Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2006-09686)

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Oviedo. Instituto Universitario de Oncología del Principado de Asturias (I.U.O.P.A.).

M. A. Prado, P. Casado, L.J. Ugarte, P. Zuazua-Villar, E. del Valle,  L. Cabal-Hierro , N. Artime, P. S. Lazo, S. Ramos

Fosforilación del EF1BFosforilación del EF1Bγγ de eucariotas durante la parada en de eucariotas durante la parada en mitosis producida por los MIAs y los inhibidores de KSPmitosis producida por los MIAs y los inhibidores de KSP

RESUMENRESUMENLos MIAs o agentes que interfieren con los microtúbulos incluyen compuestos como el nocodazol, y fármacos antitumorales como el paclitaxel y el docetaxel. Estos agentes, capaces de inhibir la

dinámica de los microtúbulos, junto con los inhibidores de la KSP (Kinesin Spindle Protein) provocan la parada del ciclo celular en mitosis y la posterior muerte de las mismas.En nuestro laboratorio hemos descrito que el paclitaxel induce la fosforilación del eEF1Bγ (Prado M.A. y cols., Proteomics, 2007, Vol.7, 3299-3304), siendo esta proteína parte fundamental del

complejo eEF1B. Este complejo, de gran importancia en la fase de elongación de la síntesis proteica, se encarga de activar el eEF1A (transportador del aminoacil-tRNA al ribosoma) gracias a la actividad intercambiadora de nucleótidos de guanina que posee.

Realizando 2D-PAGE del proteoma de células HeLa demostramos que el cisplatino, un fármaco antitumoral independiente de fase, no induce la fosforilación del eEF1Bγ, mientras que otros compuestos antimitóticos, como docetaxel, nocodazol y STLC, sí inducen la fosforilación de esta proteína. El posterior análisis del proteoma de células HeLa tratadas con paclitaxel, pero paradas previamente al comienzo de fase S por acción de la afidicolina, revela que la parada en mitosis es necesaria para la fosforilación del eEF1Bγ. Una 2D-PAGE de extractos tratados con roscovitina, un inhibidor de CDK1, mostró que esta vía de fosforilación del eEF1Bγ es dependiente de esta quinasa. Finalmente, un análisis por espectrometría de masas MALDI-ToF del eEF1Bγ digerido con la endoproteinasa GluC, mostró que el péptido comprendido entre los residuos 224 y 234 se fosforila tras el tratamiento con paclitaxel. Debido a que las CDKs reconocen de forma específica la secuencia S/T-P podemos asumir que la fosforilación tiene lugar en el T230.

1.- Los taxoides y la STLC inducen la fosforilación del eEF1B1.- Los taxoides y la STLC inducen la fosforilación del eEF1Bγγ..

2.- La fosforilación del eEF1Bγ inducida por el paclitaxel requiere de la parada en 2.- La fosforilación del eEF1Bγ inducida por el paclitaxel requiere de la parada en mitosis de las células.mitosis de las células.

3.- La CDK1 participa en la fosforilación del eEF1Bγ inducida por el paclitaxel. 3.- La CDK1 participa en la fosforilación del eEF1Bγ inducida por el paclitaxel. Los datos sugieren que la propia CDK1 fosforila a la Thr230 situada en una de las Los datos sugieren que la propia CDK1 fosforila a la Thr230 situada en una de las secuencias consenso S/T-P del eEF1Bγ.secuencias consenso S/T-P del eEF1Bγ.

CONCLUSIONES:CONCLUSIONES:

RESULTADOSRESULTADOS

Fig. 1. El cisplatino no provoca ni la parada en mitosis ni la fosforilación del eEF1Bγ. Células HeLa fueron tratadas durante 24 horas con paclitaxel y cisplatino (Cpt). a) El análisis western de una 2D-PAGE evidenció que la forma fosforilada del eEF1Bγ inducida por el paclitaxel (mancha A) no se observa tras el tratamiento con cisplatino. b) El análisis western del marcador de mitosis, histona H3 fosforilada en serina 10, demuestra que el cisplatino no provoca la parada de las células en mitosis. La β-actina es utilizada como control de carga.

Control EtOH

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Control DMSO

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Paclitaxel 10-6M

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Cpt 5 μg/ml

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A B A B

A B A B

a)

Histona H3 P

β-actina

Cpt (μg/ml)0 5 7,5 10

b)

Fig. 2. Otros MIAs que paran las células en mitosis también inducen la fosforilación del eEF1Bγ. a) El proteoma de células HeLa tratadas durante 24 horas con diferentes agentes que interfieren con los microtúbulos (MIAs), paclitaxel, docetaxel y nocodazol 1μM (Ptx, Dtx y Noc, respectivamente), fue separado por 2D-PAGE y teñido con Coomassie. b) El análisis western del marcador de mitosis, histona H3 fosforilada, demuestra que los tres compuestos no provocan la parada del ciclo celular en mitosis. La β-actina es utilizada como control de carga.

Control

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Paclitaxel

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Docetaxel

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Nocodazol

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A B A B

A BA B

a)

Histona H3 P

β-actina

C Ptx Dtx Noc

b)

Fig. 3. La STLC provoca la parada de las células en mitosis y la fosforilación del eEF1Bγ. a) Estudio del eEF1Bγ por análisis western de una 2D-PAGE de células HeLa tratadas con S-Tritil-L-Cisteina (STLC). Este compuesto inhibe la KSP (Kinesin Spindle Protein), encargada de separar los centriolos a los polos de la célula durante la mitosis. Se observa cómo la STLC también es capaz de inducir la fosforilación del eEF1Bγ. b) Análisis western del marcador de mitosis, histona H3 fosforilada. La β-actina es utilizada como control de carga.

Control

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STLC 5 μM

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Histona H3 P

β-actina

STLC (μM)0 1 2,5 5 10

A BA B

a)

b)

Fig. 4. La fosforilación del eEF1Bγ es dependiente de la parada en mitosis inducida por los fármacos en las células. a) Análisis western de 2D-PAGE de extractos proteicos de células HeLa pretratadas con afidicolina por 24 h y tratadas posteriormente con paclitaxel durante otras 24 horas (Afi + Ptx) y sus controles correspondientes (Control, Afidicolina y Paclitaxel). La afidicolina bloquea las células en fase S impidiendo la llegada de las mismas a mitosis, punto en el que se observan los efectos del paclitaxel. b) El análisis western de histona H3 fosforilada indica que los pretratamientos con afidicolina impiden la llegada de las células a mitosis. La β-actina es utilizada como control de carga.

Control

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A B

Afidicolina

pI3 11

A B

Paclitaxel

pI3 11

A B

Afi + Ptx

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A B

a)

Histona H3 P

β-actina

AfidicolinaPaclitaxel+

++

+

b)

Fig. 5. La CDK1 está implicada en la fosforilación del eEF1Bγ. Análisis western (2D-PAGE) del eEF1Bγ de extractos de células HeLa tratadas con paclitaxel (Ptx) y/o roscovitina (Ros), siendo esta última un inhibidor de las CDKs. Se observa que la fosforilación del eEF1Bγ se revierte en presencia de roscovitina .

Control

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A B

Roscovitina

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A B

Paclitaxel

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A B

Ptx + Rosc

pI3 11

A B

Fig. 6. La parada en mitosis inducida por el paclitaxel provoca la fosforilación del eEF1Bγ en T224 o T230. Espectro de masas obtenido al analizar los péptidos resultantes de la digestión con endoproteinasa GluC de las formas A (a) y B (b) del eEF1Bγ por MALDI-ToF. Los espectros muestran las masas en el rango de 1300 a 1500 Da. En la tabla c) se muestra el péptido fosforilado en el residuo T224 o T230 en el caso de la proteína A, y el fosforilable en el caso de la proteína B. Ambos péptidos se encuentran marcados en rojo en sus respectivos espectros. Masas en Daltons. En la secuencia aminoacídica presente en la tabla se marcan en rojo los residuos susceptibles de ser fosforilados.

Mancha proteica

Masa experimetal

Masa teórica

Diferencia de masas

Masa de la modificación

DeltaModificación

post-traduccional

Secuencia Posición

A 1407,738 1327,7328 80,0052 79,9663 -0,038 Fosforilación TQPKKDTPRKE 224-234

B 1327,773 1327,7328 - - -0,039 - TQPKKDTPRKE 224-234

a)

b)

c)

Forma A del eEF1Bγ

Forma B del eEF1Bγ