estudo comparativo dos efeitos do 17-β-estradiol, do ...ão de... · tripsinização ..... 35 5.2

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  • UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR Cincias da Sade

    Estudo comparativo dos efeitos do 17--estradiol,

    do extracto de soja e dos fitoestrognios que o

    integram em culturas de clulas humanas

    Ana Lusa Baptista Arquilino

    Dissertao para obteno do Grau de Mestre em

    Cincias Farmacuticas (Ciclo de estudos integrado)

    Orientador: Professora Doutora Luza Augusta Tereza Gil Breitenfeld Granadeiro

    Covilh, Outubro de 2011

  • ii

    Folha em branco

  • iii

    Agradecimentos

    Durante os ltimos meses, vrias foram as pessoas que me apoiaram na realizao desta

    dissertao de mestrado, e s quais no posso deixar de agradecer:

    Em primeiro lugar, Professora Doutora Luza Granadeiro, minha orientadora, pelo apoio

    que me proporcionou. O meu muito obrigado pela sua disponibilidade e partilha de

    conhecimentos;

    Ao Professor Doutor Miguel Freitas, pelo apoio, acompanhamento e dedicao;

    Ao Professor Doutor Samuel Silvestre e Dra. Cristina Ramalhinho. A ajuda e companhia no

    laboratrio so sempre bem recebidas;

    s colegas de laboratrio, Ana Rebelo, Ana Dias, Eduarda, Joana Marques, Mrcio e Vernica.

    O tempo convosco passou rapidamente, e as tarefas a realizar foram sempre mais fceis;

    Aos meus pais, avs e minha irm Margarida por todo o amor, confiana e apoio

    incondicional. O incentivo para melhorar a cada dia que passa, e a nunca desistir dos meus

    sonhos e objectivos, ser um lema que ficar guardado para toda a vida;

    Ao Joo, por todo o apoio, amizade, carinho, dedicao e disponibilidade, bem como todas as

    longas conversas e desabafos, que muito me ajudaram, principalmente nas horas menos boas;

    Agradeo Sofia e aos pais do Joo por todo o apoio e amizade;

    No poderei deixar de me referir, por fim, a todos os meus amigos e colegas, que nos ltimos

    meses me auxiliaram, e com quem convivi.

  • iv

    Folha em branco

  • v

    Resumo

    A soja tem vindo a adquirir uma posio de destaque no mercado ocidental, ao longo dos

    ltimos anos, com o aumento da procura por este produto vegetal. Os fitoestrognios so

    importantes constituintes da soja que se ligam a receptores de estrognio (ER), podendo

    exercer alguns efeitos benficos no Homem. A aco anticarcinognica, a diminuio de

    alguns sintomas associados menopausa, e a preveno da osteoporose e das doenas

    cardiovasculares so alguns dos resultados positivos j evidenciados. Os fitoestrognios mais

    estudados so as isoflavonas, onde se insere a genistena e a daidzena.

    Os estudos realizados pretenderam estudar qual o efeito de diferentes concentraes dos

    compostos estrognicos (extracto de soja, genistena, daidzena e 17--estradiol) em

    fibroblastos saudveis da derme humana- NHDF e clulas epiteliais com carcinoma

    mamrio-MCF7. Para alcanar este objectivo, optimizou-se o modelo de estudo,

    determinaram-se os efeitos na viabilidade celular aps incubao e recuperao (ensaio de

    MTT), e estudou-se a capacidade de induzir a apoptose (ensaios de citometria de fluxo).

    Dos vrios protocolos testados na optimizao do modelo de estudo, foi escolhido o protocolo

    que se baseou na aplicao de meio de cultura completo, e que usou tempos de incubao e

    recuperao de 48 horas. Observou-se uma variao na viabilidade celular dependente da

    concentrao aplicada, tendo as concentraes mais elevadas demonstrado uma diminuio

    estatisticamente significativa da mesma, para as linhas celulares NHDF e MCF7. Registou-se

    uma recuperao nas 2 linhas celulares, que foi superior nas MCF7. Os ensaios de citometria

    de fluxo indicaram que os compostos estudados poderiam exercer uma aco protectora sobre

    as clulas, no entanto, o nmero de ensaios realizados no foi suficiente para podermos tirar

    concluses. Por fim, foram comparadas diluies semelhantes de 1 cpsula de extracto de

    soja e de um comprimido de 17--estradiol, aconselhados na terapia hormonal de

    substituio. Concluiu-se que a recomendao da administrao do extracto de soja deve ser

    cuidadosamente avaliada, pois pode aumentar a proliferao celular em tecidos

    cancergenos.

    Palavras-chave

    Extracto de soja, 17--estradiol, daidzena, genistena, NHDF, MCF7, Terapia Hormonal de

    Substituio

  • vi

    Folha em branco

  • vii

    Abstract

    Over the past years, soy has gained a prominent position in the Western market, with the

    increasing demand and supply for this plant. Phytoestrogens are important constituents of

    soy. They bind to estrogen receptors (ER) and they are able to modify some physiological

    processes, with benefits for humans. The anticarcinogenic action, the reduction of some

    symptoms associated with menopause, and prevention of osteoporosis and cardiovascular

    diseases are some of the positive outcomes. The most studied phytoestrogens are isoflavones,

    which include genistein and daidzein.

    The studies conducted sought to investigate the effect of different concentrations of

    estrogenic compounds (a soy extract, genistein, daidzein and 17--estradiol) in human dermal

    fibroblasts from healthy subjects NHDF and epithelial breast carcinoma cells MCF7. To

    achieve the objectives, it was necessary to optimize the model of study, to determine de

    effects on cells viability: after incubation and after recovery (MTT assay), and to study the

    capacity of the induction of apoptosis (flow cytometry assays).

    We tested different protocols, in the process of optimization of the model of study. The

    chosen protocol was based on the application of complete culture medium, and incubation

    and cells recoverys time was 48 hours. We checked a variation in cells viability, that was

    concentration-dependent; the results for the highest concentration applied showed a

    statistically significant decrease in cells viability for the MCF7 and NHDF cell lines. Both cell

    lines recovered, but MCF-7 cells recovered more. The flow cytometry assays indicated that

    the compounds studied may exert a protective action on cells, however, the number of tests

    developed in our studies was not enough to draw conclusions. Finally, we compared a soybean

    extract (capsules) and 17--estradiol (tablets), used on hormone replacement therapy. We

    concluded that the recommendations about administering supplements or medicines based on

    soybean extracts must be carefully evaluated, as it may increase cell proliferation in cancer

    tissues.

    Keywords

    Soy extract, 17--estradiol, daidzein, genistein, NHDF, MCF7, Hormonal Replacement Therapy

  • viii

    Folha em branco

  • ix

    ndice

    Introduo ........................................................................................ 1

    1. O consumo de produtos naturais base de plantas ................................. 1

    2. Soja (Glycine max) ........................................................................ 3

    2.1. Caracterizao da soja ............................................................. 3

    2.2. Diferenas no tratamento da soja ................................................ 4

    2.3. Principais constituintes da semente de soja .................................... 4

    2.3.1. Macronutrientes ................................................................. 4

    2.3.2. Micronutrientes ................................................................. 5

    2.4. Efeitos da soja e suas aplicaes ................................................. 6

    3. Fitoestrognios ............................................................................. 9

    3.1. Os fitoestrognios como constituintes da semente de soja .................. 9

    3.2. Isoflavonas da soja ................................................................. 11

    3.2.1. Genistena ....................................................................... 11

    3.2.2. Daidzena ........................................................................ 13

    3.3. Metabolismo das isoflavonas ...................................................... 13

    3.4. Outros mecanismos de aco dos fitoestrognios............................. 16

    4. Estrognios................................................................................. 17

    4.1. Recursos endgenos de estrognios ............................................. 17

    4.2. Sntese de estrognios ............................................................. 18

    4.3. Transporte e Metabolismo dos estrognios .................................... 20

    4.4. Receptores de estrognios ........................................................ 21

    4.5. Mecanismo de aco dos estrognios ........................................... 22

    4.5.1. Mecanismos de aco genmica ............................................. 22

    4.5.2. Mecanismos de aco no genmica ou extranuclear ................... 23

    5. Cultura de clulas: Modelo experimental para o estudo de compostos

    estrognicos .................................................................................. 25

    Objectivos ...................................................................................... 27

  • x

    Material e Metodologia .......................................................................29

    1. Material .................................................................................... 29

    1.1

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