estudio de la regulación por ph de la expresión de genes

2017

Estudio de la regulación por pH de la expresión de genes inducidos por la carencia de zinc en Aspergillus fumigatus DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA. INSTITUTO DE BIOLOGÍA FUNCIONAL Y GENÓMICA. HECTOR TOLEDO PORTEROS

Dr. José Antonio Calera Abad, Profesor Titular del Departamento de Microbiología y Genética

de la Universidad de Salamanca,

CERTIFICA:

Que la tesis titulada “Estudio de la regulación por pH de genes inducidos por la carencia de zinc

en Aspergillus fumigatus”, presentada por D. Héctor Toledo Porteros para optar al grado de

Doctor en Biología, ha sido realizada bajo mi dirección en el Instituto de Biología Funcional y

Genómica (IBFG), dentro del Programa de Doctorado de Microbiología y Genética Moleculares

del Departamento de Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca. El autor del

trabajo ha disfrutado de una beca pre doctoral de la Universidad de Salamanca para la

realización del mismo.

Y para autorizar su presentación y evaluación por el tribunal correspondiente, extiendo el

presente certificado en Salamanca, 30 de mayo de 2017

Fdo: José Antonio Calera Abad

Dr. Pedro F. Mateos, Director del Programa de Doctorado en Microbiología y Genética

Moleculares de la Universidad de Salamanca

CERTIFICA:

Que la tesis titulada “Estudio de la regulación por pH de genes inducidos por la carencia de zinc

en Aspergillus fumigatus”, presentada por D. Héctor Toledo Porteros para optar al grado de

Doctor en Biología, ha sido realizada bajo la dirección del Dr. D. José Antonio Calera Abad en el

Instituto de Biología Funcional y Genómica (IBFG), dentro del Programa de Doctorado de

Microbiología y Genética Moleculares del Departamento de Microbiología y Genética de la

Universidad de Salamanca.

Y para que así conste, expido este certificado en Salamanca, a 30 de mayo de 2017

Fdo.: Pedro F. Mateos.

Por mí se va a la ciudad del llanto; por mí se va al eterno dolor;

por mí se va hacia la raza condenada […]

¡Oh, vosotros, los que entráis, abandonad toda esperanza!

Infierno, Canto III, Dante Alighieri.

Si las palabras que acabo de citar estuvieran escritas en las puertas de los laboratorios, al menos

los doctorandos no podríamos decir que nos sabíamos a lo que veníamos.

Hacer una tesis -investigar, en generales duro, exigente, cansado, frustrante, exasperante. Y

uno sólo se mete en semejante viaje porque sabe que al final merecerá la pena, porque sabe

que, al igual que Dante tiene que cruzar infierno y purgatorio para llegar al paraíso, uno tiene

que soportar todas las frustraciones cotidianas del día a día del científico experimental para

alcanzar la meta. El periplo de Dante es una revisión del motivo literario de la Odisea: el viaje

del héroe. Sólo cambia el modelo de héroe: para los antiguos griegos era un guerrero astuto

capaz de desafiar a los dioses; para los humanistas cristianos del siglo XIV, un hombre virtuoso

y sabio que cumple los preceptos religiosos. Cada época tiene sus héroes. La nuestra, más

prosaica, opta por los héroes cotidianos y resume el motivo épico del viaje en una frase que

podría decir cualquier abuela: “Arrancar un ajo, cuesta trabajo” Porque quien algo quiere, algo

le cuesta, y las lentejas, si quieres las comes y si no, las dejas. Y ahí vamos todos en nuestro día

a día: salvando dificultades en pos de algún objetivo.

Pero no todo es horror y penurias y el pobre héroe sólo contra el mundo. Uno siempre encuentra

aliados por el camino. Odiseo tenía a Palas-Atenea, Dante tenía a Virgilio… En este periplo que

me ha tenido entretenido un puñado de años yo también he encontrado valiosos aliados sin

cuya ayuda no habría podido ni avanzar un par de pasos. Y no voy a seguir el ejemplo de los

héroes clásicos, quienes, la verdad, olvidaban con bastante facilidad a quienes les habían

permitido llegar a donde estaban; sino que aplicaré el principio contemporáneo que, como todo

lo contemporáneo, se puede resumir con otra frase de abuela: “es de bien nacido ser

agradecido”. Vayan pues, mis agradecimientos.

En primer lugar, por supuesto, debo agradecer el apoyo incondicional de mis padres, mis

familiares, amigos, compañeros teatreros y toda la gente cercana a mí en estos años. Ellos saben

quiénes son y lo bien que les quiero, y yo sé que es gente sensata que no se va a leer jamás esta

tesis, así que no me extenderé más sobre ello.

En segundo lugar, agradezco a toda la encantadora gente que ha trabajado y trabaja en el IBFG

(anteriormente conocido como IMB) el fantástico ambiente de trabajo que día a día construyen

y la abierta disposición de todo el mundo a echar un cable y ayudar siempre que puede.

También debo agradecer al Dr. Fernando Leal que allá por el lejano 2008 me impulsara a

disfrutar de mi beca de iniciación a la investigación en el laboratorio de Aspergillus, y a los

doctores Vicentefranqueira, Moreno y Amich, porque sólo sobre su magnífico trabajo ha sido

posible que yo levantara el mío.

Por supuesto, a mis compañeras de laboratorio: en primer lugar, a Rocío, que desde el principio

de los tiempos ha estado siempre ahí detrás, apoyando, ayudando y empujando todo lo que ha

podido para tratar de hacerme la vida más fácil. También a Clara y a Laura, cuyo apoyo

profesional y personal han hecho que los dos últimos años hayan transcurrido mucho más rápida

y fácilmente de lo imaginado entre risas, grandes conversaciones y admirables sarcasmos.

Y para finalizar, los agradecimientos más importantes para quien ha sido el gran responsable del

éxito de este viaje: mi director, José Antonio, quien me ha conducido con paso firme entre las

espesas nieblas de la biología molecular cargado de paciencia, excelentes ideas y buen hacer.

Escribo estas líneas a las puertas del final del viaje sin haberlo completado aún del todo. Ulises

volvió a casa, Dante alcanzó el paraíso… Yo ignoro cuál es mi premio final. ¿El título de doctor?

¿El conocimiento? ¿El haber despejado un trocito de camino para que otros lo recorran? El

problema de las heroicidades cotidianas es que su premio acostumbra a ser menos heroico que

cotidiano. Quizá el premio haya sido el viaje en sí, y con eso baste. Misterios del porvenir.

Gracias a todos por todo. Espero haber estado a la altura de lo que se esperaba de mí. Y si en

algo fracasé, lo siento y me aplico en mi descargo otra frase de abuela: Otro vendrá, que bueno

me hará.

Índice

INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 5

1. Ciclo de vida de Aspergillus fumigatus .................................................................................. 7

2. Aspergillus fumigatus, patógeno oportunista. ...................................................................... 8

3. Funciones biológicas del zinc. ............................................................................................. 11

3.1. Mecanismos generales de la homeostasis del zinc en eucariotas. .............................. 12

3.2. Homeostasis del zinc en células humanas. .................................................................. 13

3.3. Homeostasis del zinc en Saccharomyces cerevisiae .................................................... 14

3.4. Homeostasis del zinc en Aspergillus fumigatus ........................................................... 17

4. Relación entre homeostasis del zinc y virulencia en A. fumigatus. .................................... 20

5. Regulación de la expresión génica por pH ambiental en hongos. ...................................... 22

5.1. Regulación de la expresión génica por pH ambiental mediante la vía rim/pal en

Aspergillus y levaduras. ....................................................................................................... 22

5.2. Otros reguladores implicados en el control de la expresión génica por pH en

Aspergillus ........................................................................................................................... 25

6. Regulación por pH de genes implicados en la homeostasis del zinc .................................. 26

7. Hipótesis de trabajo y objetivos .......................................................................................... 28

Materiales y Métodos ............................................................................................................ 84

1. Microorganismos y medios de cultivo empleados .............................................................. 87

2. Medios de cultivo empleados ............................................................................................. 88

2.1. Medio usado para el cultivo rutinario de Escherichia coli ........................................... 89

2.2. Medios usados para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae ...................................... 89

2.3. Medios usados para el cultivo de Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans ......... 89

3. Cultivo de Aspergillus .......................................................................................................... 91

4. Plásmidos usados para generar cepas mutantes de A. fumigatus ...................................... 91

5. Obtención de cepas mutantes de Aspergillus fumigatus .................................................... 92

5.1. Obtención de protoplastos de Aspergillus fumigatus .................................................. 92

5.2. Transformación de Aspergillus fumigatus .................................................................... 93

5.3. Selección de mutantes de Aspergillus fumigatus ......................................................... 93

5.4. Obtención de cepas PyrG– a partir de cepas mutantes PyrG+ ...................................... 94

6. Obtención, detección y manipulación de ácidos nucleicos ................................................ 94

6.1. Obtención de ADN genómico de Aspergillus y análisis por Southern-blot .................. 95

6.2. Obtención de ARN total de Aspergillus y análisis por Northern-blot ........................... 95

6.3. Obtención de ADN plasmídico de Escherichia coli y análisis de restricción ................ 96

7. Extracción y análisis por Western-blot de proteínas totales de Aspergillus ....................... 97

8.- RT-q-PCR ............................................................................................................................. 98

9.- Técnicas de ingeniería genética utilizadas rutinariamente ................................................ 99

9.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ................................................................ 99

9.2. Mutagénesis dirigida .................................................................................................. 101

9.3. Clonación de fragmentos de PCR ............................................................................... 101

9.4. Transformación de células competentes de Escherichia coli..................................... 101

10. Plásmidos utilizados para generar cepas mutantes de S. cerevisiae .............................. 102

11. Construcción de cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae .................................... 102

12. Ensayo de BiFC in vivo en Saccharomyces cerevisiae ..................................................... 103

Bibliografía. ............................................................................................................................... 87

INTRODUCCIÓN

7

1. Ciclo de vida de Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus es un hongo filamentoso, habitante común del suelo, donde crece

alimentándose a partir de materia orgánica en descomposición. Es, por tanto, un saprofito que

se caracteriza por tener una amplia distribución ambiental, en gran medida gracias a su

considerable versatilidad metabólica y termotolerancia.

Aspergillus fumigatus se reproduce mediante un ciclo asexual que implica la producción de

conidios uninucleados (Fig. 1). Cuando éstos alcanzan un medio adecuado, germinan y crecen

produciendo hifas septadas constituidas por células multinucleadas haploides que crecen por

extensión apical y se ramifican formando una densa masa o micelio. Conforme éste se va

extendiendo, algunas células de las hifas se diferencian para generar células pie a partir de las

cuales se erigen los conidióforos, una suerte de prolongaciones aéreas ensanchadas en sus

extremos apicales sobre las que se diferencian a su vez las fiálides o células conidiogénicas, que

producen conidios blásticos de manera basípeta. Los conidios son relativamente pequeños (unas

2-3 micras de diámetro) y diseminan con facilidad por el viento.

En 2009 se describió la existencia de un ciclo sexual en A. fumigatus tras la observación de

cleistotecios al cruzar diversos aislados ambientales, confirmando de este modo el carácter

heterotálico de este hongo (1). Sin embargo, este ciclo sexual sólo pudo ser inducido en

condiciones de laboratorio tras 6 meses de incubación en unas condiciones muy precisas, por lo

que las posibilidades de darle uso como herramienta en investigación son poco halagüeñas.

Además, se desconoce su relevancia en la biología del hongo.

Figura 1. Ciclo de vida asexual de Aspergillus fumigatus. (A) Imágenes de microscopía electrónica de barrido que

muestras detalles de las distintas estructuras. (B) Evolución del crecimiento de una colonia de una cepa silvestre en

medio SDA a las 24, 48 y 72 horas respectivamente.

8

2. Aspergillus fumigatus, patógeno oportunista.

Debido a su pequeño tamaño, los conidios de A. fumigatus pueden ser transportados por el

viento a largas distancias y permanecer mucho tiempo suspendidos en el aire, siendo fácilmente

inhalados por las personas. En circunstancias normales, la inmensa mayoría de los conidios son

retenidos por los cilios de la mucosa epitelial de las vías respiratorias, mientras que los que

alcanzan los alvéolos son fagocitados y eliminados eficientemente por los macrófagos alveolares

mediante un procedimiento oxidativo basado en el uso de especies reactivas de oxígeno (ROS,

reactive oxygen species) (2–4). Cuando los conidios escapan a la acción oxidativa de los

macrófagos y finalmente germinan y forman hifas, estas son combatidas por medios no

oxidativos por acción de los neutrófilos mediante una estrategia que implica la formación de

NETs (5, 6). Las NETs (Neutrophil Extracellular Traps) son una estrategia de defensa inespecífica

en la cual los neutrófilos expulsan su material genético al exterior celular. Este ADN forma una

masa “pegajosa” capaz de contener la infección evitando la diseminación del patógeno (7). En

cualquier caso, los mecanismos de defensa innata de un individuo sano son tremendamente

eficaces para evitar el crecimiento invasor de A. fumigatus en los pulmones de un hospedador,

de manera que sólo los individuos con un alto grado de inmunosupresión son susceptibles de

ser invadidos por A. fumigatus (8).

Si bien para que la infección con A. fumigatus resulte en la invasión y colonización efectiva del

tejido pulmonar es imprescindible un alto grado de inmunosupresión en el hospedador, no es

menos imprescindible que el microorganismo responsable de la infección presente una serie de

características biológicas que le habiliten para crecer y reproducirse en el interior de un

hospedador susceptible. Así, el fenómeno de “virulencia”, aunque referido a un patógeno, en

realidad resulta de una combinación de factores dependientes tanto del hospedador como del

potencial patógeno. En el caso de Aspergillus fumigatus, entre las características que facilitan su

virulencia son destacables la producción de conidios suficientemente pequeños como para

alcanzar los alveolos pulmonares, su capacidad para obtener nutrientes del medio al pH

fisiológico (pH 7,3-7,6) y su capacidad de crecer mejor a 37ºC que a 28ºC, lo que le habilita para

extenderse de forma rápida a la temperatura corporal de mamíferos (9). Por tanto, la virulencia

de A. fumigatus parece ser una propiedad multifactorial puesto que hasta la fecha no se ha

encontrado un factor de virulencia en sentido estricto, es decir, un componente que sea esencial

para el desarrollo del hongo como patógeno, pero no para su desarrollo en cualquier otra

condición ambiental (10).

Sea como sea, A. fumigatus es capaz de comportarse como un patógeno y provocar daños en

hospedadores susceptibles. En general, la manifestación de los daños o enfermedad causada

por el crecimiento de A. fumigatus dentro de los tejidos de un hospedador susceptible se

denomina aspergilosis. Sin embargo, las manifestaciones clínicas e histopatológicas de la

aspergilosis pueden ser muy diversas. Así, las aspergilosis se pueden clasificar en 3 tipos:

alérgicas, saprofíticas o crónicas, e invasoras (11, 12).

Las manifestaciones alérgicas son habituales en pacientes con asma y fibrosis quística y se suelen

producir como consecuencia de una hipersensibilidad del sistema inmune a antígenos presentes

en las paredes de las esporas. De entre los distintos cuadros clínicos que pueden producirse,

9

destaca la aspergilosis broncopulmonar alérgica o ABPA, cuyos síntomas son asma, eosinofilia y

aparición de infiltrados pulmonares (12, 13) (Fig. 2A).

Cuando el hongo crece aprovechando el tejido muerto de cavidades preformadas en el pulmón,

provocadas por enfermedades previas como sarcoidosis o tuberculosis, se habla de

enfermedades saprofíticas o crónicas. En estos casos el crecimiento saprofito de A. fumigatus

puede formar un aspergiloma pulmonar o bola fúngica (Fig. 2B). Con frecuencia el aspergiloma

es asintomático y sólo se producen síntomas cuando el crecimiento del hongo es capaz de

provocar la rotura de vasos sanguíneos adyacentes (13). La cronificación de estas bolas fúngicas

puede causar eventualmente la destrucción del tejido pulmonar, una condición conocida como

aspergilosis pulmonar necrótica crónica, caracterizada por pérdida de peso, hemoptisis, tos

productiva y esputos crónicos (12).

Pero sin lugar a dudas, las manifestaciones más peligrosas de la patogenicidad de A. fumigatus

las encontramos dentro del grupo de enfermedades invasoras, que sólo se producen en

pacientes inmunosuprimidos. Cuando las esporas del hongo germinan y crecen en los alvéolos

pulmonares de un individuo inmunosuprimido, pueden terminar invadiendo el tejido

circundante (Fig. 2C). Se habla entonces de aspergilosis pulmonar invasora (API), la forma más

frecuente y fatal de las enfermedades invasivas causadas por A. fumigatus, con una tasa de

mortalidad que oscila entre el 50-90% según las fuentes consultadas (14, 15). Además, una

consecuencia de la API es la rotura de capilares y vasos sanguíneos del pulmón que facilitan la

dispersión hematógena de Aspergillus fumigatus (Fig. 2D). De este modo, cualquier órgano

puede resultar afectado dando origen a un cuadro agravado conocido como aspergilosis

diseminada que resulta mortal en caso de que resulten afectados órganos vitales como el

corazón o el cerebro (14) (Fig. 2E). La alta tasa de mortalidad se debe principalmente a la

dificultad para lograr diagnósticos tempranos y a la relativamente baja eficacia de los agentes

quimioterapéuticos utilizados (principalmente anfotericina B y voriconazol) (12, 15, 16). Una

dificultad añadida a todo ello es la creciente aparición de cepas resistentes a azoles (17). Por

esta razón, la búsqueda de nuevas dianas terapéuticas es de capital interés desde el punto de

vista biomédico. Para ello, resulta fundamental comprender la biología del hongo en las

condiciones ambientales en las que crece dentro de un hospedador susceptible.

Para que A. fumigatus sea capaz de crecer eficazmente en los tejidos del hospedador deberá ser

capaz de obtener todos los nutrientes necesarios a partir de dichos tejidos. Sin embargo, esto

no resulta sencillo para el hongo, especialmente en lo que se refiere a la obtención de cationes

metálicos esenciales, por dos razones fundamentales:

1. El sistema inmune de los mamíferos ha desarrollado una estrategia antimicrobiana

inespecífica para limitar la biodisponibilidad de cationes metálicos en los tejidos vivos que, en

general, se conoce como “inmunidad nutricional” (18). Por ejemplo, en mamíferos se han

descrito dos estrategias para secuestrar cationes de Zn2+: La primera pasa por la secreción de

calprotectina, proteína capaz de quelar zinc que es producida por los neutrófilos en abscesos

(19); la segunda opera en macrófagos activados por su infección con patógenos intracelulares,

e incluye el secuestro de zinc mediante metalotioneínas (MTs) (20, 21). Sin embargo, un exceso

de zinc es también nocivo para cualquier patógeno, ya que reacciona con los grupos -SH de las

proteínas. Por esta razón, los mamíferos también han desarrollado estrategias consistentes en

10

intoxicar a los microorganismos con zinc tras ser fagocitados por macrófagos y encerrados en

endosomas (22). Estas estrategias de defensa demuestran que la adquisición y detoxificación de

zinc es fundamental para la virulencia de bacterias y hongos. Mecanismos similares han sido

hallados al estudiar las relaciones entre la adquisición de hierro y la virulencia de distintos

patógenos (23). La lactoferrina, por ejemplo, es una proteína muy similar a la transferrina

presente en abscesos y en neutrófilos, capaz de unir hierro sin liberarlo a pH ácido (24). La acción

de la lactoferrina reduce la biodisponibilidad de hierro extracelular, como también lo hace la

hepcidina, un pequeño péptido capaz de unirse a la ferroportina, proteína que transporta hierro

hacia el exterior de la célula, induciendo su internalización y degradación y contribuyendo a

mantener los niveles de hierro extracelular muy bajos (25). Otro mecanismo pasa por bloquear

la capacidad de captar hierro del patógeno bloqueando los sideróforos que éste secreta, como

se ha comprobado que hace la siderocalina con los sideróforos de E. coli (26). Por último, la

proteína de membrana Nramp1 y el receptor de transferrina TfR1 constituyen eficaces

mecanismos de defensa contra patógenos intracelulares contribuyendo a la reducción de la

cantidad de hierro disponible en los macrófagos infectados (27, 28).

2. Los cationes metálicos son tóxicos cuando se encuentran en estado libre en las células

(29, 30), razón por la cual, se suelen encontrar asociados a diversas clases de proteínas. Por

ejemplo, se ha estimado que la concentración de hierro libre (en forma de Fe2+/3+) es de ~10–12

M (31) mientras que la de zinc libre (Zn2+) es de ~10–4M (32). Por tanto, las concentraciones

de éstos metales son muy inferiores a las mínimas requeridas para el crecimiento óptimo de una

cepa silvestre de A. fumigatus en un medio definido con pH igual al fisiológico, cuyos valores

hemos fijado en nuestro laboratorio en 6 M para el Fe2+/3+ y 1 M para el Zn2+. Esto sugiere que

A. fumigatus ha debido desarrollar estrategias para obtener a partir del hospedador todo el

hierro y el zinc que necesita para crecer e invadir sus tejidos y órganos.

Figura 2. Pruebas diagnósticas de distintas enfermedades causadas por Aspergillus fumigatus. (A) TC que muestra las estructuras típicas en sortija (flecha corta y gruesa) y en rosario (flecha larga y delgada) indicativas de bronquiectasia en un paciente con ABPA. Imagen tomada de Oxilia, H.G. et al. (2008). (B) Tomografía Computerizada (TC) de tórax con cavitación en forma de media luna y masa fúngica diagnosticada como aspergiloma. Imagen tomada de Shah, A. & Panjabi, C. (2016) (C) TC que muestra un nódulo excavado con necrosis en una paciente con API. Imagen tomada de Marchiori, E. et al. (2003). (D) Preparación histológica en la que se aprecia cómo las hifas de Aspergillus fumigatus invaden un capilar sanguíneo. (E) Resonancia Magnética que muestra las lesiones cerebrales provocadas por el crecimiento de Aspergillus en el cerebro de una paciente seropositiva. Imagen tomada de Reus-Bañuls, S., et al (2012).

11

3. Funciones biológicas del zinc.

El zinc es, tras el hierro, el segundo metal más abundante en las células eucariotas y, tras el

magnesio aquel que con más frecuencia aparece asociado a proteínas, incluyendo más de 300

enzimas de las 6 principales clases funcionales (33, 34) El zinc puede unirse a las proteínas por

distintos tipos de enlaces y tener función estructural, catalítica o co-catalítica (35) (Fig. 3).

Cuando su función es estructural se coordina preferentemente con los grupos –SH de cuatro Cys

o distintas combinaciones de Cys/His para estabilizar la estructura de la proteína. Cuando su

función es catalítica, forma complejos con una molécula de agua y tres aminoácidos donadores

de oxígeno, nitrógeno y azufre (His, Glu, Asp o Cys), siendo la His el preferido. En este caso la

función del Zn es activar el agua de la manera adecuada en función del tipo de reacción en la

que esté implicado (ionización, polarización o desplazamiento), lo cual está determinado por los

residuos con los se encuentra coordinado. Cuando su función es co-catalítica, dos iones de Zn2+

interaccionan con un mismo aminoácido, generalmente Asp y, a veces, con una molécula de

agua. Además, cada átomo de Zn también se coordina con 2 aminoácidos más, generalmente

Asp, His o Glu (la Cys nunca se encuentra en un sitio co-catalítico), aunque también pueden ser

otros ligandos inusuales como grupos amida (aportados por Asn, Gln), hidroxilo (Ser, Thr o Tyr)

o amino (Lys o N-terminal) (36). Por consiguiente, el zinc no sólo es esencial para la actividad de

Figura 3. Función del zinc en los sitios activos de las enzimas. Representación esquemática de tres ejemplos de

sitios activos en los que el zinc está cumpliendo respectivamente una función catalítica, estructural o co-

catalítica.

12

numerosas enzimas, sino que también es fundamental para el correcto plegamiento y

configuración de la gran diversidad de motivos zinc-finger presentes en proteínas implicadas en

procesos muy diversos, tales como replicación y reparación del ADN, transcripción, traducción,

metabolismo y señalización. Por lo tanto, la deficiencia de zinc, de la misma manera que su

exceso, afectará gravemente la capacidad de crecimiento y diferenciación y, en última instancia,

a la supervivencia de cualquier organismo vivo (37). Por esta razón, todos los seres vivos tienen

un sistema de control de la homeostasis del zinc.

3.1. Mecanismos generales de la homeostasis del zinc en eucariotas.

Todas las células disponen de mecanismos orientados a mantener la homeostasis de zinc en su

interior, pues un déficit puede detener el crecimiento mientras que un exceso puede resultar

tóxico. La cantidad mínima de átomos zinc necesaria para el crecimiento y desarrollo óptimo de

un microorganismo recibe el nombre de cuota de zinc (38). Por ejemplo, se estima que la

cantidad de átomos de Zn que contiene Escherichia coli creciendo en medio mínimo es de 2

105 átomos/célula. En el caso de Saccharomyces cerevisiae la cuota de zinc se estima que es de

1,5 107 átomos/célula (39). A pesar de que hay dos órdenes de magnitud de diferencia,

teniendo en cuenta los volúmenes celulares, resulta que la concentración intracelular de zinc en

E. coli y S. cerevisiae es 0,2 y 0,5 mM respectivamente (~100-1000 veces mayor que la

concentración de Zn en el medio).

En general, el sistema homeostático del zinc en células eucariotas depende de transportadores

específicos de zinc, proteínas de unión y reguladores transcripcionales (40):

A) Transportadores de zinc de la familia ZIP (Zrt- Irt- like proteins) (40, 41). Se encuentran

principalmente en la membrana plasmática y en la membrana de algunos orgánulos y su

misión principal es transportar zinc hacia el citoplasma. Suelen funcionar como

homodímeros. Normalmente tienen 8 regiones hidrofóbicas transmembrana con el

extremo N y C terminal orientado hacia el medio extracelular o al lumen de los orgánulos,

con una región rica en His entre los dominios transmembrana 3 y 4 orientada hacia el

citoplasma. Los dominios transmembrana 4 y 5 son muy anfipáticos, con residuos de

histidina muy conservados, y parecen ser los que forman el canal por el que pasan los

iones. El mecanismo de transporte no está nada claro. La especificidad de sustrato parece

estar definida por la secuencia de lazo que conecta los dominios transmembrana 2 y 3 o

por un residuo de histidina muy conservado en el VI dominio transmembrana (Fig. 4A).

B) Transportadores de zinc de la familia CDF (Cation diffusion facilitator) (40). Transportan zinc

desde el citoplasma hacia el interior de orgánulos o hacia el exterior celular y participan

en su detoxificación o almacenamiento. Típicamente constan de 6 regiones

transmembrana con el extremo N y C terminal orientado hacia el citoplasma. Un lazo con

un motivo rico en histidina, entre los pasos 4 y 5, es el que potencialmente capta los iones

metálicos. Existe otro dominio de unión a metales en el C-terminal. Los dominios 1, 2 y 5

forman el canal de transporte, cuyo mecanismo no se ha definido, aunque se ha sugerido

la posibilidad de un antiporte Zn2+/H+ (42, 43) (Fig. 4B).

13

C) Proteínas quelantes de zinc (MTs) (40, 41). Entre éstas se encuentran las metalotioneínas,

proteínas de bajo peso molecular (66-68 aminoácidos) caracterizadas por tener un alto

contenido en cisteína (entre 20 y 22 residuos). Aunque presentan una gran

heterogeneidad de secuencias, todas tienen elementos estructurales que les permiten

unir fuertemente iones metálicos como Zn2+, Cu2+ y Cd2+. Las metalotioneínas regulan la

concentración citosólica de zinc, ya que pueden unir hasta 7 átomos de este elemento a

través de los grupos -SH de las cisteínas. Se ha descrito su función en la protección contra

la toxicidad por zinc (44).

D) Factores de transcripción. Todos los elementos señalados deben estar sujetos a regulación

directa por uno o más factores de transcripción que activan o reprimen la expresión

génica en función de la concentración ambiental de zinc (40, 45). No obstante, algunos de

estos genes pueden estar regulados por factores de transcripción que responden a otros

estímulos ambientales tales como el pH del medio o la disponibilidad de otros metales (ej.

Fe), según se ha demostrado en Aspergillus fumigatus (46, 47).

Figura 4. Esquema de la estructura y topología de los transportadores de zinc. (A) Transportadores de la familia

ZIP. (B) Transportadores de la familia CDF. Imagen tomada de la tesis doctoral de Jorge Amich (2010).

3.2. Homeostasis del zinc en células humanas.

Hasta la fecha, se han identificado en las células humanas un factor regulador (MTF1), alrededor

de 12 metalotioneínas, 9 ZnTs (familia CDF) y 14 transportadores de la familia ZIP (41).

14

El regulador MTF1 se expresa en todos los tipos celulares. Tiene un dominio de unión a ADN en

el extremo amino que consta de 6 dedos de zinc que reconocen una secuencia denominada MRE

(Metal Response Element) cuyo consenso es 5’TGCRCnCGCCC3’ (48). MTF1 es capaz de unir zinc

cuando la concentración de este metal es elevada en la célula e inducir la transcripción de los

genes de las metalotioneínas I y II y de ZnT1 y ZnT2, así como reprimir Zip10 (49). Hasta muy

recientemente se pensaba que MTF1 era el único regulador de zinc en mamíferos, pero hace

poco se ha descrito un segundo factor de transcripción, ZNF658, que no sólo parece regular la

expresión de transportadores de zinc como ZnT5 y Zip10, sino que además parece conectar la

homeostasis de zinc con la producción de proteínas ribosomales (50). Además, más

recientemente se ha descrito en Caenorhabditis elegans un factor nuclear (HIZR-1) que media la

respuesta a altas concentraciones de zinc (51), aunque su ortólogo en humanos no ha sido aún

estudiado.

Las metalotioneínas I y II tienen como función principal controlar y mantener en niveles bajos el

Zn2+ citosólico controlando el exceso de zinc. Dada su baja afinidad por el zinc, sólo lo captan

cuando los niveles son altos y son capaces de liberarlo con cierta facilidad, sirviendo como buffer

de zinc y para donárselo a otras enzimas cuando estas lo necesitan (49).

Respecto a los transportadores, tanto los ZnTs como los de la familia ZIP se caracterizan por

tener distintas distribuciones en la célula o incluso por ser específicos de distintos tejidos, como

es el caso del ZnT8 que se expresa únicamente en las células del páncreas (52) o ZnT3 que se

expresa mayoritariamente en el hipocampo y la corteza cerebral (53). Aunque aún hay grandes

lagunas que cubrir, en los últimos años el estudio de la homeostasis del zinc en células humanas

ha avanzado considerablemente. Actualmente todos los transportadores han sido estudiados

en mayor o menor detalle y sus funciones concretas pueden consultarse en cualquier revisión

sobre el tema (41).

3.3. Homeostasis del zinc en Saccharomyces cerevisiae

La homeostasis del zinc en la levadura S. cerevisiae ha sido ampliamente estudiada y revisada

(45, 54). Nos encontramos con un sistema que consta de transportadores ZIP (Zrt1, Zrt2, Zrt3 y

Ke4), transportadores CDF (Zrc1, Cot1, Zrg17 y Msc2), al menos una metalotioneína (Csr5) y un

factor de transcripción capaz de regular todo el sistema (Zap1). (Fig. 5).

Zap1 fue el primer factor de transcripción de respuesta a zinc descrito en hongos (55). Tiene 880

aminoácidos, con un dominio de unión a ADN (DBD, DNA binding domain) en el C-terminal,

compuesto de 5 dedos de zinc del tipo C2H2, y dos dominios de activación (AD, activating

domains) susceptibles de inhibirse por la unión de iones Zn2+. El dominio AD1 está formado por

una región rica en histidinas y cisteínas (56). El dominio AD2 incluye dos dedos de zinc atípicos

del tipo tCWCH2 (tándem CWCH2) (57, 58). Tanto los dominios AD como el DBD están regulados

por la unión de iones Zn2+, alcanzando su máxima actividad en condiciones de limitación extrema

(59). Conforme va incrementándose la concentración intracelular de zinc, los dominios AD van

uniendo iones Zn2+ y Zap1 va perdiendo actividad. (Fig. 6).

15

Figura 5. Esquema general de la homeostasis del zinc en Saccharomyces cerevisiae. (A) S. cerevisiae creciendo

en condiciones limitantes en Zn2+ y, (B) de exceso de Zn2+. Las proteínas de la familia ZIP se muestran en verde,

las de la familia CDF en amarillo y Zap1 en azul. Los átomos de zinc están representados como puntos negros.

16

Hay más de 80 genes regulados por Zap1, bien por activación, bien por represión, lo que indica

que existe más de un mecanismo de acción. Como norma general, Zap1 actúa activando

promotores al unirse a secuencias de reconocimiento específicas denominadas ZREs (Zinc

Response Elements) cuya secuencia consenso es 5’-ACCYYNAAGG-3’ (60). Estas secuencias

pueden tener mayor o menor afinidad por la unión de Zap1, lo cual es clave en la regulación del

sistema.

La presencia de ZREs de baja afinidad en el propio promotor de Zap1 permite sugerir que, en

ausencia de zinc, estimula su propia transcripción mediante un mecanismo de retroalimentación

positiva que se activa cuando la limitación en zinc es muy elevada (54), del mismo modo que

sucede en otros organismos como A. fumigatus (61) (datos no publicados), y como posiblemente

también ocurre en Cryptococcus gattii (62), o Candida sp. (63). Al ser capaz de autorregular su

propia producción y gracias a la existencia de ZREs con distinta afinidad, cuando la limitación de

zinc es moderada, Zap1 se produce en cantidades moderadas y sólo se une a los sitios ZRE de

alta afinidad del genoma. Sin embargo, cuando la limitación de zinc es severa, Zap1 se produce

en grandes cantidades y es capaz de unirse también a los ZREs de baja afinidad.

Cuando la limitación en zinc es moderada, Zap1 es capaz de unirse a los sitos ZRE de alta afinidad

del promotor de ZRT2 y activar su transcripción. Zrt2 es un transportador ZIP de baja afinidad

Figura 6. Modelo de funcionamiento de Zap1 en S. cerevisiae. Según va aumentando la cantidad de Zn2+ en la célula, éste se va uniendo a los dominios AD reduciendo progresivamente la actividad del factor de transcripción. Imagen tomada de Wilson, S. & Bird, A.J. (2016)

17

que introduce zinc en la célula procedente del medio. Su transcripción depende de la activación

de 2 sitios ZRE situados upstream de la caja TATA de su promotor. Sin embargo, en el promotor

de ZRT2 hay una secuencia ZRE adicional, de baja afinidad, situada por debajo de la caja TATA y

solapando con sitio de inicio de la transcripción. Cuando la concentración en zinc es muy baja,

Zap1 se une a esta secuencia y bloquea la transcripción de ZRT2 (64). En condiciones de

limitación moderada de zinc, Zap1 también activa la expresión de Fet4, un transportador de baja

afinidad de Fe2+, Cu2+ y Zn2+ (65).

En cambio, cuando la limitación de zinc es extrema, Zap1 es capaz de unirse a los sitios de baja

afinidad del promotor del gen ZRT1, que codifica un transportador de membrana de alta afinidad

por Zn2+. Zrt1 es el principal encargado de captar e introducir zinc en la célula en condiciones de

limitación severa (66).

El transporte de zinc hacia la vacuola depende de Zrc1 y Cot1, mientras que en sentido opuesto

(de la vacuola al citoplasma), depende de Zrt3, que se expresa sólo en déficit de zinc inducido

por Zap1 (67). Paradójicamente, Zrc1 se activa por Zap1 cuando hay una limitación severa en

zinc para contrarrestar el zinc-shock causado por el aumento súbito de la concentración de este

metal en el citoplasma tras la entrada en acción del transportador de alta afinidad Zrt1 (68). En

la detoxificación de Zn2+ también está involucrada la metalotioneína Csr5, que es capaz de

secuestrar zinc (69).

En condiciones en las que no existe limitación en zinc, Zrc1 y Cot1 almacenan zinc en la vacuola

para que sirva de reservorio ante una posible limitación. Sin embargo, la vacuola no es el único

orgánulo capaz de almacenar zinc. Zrg17, Msc2 y Ke4 son transportadores encargados de

introducir zinc en el retículo endoplásmico con el fin de proporcionar la cantidad necesaria de

este metal para la correcta síntesis y plegamiento de proteínas reticulares. Zrg17 está controlado

por Zap1, pero no los otros dos (70, 71). Adicionalmente, podemos encontrar zinc almacenado

en vesículas denominadas zincosomas, que han sido descritas tanto en mamíferos como en

levaduras, pero cuya función aún no está clara (39).

Por último, Pho84 es un transportador de alta afinidad de fosfatos capaz de co-transportar zinc

hacia el interior celular. Sin embargo, éste transportador sólo se sintetiza en condiciones

limitantes en fosfatos y no está regulado por la biodisponibilidad de zinc (72) por lo que su

función en la homeostasis de este metal parece poco relevante.

3.4. Homeostasis del zinc en Aspergillus fumigatus

La homeostasis del zinc en A. fumigatus está regulada por un sistema que consta básicamente

de los mismos componentes esenciales que en el resto de seres vivos. Sin embargo, debido a su

capacidad infecciosa, su estudio reviste un interés especial por la relevancia que este sistema

tiene para la patogénesis del hongo, como se explicará más adelante. A. fumigatus tiene 8

transportadores de zinc de la familia ZIP (ZrfA-ZrfH), 8 de tipo CDF (MscA, ZgrA, ZrcA, ZrcB, ZrcC,

MntA, MtpA y MtpB) y un factor regulador (ZafA) (73) (Fig. 7). Hasta el momento, no se han

descrito metalotioneínas.

18

Figura 7. Homeostasis del zinc en Aspergillus fumigatus. Esquema en el que se sitúa cada proteína en su

localización subcelular más probable en función de lo conocido en otros organismos. En el panel superior se

observa la situación en un medio sin limitación en zinc; en el central, en un medio ácido limitante en zinc; y en el

inferior, en un medio alcalino limitante en zinc. El nombre de los distintos elementos representados puede

consultarse en la leyenda que contiene la propia figura. Imagen tomada de Amich, J. and Calera, J.A. (2014)

19

ZafA (61) es un factor de transcripción ortólogo a factor Zap1 de S. cerevisiae que se expresa en

condiciones de limitación en zinc. Tiene 570 aminoácidos con 2 dedos de zinc atípicos del tipo

tCWCH2 y 4 dedos de zinc típicos del tipo C2H2 en su región C terminal. Consta de dos dominios

de activación, llamados AD1 y AD2 cuya regulación se desconoce y 4 probables motivos de unión

a zinc, así como una secuencia de localización nuclear solapando con el 6º dedo de zinc.

Autorregula su propia expresión por un sistema de retroalimentación positiva mediante su

unión directa a una secuencia ZR (zinc response) cuya secuencia consenso es 5’-

RYYNYCAAGGTNYYY-3’ (datos no publicados). Amén de estar presente en su propio promotor,

encontramos varias repeticiones de estas secuencias en los promotores de los genes que

codifican los transportadores ZrfA, ZrfB, ZrfC y ZrfF cuya expresión está inducida por ZafA en

condiciones de carencia de zinc, mientras que la expresión de los demás genes ZIP no parecen

estar regulados por ZafA. Además, los genes zrfA, zrfB y zrfC presentan niveles diferentes de

expresión en función del pH del medio (Fig. 8).

Por su parte, los transportadores ZrcA, ZrcB y ZrcC, de la familia CDF, están implicados en el

transporte de zinc hacia la vacuola, siendo ZrcC el más parecido a Zrc1/Cot1 de S. cerevisiae;

Figura 8. Análisis mediante northern blot de la

expresión de los genes de los transportadores de la

familia ZIP en Aspergillus fumigatus. Se ha medido

la expresión combinando dos variables: condiciones

de ausencia o exceso de Zn2+ y pH ácido o alcalino. Se

usaron los medios SDA y SDN (sin Zn2+ y con Zn2+

respectivamente). Como se puede ver, sólo zrfA,

zrfB, zrfC y zrfF están regulados por la

biodisponibilidad de zinc en el medio de cultivo.

Además, los tres primeros responden también al pH

ambiental.

20

MtpA y MtpB son similares a la proteína YiiP de E. coli y a otras implicadas en tolerancia a

metales en hongos y plantas (73).

La proteína ZrfA es el ortólogo de Zrt1 de S. cerevisiae. En la región promotora de zrfA hay tres

secuencias reguladoras de respuesta a ZafA (ZR1-3) y una secuencia de unión al factor regulador

de la expresión por pH, PacC, que solapa con los motivos ZR1 y ZR2 (46). Su expresión es muy

sensible a la concentración de zinc en el medio y se inhibe cuando ésta es mayor de 2 M.

Además, zrfA se expresa a su máximo nivel en medios ácidos limitantes en zinc mientras que su

nivel de expresión se reduce ligeramente en los medios alcalinos (74).

Algo similar ocurre con ZrfB, ortólogo de Zrt2 de S. cerevisiae. En la región promotora del gen

zrfB se encuentran 5 motivos ZR y 4 motivos de unión del factor PacC, estando ubicado uno de

ellos justamente downstream de la caja TATA. Todo ello hace que zrfB se exprese a mayor nivel

en medios ácidos limitantes en zinc mientras que su nivel de expresión se reduce notablemente

en medios alcalinos (74). Además, la expresión de zrfB es menos sensible a la concentración de

zinc que la de zrfA y sólo se inhibe completamente con concentraciones de zinc en el medio

mayores de 10 M (46).

Por su parte, ZrfC no tiene ortólogos conocidos en S. cerevisiae, aunque sí se encuentra un

ortólogo de ZrfC en C. albicans (donde se ha denominado Zrt1) (75). Como todas las proteínas

ZIP tiene 8 dominios transmembrana con los extremos N y C terminales hacia el exterior, pero

también tiene un extremo amino inusualmente largo que presenta 4 posibles motivos de unión

de zinc. El gen zrfC comparte promotor con aspf2, que codifica un antígeno inmunodominante

de función desconocida cuya expresión responde al mismo patrón que la de zrfC (76). El

promotor bidireccional zrfC-aspf2 tiene 3 motivos ZR y 6 sitios de unión a PacC. Es muy sensible

a la biodisponibilidad de zinc y al pH y únicamente se expresa en medios alcalinos muy limitantes

en zinc.

4. Relación entre homeostasis del zinc y virulencia en A. fumigatus.

Como ya se anticipó en el epígrafe 3, la concentración de zinc disponible en los tejidos del

hospedador es considerablemente inferior a la que necesitaría A. fumigatus para poder crecer

de forma óptima in vitro en un medio mínimo definido. De entre todos los componentes del

sistema de mantenimiento de la homeostasis del zinc en A. fumigatus, aquellos que por orden

de prelación deberían ser los más importantes para su virulencia serían los implicados

directamente en la captación de zinc a partir de los tejidos del hospedador. Teniendo en cuenta

que el pulmón es un medio ligeramente alcalino limitante en zinc, el transportador ZrfC sería el

más crítico para el crecimiento inicial del hongo en este medio. El crecimiento de A. fumigatus

en el tejido pulmonar, como el de otros patógenos, resulta en una respuesta inflamatoria que

conlleva la restricción del zinc libre y un ligero descenso del pH en los abscesos fúngicos, por lo

que es posible que además de ZrfC, los transportadores ZrfA y ZrfB también sean importantes

en virulencia. Por otra parte, considerando que la expresión de estos genes está inducida por

ZafA, es lógico pensar que éste gen también sea esencial en virulencia.

21

En concordancia, se demostró que un mutante zafA es incapaz de crecer en medios limitantes

en zinc y, por consiguiente, de infectar ratones inmunosuprimidos (61). La acción supresora de

la virulencia en este mutante depende en primera instancia de su incapacidad para inducir la

expresión de los transportadores transmembrana (ZrfA-C). De hecho, un mutante

zrfAzrfBzrfC es igualmente avirulento (77). Ahora bien, ¿En qué medida contribuye cada uno

de los transportadores a la virulencia de A. fumigatus? Ya que ZrfC es el principal encargado de

captar zinc en las condiciones que más se asemejan a las de un entorno pulmonar, debe ser el

principal responsable de la virulencia. Efectivamente, se ha demostrado que un mutante zrfC

ve reducida su virulencia permitiendo la supervivencia del 50% de los ratones infectados.

Además, se ha demostrado que dicha virulencia depende de la capacidad de captación de zinc

Figura 9. Función de los genes zafA, zrfA, zrfB y zrfC en la virulencia de Aspergillus fumigatus. (A) Curva de

supervivencia de ratones inoculados con 2 x 106 conidios de las cepas AF171 (zafA), AF56 (zafA [zafA]) y AF14 (WT). Gráfica tomada de Moreno, M.A. et al (2007). (B) Curva de supervivencia de ratones inoculados

con 105 conidios de las cepas AF14 (WT), AF54 (zrfC), AF721 (zafAzrfBzrfC) y AF731

(zafAzrfBzrfCzrfC]). En todos los casos, cada curva es la media de la supervivencia de dos cohortes de 10 ratones inmunosuprimidos con cortisona. Imagen tomada de Amich, J. et al. (2014).

22

de ZrfC mediante su extremo N-terminal, el cual está ausente en ZrfA y ZrfB (77). No obstante,

aunque ZrfC es el principal responsable de la captación de zinc cuando A. fumigatus crece como

patógeno pulmonar, el bajo nivel de expresión de zrfA y zrfB también contribuye a la obtención

de zinc, como lo prueba que la cepa zrfC no sea totalmente avirulenta. Sin embargo, ZrfA y ZrfB

no son esenciales en presencia de ZrfC (73, 77) (Fig. 9).

Adicionalmente se ha podido comprobar que ZrfC es esencial para contrarrestar la acción

antimicrobiana de la calprotectina (77, 78) proteína secretada por los neutrófilos en abscesos

que es capaz de inhibir el crecimiento microbiano mediante el secuestro de zinc y manganeso

(19, 79, 80), incluyendo el de hongos patógenos como C. albicans (81), y A. fumigatus (77).

Por todas estas razones se ha propuesto que el sistema de la homeostasis de zinc en A.

fumigatus es esencial para la virulencia de este hongo y que, concretamente, ZafA y ZrfC pueden

ser dos posibles dianas terapéuticas a tener muy en cuenta a la hora de desarrollar nuevos

fármacos contra la aspergilosis (73, 78). No es la primera vez que se señala a los transportadores

de membrana y sistemas de adquisición de nutrientes como posibles dianas terapéuticas. Son,

de hecho, una línea que está siendo cada vez más explorada en los últimos tiempos (82, 83).

5. Regulación de la expresión génica por pH ambiental en hongos.

La regulación de la expresión génica por pH ambiental es un proceso esencial, muy complejo,

que obliga a los hongos desplegar la respuesta homeostática y adaptativa más adecuada para

poder sobrevivir, nutrirse y crecer. Paradójicamente, la adaptación del programa de expresión

génica a cambios en el pH ambiental no depende exclusivamente del pH, sino que también está

influida por la disponibilidad de otros nutrientes y, en particular, de iones metálicos. Así, esta

adaptación es el resultado final de la integración de las señales detectadas y transmitidas a

través de varias vías de señalización.

Aunque los primeros estudios sobre regulación de la respuesta a pH se realizaron en el hongo

A. nidulans, actualmente se ha alcanzado un mayor grado de conocimiento para el caso de la

levadura S. cerevisiae. Se sabe que, en esta levadura, además de la ATPasa de membrana Pma1

(que bombea H+ desde el citoplasma al medio externo) y la ATPasa vacuolar de H+, ambas

implicadas en el mantenimiento del pH citosólico, la respuesta a pH ambiental es dependiente

de al menos 5 vías distintas interconectadas: La ruta de la Mid1/Ca2+-calcineurina/Crz1, la ruta

Rim, la vía Gpr/Ras-cAMP-PKA, la ruta glucosa-Snf1 y, por último, la vía de señalización de la

integridad de la pared celular o vía Wsc1-PKC-Slt2 (84) (Fig. 10).

5.1. Regulación de la expresión génica por pH ambiental mediante la vía rim/pal en

Aspergillus y levaduras.

Aspergillus fumigatus destaca por su capacidad para crecer en un amplio rango de valores de

pH ambiental (pH 2-9). Además, ésta capacidad adaptativa resulta esencial para el crecimiento

23

del hongo en el tejido pulmonar y, por tanto, para su virulencia (85). Esto se debe

fundamentalmente a que el sistema de regulación de la expresión génica en función del pH

ambiental regula y condiciona muchos otros sistemas (86), entre los que se cuenta el sistema

regulador de la homeostasis del zinc.

La regulación por pH en Aspergillus ha sido ampliamente estudiada en Aspergillus nidulans (87–

89), si bien hay datos que permiten suponer un alto grado de conservación del sistema en todo

el género (86). La regulación del sistema a nivel transcripcional depende de PacC. Éste factor de

transcripción está formado por 678 aminoácidos (90) consta de 2 dedos de zinc del tipo tCWCH2

y un dedo de zinc del tipo C2H2 en la región N-terminal (concretamente entre el residuo 76 y el

165). Solapando con el tercer dedo de zinc tiene una secuencia de localización nuclear. Además,

consta de 3 regiones denominadas A, B y C (desde el N-terminal al C-terminal) que interaccionan

entre sí manteniendo a la proteína relativamente estable en una conformación “cerrada”

(PacC72) (90–93).

PacC72 se encuentra libre en el citoplasma. Cuando la célula pasa de un medio ácido a uno neutro

o alcalino, se inicia entonces una cascada de transcripción mediada por la ruta pal. PalH se

encuentra en la membrana plasmática y es capaz de detectar el pH alcalino del medio,

reclutando entonces a la arrestina PalF y a la proteína de membrana PalI, encargada de

estabilizar la unión entre PalH y PalF. Como consecuencia de esta interacción, PalF resulta

ubiquitinada (94–97). La ubiquitinación de PalF permite el reclutamiento y unión de PalC a través

de su dominio Bro1 (98) y de Vps23, proteína perteneciente al complejo ESCRT-I (endosomal

sorting complex required for transport I) (99). Estas dos nuevas proteínas permiten a su vez el

Figura 10. Esquema de la regulación en función del pH en S. cerevisiae. Representación esquemática en la que

se muestran las principales rutas y factores implicados en la respuesta a pH alcalino extracelular. Las líneas

discontinuas indican rutas o mecanismos aún pendientes de elucidar. Tomada de Serra-Cardona, A., et al (2015)

24

reclutamiento de otros componentes del ESCRT-I y ESCRT-II, como Vps20, capaz de inducir la

polimerización de Snf7 (89). Esto permite la suma de nuevos elementos de la ruta pal entre los

que se encuentran PalA y PalB. PalA es reclutada por Vps32/Vps20, el cual facilita la interacción

con PalC. La proteasa PalB es reclutada y activada por Vps24 (98, 100, 101). PacC tiene dos

motivos (YPXL/I) flanqueando la “Signaling Protease Box”, la secuencia de reconocimiento de

PalB que orientan correctamente a PacC para que pueda ser procesada por PalB, ya que ésta no

tiene especificidad de secuencia (101).

Así pues, PacC72 es digerida por PalB por un mecanismo dependiente del pH ambiental, para

generar una forma intermediaria llamada PacC53 en la que se ha eliminado el extremo C-terminal

que contiene la región C (102, 103). Esto impide el mantenimiento de la conformación cerrada

y se pasa a una conformación abierta que es fácilmente reconocida y procesada por el

proteasoma. Éste, mediante un mecanismo independiente de pH, elimina completamente la

región B y parte de la A para generar la forma activa de la proteína (PacC27) que corresponde

aproximadamente a los 245 residuos del extremo N-terminal (104) (Fig. 11). Las formas PacC27

y PacC53 entran en el núcleo, donde pueden unirse a la secuencia consenso 5’ GCCARG-3’

presente en los promotores de los genes que regula [en adelante al motivo consenso 5’ GCCARG-

3’ de unión de PacC lo denominamos PR (pH response)].

Este modelo asume que el factor de transcripción, PacC, sólo es funcional cuando el pH es

alcalino y se mantiene en su forma procesada PacC27, manteniendo al margen a las formas

PacC53 y PacC72, aunque recientemente se ha comprobado que PacC72 funciona como represor

de la expresión de su propio gen en medios ácidos (105). La forma PacC27 se uniría entonces a

Figura 11. Representación esquemática de la activación de la ruta pal para el procesamiento de PacC. Cuando

el pH del medio es alcalino, PalH inicia una cascada de transducción que desemboca en el reclutamiento de una

compleja maquinaria que activa el procesamiento proteolítico de PacC.

25

los sitios PR de los genes que regula bloqueando o atenuando la expresión de genes de expresión

a pH ácido e induciendo la de los genes que se expresan a pH alcalino (87, 88). En medios ácidos

PacC72 reprime pacC en colaboración con el factor PacX de manera que el incremento en la

expresión de pacC observada en medios alcalinos no se debe a inducción mediada por PacC sino

a su desrrepresión en ausencia de PacC72 (105). Este sistema permite además mantener un bajo

nivel basal de PacC27 en medios ácidos gracias a que, en ausencia de señal alcalina, una pequeña

proporción de la forma PacC72 podría adquirir espontáneamente una conformación abierta

haciéndola accesible directamente al proteasoma y permitiendo un procesamiento basal

independiente de pH (93, 106).

Algo similar ocurre con Rim101, ortólogo de PacC en S. cerevisiae, si bien éste se procesa en un

único paso de activación proteolítica para dar una forma análoga a PacC53 (107, 108).

Contrariamente al efecto dual de PacC, Rim101 sólo actúa como represor, bien directamente,

desactivando genes de expresión ácida, o bien indirectamente, bloqueando la acción de otro

represor, como por ejemplo Nrg1 o Smp1 (108). En cualquier caso, Rim101 ejerce su acción

uniéndose a la secuencia consenso 5’-TGCCAAG-3’.

El sistema también está descrito en el patógeno oportunista Candida albicans. La regulación por

pH en Candida depende de Rim101, que también se activa por procesamiento proteolítico:

cuando las condiciones son alcalinas, se origina una forma activa de 74 kDa. CaRim101 tiene la

particularidad de que también experimenta procesamiento proteolítico cuando las condiciones

son ácidas para dar una proteína de 65 kDa que parece estar implicada en la regulación de genes

independientes de pH (109). Al contrario que en S. cerevisiae, CaRim101 parece actuar tanto

como activador como como represor de forma directa mediante su un unión a la secuencia

consenso 5’-(G)CCAAGAA-3’ (110, 111).

También se ha encontrado el ortólogo de PacC/Rim101 en Cryptococcus neoformans, otro

hongo patógeno oportunista. Rim101 es esencial en Cryptococcus para la producción de la

cápsula, que es, a su vez, esencial para la virulencia. En este caso también se procesa en dos

pasos de proteólisis pero, al contrario de lo que ocurre en Aspergillus, Candida y Saccharomyces,

su activación no depende sólo de una señal de pH, sino que también de la ruta AMPc/PKA (112).

5.2. Otros reguladores implicados en el control de la expresión génica por pH en

Aspergillus

PacC no es el único factor de transcripción que afecta al crecimiento del hongo en función del

pH ambiental. Ya hemos mencionado anteriormente que la respuesta a cambios en el pH es

compleja e incluye una señal integrada a la que se suman hasta 5 rutas de señalización.

Recientemente, se han descubierto dos factores que son esenciales para el crecimiento de A.

nidulans cuando el pH es alcalino y que parecen responder a estímulos de rutas alternativas a

Pal/Rim: CrzA y SltA (113).

CrzA es un factor de transcripción con dedos de zinc homólogo de Crz1p en S. cerevisiae

implicado en la regulación de la homeostasis del calcio y en la respuesta a estrés alcalino (114).

26

Cuando el pH del medio es alcalino, se activan canales de transporte de calcio de la membrana

(Cch1/Mid1 en S. cerevisiae) (84) induciendo la activación de Calmodulina, que a su vez activa a

la fosfatasa calcineurina. Ésta defosforila CrzA, que se localiza en el citosol. Su defosforilación

permite que sea transportada hacia el núcleo donde reconoce la secuencia consenso 5’-

GNGGC(G/T)CA-3’ gracias a un dominio de unión a ADN situado entre los residuos 469-603 (113).

El pH alcalino también induce la activación de CrzA por mecanismos que aún no han sido

identificados pero que, en todo caso, parecen independientes de la ruta pal (113, 115). Se sabe

que Crz1p regula genes que aparecen en otras rutas de señalización, transporte vesicular y

mantenimiento de la pared celular (116), y que su homólogo en C. albicans participa en la

inducción de filamentación a pH neutro o alcalino (117). Por su parte, un mutante crzA en A.

fumigatus, presenta defectos en tolerancia a pH, temperatura y estrés iónico, así como defectos

en crecimiento polarizado y conidiación y pérdida de virulencia (118).

La distribución del factor SltA parece limitada al subphylum Pezizomycotina y no tiene homólogo

en S. cerevisiae (119). Es un factor de transcripción con tres dedos de zinc tipo C2H2, que

reconoce la secuencia 5′-AGGCA-3’ (113). Está implicado en detoxificación de cationes metálicos

(Na+, K+, Li+, Cs+ y Mg2+) y es esencial para el desarrollo de los esterigmatocistos (120, 121). SltA

se activa por proteólisis gracias a la intervención de SltB, una serín-proteasa similar a

quimiotripsina que se activa a su vez por autoproteolisis. SltA parece inducir la síntesis de SltB y

de sí misma mediante un sistema de retroalimentación positiva. La activación proteolítica de

ambas proteínas no es dependiente de pH y no se conocen los mecanismos que provocan que

los mutantes sltA y sltB no crezcan cuando el pH es alcalino (122).

6. Regulación por pH de genes implicados en la homeostasis del zinc

Hemos visto anteriormente cómo los genes zrfA, zrfB y zrfC, que codifican transportadores de

zinc ubicados en la membrana plasmática de A. fumigatus, poseen en sus promotores sitios de

unión para el factor ZafA, lo que les permite responder a una regulación en función de la

biodisponibilidad de zinc, y sitios de unión para el factor PacC, para responder a una regulación

en función del pH ambiental. Parece claro que, en el caso que nos ocupa, el factor clave para la

inducción de la expresión génica en medios limitantes en zinc es ZafA, ya que ninguno de éstos

genes regulados por ZafA es capaz de expresarse en presencia de zinc, con independencia del

pH ambiental (61, 74, 76). No obstante, en este caso PacC tendría una función moduladora de

la expresión que podría ejercer mediante distintos mecanismos.

Así, si observamos el promotor de zrfB (Fig. 12A y C), encontramos en él 4 supuestos sitios de

respuesta a pH medida por PacC: PR1, PR2, PR3 y PR4 (16, 716, 1044 y 1422 pb upstream del

sitio de inicio de la transcripción). Los tres últimos se encuentran bastante alejados tanto del

codón de inicio como de los sitios ZR (de respuesta a zinc), pero el primero, PR1, se encuentra

en situado entre el sitio de inicio de la transcripción y la probable caja TATA del promotor. Este

particular posicionamiento nos llevó a postular que en condiciones ácidas, el sitio PR1

permanecería desocupado, pero cuando las condiciones son alcalinas, PacC27 se uniría a este

sitio e interferiría de forma directa con la maquinaria de inicio de la transcripción, atenuando

27

notablemente la expresión del gen (74). Uno de los objetivos del presente trabajo será adquirir

datos que sustenten dicha hipótesis y profundizar en el mecanismo de regulación de dicho

promotor.

En lo que respecta al promotor de aspf2-zrfC (Fig. 12B y C), su arquitectura es más compleja. Es

un promotor bidireccional genuino puesto que regula la transcripción de los genes divergentes

aspf2 y zrfC de manera idéntica. El promotor de aspf2-zrfC tiene 3 sitios ZR: ZR1, ZR2, ZR3 (150,

268 y 593 pb upstream del sitio de inicio de la transcripción de zrfC) y 6 sitios PR: PR1, PR2, PR3,

PR4, PR5, y PR6 (168, 188, 293, 305, 313 y 605 pb upstream del sitio de inicio de la transcripción

de zrfC). Estos sitios están dispuestos de tal manera que cada uno de los sitios ZR tiene muy

cerca al menos 1 sitio PR. Esto nos permitió especular sobre la posibilidad de que exista una

regulación cruzada por interacción física entre ambos factores de transcripción (ZafA y PacC) a

nivel del promotor de ZrfC (76).

Adicionalmente se había demostrado previamente que la eliminación por mutagénesis dirigida

de todos los sitios PR del promotor de zrfC permitía la expresión de aspf2 y zrfC a pH ácido en

condiciones limitantes de zinc (76) (Fig. 13). Este hallazgo sugirió una alternativa al modelo

tradicionalmente establecido para el funcionamiento de PacC, proponiendo una posible función

reguladora de la forma completa PacC72 cuando el pH es ácido. Estos datos animan otro de los

Figura 12. Representación esquemática de los promotores de los genes zrfA, zrfB y zrfC, y efecto del pH ambiental sobre su expresión. (A) Patrón de expresión de zrfA y zrfB en condiciones ácidas y alcalinas con y sin limitación en zinc. (B) Patrón de expresión de zrfC y aspf2 en condiciones ácidas y alcalinas con y sin limitación en zinc. (C) Promotores de los genes zrfA, zrfB y zrfC. Los sitios PR se muestran en cajas naranjas y los sitios ZR como cajas negras. La caja TATA más probable de cada gen se representa en amarillo.

28

objetivos del presente trabajo: desentrañar el mecanismo de regulación por pH del promotor

de zrfC.

7. Hipótesis de trabajo y objetivos

Los resultados mostrados en la figura 13 sugieren una posible función represora de PacC sobre

la expresión de zrfC en medios ácidos. Esto no sólo nos brindó la posibilidad de investigar de qué

manera PacC era capaz de ejercer distintas funciones (activadoras y represoras) sobre un mismo

promotor en función de su estado de procesamiento y de posibles interacciones con el principal

regulador del sistema (en este caso ZafA), sino también poder utilizar los conocimientos

adquiridos para revertir la regulación de zrfC con fines prácticos. Dada la importancia que tiene

el sistema de captación de zinc para la virulencia del hongo, resultaría del máximo interés

conocer en profundidad el mecanismo de regulación que gobierna la expresión de los

transportadores de membrana. En particular, teniendo en cuenta la importancia de la expresión

de zrfA, zrfB y zrfC para la virulencia de A. fumigatus, una estrategia para reducir la capacidad

de crecimiento del hongo en los tejidos sería interfiriendo negativamente la regulación de estos

genes. Sin embargo, para ello será esencial conocer con detalle el mecanismo de regulación del

sistema de homeostasis del zinc en A. fumigatus.

Por todo ello, se emprendió este trabajo con el objetivo general de determinar la función de

PacC y, en particular, de las formas PacC72 y PacC27 en la regulación de la expresión de los genes

zrfB y zrfC como prototipos de genes expresados en medios ácidos o alcalinos limitantes en zinc

respectivamente.

Para ello, los objetivos específicos del trabajo fueron:

1. Determinar el patrón de procesamiento de PacC en Aspergillus fumigatus.

Figura 13. Análisis de la función de los sitios PR sobre la expresión de aspf2 y zrfC. (A) Todos los sitios del promotor del aspf2-zrfC se inactivaron mediante mutagénesis dirigida. Los sitios PR se muestran en cajas naranjas y los sitios ZR como cajas negras. La caja TATA más probable se representa en amarillo. (B) Análisis por northern blot de la expresión de zrfC en una cepa con los sitios PR del promotor del gen mutados, lo que permite la expresión de este gen en medios ácidos limitantes en zinc. Imagen tomada de Amich, J. et al. (2010)

29

2. Analizar las variaciones en la regulación de la expresión de los genes de los transportadores

de zinc zrfC y zrfB en respuesta a alteraciones en el patrón de procesamiento de PacC.

3. Determinar si PacC está cumpliendo una función represora sobre zrfC a pH ácido y

caracterizar el promotor bidireccional PzrfC-aspf2.

4. Determinar la función de PacC sobre la regulación de la expresión de zrfB y caracterizar el

promotor de este gen.

5. Determinar si la expresión de zafA o la función del factor regulador ZafA de homeostasis del

zinc en A. fumigatus que codifica, se encuentran influidas por el pH ambiental y si ello

depende de PacC.

6. Proponer un modelo que explique la acción conjunta de PacC y ZafA sobre la regulación de

la expresión de zrfB y zrfC por pH y disponibilidad de zinc.

Materiales y Métodos

87

1. Microorganismos y medios de cultivo empleados

Las cepas de microorganismos utilizadas en este trabajo y sus correspondientes genotipos se

encuentran listados en la Tabla 1.

Tabla 1. Relación de cepas utilizadas

Microorganismo Cepa1 Genotipo2,3 Referencia

E. coli DH5 F– gyrA96 (Nalr) recA1 relA1 endA1 thi-1

hsdR17 (rk-mk

+) supE44 deoR U169 (lacZYA-

argF) [Φ80 lacZM15]

(186)

A. fumigatus CEA17* pyrG1 (pyrGC756G) (187)

AF2511* pyrG1 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI (76)

AF801 zrfC::lacI [PzrfCPR123456 zrfC] (76)

AF14 Wt (46)

AF58 pyrG1 pacC∆15982215::pyrG (76)

AF60 pyrG1 pacC∆15981855::pyrG (76)

AF721 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI (77)

AF731 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfCwt zrfC]

(76)

AF761 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfBwt zrfB]

(76)

AF763 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfBPR1 zrfB]

Este trabajo

AF765 zrfA::neo zrfB::hisG zrfC::lacI [PzrfBTATA

zrfB]

Este trabajo

AF841 pyrG1 pacC::hisG-pyrG-hisG Este trabajo

AF851* pyrG1 pacC::hisG Este trabajo

AF97 pyrG1 myc3::pacC∆13862215::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo

AF992* pyrG1 myc3::pacC∆13862215::Tgst Este trabajo

AF9911 pyrG1 myc3-pacCwt:: Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo

AF9913 pyrG1 myc3-pacC∆15982215::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo

AF9915 pyrG1 myc3-pacC∆15981855::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo

AF100 pyrG1 myc3x-pacCwt_Anid::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo

AF9921 pyrG1 V5-pacCwt::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo

AF9925 pyrG1 V5-pacC∆15981855::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo AF9900* pyrG1 myc3-pacCwt::Tgst Este trabajo

AF9923* pyrG1 V5-pacCwt::Tgst Este trabajo

AF110 pyrG1 myc3-pacCwt::Tgst palH::lacI-pyrG-lacI

Este trabajo

AF9926 pyrG1 V5-pacC∆15982215::Tgst-pyrG-Tgst Este trabajo AFPR0 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCwt GFP] Este trabajo

AFPR1 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfCPR1 GFP] Este trabajo











88





AF8530 pacC::hisG [LUC PzrfCwt GFP] Este trabajo

AF8531 pacC::hisG [LUC PzrfCPR123456 GFP] Este trabajo

AF99230 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBwt GFP] Este trabajo

AF99231 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBPR1 GFP] Este trabajo

AF99232 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBTATA GFP] Este trabajo

AF99233 V5-pacCwt::Tgst [LUC PzrfBPR1234 GFP] Este trabajo

AF8540 pacC::hisG [LUC PzrfBwt GFP] Este trabajo

AF8541 pacC::hisG [LUC PzrfBPR1 GFP] Este trabajo

AF8542 pacC::hisG [LUC PzrfBTATA GFP] Este trabajo

AF8543 pacC::hisG [LUC PzrfBPR1234 GFP] Este trabajo

A. nidulans MAD2009 WA2 pyroA4 pantoB100 pacC900 (104)

S. cerevisiae ZHY6 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112

trp1-1 ura3-52 zap1::TRP1

(55)

HTP1 MAT ade6 can1-100 his3-11,15 leu2-3,112


rim101::KanMX6

Este trabajo



rim101::KanMX6 [URA3, VN-ZafA, PacC72-VC]

Este trabajo



rim101::KanMX6 [URA3, yEVenus-ZafA]

Este trabajo



rim101::KanMX6 [URA3, VN-ZafA, PacC72-

VC] [LEU2, PzrfCwt NanoLuc]

Este trabajo



rim101::KanMX6 [VN-ZafA, PacC72-VC]

[LEU2, PzrfCPR123456 NanoLuc]

Este trabajo

1Las cepas de A. fumigatus marcadas con un asterisco son PyrG–, es decir, requieren uracilo y uridina para crecer.

2Los genes situados entre corchetes en las cepas de A. fumigatus se introdujeron entre los genes AFUA_2G08360 (pyrG) y AFUA_2G08350 del genoma de A. fumigatus a la vez que se produce la reparación de la mutación pyrG1, restaurando así su plena capacidad de crecimiento en ausencia de uracilo.

3Los genes situados entre corchetes en las cepas de S. cerevisiae son portados por plásmidos episómicos.

2. Medios de cultivo empleados

Se utilizaron medios de cultivos específicos, sólidos y líquidos, para el crecimiento de los

distintos microorganismos utilizados a lo largo de este estudio: Escherichia coli, Saccharomyces

cerevisiae y Aspergillus.

89

2.1. Medio usado para el cultivo rutinario de Escherichia coli

• Luria Bertani (LB). Su composición es: 10 g/L bacto-triptona (Difco), 5 g/L extracto de levadura,

10 g/L NaCl (pH 7,0). El medio LB selectivo (LB amp) se preparó suplementando el medio LB con

ampicilina (0,1 mg/mL) a partir de un stock de ampicilina (100 mg/mL) conservado a −20ºC. Para

preparar LB sólido en placas Petri se añadieron 15 g/L de agar.

2.2. Medios usados para el cultivo de Saccharomyces cerevisiae

• Yeast Potato Dextrose (YEPD). Su composición es: 10 g/L extracto de levadura; 20 g/L peptona;

20 g/L glucosa. Para preparar YEPD sólido en placas Petri se añadieron 15 g/L de agar.

• Yeast Potato Raffinose (YEPR). Su composición es: 10 g/L extracto de levadura; 20 g/L

peptona; 20 g/L rafinosa. Para preparar YEPD sólido en placas Petri se añadieron 15 g/L de agar.

Se usó para inducir la producción de proteínas bajo el control del promotor GAL1.

• Synthetic Dextrose Ammonium plus CSM (SDA+CSM). Su composición es: 1,7 g/L YNB without

amino acids, ammonium sulfate & without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L glucosa,

5 g/L (NH4)2SO4. El medio se suplementó con la mezcla CSM adecuada según las auxotrofías de

la cepa utilizada: 0,77 g/L CSM-Ura (BIO 101, Inc. #4511-212) o 0,65 g/L CSM-His-Leu-Ura (BIO

101, Inc. #4531-212).

• Synthetic Raffinose Ammonium plus CSM (SRA+CSM). Su composición es: 1,7 g/L YNB

without amino acids, ammonium sulfate & without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L

rafinosa, 5 g/L (NH4)2 SO4. El medio se suplementó con la mezcla CSM adecuada según las

auxotrofías de la cepa utilizada: 0,77 g/L CSM-Ura o 0,65 g/L CSM-His-Leu-Ura.

2.3. Medios usados para el cultivo de Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans

• Aspergillus Minimal Medium (AMM). Su composición es: 10 g/L glucosa, 3 g/L NaNO3, 0,52

g/L MgSO4-7H2O, 0,52 g/L KCl, 1,52 g/L KH2PO4; 1 mL/L solución de elementos traza de Cove

1000. La solución de Cove se preparó con ZnSO4-7H2O o sin él según las necesidades

experimentales. Nuestra solución de Cove contó con las siguientes modificaciones respecto a la

original(188): Sustitución del MnSO4-2H2O (0,8 g/L) por MnSO4-1H2O (0,72 g/L) y del FePO4-2H2O

(0,8 g/L) por FeSO4-7H2O (1,2 g/L).

• Aspergillus Minimal Medium + KCl (AMM+KCl). Se utilizó para el rescate de transformantes

de Aspergillus fumigatus. Se preparó igual que el AMM, pero añadiendo 44,72 g/L de KCl (para

dejarlo a 0,6 M) en lugar de la cantidad estándar.

• Aspergillus Minimal Medium + Uracilo (AMMU). Se utilizó para aislar cepas de A. fumigatus

auxótrofas para uracilo. Se preparó igual que el AMM, pero añadiendo 0,5 g/L de uracilo y 1,2

g/L de uridina.

90

• Aspergillus Minimal Medium + Uracilo + KCl (AMMU+KCl). Se utilizó para cultivar los

protoplastos de A. fumigatus auxótrofos para uracilo en los controles de regeneración de

protoplastos. Se preparó igual que el AMMU, pero añadiendo 44,72 g/L de KCl (para dejarlo a

0,6 M).

• Synthetic Dextrose Ammonium (SDA). Su composición es: 1,7 g/L YNB without amino acids,

ammonium sulfate & without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L glucosa, 5 g/L

(NH4)2SO4, 6 M FeSO4-7H2O, 2 M CuSO4-5H2O, 2 M Na2MoO4-2H2O y 0,1 mM ZnSO4-7H2O

(pH ~4,2).

• Synthetic Dextrose Ammonium limitante en Zn (SDA–Zn). Idéntico al anterior, pero omitiendo

el ZnSO4-7H2O.

• Synthetic Dextrose Ammonium EDTA (SDAE): Medio utilizado para incrementar la limitación

en Zinc. Se preparó añadiendo 0,25 mM Na2EDTA al medio SDA–Zn.

• Synthetic Dextrose Nitrate (SDN): 1,7 g/L YNB without amino acids, ammonium sulfate &

without zinc (FORMEDIUM, Ref No. CYN2401), 20 g/L glucosa, 3 g/L NaNO3, 6 M FeSO4-7H2O,

2 M CuSO4-5H2O, 2 M Na2MoO4-2H2O y 0,1 mM ZnSO4-7H2O. Se ajustó el pH a 7,5 con NaOH

5 M.

• Synthetic Dextrose Nitrate limitante en Zn (SDN–Zn). Idéntico al anterior, pero omitiendo el

ZnSO4-7H2O.

• Synthetic Dextrose Nitrate EDTA (SDNE–Zn): Medio utilizado para incrementar la limitación

en zinc. Se preparó añadiendo 0,25 mM Na2EDTA al medio SDN–Zn.

• Placas de potato Dextrose Agar (PDA): 20 g/L Potato Dextrose Agar (Difco), 20 g/L sacarosa,

2,5 g/L MgSO4-7H2O, 1 mL/L solución 1000× de elementos traza de Cove modificada y 10 g/L de

agar bacteriológico estándar. El pH se ajustó a 6,5 con NaOH 5 M.

• Yeast Peptone Dextrose (YEPD): 10 g/L extracto de levadura, 20 g/L peptona, 20 g/L glucosa.

Para preparar medio sólido en placas Petri, se añadieron 20 g/L de agar bacteriológico estándar.

En todos los casos, a excepción de las placas de PDA y YEDP, para preparar medios sólidos en

placas Petri se añadieron 20 g/L de agar purificado (Cat. 1806.00, Pronadisa).

En general, los medios definidos utilizados para el crecimiento de cepas PyrG– se suplementaron

con 0,5 g/L de uracilo y 1,2 g/L de uridina. Todos los medios y soluciones se esterilizaron en

autoclave a 121º C durante 20 minutos. En todos los casos, la glucosa se esterilizó por separado

en autoclave y después se añadió al medio en condiciones de esterilidad. Los medios se

guardaron a temperatura ambiente hasta su utilización.

Todos los medios utilizados se prepararon con agua Milli-Q y reactivos de la mejor calidad para

reducir posibles contaminaciones con trazas de zinc. Además, para reducir al mínimo las trazas

de iones metálicos adheridos a las paredes de los recipientes, todo el material utilizado para la

preparación de los medios (probetas, vasos de precipitado, botellas y matraces de cultivo), se

lavaron previamente con una solución de EDTA 3 mM (pH 8,0) y posteriormente se enjuagaron

varias veces con agua Milli-Q antes de su esterilización por calor seco.

91

3. Cultivo de Aspergillus

Para la obtención de conidios frescos de Aspergillus se realizaron resiembras en placas de PDA

a razón de 105 esporas por placa, usando conidios mantenidos a 4°C. Las placas se incubaron a

37 °C durante 3-4 días en atmósfera húmeda. Una vez el hongo había esporulado, se añadió a

las placas una solución acuosa estéril de Tween-20 al 0,1% (v/v) y se raspó la superficie de la

placa suavemente con un asa de cultivo estéril. Las suspensiones de conidios se sedimentaron

por centrifugación a 1500 g durante 10 minutos en tubos estériles de fondo cónico y se lavaron

2 veces con la solución de Tween-20 para eliminar restos de hifas y deshacer posibles agregados

de conidios. Finalmente, los conidios se suspendieron en la solución de Tween-20 al 0,1% y se

calculó su concentración con una cámara cuentaglóbulos “Thoma”. Estas suspensiones frescas

se utilizaron para inocular los distintos medios. Los medios líquidos se inocularon de forma

general con 106 conidios/mL y se incubaron a 37ºC en agitación constante a 200 rpm. Los medios

sólidos se incubaron a 37ºC en atmósfera húmeda durante 3-5 días.

4. Plásmidos usados para generar cepas mutantes de A. fumigatus

Los plásmidos utilizados para generar todas las cepas mutantes de A. fumigatus construidas

durante la elaboración de este trabajo se recopilan en la Tabla 2.

Tabla 2. Plásmidos utilizados para construir cepas mutantes de A. fumigatus

Plásmido Descripción

pZRF220 Porta el gen zrfB bajo el control del PzrfBPR1. Se utilizó para construir la cepa AF761.

pZRF221 Porta el gen zrfB bajo el control del PzrfBTATA. Se utilizó para construir la cepa AF765. pPAC81 Porta la región promotora y la terminadora del gen pacC flanqueando el marcador

hisG-pyrG-hisG. Usado para construir la cepa AF841.

pPAC111 Porta el alelo myc3::pacC∆13862215 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF97.

pPAC113 Lleva el alelo pacC silvestre marcado con myc (myc3-pacC) seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9911.

pPAC114 Lleva el alelo mimético alcalino extremo myc3-pacC∆15982215 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9913.

pPAC110 Lleva el alelo mimético ácido myc3-pacC∆15981855 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9915.

pPAC9002 Porta el gen pacC silvestre de A. nidulans marcado con myc (myc3x-pacCwt_Anid) bajo el control del promotor de pacC de A. fumigatus, seguida del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF100.

pPAC115 Lleva el alelo silvestre pacC marcado con V5 (V5-pacCwt) seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9921.

pPAC117 Lleva el alelo mimético ácido V5-pacC∆15981855 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9925.

pPALH4 Porta la región promotora y la terminadora del gen palH flanqueando el marcador lacI-pyrG-lacI. Usado para construir la cepa AF110

pPAC116 Lleva el alelo mimético alcalino V5-pacC∆15982215 seguido del marcador Tgst-pyrG-Tgst. Usado para construir la cepa AF9926.

pPYRGQ3 Plásmido pPYRGQ3 (76) diseñado para introducir fragmentos de DNA en el locus pyrG entre los genes AFUA_2G08360 (pyrG) y AFUA_2G08350 del genoma de A. fumigatus a la vez que se produce la reparación de la mutación pyrG1.

92

pPYRGQ19.PRn (n = nº de sitio PR inactivado)

Serie de plásmidos basados en el pPYRGQ3 que portan diferentes versiones del promotor de zrfC con distintas combinaciones de sitios PR mutados que controlan la expresión de dos genes reporter, GFP (en lugar de zrfC) y luc (en lugar de aspf2):

[LUC PzrfCwt/PRn GFP]. Se utilizaron para crear la serie de cepas AFPRn (n = nº de sitio PR inactivado) con fondo silvestre y las cepas AF8530 (PzrfCwt) y AF8531

(PzrfCPR123456) con fondo pacC. pPYRGQ31 Versión mejorada del plásmido pPYRGQ3 (76) para incrementar la frecuencia de

recombinación homóloga. pPYRGQ192n PzrfBwt (n=0) PzrfBTATA (n=1) PzrfBPR1 (n=2) PzrfBPR1234 (n=3)

Serie de plásmidos basados en el pPYRGQ31 que portan diferentes versiones del promotor de zrfB con distintas combinaciones de mutaciones (en los sitios PR o en la caja TATA) controlando la expresión de dos genes reporter: GFP (en lugar de zrfB)

y luc (en lugar de AFU2G03850): [LUC PzrfBwt/TATA/PRn GFP] (n = nº de sitio PR). Se utilizaron para crear las series de cepas AF9923n (con fondo silvestre) y AF854n

(con fondo pacC).

5. Obtención de cepas mutantes de Aspergillus fumigatus

Se construyeron cepas mutantes en A. fumigatus mediante la sustitución de genes por versiones

mutadas en los correspondientes loci originales o mediante la inserción dirigida de DNA

transformante en el locus pyrG de una cepa que portaba la mutación pyrG1, para permitir que

ocurra la reparación de dicha mutación y la cepa se convierta en PyrG+. El marcador de selección

usado en todos los casos fue pyrG.

5.1. Obtención de protoplastos de Aspergillus fumigatus

Se inocularon 107 conidios la cepa de interés PyrG– en 50 mL del medio adecuado según su

fenotipo (normalmente AMM) suplementado con uracilo (0,5 g/L), uridina (1,2 g/L) y 0,1 mM de

ZnSO4, y se incubaron durante ~16 horas a 37ºC. Se recogió el micelio por filtración a través de

un filtro Cell strainer (BD Falcon. Ref 352340). Se preparó la solución de protoplastos de la

siguiente manera: A 10 mL de tampón PB (0,75 M KCl, 25 mM citrato/fosfato [pH 5,8]

esterilizado por autoclave y almacenado a temperatura ambiente), se añadieron 0,5 g de

VinoTaste (Novozymes, 2860-689) que se disolvieron por agitación vigorosa en vortex. Tras ello,

se esterilizó la solución a través de un filtro de 0,22 m, se suspendió el micelio en la solución

resultante y se incubó en un matraz durante 2 horas a 30ºC y 120 rpm. Después se comprobó al

microscopio la formación de protoplastos, que se observaban como células redondas de tamaño

variable, no refringentes, vacuolizadas y de color oscuro. La solución se filtró a través de un

embudo con doble filtro Miracloth (Calbiochem 475855) y el filtro se lavó con 25 mL de tampón

KC (0,6 M KCl, 50 mM CaCl [pH 5,8] esterilizado por autoclave y almacenado a 4ºC). Se centrifugó

el filtrado durante 10 minutos a 1200 g a 4ºC. Se retiró el sobrenadante y se suspendió por

agitación muy suave en 15 mL de tampón KC. Se repitió el paso de centrifugación, se

suspendieron los protoplastos sedimentados en 0,4 mL de tampón KC y se comprobó al

microscopio la cantidad y calidad de los mismos. Para ello se añadió sobre un portaobjetos 5 L

de SDS 10% y se comprobó la lisis celular. La mitad de los protoplastos se destinaron a

transformación y la otra mitad a controles.

93

5.2. Transformación de Aspergillus fumigatus

Los plásmidos que portan el ADN transformante (~ 5 g) se digirieron con las enzimas de

restricción adecuadas y éste se purificó mediante una extracción 1:1 (v/v) con fenol-cloroformo-

isoamílico y otra, también 1:1 (v/v) con cloroformo-isoamílico. Posteriormente se precipitó con

0,1 volúmenes de AcNa 3 M (pH 7) y 0,7 volúmenes de isopropanol. El precipitado se lavó con

etanol al 70% y se suspendió en 16 L de agua Milli-Q. Se analizó 1 L en un gel de agarosa al

0,8% para comprobar la cantidad y calidad del ADN.

La solución de ADN transformante se mezcló con 15 L de tampón KC y se añadió sobre 0,2 mL

de solución de protoplastos previamente dispensados en un tubo de 15 mL. Al tubo control se

añadieron 30 L de tampón KC. A continuación, se añadieron 0,5 mL de tampón PEG (30% PEG-

6000 w/v, 0,6 M KCl, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl [pH7,5], esterilizado por autoclave y

almacenado a -20ºC) y se mezcló por suave pipeteo. Se incubaron en hielo durante 30 minutos,

se volvieron a mezclar suavemente con micropipeta y se incubaron otros 30 minutos en baño

de agua a ~25ºC. Finalmente, se añadieron 12 mL de tampón KC, se mezcló suavemente, se

sedimentaron los protoplastos por centrifugación a 1200 g durante 10 minutos a 4ºC y se

repitió el lavado con KC. Por último, se suspendieron los protoplastos en 0,5 mL de tampón KC.

Paralelamente, se prepararon 3 alícuotas fundidas de ~4 mL de AMM+KCl con 0,4% agarosa y 1

alícuota de AMMU+KCl con 0,4% agarosa (suplementado con uracilo y uridina). Estos medios se

mantuvieron fundidos a ~48ºC en un tubo hasta su uso. Los protoplastos transformados se

sembraron del siguiente modo:

*Se añadieron 0,25 mL de protoplastos transformados sobre una alícuota de AMM+KCl con 0,4%

agarosa, se mezcló bien y se extendieron sobre la superficie de una placa de AMM+KCl con 1,5%

agar (se hicieron por duplicado).

*Se añadieron 0,25 mL del control sobre una alícuota de AMM+KCl con 0,4% agarosa, se

mezclaron bien y se extendieron sobre la superficie de una placa de AMM+KCl con 1,5% agar

(control de contaminación).

*Se añadieron 0,25 mL del control sobre una alícuota de AMMU+KCl con 0,4% agarosa, se

mezclaron bien y se extendieron sobre la superficie de una placa de AMMU+KCl con 1,5% agar

(control de regeneración de protoplastos).

Todas las placas se incubaron durante 24 h a 28ºC y posteriormente durante 48 h más a 37ºC en

atmósfera húmeda.

5.3. Selección de mutantes de Aspergillus fumigatus

Aquellas colonias que crecieron en las placas de transformación se resembraron por estría en

una placa de AMM estándar e incubaron durante 48 h a 37ºC. Tras repetir el proceso dos veces

más, colonias bien aisladas se resembraron en placas individuales de PDA para obtener conidios

de varios transformantes independientes.

94

En primer lugar, las cepas se analizaron por PCR para comprobar si habían incorporado

correctamente el ADN transformante. Esta comprobación previa nos permitió reducir

notablemente el número de transformantes que posteriormente analizamos por Southern-blot.

Para poder realizar la PCR obtuvimos mini-preparaciones de ADN genómico a partir de

protoplastos de cada aislado. Para ello, se inocularon los conidios de los distintos aislados con

hisopos estériles en alícuotas de 0,8 mL de SDN+Zn en tubos de 1,5. Se incubaron durante 15

horas a 37ºC en agitación. El micelio se sedimentó por centrifugación, se retiró el sobrenadante,

se añadieron 0,8 mL de tampón PB con VinoTaste (ver apartado 4.1 de materiales y métodos) y

los tubos se incubaron tumbados durante 30 minutos a 37ºC y 120 rpm. Se sedimentaron los

protoplastos a 2000 g durante 5 minutos a 4ºC y se suspendieron en 0,62 mL de tampón de

lisis (20 mM Tris-HCl [pH7,5], 50 mM EDTA, 0,2% SDS). Se incubaron 10 minutos a 37ºC en bloque

térmico. El ADN se extrajo con fenol/cloroformo/isoamílico y se precipitó con 3,0 M AcNa y 0,7

volúmenes de isopropanol del mismo modo descrito anteriormente. Finalmente, se suspendió

en 30-40 L de agua Milli-Q y se analizó su calidad en un gel de agarosa al 0,8.

5.4. Obtención de cepas PyrG– a partir de cepas mutantes PyrG+

Las construcciones utilizadas para mutar en sus propios loci los genes en estudio portaban el

gen pyrG de Aspergillus niger como marcador de selección flanqueado por dos regiones

idénticas ausentes en el genoma del hongo (Tgst, hisG o lacI). Éstas secuencias permitieron que

ocurriera espontáneamente un proceso de recombinación intracromosomal que eliminara el

marcador pyrG, de manera que las cepas se convirtieron en auxótrofas para uracilo. Para

seleccionar estas cepas se realizaron resiembras sucesivas en medio AMMU suplementado con

1 mg/mL de ácido 5´-fluororótico (5´-FOA) (Fermentas #R0811). Cuando este compuesto se

metaboliza por acción de la orotidina monofosfato decarboxilasa (proteína codificada por el gen

pyrG) se produce 5-fluoro-UMP (5-FUMP) que se convierte en 5-FUDP. Finalmente, el 5-FUDP se

transforma en 5-FUTP o 5-FdUMP. El 5-FUTP se incorpora al mRNA, el cual no se puede traducir

en el ribosoma. Por otra parte, el 5-FdUMP inhibe irreversiblemente la acción de la timidilato

sintasa y, por tanto, la síntesis de dTMP. Por tanto, al perder el gen pyrG, los hongos crecen

normalmente en medio con 5´-FOA, mientras que en presencia del gen pyrG las células fúngicas

se intoxican y dejan de crecer. Las cepas recuperadas se cultivaron en placas AMM y AMMU,

para comprobar que efectivamente habían perdido el gen pyrG. Estas cepas resultaron muy

útiles pues nos sirvieron para poder introducir una segunda mutación en la misma cepa usando

el mismo marcador de selección.

6. Obtención, detección y manipulación de ácidos nucleicos

La obtención, detección y manipulación de ácidos nucleicos de Aspergillus y E. coli se realizó

conforme a los procedimientos experimentales que se describen a continuación.

95

6.1. Obtención de ADN genómico de Aspergillus y análisis por Southern-blot

El ADN genómico de Aspergillus se extrajo a partir de micelio obtenido a partir de 20-40 mL de

medio AMM inoculado con 106 esporas/mL e incubado a 37ºC en agitación (200 rpm) durante

~24 horas. Este micelio se recogió por filtración y se lavó con agua destilada previamente a su

congelación en nitrógeno líquido. El micelio congelado se pulverizó en mortero y al polvo

obtenido se añadieron 1,6 mL de tampón de lisis (20 mM Tris-HCl [pH7,5], 50 mM EDTA, 0,2%

SDS) y 0,16 mL de SDS 10% (w/v). La mezcla se homogenizó por suave pipeteo y se incubó

durante 15 minutos a 65ºC en baño de agua. Tras ello, se añadieron 1,8 mL de tampón de

dilución (50 mM Tris-HCl, 20 mM EDTA, [pH 8]). De esta mezcla se extrajeron las proteínas,

restos de pared y otros contaminantes con 1 volumen de fenol-cloroformo-isoamílico (25:24:1).

Este paso se repitió hasta que la interfase quedó clara. Se realizó una última extracción con 1

volumen de cloroformo-isoamílico (24:1) y posteriormente se precipitó el ADN a partir de la fase

acuosa añadiendo 0,1 volúmenes de AcNa 3,0 M y 0,7 volúmenes de isopropanol, mezclando

por inversión y centrifugando a 3000 g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se lavó

con etanol al 70% (v/v), se dejó secar al aire, se suspendió en 0,6 mL de 10 mM Tris-ClH (pH 8,0),

se añadieron 10 L de una solución de RNAsa (DNAsa free) (10 mg/mL) y se incubaron a

temperatura ambiente durante 40 minutos. Para comprobar la calidad y cantidad, se analizaron

muestras de 1 L en un gel de agarosa al 0,8% y se guardó el resto a –20ºC hasta su utilización.

El ADN genómico se digirió con las enzimas de restricción adecuadas (~4 µg por muestra) y se

analizó mediante Southern-blot en geles de agarosa al 0,8%. Después se transfirió en

condiciones neutras a membranas de nylon (Hybond, Amersham) mediante capilaridad

siguiendo un protocolo estándar (189). Las sondas usadas para detectar los fragmentos de

interés se marcaron por random priming con dUTP-digoxigenina siguiendo las instrucciones del

DIG DNA Labelling Kit (Roche). La hibridación y detección de las sondas se realizó por

quimioluminiscencia según las instrucciones del DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche).

Los fragmentos de ADN utilizados como sondas para la comprobación de cepas mutantes por

Southern-blot se especifican en las leyendas de las correspondientes figuras en las que se

muestra la construcción y análisis por Southern blot.

6.2. Obtención de ARN total de Aspergillus y análisis por Northern-blot

El ARN total de A. fumigatus se purificó a partir de micelio obtenido por filtración de cultivos de

50 mL del medio correspondiente inoculado con 5 × 107 esporas, e incubados a 37ºC durante 20

horas. Tras recoger el micelio por filtración, se congeló y pulverizó totalmente en un mortero en

presencia constante de nitrógeno líquido. La extracción del ARN se realizó a partir de 100 mg de

micelio pulverizado de acuerdo a las instrucciones del RNeasy Plant mini kit (QIAGEN). El ARN

total (10 µg por muestra) se separó mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes

en geles de agarosa al 1% con 2,2 M de formaldehído. El ARN se transfirió por capilaridad a

membranas neutras de nylon según protocolo estándar (189).

Las sondas para la detección, se prepararon y marcaron radiactivamente siguiendo el siguiente

protocolo: Se desnaturalizaron ~50 ng de ADN de cada sonda en un volumen de 10 L hirviendo

96

10 minutos en baño de agua y se enfriaron rápidamente en hielo. A continuación, se añadieron

al tubo mantenido en hielo: 1L del oligonucleótido de interés (0,5M final), 3 L del dNTP mix

sin dCTP (25M cada uno), 1,5L de [-32P] dCTP (20Ci; 6,66 picomoles final), 2L Buffer

Klenow 10 y 2L Klenow (2 U/L) (Thermo Scientific #EP0054). La mezcla se incubó durante 1

hora a 37ºC en baño de agua.

La membrana con el ARN se pre-hibridó en tampón de hibridación (17,08 g/L NaH2PO4 anhidro,

50,78 g/L Na2HPO4 anhidro, 1 mM EDTA, 7% SDS) durante 1 hora a 65ºC. La sonda marcada

radiactivamente se desnaturalizó durante 10 minutos a 100ºC en bloque térmico y se añadió al

tampón de hibridación. La membrana se incubó con la sonda durante ~20 horas a 65ºC. Las

membranas se lavaron con SSC2 (0,03 M citrato sódico, 0,3 M NaCl, pH 7,0) + 0,1% SDS durante

5 minutos a 42ºC y después con tampón de hibridación 0,5 (diluido con agua) durante 20

minutos a 65ºC. Finalmente, se hizo un nuevo lavado con SSC2 + 0,1% SDS durante 15 minutos

a 65ºC. Las membranas se expusieron a -80ºC con pantalla intensificadora entre 2 horas y 8 días,

según la intensidad de la señal detectada.

Las sondas usadas para detectar la expresión de los diferentes genes se obtuvieron por PCR

usando las parejas de oligonucleótidos y plásmidos molde que se relacionan en la Tabla 3.

Tabla 3. Sondas utilizadas en experimentos de Northern-blot

Gen Tamaño Parejas de oligonucleótidos1 Plásmido

zrfB 507pb ZRFB-D/JA300* pZRF21g

zrfC 510pb ZRFC-D/JA54* pZRF30c aspf2 961pb JA166/JA167* pZRF30c

gfp 556pb JA502/qSGFP-R* pSGFP1

zafA 1037pb JA57/JA58* pZAF14

hisG 867pb JA493/JA494* pHISG

luciferasa 1146pb LUC-D/LUC-R* pLUC1 AFUA_2G03850 416pb JA421/JA422* pZRF21g

1Los oligonucleótidos señalados con un asterisco fueron los utilizados en la reacción de marcaje.

A partir de los datos por northern blot, se realizó una cuantificación relativa de la expresión de

cada gen usando Fiji, un paquete de procesamiento de imagen basado en ImageJ (190). Para ello

se digitalizaron las imágenes de las autorradiografías y las imágenes del ARN 18S obtenidas a

partir del análisis del ARN total de la muestra en gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Fiji

permite medir la intensidad de la señal en una determinada área, de modo que nos permitió

cuantificar con valores absolutos las intensidades tanto de las señales radiactivas, como de sus

respectivos controles. Los datos obtenidos se normalizaron dividiendo el valor de la señal

radiactiva por su respectivo control. El cociente se representó mediante un gráfico de barras.

6.3. Obtención de ADN plasmídico de Escherichia coli y análisis de restricción

La obtención de mini-preparaciones de ADN plasmídico de E. coli se realizó mediante el

procedimiento estándar de lisis alcalina. Se dispensaron alícuotas de 1 mL de LB+amplicilina en

tubos de 1,5 mL y se inoculó cada uno con una colonia bien aislada de la cepa de interés. Se

97

incubaron durante 15 horas a 37ºC a 200 rpm. Tras ello, las células se sedimentaron por

centrifugación a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa y se retiró el medio por

aspiración con bomba de vacío. Las células se suspendieron en 0,1 mL de tampón P1 (50 mM

Tris-HCl [pH 8,0], 10 mM EDTA, 0,25 mg/mL RNAsa), se añadieron 0,1 mL de tampón P2 (0,2 M

NaOH, 1% SDS) y se incubaron 5 minutos a temperatura ambiente. Tras esto, se añadieron 0,1

mL de tampón P3 (3 M AcK pH 5,5), se mezclaron bien y se centrifugaron 10 minutos a 16000

g. Tras ello se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se precipitó el ADN usando

isopropanol/etanol, tal y como se ha descrito previamente (ver apartado 4.2 de Materiales y

métodos).

Los análisis de restricción de ADN plasmídico se realizaron de manera estándar en tubos de 1,5

mL añadiendo los distintos componentes de la reacción en el orden y cantidades señaladas en

la Tabla 4.

Tabla 4. Reacción prototípica para un análisis de restricción estándar

Orden Componente Cantidad total por reacción

Volumen

1º H2O - 42 L

2º Tampón 10 1 5 L

3º Solución de ADN 0,2-1,5 mg 2 L

4º Enzima de restricción (10 U/L) 10 unidades 1 L

Total 50 L

7. Extracción y análisis por Western-blot de proteínas totales de Aspergillus

Los extractos de proteínas totales de Aspergillus se obtuvieron a partir de muestras de micelios

obtenidos por filtración de cultivos de 50 mL inoculado con 5 × 107 esporas e incubados a 37ºC

durante 18-20 horas. Tras recoger los micelios por filtración, se hicieron alícuotas de 100 mg de

micelio (peso húmedo), se congelaron con nitrógeno líquido y se liofilizaron. A las muestras de

micelios liofilizadas se añadieron 300 mg de Glasperlen de 0,4-0,6 mm de diámetro (Braun

Biotech, BBI-8541701) y se rompieron en FP120 Fast Prep (Bio101/Savant) mediante 3 pulsos de

20 segundos a máxima velocidad. Una vez pulverizados, se añadió 1 mL de tampón de lisis (0,2

M NaOH, 0,2% (v/v) 2-mercaptoetanol) por muestra de micelio pulverizado, se agitaron

vigorosamente al vortex, se extrajo la fracción líquida a la cual se añadieron 75 L de TCA al

100% (w/v) y se incubaron durante 10 minutos en hielo. Tras sedimentar las proteínas por

centrifugación durante 5 minutos a 16000 g, se retiró el sobrenadante, el pellet se lavó con

una solución de TCA al 0,2% y se suspendió en 0,2 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8,5). Para comprobar

la cantidad y calidad de las proteínas extraídas, alícuotas 2 L de cada extracto se suspendieron

en tampón de electroforesis desnaturalizante 4 (0,25 M Tris-HCl [pH 6,8], 8% SDS, 40 mM DTT,

40% Glicerol, trazas de azul de bromofenol) y se analizaron mediante electroforesis en geles

desnaturalizantes de poliacrilamida (SDS-PAGE, T = 12%; 30 mA por gel) según el protocolo

estándar (189).

Para realizar el análisis por Western-blot las distintas muestras de proteínas se separaron

mediante SDS-PAGE (T = 12%) y se transfirieron durante una hora a una membrana de PVDF

previamente humedecida en metanol aplicando una corriente de 300 mA en presencia de

98

tampón de transferencia (20 mM Tris, 0,19 M Glicina, 10% (v/v) Metanol). El éxito de las

transferencias se comprobó gracias al uso de marcadores de peso molecular pre teñidos (Page

Ruler Prestained Plus, Thermo Scientific, #26619), que pueden verse a simple vista. Tras ello, las

membranas se bloquearon con una solución de leche en polvo desnatada al 5% (w/v) durante

30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió a la solución de bloqueo la cantidad

recomendada del anticuerpo adecuado y se incubó ~18 horas a 6-8ºC en una noria con suave

agitación. En caso de ser necesaria la adición de un anticuerpo secundario, la membrana se lavó

3 veces durante 10 minutos con tampón TBST (10 mM Tris-HCl [pH7,5], 150 mM NaCl, 0,2% (v/v)

Tween-20) para quitar el exceso de anticuerpo primario, se añadió la cantidad adecuada del

anticuerpo secundario correspondiente sobre el propio tampón y se incubó durante 90 minutos

a temperatura ambiente en suave agitación. Los anticuerpos utilizados en este trabajo se

encuentran recopilados en la Tabla 5. En cualquier caso, como paso previo al revelado las

membranas se lavaron 3 veces durante 10 minutos con tampón TBST y una vez con TBS (TBST

sin Tween-20). En todos los casos, se procedió al revelado quimioluminiscente usando el kit

WesternBright ECL (Advansta, K-12045-D50) sobre películas CL-XPosure Film (Thermo Scientific,

#34089) y usando una máquina de revelado M35 X-OMAT (Kodak).

Tabla 5. Anticuerpos utilizados

Anticuerpo Especificaciones Fuente

Anti-c-myc-Peroxidase

Monoclonal (clon 9E10) primario producido en ratón y conjugado a peroxidasa. No necesita secundario

Roche (ref. 11814150001)

Anti-GFP, C-terminal

Monoclonal primario producido a partir de células de ratón. Reconoce el extremo C-terminal de la GFP

BD living colors JL-8 (ref. 8371-2)

Anti-GFP, N-terminal

Policlonal primario producido en conejo frente al epítopo 3-17 de la GFP y conjugado al hapteno KLH

Sigma (ref. G1544)

Anti-V5 tag Monoclonal primario producido a partir del clon SV5-Pk1 en células de ratón. Reconoce el epítopo: IPNPLLGL

Bio Rad (ref. MCA1360)

Anti-actin (C-2) Monoclonal primario producido a partir de células de ratón. Reconoce el epítopo 350-375 del C-terminal de la actina humana (100% identidad con la de A. fumigatus)

Santa Cruz Biotech (ref. sc-8432)

Anti-mouse IgG (H+L)-Peroxidase

Policlonal secundario producido en caballo y conjugado a peroxidasa

Enzo life Sciences (ref. VC-PI-2000-M001)

Anti-rabbit IgG (H+L)-Peroxidase

Policlonal secundario producido en cabra y conjugado a peroxidasa

BioRad (ref. 170-6515)

8.- RT-q-PCR

Se usó la técnica conocida como Real Time Quantitative PCR para cuantificar de forma más

precisa los niveles de expresión de zrfB, zrfC y zafA en distintas cepas.

Extractos de ARN obtenidos por el método detallado en el apartado 6.2 de esta sección se

cuantificaron por espectrofotometría con NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y se igualaron a

una concentración de 150 ng/L. Tras ello, se eliminaron los restos de ADN de la muestra con

1,5g de RQ1 RNAse free DNAse I (Promega, M6101) y siguiendo las instrucciones del

99

fabricante, y se comprobó su eliminación realizando una PCR convencional para el gen de interés

de cada muestra, en la que no se observó amplificación.

Posteriormente se procedió a la síntesis de cDNA a partir de cada muestra por random priming

usando la SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, 18064-014) siguiendo las

instrucciones del fabricante.

La cuantificación se realizó mediante el método Ct usando como control el valor del ARN 18S

en cada muestra. Para ello, una vez obtenido el cDNA, se preparó una dilución 1/4 del mismo

para medir los genes de interés, y una dilución 1/1600 para medir el ARN 18S. Las reacciones de

RT-q-PCR se prepararon con: 5 L de SYBR Premix Ex Taq (TAKARA, RR420A), 0,25 L de cada

oligo (6 M) 2,5 L de agua MilliQ y 2 L de muestra. Se hicieron duplicados de cada muestra.

Las parejas de oligos utilizadas (Tabla 6) habían sido validadas con anterioridad mediante la

cuantificación de diluciones seriadas de ADN genómico de Aspergillus.

La reacción y la medición de los resultados se realizó con CFX96 Real-Time System (Bio Rad) (39

ciclos: 10’ a 95ºC; 20’ a 59ºC; 20’ a 72ºC). La normalización de los datos se realizó mediante la

aplicación de la fórmula (2Ct problema – Ct 18S).

Tabla 6. Oligonucleótidos usados para RT-q-PCR

Nombre Secuencia (5’ 3’) ZAFA-D1 GGCAAGTCATTTACCGACAGC

ZAFA-R1 TCGATGACTTGACATGTTGGACG

ZRFB-D ACCGGCAGAAGAAGCATTGA

ZRFB-R ACCGCATCACCATCAACTCA

ZRFC-D CAAACTCTCGGTGCTCGTCA ZRFC-R GAAGACAATCACCACCAGCA

18SRNA-D TGTTAAACCCTGTCGTGCTG

18SRNA-R GTACAAAGGGCAGGGACGTA

9.- Técnicas de ingeniería genética utilizadas rutinariamente

Se usó la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) y se realizaron digestiones de plásmidos

con enzimas de restricción y reacciones de ligación para procedimientos rutinarios de clonación

y subclonación de fragmentos de ADN mediante transformación de E. coli.

9.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La PCR se utilizó con mucha frecuencia para obtener fragmentos de ADN genómico y para la

comprobación de mutantes. Para el primer caso se utilizó el enzima Pfu Turbo DNA Polimerase

(Thermo Scientific #EP0501), mientras que para reacciones rutinarias de comprobación de

mutantes se utilizó la Taq DNA Polimerase (New England Biolabs, #M0267L). Las reacciones de

PCR se prepararon según se describe en la Tabla 7. Los oligonucleótidos utilizados en la

realización de este trabajo se encuentran recopilados en la Tabla 8.

100

Las temperaturas de anillamiento de los distintos oligonucleótidos (entre 54-61ºC), se calcularon

para cada caso usando la herramienta Oligo Analyzer (http://eu.idtdna.com/calc/analyzer), disponible online. La temperatura de elongación siempre fue 72ºC, excepto en los casos en que el amplicón fue > 2,5 kb en cuyo caso la temperatura de elongación fue de 70ºC. La duración de

las reacciones de elongación fue de 1 minuto por kilopar de bases (kb) (para la Taq polimerasa) o de 2 minutos por kb (para la Pfu polimerasa). El nº total de ciclos osciló entre 32 y 35.

1Alternativamente se añadieron 0,5 L de la Pfu DNA polimerasa (2,5 U/L)

Tabla 8. Oligonucleótidos

Nombre Secuencia (5’ 3’) ZRFB-D ACCGGCAGAAGAAGCATTGA

ZRFC-D CAAACTCTCGGTGCTCGTCA

LUC-D TCCATGTACACCTTCGTCACCT

LUC-R CTTCTTGGCCTTGATCAGGATCTC qSGFP-R GACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTC

JA15 GAAGAATGATCAGAGGAGTGG

JA54 GATTCGTTAACAGCTTCAGAGCAAACAAGG

JA57 TACTTCCGTCGTCGACCATCG

JA58 CCGTGTGCGTCCGTGAATGCG JA109 CATCTACACTGCTCTTGTGGAGC

JA153 ACTAGTCCGGAGCCTCCGCGTC

JA157 ATCAGCATAAGCACGAGGG

JA166 ATGTCTAGAATAATGGCTGCTCTCCTCCG

JA167 GATATCGGATCCTCGCCTAAGTGC JA197 TGTCTCCATCCAGATTGGCACGC

JA205 TGCTTCTCCAGCTTCGGATCC

JA240 TGGAGGGTTAACGGACGTCGTCTGCC

JA281 TGGGAGAGGAACTCTTGG

JA298 AGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC

JA300 AGTGAAGCGTTTCGAGTTGGGC JA400 CCCGGGAATTCAAAACTCGGGAAG

JA401 TCTAGACGAGCATCATCCCCCATGGT

JA403 ACTAGTGAATTCACCTGACCGGGA

JA404 ACTCGTAGATCCGCACACATCG

JA415 GATATCTTGTACATACTTTTCTCTGCCC JA421 AGATGATTTCGAGGTCGCCTTGT

JA422 GAGCTCTCGCCTTATTGCCCTT

JA436 CAGTACTACCACCGCTTTGTTG

JA437 CAGTATAGCGACCAGCATTCAC

JA463 GAAGTCCCTGATCAAGTACAAGGGCTAC JA493 GCGCGATACAGACCGGTTCAGAC

JA494 CAGAACAACGTTTCGCTGCTGACCA

Tabla 7. Reacción típica de PCR

Orden Componente Cantidad

1º H2O 19,375 – x L 2º PCR buffer (10) con Mg2+ 2,5 L 3º Oligonucleótido A (10 M) 1,25 L

4º Oligonucleótido B (10 M) 1,25 L 5º Dilución del ADN molde x L 6º dNTPs (10 mM de cada) 0,5 L 7º Taq DNA polimerasa (5 U/L)1 0,125 L

Total 25 L

http://eu.idtdna.com/calc/analyzer

101

JA498 GAGAGCTAGCCATTGGCAACGGAG JA499 AGCCATCAAGATGCATGGTTCGTTTGT

JA502 GCGACGTAAACGGCCACAAGTTC

JA505 GCCGTTAGGGATATCTGCAATGAGTGCGT

9.2. Mutagénesis dirigida

Para la creación de las distintas versiones mutadas de los promotores de zrfB y zrfC se utilizó la

técnica de mutagénesis dirigida sobre plásmidos. Para ello, un plásmido que portaba el

fragmento de ADN que se deseaba modificar se sometió a una reacción de PCR para amplificar

todo el plásmido con dos oligonucleótidos complementarios que portaban hacia la mitad de su

secuencia la mutación que se deseaba introducir. Para este propósito se utilizó el enzima Pfu

Turbo DNA Polimerase (Thermo Scientific #EP0501). En este caso, a diferencia de las reacciones

de PCR estándar, se realizaron tan sólo 15-16 ciclos a una temperatura de elongación de 68ºC,

con un tiempo de elongación de 2 minutos por kilobase a amplificar y una temperatura de

anillamiento de 55ºC. Tras ello, se comprobó que la amplificación había funcionado

correctamente analizando 10 L de la reacción de PCR en un gel de agarosa al 0,8%, y después

se añadió a la reacción 1 L de la enzima de restricción DpnI (10 U/L) y se incubó a 37º durante

90 minutos para eliminar restos del plásmido original. Por último, se usaron 5 L de la solución

final para transformar E. coli DH5

9.3. Clonación de fragmentos de PCR

Los amplicones obtenidos mediante PCR se purificaron conforme a las instrucciones descritas

en QIAquick Gel Extraction Kit (Quiagen, 28706). Los fragmentos de PCR purificados que habían

sido obtenidos con la Taq DNA polimerasa, que no tienen actividad exonucleasa 3’5’, se

clonaron de forma sistemática mediante el procedimiento del TA-cloning en el plásmido pGEM-

T-easy (Promega, A137A). Los fragmentos de PCR purificados obtenidos con la Pfu DNA

polimerasa, que al contrario que la Taq DNA polimerasa si exhibe actividad exonucleasa 3’5’,

se incubaron a 72ºC durante 15 minutos en presencia de 0,2 mM dATP y 5 unidades de Taq DNA

polimerasa para añadir un nucleótido de adenina en cada extremo 3’ con el fin de hacer posible

su posterior clonación mediante el procedimiento del TA-cloning en el plásmido pGEM-T-easy

(Promega, A137A). En todos los casos, las reacciones de ligación de los distintos fragmentos de

ADN a los plásmidos de interés se realizaron utilizando las condiciones del prospecto de la T4

DNA ligase (Thermo Scientific, #EL0011).

9.4. Transformación de células competentes de Escherichia coli

Todos los plásmidos construidos se rescataron transformando la cepa DH5 de E. coli. Para

transformar esta bacteria se añadieron 5 L de cada reacción de ligación a 0,1 mL de una

suspensión de células competentes (DO600nm = 10). Esta mezcla se incubó durante 30 minutos en

102

hielo, tras lo cual se le aplicó un choque térmico transfiriendo los tubos a un baño de agua a

42ºC durante 1 minuto y después a hielo durante 1 minuto. Se añadieron 0,8 mL de medio LB

líquido y se incubaron 1 hora a 37ºC a 200 rpm antes de sembrarlas por extensión en medio

selectivo (LB+ampicilina). Además, los plásmidos construidos utilizando el p-GEM-T-easy

(Promega, A137A) se seleccionaron por -complementación sobre placas de LB+ampicilina

suplementadas con 32L de Bluo-Gal (25 mg/mL) y 3L de IPTG 1 M. Todas las placas se

incubaron a 37ºC durante 15 horas, se re-seleccionaron varios transformantes independientes,

se obtuvieron mini-preparaciones de DNA plasmídico y se realizó un análisis de restricción con

las enzimas adecuadas para comprobar si el plásmido que portaban era el esperado. Finalmente,

se guardaron stocks en glicerol a –80ºC de las cepas de E. coli con las construcciones adecuadas.

10. Plásmidos utilizados para generar cepas mutantes de S. cerevisiae

Los plásmidos utilizados para generar todas las cepas mutantes de S. cerevisiae construidas

durante la elaboración de este trabajo se recopilan en la Tabla 9.

Tabla 9. Plásmidos para transformar Saccharomyces cerevisiae

Plásmido Descripción Referencia

pRS425 Vector episómico para levadura derivado del pBLUESCRIPT II que porta el marcador auxotrófico LEU2.

(191)

pRS426 Vector episómico para levadura derivado del pBLUESCRIPT II que porta el marcador auxotrófico URA3.

(191)

pRIM2 Porta el marcador KanMX6 flanqueado por la región promotora y terminadora de gen RIM101 de S. cerevisiae. Se utilizó para construir la cepa HTP1.

Este trabajo

pPZ1 Derivado del pRS426. Porta las regiones codificantes de V5-pacCwt-VC155 y VN173-ZafA, ambas bajo el control del promotor GAL1. Se utilizó para construir la cepa HTP12.

Este trabajo

pZAF146 Derivado del pRS426. Porta la región codificante de vEGFP-ZafA bajo el control del promotor GAL1. Se utilizó para construir la cepa HTP13 (cepa control).

Este trabajo

pASPF2-ZRF34 Derivado del pRS425. Porta la región codificante de la luciferasa NanoLuc (136) bajo control del PzrfCwt y del terminador ADH1. Se utilizó para construir la cepa HTP14.

Este trabajo

pASPF2-ZRF35 Derivado del pRS425. Porta la región codificante de la luciferasa NanoLuc (136) bajo control del PzrfCPR123456 y del terminador ADH1. Se utilizó para construir la cepa HTP15.

Este trabajo

11. Construcción de cepas mutantes de Saccharomyces cerevisiae

Se cultivaron las cepas de S. cerevisiae deseadas en 50 mL de medio YEPD a 30ºC durante el

tiempo necesario hasta que las células alcanzaron el inicio de la fase de crecimiento exponencial.

En este momento las células se sedimentaron a 3000 g durante 5 minutos y se lavaron una vez

con agua Milli-Q estéril y otra vez con el tampón TE/LiAc (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,1 M

LiAc [pH7,5]). Tras ello se suspendieron de nuevo en 0,5 mL de tampón TE/LiAc y se hicieron

103

alícuotas de 50 L de la suspensión de células en tubos de 1,5 mL. Para cada transformación se

añadieron ~1 g de ADN transformante (ADN lineal o plasmídico) disuelto en agua, 5L de

Salmon sperm DNA (10 mg/mL) (Thermo-Fischer Scientific, 15632-011) y 0,3 mL de PEG 4000 al

50% (w/v) (Merck, 25322-68-3). Esta mezcla se incubó durante 30 minutos a 30ºC en agitación.

Posteriormente se le aplicó un choque térmico a 42ºC en baño de agua durante 15 minutos, se

sedimentaron las células por centrifugación a 10000 g durante unos segundos, se retiró el

sobrenadante, se suspendieron las células en tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH7,5]),

se sembraron en placas de medio selectivo y se incuban 48 horas. Tras este periodo de

incubación, se reaislaron los transformantes en medio selectivo fresco antes de proceder a su

análisis.

La selección de la cepa de S. cerevisiae HTP1, se realizó en placas de YEPD acidificado (pH ~ 5

con HCl) suplementado con 200 g/mL geneticin (G418) y 0,2 mM ZnSO4. Las demás cepas

mutantes de S. cerevisiae (HTP12-15) se seleccionaron en medio SDA suplementado con 1 mM

ZnSO4 y la mezcla CSM drop-out adecuada.

Las cepas de interés se inoculan en 1 mL de YEPD dispensados en tubos de 1,5 mL que se

cultivaron tumbados durante 18-20 h a 28ºC en agitación. Las células se sedimentaron por

centrifugación, se retiró el sobrenadante y se suspendieron en 0,15 mL de tampón P1 (50 mM

Tris-HCl [pH 8,0], 50 mM EDTA), se añadieron 0,15 mL de tampón P2 y se incubaron a 65ºC

durante 20 minutos. Tras haberlos dejado enfriar se añadieron 0,15 mL de tampón P3 y la

suspensión del ADN genómico se clarificó centrifugando a 20000 g durante 20 minutos a 4ºC.

A continuación, 0,4 mL de los sobrenadantes clarificados se transfirieron a tubos nuevos y el

ADN genómico se precipitó con AcNa/isopropanol, según se ha descrito. El ADN se suspendió en

15 L de 10 mM Tris-ClH (pH 8,0) y se analizó su calidad por electroforesis en geles de agarosa

0,8%.

12. Ensayo de BiFC in vivo en Saccharomyces cerevisiae

Para analizar la posible interacción entre PacC72 y ZafA in vivo a nivel de ADN en el promotor de

zrfC se utilizó la técnica de complementación por bifluorescencia molecular (BiFC). Para ello se

generó una cepa de S. cerevisiae que co-expresaba versiones marcadas de ambas proteínas:

PacC72::VC, en la que PacC72 llevaba fusionada en su extremo carboxilo el dominio C-terminal de

la proteína Venus-EYFP (192) (VC155) (133), y VN::ZafA, que llevaba fusionada en su extremo

amino el dominio N-terminal de la proteína Venus-EYFP (VN173) (133).

Para inducir la producción de proteínas en las cepas de S. cerevisiae bajo el control del promotor

GAL1, se inocularon dichas cepas en 10 mL de medio YEPR y se incubaron a 28ºC durante ~24

horas. Posteriormente se recogieron las células por centrifugación a 3000 g durante 5 minutos,

se retiró el sobrenadante y se inocularon en 50 mL de medio SRA suplementado con 1 M ZnSO4

y el CSM drop-out adecuado según las auxotrofías, y se incubaron 24 horas a 28ºC. Tras ello, el

cultivo se repartió en dos matraces y a uno de ellos se indujo la expresión añadiendo 2%

galactosa; así resultaron dos cultivos, SRA+Gal y SRA–Gal que se incubaron durante 14 h más

antes de repartirse de nuevo cada uno en dos matraces, uno de los cuales se suplementó con

100 M ZnSO4. Finalmente, tras 6 horas de incubación a 28ºC a 200 rpm se midió la DO600nm de

104

todos los cultivos, se prepararon suspensiones iguales de células con una DO600nm = 1, se

sedimentaron por centrifugación, se suspendieron en 0,1 mL de tampón de BiFC (NaPO4 [pH

8,0], 0,15 M NaCl, 5% glicerol), se dispensaron en una placa multipocillo negra y se midió en un

lector de placas Varioskan Flash (Thermo Scientific) tras excitación a 485 nm y emisión a 528 nm

durante 1 segundo y con excitación a 515 nm y emisión a 528 nm durante 1 segundo tras la

excitación. Se realizaron 3 mediciones de cada pocillo a intervalos de 2 minutos.

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