
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
CR24 CRP24 CR72 CRP72
Fígado
Rim
Pulmão
Coração
Soro
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quantidades, no colón, duodeno, pulmão, coração e
cérebro [19]. Isso pode ser justificado pelo
comportamento do resveratrol, pois, embora a
absorção deste seja elevada, sua biodisponibilidade
por via oral é muito baixa, haja vista sua rápida
metabolização no fígado [20; 1; 8; 4].
Isso corrobora com o presente estudo, pois
pode-se observar que o padrão de distribuição nos
órgãos dos ratos seguiram o mesmo padrão obtido por
Walle e colaboradores (2004), após administração oral
de 25 mg, o resveratrol se manteve em maior
concentração no tecido hepático comparando-se com
os outros órgãos estudados, todos esses com
concentrações significativamente inferiores à
encontradas no fígado nos períodos de 24 e 72 horas.
Rins exibiram concentrações decrescentes de
resveratrol, e em estudos com roedores, a diminuição
dos níveis de resveratrol nos rins e as baixas
concentrações encontradas no cólon indicaram que a
excreção é realizada preferencialmente por via urinaria
e em menores quantidades pela rota fecal [19], sendo
semelhante aos resultados encontrados por Walle e
colaboradores (2004), que observaram em humanos
maior excreção pela urina após administração oral ou
intravenosa de trans-resveratrol. Coração, pulmão, e
soro mostraram concentrações constantes com
diferenças insignificantes entre eles.
Como descrito anteriormente doses toxicas de
paracetamol, saturam a via de sulfatação e
glucorinazação hepática forçando a metabolização da
droga pelo complexo do Citocromo P-450 [6]. Com
base nesse mecanismo de hepatotoxicidade, na
conhecida ação antioxidante do resveratrol e nos
resultados da biodistribuição obtidos nesse trabalho, é
possível justificar a diminuição significativa de
resveratrol no fígado no grupo CRP72. Seguramente a
diminuição da concentração de resveratrol no fígado é
devido a sua capacidade de reagir com os produtos
formados na intoxicação aguda nos hepatócitos,
neutralizando-os e como consequência diminuir a
hepatoxicidade, sendo excretado logo em seguida.
Estudos da distribuição do licopeno após
administração via oral revelaram que as maiores
concentrações desse, se encontram no fígado, adrenal,
próstata e tecido adiposo. Isso se da após o licopeno
se acumular no fígado devido a sua entrada no
organismo através de quilomícrons , assim, interagindo
com as lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL)
e nas lipoproteínas de baixa densidade (LDL) são
jogado na corrente sanguínea, com isso os tecidos que
apresentarem receptores de LDL apresentarão maior
captação desses, além disso tecidos com propriedades
apolares, como o tecido adiposo leva a uma maior
retenção do carotenoide [9].
Ferreira e colaboradores (2000), obtiveram
resultados parecidos tratando furões e ratos com
suplemento de licopeno durantes 9 semanas e
analisando em HPLC as amostras, e foram
identificados nos animais concentrações grandes do
pigmento no fígado, intestino, estomago e próstata. Já
em Roth e colaboradores (1990) em dose única de
licopeno via oral em macacos e ratos pode se observar
maiores concentrações no fígado, intestino, colón e
baço. Estudo com cachorros machos, com tratamento
por 28 dias com suplemento de licopeno, como visto
por Koytko e colaboradores (2003), as maiores
concentrações do licopeno foram encontradas no
fígado, adrenal, baço, linfonodos e tecidos adiposo
abdominal.
6. CONCLUSÃO
Como base nos resultados obtidos até o
momento, pode-se concluir que o resveratrol se
apresentou em quantidades mais elevadas no fígado
do que em outros órgãos/fluido. Esse padrão de
distribuição se justifica pela fisiologia destes
órgãos/fluido e está de acordo com os poucos relatos
encontrados na literatura científica e o paracetamol
provocou redução significativa na concentração de
resveratrol no tecido hepático, indicando que a
atividade antioxidante deste está relacionada à sua
ação hepatoprotetora.
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