ESTRUCTURA Y LAS INTERACCIONES BIOLÓGICAS DE HEPARIN Y HEPARAN SULFATO

Por: BENITO CASU Y ULF LINDAHL

Heparin ha estado en el empleo clínico durante décadas, prevenir y curar la enfermedad tromboembólica.

Es sólo relativamente recientemente que los mecanismos moleculares detrás de los efectos de

anticoagulant/antithrombotic fueron aclarados. Un artículo anterior sobre el sujeto en este series1 destacó

algunos avances principales en nuestra comprensión de estos mecanismos, en particular en cuanto al papel

de antithrombin (EN) y su interacción con el polisacárido. Estas relaciones ahora pueden ser explicadas en

el detalle molecular. El desarrollo más importante de años recientes ha sido el cultivar - ing la conciencia de

la distribución ubicua, la diversidad estructural, y la importancia biológica de sulfato heparan (HS)

.anteriormente era por lo general un subproducto querido.

Los componentes de monosacárido de heparin/HS, con abreviaturas y símbolos. (a) Uronic residuos ácidos.

(b) Glucosamine residuos, con unidades adyacentes uronic ácidas. La demostración de residuos substituidos

de forma diversa GlcN y unidades adyacentes está basada en HexA-GlcN relatado y GlcN-HexA.

ESTRUCTURE E INTERACCIONES BIOLÓGICAS.

de fabricación de heparin, HS ahora es reconocido como una familia de múltiple, estrechamente re lated la

especie de polisacárido aún distinta. De hecho, heparin bien puede ser considerado simplemente otro

miembro de esta familia. Debido a la diversidad estructural de la familia heparin/HS, los polisacáridos son

capaces de atar un número grande de proteínas diferentes, y así pueden ser concebidos como los

reguladores importantes de una variedad de procesos biológicos. La investigación intensa actualmente es

apuntada a la clarificación del registro - ulatory las funciones de HS en el factor de crecimiento y la acción

cytokine. A la inversa, varios efectos biológicos ejercidos por heparin exógeno ahora están siendo

considerados en términos de reforzados o competidos con, HS funciones.

¿Con la comprensión profundizada de estructura de HS y función, allí ha estado cultivando la perspicacia en los mecanismos que controlan la formación de speci? c saccharide secuencias durante la biosíntesis de heparin/HS. En la par - ticular, este progreso ha implicado la reproducción molecular de las enzimas en - volved en el proceso de biosynthetic y sobre su caracterización en el nivel génico. Varios aspectos de este desarrollo han sido hablados en revisiones, 2-6 actas de simposio, 7 y un libro 8 las actividades Biológicas de heparin/HS otro que anticoagulant/antithrombotic también extensivamente ha sido estudiado y reviewed.8-14

¿El artículo presente dará principalmente con aspectos estructurales y las relaciones de actividad de estructura de heparin/HS, pero también con pertinente? ¿ndings en cuanto a polysaccha-montan la formación, por procesos de biosynthetic o la síntesis química nuestro modi? catión.

II. BIOSÍNTESIS:

¿Aunque heparin y HS a menudo sean descritos en términos de sus secuencias frecuentes disac-charide, la biosíntesis compleja de estos glycosaminoglycans (MORDAZAS) conduce a varias combinaciones de secuencias que implican nonsulfated y de forma diversa sulfated al ácido de D-glucuronic (GlcA), el ácido de L-iduronic (IdoA), N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), N-sulfo-D-

glucosamine (GlcNSO3), y la D-glucosamine (GlcN) unidades (el Higo 1) .All de estos residuos son " un " (1? ¿4) - unido excepto GlcA, que es ß - (1 4) - unido.

Heparin es sintetizado en el tejido conjuntivo, como la parte de los proteoglicanos.HS es producido por la mayoría Mamíferos (y muchos otros) de las células y está destinados a una variedad de proteínas fundamentales, en syndecans particular, gly-picans, perlecan, y agrin. La traducción siguiente en bruto endoplasmic reticulum (la NUEVA R), las proteínas principales son transportadas al aparato Golgi, donde las enzimas responsables de la biosíntesis HS/HEPARIN son localizadas. Seleccionado serine unitsareO-substituido con el GlcA-Gal-Gal-Xyl-" la región de acoplamiento " que une la cadena de polisacárido apropiada con la proteína principal. La estructura de hidrato de carbono a menudo su región es la misma para glucosaminoglycan-(heparin/HS) y galactosamino-glycan (chondroitin el sulfato, dermatan el sulfato) conteniendo proteoglycans (aunque el modelo de substituent pueda diferenciarse), y mismo glycosyltransferases aparece estar implicado en su biosíntesis, independientemente de la naturaleza del glycosaminogly-puede (AMORDAZAR) la cadena 24 la Mayor parte de estas enzimas ahora han sido reproducidas.

La siguiente reacción, la transferencia de un residuo GlcNAc de UDP-GLCNAC para formar un acoplamiento a C4 de la unidad GlcA en la región de acoplamiento, aparece ser el paso de comisión hacia la formación de HS/HEPARIN más bien que el sulfato chondroitin/dermatan. La enzima correspondiente es al parecer capaz de distinguir entre proteínas principales diseñadas para HS y el accesorio de sulfato chondroitin, por lo visto por recog-nition del péptido rasgos estructurales antes asociados con la adición HS (un racimo de residuos ácidos, aminoácidos hidrófobos, y un espaciado cercano de gly-cosylation sitios). ¿Un GlcNAc transferase con las propiedades correspondientes ha sido parcialmente puri? el editor y más recientemente fue reproducido. Notablemente, thisenzyme es capaz de transferir una unidad a-GalNAc también al mismo aceptador, así dis-tinct del ß-GalNAc la transferencia que inicia la formación 29,30 de sulfato chondroitin el residuo a-GalNAc evidentemente puede servir como un stop que impide más lejos GAGf ormation. ¿Formación de los los reales [ß-glca-(1? ¿4)-a-glcnac-(1? 4)] la n heparin/HS la estructura de precursor es catalizada por un GlcA/GlcNAc copolymerase.31 la Reproducción de esta enzima notablemente reveló la existencia de dos isoforms que eran idénticos con el tumor presunto suppressionf actores EXT1 andEXT2. Datos intrigantes recientes sugieren que EXT1 Y EXT2 funcionen como un complejo hetero-oligomeric en el Golgi.

¿La conversión de la estructura de precursor de n (GlcA-GlcNAc) en los productos rec-ognized como heparin/HS ocurre por una serie de polímero-modi? ¿reacciones de catión, esquemáticamente ilustradas en el Higo 2a, 4 cuál también muestra las estructuras de la secuencia principal disaccharide 1 del extensivamente modi? ¿editor NS-dominio, y 2 del unmodi? editor NA-dominio. ¿Este polímero modi? ¿el catión aparece ser iniciado mientras la cadena es todavía bajo la elongación 36 las reacciones individuales y su estafa - certed la acción han sido descritas en reviews.3,4 reciente el ? ¿rst modi? paso de catión, N-deacetylation y N-sulfation de residuos GlcNAc, es catalizado por aún otra enzima bifunctional. ¿El resultado grupos de Sulfato de n el requisito previo es a todo el subse-quent modi? cationes, que incluyen C-5-epimerization de GlcA al ácido de L-iduronic (IdoA) unidades, 2-o-sulfation de GlcA y unidades IdoA, y de 6 o - y 3-o-sulfation de residuos GlcN. El proceso ocurre en al menos la manera en parte gradual, tal que los productos de una reacción dada proporcionarán el sustrato para reacciones subsecuentes. ¿Sin embargo, la mayor parte de las reacciones no van a la terminación, como típicamente una fracción de los residuos de sustrato potenciales en cada paso evitará modificación. Tal parcial

ESTRUCTURA E INTERACCIONES BIOLOGICAS

modificación del

polímero es una característica fundamental del proceso debiosíntesis y la causa directa de la estructura del dominio diversi

fied de cadenas HS.En este contexto la heparina puede considerarse como un producto de la modificaciónde polímeros m

enos restringido, esencialmente un extendido NS-dominio (Fig. 2a). Unproducto típico de la modificación del

polímero estrictamente regulado es elhexasaccharide 3 (Fig. 2b), que incorpora el mínimo (pentasacárido) secuenciavincula

nte en 4.

Aunque los mecanismos básicos de modificación de la biosíntesis del

polímero hansido aclados, la organización y regulación del proceso global siguen

siendo malentendidas. La mayoría de las enzimas implicadas son glicoproteínas y se hapresumido que forman uno o más c

omplejos, Unidos a las membranas de Golgi, queatacan a la cadena de polisacárido de manera procesual (ver modelo en R

ef. 2).Aparente de acuerdo con esta noción, polímero modifi-

cación es un proceso rápido,una cadena de heparina se completa en menos de 30 s.37 aunque este modelo pareceatractiv

o no está establecido, y no podemos excluir otros modos de GAG Asamblea.Cualquiera que

sea la solución final a este problema, tendrá en cuenta para el controlmuy estricto de expresión HS, como reveló a

través de análisis compositivo de HS dediversos órganos, 38,

39 y, en particular, mediante la aplicación deinmunohistoquímica de los anLos resultados recientes de la clonación de

estas enzimas añadir más complejidad. At-zymes todos (con algunas excepciones) son proteínas transmembrana con

topología de tipo II. Sin embargo, varias especies ocurren como genéticamente distintas isoformas, las características

funcionales de los cuales sólo han comenzado a ser revelados, pero claramente implican variaciones en el patrón de

expresión así como sustrato specificity y propiedades catalíticas. El modo de expresión y el sustrato specificities de estas

isoformas presumiblemente determinan las propiedades del producto final polisacárido estructurales. Aunque una lista

detallada de las distintas especies de enzima cae fuera del alcance de este capítulo, se resaltará algunas características

llamativas. El trans-ferase GlcNAc que añade el residuo GlcNAc primero en la región de vinculación fue encontrado

pertenecen a la misma familia de proteínas como la enzymes.28 de copolymerase de EXT1/EXT2 el GlcNAc N-

deacetilasa/N-sulfotransferasa (NDST en la Fig. 2) que cataliza la modificación inicial del polímero n (iniciativa-GlcNAc) ha

demostrado que se producen en al menos cuatro isoforms.42–45 diferentes dos de estas especies, NDST-1 y NDST-2,

ambos muestran expresión ubicua en una variedad de células y tejidos. Sobreexpresión experimentos indicaron que la

última forma es más propensa a generar secuencias de N-sulfatada extendidas, del tipo encontrado en heparin.46 notable,

disrup-ción específica del gen en ratones NDST-2 selectivamente abolió la biosíntesis de la heparina en tejido conectivo

tipo mastocitos, pero en cambio no tuvo ningún efecto notable en HS biosynthe-sis, o en el estado de salud aparente de

la animals.47, Ratones knockout NDST-1 sintetiza undersulfated HS y murió antes o durante el período neonatal, con

graves defectos múltiples del órgano.ticuerpos monoclonales contra diferentes HSepitopes.40

Fig.2. (a) generación de la estructura del dominio típico durante la biosíntesis de HS.Para la definición de símbolos ver Fig.

1 y las unidades del disacárido dos modelo que se

muestra a continuación el esquema. Los residuos de destino para cada reacciónenzimática se indican mediante las puntas

de flecha. NS-dominios están compuestospor unidades del disacárido de N-sulfatada contiguos, NA/NS-

dominios por unidadesde N-sulfatada y N-acetilada alternos y NA-dominios por unidades de N-acetiladacontiguas. AT-

bd: Secuencia de pentasacárido AT-obligatorio. (Modificar desde Ref. 4).(b) detallada estructura de la secuencia en

vinculante (unidades 1-5 entre las líneaspunteadas verticales). Los grupos sulfato en

círculo son esenciales para la interaccióncon AT. (Reimpreso con el permiso de ref. 4)

que ocurre en menos de tres formas diferentes. Curiosamente, se han encontrado hasta el momento sola formas de la

iniciativa C-5-epimerase (EPI) 51 y el IdoA 2-O-sulfotransferasa (2-OST) 52,53. IdoA unidades en diferentes contextos

estructurales, tales como la "alternativa-ing" NA/NSdomains y las estructuras contiguas de NS de cadenas HS, o de la

heparina, así pueden ser generadas por la misma enzima. Por otra parte, el 2-OST sulfatos no sólo IdoA pero también

aumentarán units.53–55 de hecho, sobreexpresión de OST-2 recombinante en células de riñón embrionario humano

condujo a 2-O-sulfatación selectiva de unidades aumentarán en HS endógeno, 53, sugiriendo que la abundancia relativa

de dichos residuos en HS de ciertas tissues38 puede depender de la disposición de 2-OST en el sistema de Golgi de las

células adecuadas. En el futuro, cada vez más se correlacionará los aspectos funcionales del HS con análisis de la estructura

del epítopo y el substrato specificities de at-zymes biosintéticas. Como ejemplo para destacar de este desarrollo, residuos

de N-sustituidos GlcN fueron demostrados, mediante un enfoque de inmunohistoquímica, para formar parte de

structures.40 HS nativa aunque se desconoce el mecanismo de formación de N-sustituidos GlcN unidades, una de las

isoformas NDST recientemente descubiertas, NDST-3, es potencialmente implicado debido a su actividad de N-deacetilasa

relativamente alta y baja actividad N-sulfotransferasa comparado con otros isoenzymes.56 NDST la ocurren-rence de

residuos GlcN N-sustituidos se encontró que se correlaciona con la capacidad de HS para interactuar con L-selectin.57 por

otra parte, una de las isoformas 3-OST pista - cialmente ataca GlcN N-sustituidos los residuos, 15 y la resultante GlcN(3-

OSO3) estructura es específicamente reconocido por la glicoproteína gD capsular de virus del Herpes simple 1, en un paso

esencial de la penetración viral de la célula huésped.

papel propuesto de 3-O-sulfatación también en la formación de complexes58 HS-FGF-

FGFR no es apoyado por los experimentos más recientes. Identificación de uncreciente número de secuencias de novela H

S subraya la vista que HS no es siempredifferen-

trasero de heparina por mero análisis compositivo. Aunque HSs songeneralmente más

ricas en unidades del disacárido de N-acetilada y contienen menosO-sulfatos (especialmente IdoA2SO3) que las heparinas,

60, 61 un tala rasa en

el límiteentre las dos especies no se dibuja fácilmente. Una característica más distintiva es laorganización de dominio típico

de cadenas HS, dictadas por los patrones de N-

sustituyentes y complementa la distribución diferencial de los diversos grupos O-sulfato.

ANALISIS ESTRUCTURAL

ESTRATEGIAS GENERALES

Aclaración de la heparina y las estructuras HS se ha ampliado continuamente mediante la optimización de los métodos

clásicos, así como por desarrollar más eficiente de separación y métodos espectroscópicos. Aunque en casos favorables

"fingerprints" de los preparados de heparina, proporcionada por espectros de resonancia magnética nuclear (RMN), podrá

permitir análisis composicional y caracterización de los patrones de sulfatación, estructuras de análisis detallado de la

heparina (y especialmente de los más complejo HS) requiere en gran medida la caracterización de GAG fragmentos

generados por liasas heparina o ácido nitroso o ambos. Intercambio aniónico HPLC, electroforesis en gel de poliacrilamida

degradado, electroforesis en gel de agarosa, y electroforesis capilar, son ejemplos de metodologías que han contribuido a

aislar oligosacáridos de andheparin/HS de heparina fracciones susceptibles de análisis estructural por una combinación de

productos químicos, enzimáticos, y espectroscópicas methods.66 espectrometría de masas (MS) tiene definitely

consolidado como una importante herramienta para el análisis estructural de los oligosacáridos sulfatadas, previamente

apenas ac-accesible a este approach.74 analíticos estos avances han vuelto posibles mediante el desarrollo de estrategias

para la explotación del bombardeo rápido átomo (FAB), 75 – 77 FAB-tandem (FAB-MS-MS), 78, 79 ionización por

electrospray (ESI), 80-82 y desorción secundario líquido (LSI) 83 MS técnicas. Más recientemente, matriz asistida por

ionización de la desorción del laser (MALDI) ha añadido una nueva dimensión a la MS, debido a su casi ilimitada, aunque

aún inexplotadas en gran medida, poten-tial analizar cantidades subnanogram de sulfatada fragmentos

glucosaminoglicano sobre una amplia gama de weights.84,85 molecular ahora esta técnica se utiliza en combinación con

métodos de degradación enzimática – productos químicos y el uso de enzimas at-dolytic (véase la sección III.3.c), 86,87 y

también para la secuencia de la heparina/HS oligosaccharides.88 cada vez que las muestras en la gama de miligramo están

disponibles, two - dimensional NMR los métodos pueden proporcionar evaluación de secuencia y conformación

molecular.

2.- análisis conpositivo

Cadenas de heparina/HS no son susceptibles al enfoque clásico para el análisis de composición Internacional de

polisacáridos, que implican escote con ácidos de glucosídicos y perfiles la composición monosacárido de bbma. De hecho,

tanto la carga negativa de los residuos de ácido urónico y la carga positiva en los grupos aminos libres expuestos por N-

desulfatación de grupos sulfamino estabilizan la mayoría de los enlaces glucosídicos de estas garantías. Intentos de eludir

el problema de ácido-labilizing el ácido urónico glucosamina bonos por reducción carboxilo han tenido también éxito

debido a la fácil conversión de residuos Idosa resultante en derivatives.1 anhidro,8 análisis de metilación (otro enfoque

común para com - Análisis posicional de polisacáridos neutros) además ha tenido poco éxito en el análisis de GAGs

altamente sulfatadas, principalmente debido a la difficulties en lograr la completa etherification de grupos hidroxilos libres

y escote posterior a monosacáridos metilados sin pérdida de grupos sulfato. Los esfuerzos hacia la mejora de la hidrólisis

no destructiva y quantification de metilado monosacáridos por cromatografía de gases (GC) y métodos de GC/MS

permiten perfiles parcial de heparina monosacárido components.90 también, determinación de ácidos urónicos total y

total hexosamina, clásicamente por - formado por métodos colorimétricos, ha perdido popularidad, principalmente

porque se obtienen diferentes respuestas (especialmente para los ácidos urónicos) dependiendo de la naturaleza de los

patrones urónico ácido y sulfatación del ácido urónico, así como de la hexosamina. Métodos colorimétricos

cromatográfico/han sido específicamente desarrollado para las proporciones molares de-termining entre iniciativa e IdoA

en heparina/HS hydrolyzates.91 otra vez, estos métodos también han sido ampliamente reemplazados por la exitosa

devel-sarrollo de métodos para el análisis del disacárido, que, además de quantification de urónico diferentes residuos de

ácido y la glucosamina, proporcionan más estructural en formación (véase más adelante). Cuando la cantidad de muestra

no es un factor limitante, residuos individuales (especialmente IdoA, IdoA2SO3, iniciativa, GlcNS, GlcNAc) y el grado de 6-

O-sulfatación en el glucosamines pueden confiablemente determinarse mediante Espectroscopia NMR directamente en

unmodified heparins65, 92 y HSs.93 aunque con menos sensibilidad, que el grado de 3-O-sulfatación de glucosamines

también puede estimarse por espectroscopia RMN directa.

Los métodos de despolimerización y análisis de secuencias

a. Métodos enzimáticos.— Flavobacterium heparinum y otras bacterias inducidas a crecer en GAGs

contienen una serie de heparina / HS enzimas degradantes, los más ampliamente explotados

pertenecientes a la clase de liasas, que escinden los enlaces glucosídicos a través de una reacción de β-

eliminación. Desde el primer artículo de esta serie, 1 extensos estudios se han realizado con lyases

purificados (revisado en Refs. 8, 96-99). Heparina recombinante / lyases HS también se han convertido en disponible.

La fabricación de heparina / lyases HS-degradantes por parte de grupos independientes se ha generado

cierta confusión con respecto a la nomenclatura de estas enzimas. Algunos grupos de investigación y

empresas de fabricación distinguen liasas que actúan preferentemente sobre el más abundante secuencia

de la heparina como "heparinasa" y los que escinden de manera más eficiente HS como "heparitinases,"

este último nomenclatura que se basan en la designación anterior de HS como sulfato de heparitin.

También, el término "heparanasa" propuesto en la revisión temprana en esta serie como un sustituto de

"heparitinases" 1 es engañosa, ya que no distingue HS-liasas de la ahora mejor conocido endoglicosidasa

hidrolítica HS-escisión (véase más adelante). Hoy en día, los tres principales heparina / enzimas HS-

depolymerizing son los más comúnmente designados liasa I, II, y III.8 para evitar confusiones con glicosidasas, en el presente artículo serán nombrados liasas de heparina I, II, y III.

La heparina liasas enlaces escinden glucosaminidic entre GlcNSO3 (o GlcNAc) y residuos de ácido urónico (IdoA o GlcA) con diferentes especificidades en función del tipo y la sulfatación del

ácido urónico y el estado de sulfatación del residuo glucosamino precedente y el siguiente residuo de ácido urónico. La especificidad de sustrato de liasas de heparina como se determina usando heparina / HS y fragmentos bien caracterizados de los polisacáridos se resume en la Fig.

3

La enzima más ampliamente utilizada para la escisión de la heparina es liasa de heparina I (EC 4.2.2.7), que escinde enlaces entre GlcNSO3 (6SO3) y IdoA2SO3 y, por tanto, actúa

preferentemente en las regiones altamente sulfatados de heparina y HS. La liasa de heparina II (sin número EC) tiene una especificidad mucho más amplia que los otros dos heparinasas, ya

que escinde los vínculos entre la glucosamina y unidades de ácido urónico, independientemente del tipo de residuo de ácido urónico o la sulfatación de cualquiera de residuo. En contraste, la heparina liasa III (EC 4.2.2.8) no funciona cuando el ácido urónico es 2-O-sulfatado. Aunque

liasa de heparina III es generalmente más activa cuando el ácido urónico es GlcA y la glucosamina es N-acetilado, escisión de los enlaces GlcNSO3-IdoA También se ha observado de

este requisito enzyme.102 de N-acetilación de la escisión por la liasa III parece más estricta cuando GlcA es el único ácido urónico. De hecho, mientras que tanto la (GlcNAc-GlcA) n secuencias del polisacárido Escherichia coli K5 y (GlcNSO3-GlcA) n secuencias de su análogo de

N-sulfatado son buenos sustratos para la liasa de heparina II, liasa de heparina III escinde sólo el primero.

El tratamiento de heparina / HS con liasas individuales genera una variedad de oligosacáridos.

Las preparaciones de heparina de mucosa de cerdo instestinal incubaron con liasa de heparina I

actualmente generan cinco grandes di- y oligo-sacáridos, el más abundante derivados de secuencias del disacárido trisulfatado IdoA2SO3-GlcNSO36SO3 (1). Probablemente debido a que

la enzima requiere al menos tres unidades consecutivas de 1 para una acción eficaz (véase Ref. 1 y referencias en él), alrededor de un tercio de estas secuencias generalmente permanecen

como tetrasacáridos. Una posible razón para las discrepancias señaladas en lo que respecta

especificidades de liasas de heparina es la dependencia peso molecular de su actividad, las cadenas más

largas se escinden generalmente a tasas más altas. Además, las discrepancias aparentes en lo que

respecta al mecanismo de acción de la heparina liasa puedo reconciliarme por la evidencia de que, aunque

algunos vínculos internos son escindidos por la enzima a una velocidad detectable, esta liasa actúa

predominantemente con un mecanismo exolytic. Por el contrario, la liasa de heparina II es una enzima endolitica.

4. Otras proteínas

Se cree que las proteínas pueden interactuar con HS in vivo, todavía hay por lo general escasas pruebas para el papel funcional de dicha unión. Sin embargo, un número creciente de la proteínas están implicadas, en el nivel de célula o tejido, con los fenómenos que parece depender de la unión HS. Ejemplos seleccionados de un constante crecimiento lista de tales proteínas y funciones objetivo, además de los descritos en más detalle anteriormente, incluir el dominio G en supramoleculares del matriz extracelular, lipoproteína lipasa en el transporte de la enzima, endostatina (La endostatina es derivada de una forma del colágeno, una proteína estructural

encontrada en el tejido conectivo) en la inhibición de la angiogénesis, sobre las glicoproteínas virales en la infección viral, crecimiento asociada a la molécula de unión a heparina (HB-GAM) en outgrowth neuritas y la plasticidad neural, y factores de crecimiento en desarrollo embrionarios. Pocas de estas interacciones se han caracterizado en detalle molecular. Un particular característica interesante es la organización del dominio de las cadenas de HS, el significado funcional de los cuales es poco conocido. En particular, las proteínas

oligoméricas pueden unirse a HS cadenas en modo de dominio de diseño, tales que los monómeros de proteínas separadas interactúan con NS distintos dominios que están separados por secuencias N-acetiladas.

V. MODIFICADO Y ESTRUCTURAS DE NOVELA

1. Las heparinas de bajo peso molecular

La unión con una afinidad significativa a las proteínas por lo general requiere heparina / HS cadenas más de 4-5 residuos de monosacáridos. Tal requisito es debido a la necesidad de la participación de varias (al menos dos) residuos básicos en la proteína. Por otra parte, varias de las actividades biológicas asociadas con la proteína de unión implican formación de complejos ternarios, que requieren relativamente largas cadenas. Como ampliamente investigado en conexión con la actividad antitrombótica, los efectos de la heparina sobre la inactivación por AT de diferentes enzimas de la cascada de la coagulación tienen diferente peso molecular, mediada por AT inhibición de la trombina requiere cadenas de heparina que contienen 16 a 18 residuos de sacárido, mientras que una inhibición similar del Factor Xa se puede lograr con cadenas más cortas inducida el concepto de heparinas de bajo peso molecular (HBPM) como agentes antitrombóticos con relativamente baja actividad inhibidora de trombina (y, posiblemente, la reducción hemorrágica riesgos). Aunque la hipótesis de que el potencial hemorrágico está asociado sólo con actividad anti-trombina no es correcta, HBPM están reemplazando gradualmente heparina convencional "no fraccionada" en la prevención de la trombosis venosa principalmente debido a su mejor biodisponibilidad en la administración subcutánea y más predecible propidades dosis-respuesta. HBPM comerciales tienen un peso molecular medio (Mr) de 2500 a 8000. Ellos se preparan ya sea por fraccionamiento por tamaño, o (ahora predominantemente) por química o enzimática despolimerización de la heparina. La mayoría de los procesos de fabricación común de implicar el tratamiento controlado de heparina con nitroso ácido; con liasa de heparina I; con cloruro de bencilo seguido de β-eliminación con álcali; por radical-escisión catalizada peroxidativa; o con irradiación de rayos γ.

División por ácido de la heparina en condiciones de sulfatación proporciona un tipo diferente de fragmentos ("Supersulfatada" HBPM) 0. Caracterización de los grupos terminales de fragmentos de heparina generada por diferentes métodos de despolimerización permite la distinción de diferentes clases ofLMWHs.Typically, los residuos de la reducción de ácido nitroso generado HBPM son 2,5-anhidromanosa (o anhidromanitol, después de la reducción), y el terminal no reductor residuos de fragmentos obtenidos tanto por la heparina y la liasa β-eliminación son ácidos urónicos 4,5-insaturados (predominantemente derivados de IdoA2SO3residuos) . estos residuos finales, así como los residuos terminales en la reducción y / o no reductoras extremos que no están modificados por la reacción de despolimerización, puede ser caracterizado y cuantificado por una variedad de métodos analíticos (revisado en Refs. 230, 291, 294) .LMWHsfrom varias fuentes comerciales difieren significativamente una de la otra también en sus estructuras "internos" como se refleja en la composición disacárido análisis, mapeo de oligosacárido, andNMRspectra, así como por otros parámetros físico-químicos, incluyendo los espectros de Raman y dinámico scattering. Todavía se debate si estas diferencias son atribuibles a la diferentes procedimientos de despolimerización / purificación adoptadas por los fabricantes, o (al menos en parte) a las diferencias estructurales entre las heparinas de los padres.

Suponiendo que las HBPM conservan en gran medida la estructura interna de las heparinas de los padres (Incluyendo el original AT-secuencia de unión), el parámetro más importante para definir una HBPM es su peso molecular medio (Mr). Los valores Mr para HBPM se pueden evaluar por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y por cromatografía de exclusión molecular de alto rendimiento (HP-GPC) . HP-GPC evaluará tanto el promedio en número Mr (MN), promedio en peso MR (MW), y la polidispersidad (P) de los valores de heparina y MWHs. Mw también se puede determinar por 13C spectroscopy. Estos parámetros son significativamente diferentes para comercial HBPM de diferentes fabricantes. No inesperadamente en vista de la dependencia de peso molecular distinto para diferentes mecanismos de generación de trombina y la inhibición, tipos diferentes de HBPM comerciales muestran diferente perfiles anticoagulantes tanto in vitro

como en vivo. Las últimas propiedades reflejan no sólo la actividad biológica inherente del polisacárido, sino también el tamaño la dependencia de la farmacocinética en models305 animales y en humanos.

2. Modulación de Patrones sulfatación; La heparina / HS Imita

Los métodos clásicos para la eliminación de los grupos N-SO3 y para la N-acetilación de expuestos grupos amino, por solvolıtica N, O-desulfatación (con o sin re-N-sulfatación), como así como para preferencial 6-O-desulfatación han sido ampliamente utilizado para evaluar la importancia relativa de los sustituyentes sulfamino / acetamido y 6-O-sulfatación de los residuos de glucosamina en la expresión de actividades biológicas heparina (y, con menor frecuencia, de HS) Procedimiento Arecently desarrollado permite selectiva y completa 6-O-desulfatación prácticamente sin ninguna 2-O-desulfatación de IdoA units. selectivo 2-O-desulfatación se consigue convenientemente mediante tratamiento controlado de heparinas con álcali. Por liofilización de heparina a pH 11-13, secuencias de 1 se puede convertir cuantitativamente en las secuencias "epoxidados" 122. Liofilización de 122 a pH> 13 proporciona la secuencia de 2-O-desulfatada 123. Sin embargo, el reflujo de 1 en Na2CO3, o su tratamiento con 0,1 M NaOH a temperaturas> 80◦C, proporciona 124, en la que los residuos de IdoA2SO3 originales se convierten en L-GalA. variantes de estas condiciones de reacción también se puede aplicar a la generación de selectivamente 2-O-desulfatada heparins. La reacción de O-desulfatación con basewas reportados a implicar, además, la eliminación del grupo 3-O-sulfato de GlcNSO33 (6) site.311 residuos SO3 típicos de la AT vinculante Bajo la alcalina condiciones usadas para la 2-O-desulfatación, residuos de glucosamina 3-O-sulfatado en tanto sobresulfatados heparins y en fracciones de heparina con alta afinidad por AT314 son de hecho convertida en derivados de N-sulfoaziridine (125), lo que sugiere que la eliminación de 2-OSO3 a partir de ácido idurónico y de 3-OSO3 de glucosamina tiene lugar por dos mecanismos diferentes. Desulfatación selectiva se ha utilizado para identificar las relaciones estructura / función de una variedad de actividades biológicas in vitro e in vivo. N- y O-desulfatación de la heparina supone la pérdida de propiedades anticoagulantes generales de los polisacáridos originales, principalmente debido a la eliminación de los grupos esenciales para la unión a AT sulfato (Ver Ref. 150), sino también porque desulfatación del disacárido trisulfatado regulares secuencia 1 suprime la inhibición de la trombina por la heparina cofactor II, así como la interacción con trombina requerida para su inhibición por AT.239 La mayoría de estos modificaciones han de hecho han realizado deliberadamente con el fin de disminuir la actividad anticoagulante de la heparina (se cree que se asocia con hemorragia y otros efectos secundarios), mientras que no afectan a otra bioquímica deseable y biológica propiedades de este versatileGAG. Por ejemplo, la heparina 6-O-desulfatada todavía se une a FGF-2168316 y por lo tanto inhibe angiogenesis. FGF-2-inducida Por otro lado, completamente heparina 6-O-desulfatada no inhibe la proliferación de FGF-2-promovido de types.318 celda seleccionada la inversa, 2-O-desulfatación no afecta significativamente la actividad antimetastásica de heparin.

En comparación con los procedimientos de desulfatación, sulfatación química regioselectiva de sacáridos relacionados heparina plantea más de un desafío. Re-O-sulfatación de Heparina O-desulfatada (normalmente realizada en sales pyrididium, con piridina · SO3 o SO3 · DMF en disolventes apróticos) no puede restaurar el patrón de sulfatación de la polisacárido original, ya que conduce a preferencial 3-O-sulfatación (en lugar de 2-O-sulfatación) de IdoA residues. en condiciones más drásticas de reacción, Residuos IdoA están sulfatados tanto en el positions. Por otro lado, 3-O-sulfatos en IdoA se pueden eliminar más rápidamente que 2-O-sulfatos menores condiciones solvolíticas, de tal manera que la desulfatación de la heparina solvolıtica totalmente sulfatado puede producir especies intermedias con un contenido sustancial de IdoA2SO3 así como GlcN3SO3 residues. Algunos de enriquecimiento en los residuos GlcN3SO3 ha sido

Observado también en la simple secado al vacío de la heparina, a través de la transferencia de SO- 3 grupos desde grupos sulfamino. Directo O-sulfatación de HS conduce preferentemente a 2-Osulfation de GlcA residues.324 contra de las conclusiones de 2,3-O-disulfated IdoA en heparina sobresulfatado, los grupos 2-O-sulfato se eliminan preferentemente en solvolıtica desulfatación de 2,3-O-disulfated glcA residuos de HS.

sobresulfatado Variously O-desulfatada o heparinas sobresulfatado y los oligosacáridos correspondientes se han utilizado para establecer relaciones entre los patrones de sulfatación y parámetros NMR. Dichos derivados también han sido ampliamente utilizados para la estructura- estudios de actividad. Algunos ejemplos de actividades biológicas distintas de las ya descrito investigado utilizando heparinas modificadas químicamente incluir antiproliferativo actividad (inhibición del crecimiento celular del músculo liso), actividades moduladas por diversos factores de crecimiento y sus receptores, y efectos sobre bleeding. (Ver también las revisiones de heparina en relación con la aterosclerosis, la inflamación y trombocitopenia, que esencialmente implican interacciones con las lipoproteínas, selectinas, y PF4, respectivamente).

Métodos de sulfatación se han aplicado a una variedad de polisacáridos, también de origen no mamífero tales como quitosano, para producir productos relacionados con heparina.

Reacciones de N-desacetilación / N-sulfatación se utilizan para convertir el sulfato Acharan, Agag del gigante Achatina fulica caracol africano predominantemente compuesto por unidades 126a en N-sulfoacharan sulfato de (126b) . Del mismo modo, la E. coli microbiana Polisacárido K5 127a se ha convertido a sulfaminoheparosan (127b) 0, regioselectiva O-sulfatación de 127b proporcionó el sulfaminoheparosan 6-O-sulfatado (127c) y su análogo 127d 6,3'-di-O-sulfatado. Además sulfatación cedió híbrido structures342 que contiene secuencias menores que difieren de la de fijación de AT secuencia de pentasacárido 4 de heparina / HS en tener GlcA2SO3 en lugar de una IdoA2SO3 residue. 127b es un buen sustrato para enzimas responsables de la polímero modificación de heparina / Conversión HS biosynthesis.344 a IdoA de un significativo proporción de los residuos de GLCA 127b se ha logrado usando un C-5- epimerasa. y los productos epimerizado han sido más O-sulfatado cualquiera enzymically345 o químicamente. Hasta proporcionar especies HS-similares. De hecho, experimentos recientes han demostrado que la química cuidadosamente controlada y enzimática modificación del polisacárido K5 puede producir productos con actividades biológicas muy similares a los de heparin.

Los propiedades antitrombóticas de derivados de K5 sulfatados son presumiblemente debido a la presencia de secuencias menores que imitan la unión de AT-site. Se por eso menos claro que estos productos son también antimetastatic; sin embargo, se observa que también son buenos sustratos para heparinasa. Las estructuras de sobresulfatado heparinas y HSS rara vez se han caracterizado en detalle (para una revisión, ver Ref. 350). Sobresulfatación implica invariablemente un cierto aumento en el anticoagulante actividad de heparina y otros polisacáridos, en su mayoría debido a la no-AT mediada mecanismos o liberación de especies anticoagulantes endógenos tales como Tissue Factor inhibidor de la ruta (TFPI) . La inducción de alta actividad anticoagulante consistentemente requiere secuencias cortas que se unen con alta afinidad AT y / o más largo secuencias que se unen HC2. El contrario, la nonanticoagulant / nonantithrombotic actividades de heparina / HS no requieren tales secuencias. Imita semisintéticos de heparina también se han preparado enlazando (A través de un puente formado por reacción de la reducción de cistamina con ácido yodoacético) la reducción

de AM residuos de fragmentos y no reductor HNO2 generados GlcNSO3-6-SO3 residuos de fragmentos liasa generada expuestas por la eliminación (con acetato mercúrico) del ácido urónico insaturado terminal de residue. El terminal residuos de ácidos urónicos insaturados son en sí mismos explotable para la conjugación de GAG di- y oligo-sacáridos fragmentos. Estos "neo-GAG" son especialmente útiles para el estudio de la organización del dominio de complejos que implica dos moléculas de proteínas, tales como AT y la trombina.

La heparina / HS y sus fragmentos también se han conjugado con apropiada Sondas para la detección de proteínas de unión. Sondas novedosos, como la 125I-DTAF (Dichlorotriazinylaminofluorescein) -heparina, heparina biotinilada en ocasional grupos amino libres a lo largo de la cadena de polisacárido, y un biotinilado heparina en sustituyentes amino-group-cojinete, se han propuesto como sustitutos de la menos sensibles 125I y 125I-fluoresceinamina conjugados para la detección de la histona y FGF-2. biotinilación de la heparina también se ha obtenido por reacción de la aldehído grupos de un heparin357 oxidado con peryodato y de AM residuos terminales generado por despolimerización con ácido nitroso limitada hydrazide. biotinil

Estos últimos residuos también se han utilizado para conjugar radio marcado y fluoresceinado tiramina a LMW heparinas.

3. Total de Síntesis Química

Aunque la cobertura de la síntesis química total de heparina / secuencias del SA está fuera el alcance de este capítulo, se mencionará logros importantes en este campo, en la medida en que han contribuido a nuestra comprensión del molecular mecanismos que subyacen a las actividades biológicas de estos GAGs. Poco después de la estructura de la secuencia de fijación de AT fue aclarada, se hizo un gran esfuerzo hacia la síntesis química de oligosacáridos de heparina que contiene parcial o totalmente la secuencia activa para AT. Estos estudios (revisado en Ref. 249) llevaron a la síntesis de pentasacárido 4 (como metilo α-glucósido, N-sulfatado en el residuo 1 y 6-O-sulfatado en el residuo 3), así como de un número de sus variantes, incluyendo un pentasacárido más activo que lleva un grupo O-sulfato extra en la posición 3 del residuo de glucosamina 5. Los oligosacáridos que llevan sustituyentes O-metilo en grupos OH que no participan en la unión a AT, así como "nonglycosaminoglycan" oligosacáridos donde se sustituyeron los residuos GlcNSO3 por residuos de glucosa 2-O-sulfatado, han demostrado ser tan activo como lo natural pentasaccharide. El problema de obtener suficientemente largo sacárido cadenas para la unión tanto AT y la trombina se ha acercado primero mediante la evaluación de a través de síntesis química el tamaño de la secuencia de heparina involucrado en inhibición de la trombina, y la identificación de un hexasacárido / pentasacárido secuencia necesaria para promover la inhibición de thrombin. Vinculación de una parte pentasacárido metilado que contienen los residuos y de los grupos esenciales de la secuencia de unión a AT-natural, a través de una correa de sujeción hexasacárido neutral, con el hexasacárido antes mencionada o pentasacárido que ofrece productos con actividades anticoagulante y antitrombótica comparables con los de la heparina. Estos experimentos establecen de manera inequívoca la topología de la unión a AT- y la trombina de unión a regiones a lo largo de la cadena de polisacárido, con el primero dominio vinculado al extremo reductor de la última secuencia. En Además, el producto está desprovisto de efectos secundarios principales de la heparina, tales como la activación de las plaquetas, que pueden causar trombocitopenia, y sangría.

La síntesis química también ha proporcionado modelos útiles para estudiar la interacción de heparina / HS oligosacáridos con los FGF y ha revelado variantes estructurales compatible con la unión a FGF-2 y la inducción de activity. Mitogénica Además, los oligosacáridos sintéticos han ayudado a evaluar el facilitador vinculante papel de IdoA no sulfatados en comparación con residuos GlcA y para identificar el secuencia mínima heparina capaz de inhibir la unión de FGF-2 receptor y FGF-1 y la inducción de la unión a (y de dimerización) FGF-1.

VI. PERSPECTIVAS FUTURAS

Proteoglicanos SA atraen creciente interés de los investigadores en muy diferentes disciplinas, y un rápido progreso es posible prever en varias áreas. Métodos refinados para el análisis estructural microescala de HS, con respecto a la composición, la secuencia, y la conformación, será requisito previo a estos avances. En particular, los métodos para la secuenciación eficaz de pequeñas cantidades de oligosacáridos del SA son obligatorios.

Para este fin, una variedad de técnicas / reactivos será explotado, incluyendo específica exo-enzimas, anticuerpos de presentación en fagos específicos de secuencia, espectrometría de masas, y Espectroscopía de RMN. Estos métodos se aplican principalmente para el análisis de dominios aislados de proteína de unión, sino también, en una perspectiva más amplia, a "mapeo" completa de especies del SA en las superficies celulares y en diferentes tejidos. La acumulación de información de la secuencia, sin duda, va a generar un complejo foto de HS como un ligando de proteína. Ciertos tipos de funcionalmente importante interacciones, tales como "la difusión unidimensional" de las proteínas en las cadenas de HS, es probable que dependerá de efectos no específicos de polielectrolitos en lugar de sequencespecific vinculante. Sin embargo, la aparición de epítopos sacáridos distintos en tejidos, como se visualiza mediante anticuerpos monoclonales específicos (véase la Sección II), claramente apunta a la necesidad de especificidad en una multitud de interacciones. Hasta ahora, la mayoría de los estudios en este sentido se han dirigido a identificar las secuencias del SA afines que corresponden a las proteínas especificadas. La pregunta inversa se debe considerar: ¿Qué proteína (s) sirve (n) como ligando natural (s) para una secuencia HS dado? Otras preguntas que son capaces de atraer mucha atención en un futuro próximo se apoyan sobre los papeles funcionales reales de interacciones HS-proteína in vivo. La unión de una proteína a la cadena HS de un proteoglicano, en la superficie celular o en la matriz extracelular, pueden servir a una variedad de propósitos (almacenamiento / protección, la presentación de proteínas para la interacción con otros ligandos, la activación de las funciones efectoras de proteínas) 0. Miradas en torno a la potencial funcional in vivo de HS han sido proporcionados por los biólogos del desarrollo, que han descubierto una serie de genes, en moscas, gusanos y mamíferos, con esencial roles en el desarrollo embrionario. Cabe destacar que, mientras que las estructuras de estos genes han sido bien establecido, el papel funcional de las proteínas correspondientes son sólo recientemente comienza a entenderse. Información en muy diversos campos de la investigación ha revelado que una proporción sorprendentemente grande de desarrollo genes importantes son codifican proteínas del núcleo, ya sea de HS-proteoglicanos, enzimas implicados en la biosíntesis de SA cadenas, factores de crecimiento / citoquinas dependiendo SA para su presentación / funcionamiento adecuado, o los receptores de tales factors. Esta fructífera interacción entre los campos de la biología del desarrollo y glicobiología es probable que se expanda.

Dada la diversidad funcional de las cadenas de HS, y la especificidad de sus interacciones con muchas proteínas, los mecanismos detrás de la biosíntesis del polisacárido y su reglamento seguirán atrayendo interés. Información valiosa es obtenida a través de una variedad de enfoques, incluyendo la formación catalizada por GAG enzimas en las preparaciones libres de células de la membrana y la clonación, expresión y funcional caracterización de enzimas biosintéticas, así como el análisis mutacional de la biosíntesis de Modelos process. Han conjeturado para explicar la los datos experimentales (véase, por ejemplo, Ref. 372). Sin embargo, de forma preocupante todavía se sabe poco acerca de varias características clave del proceso, tales como el modo de polímero "encendido-apagado" modificación que es un sello de formación HS. Nosotros necesitamos saber más acerca de la interacción entre las proteínas biosintéticas y su organización en la membrana del aparato de Golgi; sobre todo, no tenemos ninguna información con respecto a cualquiera de las proteínas auxiliares que actividad catalítica falta, sin embargo, puede ser esencial para la biosíntesis de procesos. Y el último objetivo sería la construcción de maquinarias biosintéticas funcionales compuestas de proteínas recombinantes ensamblados en sistemas de membranas artificiales, que pueden ser instruidos para producir una cadena de HS de estructura predeterminada.

Este último desafío conduce a un aspecto final de la perspectiva de futuro, GAGbiotechnology. La multitud de procesos fisiológicamente importantes que están mediadas a través de interacciones específicas proteína-HS se presumible desencadenar el desarrollo de sacáridos (o glycomimetic), basado medicamentos para uso clínico, excepto la anticoagulación de la sangre. Tal desarrollo dependería de nuevo de entrada fuerte de una variedad de áreas de investigación separadas, incluyendo las interacciones proteína-carbohidrato (Espectroscopía de RMN; cristalografía), la síntesis orgánica y enzimática, célula biología y fisiología.

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