estudio microbiologico de las salinas en el estado falcÓn

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE FARMACIA Y

BIOANÁLISIS

ESCUELA DE BIOANÁLISIS

COMPONENTE DE INVESTIGACIÓN

“ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LAS

SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN”

TUTOR:

FÉLIX D. ANDUEZA L.

AUTORES:

CASTILLO J. JOHAN X.

REY S. KLERISMAR.

MÉRIDA, MARZO DEL 2013

ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN 2013


FACULTAD DE FARMACIA Y

BIOANÁLISIS



“ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LAS

SALINAS EN EL ESTADO FALCÓN”

Tesis de Grado para obtener el Titulo de

Licenciado (a) en Bioanálisis

TUTOR:

FÉLIX D. ANDUEZA L.

AUTORES:

CASTILLO J. JOHAN X.

REY S. KLERISMAR.

MÉRIDA, MARZO DEL 2013


INDICE GENERAL

Pág.

DEDICATORIA………………………………………………………………viii

AGRADECIMIENTOS………………………………………………………..ix

RESUMEN……………………………………………………………………..x

INTRODUCCION…………………………………………………………. 1

CAPITULO I

ANTECEDENTES DEL PROBLEMA………………………………. 3

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………………... 5

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION…………………………….. 6

CAPITULO II

MARCO TEORICO………………..…………………………………… 7

Ambientes extremos: Generalidades…………………………...…. 7

Ambientes hipersalinos……………………………………………… 8

Origen de la salinidad……………………………………………….. 9

Efectos de la salinidad en propiedades fisicoquímicas del agua.. 9

Factores que originan la coloración de las salinas……………….. 11

Microorganismos halófilos…………………………………………... 14

Clasificación de los microorganismos según sus requerimientos

Salinos………………………………………………………………...

iii

15


Clasificación de los halófilos en función de la salinidad………… 16

Adaptación de los microorganismos a los ambientes salinos….. 17

Taxonomía de los microorganismos halófilos……………………. 21

Clasificación de los microorganismos en función de su

temperatura optima de crecimiento………………………………

Alcalófilos……………………………………………………………...

…

25

26

CAPITULO III

ANTECEDENTES DE LA HIPOTESIS…………………………. 27

HIPOTESIS……………………………………………………....... 29

CAPITULO IV

MARCO METODOLOGICO……………………………………… 30

MATERIALES…………………………………………………..….. 30

Población muestral……………………………………………….. 30

Descripción del área de estudio………………………………… 30

Medios de cultivo…………………………………………………. 31

Reactivos………………………………………………………….. 31

METODOLOGIA………………………………………………….. 32

Tratamiento de la muestra……………………………………….

Aislamiento y Cuantificación de microorganismos halófilos

presentes

iv

32

33


Determinación de la cantidad de microorganismos

heterótrofos aerobios

Identificación de los microorganismos aislados……………….

Elaboración de antibiogramas…………………………………..

CAPITULO V

RESULTADOS Y DISCUSIONES..………………..…………

CAPITULO VI

CONCLUSIONES……………………….……………………...

RECOMENDACIONES………………………………………...

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………............

35

36

36

38

51

52

53

v


INDICE DE TABLAS

Tabla Pág.

Tabla 01: Clasificación de los halófilos en función de la salinidad…. 16

Tabla 02: Clasificación de los microorganismos en función de su

temperatura optima de crecimiento……………………………………

…

25

Tabla 03: Preparación del medio de agar nutrientes a diferentes

concentraciones salinas

32

Tabla 04: Resultados Galería API de estudio microbiológico de

salinas

38

Tabla 05: Conteo de colonias…………………………………………... 39

Tabla 06: Estructura morfológica de los microorganismos………….. 40

Tabla 07: Características y estructura morfológica de los

microorganismos

41

Tabla 08: Pruebas bioquímicas para identificación de

enterobacterias

42

Tabla 09: Pruebas bioquímicas para identificación del género

Staphylococcus……………………………………………………………

…

43

Tabla 10: Antibióticos…..……………………………………………….. 44

Tabla 11: Interpretación de las zonas de inhibición para especies

de la familia Enterobacteriacea.

…

45

vi


INDICE DE FIGURAS

Figura Pág.

Figura 01: Diferentes condiciones ambientales extremas y grupos

de organismos adaptados a ellas (extremófilos)………………………

…

7

Figura 02: Toma de muestras de las salinas…………………………. 30

Figura 03: Agua peptonada en diferentes concentraciones………… 33

Figura 04: Método de siembra por difusión en placa………………… 34

Figura 05: Tratamiento y siembras de las muestras salinas………... 34

Figura 06: Contaje y repique de colonias microbianas……………… 35

Figura 07: Procedimiento para la realización de antibiogramas…… 37

Figura 08: Pruebas API 20 NE usadas para la identificación de los

géneros de bacterias

38

Figura 09: Coloración GRAM…………………………………………… 41

Figura10: Penicillium spp al microscopio……………………………… 42

Figura 11: Pruebas Bioquímicas O/F………………………………….. 43

Figura12: Medio manitol salado………………………………………... 44

Figura 13: Antibiograma………………………………………………… 46

vii


DEDICATORIA

A Dios Todopoderoso, por darme la oportunidad de vivir y por estar

conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi

mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido

mi soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.

A mis Padres: Maritza y Kléver por haberme traído a este maravilloso

mundo con gran amor y estar conmigo en todo momento. Hoy con

sacrificio han dado una carrera para mi futuro, ustedes son pilares

fundamentales en mi vida, los quiero y Amo con todo mi corazón.

A mis hermanos Kleimar, Klever, Eliezer y Jesús ustedes han sido un

motor para lograr mis propósitos, aun son muchas las bendiciones por

llegar y estoy segura que también vivirán este momento de felicidad. Los

adoro.

A mi sobrino Kleiver mi tesoro, quien me ha brindado alegría en todo

momento, que este triunfo te sirva de motivación.

A toda mi familia por estar presente a lo largo de mi camino brindándome

cariño y la fuerza necesaria para continuar; así como dándome consejos

y orientación.

A mis compañeros (as) en especial a Xavier por compartir momentos

agradables y juntos lograr el objetivo final. A ustedes Mayra, María

Alejandra y Nosllely por la amistad puesta en mí y gran compañía a lo

largo de nuestro trayecto. Lo(as) quiero mucho!

Y a todos los que formaron parte de mi vida profesional estarán en mis

recuerdos y en mi corazón gracias por sus Bendiciones.

Klerismar

viii


AGRADECIMIENTOS

Cuando uno se propone alcanzar una meta tal como llevar a cabo la

presente Tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,

participan muchas personas con su enseñanza, información, experiencia,

apoyo, consejos y dando ánimo, acompañando en los momentos de

crisis y en los momentos de felicidad. A todas ellas quisiéramos brindarle

nuestro más reconocido agradecimiento:

Primeramente agradecemos a Dios por Bendecirnos para llegar hasta

aquí y hacer realidad este sueño anhelado.

A la Ilustre Universidad de Los Andes (ULA) y al Departamento de

Microbiología por darnos la oportunidad y ser parte de esta casa de

estudios.

A los Profesores(as) Félix Andueza y Judith Araque por su esfuerzo y

dedicación, quienes con sus conocimientos, experiencia, paciencia y su

motivación formaron parte en la elaboración de la tesis hoy más que

nunca infinitamente agradecidos.

También nos gustaría agradecer a los profesores que durante toda la

carrera profesional aportaron con un granito de arena nuestra formación

académica y profesional.

Compañeros (as) de estudio por haber compartido grandes momentos y

lograr juntos esta meta.

A mi familia por su compresión y apoyo.

Y a todos los que formaron parte de nuestra vida profesional muchas

gracias y que Dios los bendiga.

Klerismar y Xavier

ix



FACULTAD DE FARMACIA Y BIOANÁLISIS



“ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DE LAS SALINAS EN EL ESTADO

FALCÓN”

Las salinas son masas de agua situadas normalmente en el litoral y zonas

costeras el cual difieren de otros ambientes por poseer características

únicas y propias como su gran coloración rojiza debido a

microorganismos, crustáceos y flora planctónica presentes en ellas

convirtiéndolas en una gran atracción turística, sin embargo su principal

objetivo es la obtención de sal a través de la evaporación y por acciones

industriales (o en algunos casos de aguas salinas continentales). En el

siguiente trabajo de investigación se analizaron muestras solidas de

salinas de Las Cumaraguas ubicadas en el Estado Falcón con el objetivo

de estudiar si se encuentra presencia microbiológica en ellas. Pruebas

y determinaciones bioquímicas comprobaron la presencia de

Microorganismos Halófilos presentes en ella y cuyo aislamiento se realizó

utilizando medios de cultivos como el agar nutriente y Manitol salado los

cuales se prepararon en diversas concentraciones de sal con la finalidad

de crear distintas condiciones en el medio de cultivo así como también la

realización de Antibiogramas para determinar la susceptibilidad de los

microorganismos. Basándonos en el sistema API el 50 % de las muestras

tratadas se logró hallar Chryseomonas luteola y en menos % Pasteurella

spp, Burkholderia cepacia, Photobacterium dansela y Pseudomonas

fluorescens. En cuanto al cultivo micológico se logró hallar Penicillium spp

De acuerdo a los resultados se concluye que existen individuos

pertenecientes a los organismos procariotas y eucariotas, sin embargo de

acuerdo a la concentración de sal del medio, la abundancia de unos a

otros varía considerablemente. x


INTRODUCCIÓN

Entre los amplios propósitos de la Universidad de los Andes U.L.A, se

destaca la investigación científica, la cual además de contribuir a la

formación académica, también aporta en forma práctica y efectiva la

adquisición de conocimientos que enriquecen el saber universal para

encarar problemas que afecten directa o indirectamente a la humanidad.

Sin embargo, universidades de otras partes del mundo han realizados

numerosos trabajos de investigación sirviendo de soporte para el presente

trabajo de investigación que permitirá evaluar el estudio de

microorganismos halófilos en las salinas del Estado Falcón.

Investigaciones realizados en las últimas décadas han descubierto una

gran variedad de organismos microbianos que han logrado prosperar en

diferentes ambientes salinos la cual han tenido que adaptarse a

condiciones ambientales muy extremas a las que deben exponerse por

estar en dichos hábitat, condiciones como variaciones de pH, elevadas

presiones, alta salinidad, disponibilidad de agua, grandes radiaciones,

metales pesados, compuestos tóxicos y cambios bruscos de temperatura

son factores que perturban su crecimiento y modo de vida [1,2,3,4].

Como se describió anteriormente las diferentes comunidades de

microorganismos que se encuentran habitando estos ambientes

extremos, han tenido que recurrir a cambios drásticos en su metabolismo

para así poder sobrevivir y soportar condiciones intolerables a los que se

encuentran expuestos consiguiendo variar unas serie de aspectos como:

el tamaño celular, morfología, estrategias metabólicas, movilidad, división

celular, biología del desarrollo y otros aspectos estructurales de su

organismo [3]. Debido a todos estos cambios sufridos en su organismo se

le han denominado microorganismos extremófilos [4].

1


Los denominados microorganismos Halófilos se han clasificado en dos

grupos: Halófilos moderados y Halófilos extremos; estos difieren de los

Halotolerantes porque son capaces de reproducirse y realizar sus

funciones metabólicas de una manera más eficaz en presencia de altas

concentraciones salinas logrando así despertar el interés de muchos

científicos del mundo biotecnológico [4, 5,6].

Los ambientes hipersalinos se encuentran actualmente en diversos

puntos geográficos del mundo; sin embargo sus condiciones físico

químicas así como sus niveles de sales, van a depender de una serie de

características particulares como su topografía geológica, condiciones

climática e incluso la mano del hombre, clasificándolas en salinas

naturales y artificiales; estos tipo de ambientes representan una utilidad

importante en la realización de estudios sobre el mundo microbiano

halófilo, despertando interés desde el punto de vista biotecnológico como

industrial dentro de los cuales la PCR es uno de los más destacados [4,

5,7].

En Venezuela no se han realizado proyectos relacionados a este

contenido; no obstante en otros países, numerosos estudios han arrojado

una gran complejidad de microorganismos halófilos de los que apenas se

han aislado y analizados un pequeño porcentaje [5].

Tomando en consideración lo antes señalado y teniendo en cuenta, que

es un campo de estudio cuya exploración apenas se ha iniciado, se ha

planificado llevar a cabo el presente proyecto el cual se basa en el

Estudio Microbiológico de Salinas ubicadas en el Estado Falcón.

2


CAPITULO I

ANTECEDENTES DEL PROBLEMA

Hoy en día el estudio de especies microbianas halófilas a nivel mundial

han arrojado numerosos resultados de gran importancia biotecnológica

destacando la producción de diversas enzimas y biopolímeros los cuales

aportan ventajas a nivel industrial y científico, debido a las imponentes

condiciones hipersalinas han recurrido a elaborar gran variedad de

sustancias y moléculas para su adaptabilidad en ambientes extremos

logrando competir exitosamente ante los efectos desnaturalizantes de las

sales [3].

La importancia de estos microorganismos y sus productos enzimáticos en

el mercado biotecnológico han despertado en los últimos años un gran

interés debido a sus propiedades catalíticas y potencial aplicación

industrial en la formulación y elaboración de detergentes, productos

dietéticos, procesamiento de cuero, papel, biodegradación de residuos

tóxicos y contaminantes industriales, mineras e industrias farmacéuticas,

así como el estudio de los lactobacilos, empleados para la fabricación de

quesos en la industria Láctea, podría aportar conocimiento para acelerar

los procesos industriales, jugando un papel importante en el campo

industrial [2,5]

Actualmente, en la Universidad Autónoma Metropolitana Xochimilco se

está realizando un proyecto experimental titulado “Caracterización de

actinomicetos aislados a partir de ambientes Hipersalinos”. En dicho

proyecto se realizan muestreos en ambientes salinos extremos de

distintas zonas geográficas de México, tales como: suelos salados,

lagunas saladas así como salinas costeras, dicha investigación tiene

como objetivo aportar conocimientos sobre la diversidad de los

actinomicetos halófilos en este país [6].

3


Otra investigación realizada es en la Universidad Mayor de San Simón

titulado “Aislamiento, Caracterización parcial y perfil de producción

enzimática de bacterias halófilas y halotolerantes de la Laguna Chairkota,

Potosí-Bolivia; este trabajo es un aporte al estudio de la diversidad

microbiana de dicho país y al potencial biotecnológico de los

microorganismos extremófilos para su posterior explotación [27].

Otras se están estudiando a escala piloto, o están en desarrollo.

Seguramente muchas aun no las conocemos pero en los últimos años se

está haciendo un gran esfuerzo, potenciando los proyectos de

investigación destinados a buscar nuevos productos entre

microorganismos extremófilos: halófilos, termófilos, psicrofilos, etc, por lo

que cabe esperar un futuro muy prometedor en el campo de la

biotecnología de estos microorganismos [3].

4


PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Por lo anterior se plantea la siguiente interrogante:

¿Cuáles son los tipos de Microorganismos Halófilos que prevalecen en las

principales Salinas ubicadas en el Estado Falcón.

5


OBJETIVOS

a. Objetivo General

Detectar e Identificar microorganismos halófilos en salinas

ubicadas en el Estado Falcón.

b. Objetivos Específicos

1. Determinar la cantidad de microorganismos heterótrofos presentes

en las salinas ubicadas en el Estado Falcón.

2. Aislar y cuantificar los microorganismos halófilos presentes en las

salinas ubicadas en el Estado Falcón.

3. Identificar los microorganismos aislados.

4. Determinar los perfiles antimicrobianos de las cepas aisladas e

identificadas.

6


CAPITULO II

MARCO TEÓRICO

AMBIENTES EXTREMOS: GENERALIDADES

Los ambientes extremos son lugares inimaginables entre los cuales se

encuentran los ambientes hipersalinos, estos se caracterizan por

presentar condiciones físico-químicas muy variables en relación a

cualquier otro ambiente presente en la naturaleza. La mayoría de los

organismos están adaptados a las condiciones físicas y químicas

estándar medias de la superficie de la Tierra, que les permite cumplir las

funciones necesarias para poder sobrevivir, estas condiciones influyen en

el intercambio de materia, energía y diversas funciones metabólicas del

microorganismo, de manera que el medio debe permitirle realizar estas

funciones, pero las condiciones en estos medios salinos son tan

inestables que provocan al organismo una situación de stress, dichas

condiciones como variaciones temperatura, pH, presión hidrostática,

potencial redox, actividad del agua, salinidad, irradiación solar,

concentración de nutrientes o metales tóxicos extremos e inusuales se

ven alteradas tanto por variaciones del clima atribuibles a causas

naturales como a acciones antrópicas, convirtiéndolos así en ambientes

no favorables, incluso letales para la mayoría de los seres vivos [8].

(Figura 01).

Figura 01.Diferentes condiciones ambientales extremas y grupos de

Organismos adaptados a ellas (extremófilos).

Fuente: Comerio et al., (2007).

7


AMBIENTES HIPERSALINOS

Los ambientes hipersalinos son considerados como ecosistemas con una

baja diversidad de especies dominados por microorganismos procariotas,

no obstante aun se conoce muy poco sobre la cantidad de bacterias

halofílicas que coexisten en estos ambientes, debido a que ellos se

caracterizan por presentar altas concentraciones de sales inorgánicas

más elevadas que las del agua del mar impidiendo cualquier modo de

vida [10]. Dentro de los hábitats hipersalinos se encuentran también los

desiertos de sal que cubren enormes áreas de mundo, salitrales y lagos

salados formados por el proceso de evaporación cuyos niveles dependen

de su localización geográfica, por lo general estos ambientes se

encuentran en zonas áridas presentado por ello un mayor grado de

evaporación a comparación de la precipitación originando que a mayor

evaporación aumente la concentración de las sales en relación a los

niveles que naturalmente presenta el agua del mar [11].

El agua del mar está compuesta en promedio de un 96.52% de agua y un

3.49% de sustancias disueltas mayormente sales la cual el NaCl es el

compuesto más importante de los cloruros y el principal producto de estos

ambientes salinos conocido generalmente como sal común o sal de mesa,

el ión de sodio es el catión más abundante en el agua del mar

aproximadamente 30.4 % mientras que el ión cloruro es el anión principal

aproximadamente en 55.2% encontrándose junto a otras sales como

partículas cargadas eléctricamente llamadas iones, distribuidos de forma

disociada por su interacción con el agua [12].

Además del proceso de evaporación los ambientes salinos también se

han ido formando por una serie de procesos de transporte y acumulación

de sales de índoles geográficas y geoquímicas que conducen, en

periodos más o menos prolongados a la salinización de determinadas

áreas.

8


Muchos de estos ambientes representan un rol fundamental en el

desarrollo económico tanto a nivel industrial tal es el caso de las

industrias saleras como a nivel social como fuente turística [13].

ORIGEN DE LA SALINIDAD

El origen de la salinización de las aguas marinas viene dado por los

diversos acontecimientos que formaron parte del proceso de formación de

la tierra como géiseres que se formaban en la superficies, gases volátiles

y otros como el vapor de agua que al salir a la atmósfera y enfriarse se

condensaba y se convertía en agua de lluvia cayendo sobre los mares y

superficie terrestre, las erupciones volcánicas originaban la expulsión

elementos químicos como potasio magnesio, sulfatos, calcio, bicarbonato,

bromuro que por ser elementos mucho más pesados que el vapor de

agua quedaban depositados en la superficie de las rocas y suelos dando

lugar a la acumulación de sales en estos sitios formando así los suelos

salinos, además la salinización se mantiene de forma interrumpida, sin

embargo hay ciclos de salinización que han ido formando ambientes

salinos a lo largo del tiempo [11].

Además de la cantidad elevada de sales, los medios hipersalinos

presentan al mismo tiempo un alto contenido de iones (factor que le

atribuye la característica de ser un ambiente inhóspito para la mayoría de

los microorganismos), se suelen caracterizar por registrar generalmente

temperaturas elevadas, una luz intensa, un pH alcalino y la presencia de

otros aceptores de electrones alternativos al oxígeno [14].

9


EFECTOS DE LA SALINIDAD EN PROPIEDADES FISICO

QUIMICAS DEL AGUA

La excesiva cantidad de sales presentes perturban varios procesos físicos

elementales, así como propiedades importantes del agua y de sustancias

disueltas en agua, propiedades como densidad, viscosidad, tensión

superficial, presión osmótica, punto de fusión, punto de ebullición y

solubilidad de los gases. Un parámetro afectado es la densidad donde se

ha demostrado que es más densa incluso que la del agua del mar debido

a su alta concentración de sales estas partículas se encuentran disueltas

y mas unidas debido a las condiciones de los medios salinos, provocan

además de una disminución de la temperatura dado a que sus partículas

no pueden acomodarse libremente en el agua incrementando así su

densidad [15].

La viscosidad depende principalmente de dos variables como lo son la

salinidad y la temperatura, relacionadas directamente ya que cuando la

salinidad aumenta la viscosidad también lo hace. Estas variaciones

impactan la fisiología, reproducción, morfología, distribución, diversidad y

el comportamiento de los organismos superiores y microorganismos que

habitan estos ambientes inclusive afectando el desplazamiento de

microorganismos motiles y llegando a destruir cualquier tipo de vida ya

que las condiciones que les ofrece el medio salino no son las adecuadas

y deben invertir mayor cantidad de energía para poder vencer la

resistencia que este les ocasiona pero que dicha energía se torna critica

cuando los nutrientes escasean o los microorganismos enfrentan

temperaturas bajas que reducen su actividad metabólica [15].

10


Cuando la salinidad logra alcanzar niveles mayores de 30% sumadas a

las variaciones de temperaturas que se registran en dichos ambientes,

explican el carácter anóxico que estos poseen, debido a que las sales

disueltas excluyen a las moléculas de oxígeno por que reducen los

espacios intermoleculares disponibles reduciendo así la solubilidad de

este gas en el agua [15].

FACTORES QUE ORIGINAN LAS COLORACIONES DE LAS SALINAS

La coloración que adoptan las salinas se debe a los microorganismos que

ocupan estos lugares hostiles e inhóspitas llamadas salinas (altas

temperaturas, alta salinidad y carencia de oxígeno). Pero estudios

realizados han confirmado que la Artemia salina es un pequeño crustáceo

braquiópodo, pertenece a la subclase de los anostráceos su nombre

científico es Brine shrimps y conforma el plancton de las aguas

continentales salobres, su tamaño es de 8 a 13 mm. de longitud, habitan

en lagunas salobres o zonas salinas donde ya existen unos rangos de

salinidad superior a los del agua de mar (3,6 gr/l), estos crustáceos son

unos de los pocos organismos eucariotas que se pueden observar en

estos hábitats con salinidad intermedia o mayor a 10% de sal; asimismo le

proporcionan una coloración a las salinas debido a que su alimentación

está basada en microalgas ricas en pigmentos carotenoides, pero además

dicha coloración es producida cuando el medio donde se encuentran va

aumentando su salinidad debido a la rápida evaporación y de su

localización geográfica que se encuentre dicho hábitat, ellos al exponerse

a una concentración de NaCl muy alta deben aumentar notoriamente la

hemoglobina en sangre para compensar la falta de oxígeno, estos

crustáceos pueden llegar a soportar aguas hipersalinas hasta de 300 gr/l

[16].

11


Otro responsable del color rojo que se presentan en los ambientes salinos

es la Dunaliella salina es un alga microscópica o unicelular que crecen

óptimamente en sistemas con concentraciones de sales de 20-25% y

aunque pertenece a las algas verdes su color es rojo debido a que posee

grandes cantidades de beta y alfa carotenos [16].

La Dunaliella salina es una alga planctónica clorofita microscópica

perteneciente a las clorofíceas o algas verdes, caracterizada por acumular

grandes cantidades de carotenoides llegando hasta 14% de su masa

seca, debido a esto su coloración roja se hace mucho más notoria debido

a que ellas no presentan pared celular, haciéndola muy digestiva para los

consumidores, así como por poseer gran cantidad de pigmentos rojos de

α y ß-caroteno y glicerol aparte de la clorofila, pero bajo las condiciones

hipersalinas el glicerol funciona en el citoplasma como un soluto

compatible para mantener la integridad de la membrana y proteínas. Al

parecer las respuestas celulares al estrés salino son regulatorias y

parecen depender de una diversidad de mecanismos ligados a la

modificación en el balance del ácido abcisico. Diversos estudios han

demostrado que el aumento de la concentración de NaCl, intensidad

luminosa, temperatura y/o limitación de nutrientes acrecienta la

producción de carotenoides y clorofila en Dunaliella salina la cual la hace

responsable de la gran parte de la coloración de los ambientes salinos,

además, sirve de alimento a la Artemia, dado que esta última es filtradora

de plancton y en rangos altos de salinidad prácticamente sólo vive este

tipo de microalgas [16,17,18].

La Dunaliella salina sintetiza altas concentraciones de glicerol intracelular

7 M (56%) como soluto compatible para mantener el balance osmótico y

ser prácticamente la única alga presente en lagos o ambientes salinos [6].

12


Las bacteriorrodopsina es una proteína de color purpura presente en la

membrana de algunos microorganismos halófilos característica de las

Arqueas y Halobacterias, actúa como bomba de protones, es decir, tiene

función foto sensitiva ya que captura luz solar para proveer de energía

química al microorganismo así como también la utiliza para mover los

protones a través de la membrana celular. Esta proteína posee enlaces π

conjugados en la molécula retinal. Esta conformación de la molécula

retiniana cambia al absorber un fotón, produciendo un cambio

conformacional en la proteína circundante y el bombeo del protón,

Cuando los nutrientes son escasos, la membrana celular que es rica en

bacteriorrodopsina entra en acción. Sirven como enzimas fotoconversoras

que mantienen en ciclo de vida del organismo en funcionamiento.

Específicamente, en respuesta a la luz la esta proteína bombea protones

a través de la membrana, transportando iones cargados dentro y fuera de

la célula. De esta forma, la bacteriorrodopsina es una central eléctrica de

proteína que se conecta en tiempos de escasez, cambiando el color de

morado a amarillo cuando está absorbiendo luz [16].

No obstante algunas bacterias como las Halobacterium salinarum y

Halobacterium. halobium pertenecientes al grupo de las Arqueobacterias,

consideradas como los organismos más antiguos del planeta, poseen

características bioquímicas y genéticas bastante diferentes a las bacterias

comunes ya que no poseen paredes celulares con peptidoglicano,

presentar secuencias únicas en la unidad pequeña del ARNr, y poseen

lípidos de membranas diferentes tanto de las bacterias como de los

eucariotas entre otros aspectos permitiéndoles así su adaptación a estos

medios salinos [12].

Los microorganismos por su carácter unicelular los hace muy vulnerables

a las diferentes condiciones a los que se encuentran expuestos como los

diversos cambios de temperaturas, pH, y luz solar, que presenta el

medio ambiente [13]. 13

http://es.wikipedia.org/wiki/Bomba_de_protones

http://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_celular


MICROORGANISMOS HALÓFILOS

El término “halófilo” viene del griego, donde “halo” es “sal” y “filo” es

“amante de”, es decir, significa “amante de sal”. Sin embargo no todos los

microorganismos halófilos tienen los mismos requerimientos de sal, por lo

que tienden a agruparse en función al rango de sales que necesitan para

tener un crecimiento óptimo [5].

Muchos organismos pueden llegar a vivir en un rango de salinidad, que va

desde el agua destilada hasta soluciones saturadas de sal. La osmofilía

se refiere a los aspectos osmóticos de la vida en altas concentraciones de

sal, especialmente la presión de la tensión hídrica, la deshidratación

celular y la desecación. Los halófitos hacen referencia a los

requerimientos iónicos para la vida en altas concentraciones de sal. Los

halófitos incluyen un rango de microbios, muchas son archeas,

cianobacterias y el alga verde Dunaliella salina que puede sobrevivir en

soluciones saturadas de cloruro sodio [5].

La estrategia de estos microorganismos para soportar la gran

concentración de sal es evitar los efectos de un proceso denominado

ósmosis. En este proceso, el agua pasa a través de la membrana de la

célula, de la solución más diluida a la más concentrada. Por tanto, si fuera

de un organismo hay una alta salinidad, el agua saldrá de él y el

organismo morirá deshidratado. Los halófilos logran retener el agua en su

interior acumulando numerosos compuestos en el citoplasma, de modo

que se compensa la presión osmótica, y el agua no sale de ellos evitando

su deshidratación [5].

Estos microorganismos se diferencian de los halotolerantes porque son

capaces de reproducirse y realizar sus funciones metabólicas de una

manera más eficaz en presencia de altas concentraciones de sales que

en ausencia [5].

14


CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SEGÚN SUS

REQUERIMIENTOS SALINOS

Cada cepa microbiana tiene un determinado rango de tolerancia a

factores ambientales como son: la temperatura, el pH y la salinidad, los

cuales pueden afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones

microbianas. En consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad de

microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de

tolerancia. Los microorganismos que requieren elevadas concentraciones

de sal se denominan halófilos. Kushner y Kamekura, en 1998,

propusieron las siguientes categorías de microorganismos teniendo en

cuenta sus requerimientos de NaCl [30].

No Halófilos: su crecimiento óptimo se produce a una concentración de

NaCl inferior a 0,2 M (1% p/v). Existen microorganismos no halófilos

capaces de crecer en medios hasta con 2,5 M de NaCl (15% p/v).

Denominándose halotolerantes [14].

Halófilos débiles: También llamadas bacterias marinas. Su crecimiento

se produce a una concentración de NaCl de 0,2-0,5 M (1-3%p/v) [14].

Halófilos moderados: crecen de forma óptima a concentraciones de

NaCl comprendidas entre 0,5 y 2,5 M (3-15% p/v) [14]. Las bacterias

halófilas moderadas representan el grupo más común de las bacterias

halófilas, en los ambientes hipersalinos se encuentran en mayor

frecuencia representantes de bacterias Gram negativas aerobios o

anaerobios facultativos [14].

Del grupo de bacterias halófilas moderadas aisladas e identificadas en

diversos proyectos de investigación, se destaca el género Pseudomonas.

15


Los miembros pertenecientes a esta familia son bacilos Gram negativos

rectos o ligeramente curvos, móviles por medio de flagelos polares,

estrictamente aerobios y están ampliamente distribuidos en la naturaleza

particularmente en ambientes acuáticos [14].

Halófilos extremos: Tienen un crecimiento optimo entre 2,5 y 5,2 M (15-

32% p/v) de NaCl [14].

CLASIFICACION DE HALÓFILOS EN FUNCIÓN DE LA SALINIDAD

Sin embargo estudios realizados en los últimos años han dado a conocer

que los microorganismos extremófilos han elevado su capacidad de

soportar las altas concentraciones de sal por diversos mecanismos

utilizados en su metabolismo logrando así aumentar el rango de salinidad

en el cual crecen [30] (Tabla 01).

Halófilos Concentraciones de NaCl

Halófilos Débiles 0.5 – 10 %

Halófilos Moderados Arriba de 10 – 20 %

Halófilos Extremos Arriba de 20 %

Halotolerantes Toleran la salinidad

Tabla 01. Clasificación de los halófilos en función de la salinidad.

Fuente: Ramírez et al., (2006).

16


ADAPTACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS A LOS AMBIENTES

SALINOS

a) Osmoadaptación

Las bacterias adaptadas a vivir en ambientes hipersalinos han de

enfrentarse a un medio con una fuerza iónica elevada [15]. Debido a que

las membranas biológicas celulares son permeables al agua, las células

que no están adaptadas no pueden mantener una concentración del

citoplasma mayor que la del medio externo, ya que se produciría una

deshidratación y la consiguiente muerte de la célula [16]. La adaptación

del medio ambiente hipersalinos consiste en equilibrar la presión osmótica

interna con la externa, a fin de mantener la integridad celular y las

funciones vitales [16].

Los microorganismos que viven en ambientes hipersalinos han adoptado

dos estrategias de Osmoadaptación: mediante la acumulación de grandes

cantidades de sal, “salt in” en concreto KCl, en el interior de la célula, y

mediante el empleo de solutos compatibles orgánicos. Algunos sistema

intracelulares deben adaptarse a la presencia de altas concentraciones de

sal para poder sobrevivir y lo realizan por medio de la estrategia “salt in”

manteniendo en las células bajas concentraciones de sal en su

citoplasma para una adaptación osmótica de las enzimas y componentes

estructurales de las células consiguiendo asegurarse de un propio y

adecuado funcionamiento de la maquinaria enzimática intracelular,

aunque también se han determinado adaptaciones moleculares dentro de

las cuales existe un exceso de aminoácidos con carácter ácido y pocos

aminoácidos hidrofobitos en sus proteínas [4].

Sin embargo la adaptación a estos hábitats son muy exigentes por su

elevada fuerza iónica exterior significando para los microorganismos

realizar un gasto energético mayor.

17


La estrategia del KCl es menos costosa que la acumulación de solutos

compatibles pero requiere grandes adaptaciones de la maquinaria celular,

de modo que se lleva a cabo por un proceso más complejo y largo desde

el punto de vista evolutivo [16].

Esta opción solo la realizan los grupos de procariotas especializados,

como las arqueas halófilos y las bacterias anaerobias halófilas, que

obtienen cantidades limitadas de energía debido a su metabolismo

fermentador. El resto de los microorganismos utilizan solutos compatibles

orgánicos, que son más costosos energéticamente [17].

Los microorganismos que acumulan KCL son las arqueas halófilas del

orden Halobacteriales [14] y las bacterias halófilas del orden

Haloanaerobiales [17]. También acumulan esta sal Acetohalobium [17], y

algunas bacterias sulfato reductoras [19].

La acumulación de solutos compatibles depende de la fuerza osmótica,

de la fase de crecimiento del cultivo, de la fuente de carbono y de la

presencia de osmolitos en el medio de cultivo [19]. Las condiciones de

crecimiento son muy importantes; por ejemplo, Chromohalobacter

israelensis y Chromohalobacter salexigens sintetiza y acumula

principalmente trehalosa como mecanismo de respuesta al estrés

osmótico y de osmorregulación durante la etapa de crecimiento y térmico

cuando crece a concentración de NaCl inferior a 0,6 M, además muestra

características de estabilizador de proteínas y membranas bajo

condiciones de estrés actuando como protector reemplaza a las

moléculas de agua a través de las uniones polares de sus residuos

previniendo la desnaturalización de las proteínas y la fusión de membrana

formando cristales en estado seco proceso requerido para la

estabilización de las moléculas en estado deshidratado, manteniendo así

estables a las proteínas en altas temperaturas y pH ácido, pero a mayores

concentraciones el soluto principal es la ectoína al igual que,

hidroxiectoína la cual ayuda a sobrevivir a un estrés osmótico extremo

[4,18]. 18


Dichos microorganismos al estar sometido constantemente a un shock

hipo osmótico desencadenan la apertura de canales mecanosensibles en

la membrana citoplasmática permitiendo la salida de solutos al exterior

favoreciendo así su permanencia en dicho medio [20].

La ectoína es un compuesto natural que se encuentra en varias especies

de bacterias se trata de un soluto compatible, que sirve como una

sustancia protectora, actuando como un osmolito que confiere resistencia

a los microorganismos estabilizando las proteínas, el ácido nucleico y las

membranas ante el estrés salino y la temperatura. En las bacterias

halófilas se han descrito dos tipos de transportadores de ectoína: un

transportador osmoregulador de la familia TRAP con alta afinidad por

ectoína, codificado por los genes teaABC y el transportador EctM (tipo

BCCT) implicados en la captación de ectoína [20].

Por otra parte algunos microorganismos halófilos y halotolerantes su

balance osmótico lo establecen mediante pequeñas moléculas que son

sintetizadas por las células o tomadas del medio donde se encuentra, la

estrategia “compatible solute” se define en solutos que a altas

concentraciones permiten un alto grado de adaptabilidad de las células y

protección de las enzimas contra los efectos de las altas concentraciones

de sal y el estrés, alguno solutos compatibles encontrados son los polioles

como el glicerol y arabimitol, azúcares y sus derivados como (sacarosa,

thealosaglucosil, glicerol) aminoácidos y derivados de aminas, que

poseen un bajo peso molecular y que son totalmente solubles en agua,

[4].

19


La lógica que apoya estas ideas es que muchas de las maquinarias

metabólicas y biosintéticas de los organismos multicelulares están en el

compartimiento intracelular y que durante un estrés hiperosmótico los

osmolitos orgánicos se acumulan en formas elevadas dentro de la células

pero sin alterar la actividad enzimática a comparación de las sales

inorgánicas, por ello, se les denomina solutos compatibles [4].

b) Modificación en la morfología celular y estructura

Las bacterias que normalmente crecen en condiciones diferentes a

medios salinos pueden mostrar grandes modificaciones cuando se

someten a una elevada concentración de sal. 18

El engrosamiento, el alargamiento y la reducción del volumen de las

células son las modificaciones más frecuentes. Se trata de una respuesta

común en algunas bacterias como Pseudomonas fluorescens. Sin

embargo estos cambios no ocurre en Escherichia coli gram negativa

debido a que su pared es más delgada, resultándole difícil sobrevivir en

un ambiente salino [21].

Las bacterias Gram positivas como Bacillus y Staphylococcus también

modifican su estructura, al 10-20% (p/v) de NaCl [21].

Por otro lado también se han encontrado modificaciones estructurales en

las bacterias halófilas. Un aspecto importante es el cambio en la pared

celular y en las membranas. Las adaptaciones estructurales de la

membrana principalmente se refieren a alteraciones en la composición y

síntesis de proteínas, lípidos y ácidos grasos sin embargo la Bacillus

subtilis es una bacteria Gram positiva el cual presenta una membrana y

una gruesa pared que permite que la bacteria pueda soportar con

entereza el estrés osmótico pero otra propiedad importante de los Bacillus

es la esporulación. 20


Frente a condiciones de falta de alimento (estrés nutricional) estas

bacterias, en lugar de morir, desarrollan un proceso de diferenciación que

les permite formar una estructura inerte, la espora, que los cobija. Con

ella, espera condiciones de vida mejores para volver a multiplicarse. Este

rasgo resulta interesante pues, al igual que la mayoría de las bacterias, B.

subtilis posee un solo cromosoma, y esa información genética la puede

modular para crecer libremente en forma bacilar o para formar esporas.

Es decir, esta bacteria puede llevar a cabo un proceso de diferenciación,

aunque en pequeña escala, al igual que los organismos superiores [22].

TAXONOMÍA DE LOS MICROORGANISMOS HALÓFILOS

a) Taxonomía de las arqueas halófilas:

La mayoría de las arqueas halófilas se consideran halófilas extremas, ya

que su optimo de crecimiento se encuentra a 3,5-4,5 M de NaCl. Entre

sus características distintivas destacan la carencia de todos los casos del

ácido murámico (peptidoglicano) como constituyente principal de la pared

celular, presentan una morfología típica que no se ha encontrado en

ninguno de los microorganismos que componen el dominio bacteria como

formas poligonales o cocos extremadamente irregulares que presentan

algunos hípertermófilos. Se denominaban comúnmente Halobacterias

(actualmente Haloarqueas), y quedan agrupadas en el orden

Halobacteriales con una sola familia, Halobacteriaceae [21].

Este grupo incluye cocos, bacilos y multitud de formas pleomórficas como

las triangulares y cuadradas causando una gran controversia sobre la

relación que existe entre los dominios, sin embargo son llamados halófilos

obligados ya que muestran una estricta dependencia por altas

concentraciones de sal requiriendo al menos un 1,5 M de NaCl para su

crecimiento y estabilidad estructural por ello considerados como halófilos

por excelencia. 21


Hasta hace varios años se pensaba que únicamente las arqueas eran

capaces de habitar dichos ambientes no obstante empleando técnicas de

hibridación in situ por fluorescencia se puso en manifiesto que constituyen

una parte significativa de la microbiota de estos ambientes salinos como

es el caso de la Salinibacter ruber [21].

Esta familia de Halobacteriaceae para sobrevivir a estas limitaciones que

le ofrecen estos ambientes han recurrido a estrategias como por ejemplo

forman vesículas de gas que le permiten flotar hasta la superficie donde la

concentración de oxigeno es mayor, otras utilizan aceptores de electrones

alternativos en la respiración como el nitrato.

Además las colonias de la mayoría de las cepas tienen colores rojizos

debido a la presencia de carotenoides, asimismo toleran bastante bien

temperatura elevadas incluso su temperatura optima de crecimiento para

la mayoría de las arqueas halófilas es de 35-50°C [21].

b) Taxonomía de las bacterias halófilas

Bacterias halófilas extremas

La mayoría de las bacterias halófilas se clasifican como moderadas o

débiles. Es difícil encontrar verdaderas bacterias halófilas extremas, entre

ellas podemos nombrar Acetohalobium arabaticum [22], y también las

especies del genero Halorhodospira [23]. Otro microorganismo halófilo

extremo es el actinomiceto Actinopolyspora halophila [23].

22


Bacterias halófilas moderadas

El orden Halanaerobiales incluye bacilos Gram negativos anaerobios.

Este orden reúne la familia Halanaerobiaceae, con los géneros

Halanaerobium, Halothermothrix y Halocella, y la familia

Halobacteriodaceae, que incluye los géneros Halobacteroides,

Acetohalobium, Haloanaerobacter, Sporohalobacter y Orenia [24].

Excepto Acetohalobium, formado por bacterias halófilas extremas, todos

agrupan a bacterias halófilas moderadas.

Uno de los grupos de microorganismos halófilos moderados más

ampliamente distribuido en las aguas y suelos, independientemente de su

situación geográfica, lo constituyen los miembros del genero Halomonas

[25].

Bacterias halófilas débiles

Se encuentran ampliamente distribuidos en ambientes marinos,

denominándose generalmente bacterias marinas. Desde el punto de vista

taxonómico, se distinguen géneros de bacterias anaerobias facultativas

fermentadoras como Vibrio, Photobacterium, Moritelia y Colwelia,

no fermentadoras o débilmente fermentadoras como Shewanella y

Ferrimonas, y aerobios estrictos, distribuidos en géneros que incluyen

microorganismos halófilos y halotolerantes como Alcanivorax,

Alteromonas, Cycloclasticus, Fundibacter, Gelidibacter, etc.

Algas Halófilas

Hay algas halófilas en el Phylum Chlorophyta, en el orden Volvocables. El

género principal con especies halófilas es Dunaliella y Chlamydomonas.

Ambos son flagelados; la principal distinción morfológica entre ellos es la

carencia de una pared celular en Dunaliella [4].

23


Una diferencia fundamental entre las bacterias y las algas halófilas reside

en la capacidad de las algas para extender sus límites de tolerancia a la

sal, hacia una alta o baja concentración, con la implicación de que esos

límites están determinados en parte por la historia evolutiva del organismo

[4].

Levaduras Halófilas

Estudios fisiológicos con las levaduras marinas han puesto en evidencia

un amplio margen de adaptabilidad en algunas de ellas. Por ejemplo, al

estudiar el efecto de la presión osmótica se encontraron diferentes

respuestas para organismos de los géneros Aurobasidium, Cándida,

Cryptococcus, Debaryomyces y Rhodotorula [4].

Dos estrategias generales de los organismos se han registrado para

sobrevivir en ambientes de alta salinidad: uno es la exclusión de sodio del

citoplasma acumulando grandes cantidades de solutos compatibles para

evitar la pérdida de agua (sodio-excluyentes); otro, el que los organismos

usan y acumulan altas concentraciones de sodio sin que éste represente

un problema de toxicidad para la célula (sodio-incluyentes) [4].

La levadura D. hansenii puede ser aislada de ambientes con baja

actividad de agua o con salinidades relativamente altas, como el medio

marino.

Desde hace más de 30 años se demostró que esta levadura tiene la

capacidad de resistir altas concentraciones de NaCl por lo que

originalmente se le consideró el modelo eucariótico ideal para estudios de

halotolerancia. Posteriormente, se demostró que esta levadura puede

acumular altas concentraciones de Na⁺ intracelular provocando una mejor

funcionalidad bajo diferentes condiciones de estrés, dado que la

acumulación de sodio intracelular, no ejerce algún efecto tóxico en su

metabolismo. 24


Pese a que la D. Hansenii es una levadura sodio incluyente, los primeros

estudios relacionados a su carácter halofílico estuvieron dirigidos a la

producción de glicerol como soluto compatible [4].

CLASIFICACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN FUNCIÓN DE SU

TEMPERATURA ÓPTIMA DE CRECIMIENTO.

Temperatura Descripción

Hipertermófilos Su temperatura óptima de crecimiento está por encima de

los 80ºC y el máximo crecimiento de cultivos puros se ha

llegado a dar entre 110ºC y 113ºC.

Termófilos Crecen por encima de los 45ºC.

Mesófilos Frecuentemente su crecimiento es en rango alrededor de

25 a 45ºC.

Psicrófilos Capaces de crecer por debajo de 5ºC y con temperaturas

máximas de 20ºC , frecuentemente crecen en 10ºC.

Psicrófilos

facultativos

Temperaturas optimas de 15ºC llegando alcanzar los 20

ºC y también capaces de crecer hasta por debajo de 0 ºC.

Tabla 02. Clasificación de los microorganismos en función de su

temperatura optima de crecimiento.

Fuente: Ramírez et al., (2006).

25


ALCALÓFILOS

Los microorganismos alcalófilos son aquellos que viven en ambientes con

pH por encima de 9 y que principalmente se encuentran localizados en

hábitats muy básicos como lagos sódicos y suelos muy carbonatados,

estos para poder sobrevivir a esta condiciones han tenido que aislar el

interior de la célula del medio alcalino exterior ya que algunas moléculas,

especialmente hechas de ARN se rompen a pH superior de 8. Ellas se

protegen por medio de extremoenzimas que se localizan cerca de la

pared celular o por medio de secreciones externas además del

peptidoglicano tienen en su pared celular polímeros cargados

negativamente, los cuales pueden reducir la densidad de la carga en la

superficie de la célula y ayudar a estabilizar la membrana de la célula. La

mayor parte de estos microorganismos pertenecen al género Bacillus y

son también llamados halófilos [6].

26


CAPITULO III

ANTECEDENTES DE LA HIPÓTESIS

La diversidad microbiana es un término general que comprende la

diversidad genética, que es la cantidad y distribución de la información

genética de las especies microbianas; la diversidad de las bacterias y los

hongos que forman parte de las comunidades microbianas; y la diversidad

ecológica, que es la variación en la estructura de las comunidades, la

complejidad de las interacciones, el número de niveles tróficos y el

número de agrupaciones. Así, la diversidad microbiana incluye el número

de las distintas especies bacterianas y fúngicas (riqueza) y su abundancia

relativa en la microflora del suelo [5]. En los ambientes hipersalinos

coexisten microorganismos halófilos pertenecientes a grupos filogenéticos

muy diferentes. Sin embargo su distribución no es precisamente

homogénea sino que existe un claro predominio de unos grupos frente a

otros dependiendo del grado de salinidad del medio [5].

Entre los microorganismos halófilos estudiados hasta la fecha se

encuentran géneros pertenecientes a los tres dominios Eukarya, Bacterias

y Archeas que van a depender de la concentración de sal del medio

donde se encuentren [3].

Dentro de los dominios de bacterias estudiados el primer miembro

reconocido es la Salinibacter ruber descrito por primera vez en las salinas

de Mallorca y Alicante y desde entonces han sido detectadas en múltiples

localizaciones a nivel mundial por su capacidad de crecimiento por debajo

del 16% de NaCl [21].

Otra especie de las bacterias halófilas es la Chromohalobacter salexigens

por su capacidad de síntesis de solutos compatibles en respuesta a los

diferentes tipos de estrés abióticos [20].

27


También la Haloferax mediterranei, arquea halófila tiene la capacidad de

crecer en medios carentes de O2 utilizando glucosa como única fuente de

carbono, cabe destacar dos propiedades de este microorganismo muy

interesante desde el punto biotecnológico.

La primera consiste en la acumulación de cantidades considerables de

polihidroxialcanoato un copolímero que se emplea para la producción de

plásticos biodegradables aunque todavía no se ha comercializado, y la

segunda se basa en la producción de exopolisacáridos que pueden ser

empleados como agentes gelatinizantes, emulsionantes, espesantes

pero su producción a gran escala todavía no se ha iniciado [20].

Así mismo otro dominio encontrado perteneciente a la Eukarya es la

Levadura Halófila Debarynomyces hansenii, siendo interesantes por

competir exitosamente en los medios salinos y resistir a los efectos

desnaturalizantes [4].

28


HIPÓTESIS

Para tratar dar respuesta a esta interrogante, se planteó la siguiente

hipótesis:

Es posible encontrar una diversidad de microorganismos halófilos como

bacterias y hongos; en salinas ubicadas en el Estado Falcón

29


CAPITULO IV

MARCO METODOLOGICO

MATERIALES

Población Muestral

La fuente primaria para determinar la presencia de microorganismos

halófilos fue una muestra sólida de sal cloruro sódico (NaCl),llamada sal

marina debido a que su obtención se tiene por evaporación, se recolecto

una sola muestra sólida de sal y su posterior transporte se realizó de

manera aséptica y adecuada en una bolsa plástica hermética con la

finalidad de preservar la materia prima para evitar alteraciones (Figura

02).

Descripción del área de estudio.

El Estado Falcón está ubicado al noreste del país, entre los 10°18´08",

12°11´46" de latitud Norte y los 68°14´28",71°18´21" de longitud Oeste. El

sitio de investigación se realizó en La salina de Las Cumaraguas ubicada

al noreste de la Península, específicamente en el Municipio Falcón del

Estado Falcón.

Figura 02. Toma de muestras de las salinas.

30

http://es.wikipedia.org/wiki/Cloruro_s%C3%B3dico

http://es.wikipedia.org/wiki/Sodio

http://es.wikipedia.org/wiki/Sodio


Medios de cultivos

En la investigación microbiológica se utilizaron medios de cultivos

deshidratados comerciales, así como los medios preparados directamente

por el fabricante, como los medios Petrifilm. Los medios de cultivos

comerciales utilizados venían deshidratados por lo que se realizó su

hidratación con agua destilada mezclando y calentando ligeramente.

Posteriormente se llevó a cabo la esterilización del medio de cultivo el cual

se utilizó el autoclave a 120 ºC a 20 PSI durante 20 minutos, este método

de autoclavado es el más comúnmente utilizado ya que consiste en la

esterilización con presión de vapor de agua. Una vez concluido el proceso

de esterilización del medio se procedió a sacar y dejar reposar por 1 hora

aproximadamente hasta alcanzar la temperatura ambiente, se vertió en

las placas de petri previamente esterilizadas y se colocaron en la estufa

para su condensación.

Reactivos

Todos los reactivos comerciales presentan diferentes grados de pureza

según las necesidades de la investigación y lo que se pretende realizar es

por ello que los reactivos que se utilizaron fueron de grado analítico ya

que el contenido de ciertas impurezas que este presenta están por debajo

de los límites establecidos por el comité de reactivos analíticos de la

Analytical Chemical Society (ACS), siendo los más adecuados para el

análisis investigativo y químico [38].

31


METODOLOGIA

Tratamiento de la muestra.

A cada una de las muestras de salinas obtenidas se le realizaron

diluciones seriadas con agua peptonada al 0.1 %. Seguidamente se

realizó las determinaciones microbiológicas [27].

Para el análisis microbiológico de esta investigación se prepararon 15

tubos de agua peptonada al 1%y diversos medios de cultivo dentro de los

cuales se encuentra el agar nutriente, el cual se preparó a diferentes

concentraciones de sal que van desde 0%, 3%, 5%, 10%, 15% con la

finalidad de crear diferentes condiciones en el medio de cultivo y así

favorecer el crecimiento a los microorganismos de acuerdo a sus

requerimientos salinos (Tabla 03) (Figura 03).

Nº de placas

Concentración de sal

Agar nutriente

Concentración] de sal (muestra)

mL de agar para el total de

placas

10 0% 5,75 gramos 0 gramos 250 mL

10 3% 5,75 gramos 7,5 gramos 250 mL

10 5% 5,75 gramos 12,5 gramos 250 mL

10 10% 5,75 gramos 25 gramos 250 mL

10 15% 5,75 gramos 37,5 gramos 250 mL

Tabla 03. Preparación del medio de agar nutrientes a diferentes

concentraciones salinas

32


Figura 03. Agua peptonada en diferentes concentraciones.

Aislamiento y Cuantificación de Microorganismos halófilos

presentes

Para el aislamiento de microorganismos halófilos a partir de las muestras

obtenidas se procedió a homogenizar debido a que la muestra se

encontraba de manera sólida por lo cual se añadió 10 gramos de la

muestra a un recipiente con 90 mL de agua peptonada estéril al 0.1%, se

realizó la siembra en agar nutritivo con cloruro de sodio al 1,5%, para

obtener un aislamiento primario; la incubación fue a temperatura ambiente

por una semana

.

En la segunda fase de aislamiento, una vez homogenizada la muestra se

procedió a realizar las diluciones 1:100 y 1:1000 en tubos con agua

peptonada estéril al 0.1%, una vez que se han obtenido las diluciones se

inocularon en los medios de cultivo agar nutriente preparados

anteriormente. Para la siembra se utilizó el método de siembra por

difusión en placa basado en un extendido con una varilla de cristal que

permite esparcir la muestra por toda la superficie del agar quedando así

las bacterias separadas unas de otras, llevando a incubar a 30ºC por 24

horas.

33


Este procedimiento se realizó por duplicado (Figura 04,05).

Se realizó el recuento de las colonias en agar estándar platecount (PCA)

durante un periodo de incubación a 30°C.

Figura 04. Método de siembra por difusión en placa.

Figura 05. Tratamiento y siembra de la muestra salinas.

34


Determinación de la cantidad de Microorganismos heterótrofos

aerobios

Para los microorganismos heterótrofos se utilizó el número más probable

a través de las diluciones. Trascurrido el tiempo de incubación y realizada

la observación en las placas inoculadas el crecimiento microbiano se

realizó los cálculos correspondientes con la finalidad de expresar el

contaje de colonias en placas como unidades formadoras de colonia por

centímetro cuadrado (UFC/cm²).

De acuerdo a esto se llevó a cabo el repique de las colonias presente en

el medio de cultivo de igual forma que en la siembra anterior utilizando

medios de cultivo de diferentes concentraciones salinas (Figura 06).

Posteriormente se realizo pruebas confirmatorias bioquímicas y a su vez

galería API 20NE para la determinación de las bacterias.

Figura 06. Contaje y repique de colonias microbianas.

35


Identificación de los microorganismos aislados

La identificación de los géneros predominantes se realizó mediante la

aplicación de las pruebas API20 NE, específicas para bacterias aerobias

Gram negativas no Enterobacterias.

El API 20 NE BioMérieux es un sistema para la identificación de bacilos

Gram negativos no Enterobacterias. El sistema está estandarizado, y

combina 8 pruebas convencionales y 12 de asimilación. El kit consta de

una galería con 20 microtubos que contienen medios y/o sustratos en

forma deshidratada.

Elaboración de antibiogramas

Se empleo el método de difusión por disco ó método Kirby-Bauer, trata

de una técnica en placa que permite obtener una lectura directa y

determinar la sensibilidad de un agente microbiano frente a la acción de

un antibiótico.

Se inoculó una o varias placas de agar y sobre su superficie se colocaron

los discos correspondientes a varios antibióticos. Se incuban las placas

durante 16-24 horas a 37º C y se estudia el crecimiento en ellas. Su

valoración está en la medición del diámetro de la zona de inhibición que

se forma alrededor de cada disco y se compara con las referencias

oportunas publicadas por la NCCLS, y de esta manera saber si el

microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente a cada uno de los

antibióticos [39].

36

http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo

http://es.wikipedia.org/wiki/Antibi%C3%B3tico


Esquemáticamente se resume en la figura 07 el procedimiento realizado

para la elaboración de los antibiogramas de las cepas aisladas.

Agar Müeller Hinton.

Figura 07. Procedimiento para la realización de antibiogramas

37

Cepas positivas se

inoculan en solución

salina

Comparación

con el patrón

de Mac

Farland

Incubación

a 37°C por

24 horas


CAPITULO V

RESULTADOS

Al realizar el estudio microbiológico de las salinas obtenidas en el Estado

Falcón se pudo identificar el género y especie de los microorganismos

aislados. Se notó la presencia de Chryseomonas luteola en la mayoría de

las muestras estudiadas (Tabla 04) (Figura 08).

Cepa Concentración salina

Microorganismos

4 0 % Chryseomonas luteola 99,9 %



6 3 % Photobacterium dansela 99,8 %

4 3 % Pasteurella spp 83 %

6 3 % Burkholderia cepacia 99,8 %

2 5 % Pseudomonas fluorescens 85,2 %



Tabla 04. Resultados Galería API de estudio microbiológico de salinas

Fuente: Datos obtenidos de los análisis de laboratorio

Figura 08. Pruebas API 20 NE usadas para la identificación de los

géneros de bacterias.

38


En el caso del conteo de colonias, cuyos resultados se exponen en la

tabla 05 podemos indicar lo siguiente: cada una de las cepas en diversas

concentraciones analizadas arrojaron diferentes cantidades de UFC/cm².

Dilución Concentración salina del medio de

cultivo

Nº de colonias (UFC/cm²)

SD 0 % 61 61

1:10 0 % 13 130

1:100 0 % >2.0 x 10³ >2.0 x 10³

SD 3 % 26 26

1:10 3 % 25 250

1:100 3 % >2.0 x 10³ >2.0 x 10³

SD 5 % 70 70

1:10 5 % 9 90

1:100 5 % 6 600

SD 10 % 61 61

Tabla 05. Conteo de colonias.

Fuente: Datos obtenidos de los análisis de laboratorio.

Identificación de Cepas

Para identificar las cepas puras se llevó a cabo el extendido de las

colonias en láminas portaobjeto posteriormente se realizó la tinción de

GRAM el cual es una coloración de tipo diferencial que tiñe a los

microorganismos de acuerdo a su estructura y composición bioquímica

de su pared celular logrando así observar la morfología celular bacteriana

y la diferenciación bacteriana de cada cepa (Tabla 06) (Figura 09).

39



Forma Bacteriana

1 0 % Bacilos Gram positivos y cocos Gram negativos

2 0 % Bacilos Gram negativos *

3 0 % Cocos Gram positivos dispuestos en cadena y racimo

4 0 % Bacilos Gram positivos y cocos Gram negativos

5 0 % Cocos Gram positivos, Bacilos Gram positivos y negativos

6 0 % Bacilos Gram positivos

1 3 % Bacilos y cocos Gram positivos



4 3 % Bacilos y Cocos Gram positivos, Bacilos Gram negativos

6 3 % Bacilos Gram negativos

Tabla 06. Estructura morfológica de los microorganismos. (*)Cepas puras.


40

1 5 % Cocos Gram positivos y negativos

2 5 % Bacilos Gram negativos *

3 5 % Bacilos Gram positivos y negativos


5 5 % Cocos Gram positivos





Figura 09. Coloración GRAM

Se realizó la Siembra de las colonias en agar BHI con el fin de aislar

cepas puras y terminar con el proceso de diferenciación morfológica

(Tabla 07).


Características Gram

1 0 % Blanca, pequeña, lisa

Bacilos Gram negativos y positivos

2 0 % Rosada, pequeña, lisa

Cocos Gram negativos y positivos

3 0 % Amarilla brillante,

pequeña, lisa

Cocos Gram negativos

4 0 % Amarilla, pequeña, cremosa

Bacilos Gram negativos*

1 3 % Amarilla, pequeña, cremosa

Bacilos Gram negativos y positivos


Bacilos Gram negativos *



8 5 % blanca, pequeña,

rugosa


Tabla 07. Características y estructura morfológica de los

microorganismos. 41


De acuerdo a las características microscópicas de la cepa impura n° 9

correspondiente al 3% se notó la presencia de Penicillium spp. (Figura

10).

Figura 10. Penicillium spp al microscopio


Se realizaron pruebas bioquímicas a las cepas puras de bacilos Gram

negativos aisladas para determinar sus características metabólicas y

diferenciar un grupo de bacterias de otras. Los medios utilizados fueron

O/F (Hugh y Leifson), oxidasa (Tabla 08) (Figura 11) [28].

Tabla 08. Pruebas bioquímicas para identificación de enterobacterias.

42

Cepa [ ] salina O/F Oxidasa

2 0 % -/- Negativa

4 0 % -/- Negativa

5 0 % -/- Negativa

2 3 % -/- Negativa

3 3 % -/- Negativa

4 3 % -/- Negativa

6 3 % -/- Negativa

8 5 % -/- Negativa


Figura 11. Pruebas Bioquímicas. O/F

Las pruebas bioquímicas para identificación de cocos Gram positivos

determinaron que eran Staphylococcus coagulasa negativa por los

resultados arrojados, estos microorganismos se caracterizan por no

utilizar el manitol como fuente de energía siendo aerobios y anaerobios

facultativos (Tabla 09) (Figura 12).

Cepa Concentración

salina

Manitol Salado Caldo Nutriente

Coagulasa

3 0 % Cocos Gram positivos no

fermentadores

Crecimiento a las 48 hrs

Negativa


fermentadores

Crecimiento

a las 48 hrs

Negativa


fermentadores

Crecimiento

a las 48 hrs

Negativa


fermentadores

Crecimiento

a

las 48 hrs

Negativa

Tabla 09. Pruebas bioquímicas para identificación del género

Staphylococcus. 43


Figura 12. Medio Manitol salado.

Una vez concluido con las pruebas bioquímicas correspondientes para la

identificación metabólica de las cepas microbianas se procedió a realizar

los respectivos antibiogramas para determinar la actividad y sensibilidad

de los antimicrobianos frente a los microorganismos en acción (Tabla 10

y 11) (Figura 12).

Antibióticos Casa comercial

AmC: Amoxicilina acidoclavulanico 30 μg BectonDickinson

CTX: Cefotaxime 30 μg BenexLimited

CAZ: Ceftazidime 30 μg BectonDickinson

IPM: Imipenem 10 μg BectonDickinson

CIP: Ciprofloxacina 5 μg BectonDickinson

GM: Gentamicina 10μg BectonDickinson

Tabla 10. Antibióticos

44


Antibiótico zona de inhibición (mm) C.

luteola

0-3-5 %

P.

dansela

P.

fluorescens

B.

cepacia

P.

spp

R I S

AmC30 μg ≤13 14 – 17 ≥18 34 44 31 44 36

CTX 30 μg ≤ 14 15 – 22 ≥ 23 R 26 14 26 26

CAZ 30 μg ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 R 26 30 26 26

CIP5 μg ≤ 15 16 – 20 ≥ 21 25 18 34 18 25

IPM10 μg ≤ 13 14 – 15 ≥ 16 36 48 46 48 36

GM10 μg ≤ 12 13 – 14 ≥ 15 26 28 ≥34 28 26

Tabla11. Interpretación de las zonas de inhibición para especies de la

familia Enterobacteriaceae.

Fuente: Clinical and Laboratory Standards Institut, Technical Procedure

Manuals, (2007).

De las 5 bacterias aisladas que presentaron crecimiento bacteriano solo

Chryseomonas luteola resulto ser resistente a los antibióticos cefotaxime

y ceftazidima los cuales son cefalosporinas de 3era generación

pertenecientes al grupo de los β-lactámicos, la Chryseomonas luteola

adquiere parte de su resistencia natural y es que este género por

característica propia son naturalmente resistentes a la mayoría de los

antibióticos relacionados con Monobactámicos y β-lactámicos debido a su

pared celular resistente que contiene porinas proteína formada por

laminas β que a diferencia de otras proteínas de transporte de

membranas, estas son lo suficientemente grandes para permitir procesos

de difusión pasiva y donde se encuentran β-lactamasas enzimas que

hidrolizan el anillo β-lactámico de los antibióticos, de esta manera

destruyen el sitio activo del antibiótico e impiden su actividad.

45

Las β-lactamasas se caracterizan por su capacidad de inhibir

determinados subgrupos de β-lactámicos, es por esto que algunas sub

http://yasalud.com/monobactamicos/

http://yasalud.com/betalactamicos/


clasificaciones las denominan, penicilinasas, cefalosporinasas o

carbapenemasa.

Esta resistencia también se atribuye a las bombas de flujo, que bombean

algunos antibióticos antes de que los antibióticos sean capaces de actuar.

El resto de microorganismos aislados fue sensible para los demás grupos

de antibióticos gran parte de esto corresponde a que ellas a pesar de

habitar estos ambientes salinos y soportar acondiciones extremas no son

microorganismos que ocasionen enfermedad en individuos sanos los

cuales corresponden a los llamados patógenos oportunistas [37].

Figura 13. Antibiograma

46


DISCUSIONES

Al analizar los resultados obtenidos del estudio microbiológico de las

salinas en el estado Falcón podemos afirmar que en este tipo de

ambiente habitan numerosos microorganismos que requieren diferentes

rangos de concentración de sal para su crecimiento óptimo. Gracias a los

resultados obtenidos se pudo demostrar que las muestras analizadas

tuvieron un rango de concentración de sales de 0, 3, 5, 10 y 15%.

Actualmente en Venezuela no se han reportado estudios en los que se

utilicen dichas muestras pero en otros países si se han desarrollado

exitosamente [5].

De lo expuesto anteriormente podemos deducir que hay una estrecha

relación con los resultados obtenidos por González y Peña (2002) donde

demostraron que los microorganismos halófilos cuentan con estrategias

que les permiten enfrentar el estrés osmótico manteniendo altas

concentraciones intracelulares de sal [4].

Actualmente en la Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco se

está realizando un proyecto experimental titulado “Caracterización de

actinomicetos aislados a partir de ambientes hipersalinos” en dicho

proyecto se realizan muestreos en ambientes salinos extremos de

distintas zonas geográficas de México como: lagunas saladas y salinas

costeras, esta investigación tiene como objetivo aportar conocimientos

sobre la diversidad de los actinomicetos halófilos a este país [6].

Trabajos realizados por Consuelo y colbs (2006) valoraron la capacidad

de microorganismos como P. aeruginosa (8), Bacillus(9), y algunos

hongos (10) para remover metales pesados como mercurio, plomo,

cadmio, cobalto, entre otros han evidenciado que los microorganismos

son capaces de cambiar los iones originales y formar complejos.

47


No se conocen reportes científicos en los cuales se haya considerado la

posibilidad de utilizar microorganismos para biorremediar suelos salinos y

sódicos.

La hipótesis de esta investigación fue que microorganismos bacterianos

con capacidad halófila, es decir que dependen para su supervivencia del

sodio, podrían ser utilizados como posibles remediadores de suelos

sódicos y salinos.

Los resultados del presente trabajo arrojaron los siguientes

microorganismos:

Chryseomonas luteola llamada anteriormente Pseudomonas luteola es un

aerobio obligados ya que requieren al menos mínimas condiciones de sal

para su crecimiento. [21] Son Gram-negativos, son de pigmento amarillo

característico a naranja que después de 48 horas de incubación, las

colonias son típicamente áspera o rugosa estos organismo son no

fermentadores, oxidasa negativa, catalasa positiva [31]. Actualmente

constituyen un grupo heterogéneo de patógenos oportunistas que se

encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza y dado a su

obicuidad pueden sobrevivir en aguas destilada, soluciones salinas

superficies húmedas sin embargo no son considerados como patógenos,

pero debido a sus grandes condiciones que han adquirido para sobrevivir

en ambientes hostiles se consideran patógenos intrahospitalararios y

debido a esto han adquirido resistencia a los β- lactámicos como

ampicilina, cefalosporinas [32].

La Pasteurella spp son cocobacilos Gram negativos, que tienen aspecto

bipolar en los frotis, aerobios y anaerobios facultativos, poseen cápsulas y

no esporas. Todas las especies son positivas a oxidasa pero divergen

entre sí en otras reacciones bioquímicas.

48

http://translate.googleusercontent.com/translate_c?depth=1&ei=3h4HUcTrIIP68QSw4oDACw&hl=es&prev=/search%3Fq%3Dchryseomonas%2Bluteola%26hl%3Des%26tbo%3Dd%26biw%3D1280%26bih%3D685&rurl=translate.google.co.ve&sl=en&u=http://www.biomedcentral.com/1471-2334/5/82&usg=ALkJrhgvJl2EiNeF2HwT4R65jjK-ApeI1A#B1


El hábitat de estos microorganismos puede ser el medio ambiente en

general, Los medios de cultivo para este género son el agar-sangre

(donde origina hemolisis) y agar-chocolate. En el BHI da una

característica especial, y es que estas colonias son grises, mucoides y

presentan un olor característico [32,36].

Photobacterium dansela muestra una forma cocobacilar, perteneciente a

la familia Vibrionaceae, halófilos facultativos ya que utilizan otras vías

para obtener energía debido a la ausencia de oxigeno presentan una

series de características fenotípicas los cuales algunas proteínas y

genes están implicados tanto en el metabolismo general y control de los

niveles intracelulares del mismo que le permite modificar su metabolismo

para adaptarse a diferentes condiciones el cual para su crecimiento

óptimo necesita un rango de 160- 280 mmol de iones de Na⁺ así como

también un rango de temperatura que oscila entre 18 y 25 ºC, estudios

anteriores relacionados acerca de los genes implicados y proteínas en la

membrana externa tienen un estudio especial para estudios de

patogenicidad, diagnostico y desarrollo de vacunas [33,34].

Burkholderia cepacia es un bacilo Gram negativo no fermentador, aerobio

facultativo, perteneciente a la familia Psedomonadaceae formado a partir

del género Pseudomonas en función de su ARNr, aunque existe 7

especies de Burkholderia la que tiene acción patógena sobre los seres

humanos es la especie Burkholderia cepacia sin embargo es una

patógeno oportunista, se encuentra distribuido ampliamente en la

naturaleza interviniendo en el proceso de reciclaje de materia orgánica

ellos utilizan como sustancia de reserva el polihidrixibutirato, participa en

el metabolismo energético anaerobio, reduciendo el piruvato (procedente

de la glucólisis) para regenerar el NAD+ que, en presencia de glucosa, es

el sustrato limitante de la vía glucolítica.

49

http://es.wikipedia.org/wiki/Metabolismo

http://es.wikipedia.org/wiki/Anaerobio

http://es.wikipedia.org/wiki/Piruvato

http://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3lisis

http://es.wikipedia.org/wiki/Nicotinamida_adenina_dinucle%C3%B3tido

http://es.wikipedia.org/wiki/Glucosa

http://es.wikipedia.org/wiki/Gluc%C3%B3lisis


Los polihidroxialcalonatos son biopolímeros degradables de naturaleza

lipídica que se acumulan en el citoplasma de algunos microorganismos

cuando están en condiciones desfavorables funcionando como almacén

energético para las células convirtiéndolo en material carbonado cuando

las condiciones ambientales varían. El polidroxibutirato en investigaciones

anteriores se ha determinado que es un biopolímero biodegradable

suscitado como alternativa a las aplicaciones de termoplásticos sintéticos

con propiedades físico mecánicas muy similares al poliéster producido a

partir de petroquímicos como el polipropileno [35,36].

La durabilidad de los plásticos sintéticos en el medio ambiente y el

aumento de los desechos sólidos producto de las sociedades de consumo

han generado gran impacto ambiental generando grandes emisiones de

gases tóxicos y epidemias constituyendo un problema epidemiológico y

estético en la sociedad. Por otra parte la investigación biotecnológica de

enzimas, biopolímeros y diferentes moléculas originados por diversas

especies de microorganismos han arrojados resultados satisfactorios a

nivel del campo industrial aportando un gran interés científico en el

desarrollo de plásticos o materiales biodegradables a partir de fuentes

renovables de energía cuyo fin principal es sustituir gran parte del material

convencional no degradable [2,5,35].

Pseudomonas fluorescens Bacilo Gram negativo no fermentador

aeróbicas provista de un flagelo polar que le confiere movilidad y le

permiten adherirse a las superficies.

50


CAPITULO VI

CONCLUSIONES

Las salinas del estado Falcón cuenta con la presencia de

microorganismos halófilos los cuales se aislaron e identificaron como

bacterias aerobias halófilas débiles debido a su crecimiento a

concentraciones salinas comprendidas entre 0.5 a 10%, tras sembrar en

medios nutrientes modificados con la finalidad de obtener condiciones

similares a las del medio salino, así como también en medios BHI que

permitieron su desarrollo y aislamiento para su posterior identificación

bacteriana [30].

Según la hipótesis planteada, se pudo determinar diversidad de

microorganismos halófilos como bacterias y hongos; en salinas ubicadas

en el Estado Falcón siendo la mayoría de los aislados bacterianos

identificados como especies pertenecientes al género Pseudomonas

como uno de los predominantes en ambientes hipersalinos.

De acuerdo a los antibiogramas realizados para determinar la sensibilidad

y actividad de los antimicrobianos frente a las cepas aisladas se observó

gran sensibilidad a las diferentes clases de antibióticos a los que fueron

expuestos esto debido a que los microorganismos identificados son

microbiota habitual que colonizan un amplio rango de nichos el cual

representan un bajo riesgo para el hombre por su bajo rol patógeno frente

a ellos.

No obstante, el hecho que en la investigación se determinó un pequeño

margen de microorganismos se concluye que la población microbiana en

estos ambientes salinos es baja, de acuerdo al estudio, los resultados

arrojados y sus diferencias metabólicas con respecto a los requerimientos

salinos conducen a pensar que hay mayor diversidad que proporcionaran

un gran interés para las aplicaciones Biotecnológicas.

51


RECOMENDACIONES

Realizar estudios sobre las bacterias halófilas y sus aplicaciones

biotecnológicas.

Revisar aspectos relacionados con su ecología en los ambientes

hipersalinos y sus características como microorganismos

extremófilos.

Realizar estudios de caracterización molecular específicamente en

los aislados del género Chryseomonas identificados, ya que

presentan las mejores características deseables para los fines del

presente proyecto.

52


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Brisou J, Curtois D, Denis F. Microbiological Study of a Hypersaline

Lake in French Somaliland. Applied Microbiology (1974) May; 27 (5):

819-822.

2. Ventosa A, and Nieto J.J. Biotechnological applications and

potentialities of halophilic microorganisms. World J. Microbiol. Biotech

(1995); 11: 85-94.

3. Ramírez N, Sandoval AH, Serrano JA. Las bacterias halófilas y sus

aplicaciones biotecnológicas. Rev. Soc. Microbiol. (2004)Jan; 24 (1-2):

12-23.

4. González J, and Peña A. Estrategias de adaptación de

microorganismos halófilos y Debaryomyces hansenii (Levadura

halófila). Rev. Latinoam Microbiol(2002) July-September. October-

December; 44 (3-4): 137-156.

5. Meseguer I. Los Microorganismos Halófilos y su potencial aplicado en

Biotecnología. Ciencia e Investigación (2004) (2): 13-17.

6. Ramírez N, Serrano J, Sandoval H. Microorganismos Extremófilos.

Actinomicetos Halófilos en México. Revista Mexicana de Ciencias

Farmacéuticas (2006) Julio-Septiembre; 37 (03): 56-71.

7. Gunde N, Zalar P, de Hoog S, Plemenitas A. Hypersaline waters in

salterns-natural ecological niches for halophilic black yeasts. FEMS

Microbiology Ecology March (2000); (32): 235-240.

53


8. Brock, T.D. Microbial growth under extreme conditions. Symp. Soc.

Gen. Microbiol(1969) (19): 15-42.

9. Horikoshi, K. A new microbiol World-Extremophiles; (1997) 1:1.

10. Javor, B. Hypersaline environments: microbioloy and biogeochemistry.

Springer-Verlang KG, Berlín (1989).

11. Fitter, A.H., Hay. P.K.H. Environmental physiology of plants. Academia

Press. London. 256-259 (1987).

12. Margalef, R. Limnología. (1983) Revista de Biología Tropical.

Barcelona 1010p.

13. Brock, Madigan, Martinko, Parker.Biología de los microorganismos,

8va, Prentice Hall, capítulos 4 y 5 (2000).

14. Kushner, D.J., Kamekura M. Physiology of halophilic eubacteria. En:

Halophilic bacteria. Rodríguez-Valera, F. (Ed), pp. 109-138 (1988).

15. Galinski, E.A. Osmoadaptation in bacteria. Adv. Microbiol. Phisiology.

(1995) 37: 273-328.

16. Gómez, P., A. Barriga, A. Cifuentes & M. González. Effect of salinity on

the quantity and quality of carotenoids accumulated by Dunaliella

salina (strain CONC-007) and Dunaliella bardawil (strain ATCC 30861).

2003. Biol. Res. 36: 185-192.

17. Oren, A. Bioenergetics aspects of halophilism. Microbiol. Mol. Biol.

Rev; 1999. 63: 334-348.

54


18. Ollivier, B., Caumette, P., Garcia, J.L., Mah, R.A. Anaerobic bacteria

from hypersaline environments 1994; Microbiol. Rev. 58: 27-38.

19. Baldwin, W.W., Sheu, M.J.T., Bankston, P.w. y Worldringh, C.L.

Changes in bouyant density and cell size of Escherichia coli in

response to osmótica shocks. 1988. J. Bacteriol. 170: 452-455.

20. Russel, N.J., Adams. R.L. Effect of salinity on membrane lipids and

membrane-derived oligosaccharides. En: General and applied aspects

of halophilic microorganismo. Rodríguez-Valera. F. (Ed), pp. 225-231.

Plenum Press. New York(1991).

21. Grant, W.D., Larsen, H. Group III. Extremely halophilic

archaeobacteria. Order Halobacteriales. En: Bergey`s Manual of

Systematic Bacteriology. Staley. J.T., Bryant, M.P., Pfenning. N. y Holt,

J.G. (Eds), pp. 2216-2233.(1989).

22. Zhilina, T.N., Zavarin. G.A. Methanohalo biumevestigatus, n. gen., n.

sp. Theextremely halophilic methanogenic Archaebacterium. Dokl.

Akad. Nauk 293: 464-468.(1996)

23. Imhoff, J. F. Osmotic adaptation in halophilic and halotolerant

microrganism. En: The biology of halophilic bacteria. Vreeland, R.H. Y

Hochstein, LI. (Eds). Pp. 211-253.(2002)

24. Rainey, F.A., Zilina, T.N., Boulygina, E.S., Stackebrandt, E., Tourova,

T.P., Zavarin, G.A. The taxonomic study of the fermentative halophilic

bacteria: description of Haloanaerobiales ord. (1995); Nov.,

Halobacteriaceae fam. Nov., Orenia gen. And further taxonomic

Rearrangements at the genus and species level. Anaerobe. 1: 185-

199.

55


25. Arahal, D.R., Castillo, A.M., Ludwig. W., Scheleifer, K.H., Ventosa, A.

Proposal of Cobetia marina gen. Nov., comb. Nov., within the family

Halomonadaceae, to include the species Halomonas marina. (2002);

Sist. Appl. Microbiol. 25: 207-211.

26. Sampieri H. R. y colbs. Metodología de la investigación. Tercera

edición McGraw – Hill Interamericana. México (2003).

27. Ayala P. Aislamiento, caracterización parcial y perfil de producción

enzimática de bacterias halófilas y halotolerantes de la laguna

Chairkota, Potosí-Bolivia. Tesis de Pregrado. Centro de Biotecnología-

Universidad Mayor de San Simón(2005).

28. Latorre N. Evaluación de medios de cultivo altos y bajos en nutrientes

para la recuperación de heterótrofos edáficos en la eco región cafetera

de los Andes. Tesis de Pregrado. Potificia Universidad Javeriana

(2007).

29. Consuelo L y colbs. Capacidad de bacterias halófilas para capturar

sodio in Vitro y su posible aplicación en bioremediación en suelos

salinos sódicos. Tesis de Pregrado. Universidad Militar Nueva

Granada (2006).

30. Alexander, M. Biodegradation and Bioremediation. Segundaedición.

AcademicPress, Inc., San Diego (1999).

31. Holmes B, AG Steigerwalt, Weaver RE, Brenner DJ: Chryseomona

speine luteola. noviembre y Flavimonas oryzihabitans. Int J Syst

Bacteriol 1987, 37: 245-250.

56


32. Chihab W, Alaoui AS, Amar M. Chryseomonas luteola identificado

como la fuente de infección grave en el hospital de la Universidad de

Marruecos. J Clin Microbiol 2004; 42:1837-9

33. Clarke, T. E., Tari, L. W. & Vogel, H. J. (2001). Structural biology of

bacterial iron uptake systems. Curr. Top Med. Chem. 1, 7-30.

34. Rivas, A, Caracterización genética de factores de virulencia en

Photobacterium damselae: bases moleculares de la actividad

hemolítica, Madrid-España. Tesis Doctoral. Departamento de

Microbiología y Parasitología Instituto de Acuicultura-Facultad de

Biología (2012).

35. Lee. S. Y. Plastic bacteria progress and prospects for

polyhydroxyalkanoate production in bacteria. Trends in Biotechnology

14: p.431- 438 (1996).

36. Mahenthiralingam, E., T. A. Urban y J. B. Goldberd. The multifarious,

multireplicon Burkholderia cepacia Complex. Nature Review Microbiol.

(2005) 3:144- 156.

37. Arias C, Panesso D, Zuñiga M. Guías para el uso racional de

antibióticos β-lactámicos: mecanismos de resistencia y su

interpretación clínica. Biomédica (2003); 23:134-40.

38. OSPINA, L.V. Manual de laboratorio de Química. 3ed. Medellín:

Escuela de Ingeniería de Antioquia, (2005).

39. NCCLS. Clinical and Laboratory Standards Institute, Technical

Procedure Manuals; Approved Guideline—Fourth Edition. NCCLS

document M100-S17, Vol. 27 Nº 17: p 32-41.USA (2007).

57

estudio microbiologico de las salinas en el estado falcÓn

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