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Estudio Espectroscópico para
Identificar y Cuantificar Capsaicina
en la Especie Capsicum Annumm
Por
Manuel Abraham López Pacheco
Tesis sometida como requisito parcial para obtener el
grado de:
DOCTOR EN CIENCIAS EN LA ESPECIALIDAD
DE ÓPTICA
En el
Instituto Nacional de Astrofísica, Óptica y Electrónica
Febrero 2017
Tonantzintla, Puebla
Director:
Dr. José Javier Báez Rojas
Codirector:
Dr. Jorge Castro Ramos
Departamento de Óptica
INAOE 2017
Resumen
El objetivo de este trabajo de tesis doctoral es aportar marco teórico y diseño
experimental, que permita entender los espectros de absorción y reflexión difusa de
la capsaicina de forma aislada y directa en chiles, para diseñar un método
clasificador de frutos capsicum annum según su concentración de capsaicina de
forma rápida.
La respuesta espectral de la capsaicina en el rango visible tiene picos muy
característicos, lo cual facilita identificar la presencia de ésta molécula en
mediciones directas en chiles, conjuntamente se corrobora la distribución de la
capsaicina en los frutos ya que la teoría indica, que sólo está presente en algunas
partes de estos. El primer procedimiento experimental sólo se empleó una
oleorresina con capsaicina de uso alimentario, se diseñó un experimento partiendo
de concentraciones conocidas, con el objetivo de comprender la respuesta espectral
de ésta substancia, y finalmente recuperar analíticamente los valores de estas
concentraciones iniciales, realizando un procedimiento estadístico.
De las mediciones realizadas directamente en frutos capsicum annum usando
reflexión difusa, se cotejó las curvas ya medidas de la oleorresina mencionada y del
extracto de éstos frutos, haciendo una correlación de picos característicos en las
muestras medidas. Es importante destacar que los picos característicos
identificados no se ven obstruidos por la presencia de otras sustancias presentes
en los frutos analizados. Finalmente se proporciona un método que permitió
clasificar de forma sencilla las curvas medidas directamente, con alta y baja
concentración de capsaicina. La utilidad de esta propuesta de clasificación puede
verse reflejado en disminuir el tiempo de análisis y los costos de otras metodologías
ya existentes.
ii
Agradecimientos
A los contribuyentes de este hermoso país, que por medio de sus aportaciones y al
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), la asignación de la beca
económica para poder desarrollar la tesis doctoral. Al Doctor José Báez Rojas por
apoyar la idea de investigación de tesis y por su dirección haciendo aportaciones en
el desarrollo experimental y teórico. Al doctor Jorge castro Ramos por su paciencia
y dirección de la tesis. Al Doctor José Alberto Delgado Atencio que con sus
enseñanzas me introdujo al mundo de la aplicación de la espectroscopía. A todo el
personal de Instituto Nacional de Astrofísica Óptica y Electrónica por facilitar los
servicios durante mi estancia en este lugar de investigación.
iii
Dedicatoria
A mis padres Yadira y Juan Manuel
Por darme su amor desde el día que nací, el apoyo moral y material, ya que sin ellos
avanzar hasta donde hoy lo estoy haciendo no hubiese sido imposible.
A mi esposa Alma Delia
Por su amor, compresión y apoyo que han sido y son un pilar, siendo de mis
principales motivos para concluir esta etapa de mi vida profesional.
A mis hijos Taiyari y Balam
Por su alegría que me contagiaron en esos días cuando el camino se veía muy
largo, pero al final ellos agregaron esa sal y pimienta a mi vida y me propulsaron a
concluir la tesis.
A mi hermano Raúl
Siempre un ejemplo de vida para mí, me enseñó a ser perseverante y no darte por
vencido a pesar de lo complicada que sean las metas que me propuse.
Y a mi abuela Elena
Me hubiera hecho muy feliz verte entre el público recibiendo mi grado de Doctor
iv
Índice Resumen ................................................................................................................. i
Agradecimientos ..................................................................................................... ii
Dedicatoria ............................................................................................................. iii
Prefacio .................................................................................................................. vi
Capítulo 1: Marco Teórico del Objeto de Estudio: Propiedades Físicas, Químicas
y Ópticas de la Capsaicina ..................................................................................... 9
1.1. Introducción .............................................................................................. 9
1.2. Anatomía de los frutos capsicum ssp ...................................................... 10
1.3. Propiedades Físicas y Químicas de la Capsaicina .................................. 11
1.4. Propiedades Ópticas de la Capsaicina .................................................... 12
1.5. Hipótesis ................................................................................................. 15
1.6. Objetivos ................................................................................................. 15
1.7. Justificación ............................................................................................ 15
Capítulo 2: Marco Teórico de las Bases de Absorción y Esparcimiento para un
Medio Aleatorio y métodos matemáticos de ajuste de datos experimentales ....... 16
2.1 Introducción ............................................................................................ 16
2.2 Absorción de la luz .................................................................................. 16
2.3 Teoría de Kubelka-Munk ......................................................................... 18
2.4 Teoría de Ajuste por Mínimos cuadrados ................................................ 21
2.4.1 Ajuste modelo lineal.......................................................................... 22
2.4.2 Análisis de dos colas ........................................................................ 23
2.4.3 Ajuste a un modelo de grado n ......................................................... 24
2.4.4 Bondad de Ajuste ............................................................................. 25
2.5 Discusión ................................................................................................ 27
v
Capítulo 3: Aplicación de espectroscopía de absorción y reflexión difusa en
capsaicina 29
3.1 Introducción ............................................................................................ 29
3.2 Cálculo del Coeficiente de Extinción ....................................................... 30
3.3 Materiales y Métodos (Espectroscopía de Absorción) ............................. 31
3.3.1 Preparación de Muestras de Capsaicina .......................................... 31
3.3.2 Toma de Espectros de Absorción ..................................................... 31
3.4 Resultados Experimentales ..................................................................... 33
3.4.1 Espectros de Absorción .................................................................... 33
3.5 Resultados Estadísticos .......................................................................... 35
3.5.1 Resultados de Ajuste de modelo lineal ............................................. 35
3.5.2 Error Estadístico ............................................................................... 37
3.5.3 Análisis de dos colas ........................................................................ 39
3.6 Espectros de Reflexión difusa ................................................................. 40
vi
Prefacio
Clasificar materiales de forma rápida de acuerdo su composición química utilizando
técnicas que tomen poco tiempo de ejecución, ha sido un tópico de interés de
muchas investigaciones. En la actualidad las algunas investigaciones se orientan a
proponer técnicas para identificar o cuantificar sustancias usando teorías ópticas.
Una de las más usadas es la espectroscopía, ya que permite dar de forma cualitativa
y cuantitativa el estado de algún material o substancia que sea de interés a
investigar. Estas se han sido aplicadas en áreas como la química, biología por
mencionar algunas.
Basándose en la luz cuando interactúa con un medio que se considera de aleatorio,
es decir está compuesto por pequeñas partículas embebidas e un medio con índices
de refracción diferentes entre partícula y medio. La luz se somete a procesos de
absorción y esparcimiento, debido a que cada material tiene características que son
su coeficiente de absorción y esparcimiento. Estas propiedades permiten calcular la
concentración de la sustancia que se desea estudiar además de identificar.
En este trabajo se analizó la capsaicina, ésta es una de las moléculas activas de los
capsicum annum que produce pungencia en la boca. Además posee propiedades
antinflamatorias por lo cual ha sido aplicado en área de la medicina. Por tal razón
algunas investigaciones has sido encausadas generar recursos filogenéticos, para
maximizar la producción de capsaicina en algunas especies de chiles. La
complicación que se han encontrado al momento de determinar si el objetivo se ha
logrado en este tipo de trabajos, es cuantificar la cantidad de capsaicina, ya que los
métodos existentes normalmente toman mucho tiempo y también son de costos
altos. En el actual trabajo de tesis se propone una metodología ocupando la
espectroscopía para clasificar chiles con alta o baja concentración de capsaicina.
Para lograr el objetivo de la tesis. Se inicia explicando la absorción de la luz por un
medio, usando la ley de Lamber-Beer y la relación que existe con un su modelo
vii
matemático. La otra teoría consultada para lograr parte de los objetivos particulares
es la función de reemisión de Kubelka-Munk y también el modelo matemático que
la respalda. Del mismo modo se explican los modelos de ajuste usados para el
análisis de datos experimentales. Por otra parte se establecen las condiciones bajo
las cuales se establecen los límites del diseño experimental.
Los materiales de cualquier índole tienen la capacidad de reflejar, absorber o
transmitir luz que incide sobre ellos. La teoría básica y más usada para entender
cómo y medir la cantidad de luz que absorbe y transmite un medio es la ley Empírica
de Lambert-Beer. Esta teoría relaciona la luz incidente con el coeficiente de
absorción de un medio y su espesor para poder determinar la intensidad de luz
transmitida. De las variantes existentes, en ésta tesis se usa la relación de absorción
en función del mencionado coeficiente y la concentración del medio, que como ya
se mencionó es la capsaicina. En algunos casos medir luz transmitida puede ser
complicado, por la naturaleza del objeto de estudio que se desea analizar.
Para medir la luz que se regresa, es decir para el caso de un medio aleatorio el
término más propio es el retro-esparcimiento, la función de re-emisión de Kubelka-
Munk, es un modelo teórico usado para establecer relación entre concentración y
luz retro-esparcida lo que facilita analizar un medio de forma rápida. En la parte
estadística se utilizó análisis por ajuste de mínimos cuadrados, ajustar datos es
necesario para entender en qué medida los datos se acoplan a los modelos físicos.
También dentro del análisis estadístico se calcula el error y la confianza con la que
los modelos pueden ser utilizados para predicciones futuras.
Los diseños experimentales están sustentados en la ley de Lambert-Beer y la
función de re-emisión de Kubelka-Munk. El análisis estadístico se aplicó método de
mínimos cuadrado para modelos: lineal y de orden n. De este análisis se calculó los
coeficientes de absorción y los coeficientes para el modelo de re-emisión de la
capsaicina. Al mismo tiempo del ajuste de datos, permite analizar parámetros que
permite asegurar que los datos experimentales son descritos por los modelos
teóricos propuestos en la tesis
viii
Las aportaciones de la tesis al estudio y análisis de la capsaicina utilizando técnicas
espectroscópicas son: modelo óptico que permita establecer relación entre curvas
de reflexión difusa, en una parte del rango visible, y la concentración de la
capsaicina. Además de reportar los espectros característicos de absorción, reflexión
de la molécula ya mencionada y un comparativo con mediciones directas en los
frutos capsicum annum, mostrando que a pesar de presencia de otras substancias
en los chiles, las señal de molécula no se ve obstruida por éstas. Conjuntamente el
desarrollo de códigos en MATLAB® para un análisis multi-espectral de ajuste de
datos. Así mismo un diseño experimental que permite analizar muestras líquidas sin
exponer la integridad del equipo de laboratorio garantizando confiabilidad del 100%.
Al mismo tiempo del ajuste de datos, permite analizar parámetros que permite
asegurar que los datos experimentales son descritos por los modelos teóricos
propuestos en la tesis.
Finalmente se concluye proponiendo un método de clasificación simple de chiles,
usando las características ópticas mencionadas y las curvas obtenidas del análisis
de la capsaicina de forma aislada. De las curvas medidas directamente en chiles,
del extracto de capsaicina de éstos, cabe destacar que para la longitud de 663nm
se mantiene un espectro característico en la oleorresina de uso alimentario, los
chiles y del extracto, la técnica es útil para reconocer la molécula de la capsaicina y
clasificar altas concentraciones de ésta en los chiles.
9
Capítulo 1: Marco Teórico del Objeto de Estudio:
Propiedades Físicas, Químicas y Ópticas de la
Capsaicina
1.1. Introducción
En la naturaleza existen moléculas activas que por sus propiedades se utilizan en
el área de la medicina, alimentación o en mejoramiento genético. Dentro de toda
esta gama se encuentra la capsaicina. Esta molécula está presente en los frutos
Capsicum ssp, (Chiles), es una de las sustancias presentes en los chiles, que
causan pungencia en la boca que al ser ingerido, por otra parte es derivado por la
planta como defensa de depredadores [1]. Además la capsaicina ha sido sugerida
por algunos investigadores su uso para la prevención del cáncer de próstata [2].
También en el caso de la medicina, es usada como ungüento para reducir los
efectos de la psoriasis [3]. Por tal motivo dicha molécula ha sido analizada en
distintas áreas de investigación. Para lograrlo se han utilizado distintas técnicas.
Habitualmente la más común es la espectroscopía [4]. Para alcanzar dichos logros
es necesario identificar de nuestro analito sus propiedades físicas, químicas de éste.
En ésta sección de la tesis se hace una revisión de la anatomía de los frutos
capsicum ssp, así como de las mencionadas propiedades de la capsaicina. Este
primer capítulo se explica la temática de la tesis. Se menciona brevemente la teoría
y técnica experimentales con las cuales se realizó la investigación de tesis doctoral.
También la hipótesis, justificación y objetivos de la tesis.
10
1.2. Anatomía de los frutos capsicum ssp
En el entendimiento de nuestro objeto de estudio se revisó la bibliografía
relacionada a la taxonomía de los frutos capsicum ssp con el fin de localizar la
distribución de la capsaicina. Éstos frutos pueden ser de diferente color tamaño, a
pesar de esto su composición es la siguiente, las paredes de dichos frutos están
compuesto por una capa externa cerosa denominada exocarpio, ésta cubre una
capa carnosa de nombre endocarpio y finalmente al interior de ésta capa está el
mesocarpio. Al partir un fruto capsicum por la mitad se encuentran en la parte más
cercana al rabo (cáliz) se localiza la placenta, en ella inicia el crecimiento de las
glándulas (venas) y también las semillas [5], Figura 2.1.
Figura 1.1 Anatomía frutos capsicum [6].
11
De acuerdo con investigaciones realizadas la capsaicina no sólo es única molécula
activa en dichos frutos. También se encuentran otros tipos de capsaicinoides que
son Nornorcapsaicina, Norcapsaicina, Homocapsaicina, Nornordihydrocapsaicina,
Dihydrocapsaicina Homodihydrocapsaicna y la ya mencionada capsaicina que es
nuestro objeto a caracterizar ópticamente. La presencia de estas comparadas con
la capsaicina no supera aproximadamente el 20%. Es decir la capsaicina es la de
mayor porcentaje presente en los frutos capsicum ssp [6]. En el actual trabajo sólo
nos concentraremos en la de mayor presencia que es la capsaicina.
1.3. Propiedades Físicas y Químicas de la Capsaicina
La expresión molecular de la capsaicina es 8-Metyl-N-Vanillyl-trans-6-nonamida y
su fórmula química se escribe C18-H27-N-O3 [7]. Irritante al contacto con cualquier
parte de cuerpo humano y antibacteriana. En su estado puro no puede ser ingerida
o inhalada. En su estado puro es granulosa y de apariencia cristalina inodora y color
blanco. Para el caso en su estado natural proveniente del capsicum es una
oleorresina de color marrón obscuro. Posee un peso molecular de 305.42 g/mol. Su
estado de ebullición es a los 220°C y su estado de fusión es a los 65°C [8]. La
capsaicina además es hidrofóbica, sus solventes naturales son la acetona, el etanol
por mencionar algunos.
12
Figura 1.2 [a] Fórmula molecular de la capsaicina, [b] Capsaicina en estado puro.
1.4. Propiedades Ópticas de la Capsaicina
Metodologías basadas en teorías de interacción con medio aleatorio han sido de
gran ayuda para identificar y cuantificar sustancias. Para el caso de nuestro objeto
de estudio la capsaicina ha sido estudiada y reportada su alta absorción en el rango
ultravioleta λmax= (227nm, 281nm) [7]. Con ésta información ha sido posible
cuantificar extractos de capsaicina proveniente de los frutos o productos que usan
como sustancia activa la capsaicina debido a sus propiedades curativas [9]. Usando
diferentes métodos de extracción algunos investigadores han reportado que la
capsaicina tiene curvas de absorción muy bien definida para zonas de Ultravioleta
[10].
13
Figura 1.3 Espectro UV/Visible para la capsaicina, Grafica arriba, mismo rango espectral para la
dihydrocapsaicina, Grafica lado abajo [11]
Para el caso de cuantificación se ha aplicado técnicas que usan información óptica
como la mencionada anteriormente. Por mencionar una de éstas aplicaciones se
comparó la cantidad de capsaicina de diferentes tipos de frutos capsicum logrando
determinar con gran precisión el contenido de ésta sustancia [12]. También para el
caso del visible se ha reportado que la capsaicina tiene un pico de absorción, donde
se resalta el hecho que las curvas de absorción dependen del tamaño de la partícula
de la muestra [13].
14
Figura 1.4 Espectro en intensidad de capsaicina pura y de chile en polvo a diferentes tamaños de grano.
De las técnicas existentes, la capsaicina ha sido analizada aplicando
espectroscopía de absorción [14], y lograron cuantificar el porcentaje de capsaicina
y su grado de pungencia. Además se reporta que esta molecular tiene un pico de
absorción en un ancho de banda entre los 400nm y 500nm. De acuerdo a la
información, debido al hecho que se analizaron muestras granulosas, los espectros
medidos bajo espectroscopía de absorción, mostraron un inconveniente, ya que al
usar retro-esparcimiento, este miso efecto óptico genera que se vean opacadas, ya
que el tamaño de partícula influye en los espectros recolectados. En efecto se
reporta como cambian las señales por la influencia del tamaño de la partícula.
Además la metodología usada depende de homogenizar las muestras, ya que el
cambio de camino óptico influye en las lecturas para el cálculo de concentración.
En la mayoría de las investigaciones se aplican técnicas estadísticas para
correlacionar el comportamiento de los datos experimentales a un modelo
matemático [15]. El propósito de ésta es conocer datos de interés para la
investigación. Se pueden seguir dos caminos resolver el problema directo, es decir
15
con todas las variables controladas predecir el resultado experimental final,
aplicando el modelo matemático asociado. La otra opción el proceso inverso, a partir
de mediciones experimentales identificar alguna de las variables que se desean
obtener.
1.5. Hipótesis
Mediante el uso de técnicas ópticas proveer un método que permita clasificar chiles
con baja o alta concentración de capsaicina.
1.6. Objetivos
Realizar una caracterización de espectros de absorción reflexión de la capsaicina
para comparar con mediciones de reflexión difusa directa en chiles.
1.7. Justificación
En la actualidad se carece de métodos que permitan clasificar chiles con alta o baja
concentración e capsaicina que no implique alto costo y además pueden tomar
mucho tiempo.
16
Capítulo 2: Marco Teórico de las Bases de Absorción y
Esparcimiento para un Medio Aleatorio y métodos
matemáticos de ajuste de datos
experimentalesIntroducción
En la óptica existe teoría que permiten entender cómo un medio al ser irradiado por
alguna o muchas longitudes de onda, éstas pueden ser absorbidas o cambiar su
dirección de propagación respecto a la de incidencia, a lo cual se le conoce
comúnmente como esparcimiento, después de interactuar con las partículas del
medio en cuestión. De las primeras teorías establecidas es la ley de Lambert-Beer
la cual describe como un medio absorbe la luz con que es iluminado [16]. Por otra
parte para la luz que es esparcida esta la teoría de Kubelka-Munk que no sólo se
enfoca en dicho fenómeno de la luz, también influye la absorción [17]. En la física
experimental es necesario relacionar los datos obtenidos con modelos teóricos que
permitan validar que el trabajo realizado se comporta de acuerdo a la teoría
establecida. Una de las técnicas habitualmente aplicadas es el uso de mínimos
cuadrados. Ésta técnica minimiza la diferencia entre el modelo matemático y los
datos experimentales. Además es posible calcular el error asociado al experimento
[18]. Todo éste análisis es posible realizarlo con precisión utilizando programas
computacionales, que permiten programar las ecuaciones necesarias para ajustar
datos y calcular la información necesaria [19]. En el desarrollo de éste capítulo se
muestra el marco teórico utilizado para analizar los chiles (capsicum annum) y la
capsaicina.
2.2 Absorción de la luz
Toda la materia responde al estímulo ocasionado por ondas electromagnéticas, a la
cual en adelante la referiremos como luz. La absorción de ondas de luz permite
17
establecer parámetros físicos para caracterizar y cuantificar sustancias. La Ley
empírica de Lambert-Beer asocia la luz absorbida con la cantidad de sustancia
presente en nuestro objeto de estudio [20]. Dicha ley consiste en lo siguiente se
irradia un objeto con un ancho finito y se mide la luz que logra transmitirse figura
2.1. Con ésta información se establece una ecuación en la cual la luz transmitida
está en función de la luz incidente y la intensidad emergente [21].
Figura 2.1 Esquema de la Ley empírica de Lambert-Beer.
Ecuación 2—1
𝑇 =𝐼
𝐼0
Donde T es la cantidad de luz transmitida, I0 es la intensidad incidente e I es la
intensidad transmitida. La resolución a la ecuación 2--1 es:
Ecuación 2—2
𝐴 = − log 𝑇 = log𝐼0
𝐼
Donde A es la absorción del medio.
Ecuación 2—3
∴ 𝐼 = 𝐼0𝑒𝐴
18
Por otra parte la absorbancia se define de la siguiente manera:
Ecuación 2—4
𝐴 = 휀𝑐𝑙
Donde ε es el coeficiente de absorción, c es la concentración y 𝒍 es el ancho del
medio conocido como el camino óptico. La ley de Lambert-Beer se puede asociar a
un modelo matemático sencillo, es decir una la línea recta que pasa por el origen,
considerando la pendiente el coeficiente de extinción, la concentración cómo la
variable independiente y tomando como constante el camino óptico [22].
2.3 Teoría de Kubelka-Munk
Un medio turbio se define como un medio dónde la luz se somete a procesos de
absorción y esparcimiento. La teoría de Kubelka-Munk permite analizar éstos en
dependencia de sus propiedades ópticas y luz que incide sobre el medio [17]. Una
de las particularidades de ésta teoría es la función de reemisión. Se considera un
medio semi-infinito en el cual incide un haz de luz el cual se distribuye casi uniforme
mente dentro de éste Fig. 2.2. Se considera una intensidad viajando hacia adelante
I y otra en la dirección opuesta J. Para resolver este problema se establecen un par
de ecuaciones diferenciales dónde como variable dependiente es la luz
retransmitida [23].
19
Figura 2.2 Esquema representativo para el retro-esparcimiento de luz según la Función de re-emisión de Kubelka-Munk
Se considera un diferencial del medio y se establecen las siguientes ecuaciones:
Ecuación 2—5
𝑑𝐼 = −(𝑘′ + 𝑠)𝐼𝑑𝑥 + 𝑠𝐽𝑑𝑥
Ecuación 2—6
𝑑𝐽 = (𝑘′ + 𝑠)𝐽𝑑𝑥 − 𝑠𝐼𝑑𝑥
Donde dI y dJ son diferencial de intensidad hacia adelante y retro-esparcida
respectivamente. k’ es la absorción del medio y s el esparcimiento del mismo. En la
ecuación 2.5 la intensidad dI sufre pérdidas por absorción y esparcimiento
representados en primer término de ésta ecuación. Pero al mismo tiempo gana
intensidad debido a dJ por el esparcimiento del medio. El signo negativo es
consecuencia del sistema de referencia propuesto. Algo análogo sucede para dJ
con signos opuestos ya que viaja en sentido contrario a dI. Por otra parte de
teniendo la expresión para la Reflectancia las ecuaciones 2.5 y 2.6 pueden ser
reescrita y realizar una diferencia entre ellas para simplificar la solución del
problema.
20
Ecuación 2—7
𝑅 =𝐽
𝐼⇒ 𝐽 = 𝐼𝑅
Ecuación 2—8
𝑑𝐽 = 𝑑𝐼𝑅
Ecuación 2—9
𝑑𝐼
𝑑𝑥= −(𝑘′ + 𝑠)𝐼 + 𝑠𝑅𝐼
Ecuación 2—10
− [𝑑𝐼
𝑑𝑥= (𝑘′ + 𝑠)𝐼 − 𝑠
𝐼
𝑅]
Ecuación 2—11
(1 − 𝑅)2
2𝑅=
𝑘′
𝑠
Donde R es la reflexión difusa del medio. La ecuación 2.11 es conocida como la
función de re-emisión de Kubelka-Munk. La cual tiene por solución exacta la
siguiente expresión matemática.
Ecuación 2—12
𝑅 = 1 +𝑘′
𝑠− [(
𝑘′
𝑠)
2
+ 2𝑘′
𝑠]
12
Suponiendo que el medio es poco absorbente el término al cuadrado se puede
despreciar y reescribir la ecuación 2.12.
Ecuación 2—13
𝑅 = 1 − (2𝑘′
𝑠)
12
+𝑘′
𝑠
Ésta última expresión es proporcional a la ley de Lambert-Beer considerando la
absorción k’= ε c [24]. La ecuación anterior podemos rescribir la como un polinomio
21
de grado 2 y a los coeficientes asignarles nomenclatura más sencilla, con un cambio
de variable 𝑥 = − (2𝑘′
𝑠𝑐)
1
2.
Ecuación 2—14
𝑅 = 𝑎0 + 𝑎1𝑐 + 𝑎2𝑐2
Donde 𝒂𝟎 = 𝟏, 𝒂𝟏 = − (𝟐𝜺
𝒔)
𝟏
𝟐 y 𝒂𝟐 =
𝜺
𝒔. De esa manera c es igual a concentración. Y
se puede ajustar a un polinomio de grado dos. La ventaja consiste que el ajuste es
un sistema de ecuaciones 3x3.
2.4 Teoría de Ajuste por Mínimos cuadrados
El ajuste por mínimos cuadrados es un método estadístico que permite relacionar
un modelo matemático a una serie de datos experimentales. El objetivo consiste en
minimizar la distancia entre el punto experimental yi y la ecuación propuesta f (xi) y
debido que deseamos se la mínima distancia esta diferencia se eleva al cuadrado.
Para completar la solución del método se aplica el criterio de la segunda derivada
para lograr el objetivo del método, que es encontrar el mínimo error posible [25].
Dicha diferencia para una serie de datos se puede definir de la siguiente manera:
Ecuación 2—15
𝐸 = ∑ 휀𝑖2
𝑛
1
= ∑(𝑦𝑖 − 𝑓(𝑥𝑖))2
𝑛
1
22
2.4.1 Ajuste modelo lineal
El caso más sencillo es ajuste a una línea recta, ya que el objetivo es calcular los
coeficientes desconocidos como la pendiente y la intersección al eje de las
ordenadas [26].
Ecuación 2—16
𝐸 = ∑ 휀𝑖2
𝑛
1
= ∑(𝑦𝑖 − (𝑎𝑖 + 𝑏))2
𝑛
1
Donde a es la pendiente y b la intersección al eje de las ordenadas. Para calcularlas
se hace lo siguiente, se calculan las derivadas parciales respecto a a y b:
Ecuación 2—17
𝛿𝐸
𝛿𝑎= 0
Ecuación 2—18
𝛿𝐸
𝛿𝑏= 0
Las expresiones para los coeficientes mencionados son:
Ecuación 2—19
𝑎 =𝑛 ∑ 𝑥𝑖𝑦𝑖−
𝑛1 (∑ 𝑥𝑖
𝑛1 )(∑ 𝑦𝑖
𝑛1 )
∑ 𝑥𝑖2 − (∑ 𝑥𝑖
𝑛1 )2𝑛
1
Ecuación 2—20
𝑏 =𝑛 ∑ 𝑦𝑖−
𝑛1 𝑎 ∑ 𝑥𝑖
𝑛1
𝑛
Donde n es el número de datos. También es posible calcular el error asociado al
computado de estos coeficientes [15].
Ecuación 2—21
∆𝑎 =√𝑛𝜎
√∑ 𝑥𝑖2 − (∑ 𝑥𝑖
𝑛1 )2𝑛
1
23
Ecuación 2—22
∆𝑏 = ∆𝑎 √∑ 𝑥𝑖2
𝑛
1
Donde σ es la desviación estándar:
Ecuación 2—23
𝜎 = √(𝑦𝑖 − (𝑎𝑖 + 𝑏))2
𝑛 − 2
Para corroborar si nuestras datos se ajustan a un modelo lineal se calcular el
coeficiente de correlación. Este valor indica el grado de dependencia entre las
variables x y y. se calcula con al siguiente expresión.
Ecuación 2—24
𝑟 =∑ (𝑥𝑖 − 𝑥)𝑛
1 ∑ (𝑦𝑖 − 𝑦)𝑛1
√∑ (𝑥𝑖 − 𝑥)𝑛1
2 √∑ (𝑦𝑖 − 𝑦)𝑛1
2
Donde 𝑥 y 𝑦 son los valores promedio. El valor del coeficiente de correlación puede
tomar los siguientes valores.
Si r=1, la correlación el lineal y los datos se ajustan perfectamente a la línea recta
con pendiente positiva [26].
Si r=-1, de igual manera la correlación el lineal y los datos se ajustan perfectamente
a la línea recta con pendiente negativa.
Si r=0, la correlación es nula, es decir no existe correlación entre los datos x y y.
2.4.2 Análisis de dos colas
En la teoría de ajuste de modelos lineales el análisis de dos colas es un método
muy utilizado para determinar el grado de confianza del ajuste realizado a los datos
24
experimentales. Basado en rechazar la hipótesis nula, es decir que el valor
experimental menos el teórico sea diferente de cero. Se le denomina de dos colas
ya que de un ajuste lineal se pueden obtener pendientes positivas y negativas,
debido a esto el análisis de dos colas considera ambos casos. La fórmula se
muestra a continuación:
Ecuación 2—25
𝑡 =|𝑟|√𝑛 − 2
√1 − 𝑟2
Donde r es el coeficiente de correlación n el número de datos, dependiendo el valor
de t, se consulta la tabla de valores asociado al porcentaje y así saber el grado de
confianza [27].
2.4.3 Ajuste a un modelo de grado n
Partiendo de la ecuación 2.14 se reescribe considerando la función f (xi) se define
como polinomio de grado n [15]:
Ecuación 2—26
𝑓(𝑥𝑖) = 𝑃(𝑥) = 𝑎0 + 𝑎1𝑥 + 𝑎2𝑥2 … +𝑎𝑛𝑥𝑛
El valor E se define de la siguiente manera:
Ecuación 2—27
𝐸 = ∑ 휀𝑖2
𝑛
1
= ∑(𝑃(𝑥) − 𝑦𝑖)2 =
𝑛
1
∑(𝑎0 + 𝑎1𝑥 + 𝑎2𝑥2 … +𝑎𝑛𝑥𝑛 − 𝑦𝑖)2
𝑛
1
En este caso para calcular los coeficientes an se calculan las derivadas parciales de
E respecto a dichos valores y se igualan a cero.
Ecuación 2—28
𝜕𝐸
2𝜕𝑎0= ∑(𝑎1𝑥 + 𝑎2𝑥2 … +𝑎𝑛𝑥𝑛 − 𝑦𝑖) = 0
𝑛
1
25
Ecuación 2—29
…𝜕𝐸
2𝜕𝑎𝑛= ∑(𝑎0 + 𝑎1𝑥 + 𝑎2𝑥2 … + 𝑥𝑛 − 𝑦𝑖)𝑥𝑛 = 0
𝑛
1
Se obtiene un sistema de n ecuaciones, para éste trabajo de tesis nos
concentraremos en un polinomio de grado 2 el cual se reduce a un sistema de
ecuaciones 3x3.
2.4.4 Bondad de Ajuste
Análogamente para ajustes que no son lineales como el mencionado en la sección
2.4.2 se puede evaluar que tan bueno es el ajuste aplicado a la serie de datos
experimentales. Se efectúan cuatro pruebas las que a continuación se definen y
describen [19].
2.4.4.1 Suma de cuadrados debido al error:
Esta prueba mide la desviación total entre el valor experimental y el teórico. También
es conocida como la suma del cuadrado de los residuos y sus prefijos en ingles son
(SSE, Sum of Square due to Error). Esta prueba se calcula de la siguiente manera.
Ecuación 2—30
𝑆𝑆𝐸 =1
𝑛∑ 휀𝑖
2
𝑛
1
=1
𝑛∑(𝑦𝑖 − 𝑓(𝑥𝑖))2
𝑛
1
Donde n es el número de datos yi colección de datos experimentales y f (xi) el
modelo teórico propuesto. Valores cercanos a cero indica que el modelo ajustado
tiene poco error aleatorio y éste será muy útil para predicciones futuras.
26
2.4.4.2 R-Cuadrado:
Es el cuadrado del coeficiente de correlación, ésta se define a partir de otras dos
cantidades, suma de cuadrados de regresión (SSR) y suma total de los cuadrados
(SST):
Ecuación 2—31
𝑆𝑆𝑅 =1
𝑛∑(𝑓(𝑥𝑖) − 𝑦)2 ⟶ (3.29),
𝑛
1
𝑆𝑆𝑇 =1
𝑛∑(𝑦𝑖 − 𝑦)2
𝑛
1
Donde a su vez SST=SSR+SSE, que ya fueron definidos en la ecuación 2.28y 2.29
respectivamente, finalmente:
Ecuación 2—32
𝑅 − 𝑆𝑞𝑢𝑎𝑟𝑒 =𝑆𝑆𝑅
𝑆𝑆𝑇= 1 −
𝑆𝑆𝐸
𝑆𝑆𝑇
El valor de esta prueba puede tomar valores entre 0 y 1. Se asocia directamente el
porcentaje de datos que se ajustan al modelo teórico.
2.4.4.3 R-Cuadrado Ajustada:
De las pruebas es el mejor indicador respectos a la calidad de ajuste de datos
experimentales. Se define con la siguiente expresión matemática.
Ecuación 2—33
𝑎𝑑𝑗𝑢𝑠𝑡𝑒𝑑 𝑅 − 𝑠𝑞𝑢𝑎𝑟𝑒 = 1 −𝑆𝑆𝐸(𝑛−1)
𝑆𝑆𝑇𝑣
Ecuación 2—34
𝑣 = 𝑛 − 𝑚
Donde v se define como la diferencia entre el número de datos n y m los valores
calculados por el modelo. Esta expresión puede tomar valores menores o iguales a
1. Valores cercanos a 1 indican un buen ajuste.
27
2.4.4.4 Error Raíz Cuadrada Promedio:
Se denomina error estándar de ajuste promedio. Habitualmente conocido por sus
siglas en inglés (RMSE: Root Mean Squared Error). Ésta prueba calcula la
desviación estándar de los valores aleatorios en los datos y se define como:
Ecuación 2—35
𝑅𝑀𝑆𝐸 = √𝑀𝑆𝐸
Donde MSE se define de la siguiente manera: 𝑀𝑆𝐸 =𝑆𝑆𝐸
𝑣. Valores cercanos a cero
indican que el modelo es útil para la predicción.
2.5 Discusión
Entender el objeto de estudio, implica revisar teoría que establezca una relación
matemática con el comportamiento experimental de éste y así poder calcular
parámetros que son de nuestro interés. La ley de Lambert-Beer es de las leyes
empíricas más útiles para poder calcular el coeficiente de extinción, el coeficiente
de extinción indica en que parte del espectro de radiación electromagnético el
material absorbe dichas radiaciones, es una propiedad óptica intrínseca de cada
material ya que este es como una huella digital de éste. La absorción depende
directamente de éste valor óptico, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer aumenta
a medida que incrementa la concentración de nuestro material. Pare el caso de esta
tesis calcular el coeficiente de absorción, es de gran utilidad puesto que, se tendrá
la seguridad en que parte del espectro visible la luz, que es el que se propone en el
trabajo actual, incidente se verá atenuada debido a este efecto, por lo cual pensar
en aplicar teoría de retro-esparcimiento no sería de gran utilidad, por el contrario
también se podrá asegurar en que partes si de este espectro, sí es posible aplicar
estas teoría de retro-esparcimiento, garantizando que éste tipo de luz pues ser
utilizad para calcular datos de interés, como la concentración. Los aspectos que se
deben cuida para diseñar un experimento eficiente es utilizar concentraciones bajas
y que la longitud de camino óptico sea constante, así, el valor a calcular sólo será
28
el coeficiente de absorción. Además las muestras para evitar cambios significativos
entre muestras se requiere que el medio sea homogéneo y que se garantice que
sólo estamos obteniendo es espectro de absorción de nuestro material que es la
capsaicina.
De acuerdo a las precauciones que se deben tomar para garantizar que el
experimento se realiza con gran exactitud, en el caso de las teorías de retro-
esparcimiento, tener un medio homogéneo garantiza que las señales medidas no
se ven afectadas por el tamaño de partícula que compone al medio. En la teoría de
la función de re-emisión de Kubelka-Munk debemos asegurar el hecho que nuestro
material tiene valores de absorción baja para así poder utilizar un expresión de esta
ecuación y establecer un modelo que relaciones las señales de reflexión difusa con
la concentración. Además se tiene que diseñar un montaje experimental en el que
sólo se asegure sólo estar midiendo las señales debida a la interacción de la luz con
la capsaicina. Las teorías de ajuste se utilizadas son ajuste por mínimos cuadrados
para resolver el problema de forma directa, es decir se propone un diseño en el cual
se controlaran las concentraciones y el espesor de la muestra, cabe resaltar que
para lograr los objetivos descrito se utilizar dos técnicas experimentales que se
describen en el capítulo siguiente y que al mismo tiempo se basan en las
suposiciones que marca la teoría.
29
Capítulo 3: Aplicación de Espectroscopía de
Absorción y Reflexión Difusa en Capsaicina
3.1 Introducción
El análisis de sustancias ha sido tópico de interés para investigadores quienes
continúan mejorando éstas. De las más utilizadas esta la espectroscopía de
absorción y Reflexión Difusa. La espectroscopía de Absorción se basa en la ley de
Lambert-Beer y permite obtener información como la concentración o el coeficiente
de absorción. Para la otra técnica la teoría de Kubelka-Munk es de gran utilidad ya
que con la luz que es retro-emitida también es posible identificar y cuantificar la
sustancia de nuestro interés [28]. Para sustentar el trabajo experimental es
necesario utilizar procedimientos de ajuste estadístico para corrobora que los datos
experimentales pueden se descritos ampliamente con el modelo matemático
propuesto [27]. El desarrollo de éste capítulo consiste en la descripción de los
materiales y métodos así como es método de ajuste basado en un programa
computacional para analizar los datos experimentales.
30
3.2 Cálculo del Coeficiente de Extinción
Como ya se había mencionado la ley de Lambert-Beer en el capítulo 2 de éste
trabajo de investigación es un resultado empírico que establece la relación entre la
intensidad luz transmitida, el ancho de nuestra muestra y la cantidad de ésa en
nuestro contenedor. De ésta ley retomaremos lo siguiente la ecuación 2.4. Ésta
expresión matemática es se puede aproximar a una línea recta de la siguiente
manera.
Ecuación 3—1
𝑦 = 𝑚𝑥 + 𝑏
Ecuación 2—9
𝐴 = 휀𝑐𝑙
Dónde A=y, m=ε y c=x y para nuestro caso el ancho de la muestra l será una
constante igual a 1. Para el caso de la intersección de las ordenadas en la ley de
Lambert-Beer es una expresión matemática que carece de éste término es decir es
una línea recta que intersecta al origen. El objetivo de ésta experimentación será
calcular el coeficiente de extinción, con mínimo de error posible, aplicando
espectroscopía de absorción basada en la Ley de Lambert-Beer.
31
3.3 Materiales y Métodos (Espectroscopía de Absorción)
3.3.1 Preparación de Muestras de Capsaicina
Para este trabajo de investigación se utilizó una oleorresina con capsaicina de uso
alimentario y se prepararon muestras de baja concentración ocupando la relación
[29]:
Ecuación 3—2
𝑐 =𝑚𝑎𝑠𝑎
𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑥 100%
Se utilizó una báscula de precisión se inició la preparación de las muestras pesando
la oleorresina a partir de 0.01 gr hasta 0.1 gr y con uso de jeringa comercial de
10mL, se midió el volumen de etanol de grado analítico y así se prepararon las
muestras de 0.1% hasta 1%. Esto se hizo tres veces para completar 3 conjuntos de
muestras independientes. Por cada concentración se tienen tres muestras
independientes completando un total de 30 muestras.
3.3.2 Toma de Espectros de Absorción
Las muestras líquidas se colocaron en cubetas de cuarzo de longitud 1 centímetro,
cada muestra se midió en diez ocasiones. El montaje experimental se muestra en
la siguiente imagen.
32
Figura 3.1 Montaje experimental para espectroscopía de absorción.
De la compañía Ocean Optics se utilizó el espectrómetro modelo USB-4000 el cual
en su interior cuenta con un detector Toshiba modelo TCD134AP (a), con una
resolución de 0.2nm, además una fuente modelo HL-2000 (b) con un ancho
espectral de 360nm hasta 2000nm también un atenuador modelo FVA-UV (c) y
finalmente un sujetador de cubetas modelo CUV-UV (d). Todo el montaje mostrado
en la figura está conectado por medio de fibras ópticas de la siguiente manera. Del
espectrómetro al atenuador se tiene conectada una fibra óptica modelo P50-2-
UV/VIS (e), del atenuador al sujetador de cubetas y de éste a la fuente dos fibras
modelo P600-2-SR (f, f’). El espectrómetro es controlado vía USB por medio de una
computadora con el Software SpectraSuite (g). El procedimiento fue el siguiente
primero se colocó una cubeta sólo con etanol de grado analítico, calibrando el
sistema en cero y garantizar que sólo el espectro obtenido es el de la capsaicina
disuelta. Posteriormente se inició la medición de cada una de las concentraciones,
repitiendo el proceso diez veces por cada una de éstas, es decir al fina por cada
experimento se tienen 10 medicines por concentración lo que da un total de 30 por
todo el procedimiento. Figura 3.2.
33
Figura 3.2 Cubeta sólo con etanol izquierda, cubeta con muestra de capsaicina
disuelta derecha.
3.4 Resultados Experimentales
3.4.1 Espectros de Absorción
Con las 30 curvas de absorción para cada concentración, se hizo un grafica
promedio las cuales se muestran en la figura .3.3
Figura 3.3 Espectros promedio de Absorción de capsaicina a diferentes concentraciones.
34
Los espectros muestran entre los 350nm y los 500nm fuerte absorción para éste
ancho de banda. A medida que la concentración incrementa en éste mismo rango
espectral la definición de éstas graficas van perdiéndose. Justo a los 500nm las
curvas de forma cualitativa no pierden su forma. Entre ésta última longitud de onda
a los 700nm el comportamiento decreciente es general para todos los espectros de
absorción. Además para todas las curvas a los 663.1nm aparece otro pico de
absorción que a medida que la concentración aumente este pico se más intenso,
debido a este comportamiento de las gráficas se decidió trabajar en la zona de los
500nm a los 700 ya que en éstas zonas las curvas fueron suaves y la intensidad de
la señal era lo suficientemente buena para aplicar un análisis estadístico, a medida
que la concentración crece.
Figura 3.4 Parte del espectro visible usado para el cálculo del coeficiente de absorción.
Con la ayuda de un programa computacional se desarrolló un sencillo código que
permitió leer por longitud de onda los valores de absorción vs concentración y se
obtuvieron graficas como se muestran a continuación. En total se hizo el ajuste para
1004 longitudes de onda para el ancho espectral mostrado en la figura 3.4
35
Figura 3.5 Grafica muestra de datos experimentales Absorción vs Concentración.
Ya que el código ha leído la información se procede a ajustar los datos
experimentales al modelo lineal de la ley de Lambert-Beer usando mínimos
cuadrados. La información obtenida con éste método son el valor de la intersección
con las abscisas, el coeficiente de correlación y la pendiente de la recta que se
asocia directamente al coeficiente de extinción.
3.5 Resultados Estadísticos
3.5.1 Resultados de Ajuste de modelo lineal
De acuerdo con la ley de Lambert-Beer, es un modelo lineal que intersecta el origen,
la pendiente es el coeficiente de extinción y la correlación permite ver que tan cerca
están los datos de un comportamiento lineal. Cada dato se obtuvo para cada
longitud de onda a continuación se muestran las gráficas de los datos obtenido para
todo el rango espectral seleccionado.
36
Figura 3.6 Grafica de intersección de cada ajuste al eje de la Absorbancia.
Figura 3.7 Ésta grafica representa la pendiente calculada para cada longitud de onda y se
asocia directamente al coeficiente de extinción.
37
Figura 3.8 Grafica del coeficiente de correlación de cada línea ajustada.
En la figura 3.7 se aprecia que los valores de intersección para los 500nm inician
alrededor del valor de 0.5 y decrece hasta el valor de 0.05 para los 540nm, a partir
de aquí los valores de estos datos están cerca del cero y toman valores negativos
sin dejar de estar en una vecindad cercana al cero. La figura 3.8 se encuentran los
resultaos del coeficiente de correlación, y de acuerdo a la teoría valores cercanos a
uno significa que los datos experimentales tienen un comportamiento lineal.
3.5.2 Error Estadístico
De acuerdo a las ecuaciones 2.19 y 2.20 de capítulo anterior se hizo el caculo de
los errores asociados a la pendiente y la intersección con la ordenada para todo el
rango espectral a continuación se muestran la imágenes de los datos obtenidos.
38
Figura 3.9 En esta gráfica en el intervalo espectral de 500nm a 520 el error es muy grande inicia alrededor de 0.2 y decrece hasta 0.05 posteriormente de los 520nm hasta
los 700nm el error se mantiene por debajo de 0.05.
Figura 3.10 En ésta grafica se puede apreciar que el error inicia en 0.3 para 500nm posteriormente decrece hasta 0.12 para 520nm, a partir de ésta última longitud de onda hasta los 700nm los valores del error se mantienen por debajo de 0.1, es decir el valor
para
39
3.5.3 Análisis de dos colas
Comparar el resultado teórico contra el experimental es otra manera de comprobar
la cantidad de error después de ajustar datos experimentales a un modelo teórico,
para nuestro caso se hizo el análisis de dos colas basado en la hipótesis nula a el
coeficiente de correlación los resultados se muestran en la siguiente gráfica [27].
Figura 3.11 Grado de confianza, en esta gráfica se muestran los resultado del análisis de dos colas
aplicado al coeficiente de correlación, se puede apreciar que el la confianza es mayor al 95%, esto
implica que la mayoría de los datos tiene un comportamiento lineal de acuerdo al a ley de Lambert
Beer.
40
3.6 Espectros de Reflexión difusa
Las mismas muestras se midieron utilizando espectroscopía de reflexión difusa,
para realizar esta parte de la investigación el mismo espectrómetro y lámpara ya
descritos, el montaje se describe a continuación. Ahora se conectó al espectrómetro
una fibra bifurcada de la compañía Ocean Optics modelo R600-7-UV-125F, con
rango espectral Ultravioleta-Visible. En total se tienes 7 fibras de 600 micras de
diámetro. Uno de los brazo tiene 6 fibras conectadas a la fuente de luz, la restante
recolecta la luz retro-esparcida y es conducida al espectrómetro. Las cubetas con
la capsaicina se dispusieron en una configuración tipo SANDWICH que permitió
obtener señales de retro-esparcimiento con buena intensidad. Usando un sujetador
de punta de prueba se fijó un Spectralon la cubeta. En la siguiente figura se muestra
dicha configuración.
Figura 3.12 Montaje experimental usado para medir la capsaicina usando reflexión difusa.
Para realizar la calibración primero se colocó una cubeta llena con etanol
posteriormente cada concentración se midió diez veces, de este modo se obtuvieron
la misma cantidad de espectros como lo fue para el caso de absorción. En la
41
siguiente figura 3.13 se muestra cómo se realizó el proceso de calibración y
medición de las concertación y detallando la configuración implementada para la
investigación.
Figura 3.13 En esta figura se muestra un diagrama de la configuración sándwich y del proceso de calibración.
Los espectros promedio se muestran a continuación
Figura 3.14 Espectros de reflexión difusa de las muestras de capsaicina a diferentes
concentraciones
De la figura anterior se aprecia que para el intervalo de los 350nm a los 500nm la
intensidad de reflexión es muy débil, es decir las líneas se mantienen cerca del 0%,
42
esto se puede asociar al hecho que en ése mismo intervalo la absorción mostrada
anteriormente es muy fuerte lo que explica el tener señales débiles de reflexión
difusa. Posterior mente de los 500nm a los 700nm la señal crece en intensidad y
alcanza un máximo a los 640nm y a los 664nmhay un mínimo que disminuye en
intensidad a medida que la concentración crece, a partir de ésta última longitud de
onda las intensidades para todas las curvas crecen hasta alcanza un máximo a los
700nm, de aquí en adelante la reflexión difusa tiene intensidades mayores al 60%
para todas las concentraciones. .
Para realizar el ajuste de datos el modelo establecido por la función de re-emisión
de Kubelka-Munk sólo se usó el rengo espectral de lo 500nm hasta los 700nm. Por
cada longitud de inda del rango espectral ya mencionado usando un código similar
al descrito para el ajuste lineal también por cada longitud de onda se realizó una
lectura para obtener graficas Reflexión Difusa vs Concentración.
Figura 3.15 En esta grafica se muestra el rango espectral analizado, se puede apreciar el cambio de la intensidad a medida que la concentración decrece en función de la longitud
de onda.
43
Figura 3.16 se muestra las lecturas realizadas de los 500nm a los 700nm cada 10 longitudes de onda de Reflexión difusa vs Concentración.
Los datos experimentarles se ajustaron por cada longitud de onda usando el
modelo descrito por la ecuación 2.15 del capítulo anterior, este código ahora usa la
ecuación de re-emisión, también se ajustaron para las 1004 longitudes de onda. En
la siguiente figura se muestran los datos calculados de los coeficientes por cada
longitud de onda. La curva roja es para el coeficiente 𝑎00, las verde al coeficiente
𝑎1 y finalmente la azul para 𝑎2. De la figura 3.17 se aprecia que la línea roja entre
los 500nm y hasta los 560nm los valores inician cercanos a cero y posteriormente
crece hasta 0.98, de aquí en adelante los valores están cerca del 1. Para el caso de
la línea verde, todos los valores son negativos para todo el rango espectral, por otra
parte la línea azul de los 500nm hasta los 670nm los valores son positivos y a partir
de esta longitud de onda se vuelven negativos.
44
Figura 3.17 En esta grafica se encuentran los coeficientes calculados ocupando el ajuste del modelo no lineal
Como ya explico previamente, el coeficiente de correlación provee una media
cualitativa de que tan parecido es el comportamiento de los datos experimentales al
modelo matemático propuesto para describir el comportamiento de algún fenómeno
físico. Para el caso analizado en esta parte de la tesis doctoral se muestra el
coeficiente de correlación obtenido para cada ajuste en el rango espectral ya
mencionado. Se puede ver en la gráfica de la figura 3.17 entre los 500nm y 560nm
el valor de este coeficiente parte de un valor cercano a 0.55 y crece
pronunciadamente hasta un valor de 0.95, a partir de estos 560nm hasta los 700nm
los valores son cercanos a uno.
45
Figura 3.18 Gráfico de Coeficiente de Correlación, esta curva muestra el grado de similitud entre los datos experimentales y el modelo matemático
Para esta sección de la investigación el ajuste usado fue para un modelo de grado
n, explicado en la sección 2.4.1 de la teoría de ajuste. Por tal razón también es
necesario ver el grado de error con el que el ajuste fue hecho. En la siguiente figura
3.19 se puede apreciar cuatro curvas. La de color rojo se asocia a la suma de
cuadrados asociado al error, este parámetro indica que valores cercanos a cero el
modelo tiene un error aleatorio bajo. Para la línea verde de acuerdo a la teoría puede
el R-Square pude tomar valores entre cero y uno, los más cercanos a uno es
muestra que los datos experimentales se ajustan al modelo teórico, para la línea
azul los valores pueden estar entre cero y uno, valores cercanos a uno indican un
buen ajuste, la línea negra provee el valor de utilidad para predecir valores fuera de
los datos usados para el ajuste entre más cercanos a cero el modelo es más útil
para predecir datos fuera del rango analizado. Las cuatro graficas entre los 500nm
y 560nm es la zona donde el modelo para predecir el retro-esparcimiento para la
capsaicina es menos confiable, de a partir de esta última longitud de onda hasta los
700nm la confianza de utilidad del modelo es mayor al 95%.
46
Figura 3.19 Resultados estadísticos de la bondad de ajuste, todos estos gráficos muestran la precisión entre los datos experimentales y el análisis estadístico.
Finalmente se hizo el cálculo para recuperación inicial por cada medición realizada
ocupando la espectroscopía de reflexión difusa. Es decir se desarrolló un pequeño
código para utilizar en Matlab y construir por cada longitud de onda su
correspondiente función de reemisión, el cambio ahora es considerar como
incógnita a encontrar la concentración, esto implica resolver una ecuación de
segundo grado. Por lo tanto resulta cada ecuación los valores se deben parecer al
valor inicial por concentración para todo el rango espectral analizado. En la siguiente
grafica en tres dimensiones se muestra el cálculo hecho para cada concentración
usando el modelo propuesto.
47
Figura 3.20 Este gráfico muestra la concentración recuperada para algunas longitudes de onda
Para verificar que la concentración inicial fue recuperada con buena precisión, se
utilizó la fórmula de error porcentual.
Ecuación 3—3
𝜕 = |𝑉𝑡 − 𝑉𝑒
𝑉𝑡| × 100%
Donde 𝑉𝑡 es el valor teórico y 𝑉𝑒 es el valor experimental. Los resultados se muestran
en la gráfica de la figura 3.20, se puede apreciar para el rango espectral las
concentraciones con mayor erro porcentual fueron para las de 0.1%,0.2% y 0.3%,
con valores de error entre el 2% y 17%, en cambio para las demás concentraciones
desde 0.4% hasta 1%, el error para todas las concentraciones no es superior al 1%,
es más el intervalo de longitudes con mayor error esta entre los 500 y 560nm que
es congruente a los datos estadísticas ya descritos.
48
Figura 3.21 Gráfico para el porcentaje de error para diferentes longitudes de onda a la correspondiente concentración recuperada.
Figura 3.22 En esta figura se muestra la un acercamiento a las zonas de error de la figure 3.27.
49
Capítulo 4: Mediciones directas y en extracto de
capsaicina de chile jalapeño
4.1 Materiales y Métodos
Se midieron veinte muestras de chile jalapeño. Las mediciones se realizaron en la
glándula y la placenta, que de acuerdo a la bibliografía consultada estas son las
zonas con mayor concentración de capsaicina [4], es decir que la presencia de
capsaicina en el chile debe tener picos en longitudes de onda similares a los ya
medidos. Las muestras se cortaron tratando de respetar la zona de la glándula.
Debido a la naturaleza de la muestras en alguna de ellas el mesocarpio quedó sin
glándula. El equipo utilizado ya fue descrito en la sección anterior usándolo en modo
reflexión difusa. Las mediciones se hicieron en cinco puntos en la siguiente figura
se ilustra los zonas elegidas.
Figura 4.1 En la imagen se indican con colores la zona donde ese colocó la punta de prueba.
50
Esta elección de zonas y colores fue aplicada a todas las muestras de chile
usadas. Los colores rojo azul y verde están sobre la placenta, el rojo es el más
cercano al rabo del chile el verde es justo donde termina la placenta e inicia la
glándula, el azul corresponde al punto medio de los dos ya mencionados y es
evidente que se localiza en la placenta. El punto negro es el punto medio entre la
punta y el fina l dela placenta sobre la glándula. Finalmente el punto cian se localizó
justo en el final de la placenta cerca de la punta de los chiles. La punta de prueba
se colocó de forma superficial procurando no hendirla más de lo permitido por la
resistencia de la muestra para evitar cambios en las propiedades física que
implicaría cambios en las curvas de reflexión difusa. De acuerdo a la teoría la
concentración de capsaicina es mayor en la placenta en la parte más cercana al
rabo y su porcentaje disminuye a medida que se avanza hacia l punta.
4.2 Resultados Experimentales
La muestras al ser cortadas de algunas se obtuvieron tres glándulas y de otras 4
glándulas. Además de las que se obtuvieron 4 piezas algunas la glándula no
permaneció en la zona y se quedó sin placenta a pesar de eso e hizo la medición.
A continuación se muestran los resultados resumidos de las mediciones hechas a
20 muestras con la técnica ya descrita.
51
Figura 4.2 Espectros típicos de las muestra de chile con toda la glándula intacta. Como puede verse, la presencia de capsaicina es el rango de longitud de onda de 400nm a
500nmm debido a la absorción, por ésta razón en esta parte las señales casi cero.
Figura 4.3 en esta imagen se muestran los espectros ya típicos de la glándula, a excepción de una de a piezas obtenidas no tiene glándula a todo lo largo, esto se refleja
in un espectro de absorción casi cero, grafica color cian de menor intensidad.
52
Figura 4.4 En ésta imagen se muestran graficas representativas de espectros típicos de glándula de capsaicina para muestras de color rojizo.
Los resultados obtenidos muestran una correlación cualitativa comparándolo con la
sustancia analizada de forma aislada, todas las curvas rojas corresponde al a zona
de la placenta cerca del rabo. Entre los 400 nanómetros y 500 nanómetros la
reflexión difusa lo que muestra la presencia de capsaicina es decir es una zona de
alta absorción que no se ve opacada por la presencia de alguna otra sustancia
presente en el chile. Además en la zona de los 500 nanómetros hasta los 600
nanómetros, las curvas decrecen y presentan picos de mínima reflexión difusa a los
663nm, llegando a los 700nm todas las curvas incrementan la señal de reflexión
difusa posteriormente alcanzando un máximo y a partir de ésta última longitud de
onda hasta los 1100nm la reflexión va disminuyendo hasta un mínimo a los 920nm
posteriormente la señal se vuelve ruidosa debido que la intensidad de la fuente en
esta zona es débil para confirmar que las lecturas son l suficiente confiables para
conjeturar información importante.
Posterior a realizar las mediciones se extrajeron la placenta y glándulas se
separando del mesocarpio. Se hizo proceso de macerado utilizando etanol puro
para extraer la capsaicina. Si inició un proceso de medición usando espectroscopia
de absorción y reflexión difusa similar al de muestras liquidas descritas en el capítulo
4. Se hicieron mediciones a las 24, 48 y 74 horas. A continuación de muestran los
resultados de éstas mediciones.
53
Figura 4.5 Esta es la curva de absorción del extracto de los 20 chiles medidos. Como ya se había descrito entre los 400nm y 500nm la capsaicina tiene un ancho de banda característico, cabe destacar que también a
los 663nm se tiene un pico característico de absorción.
Figura 4.6 Graficas de reflexión difusa para el extracto de capsaicina. La más intensa corresponde a la medición 24 horas después de haber sido extraída la capsaicina, la curva de color verde a las 48 horas y
finalmente la azul para 72 horas
Estas curvas muestran la absorción y reflexión difusa del extracto de capsaicina de
las muestras de chile jalapeño. En ambas graficas ente los 400nm y los 500nm en
la Figura 4.5 la absorción es tan intensa que muestra señales no muy confiables y esto
se ve asociado a la baja intensidad de reflexión difusa en las gráficas la figura Figura
4.6. También entre los 500nm y los 600nm las gráficas de absorción disminuyen en
54
intensidad, mientras que las de reflexión difusa aumentan su intensidad, además en
los 663nm también la absorción tiene un pico de máxima absorción y la reflexión
difusa un mínimo de intensidad. Finalmente después de los 700nm hasta los
1000nm absorción y reflexión son proceso correspondientes, es decir mientras uno
aumenta el otro disminuye.
En las siguientes imágenes se puede apreciar el aspecto inicial u fina l del extracto
de capsaicina.
Figura 4.7 Extracto en el último día de medición
Figura 4.8 extracto después de las mediciones te tornó rojizo marrón.
55
El aspecto de las muestras respecto a inicio y final muestran una pérdida en la
coloración verde del extracto y al final el color es marrón traslucido, similar al de la
oleorresina disuelta en los experimentos previos.
4.3 Clasificando chiles de acuerdo a su grafica de reflexión difusa
De acuerdo a la experimentación hecha se propone un método para clasificar chiles
de acuerdo a su concentración. Como ya se mostró en el capítulo 3 las señales de
reflexión difusa de acuerdo a la concentración disminuye a medida que la cantidad
de capsaicina aumenta, por lo tanto se propone comparar estas curvas contra las
medidas de forma directa en chiles para determinar cuales tienen alta o baja
concentración de esta molécula. A continuación se muestran las gráficas de la 20
muestras de chiles medidas. El orden corresponde al mismo mostrado para las
mediciones hechas directamente en chile.
Figura 4.9 En la imagen se muestra el resultado de la clasificación hecha comparando las curvas de reflexión difusa hechas a las concentraciones de capsaicina y las curvas de
medidas en las glándulas de los capsicum annumm.
56
La gráfica mostrada de la Figura 4.9 es un ejemplo de la comparación realizada a
toadas las muestras de chile, las curvas con mayor intensidad en porcentaje refieren
a las medidas a capsaicina pura las demás a las mediciones directas en chiles. A
pesar de tener diferentes coloraciones de las muestras de capsicum annum,. Como
se puede ver la mayoría muestra alta concentración ya que las curvas de los chiles
no rebasan la del 1%, pero también se puede apreciar que curvas cercanas a cero
corresponden a las zonas sin glándula, es decir se puede inferir que en las zonas
del endocarpio la presencia de capsaicina es nula.
57
Capítulo 5: Conclusiones Generales
La información recopilada de nuestro objeto de estudio permite entender su lugar
de ubicación y la concentración promedio en los frutos capsicum. Además la
información química y física es útil parata tomar las debidas precauciones de
manejo. Por otra parte la información óptica reportada por otros investigadores
permite proponer e investigar si dicha molécula puede ser analizada con otras
técnicas en otra parte del rango espectral. El uso de capsaicina alimentaria de forma
aislada garantiza que sólo analizamos la molécula y se reporta su respuesta
espectral sin importar el tamaño de las moléculas.
Considerar que las muestras de capsaicina están formadas por partículas
homogéneas permitió aplicar teoría logrando los objetivos de la tesis, ya que el
ajuste de datos manifestó alta confiabilidad como se reportó en los errores
estadístico que fueron bajos y los coeficientes de correlación indican que hay gran
similitud entre las ecuaciones y los datos experimentales, y del mismo modo fue de
utilidad al realizar mediciones directas en los chiles.
Las metodologías usadas tienen la ventaja de reconocer la molécula de la
capsaicina en una parte del espectro visible, lo que permite que ésta pueda ser
analizada con fuentes de luz que sean de fácil acceso incluso adquisición. La
capsaicina tiene una absorción muy fuerte de los 350nm a los 400nm y de aquí en
adelante decrece hasta la zona de los 500nm, esto es congruente con el hecho que
en esa zona los curvas de reflexión difusa tiene intensidades iguales al 0%, a
medida que la absorción pierde intensidad la reflexión difusa aumenta, con esto se
demuestra que la capsaicina se acopla a descripción de la interacción de la luz con
un medio turbio se comprueba que la absorción y esparcimiento son procesos
correspondientes. Estos resultados permitirán asegurar que las señales de la
capsaicina al hacer mediciones directas en chile ocupando reflexión difusa no se
ven obstruidas por la presencia de otras sustancias en los chiles, tal como se mostró
en la mediciones hechas directamente en chiles.
58
Las ventajas del método propuesto son evitar el excesivo tratamiento de la
capsaicina, es decir a comparación de otros métodos en este trabajo de tesis no fue
necesario hacer un molienda para garantizar que las el tamaño de las partículas
afectaran las medición de espectros de e reflexión difusa. Además el solvente al ser
invisible a la fuente de luz usada se deja abierta la posibilidad de que las mediciones
directas en otras especies se puede sólo trabajar en las longitudes de onda
reportadas sin necesidad de usar material extra. Se encontró una nueva zona
espectral, en ésta se puede proponer una validación teórica similar o diferente del
modelo usado para poder garantizar medir concentraciones altas en la zona
alrededor de 663nm.
59
Capítulo 6: Trabajo futuro
Se pretende hacer nuevas tomas de espectros en capsicum de distintas especies
en zonas accesibles para las puntas de prueba usada en ésta tesis y comparar con
técnicas consideradas con “estándar dorado” por mencionar alguna la
cromatografía de alta eficiencia. Para lograr el objetivo final el de obtener u método
confiable para cuantificar la capsaicina, se pretende mejorar las líneas de calibrado
aumentando las concentraciones hasta obtener un umbral de saturación y
establecer los límites de la detección de la metodología. También explorar la
posibilidad de usar el rango espectral cercano a los 663nm, ya que la el coeficiente
de absorción tiene menor valor comparado al analizado entre los 400nm y 500nm,
ya que esto permitirá ampliar el estudio a concentraciones altas. La ventaja de usar
este rango espectral es que los materiales pueden ser de bajo costo ya que el rango
espectral es el visible y puede ser una ventaja en la clasificación de capsicum en el
campo de la química analítica.
60
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63
FIGURA 1.1 ANATOMÍA FRUTOS CAPSICUM [6]. ....................................................................................................... 10
FIGURA 1.2 [A] FÓRMULA MOLECULAR DE LA CAPSAICINA, [B] CAPSAICINA EN ESTADO PURO.............................................. 12
FIGURA 1.3 ESPECTRO UV/VISIBLE PARA LA CAPSAICINA, GRAFICA ARRIBA, MISMO RANGO ESPECTRAL PARA LA
DIHYDROCAPSAICINA, GRAFICA LADO ABAJO [11] ............................................................................................ 13
FIGURA 1.4 ESPECTRO EN INTENSIDAD DE CAPSAICINA PURA Y DE CHILE EN POLVO A DIFERENTES TAMAÑOS DE GRANO. ............ 14
FIGURA 2.1 ESQUEMA DE LA LEY EMPÍRICA DE LAMBERT-BEER. ................................................................................... 17
FIGURA 2.2 ESQUEMA REPRESENTATIVO PARA EL RETRO-ESPARCIMIENTO DE LUZ SEGÚN LA FUNCIÓN DE RE-EMISIÓN DE KUBELKA-
MUNK ................................................................................................................................................... 19
FIGURA 3.1 MONTAJE EXPERIMENTAL PARA ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN. ................................................................ 32
FIGURA 3.2 CUBETA SÓLO CON ETANOL IZQUIERDA, CUBETA CON MUESTRA DE CAPSAICINA ............................................... 33
FIGURA 3.3 ESPECTROS PROMEDIO DE ABSORCIÓN DE CAPSAICINA A DIFERENTES CONCENTRACIONES. .................................. 33
FIGURA 3.4 PARTE DEL ESPECTRO VISIBLE USADO PARA EL CÁLCULO DEL COEFICIENTE DE ABSORCIÓN. ................................... 34
FIGURA 3.5 GRAFICA MUESTRA DE DATOS EXPERIMENTALES ABSORCIÓN VS CONCENTRACIÓN. ........................................... 35
FIGURA 3.6 GRAFICA DE INTERSECCIÓN DE CADA AJUSTE AL EJE DE LA ABSORBANCIA......................................................... 36
FIGURA 3.7 ÉSTA GRAFICA REPRESENTA LA PENDIENTE CALCULADA PARA CADA LONGITUD DE ONDA Y SE ASOCIA DIRECTAMENTE AL
COEFICIENTE DE EXTINCIÓN. ........................................................................................................................ 36
FIGURA 3.8 GRAFICA DEL COEFICIENTE DE CORRELACIÓN DE CADA LÍNEA AJUSTADA. ......................................................... 37
FIGURA 3.9 EN ESTA GRÁFICA EN EL INTERVALO ESPECTRAL DE 500NM A 520 EL ERROR ES MUY GRANDE INICIA ALREDEDOR DE 0.2
Y DECRECE HASTA 0.05 POSTERIORMENTE DE LOS 520NM HASTA LOS 700NM EL ERROR SE MANTIENE POR DEBAJO DE 0.05.
............................................................................................................................................................ 38
FIGURA 3.10 EN ÉSTA GRAFICA SE PUEDE APRECIAR QUE EL ERROR INICIA EN 0.3 PARA 500NM POSTERIORMENTE DECRECE HASTA
0.12 PARA 520NM, A PARTIR DE ÉSTA ÚLTIMA LONGITUD DE ONDA HASTA LOS 700NM LOS VALORES DEL ERROR SE
MANTIENEN POR DEBAJO DE 0.1, ES DECIR EL VALOR PARA ................................................................................. 38
FIGURA 3.11 GRADO DE CONFIANZA, EN ESTA GRÁFICA SE MUESTRAN LOS RESULTADO DEL ANÁLISIS DE DOS
COLAS APLICADO AL COEFICIENTE DE CORRELACIÓN, SE PUEDE APRECIAR QUE EL LA CONFIANZA ES
MAYOR AL 95%, ESTO IMPLICA QUE LA MAYORÍA DE LOS DATOS TIENE UN COMPORTAMIENTO LINEAL DE
ACUERDO AL A LEY DE LAMBERT BEER. ............................................................................................... 39
FIGURA 3.12 MONTAJE EXPERIMENTAL USADO PARA MEDIR LA CAPSAICINA USANDO REFLEXIÓN DIFUSA. .............................. 40
FIGURA 3.13 EN ESTA FIGURA SE MUESTRA UN DIAGRAMA DE LA CONFIGURACIÓN SÁNDWICH Y DEL PROCESO DE CALIBRACIÓN. . 41
FIGURA 3.14 ESPECTROS DE REFLEXIÓN DIFUSA DE LAS MUESTRAS DE CAPSAICINA A DIFERENTES
CONCENTRACIONES .............................................................................................................................. 41
FIGURA 3.15 EN ESTA GRAFICA SE MUESTRA EL RANGO ESPECTRAL ANALIZADO, SE PUEDE APRECIAR EL CAMBIO DE LA INTENSIDAD A
MEDIDA QUE LA CONCENTRACIÓN DECRECE EN FUNCIÓN DE LA LONGITUD DE ONDA. ................................................ 42
FIGURA 3.16 SE MUESTRA LAS LECTURAS REALIZADAS DE LOS 500NM A LOS 700NM CADA 10 LONGITUDES DE ONDA DE REFLEXIÓN
DIFUSA VS CONCENTRACIÓN. ...................................................................................................................... 43
64
FIGURA 3.17 EN ESTA GRAFICA SE ENCUENTRAN LOS COEFICIENTES CALCULADOS OCUPANDO EL AJUSTE DEL MODELO NO LINEAL 44
FIGURA 3.18 GRÁFICO DE COEFICIENTE DE CORRELACIÓN, ESTA CURVA MUESTRA EL GRADO DE SIMILITUD ENTRE LOS DATOS
EXPERIMENTALES Y EL MODELO MATEMÁTICO ................................................................................................. 45
FIGURA 3.19 RESULTADOS ESTADÍSTICOS DE LA BONDAD DE AJUSTE, TODOS ESTOS GRÁFICOS MUESTRAN LA PRECISIÓN ENTRE LOS
DATOS EXPERIMENTALES Y EL ANÁLISIS ESTADÍSTICO.......................................................................................... 46
FIGURA 3.20 ESTE GRÁFICO MUESTRA LA CONCENTRACIÓN RECUPERADA PARA ALGUNAS LONGITUDES DE ONDA ..................... 47
FIGURA 3.21 GRÁFICO PARA EL PORCENTAJE DE ERROR PARA DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA A LA CORRESPONDIENTE
CONCENTRACIÓN RECUPERADA. ................................................................................................................... 48
FIGURA 3.22 EN ESTA FIGURA SE MUESTRA LA UN ACERCAMIENTO A LAS ZONAS DE ERROR DE LA FIGURE 3.27. ...................... 48
FIGURA 4.1 EN LA IMAGEN SE INDICAN CON COLORES LA ZONA DONDE ESE COLOCÓ LA PUNTA DE PRUEBA. ............................ 49
FIGURA 4.2 ESPECTROS TÍPICOS DE LAS MUESTRA DE CHILE CON TODA LA GLÁNDULA INTACTA. COMO PUEDE VERSE, LA PRESENCIA
DE CAPSAICINA ES EL RANGO DE LONGITUD DE ONDA DE 400NM A 500NMM DEBIDO A LA ABSORCIÓN, POR ÉSTA RAZÓN EN
ESTA PARTE LAS SEÑALES CASI CERO. ............................................................................................................. 51
FIGURA 4.3 EN ESTA IMAGEN SE MUESTRAN LOS ESPECTROS YA TÍPICOS DE LA GLÁNDULA, A EXCEPCIÓN DE UNA DE A PIEZAS
OBTENIDAS NO TIENE GLÁNDULA A TODO LO LARGO, ESTO SE REFLEJA IN UN ESPECTRO DE ABSORCIÓN CASI CERO, GRAFICA
COLOR CIAN DE MENOR INTENSIDAD. ............................................................................................................ 51
FIGURA 4.4 EN ÉSTA IMAGEN SE MUESTRAN GRAFICAS REPRESENTATIVAS DE ESPECTROS TÍPICOS DE GLÁNDULA DE CAPSAICINA
PARA MUESTRAS DE COLOR ROJIZO. .............................................................................................................. 52
FIGURA 4.5 ESTA ES LA CURVA DE ABSORCIÓN DEL EXTRACTO DE LOS 20 CHILES MEDIDOS. COMO YA SE HABÍA DESCRITO ENTRE LOS
400NM Y 500NM LA CAPSAICINA TIENE UN ANCHO DE BANDA CARACTERÍSTICO, CABE DESTACAR QUE TAMBIÉN A LOS
663NM SE TIENE UN PICO CARACTERÍSTICO DE ABSORCIÓN. ................................................................................ 53
FIGURA 4.6 GRAFICAS DE REFLEXIÓN DIFUSA PARA EL EXTRACTO DE CAPSAICINA. LA MÁS INTENSA CORRESPONDE A LA MEDICIÓN 24
HORAS DESPUÉS DE HABER SIDO EXTRAÍDA LA CAPSAICINA, LA CURVA DE COLOR VERDE A LAS 48 HORA Y FINALMENTE LA AZUL
PARA 72 HORAS ....................................................................................................................................... 53
FIGURA 4.7 EXTRACTO EN EL ÚLTIMO DÍA DE MEDICIÓN ............................................................................................. 54
FIGURA 4.8 EXTRACTO DESPUÉS DE LAS MEDICIONES TE TORNÓ ROJIZO MARRÓN. ............................................................. 54
FIGURA 4.9 EN LA IMAGEN SE MUESTRA EL RESULTADO DE LA CLASIFICACIÓN HECHA COMPARANDO LAS CURVAS DE REFLEXIÓN
DIFUSA HECHAS A LAS CONCENTRACIONES DE CAPSAICINA Y LAS CURVAS DE MEDIDAS EN LAS GLÁNDULAS DE LOS CAPSICUM
ANNUMM. .............................................................................................................................................. 55