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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
TAILYN ZERMIANI
ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES
PARA A AVALIAÇÃO DE NANOSSISTEMAS CONTENDO
EXTRATIVOS DE Rapanea ferruginea
Itajaí
2015
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
TAILYN ZERMIANI
ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES
PARA A AVALIAÇÃO DE NANOSSISTEMAS CONTENDO
EXTRATIVOS DE Rapanea ferruginea
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profª Drª Tania Mari Bellé Bresolin Co-orientadora: Profª Drª Angela Malheiros
Itajaí, março de 2015
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Dedico este trabalho aos meus pais, Jaime e Sonia, que sempre acreditaram no meu sonho e me deram forças para seguir adiante em todas as minhas escolhas.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por estar sempre em meu caminho e tornar
tudo possível.
Aos meus pais, meus maiores exemplos, por todo amor, confiança e apoio.
Ao meu namorado Matheus, meu companheiro de todas as horas, pelo
carinho, amor e compreensão.
A minha madrinha Sandra por ser uma grande amiga e incentivadora. E a
minha avó Helta, por sua constante preocupação e generosidade.
A orientadora Profª. Drª. Tania Mari Bellé Bresolin por sua amizade dedicação
e disponibilidade. Obrigada pela valiosa orientação, oportunidades oferecidas e
pelos conhecimentos transmitidos. Admiração por sua inteligência, didática e
profissionalismo serão levadas sempre comigo.
A Profª. Drª. Angela Malheiros, co-orientadora deste trabalho, sou
imensamente grata por todas as oportunidades e aprendizado proporcionados.
Obrigada pelo apoio e carinho.
Aos professores membros da banca examinadora interna, Drª. Angélica
Garcia Couto e Dr. Clóvis Antonio Rodriguez, pelas valiosas contribuições.
A Profª. Drª. Hellen Karine Stulzer da Universidade Federal de Santa Catarina
por conduzir os experimentos de difração de raios X e Raman.
A Profª. Drª. Joana Lea Meira Silveira da Universidade Federal do Paraná por
possibilitar as análises por microscopia eletrônica de varredura.
Agradeço a Profª. Drª. Ruth Meri Lucinda da Silva e sua aluna de graduação
Diana Schneider pelo fornecimento da nanoemulsão contendo o AMB.
Ao doutorando Tiago Bonomini por realizar em conjunto com o Prof. Dr. Jose
Luiz Lopez a predição in silico do pKa dos marcadores em estudo.
Aos amigos feitos nas turmas de mestrado e doutorado, em especial à
Juarana Dal Mas e Bruna Xavier, parceiras do projeto R. ferruginea, e amigas com
quem dividi bons momentos e dificuldades. Obrigada pelos extratos e nanoemulsões
fornecidos para desenvolvimento do presente estudo.
Ao Prof. Theodoro Marcel Wagner pelo auxilio nas análises por
espectrometria de massas. Agradeço também, aos demais amigos do laboratório de
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instrumentação analítica Ana, Pedro e Amanda por toda ajuda e por proporcionarem
um ambiente de trabalho agradável e produtivo.
A Profª. Drª. Marina da Silva Machado, que desde a graduação se mostrou
uma amiga, minha sincera gratidão por todo apoio.
Ao CNPQ, CAPES e FAPESC (PRONEM) por conceder suporte financeiro e
bolsa de estudos para realização do mestrado.
A todos que direta e indiretamente contribuíram para a realização deste
trabalho.
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“Que eu jamais me esqueça que Deus me ama infinitamente, que um pequeno grão de alegria e esperança dentro de cada um é capaz de
mudar e transformar qualquer coisa, pois... a vida é construída nos sonhos e concretizada no amor”.
Chico Xavier
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ESTABELECIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES PARA A AVALIAÇÃO DE NANOSSISTEMAS CONTENDO
EXTRATIVOS DE Rapanea ferruginea
Tailyn Zermiani Março/2015
Orientadoa: Prof.a Dr.ª Tania Mari Bellé Bresolin Co-orientadora: Prof.a Dr.ª. Angela Malheiros Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas Número de Páginas: 169. A Rapanea ferruginea Mez., conhecida popularmente como canela-azeitona, possui em sua composição os ácidos mirsinóicos A e B (AMA e AMB). Em estudos prévios estes compostos demonstraram importantes atividades anticolinesterásica, anti-inflamatória e antimicrobiana. Com a finalidade de direcionar a elaboração de produtos farmacêuticos nanotecnológicos a partir de extratos de R. ferruginea e dos compostos AMA e AMB, o objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização física (MEV e DRX), química e físico-química (solubilidade, ponto de fusão, pKa, log P, espectroscopia por infra-vermelho-IV, no ultra-violeta-UV, RMN de 1H e 13C, pureza, umidade e testes de degradação forçada) dos marcadores. Além disso, foram desenvolvidas e validadas metodologias por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação dos marcadores em extratos e nanoemulsões. De acordo com os termos descritivos da farmacopeia brasileira, o AMA foi muito pouco solúvel em metanol e acetonitrila. O AMB foi pouco solúvel em metanol e em acetonitrila. Ambos foram praticamente insolúveis em água. O AMA apresentou pKa de 4,5 e o AMB de 4,8. O AMA apresenta-se como um óleo e o AMB apresentou uma estrutura semi-cristalina com estruturas ortorrômbicas e amorfas por MEV. A
absortividade específica foi de 287,2 e de 229,0 E1cm1% para o AMA (260 nm) e o AMB
(270 nm), respectivamente. Nos espectros de massas os sinais referentes aos íons moleculares apresentam-se em m/z 342 e em m/z 358 para o AMA e AMB, respectivamente. As estruturas químicas do AMA e AMB foram confirmadas por RMN e IV. O AMB funde a 123,6 ± 0,1°C e o AMA não apresentou pico de fusão definido, por DSC. O log P foi 3,30 para o AMA e 3,22 para o AMB. O AMA apresentou uma pureza de 76,2% e o AMB 98,9%, por CLAE, com expressiva degradação em condições ácida e oxidante, bem como sob luz visível e radiação UVA. Os métodos por CLAE permitiram uma boa separação cromatográfica, sendo específicos, lineares, precisos, sensíveis e exatos para a determinação de AMA e AMB nos extratos etanólicos 90°GL dos frutos e cascas de R. ferruginea, bem como nas nanoemulsões. O método gradiente apresentou-se indicativo de estabilidade para os marcadores. O conhecimento das propriedades físico-químicas, bem como os métodos validados para determinação do teor de AMA e AMB nos extratos e em nanoemulsões, irá contribuir para o desenvolvimento, controle de qualidade e padronização de novos fitofármacos e fitoterápicos. Palavras-chave: CLAE. Ácido mirsinóico A. Ácido mirsinóico B. Rapanea ferruginea.
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ESTABLISHMENT AND CHARACTERIZATION OF MARKERS FOR EVALUATION OF NANOSYSTEMS CONTAINING Rapanea ferruginea
EXTRACTS
Tailyn Zermiani March/2015
Supervisor: Tania Mari Bellé Bresolin, Dr. Area of Concentration: Natural products and synthetic bioactive substances. Number of Pages: 169. Rapanea ferruginea Mez, popularly known as canela-azeitona, contains the myrsinoic acids A and B (MAA and MAB) in its composition. In previous studies, these compounds have shown significant anticholinesterase, anti-inflammatory and antimicrobial activity. In order to direct the development of nanotechnology-based pharmaceutical products employing extracts of R. ferruginea and MAA and MAB compounds, the aim of this study was to provide the physical (SEM and XRD), chemical and physical-chemical (solubility, melting point, pKa, log P, IR spectroscopy, UV, NMR 1H and 13C, purity, moisture, degradation study) characterization. Additionally, high performance liquid chromatography (HPLC) methodologies were developed and validated to quantify MAA and MAB in extracts and nanoemulsions. According to the descriptive terms of the Brazilian Pharmacopoeia, MAA was very slightly soluble in methanol and ACN. MAB was slightly soluble in methanol and ACN. Both were practically insoluble in water. MAA showed pKa of 4.5 and 4.8 for AMB. MAA presented as oil, and in SEM analysis, MAB showed a semi-crystalline morphology with orthorhombic crystals and
amorphous structures. Specific absorption was 287.2 and 229.0 E1cm1% for MAA (260
nm) and MAB (270 nm), respectively. MAA and MAB mass spectrum showed molecular ion peaks at m/z 342 and m/z 358, respectively. Chemical structures of MAA and MAB were confirmed by NMR and IR. MAB melting was observed at 123.6 ± 0.1°C, and MAA showed no defined melting peak, using DSC. MAA exhibited a log P value of 3.30 and MAB of 3.22. HPLC calculated purity of MAA was 76.20% and of MAB 98.90%. Both compounds showed a significant degradation in acidic, oxidizing conditions and under visible light and UV radiation. The HPLC methods provided a good chromatographic separation and were considered specific, linear, sensitive, and accurate for the MAA and MAB determination in ethanolic extracts of R. ferruginea fruits and bark, as well as in nanoemulsions. A gradient stability-indicating method was developed. The knowledge about physicochemical properties of MAA and MAB and validated HPLC methods will contribute to the development, quality control and standardization of new phytodrugs and phytotherapics. Keywords: HPLC. Myrsinoic acid A. Myrsinoic acid B. Nanoemulsions. Rapanea ferruginea.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fotografias da planta Rapanea ferruginea: a) partes aéreas, b) frutos
e folhas c) cascas. ................................................................................ 37
Figura 2 – Espectros de IV do AMA (ATR-FTIR) (a) e do AMB (DRS-FTIR) (b). . 77
Figura 3 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMA (Acetona
deuterada, 300 MHz). ........................................................................... 79
Figura 4 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMB (Acetona
deuterada, 300 MHz). ........................................................................... 81
Figura 5 – Espectro Raman do ácido mirsinóico B (AMB). ................................... 82
Figura 6 – Espectros de massas do AMA (a) e AMB (b), obtidos por de entrada
direta de amostra na fonte de íons, com ionização por impacto de
elétrons (EI) a 70 eV, e seus respectivos fragmentos gerados em
maior proporção. .................................................................................. 84
Figura 7 – Correlação entre log P e log k determinados pelo método isocrático
para os compostos referência da Tabela 1. ......................................... 86
Figura 8 – Perfis da análise TG e de DSC do AMA (a) e do AMB (b).
Condições de análise: N2 50 mL/min, taxa de aquecimento de 1º
C/min, 5 mg amostra, aquecimento de 20-450ºC e célula de alumina. 92
Figura 9 – Fotomicrografia eletrônica de varredura do ácido mirsinóico B.
Aumentos de 105x (a), 500x (b) e 1000x (c). ....................................... 94
Figura 10 – Espectro de difração de raios X do ácido mirsinóico B (AMB) .......... 97
Figura 11 – Perfis no UV do ácido mirsinóico A (a) e do ácido mirsinóico (b),
obtidos através de análise por CLAE-DAD. .......................................... 99
Figura 12 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das
cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de
análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X 4,6 mm X 3m), fluxo 0,7
mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada
com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no
Quadro 6; 270 nm; volume de injeção 20 L. ..................................... 100
Figura 13 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das
cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de
análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X 4,6 mm X 3m), fluxo 0,7
16
mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada
com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no
Quadro 7; 270 nm; volume de injeção 20 L. .................................... 101
Figura 14 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das
cascas de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de
análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X 4,6 mm X 3m), fluxo 0,7
mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água
acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente
apresentado no Quadro 8; 270 nm; volume de injeção 20 L. .......... 103
Figura 15 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das
cascas de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de
análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9
mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água
acidificada com ácido fosfórico pH 2,5; método gradiente
apresentado no Quadro 9; 270 nm; volume de injeção 20 µL. .......... 104
Figura 16 – Perfis cromatográficos por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B
(b). Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X
2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol,
acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método
gradiente apresentado no Quadro 9; 260 nm para o AMA e 270 nm
para o AMB; volume de injeção 20 L. .............................................. 105
Figura 17 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL dos
frutos maduros de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições
de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9
mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água
acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método gradiente
apresentado no Quadro 9; 260 nm para o AMA e 270 nm para o
AMB; volume de injeção 20 L. ......................................................... 106
Figura 18 – Perfis de absorção no UV dos picos majoritários (picos 3 e 4 da
Figura 17) no extrato etanólico 90°GL dos frutos de R. ferruginea. ... 107
Figura 19 – Perfil cromatográfico por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B
(b). Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6
m), fluxo 1,0 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol,
17
acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50 (15:60:25
V/V/V); 260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB; volume de
injeção 20 L. ..................................................................................... 108
Figura 20 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração
em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em
função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 28082x
- 1880, referente ao AMA analisado pelo método gradiente. ............. 110
Figura 21 - a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração
em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em
função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 51940x
+ 6217,2, referente ao AMB analisado pelo método gradiente. .......... 111
Figura 22 – a) Curva de calibração da solução extrativa das cascas de R.
ferruginea, representada pelos marcadores AMA (1) e AMB (2) (Área
x concentração em μg/mL), para o método gradiente; Gráficos dos
resíduos em função da concentração (µg/mL) para o ajuste do
modelo y = 28790x + 8845,8, referente ao AMA (b) e para o ajuste
do modelo y = 55256x – 33330, referente ao AMB (c) na solução
extrativa das cascas de R. ferruginea. ............................................... 113
Figura 23 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de
metanol, armazenados a temperatura ambiente, geladeira e freezer.119
Figura 24 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de
acetonitrila, armazenados a temperatura ambiente, geladeira e
freezer. ............................................................................................... 120
Figura 25 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração
em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em
função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 21741x
– 794,09, referente ao AMA analisado pelo método isocrático. ......... 121
Figura 26 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração
em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em
função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo
y=43032,28x + 4572,324, referente ao AMB analisado pelo método
isocrático. ........................................................................................... 122
Figura 27 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260
nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M), nos tempos
18
de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do
AMA e das impurezas (I), (II), (III), (IV) e (V). .................................... 129
Figura 28 - a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270
nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M) nos tempos de
0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do
AMB e das impurezas (I’), (II’), (III’), (IV’), (V’), (VI’) e (VII’). .............. 131
Figura 29 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270
nm, antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas.132
Figura 30 - Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260
nm antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas. 133
Figura 31 - Perfis por CLAE das soluções de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260
nm (a) e Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm (b) submetidas à
degradação em meio alcalino (NaOH 1M), nos tempos de 0, 15, 30,
60, 240 min e 24 horas. ..................................................................... 134
Figura 32 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260
nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6
horas. b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (VI) e
(VII). ................................................................................................... 136
Figura 33 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270
nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6
horas. b) Perfis de absorção no UV do AMB e das impurezas (VIII’) e
(IX’). ................................................................................................... 137
Figura 34 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270
nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo
período de 6 horas. ............................................................................ 138
Figura 35 - Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260
nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo
período de 6 horas. ............................................................................ 139
Figura 36 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação
na região do visível. ........................................................................... 142
Figura 37 – a) Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser
submetido à degradação fotolítica na luz visível; b) Perfis de
absorção no UV do AMA e da impureza (VIII). .................................. 143
19
Figura 38 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, antes e após ser
submetido à degradação fotolítica na luz visível. ............................... 144
Figura 39 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270
nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h). ....... 145
Figura 40 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a
260 nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h);
b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (IX e X). ....... 146
Figura 41 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação
na região do ultravioleta A. ................................................................. 148
Figura 42 - Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser
submetido à degradação fotolítica em radiação UVA. ........................ 149
Figura 43 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, expostos e não
expostos à degradação fotolítica em radiação UVA. .......................... 149
Figura 44 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270
nm, exposto e não exposto a degradação na radiação UVA (400
W.h/m²). .............................................................................................. 150
Figura 45 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a
260 nm, expostos e não expostos a degradação na radiação UVA
(400 W.h/m²); b) Perfis de absorção no UV do AMA da impureza
(XI). ..................................................................................................... 152
Figura 46 – Avaliação da estabilidade acelerada dos ácidos mirsinóicos A e B
isolados (a) e nos extratos moles das cascas (b) e frutos (c) de R.
ferruginea, armazenados a 40°C, pelo período de 15, 30, 60 e 90
dias. Valores expressos em porcentagem remanescente dos
marcadores em relação às áreas iniciais medidas (Tempo zero)
(100%). ............................................................................................... 154
Figura 47 – Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação
NAMB01 (a) e da formulação NAMB01 contendo 0,1% do marcador
AMB (b), analisados através do método isocrático, no comprimento
de onda de 270 nm. ............................................................................ 156
Figura 48 – Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação
NCAS025 (a) e da formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato
mole das cascas de R. ferruginea (b), analisados através do método
gradiente, no comprimento de onda de 270 nm. ................................ 157
20
Figura 49 - Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação
NFRUT1 (a) e da formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole
dos frutos de R. ferruginea (b), analisados através do método
gradiente, no comprimento de onda de 260 nm................................. 159
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Coeficientes de partição (log P) dos compostos analisados e seus
respectivos fatores de capacidade (k) calculados. ............................... 85
Tabela 2 – Fatores de capacidade (k) obtidos experimentalmente dos ácidos
mirsinóicos A e B e seus respectivos coeficientes de partição (log P)
calculados. ........................................................................................... 86
Tabela 3 – Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos
A e B, no extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea na
diluição 1:5 em metanol, no ensaio de repetibilidade do método
analítico gradiente. ............................................................................. 114
Tabela 4 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de
exatidão para o método analítico gradiente. ....................................... 115
Tabela 5 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de
exatidão para o método analítico gradiente. ....................................... 115
Tabela 6 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método
gradiente para análise do AMA na solução extrativa das cascas de
R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel
(0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa
(2,5). ................................................................................................... 115
Tabela 7 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método
gradiente para análise do AMB na solução extrativa das cascas de
R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel
(0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa
(2,5). ................................................................................................... 116
Tabela 8 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método
gradiente para análise do AMA na solução extrativa dos frutos de R.
ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9
mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5). .... 118
Tabela 9 – Determinação da variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos
A e B na concentração de 50 g/mL, no ensaio de repetibilidade do
método analítico isocrático. ................................................................ 123
22
Tabela 10 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de
exatidão para o método analítico isocrático. ...................................... 124
Tabela 11 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de
exatidão para o método analítico isocrático. ...................................... 124
Tabela 12 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método
isocrático para análise do AMA (50 g/mL) de acordo com
modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do
forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel
H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).125
Tabela 13 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método
isocrático para análise do AMB (50 g/mL) de acordo com
modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do
forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel
H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).126
Tabela 14 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse
hidrolítico ácido (HCl 1M). .................................................................. 128
Tabela 15 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B no extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido ao
estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas. .......... 131
Tabela 16 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e
triglicerídeo no extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido
ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas....... 132
Tabela 17 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse
hidrolítico alcalino (NaOH 1M). .......................................................... 133
Tabela 18 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B submetidos à degradação por oxidação (H2O2 30%). .............. 135
Tabela 19 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea
submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas. ... 138
Tabela 20 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e
triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea
submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas. ... 139
23
Tabela 21 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B submetidos à degradação a luz visível. .................................... 141
Tabela 22 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea
submetido à degradação Na luz visível. ............................................. 144
Tabela 23 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e
triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea
submetido à degradação a luz visível. ................................................ 145
Tabela 24 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B submetidos à degradação a radiação UVA .............................. 147
Tabela 25 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos
A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea
submetido à degradação em radiação UVA. ...................................... 150
Tabela 26 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e
triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea
submetido à degradação em radiação UVA. ...................................... 151
Tabela 27 - Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóico B,
na formulação NAMB01 contendo 0,1% do mesmo, no ensaio de
repetibilidade do método analítico isocrático. ..................................... 155
Tabela 28 – Teor dos ácidos mirsinóicos A e B no extrato mole das cascas de
Rapanea ferruginea. ........................................................................... 156
Tabela 29 - Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos
A e B, na formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato mole das
cascas de R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método
analítico gradiente. ............................................................................. 157
Tabela 30 - Teor dos ácido mirsinóico A no extrato mole dos frutos de Rapanea
ferruginea. .......................................................................................... 158
Tabela 31 - Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóicos A
na formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole dos frutos de
R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método de preparo de
amostra. ............................................................................................. 158
24
25
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Termos descritivos de solubilidade e seus significados. .................... 60
Quadro 2 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método
gradiente com adição dos padrões AMA e AMB. ................................. 66
Quadro 3 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método
isocrático com adição dos padrões AMA e AMB. ................................. 67
Quadro 4 - Fórmula da nanoemulsão contendo o Ácido Mirsinóico B (AMB)
0,1% (NAMB01). ................................................................................... 72
Quadro 5 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole das cascas de
R. ferruginea 0,25% (NCAS025). ......................................................... 72
Quadro 6 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole dos frutos de R.
ferruginea 1,0% (NFRUT1). .................................................................. 73
Quadro 7 – Gradiente 1 para análise por CLAE. ................................................ 100
Quadro 8 - Gradiente 2 para análise por CLAE. ................................................. 101
Quadro 9 - Gradiente 3 para análise por CLAE. ................................................. 102
Quadro 10 - Condições cromatográficas para análise por CLAE. ...................... 103
26
27
LISTA DE ABREVIATURAS
ACN – Acetonitrila
AMA – Ácido Mirsinóico A
AMB– Ácido Mirsinóico B
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CCD – Cromatografia em Camada Delgada
CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CV – Coeficiente de Variação
DPR – Desvio Padrão Relativo
DRX – Difratometria de raios X
DSC - Differential Scanning Calorimetry (Calorimetria Exploratória Diferencial)
HPLC – High Performance Liquid Chromatography
IV – Infravermelho
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
NIQFAR – Núcleo de Investigações Químico Farmacêuticas
RDC – Resolução da Diretoria Colegiada
RE – Resolução Normativa
RMN – Ressonância Magnética Nuclear
RPM – Rotações por minuto
s – Desvio Padrão
TG - Termogravimetria
TR – Tempo de retenção
UV – Ultravioleta
UVA – Ultravioleta A
Vis - Visível
28
29
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..............................................................................31
2 OBJETIVOS ..................................................................................33
2.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 33
2.2 Objetivos Específicos ......................................................................... 33
3 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................35
3.1 Plantas medicinais ............................................................................... 35
3.2 Rapanea ferruginea ............................................................................. 36
3.3 Ácidos mirsinóicos .............................................................................. 38
3.4 Estudos de pré-formulação ................................................................ 42
3.5 Controle de qualidade de fitoterápicos e substâncias químicas de
referencia (SQR) ................................................................................... 44
3.6 Validação analítica ............................................................................... 46
3.6.1 Seletividade e Especificidade ...................................................................... 47
3.6.2 Linearidade e faixa de aplicação ................................................................. 50
3.6.3 Exatidão ......................................................................................................... 51
3.6.4 Precisão ......................................................................................................... 52
3.6.5 Limite de detecção (LD) ............................................................................... 53
3.6.6 Limite de quantificação (LQ) ........................................................................ 54
3.6.7 Robustez ........................................................................................................ 54
4 MATERIAL E MÉTODOS ..............................................................55
4.1 Material ................................................................................................. 55
4.1.1 Materiais e reagentes ................................................................................... 55
4.1.2 Equipamentos ............................................................................................... 55
4.1.3 Material vegetal ............................................................................................. 56
4.1.4 Soluções extrativas (SE) .............................................................................. 56
4.1.5 Extratos moles (EM) ..................................................................................... 57
4.2 Métodos ................................................................................................ 57
4.2.1 Isolamento dos marcadores ........................................................................ 57
4.2.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B .................. 58
4.2.3 Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE .............................. 63
30
4.2.4 Validação analítica ....................................................................................... 64
4.2.5 Estudos de degradação forçada ................................................................. 68
4.2.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões ................. 71
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................... 75
5.1 Isolamento dos marcadores ............................................................... 75
5.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B ......... 75
5.2.1 Análises por infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de ¹H e
¹³C .................................................................................................................. 75
5.2.2 Espectroscopia Raman ................................................................................ 82
5.2.3 Espectrometria de massas com unidade de entrada direta de amostra
(DI-MS) ........................................................................................................... 83
5.2.4 Solubilidade .................................................................................................. 84
5.2.5 Coeficiente de partição (log P) .................................................................... 85
5.2.6 Constante de ionização (pKa) ...................................................................... 88
5.2.7 Análise por termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial
(DSC). ............................................................................................................ 90
5.2.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ............................................... 92
5.2.9 Difração de raios X ....................................................................................... 96
5.2.10 Determinação de potência dos padrões e análise por UV/Vis ................. 98
5.3 Desenvolvimento das metodologias analíticas por CLAE .............. 99
5.4 Validação analítica ............................................................................. 109
5.4.1 Método gradiente ....................................................................................... 109
5.4.2 Método isocrático ....................................................................................... 121
5.5 Estudos de degradação forçada ...................................................... 127
5.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões ...... 154
6 CONCLUSÕES ........................................................................... 160
REFERÊNCIAS ................................................................................... 162
31
2 INTRODUÇÃO
O uso medicinal de produtos naturais precede os registros da história humana
provavelmente em milhares de anos. Desde tempos remotos, a utilização de ervas
no combate a doenças revelou empiricamente seu poder curativo (BADKE et al.,
2011; JI; LI; ZANG, 2009). Nos últimos anos, os produtos naturais tem sido as
maiores fontes de diversidade química para inspirar e direcionar descobertas
farmacêuticas, sendo que aproximadamente dois terços dos compostos ativos
utilizados no combate ao câncer e processos infecciosos são de origem natural
(KUMARI; KUMAR; YADAV, 2012; MISHRA; TIWARI, 2011).
A espécie Rapanea ferruginea (Ruiz et. Pav) Mez., conhecida popularmente
como canela-azeitona, capororoca e azeitona-do-mato, ocorre em todo o Brasil em
quase todas as formações vegetais, sendo particularmente frequente na floresta
pluvial da encosta atlântica (LORENZI, 2002; PINHEIRO; CARMO, 1993). Análises
fitoquímicas realizadas com R. ferruginea permitiram a identificação e o isolamento
dos ácidos mirsinóicos A (AMA), B (AMB) e C (AMC), aos quais já foi atribuída
importante atividade anti-inflamatória (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; ITO
et al., 2008; MAKABE et al., 2003). Investigações prévias demonstraram uma
potente atividade anticolinesterásica do AMA e AMB bem como dos extratos
hidroalcoólicos das folhas, caules e frutos de R. ferruginea (GAZONI, 2009), sendo
também comprovada a atividade antinociceptiva do AMB (ANTONIALI, 2009;
ANTONIALLI et al., 2012; HESS, 2006; HESS et al., 2010). O extrato dos frutos da
R. ferruginea e o composto isolado AMA apresentaram atividade sobre a memória
de animais normais e com Alzheimer induzido (COSTA, 2011). E as cascas e frutos
de R. ferruginea apresentaram atividade antimicrobiana seletiva contra bactérias
Gram positivas (B. subtilis, S. aureus, S. saprophyticus e S. pyogenes), efeito
atribuído aos marcadores AMA e AMB (BELLA-CRUZ et al., 2013). O extrato
etanólico das cascas de R. ferruginea e o ácido mirsinóico B isolado apresentaram
atividade leishmanicida (CECHINEL-FILHO et al., 2013).
Diante de suas propriedades já comprovadas, a espécie R. ferruginea e os
ácidos mirsinóicos A e B isolados apresentam-se promissores ao desenvolvimento
de novos medicamentos direcionados ao tratamento de processos infecciosos e
inflamatórios cutâneos. No presente trabalho, a fim de contribuir com o
32
desenvolvimento de novos fitofármacos e fitoterápicos, foi realizado um estudo de
pré-formulação dos marcadores ativos AMA e AMB, com a finalidade de fornecer
informações sobre suas características físico-químicas, analíticas e de estabilidade.
Além disso, através de comprovação de identidade química e pureza este trabalho
visa contribuir para o esbalecimento de substância químicas de referência para o
controle de qualidade de produtos desenvolvidos futuramente.
Dentre as estratégias recentes para o aumento do valor terapêutico dos
produtos naturais, destaca-se a incorporação em sistemas lipídicos, tais como as
micro e nanoemulsões (D’MELO; DAS; DAS, 2009; SHAKEEL et al., 2008). Outros
estudos conduzidos por pesquisadores do Nucleo de Investigações Químico-
Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI têm como objetivo desenvolver nanoemulsões
contendo os extratos de R. ferruginea, bem como os marcadores isolados, buscando
melhorias na atividade farmacológica dos mesmos.
Para que a qualidade dos produtos desenvolvidos seja garantida, torna-se
necessário o estabelecimento de tecnologias e metodologias analíticas apropriadas.
Visando à confiabilidade dos resultados gerados, de acordo com a RE 899 (BRASIL,
2003) o método deve ser validado por meio de estudos experimentais quanto aos
parâmetros de seletividade/especificidade, linearidade, intervalo, precisão,
sensibilidade, limite de quantificação, exatidão e robustez.
Assim, empregando a técnica de cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) buscou-se desenvolver e validar métodos para determinação de teor de
AMA e AMB em extratos das cascas e frutos de R. ferruginea e destes incorporados
em nanoemulsões. Além disso, o presente estudo visou o desenvolvimento de um
método indicativo de estabilidade para avaliação dos marcadores nas
nanoemulsões.
33
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Estabelecer e caracterizar os ácidos mirsinóicos A e B como marcadores para
a avaliação de extratos das cascas e frutos de R. ferruginea e destes incorporados
de nanossistemas.
3.2 Objetivos Específicos
Isolar os marcadores ácidos mirsinóicos A e B a partir de extratos das cascas,
galhos e folhas de Rapanea ferruginea e caracteriza-los por meio de técnicas
cromatográficas, espectroscópicas, térmicas e microscópicas;
Desenvolver metodologias analíticas por CLAE para estabelecer o perfil
cromatográfico e o teor dos marcadores em extratos das cascas e frutos de R.
ferruginea;
Desenvolver metodologias analíticas por CLAE para avaliação do teor de
AMA e AMB em nanoemulsões contendo os extratos de Rapanea ferruginea e os
marcadores isolados e a estabilidade dos mesmos.
Validar as metodologias desenvolvidas através dos parâmetros de
especificidade, linearidade, intervalo, precisão, limite de detecção, limite de
quantificação, exatidão e robustez.
34
35
4 REVISÃO DA LITERATURA
4.1 Plantas medicinais
O poder curativo das plantas é tão antigo quanto o aparecimento da espécie
humana na terra. Desde cedo as primeiras civilizações perceberam que o uso
medicinal dos produtos naturais, os quais são compostos derivados de plantas,
animais ou microrganismos, continham princípios ativos em suas essências, que
revelaram empiricamente seu poder curativo ao serem experimentados no combate
às doenças (BADKE et al., 2011; JI; LI; ZHANG, 2009).
No decorrer do ultimo milênio, a humanidade descobriu e fez uso de uma
ampla variedade de compostos naturais (JI; LI; ZHANG, 2009). Os produtos
químicos interessantes identificados como produtos naturais são derivados do
fenômeno da biodiversidade, no qual interações entre organismos e seu ambiente
formulam as diversificadas e complexas entidades químicas entre os organismos,
aumentando sua sobrevivência e competitividade (MISHRA; TIWARI, 2011).
Até hoje, aproximadamente 250.000 espécies de plantas foram catalogadas,
constituindo um esplêndido acervo natural de grande potencial químico. Entretanto,
considerado de superioridade inteiramente desproporcional em relação ao esforço
relativamente pequeno das pesquisas desenvolvidas para seu conhecimento e
utilização, uma vez que somente 5 a 15% destas espécies foram sistematicamente
investigadas (BRAZ-FILHO, 2010; CRAGG; NEWMAN, 2012).
As plantas superiores constituem uma das fontes mais importantes de novas
substâncias utilizadas diretamente como agentes medicinais. Além disso, elas
fornecem modelos para modificações estruturais e otimização das propriedades
farmacológicas e bioquímicas, e servem de inspiração para químicos orgânicos,
estimulando-os a enfrentar desafios na construção sintética de novas arquiteturas
moleculares naturais (BRAZ-FILHO, 2010).
A pesquisa fitoquímica baseada na etnofarmacologia é considerada uma
ferramenta efetiva na descoberta de novas entidades químicas com potencial como
fármacos. Plantas/extratos/decoctos utilizados por tradições populares para o
tratamento de diversos males, representam uma fonte de entidades químicas, mas
sem a informação do quanto está disponível na natureza (BRUSOTTI et al., 2013).
36
Estudos que relacionaram substâncias puras derivadas de plantas utilizadas em
países que hospedam Centros de Medicina Tradicional da OMS indicam que, de 122
substâncias identificadas, 80% são utilizadas para os mesmos propósitos
etnomédicos relacionados (CRAGG; NEWMANN, 2013).
Os fármacos baseados em produtos naturais têm sido descritos
extensivamente em revisões prévias e cobrem uma ampla faixa de indicações
terapêuticas, como antineoplásica, anti-inflamatória, antidiabética, entre outros
(HARVEY, 2008). Com a utilização dos métodos analíticos de alta tecnologia, é
possível isolar, identificar e elucidar componentes das plantas, permitindo
correlacionar suas respectivas atividades farmacológicas, sendo uma ferramenta
para padronização dos fitoterápicos como uma forma de assegurar sua segurança e
eficácia (YUNES; CECHINEL, 2012).
4.2 Rapanea ferruginea
Myrsinaceae é uma grande família de arbustos e pequenas árvores
amplamente distribuídas pelas regiões tropicais e subtropicais. Possuem folhas
simples, alternas, sem estípulas, frequentemente adensadas no ápice dos ramos,
apresentando geralmente estruturas secretoras internas que podem ser encontradas
nas flores e frutos. Nesta família estão presentes madeiras de coloração palha a
marrom-escura ou avermelhada, atrativamente desenhadas na superfície radial, a
maioria de densidade e textura média. Com poros pequenos, difusos, numerosos,
solitários ou mais raramente múltiplos, em linhas radiais ou em cachos, às vezes
com tendência a arranjos diagonais ou tangenciais, raramente em contato com os
raios (BARROSO et al. 2002; PINHEIRO; CARMO, 1993). A família Myrsinaceae
apresenta distribuição pantropical, e cerca de 1.500 espécies, subordinadas a 49
gêneros. No Brasil ocorrem os gêneros Ardisia, Cybianthus (incl. Conomorpha),
Myrsine (sin. Rapanea) e Stylogyne, totalizando cerca de 100 espécies (FREITAS;
CARRIJO, 2008; FREITAS; KINOSHITA, 2005; JUNG-MENDAÇOLLI et al., 2005).
O gênero Rapanea (sin. Myrsine) possui cerca de 300 espécies, amplamente
distribuídas em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Rapanea é representado
por 34 espécies no Brasil (AMARO-LUIS et al., 2008; NOVAES et al., 2013).
Espécies nativas deste gênero destacam-se em processos naturais de sucessão e
como importante recurso alimentar para a avifauna (FREITAS; CARRIJO, 2008),
37
sendo também utilizadas na medicina popular no tratamento de uma variedade de
distúrbios, e como aditivos alimentares (AMARO-LUIS et al., 2008).
A espécie R. ferruginea (Ruiz & Pavon) Mez (Figura 1), é uma espécie
pantropical, está presente na Bolívia, México, Argentina, Paraguai, e Uruguai. No
Brasil, ocorre nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais,
São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, aparecendo em quase
todas as formações florestais de sua região de ocorrência, prefere encostas e beira
de córregos, e ocorre em altitudes acima de 2000 metros (CARVALHO, 1994;
LORENZI, 2002; SANCHOTENE,1985).
Figura 1 - Fotografias da planta Rapanea ferruginea: a) partes aéreas, b) frutos e folhas c) cascas.
Fonte: Autor
Essa espécie possui três sinonímias na literatura botânica: Myrsine coriacea,
Myrsine floculosa Mar. e Gaballeria ferruginea Ruiz et Pav. Contudo, o nome latino
válido é Rapanea ferruginea (Ruiz & Pav.) Mez. Quanto aos nomes vulgares, R.
ferruginea é também conhecida por canela-azeitona, capororoca, azeitona-do-mato,
camará, capororocaçu, capororoca-vermelha, pororoca e capororoca-mirim
(LORENZI, 2002).
(c) (a)
(b)
38
Trata-se de uma árvore perenifólia, heliófila, seletiva higrófila e pioneira,
característica de formações secundárias, como capoeiras e capoeirões. Em
determinado estágio da sucessão secundária da encosta atlântica, a canela-azeitona
chega a ser a espécie predominante (LORENZI, 2002). A árvore é dotada de copa
piramidal, com características ornamentais, podendo ser empregada na arborização
urbana. Seus frutos são avidamente consumidos por várias espécies de pássaros, o
que a torna útil para plantios mistos em áreas degradadas, de preservação
permanente (PASCOTTO, 2007; PINHEIRO; CARMO, 1993).
Backes e Irgang (2002) descrevem que capororoca em tupi-guarani significa
“árvore que estala”. É uma árvore de madeira quebradiça, bastante comum no sul do
Brasil. A semente germina facilmente em qualquer tipo de solo, após os frutos
passarem pelo tubo digestivo dos animais que os consomem.
No Brasil, R. ferruginea também tem sido utilizada como um condimento,
assim como, para a produção de carvão, construção, lenha, paisagismo,
reflorestamento e recuperação ambiental (PASCOTTO, 2007). O chá das folhas ou
da casca de R. ferruginea é indicado como um diurético, para combater doenças do
trato urinário e também é um bom produto de limpeza. É popularmente usado para
prurido, erupções cutâneas, urticária, eczema, reumatismo e doenças do fígado
(LORENZI, 2002).
4.3 Ácidos mirsinóicos
Compostos aromáticos prenilados isolados de plantas são comuns na
literatura. Dentre as inúmeras classes de constituintes com importantes atividades
biológicas isolados de Rapanea destacam-se os derivados de ácidos benzóicos
prenilados (também chamados ácidos terpeno-benzóicos). A partir do extrato
metanólico de Myrsine seguinii foram isoladas as substâncias denominadas ácidos
mirsinóicos A (1), B (2), C (3), E (4) e F (5). Estes compostos demonstraram
importante atividade anti-inflamatória (DONG et al., 1999; HIROTA et al., 2002; ITO
et al., 2008; MAKABE et al., 2003).
39
Foi relatado que o ácido mirsinoico A (1) inibe a DNA polimerase (MIZUSHINA
et al., 2000) e o ácido mirsinoico B (2) possui atividade inibidora de metioninase em
bactérias periodontais como Fusobacterium nucleantum, Porphyromonas gingivalis e
Treponema denticola (ITO; NARISE; SHIMURA, 2008).
Na busca por outros compostos anti-inflamatórios a partir de Myrsine seguinii,
foi isolado em pequena quantidade um novo ácido terpeno-benzóico, denominado
de ácido mirsinoico E, do qual foi proposta a síntese, bem como de alguns análogos
com a finalidade de avaliar seu potencial anti-inflamatório. Através dos resultados
1
2
3 4
5
40
obtidos pode-se verificar uma importante atividade anti-inflamatória destes
compostos (MAKABE et al., 2003).
A espécie R. ferruginea vem sendo avaliada por pesquisadores do Nucleo de
Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR) da UNIVALI. Inicialmente foram
isolados e identificados o ácido mirsinóco B (5-carboxi-2, 3-dihidro-2-(1’, 5’-dimetil-1’-
hidroxi-4’hexenil)-7-(3”-metil-2”butenil) benzofurano), nomeado AMB (2) a partir dos
extratos etanólicos das folhas e caules de Rapanea ferruginea, e o ácido mirsinoico
A (1) (ácido 5-geranil-4-hidroxi-3-(3”-metil-2”butenil)-benzóico), nomeado AMA, a
partir dos frutos. Ambos apresentaram atividade anticolinesterásica quando
avaliados por bioautografia através de placas cromatográficas (GAZONI, 2009).
Estudos fitoquímicos complementares das cascas de R. ferruginea permitiram o
isolamento do ácido mirsinóico C (3) ((2S), (3S)-6-carboxi-2,3-dihidro-3-hidroxi-2-
metil-2-(4’-metilpenta-3’-enil)-8-(3’’-metil-2’’-butenil)-cromona) a partir dos extratos de
diclorometano (FRONZA; GIURADELLI, 2009).
Em outro estudo realizado por pesquisadores do NIQFAR, o AMB exibiu ação
antinociceptiva significativa e potente quando avaliada em alguns modelos
farmacológicos de dor em camundongos, produzindo antinocicepção sistêmica em
doses que não revelaram interferência na atividade locomotora. Os resultados deste
estudo sugeriram que o AMB por si mesmo, pode ter potencial valor terapêutico para
o desenvolvimento de novos fármacos analgésicos. O mecanismo antinocicepção
parece envolver a interação com α-adrenoreceptores, e os sistemas serotonérgicos,
oxidonitrérgico e colinérgicos. A sua ação também é modulada pelo eixo HPA
(hipotalâmico-pituitário-adrenal) (HESS et al., 2010).
Outros ensaios realizados no mesmo grupo de pesquisa determinaram que o
AMB também possui ação antinociceptiva na dor neuropática causada pela contrição
parcial do nervo ciático em camundongos (ANTONIALLI, 2009), e na dor neuropática
diabética (GALVAN, 2007), apresentando também atividade anti-inflamatória quando
administrado oralmente em modelo de dor inflamatória induzido por carragenina
(ANTONIALLI, 2009; ANTONIALLI et al., 2012).
Testes que avaliaram a atividade do extrato de diclorometano dos frutos da R.
ferruginea e o composto isolado AMA sobre a memória de animais normais e com
Alzheimer induzido demonstraram que o extrato apresentou ação facilitadora para
aquisição, consolidação e evocação da memória em animais normais e para
consolidação em animais com a doença de Alzheimer, efeito que pode estar
41
relacionado com o AMA, o qual teve sua atividade farmacológica também
comprovada (COSTA, 2011). Os extratos das cascas, folhas, frutos de R. ferruginea,
bem como dos ácidos mirsinóicos A, B e C, e derivados do AMB são indicados como
fontes promissoras para o desenvolvimento de moléculas bioativas frente à células
tumorais, por apresentarem níveis significativos de citotoxicidade para algumas
linhagens celulares (TOMIO, 2011).
Testes microbiológicos mostraram que o extrato de clorofórmio das cascas e
os extratos etanólicos dos caules e frutos de R. ferruginea apresentaram atividade
antimicrobiana seletiva contra bactérias Gram positivas (B. subtilis, S. aureus, S.
saprophyticus e S. pyogenes), efeito associado com uma grande porcentagem de
AMA e AMB presentes na planta. Estes compostos apresentaram potencial tóxico
moderado, e não apresentaram atividade citotóxica em células de fibroblastos L929,
bem como não foi observado efeito mutagênico para S. Cerevisiae (BELLA-CRUZ et
al., 2013).
Recentemente, Cechinel Filho e colaboradores (2013), em um estudo que
avaliou pela primeira vez a atividade leishmanicida do extrato etanólico cascas de R.
ferruginea e do ácido mirsinóico B isolado, sugere sua importância como possível
fonte de agente contra leishmaniose, uma vez que ambos apresentaram atividade
contra L. brasiliensis, com IC50 de 21,4 e 6,1 µg/mL, respectivamente.
O AMA e AMB não se encontram disponíveis comercialmente, o que
demonstra a necessidade de obtenção de padrões de referência destes marcadores.
Considerando a possibilidade de isolamento do AMB com elevada pureza,
pesquisadores do NIQFAR desenvolveram e validaram um método analítico por
CLAE-DAD para quantificação deste marcador nas cascas de R. ferruginea. O
método resultou em uma separação satisfatória do AMB em sistema isocrático
(BACCARIN et al., 2011). Porém, a metodologia não foi capaz de separar todos os
fitoconstituíntes presentes nos extratos das cascas e dos frutos de R. ferruginea.
Desta forma, considerando a presença de um maior numero de interferentes, esta
metodologia não seria aplicável para realização do controle de qualidade de
formulações contendo os extratos, além de não possibilitar a quantificação do AMA.
Estudos desenvolvidos paralelamente a este trabalho, conduzidos por Dal Mas
(2014), Xavier (2014) e Silva (2014), tem como objetivo desenvolver nanoemulsões
contendo os extratos das cascas e frutos de R. ferruginea, bem como o composto
AMB isolado visando melhorias na atividade farmacológica dos mesmos. Assim,
42
aponta-se para a necessidade metodologias adequedas para a análise destas
formulações.
4.4 Estudos de pré-formulação
Estudos de pré-formulação ganharam impulso na década de 1950, impondo
princípios científicos e racionais no desenvolvimento e controle de qualidade de
formas farmacêuticas (LAU, 2001).
O conceito de pré-formulação baseia-se na caracterização das propriedades
físico-químicas de substâncias farmacologicamente ativas. Os dados obtidos,
analisados coletivamente, vêm fornecer uma base de conhecimento fundamental
sobre a seleção do candidato a fármaco e no desenvolvimento da forma
farmacêutica, impactando em uma redução de tempo e custo desta etapa
(GAISFORD; SAUNDERS, 2013).
A aquisição dos dados de pré-formulação contribui para o estabelecimento
das especificações do fármaco destinado à avaliação toxicológica e clínica, além do
fornecimento de dados científicos para desenvolvimento da forma farmacêutica e
avaliação da eficácia do produto, qualidade, estabilidade e biodisponibilidade. A
maioria dos estudos de pré-formulação começa durante a otimização
farmacotécnica. Entretanto, ainda na fase de identificação do composto ativo são
reconhecidas características, que muitas vezes não são favoráveis para fármacos,
como quiralidade, embora às vezes possa ser o destino desejado, polimorfismo,
higroscopicidade, e problemas de estabilidade (LAU, 2001).
A seleção adequada de métodos analíticos a serem empregados para o
estudo de pré-formulação, constitui uma etapa crucial para o sucesso da
investigação. A necessidade da identificação e elucidação estrutural de novos
compostos impulsiona o progresso das técnicas como ressonância magnética
nuclear (RMN) e espectrometria de massas (EM). Na etapa do controle de qualidade
é importante a comparação e confirmação da identidade química dos fármacos.
Técnicas como espectroscopia no ultravioleta (UV), infravermelho (IV) e Raman são
utilizadas com maior regularidade (LAU, 2001).
As técnicas de separação, tais como cromatografia em camada delgada
(CCD), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa (CG) e
eletroforese em capilar (EC) são extensivamente utilizadas em estudos de pré-
43
formulação. Métodos termométricos como calorimetria exploratória diferencial (DSC)
e termogravimetria (TG) são utilizados na investigação não só de alterações
químicas, mas também sobre a mudança física da substância em estudo. Outras
técnicas mais especializadas, como a difração de raios X em pó, (XPRD) e
microscopia eletrônica de varredura (MEV) podem fornecer informações adicionais
sobre o perfil cristalográfico e a presença de polimorfos (GAISFORD; SAUNDERS,
2013).
Variáveis críticas que devem ser considerados na tomada de decisões de
formulação são pKa, lipofilicidade e solubilidade. O valor de pKa fornece dados
valiosos sobre a farmacocinética de compostos ionizáveis. O pKa também permite
saber o quanto alterar o pH para dirigir um composto à sua forma totalmente
ionizada ou não ionizada para fins analíticos além de aspectos farmacotécnicos,
como alcançar sua solubilidade ou ainda visando a maior estabilidade (NIAZI, 2007).
Grande parte dos produtos naturais que demonstram potente atividade
biológica possui pouca solubilidade em água, manifestando uma série de
consequências in vivo, como diminuição da biodisponibilidade, aumento da
possibilidade de interação com alimentos e liberação incompleta da forma
administrada. Compostos pouco solúveis também apresentam muitos obstáculos no
desenvolvimento de formulações in vitro, como limitações na escolha de tecnologias
de liberação e os ensaios de dissolução cada vez mais complexos (KUMARI;
KUMAR; YADAV, 2012; SHAKEEL et al., 2008).
Tendo em vista que os ácidos mirsinóicos A e B são metabólitos secundários
com atividades farmacológicas promissoras (ANTONIALLI et al., 2012; BELLA-
CRUZ et al., 2013; CECHINEL-FILHO et al., 2013; COSTA, 2010; GAZONI, 2009;
HESS et al., 2010), torna-se necessária a realização de um estudo de pré-
formulação para estes compostos. A caracterização físico-química do AMA e AMB é
de suma importância para sua padronização, visando aplicações farmacológicas e
analíticas, assim como, para direcionar o desenvolvimento de formulações
farmacêuticas.
44
4.5 Controle de qualidade de fitoterápicos e substâncias químicas de
referencia (SQR)
As formulações à base de plantas atingiram grande aceitabilidade como
agentes terapêuticos para diversas doenças (CHOUDHARY; SEKHON, 2011).
Atualmente, a nanotecnologia empregada para plantas medicinais e substâncias
ativas isoladas tem demonstrado resultados promissores quanto à obtenção de
efeitos terapêuticos desejados (BOSE; MICHNIAK-KOHN, 2013; KUMARI; KUMAR;
YADAV, 2012). Nanossistemas como nanopartículas poliméricas, nanoesferas e
nanocápsulas, lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas, e nanoemulsões tem
sido reportadas na literatura. A vantagem dos fitoderivados nanoencapsulados inclui
melhoria na solubilidade dos componentes ativos, sua biodisponibilidade, ação
farmacológica, estabilidade química e física, além da estabilidade no meio biológico,
ou minimizando o extensivo metabolismo de primeira passagem, contribuindo
também para o aumento da adesão do paciente (CHOUDHARY; SEKHON, 2011;
KUMARI; KUMAR; YADAV, 2012).
Considerando que a tecnologia de fitoterápicos envolve a conversão de
materiais botânicos em medicamentos, na qual são integradas técnicas científicas
modernas ao conhecimento tradicional, é ressaltada a importancia das etapas de
padronização e controle de qualidade. A padronização é um passo essencial para o
estabelecimento de uma consistente atividade biológica, um consistente perfil
químico, ou simplesmente um programa de garantia de qualidade para a produção e
fabricação de medicamentos fitoterápicos (CHOUDHARY; SEKHON, 2011).
Garantir a qualidade de uma planta medicinal é um grande desafio, pois o
conteúdo químico das plantas pode variar sob a influência de diversos fatores, tais
como a variação de espécies, local de crescimento, clima, época de colheita,
condições de armazenamento e processamento. Com a finalidade de lidar com os
problemas relacionados com sua complexidade química, os pesquisadores adotoram
a abordagem da “impressão digital” (“fingerprinting”) de plantas, nas quais são
utilizados alguns marcadores (LUCIO-GUTIERREZ; COELLO; MASPOCH, 2012).
De acordo com a Resolução RDC nº 26 de 13 de maio de 2014 publicada pela
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), um marcador é um composto ou
uma classe de compostos quimicos presentes na materia-prima vegetal,
45
preferencialmente tendo correlação com o efeito terapêutico, que é utilizada como
referência no controle de qualidade da materia-prima vegetal e dos medicamentos
fitoterápicos (BRASIL, 2014).
Para que a qualidade de produtos farmacêuticos a base de plantas seja
garantida, marcadores adequados devem ser primeiro selecionados e estabelecidos.
Para isso, alguns critérios devem ser considerados: a substância deve estar
constantemente presente na droga vegetal/ preparação, ter sua identidade química
elucidada, sua análise deve ser possível com equipamentos de análises de rotina,
deve estar presente em drogas vegetais e em preparações a base de plantas em
quantidades adequadas para o desenvolvimento de um método quantitativo válido e
reprodutível, e finalmente, deve ter seu perfil de estabilidade conhecido (SCHWARZ;
KLIER; SIEVERS, 2009).
Para um determinado marcador seja qualificado como padrão de referência,
este deve atender alguns requisitos de acordo com a legislação de cada país
(ZÖLLNER; SCHWAR, 2009). No Brasil, a Farmacopéia Brasileira define
Substâncias Químicas de Referência (SQR) como materiais de referência
certificados utilizados na avaliação da conformidade dos insumos farmacêuticos e
dos medicamentos, requeridos nas diferentes farmacopéias e códigos farmacêuticos
reconhecidos pela ANVISA, como referência de controle de qualidade nacional
(BRASIL, 2010a).
Para fitoterápicos, a disponibilidade de um número reduzido de substâncias
químicas de referência é uma dificuldade frequente (BARA et al., 2006), nesses
casos deve ser utilizada substância química caracterizada. A SQR deve ser
caracterizada por meio de ensaios adequados e os valores obtidos devem ser
devidamente documentados. Uma SQR caracterizada pode ser obtida de
fornecedores qualificados ou ser isolada a partir da droga vegetal, em ambos os
casos a identidade e o teor devem ser devidamente comprovados e deve ser
apresentado certificado de análise, incluindo resultados da análise química, físico-
química e espectroscópica (BRASIL, 2010a; BRASIL, 2010b). Para os padrões de
referência caracterizados deve-se apresentar laudo de análise completo, incluindo
testes de confirmação de identidade química como ressonância magnética nuclear,
espectrometria de massas (alta resolução), IV e UV. Uma combinação de várias
técnicas analíticas é necessária para determinar a pureza de um padrão de
referência primário. Procedimentos de separação seletiva, geralmente cromatografia
46
líquida de alta eficiência (CLAE) ou cromatografia cagosa (CG), são usados para
determinação de pureza (com base na área relativa do pico). Também é necessário
determinar ponto de fusão, teor de água e o teor de solvente residual, bem como
qualquer impureza inorgânica proveniente da etapa de síntese ou extração
(ZÖLLNER; SCHWAR, 2013).
Para que seja realizado um controle de qualidade adequado de produtos
farmacêuticos desenvolvidos contendo fitoderivados da espécie R. ferruginea, é
essencial o estabelecimento de padrões de referência dos marcadores AMA e AMB.
Desta forma, considerando que o AMA e o AMB não estão disponíveis
comercialmente, para que sejam válidos como SQR de acordo com a legislação
brasileira (BRASIL,2010a; BRASIL, 2010b) é necessário o isolamento destes
compostos, seguido de comprovação de identidade química e determinação de
pureza através da utilização de técnicas citadas anteriormente.
4.6 Validação analítica
A validação de metodologia pode ser definida como o processo de estabelecer
as características de performance e limitações do método, e identificar as influências
que podem modificar estas características e em que proporções. Atualmente
possuem várias organizações renomadas ofertando diretrizes para validação de
métodos. Uma tentativa de harmonização foi realizada para as aplicações
farmacêuticas através do ICH (International Conference on Harmonization),
representando as indústrias e agentes regulatórios dos Estados Unidos, Europa e
Japão (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-BROCH, 2012).
No Brasil, a Resolução RE 899, de 29 de maio de 2003 publicada pela
ANVISA, define que a validação deve garantir por meio de estudos experimentais,
que o método atente às exigências as aplicações analíticas, assegurando a
confiabilidade dos resultados. As informações contidas nesse anexo apresentam as
características a serem consideradas durante a validação de procedimentos
analíticos.
O Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO)
através de um documento de caráter orientativo emitido em 2010, vem auxiliar a
Divisão de Acreditação de Laboratório (DICLA) na tarefa de validar as metodologias
analíticas empregadas nos laboratórios acreditados. De acordo com este
47
documento, devem ser validados os métodos não normalizados, métodos
desenvolvidos pelo próprio laboratório, métodos normalizados usados fora dos
escopos para os quais foram concebidos, ampliações e modificações de métodos
normalizados.
O tipo do método e sua pretensão de uso indicam quais parâmetros
necessitam ser investigados. Para aplicação das metodologias na análise de
produtos naturais, são considerados os critérios estabelecidos para testes
quantitativos ou ensaio limite para a determinação de impurezas e produtos de
degradação. De acordo com a RE 899 (BRASIL, 2003) e com os critérios
estabelecidos pelo ICH (2005) a metodologia será considerada validada, desde que
sejam avaliados os parâmetros de seletividade/especificidade, linearidade, intervalo,
precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão e robustez. Conforme o guia
emitido pelo INMETRO (2010), os mesmos parâmetros anteriores devem ser
avaliados, incluindo o limite de detecção.
4.6.1 Seletividade e Especificidade
Os termos seletividade e especificidade tem sido assunto de intensas críticas,
sendo utilizados sem distinção por alguns autores. A seletividade se refere à
capacidade de cada método determinar um analito específico em uma mistura
complexa, sem a interferência de outros componentes na mistura. Esta definição é
comumente usada de forma errônea como equivalente a especificidade, a qual
refere-se o ponto final da seletividade, ou 0% de interferentes. A seletividade deve
estar conectada com a palavra “escolher”, e a especificidade com o termo “preciso”
(RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-BROCH, 2012). Se a
especificidade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão
seriamente comprometidas (INMETRO, 2010).
Na diretriz de validação de procedimentos analíticos do ICH (2005), o termo
especificidade é definido como a habilidade de avaliar exatamente o analito na
presença de componentes esperados a estarem presentes, como impurezas,
produtos de degradação, matriz, etc. De acordo com RE 899 (BRASIL, 2003) e o
INMETRO (2010), o termo seletividade possui a mesma definição.
48
Os procedimentos utilizados para demonstrar a especificidade dependem do
objetivo do método analítico e a investigação deve ser conduzida através de
análises de identificação, teor e análise de interferentes (BRASIL, 2003; ICH, 1996).
A diretriz imposta pelo ICH Q1A (2003) de testes de estabilidade de novos
fármacos e produtos enfatiza que os fatores que são susceptíveis a mudanças
durante o armazenamento e que podem influenciar a qualidade, segurança e
eficácia, devem ser simulados e o resultado de sua aplicação deve ser avaliado por
métodos validados do tipo “indicativos de estabilidade” (stability indicating). A diretriz
ICH Q3B (2003) intitulada "impurezas em novos produtos farmacêuticos" ressalta a
importância de fornecer evidências documentadas da validação dos procedimentos
analíticos comprovando que os mesmos são apropriados para a detecção e
quantificação de produtos de degradação.
De acordo com o FDA (1998), um método indicativo de estabilidade é um
procedimento analítico validado utilizado para determinar exatamente as mudanças
de concentração de fármacos e produtos farmacêuticos submetidos à degradação,
sem a interferência de impurezas e excipientes. Para produzir amostras
representativas para desenvolvimento de métodos indicativos de estabilidade e
demonstrar a especificidade do método desenvolvido são realizados ensaios de
degradação forçada (BLESSY et al., 2014).
A degradação forçada é um processo que envolve a degradação de produtos
farmacêuticos e fármacos em condições mais severas que as aplicadas no estudo
de estabilidade acelerada. As amostras geradas pela degradação forçada podem ser
utilizadas para estabelecer vias e mecanismos de degradação, elucidar a estrutura
dos produtos de degradação, determinar a estabilidade intrínseca de uma
substância, bem como auxiliar na obtenção de melhorias na etapa de produção e
nos procedimentos analíticos indicativos de estabilidade selecionados (BLESSY et
al., 2014).
As diretrizes impostas pelo ICH solicitam a realização de estudos de
degradação forçada sob uma variedade de condições, como pH, luz, oxidação,
aquecimento, etc., mas não fornecem detalhes sobre técnicas práticas envolvendo
os testes de estresse (BAKSHI; SINGH, 2002; BLESSY et al., 2014). Portanto, a
escolha das condições as quais o analito será submetido, deve ser consistente com
a sua decomposição em condições normais de fabricação e armazenamento
(BLESSY et al., 2014).
49
Uma lista mínima de fatores de estresse sugeridos para estudos de
degradação forçada deve incluir hidrólise ácida e alcalina, degradação térmica,
fotólise e oxidação (NGWA, 2010; SINGH; REHMAN, 2012). A questão de quanta
degradação é suficiente tem sido o assunto de muitas discussões, sendo que
degradações entre 5 e 20% tem sido as mais aceitas. Quando as condições de
estresse impostas são muito intensas, a amostra pode ser conduzida a produtos de
degradação secundários que não apareceriam em estudos de estabilidade de longa
duração convencionais, e quando as mesmas são muito brandas pode-se não gerar
uma quantidade suficiente de produtos de degradação (BLESSY et al., 2014).
Reações hidrolíticas, sob condições ácidas e alcalinas, estão entre os
processos mais comuns de degradação de fármacos. A seleção do tipo e
concentração dos ácidos e bases dependem da estabilidade da substância. Na
literatura são sugeridos como adequados para hidrólise os ácidos clorídrico ou
sulfúrico e os hidróxidos de sódio ou potássio, na faixa de 0,1 a 1M. Se as
substâncias testadas são pouco solúveis em água, co-solventes podem ser
utilizados. Os testes de estresse não devem exceder 7 dias, e ao final do tempo
estabelecido as amostras deve ser neutralizadas para evitar uma maior
decomposição das mesmas (BLESSY et al., 2014; WATERMAN; ADAMI, 2005).
O peróxido de hidrogênio é amplamente utilizado para oxidação de
substâncias submetidas aos testes de degradação forçada, mas também outros
agentes oxidantes podem ser utilizados como íons metálicos, oxigênio e iniciadores
de radicais livres. O agente oxidante, sua concentração e condições dependem da
substancia analisada (BLESSY et al., 2014).
A estabilidade térmica é um dos parâmetros mais simples de determinar,
geralmente através do uso de técnicas de análise térmica. Devido aos experimentos
por análise térmica serem métodos efetivamente acelerados, é necessário
usualmente extrapolar os resultados obtidos para temperaturas mais baixas, mais
compatíveis com as condições de armazenamento e uso do analito (GLASS;
NOVAK; BROWN, 2004). Amostras no estado sólido podem ser expostas ao calor
seco ou úmido a temperaturas entre 40 e 80°C (BLESSY et al., 2014).
A exposição à luz pode induzir a degradação química de moléculas
suscetíveis (WATERMAN; ADAMI, 2005). O termo fotoestabilidade inclui não
somente a degradação causada pela exposição à luz, mas também processos como
a formação de radicais livres, transferência de energia e luminescência. A
50
fotoestabilidade de uma substância irá depender do comprimento de onda,
intensidade, tempo e dose de radiação a qual foi exposta (GLASS; NOVAK;
BROWN, 2004). Fontes de luz solar direta e indireta, lâmpadas fluorescentes e
incandescentes, possuem apenas uma fração da luz na região do ultravioleta mais
prejudicial, por esta razão o ICH na diretriz Q1B (1996) padronizou a exposição UV
em 200 Wh/m². Para a luz visível, as fontes de exposição são medidas pelos seus
valores lux, que representa o fluxo de luz corrigido pela resposta visual. Um lux é
equivalente a 1,46 mW/m² a 555 nm, e a exigência de exposição padrão
preconizada pelo ICH é de 1,2 milhões de lux/horas. Com câmaras de luz
encontradas comercialmente, é possível atingir as condições de exposição
preconizadas tanto para a região do UV quanto do visível em menos de uma
semana (WATERMAN; ADAMI, 2005).
A CLAE de fase reversa é a ferramenta analítica mais utilizada para
separação e quantificação de impurezas e é mais frequentemente acoplada a um
detector PDA (Photodiode array), que fornece a informação de homogeneidade dos
picos, permitindo assegurar que os mesmos são atribuídos a um só componente
(BLESSY et al., 2014; BRASIL, 2003; ICH, 1996).
4.6.2 Linearidade e faixa de aplicação
A linearidade de um procedimento analítico consiste na capacidade de uma
metodologia analítica demonstrar que os resultados obtidos são diretamente
proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um intervalo
especificado (BRASIL, 2003; ICH, 2005).
Para determinação da linearidade recomenda-se que sejam analisadas pelo
menos cinco concentrações diferentes. Os limites percentuais do teor do analito que
devem estar contidos no intervalo de linearidade variam de acordo com o ensaio a
ser realizado. De acordo com a Resolução 899 (2003), para a determinação
quantitativa do analito em matérias-primas ou em formas farmacêuticas, as
concentrações devem seguir um intervalo de 80% a 120% da concentração teórica
do teste (BRASIL, 2003; RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-BROCH,
2012).
A linearidade de um método pode ser observada pelo gráfico dos resultados
dos ensaios em função da concentração do analito (curva analítica ou curva de
51
calibração). Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva de
calibração pode ser efetuada usando o método matemático conhecido como
regressão linear, a partir do qual é possível determinar coeficiente de correlação,
intersecção com o eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados
mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo. Para tal, antes deve ser
verificada a ausência de valores discrepantes para cada nível de concentração
através da soma dos quadrados residuais (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004;
VILEGAS; CARDOSO, 2009; INMETRO, 2010).
O coeficiente de correlação (r) expressa a relação entre a resposta do analito
e sua concentração. Este parâmetro permite uma estimativa da qualidade da curva
obtida, pois quanto mais próximo de 1,0, menor a dispersão do conjunto de pontos
experimentais e menor a incerteza dos coeficientes de regressão estimados (RIBANI
et al., 2004). A ANVISA determina que o critério mínimo de coeficiente de correlação
(r) deve ser igual a 0,99 (BRASIL, 2003).
O intervalo especificado é a faixa entre os limites de quantificação superior e
inferior de um método analítico e normalmente é derivado do estudo de linearidade.
É confirmado após os ensaios de exatidão, precisão e linearidade, quando aplicado
a amostras contendo quantidades do analito dentro da faixa de aplicação (BRASIL,
2003).
4.6.3 Exatidão
A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos
pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro (BRASIL, 2003). Desta
forma, desde que a determinação da exatidão permita estimar as dimensões dos
erros sistemáticos de um determinado método, deve ser realçado que é o aspecto
mais crucial da metodologia (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-
BROCH, 2012).
Várias metodologias para a determinação da exatidão estão disponíveis,
sendo que para os casos em que amostras de todos os componentes do
medicamento estão indisponíveis, por exemplo no caso dos medicamentos a base
de extratos de plantas, aceita-se a análise pelo método de adição de padrão, no qual
adiciona-se quantidades conhecidas do analito (padrão de referência) ao
medicamento (RIBANI et al., 2004).
52
De acordo com a RE 899 (BRASIL, 2003) a exatidão do método é calculada
como porcentagem de recuperação da quantidade conhecida do analito adicionado
à amostra, ou como a diferença porcentual entre as médias e o valor verdadeiro
aceito, acrescida dos intervalos de confiança. A exatidão deve ser determinada
após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do
mesmo, sendo verificada em três níveis de concentração, alta, intermediária e baixa,
e no mínimo com determinações em triplicata.
A recuperação esperada depende da matriz da amostra, processamento da
amostra e concentração do analito (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO;
CARDA-BROCH, 2012). No Brasil a ANVISA não determina o intervalo de
recuperação a ser atingido, mas conforme o manual da AOAC (1993) as
porcentagens de recuperação dependem no nível do analito, para amostras com o
analito a 1% por exemplo, a faixa de recuperação deve estar entre 97 a 103%.
4.6.4 Precisão
A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série
de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra realizada em três
níveis (BRASIL, 2003).
A repetibilidade ou precisão intra-corrida consiste na concordância entre os
resultados dentro de um curto período de tempo com o mesmo analista e mesma
instrumentação. O ICH (1996) e a RE 899 (BRASIL, 2003) recomendam que sejam
verificadas no mínimo nove determinações, contemplando concentrações, baixa,
média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou mínimo de 6 determinações a 100% da
concentração do teste. A precisão intermediária, ou precisão inter-corridas, é
reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados em um
único laboratório e, como tal, mais aconselhável de ser adotada, sendo
recomendada sua determinação em um mínimo de 2 dias diferentes com analistas
diferentes (BRASIL, 2003; RIBANI et al., 2004). O termo reprodutililidade define a
precisão dos resultados obtidos para uma determinada análise realizada por
laboratórios diferentes seguindo a mesma metodologia (RIBEIRO et al., 2008).
A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou
coeficiente de variação (CV) (RAMBLA-ALEGRE; ESTEVE-ROMERO; CARDA-
BROCH, 2012). O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a
53
metodologia empregada, a concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a
finalidade do método, não se admitindo valores superiores a 5% (BRASIL, 2003).
Com a finalidade de determinar a precisão de um novo método, o INMETRO
(2010) recomenda a comparação deste, com um método referência, através da
razão das variâncias dos dois métodos (Fcalc/Fcrit), ou do teste “t student”. Caso não
haja um método referência, os valores teóricos de repetitividade e reprodutibilidade
podem ser calculados a partir da equação de Horwitz (1).
𝐷𝑃𝑅𝑅 = 2(1−0,5 𝑙𝑜𝑔 𝐶) (1)
Em que, DPRR é o desvio padrão relativo, calculado a partir dos resultados
gerados em condições de reprodutibilidade e C é a faixa de concentração. Para
avaliar a aceitabilidade da precisão de um método faz-se uso do valor de HORRAT,
que é a razão entre os valores de desvio padrão relativo da reprodutibilidade e do
desvio padrão relativo da reprodutibilidade calculado a partir da equação de Horwitz,
na concentração de interesse. Se os valores de HORRAT forem menores ou iguais a
2, a reprodutibilidade do método pode ser considerada satisfatória (INMETRO,
2010).
4.6.5 Limite de detecção (LD)
Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente em uma
amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as
condições experimentais estabelecidas (BRASIL, 2003).
Segundo a ANVISA (BRASIL 2003), a estimativa do limite de detecção pode
ser feita com base na relação de 3 vezes o ruído da linha de base ou pode ser
determinado através dos parâmetros da curva de calibração (3,3 x S/IC, onde S é a
estimativa do desvio do intercepto com o eixo do Y de no mínimo 3 curvas analíticas
construídas e IC é o coeficiente angular da curva analítica).
Quando são realizadas medidas em amostras com baixos níveis do analito ou
de uma propriedade, como por exemplo, análise de traços, é importante saber qual o
menor valor de concentração do analito ou da propriedade que pode ser detectado
pelo método. Para a validação de um método analítico, é normalmente suficiente
54
fornecer uma indicação do nível em que a detecção do analito pode ser distinguida
do sinal do branco/ruído (INMETRO, 2010).
4.6.6 Limite de quantificação (LQ)
O limite de quantificação de acordo com a RE 899 (BRASIL, 2003), é definido
como a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada
com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
Para procedimentos analíticos que apresentam ruído na linha base, o LQ
pode ser determinado através do ruído da linha de base e considera-se como limite
de quantificação aquela concentração que produza relação sinal-ruído superior a
10:1. O LQ também pode ser calculado a partir do intervalo de confiança da curva
analítica (10x S/IC, onde S é a estimativa do desvio do intercepto com o eixo do Y de
no mínimo 3 curvas analíticas construídas e IC é o coeficiente angular da curva de
calibração).
Para o INMETRO (2010), a matriz da amostra utilizada para determinar o LQ
deve ser identificada e na análise em nível de traços, e é recomendado adotar o
limite de quantificação como a concentração mais baixa da curva analítica.
4.6.7 Robustez
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir
a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos, indicando sua
confiança durante o uso normal (BRASIL, 2003). Durante o desenvolvimento da
metodologia, deve-se considerar a avaliação da robustez. Constatando-se a
susceptibilidade do método a variações nas condições analíticas, estas deverão ser
controladas e precauções devem ser incluídas no procedimento. Os fatores que são
geralmente estudadas estão o pH da fase móvel ou solvente, concentração do
tampão, pequenas mudanças no sistema de solventes, temperatura e volume de
injeção, preparo das amostras, velocidade do gás de arraste, etc. (BRASIL, 2003;
ICH, 2005).
55
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Material
5.1.1 Materiais e reagentes
Acetato de etila PA, Vetec®;
Acetona deuterada, Merck®;
Acetona PA, Dinâmica®;
Acetonitrila grau HPLC, Tedia®;
Ácido clorídrico PA;
Água ultrapura grau I;
Anisaldeído sulfúrico;
Clorofórmio deuterado, Merck®;
Cromatoplacas de sílica gel 60 GF 254, 20 µm de espessura, Merck®;
Etanol 95º, Vetec®;
Filtros de membrana de celulose (0,45 µm), Millex®;
Filtros de membrana de celulose (47 mm x 0,45 µm), Sartorius Stedim®;
Hexano PA, Dinâmica®;
Hidróxido de sódio;
Metanol grau HPLC, JTBaker®;
Peróxido de hidrogênio 30%, Dinâmica;
Sílica gel 60 (Merck®) 70-230 mesh. (ϕ = 0,063-0,20 mm);
Vidrarias classe A.
5.1.2 Equipamentos
Analisador DSC/TG Netzsch STA 449 F3 Jupiter®;
Balança analítica Shimadzu AUW220D;
Câmara de radiação ultravioleta Minerallight® ( = 254 e 366 nm);
Centrífuga Micro Fanem® 243;
Coluna Kinetex C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m);
56
Coluna Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm x 3m);
Cromatógrafo líquido Shimadzu® LC 20-AC, equipado com uma bomba
quaternária, detector de varredura de espectro ao ultravioleta por arranjo de
fotodiodos (diodo array) e injetor automático SIL-20A;
Difratômetro de raios X - (Xpert Pro Multi-Purpose Diffractometer,
PanAnalytical®);
Espectrofotômetro FT-IR Shimadzu® IR Prestige-21;
Espectrofotômetro UV-1601 Shimadzu®;
Espectrômetro Bruker AC-300F®, 300 mhz;
Espectrômetro de massas Shimadzu DI-2010®;
Microscópio eletronico de varredura Philips XL 30® (Hillsboro, U.S.A.).
5.1.3 Material vegetal
Para isolamento do ácido mirsinóico A e do ácido mirsinóico B, foram
utilizados extratos etanólicos das cascas, galhos e folhas de Rapanea ferruginea
previamente preparados por pesquisadores do laboratório de fitoquímica da
UNIVALI. A planta foi coletada no município de Blumenau, Rua Belo Horizonte,
Santa Catarina, Brasil. Uma exsicata desta espécie está depositada no Herbário
Barbosa Rodrigues em Itajaí sob o código HBR 52715.
5.1.4 Soluções extrativas (SE)
Para o desenvolvimento e validação da metodologia analítica foram utilizadas
as soluções extrativas das cascas e frutos de R. ferruginea preparados por Dal Mas
(2014) e Xavier (2014), respectivamente.
As cascas de R. ferruginea coletadas de uma árvore com 35 cm de diâmetro
e da região próxima ao solo (20 cm de altura) foram pulverizadas e maceradas na
proporção planta/solvente 10% (p/V). O solvente empregado foi o etanol 90 °GL,
deixado à temperatura ambiente, sob agitação em agitador mecânico (800 ± 30
rpm), sem renovação do líquido extrator, por 2 horas, conforme padronizado por
Baccarin (2010). Posteriormente o extrato foi filtrado em três camadas de tecido
57
Sontara® para separar o resíduo da droga pulverizada do líquido extraído. A solução
extrativa obtida foi filtrada novamente a vácuo em filtro de papel.
Para obtenção da solução extrativa dos frutos de R. ferruginea, uma mistura
de frutos maduros (FM) e imaturos (FI) pulverizados foi submetida à maceração em
agitador mecânico na velocidade de 300 rpm à temperatura ambiente pelo período
de 5 horas, utilizando como extrator o etanol 90°GL na proporção planta/solvente
5%.
Os resíduos secos obtidos para a soluções extrativas das cascas e frutos de
R. ferruginea foram de 0,48 ± 0,02 % e 0,72 ± 0,14 %, respectivamente.
5.1.5 Extratos moles (EM)
Os extratos moles foram utilizados no estudo de estabilidade dos marcadores.
Para obtenção do extrato mole das cascas de R. ferruginea, a SE obtida foi reduzida
a 50% de seu volume em banho de água a 45 °C. Após, foi concentrada em estufa
de ar circulante a 45 °C até apresentar aspecto xaroposo. Para o extrato mole dos
frutos de R. ferruginea, a SE foi reduzida em banho de água a 45 ºC. Os resíduos
secos obtidos para os EM foram de 51,17 ± 0,53 % para as cascas e 45,58 ± 0,18 %
para os frutos.
5.2 Métodos
5.2.1 Isolamento dos marcadores
A mistura dos extratos etanólicos das cascas, galhos e folhas de Rapanea
ferruginea (43 g) foi submetida a uma coluna cromatográfica (CC) utilizando como
fase estacionária sílica gel 60 (266 g). O diâmetro interno da coluna utilizada foi de 9
cm. Esta coluna foi denominada de Coluna 1. A eluição foi realizada com solventes
orgânicos de polaridade crescente, utilizando hexano (Hex), acetato de etila
(AcOET) e etanol (EtOH). O gradiente de eluição foi definido baseado na observação
do comportamento frente às análises por CCD (GAZONI, 2009).
O perfil cromatográfico por CCD dos extratos e compostos puros obtidos
foram realizados em cromatoplacas de sílica gel. Os sistemas de eluição foram
escolhidos de acordo com a polaridade das amostras. Para visualização da
58
fluorescência dos compostos rastreados foi utilizada radiação ultravioleta nos
comprimentos de onda de = 254 e 366 nm, o revelador químico empregado foi o
anisaldeído sulfúrico (GAZONI, 2009). As frações semelhantes foram reunidas, o
solvente foi evaporado e os rendimentos obtidos.
5.2.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B
Para a caracterização físico-química do AMA e AMB foram avaliados os
parâmetros de solubilidade, pKa, log P, absortividade específica, ponto de fusão,
umidade e degradação forçada. Também foi realizada a determinação de pureza por
CLAE e DSC, além de análise por microscopia eletrônica de varredura e difração de
raios X, espectroscopia Raman e espectrometria de massas. Para confirmação
estrutural dos marcadores utilizados no presente estudo foram realizadas análises
espectroscópicas no ultravioleta, infravermelho e RMN de 1H e 13C, cujos resultados
não são inéditos na literatura.
5.2.2.1 Análises por infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e
13C
Os espectros de infravermelho (IV) para os compostos AMA e AMB, foram
obtidos em espectrofotômetro FT-IR Shimadzu® IR Prestige-21. A espectrometria no
infravermelho por transformada de Fourier com refletância total atenuada (ATR-
FTIR) foi utilizada para análise do AMA. Para o AMB foi utilizada a técnica de
espectroscopia por refletância difusa no infravermelho com transformada de Fourier
(DRS-FTIR). Cada espectro foi determinado na faixa de 3600-700 cm–1.
Para a análise de RMN 1H e RMN 13C foram utilizados cerca de 15 mg de
cada amostra dissolvidas em acetona deuterada, tendo como referência interna o
tetrametilsilano (TMS). Os deslocamentos químicos foram registrados em valores
dimensionais (ppm).
5.2.2.2 Espectroscopia Raman
O espectro Raman do AMB foi adquirido em um sistema PeakSeeker 785
(RAM–PRO–785) com um laser de diodo de 785 nm e 300 mW na fonte. A radiação
59
Raman reunida foi dispersada com uma grade e focada em um dispositivo de
resfriamento com carga acoplada Peltier, permitindo a obtenção de uma resolução
espectral de 6 cm-1. O laser foi focado na amostra pelas lentes objetiva 4x de um
microscópio dando um ponto de aproximadamente 2 µm de diâmetro. Todo espectro
foi obtido na janela espectral de 200-1800 cm-1 com o mesmo tempo de aquisição
(30 s). A amostra em pó (AMB) foi analisada em lamina de vidro a temperatura
ambiente.
5.2.2.3 Espectrometria de massas com unidade de entrada direta de amostra (DI-
MS)
Através da utilização do acessório de entrada direta de amostra Shimadzu DI-
2010, foi introduzida uma pequena quantidade de cada amostra diretamente na
fonte de íons. O espectrofotômetro de massa foi operado no modo de ionização por
impacto de elétrons (EI), a 70 eV, com a temperatura da fonte de íons ajustada para
250 ºC.
5.2.2.4 Solubilidade
A determinação da solubilidade dos ácidos mirsinóicos A e B foi realizada
através do método de análise de solubilidade por fases, que consiste na adição de
porções crescentes de amostra a volumes constantes de solvente no qual a
substância analisada mostra apenas ligeira solubilidade, visando à obtenção de
solução saturada dessa substância. Uma vez promovido o equilíbrio do sistema - por
agitação prolongada, a temperatura ambiente, as amostras foram analisadas
visualmente para verificar a presença de partículas que permanecem insolúveis.
A solubilidade dos ácidos mirsinóicos A e B foi determinada em água, metanol
e acetonitrila, e foi descrita conforme os termos descritivos presente na farmacopéia
brasileira (Quadro 1).
60
Quadro 1 - Termos descritivos de solubilidade e seus significados.
Solvente Termo descritivo
Muito solúvel Menos de 1 parte
Facilmente solúvel De 1 a 10 partes
Solúvel De 10 a 30 partes
Ligeiramente solúvel De 30 a 100 partes
Pouco solúvel De 100 a 1000 partes
Muito pouco solúvel De 1000 a 10000 partes
Praticamente insolúvel ou insolúvel Mais de 10000 partes
Fonte: BRASIL, 2010b.
5.2.2.5 Coeficiente de partição (log P)
O coeficiente de partição (P) é definido como a razão entre as concentrações
de equilíbrio de uma substância dissolvida em um sistema de duas fases consistindo
de dois solventes praticamente imiscíveis. No caso, octanol e água (OECD, 2004). A
utilização da técnica de CLAE de fase reversa é um dos métodos mais populares
para a determinação do log P. Os parâmetros de retenção diretamente medidos são
índices de lipofilicidade e podem também ser convertidos para uma escala log P
através do uso de padrões e equações (AVDEEFA; TESTA, 2002).
Os coeficientes de partição dos compostos AMA e AMB, foram determinados
de acordo com o método por CLAE de fase reversa, conforme descrito na diretriz da
OECD nº117 (OECD, 2004). Os compostos com coeficiente de partição conhecidos
analisados foram o álcool benzílico, fenol, ácido benzoico, benzeno, tolueno e
naftaleno. As análises foram realizadas utilizando uma coluna cromatográfica
Phenomenex C18 (150 x 4,6 m x 3m), tendo como fases móveis metanol e água
acidificada com ácido fosfórico pH 3,00, eluídas de forma isocrática na proporção
80:20, respectivamente.
Foi calculado o valor de k (fator de capacidade) em função do tempo de
retenção de cada composto através da equação (2).
𝑘 = 𝑡𝑅 − 𝑡0
𝑡0
(2)
61
Onde tR é o tempo de retenção das substâncias, e t0 é o volume morto. Os
valores de k e seus respectivos log P foram correlacionados em uma curva analítica.
Para o cálculo do coeficiente de partição octanol/água dos ácidos mirsinóicos A e B,
soluções de 50 g/mL foram analisadas nas mesmas condições cromatográficas e
os valores de k obtidos foram inseridos na equação (3), onde a e b representam os
coeficientes obtidos na regressão linear.
log 𝑃 = 𝑎 + 𝑏. log 𝑘 (3)
5.2.2.6 Constante de ionização (pKa)
Considerando que os marcadores AMA e AMB são insolúveis em meio
aquoso, o pKa dos mesmos foi estimado utilizando método computacional. A análise
conformacional foi realizada utilizando o software Spartan (Wavefunction Inc., Irvine,
California, USA). O cálculo a nível de Teoria do Funcional de Densidade (Density
Functional Theory – DFT) foi conduzido no software Gaussian 09. O cálculo de pKa
foi realizado utilizando o software Maestro, versão 9.4 (Schrodinger New York, NY,
2013).
5.2.2.7 Termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC).
A análise por termogravimetria e calorimetria exploratória diferencial dos
padrões foi realizada com a finalidade de obter dentre outros dados o ponto de fusão
e o teor de umidade. Foi utilizada uma razão de aquecimento de 1º C/min; peso da
amostra de aproximadamente 5 mg; faixa de temperatura de 20-450ºC; vazão de
gás de nitrogênio 50 mL/min e célula de alumina. A determinação de pureza
tomando como base a equação de Van’t Hoff foi possível apenas para o do AMB,
por se apresentar na forma sólida.
5.2.2.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A avaliação morfológica das partículas foi possível apenas para o AMB, que
se apresenta como um pó branco, a análise foi realizada por microscopia eletrônica
62
de varredura, no departamento de Engenharia Mecânica da Universidade Federal do
Paraná (UFPR). A superfície da amostra foi coberta com uma camada de ouro, e
posteriormente analisada. As fotomicrografias foram obtidas com ampliação de 105,
500 e 1000 vezes.
5.2.2.9 Difração de raios X (DRX)
As análises por difração de raios X e Raman foram realizadas em parceria
com o Departamento de Física da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
A análise por DRX foi possível apenas para o AMB, por este se apresentar na
forma sólida. Os difratogramas foram obtidos utilizando um difratômetro de raio X -
(Xpert Pro Multi-Purpose Diffractometer, PanAnalytical), equipado com radiação Kα-
Cobre ( = 1.5418 Å), operado com uma corrente de 40 mA e voltagem de 45 kV,
girador de amostra e um detector RTMS (Real Time Multiple Strip). As
determinações foram conduzidas a temperatura ambiente com varredura 2 de 4º a
35°, com tamanho do passo de 0,016 e tempo por passo de 25.0 s.
5.2.2.10 Determinação de potência dos padrões e análise por UV/Vis
A pureza do pico correspondente aos padrões foi avaliada através do detector
de DAD utilizando o método gradiente por CLAE desenvolvido previamente (Item
5.3). Também foi determinada a pureza dos padrões, observando a presença de
outros picos no cromatograma, suas respectivas áreas e proporções em relação aos
picos de interesse. Através do detector utilizado também foram obtidos os perfis de
absorção no UV dos padrões AMA e AMB. A partir dos espectros de UV/vis das
amostras foi possível calcular a absortividade específica (E1cm1% ) dos marcadores,
através da equação descrita na farmacopeia brasileira (4) (BRASIL, 2010b).
E1cm1% =
𝐴
𝑏. 𝑐
(4)
Em que, A é a absorbância no comprimento onda de 260 nm para o AMA e
270 nm para o AMB, c é concentração da amostra (0,01 g 100 mL-1); e b o caminho
óptico da cubeta, correspondente a 1 cm.
63
5.2.3 Desenvolvimento de metodologia analítica por CLAE
Para análise por CLAE, a SE das cascas de R. ferruginea (obtida conforme
item 4.1.4) foi diluída na proporção 1:10 com metanol filtrada com membrana de
PTFE modificada de 0,45 μm, colocada em vial (1,5 mL), e 20 L da solução foi
injetado no cromatógrafo.
Inicialmente utilizou-se como fase estacionária uma coluna de fase reversa
Phenomenex® C18, (150 X 4,6 mm X 3 m). Como fases móveis foram utilizados
solventes orgânicos grau HPLC, e água ultrapura filtrados a vácuo com membrana
de celulose regenerada 47 mm de diâmetro e 0,45 µm de porosidade.
Na escolha da melhor condição de análise, foram realizadas variações na
constituição da fase móvel, pH, gradiente e fluxo, com a finalidade de otimizar a
metodologia analítica, de forma a obter a separação adequada de todos os
fitoconstituintes presentes nos extratos. Foram avaliados os tempos de retenção,
fator de retenção, simetria de picos (fator de tailing) e resolução cromatográfica.
A detecção por varredura de espectro foi realizada na faixa de comprimentos
de onda entre 190 nm até 400 nm. O software LC Solution® foi utilizado para
registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos.
5.2.3.1 Preparo das soluções amostra
As SE das cascas e frutos de R. ferruginea (obtidas conforme Item 4.1.4)
foram diluídas em metanol na proporção 1:5.
Para análise dos EM (Item 4.1.5), a fim de obter a concentração de 1 mg/mL,
pesou-se exatamente cerca de 10 mg de de cada amostra referente as cascas e
frutos em balões volumétricos de 10 mL. Após a adição de 5 mL de metanol, as
soluções foram sumetidas a sonicação até completa dissolução, e posteriormente os
volumes foram completados com metanol.
Antes da análise por CLAE, cada solução foi filtrada em membrana de PTFE
modificada com porosidade de 0,45 μm.
64
5.2.4 Validação analítica
A validação das metodologias seguiu os protocolos segundo a RE nº 899
(BRASIL, 2003) e segundo a ICH (2005) (International Conference Harmonization). A
validação seguiu os parâmetros de especificidade, linearidade, faixa de aplicação,
exatidão, precisão, limite de detecção e limite de quantificação e robustez,
adequados à análise dos ácidos mirsinóicos A e B.
5.2.4.1 Especificidade
A especificidade do método gradiente foi demonstrada através do cálculo da
resolução dos picos correspondentes aos ácidos mirsinóicos A e B em relação aos
demais picos próximos presentes no extrato. Foi utilizado o detector de arranjo de
fotodiodos, para realizar o teste de pureza de cada pico correspondente aos
marcadores.
Para o método isocrático a especificidade foi determinada realizando o teste
de pureza dos picos dos ácidos mirsinóicos A e B.
5.2.4.2 Linearidade e faixa de aplicação
Para verificar a linearidade dos métodos gradiente e isocrático foram
construídas curvas de calibração com os padrões dos compostos AMA e AMB
previamente isolados. Foram realizadas diluições sucessivas de uma solução-mãe
preparada a partir de 5 mg de cada padrão diluídos em metanol, simultaneamente,
em um balão de 5 mL, obtendo-se as concentrações de 1000 g/mL para os dois
compostos. A partir desta solução foram realizadas diluições no intervalo de 1 a 100
g/mL, em 7 níveis (1, 5, 10, 25, 50, 75 e 100 g/mL).
Em cada método, cada nível foi injetado em triplicata e através do software
“LC Solution” foram construídas as curvas analíticas através da elaboração de um
gráfico de área média do pico versus concentração.
65
5.2.4.3 Precisão
A precisão para os métodos isocrático e gradiente foi determinada através do
método de repetibilidade (precisão intra-corrida), no qual foram realizadas seis
determinações de soluções da amostra contendo 100% da concentração do teste
(concentração alvo) dos ácidos mirsinóicos A e B.
A precisão foi expressa como desvio padrão relativo (DPR), abrangendo
valores menores que 5% (BRASIL, 2003).
5.2.4.4 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ)
Os limites de detecção e quantificação para os ácidos mirsinóicos A e B,
analisados pelos métodos gradiente e isocrático, foram obtidos através do método
da relação sinal-ruído. Foram injetadas soluções de baixa concentração dos
compostos até que a relação sinal-ruído fosse de 3:1 para LD e 10:1 para LQ
(BRASIL, 2003).
5.2.4.5 Exatidão
A exatidão dos métodos gradiente e isocrático foi determinada através do
ensaio de adição de padrão, no qual foram adicionadas na amostra quantidades
conhecidas de padrão em diferentes níveis. Este parâmetro foi determinado após o
estabelecimento da linearidade, do intervalo e da especificidade dos mesmos, sendo
verificado em triplicata nos níveis de concentração, alta, intermediária e baixa. O
cálculo de recuperação foi realizado através da equação (5).
Exatidão = Conc. média experimental
Conc. teórica adicionada . 100 (5)
Para o método gradiente o ensaio de exatidão foi realizado injetando-se
diferentes quantidades de uma solução contendo os padrões AMA e AMB resultando
em três níveis de concentrações, adicionados em uma solução preparada a partir de
uma solução extrativa das cascas de R. ferruginea.
66
Para o AMA e AMB utilizou-se uma solução com concentração de 100 µg/mL
dos padrões e 560 µg/mL da solução extrativa. A partir destas soluções, foi realizada
a adição dos ácidos mirsinóicos A e B em diferentes concentrações (25; 50; 75
µg/mL) na solução do extrato, diretamente nos viais, conforme o Quadro 2.
Quadro 2 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método gradiente com adição dos padrões AMA e AMB.
*Capacidade de 1mL em cada vial.
As análises foram realizadas injetando-se, inicialmente, a solução contendo
somente a solução extrativa e por último, a solução padrão. Cada análise foi
realizada em triplicata.
Para a determinação de exatidão do método isocrático, diferentes
quantidades de uma solução contendo os padrões AMA e AMB resultando em três
níveis de concentrações, foram adicionados em uma solução contendo uma
concentração fixa dos mesmos. Para o AMA e AMB utilizou-se duas soluções com
concentração de 100 µg/mL dos padrões, uma denominada “Solução Padrão (SP)” e
a outra “Solução Adicionada (SA)”. A adição dos ácidos mirsinóicos A e B foi feita
em diferentes concentrações (25; 50; 75 µg/mL) na solução padrão, diretamente nos
viais, conforme o Quadro 3. Cada análise foi realizada em triplicata.
Vial* Vol. (µL) solução
extrativa
Vol. (µL) solução
AMA e AMB
Vol. (µL)
metanol
Conc. (µg/mL)
teórica adicionada
AMA e AMB
01 250 - 750 0
02 250 250 500 25
03 250 500 250 50
04 250 750 - 75
05 - 500 500 50
67
Quadro 3 - Preparo das soluções para o ensaio de exatidão do método isocrático com adição dos padrões AMA e AMB.
*Capacidade de 1mL em cada vial.
5.2.4.6 Robustez
A robustez do método gradiente foi avaliada aplicando-se pequenas e
deliberadas variações na temperatura do forno (34, 35 e 36 ºC), fluxo da fase móvel
(0,8, 0,9 e 1,0 mL/min) e pH da fase aquosa (2,5, 2,6 e 2,7). Foram avaliadas as
áreas, tempos de retenção e concentrações de AMA e AMB (g/mL) na solução do
extrato etanólico 90°GL das cascas (1:5) e a área, tempo de retenção e
concentração de AMA na solução do extrato etanólico 90°GL dos frutos (1:5).
A robustez do método isocrático foi avaliada variando a temperatura do forno
(34, 35 e 36 ºC), fluxo da fase móvel (0,9, 1,0 e 1,1 mL/min), pH da fase aquosa (2,5,
2,6 e 2,7), e as proporções da fase móvel (26:59:15, 25:60:15 e 24:61:15).
5.2.4.6.1 Estabilidade dos marcadores em solução
A estabilidade dos ácidos mirsinóicos A e B foi avaliada em solução de
metanol, solvente utilizado para solubilização dos marcadores isolados e extratos
das cascas e frutos analisados por CLAE. Este parâmetro também foi avaliado para
os marcadores solubilizados em acetonitrila, que foi utilizada para a extração dos
mesmos nas nanoemulsões. Foram pesados 2,5 mg de cada padrão para balões
volumétricos de 50 mL, em cada balão foi adicionado aproximadamente 25 mL de
metanol e acetonitrila e foram submetidos a sonicação até completa dissolução dos
marcadores. Os balões foram completados e homogeneizados. Em seguida, cada
Vial* Vol. (µL) solução
padrão
Vol. (µL) solução
adicionada
Vol. (µL)
metanol
Conc. (µg/mL)
teórica adicionada
AMA e AMB
01 250 - 750 0
02 250 250 500 25
03 250 500 250 50
04 250 750 - 75
05 - 500 500 50
68
solução foi filtrada em membrana de celulose regenerada de 0,45 µm de porosidade
e transferida para viais de 1,5 mL, que foram armazenados a temperatura ambiente,
geladeira e freezer. Os marcadores em solução de metanol e de acetonitrila foram
avaliados separadamente por CLAE nos períodos de tempo de 0, 4, 8, 24, 48 horas
e 14 dias, quanto a teor e pureza dos picos.
5.2.5 Estudos de degradação forçada
O estudo de degradação forçada dos marcadores (ácidos mirsinóicos A e B)
foi delineado a partir do proposto pelo FDA (2000) e pela diretriz Q1A(R2) do ICH
(2003), com a finalidade de conhecer as rotas de degradação dos marcadores e
verificar se os produtos de degradação interferem na análise dos mesmos por CLAE,
comprovando se o método gradiente desenvolvido no presente estudo é indicativo
de estabilidade.
O AMA e o AMB foram submetidos às condições de estresse por hidrólise
ácida e alcalina, oxidação e por fotólise, seguidos de análise por CLAE. Com o
objetivo de avaliar a possível influência dos demais fitoconstituintes frente a
estabilidade do AMA e AMB, os extratos moles das cascas e frutos de R. ferruginea
(obtidos conforme item 4.1.5) foram submetidos às condições de degradação que os
compostos isolados apresentaram maior labilidade. Os ensaios foram realizados
analisando previamente soluções dos padrões e extratos sem degradação. O
percentual de degradação dos marcadores foi calculado comparando o teor dos
mesmos com as amostras não degradadas. Os produtos de degradação detectados
em cada amostra foram enumerados e comparados.
a) Estresse por hidrólise ácida
A degradação hidrolítica dos ácidos mirsinóicos A e B em condições ácidas foi
estudada pesando exatamente cerca de 1mg de cada padrão e 10 mg de cada
extrato mole, das cascas e frutos, para balões volumétricos de 5 mL. Transferiu-se
para cada balão 2,5 mL de metanol e estes foram submetidos a sonicação até
completa dissolução. Em seguida os balões foram completados com a solução
degradante, neste caso o ácido clorídrico 1M, e homogeneizados. Para os
compostos isolados, nos tempos pré-estabelecidos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 h,
69
foram retirados 500 L de cada solução e transferidos para balões de 1 mL, onde foi
adicionado o agente neutralizante, o hidróxido de sódio 1M, em quantidade
equimolar. Para os extratos o mesmo procedimento foi realizado apenas para o
intervalo de 24 horas. As misturas foram filtradas em membrana de celulose
regenerada de 0,45 m de porosidade e injetadas no cromatógrafo.
b) Estresse por hidrólise alcalina
Para o estudo de degradação dos ácidos mirsinóicos A e B em condições
alcalinas foram pesados exatamente cerca de 1mg de cada padrão em balões
volumétricos de 5 mL. Transferiu-se para cada balão 2,5 mL de metanol e estes
foram submetidos à sonicação até completa dissolução dos marcadores. Em
seguida os balões foram completados com a solução degradante, neste caso o
hidróxido de sódio 1M, e homogeneizados. Nos tempos pré-estabelecidos de 0, 15,
30, 60, 240 min e 24 h, foram retirados 500 L de cada solução e transferidos para
balões de 1mL, onde foi adicionado o agente neutralizante, o ácido clorídrico 1M, em
quantidade equimolar. As misturas foram filtradas em membrana de celulose
regenerada de 0,45 m de porosidade e injetadas no cromatógrafo.
c) Estresse por oxidação
Foram pesados exatamente cerca de 1 mg de AMA e AMB, e 10 mg de
extrato mole dos frutos e das cascas em balões volumétricos de 10 mL. Transferiu-
se para cada balão 5 mL de metanol e estes foram submetidos a sonicação até
completa dissolução dos analitos. Em seguida os balões foram completados com a
solução degradante, neste caso, o peróxido de hidrogênio a 30% e
homogeneizados. Transcorrido o tempo de 6 horas a temperatura ambiente, as
misturas foram filtradas em membrana de celulose regenerada de 0,45 µm de
porosidade e injetadas no cromatógrafo.
d) Fotólise
Os padrões AMA e AMB, pesando exatamente cerca de 50 mg, foram
expostos a radiação na região da luz visível a 1,2 e 2,4 milhões de lux/h e da luz
70
ultravioleta a energia de 200 e 400 W.h/m², em placas de Petri, utilizando câmara de
fotoestabilidade. Os extratos moles das cascas e frutos de R. ferruginea foram
submetidos as intensidades de radiação de 2,4 milhões de lux/h na região do visível
e 400 W.h/m² no UVA. Como controles foram utilizadas amostras cobertas com
papel laminado, com a finalidade de bloquear a incidência de luz. Transcorrido o
período de exposição, foram pesados exatamente cerca de 1 mg de cada padrão e
10 mg de cada extrato mole para balões volumétricos de 10 mL. Em cada balão foi
adicionado aproximadamente 5 mL de metanol e foram submetidos a sonicação até
completa dissolução das amostras. Os balões foram completados e
homogeneizados. Em seguida, as misturas foram filtradas em membrana de celulose
regenerada de 0,45 µm de porosidade e injetadas no cromatógrafo.
Os marcadores submetidos à degradação foram comparados aos seus
respectivos controles quanto ao aspecto, cor e perfil cromatográfico por CLAE. Os
extratos foram avaliados quanto ao teor dos marcadores e o perfil cromatográfico. O
percentual de degradação de AMA e AMB foram calculados comparando o teor das
amostras controle com o teor das amostras submetidas à degradação. A pureza dos
picos foi estimada usando DAD (arranjo de diodos), a qual deve superar 0,9 (> 90%).
e) Degradação térmica
O estudo de degradação térmica dos ácidos mirsinóicos A e B seguiu a
Resolução “RE nº1 - Guia para a realização de estudos de estabilidade” (BRASIL,
2005). Os padrões de AMA e AMB e os extratos moles das cascas e frutos de R.
ferruginea foram armazenados em diferentes frascos âmbar com tampas em estufa
a 40 °C durante o período de 90 dias, sendo que nos tempos de 0, 15, 30, 60, e 90
dias foram realizados os testes de doseamento e perfil cromatográfico das amostras.
Para as análises por CLAE foram pesados exatamente cerca de 1 mg de cada
padrão, e 10 mg dos extratos para balões volumétricos de 10 mL. Para cada balão
foi adicionado aproximadamente 5 mL de metanol e foram submetidos a sonicação
até completa dissolução dos marcadores. Os balões foram completados e
homogeneizados. Em seguida, as misturas foram filtradas em membrana de celulose
regenerada de 0,45 µm de porosidade e injetadas no cromatógrafo.
71
5.2.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões
A quantificação dos marcadores foi realizada utilizando o método da
padronização externa, o qual compara a área da substância a ser quantificada na
amostra com as áreas obtidas através da injeção das soluções de concentrações
conhecidas preparadas a partir de um padrão de referência do analito (RIBANI et
al., 2004).
Para a fórmula contendo apenas o AMB (NAMB01), 0,5 g da formulação foi
pesado em balão de 10 mL e colocado em ultrassom com 5 mL de metanol durante
30 minutos, foi completado o volume do balão volumétrico e a solução foi
centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi filtrado em membrana
de celulose regenerada de 0,45 m e analisado em triplicata utilizando o método
isocrático desenvolvido no presente estudo (item 5.3).
Para as nanoemulsões contendo os extratos das cascas (NCAS025) e frutos
(NFRUT1) de R. ferruginea, pesou-se exatamente cerca de 0,5 g das formulações
em balão volumétrico de 5 mL, no qual foi adicionado cerca de 2,5 mL de acetonitrila
e colocado em ultrassom por 20 minutos. Foi completado o volume do balão, e a
amostra foi centrifugada a 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi filtrado em
membrana de celulose regenerada de 0,45 m e analisado em triplicata utilizando o
método gradiente, desenvolvido no presente estudo (item 5.3).
Os métodos de preparo das amostras foram validados de acordo com a RE
nº 899/2003 e segundo a ICH (2005), quanto a precisão, através do ensaio de
repetibilidade, com a realização de 6 determinações de teor dos ácidos mirsinóicos A
e B de cada formulação. A partir dos resultados das triplicatas das áreas obtidas nas
análises por CLAE do AMA e AMB, foi calculada a média, desvio padrão(s) e desvio
padrão relativa (coeficiente de variação) para verificar a reprodutibilidade dos dados.
Para os valores de coeficiente de variação obtidos em torno de 5%, as analises
foram consideradas reprodutíveis.
Os métodos de análise desenvolvidos também foram validados quanto à
especificidade, com a finalidade de avaliar a possível presença de interferentes da
formulação nos tempos de retenção dos marcadores. Para a determinação da
especificidade dos métodos foram realizadas comparações dos cromatogramas das
nanoemulsões contendo ou não os marcadores isolados ou os extratos.
72
5.2.6.1 Nanoemulsões analisadas
Para o desenvolvimento e validação da metodologia para quantificação dos
marcadores AMA e AMB em nanoemulsões, foram utilizadas três formulações
desenvolvidas pelo grupo de pesquisa no decorrer do presente estudo.
A nanoemulsão contendo o composto isolado AMB a 0,1%, denominada
neste trabalho de NAMB01, foi desenvolvida por Silva (2014), cuja fórmula está
apresentada no Quadro 4.
Quadro 4 - Fórmula da nanoemulsão contendo o Ácido Mirsinóico B (AMB) 0,1%
(NAMB01).
Componentes Quantidade (%)
Polymol® 30
Ultramona R400-Oxiteno ® 10
Span 80 10
AMB 0,1
Água q.s.p.*
*quantidade suficiente para 100 g.
Dal Mas (2014), desenvolveu uma nanoemulsão contendo o extrato mole das
cascas de R. ferruginea (obtido de acordo com o item 4.1.3) a 0,13% denominada
neste trabalho de NCAS025. Sua fórmula está apresentada no Quadro 5.
Quadro 5 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole das cascas de R. ferruginea 0,25% (NCAS025).
Componentes Quantidade (%)
Miristato Isopropila 20
Alkest CSO 400 11,0
Span 80 2,3
Phenova 0,75
Ext. mole cascas R. ferruginea 0,25
Propilenoglicol 2
Água q.s.p.*
*quantidade suficiente para 100 g.
73
O extrato mole dos frutos de R. ferruginea (obtido de acordo com o item
4.1.3), foi incorporado a 1% em uma nanoemulsão desenvolvida por Xavier (2014),
denominada NFRUT1, cuja fórmula está apresentada no Quadro 6.
Quadro 6 - Fórmula da nanoemulsão contendo o extrato mole dos frutos de R. ferruginea 1,0% (NFRUT1).
Componentes Quantidade (%)
Polymol® 5,0
Span 80® 3,16
Ultramona RH400® 6,84
Phenonip® 0,5
Extrato mole 1
Água q.s.p.*
*quantidade suficiente para 100 g.
74
75
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Isolamento dos marcadores
Para o isolamento do AMA e AMB, a mistura dos extratos etanólicos das
cascas, galhos e folhas de Rapanea ferruginea foi submetida à cromatografia em
coluna (Coluna 1). Foram coletadas 177 frações, com volumes variando entre 20 e
100 mL.
As frações 18 a 22 eluídas com hexano:acetato de etila (8:2), foram reunidas
por apresentarem perfis semelhantes por CCD. Após a evaporação do solvente,
apresentaram rendimento de 1,1 g como um óleo amarelo, solúvel em acetona e
diclorometano. As frações 33 a 43 eluídas com hexano:acetato de etila (7,5:2,5),
também apresentaram perfis semelhantes por CCD. Estas foram reunidas e após a
evaporação do solvente e lavagem com hexano:acetona (7:3) obteve-se rendimento
de 2,73 g de um sólido branco, solúvel em acetona. Através da comparação com
estudos anteriores do perfil por CCD e características de eluição dos compostos
isolados (GAZONI, 2009; FRONZA; GIURADELLI, 2009), as frações 18-22 e 33-43
foram identificadas como sendo os ácidos mirsinóicos A e B, respectivamente. As
técnicas cromatográficas e espectroscópicas foram utilizadas para a confirmação
deste resultado, conforme será apresentado nos próximos itens.
6.2 Caracterização físico-química dos ácidos mirsinóicos A e B
6.2.1 Análises por infravermelho (IV) e Ressonância Magnética Nuclear de ¹H e
¹³C
Para confirmação estrutural dos ácidos mirsinóicos A e B, foram realizadas
análises no infravermelho e RMN de 1H e 13C e os resultados foram comparados
com estudos prévios (GAZONI, 2009; HIROTA et al., 2002; MAKABE et al., 2003).
Os espectros de infravermelho (IV) obtidos para os compostos AMA e AMB,
estão apresentados nas Figuras 2a e b, respectivamente.
O espectro de absorção no IV referente ao AMA (Figura 2a) apresentou
bandas de absorção com intensidade máxima em 2918,30 cm-1, referente à
76
deformação axial de CHsp3. Sobreposta a esta, está presente uma banda alargada,
caracterizada pela deformação axial do grupamento OH (2960–2600 cm-1), que
juntamente com a presença da carbonila com o sinal de estiramento em 1678 cm1
caracteriza o grupo funcional ácido carboxilico. Em 1600 cm-1 observa-se
deformação axial de C=C e em 1201 cm-1 deformação axial de C-O.
Para o AMB, o espectro de absorção no IV (Figura 2b) apresentou uma banda
de absorção com intensidade máxima em 3367 cm-1, referente à deformação axial
do grupamento OH de álcool. Sobreposta a esta, está presente uma banda
alargada, caracterizada pela deformação axial do grupamento OH (3000–2600 cm-1),
que juntamente com a presença da carbonila em 1701 cm-1 caracteriza o grupo
funcional ácido carboxilico. Em 1605 cm-1 observou-se estiramento de C=C e em
1282 e 1180 cm-1 deformação axial de C-O referente ao aril-alquil-eter da molécula.
Neste espectro, diferentemente do AMA, observa-se uma banda intesa em 960 cm-1
referente à deformação angular de C=C e sobreposta a esta deformação angular de
O-H de ácido carboxílico.
77
Figura 2 – Espectros de IV do AMA (ATR-FTIR) (a) e do AMB (DRS-FTIR) (b).
Para o AMA, o espectro de RMN 1H está apresentado na Figura 3a. Pode-se
observar em 7,77 ppm um dupleto (integral para dois hidrogênios), atribuído aos
hidrogênios aromáticos H-2 e H-6. Os tripletos em 5,36 ppm e 5,14 ppm (integral
para dois e um hidrogênio, respectivamente), são correspondentes aos hidrogênios
olefínicos H-2’,H-2” e H-6’, respectivamente. Já o tripleto em 3,44 ppm (integral para
4 hidrogênios) foram atribuídos aos metilenos (CH2) H-1’ e H-1”. Este sinal deveria
a)
b)
78
apresentar-se como dois dupletos, porém ocorreu sobreposição dos sinais formando
o tripleto. Os três simpletos em 1,78, 1,69 e 1,61 ppm (integral para 15 hidrogênios)
são referentes as 5 metilas (CH3) existentes. Isto ocorre porque as metilas 8’ e 10’ e
4” e 5” são equivalentes.
No espectro de RMN13C (Figura 3b) verificou-se a presença de 21 carbonos,
sendo 5 metilas, 4 metilenos, 4 metinos e 8 carbonos quaternários. Porém na
estrutura existem 22 carbonos, devido a sobreposição dos carbonos C-2 e C-6 em
129,85 ppm. Destacam-se em 167 ppm o sinal do carbono da carboxila, na região
de 160 a 120 ppm estão os carbonos aromáticos e olefínicos e abaixo de 40 ppm
encontram-se os carbonos alifáticos.
79
Figura 3 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMA (Acetona deuterada, 300 MHz).
a)
b)
80
Para o AMB, os espectros de RMN 1H e RMN 13C estão apresentados nas
Figuras 4a e b, respectivamente. O espectro de RMN de 1H apresentou um sinal
como dupleto em 7,5 ppm (integral para dois hidrogênios), atribuído aos hidrogênios
aromáticos H-4 e H-6. Os dois tripletos em 5,32 e 5,17 ppm (integral para dois
hidrogênios), estão de acordo aos hidrogênios olefínicos H-2’’ e H-4’. O tripleto em
4,81 ppm refere-se ao H-2 (integral para um hidrogênio). De ~3,40 a 3,19 ppm
(integral para quatro hidrogênios), observou-se multipletos referentes ao H-3 e H-1’’.
Na região de 1,30 a 1,75 ppm observou-se 4 simpletos referentes as 5 metilas (CH3),
sendo o sinal em 1,73 ppm referente às metilas 4’’ e 5’’, demais sinais obervados
nesta região indicaram os metilenos (CH2).
No espectro de RMN 13C do AMB (Figura 4b) verificou-se a presença de 22
carbonos. Destacam-se em 167,6 ppm o sinal do carbono da carboxila, na região de
132 a 122 ppm estão os carbonos aromáticos e olefínicos que correspondem aos
carbonos 4, 6, 4’ e 2”, respectivamente. Foi verificado abaixo de 40 ppm sinais
correspondentes aos quatro metilenos e as metilas, sendo que as metilas 6’ e 4”
apresentam o mesmo deslocamento químico.
81
Figura 4 – Espectros de RMN 1H (a) e RMN 13C (b) do AMB (Acetona deuterada, 300 MHz).
a)
b)
82
Para os compostos AMA e AMB os dados obtidos por espectroscopia no
infravermelho e ressonância magnética nuclear foram compatíveis com os
encontrados na literatura (GAZONI, 2009; HIROTA et al., 2002; MAKABE et al.,
2003), confirmando portanto, sua identidade química.
6.2.2 Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman é uma técnica analítica amplamente aplicada para a
caracterização química e físico-química de compostos sólidos, por ser um método
não-destrutivo e necessita de uma mínima preparação da amostra. Além disso, ao
contrário da espectroscopia no infravermelho, esta não é afetada pela presença de
água. Espectros Raman são métodos altamente específicos, servindo como
impressões digitais de moléculas (LÁNG et al., 2013). A espectroscopia de Raman
foi realizada para complementar as informações estruturais do AMB. O espectro
Raman apresentado na Figura 5 demonstra as principais bandas características em
1700 - 1500 cm-1, referentes ao anel aromático e vibrações COOH, respectivamente.
Em 1400 cm-1 é apresentada a vibração relacionada à CH3CH2, o sinal de dupla
ligação é demonstrado em 1300 cm-1 (VANDENABEELE et al., 2000).
Figura 5 – Espectro Raman do ácido mirsinóico B (AMB).
CH3CH2
C=C
COOH
83
6.2.3 Espectrometria de massas com unidade de entrada direta de amostra
(DI-MS)
Os espectros de massas dos compostos MAA e MAB nunca foram mostrados
anteriormente na literatura. A inserção direta do MAA no espectrômetro de massas
resultou no espectro representado na Figura 6a, no qual é possível observar a
presença do íon molecular em m/z 342, o pico base em m/z 123 que é referente ao
fragmento gerado pela quebra entre os carbonos C1’ e C2’ (C9H5).
No espectro de massas referente ao AMB (Figura 6b), também se observa a
presença do íon molecular em m/z 358. O pico base em m/z 69 é referente ao
fragmento gerado pela quebra entre os carbonos C1’’ e C7 do anel aromático (C5H9).
84
Figura 6 – Espectros de massas do AMA (a) e AMB (b), obtidos por de entrada direta de amostra na fonte de íons, com ionização por impacto de elétrons (EI) a 70 eV, e seus respectivos fragmentos gerados em maior proporção.
6.2.4 Solubilidade
A escolha dos solventes (água, metanol e acetonitrila), nos quais a
solubilidade dos marcadores foi avaliada, se deu em função das aplicações
analíticas dos mesmos.
O AMA foi muito pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (0,1 a 1 mg/mL).
O AMB foi pouco solúvel em metanol e em acetonitrila (1 a 10 mg/mL). Ambos foram
praticamente insolúveis em água (< 0,50 mg/mL). Os marcadores em estudo
85
possuem em suas estruturas o grupamento ácido carboxílico, que é capaz de formar
ligações de hidrogênio, mas a presença de uma cadeia de hidrocarbonetos longa
resulta em uma maior solubilidade destes compostos em solventes menos polares
(MARTINS; LOPES; ANDRADE, 2013).
6.2.5 Coeficiente de partição (log P)
O log P é uma constante definida como a proporção de equilíbrio de
concentração de um composto químico dissolvido em um sistema bifásico imiscível
composto de água e octanol. O log P 0 é referente a um composto que é igualmente
solúvel em um meio orgânico e em um meio aquoso. O log P de 1 indica solubilidade
do composto a uma proporção de 10:1 na fase orgânica:fase aquosa. A proporção
de solubilidade do valor de log P de -1 é 1:10 na fase orgânica:fase aquosa.
Consequentemente compostos químicos com valores de log P negativos são mais
solúveis em meios aquosos que em solventes orgânicos e estarão particionados na
fase aquosa ao invés da fase lipofílica. Em contrapartida, compostos químicos com
log P positivo irão migrar do veículo aquoso para o octanol (KORINTH et al., 2012).
O coeficiente de partição dos compostos AMA e AMB foi determinado de
acordo com o método empregando CLAE de fase reversa, conforme descrito no item
4.2.2.3. Foram injetados separadamente, substâncias com coeficientes de partição
conhecidos, cujos fatores de capacidade (k) calculados estão apresentados na
Tabela 1.
Tabela 1 – Coeficientes de partição (log P) dos compostos analisados e seus respectivos fatores de capacidade (k) calculados.
k log k log P*
Álcool benzílico 0,3610 -0,442 1,1
Fenol 0,3554 -0,449 1,5
Ácido benzóico 0,5523 -0,258 1,9
Benzeno 1,2876 0,110 2,1
Tolueno 2,1205 0,326 2,7
Naftaleno 2,8072 0,448 3,6
*OECD (2004).
86
Os valores de log dos fatores de capacidade (k) foram correlacionados com
os valores dos coeficientes de partição calculados (Figura 7) e submetidos à análise
de regressão linear, gerando a equação da reta y = 2,1311x + 2,2442, onde y
corresponde ao log P e x ao log k. O coeficiente de determinação encontrado foi de
(r²) de 0,8776.
Figura 7 – Correlação entre log P e log k determinados pelo método isocrático para os
compostos referência da Tabela 1.
Para o cálculo do coeficiente de partição octanol/água dos ácidos mirsinóicos
A e B, soluções de 50 g/mL de cada padrão foram analisadas nas mesmas
condições cromatográficas e os valores de k obtidos foram inseridos na regressão
linear. Os valores de log P calculados para os ácidos mirsinóicos A e B, estão
apresentados na Tabela 2, sendo o AMA levemente mais lipofílico do que o AMB
Tabela 2 – Fatores de capacidade (k) obtidos experimentalmente dos ácidos mirsinóicos A e B e seus respectivos coeficientes de partição (log P) calculados.
k log k log P
AMA 3,3091 0,520 3,30
AMB 3,0453 0,485 3,22
A lipofilicidade é um importante parâmetro monitorado por indústrias
farmacêuticas na pesquisa de novos fármacos, uma vez que pode influenciar a
absorção intestinal, o transporte por efluxo, biodisponibilidade, biotransformação por
enzimas do citocromo P450 e eliminação da substância no organismo (MARTEL et
al., 2013). De acordo com a “Regra dos 5 de Lipinski”, uma baixa permeação ou
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
-0,5 -0,3 -0,1 0,1 0,3 0,5
log
P
log k
87
absorção é mais plausível quando na molécula da substância de interesse o número
de doadores de ligação de hidrogênio é maior que 5, aceptores de ligação
hidrogênio maior que 10, peso molecular superior a 500 e log P maior que 5
(LIPINSKI et al., 2012). Os ácidos mirsinóicos A e B não violam nenhuma das regras
de Lipinski, mostrando-se favoráveis à farmacocinética no corpo humano, o que faz
deles substâncias ativas quando administradas via oral.
Substâncias com log P positivo possuem maior afinidade e tendem a migrar
para uma fase mais lipofílica, e quando aplicados na pele, para o estrato córneo.
Isso colabora para o aumento na penetração cutânea de certos compostos em
aplicações de formulações mais aquosas (KORINTH et al., 2012). Estudos prévios
sugerem que o máximo de absorção percutânea ocorre quando o log P está entre 2
e 3. Os resultados de log P encontrados para o AMA e AMB, foram de 3,30 e 3,2,
respectivamente, que junto às demais características moleculares, sugerem uma
boa absorção e permeabilidade pela via cutânea. Os log P encontrados foram
semelhantes ao de fármacos anti-inflamatórios não esteroidais como diclofenaco,
ibuprofeno, indometacina e naproxeno, os quais demonstram absorção cutânea
significativa (HADGRAFT; PLESSIS; GOOSEN, 2000).
Considerando a aplicação dos marcadores isolados de R. ferruginea e o
extrato dos frutos da espécie no sistema nervoso central (SNC) (COSTA, 2011),
pode-se correlacionar a lipofilicidade, como um dos fatores mais importantes para a
penetração neste órgão. Dentre os fármacos com ação no SNC empregados para o
tratamento da doença de Alzheimer em estágio leve a moderado está o donepezil,
com log P de 3,08 – 4,11, além da memantina que é utilizada principalmente em
estágios mais avançados e apresenta log P de 3,28, ambos com valores
semelhantes aos encontrados para o AMA e AMB (SONKUSARE; RAMARAO, 2005;
SOZIO et al., 2012).
Para diversos casos de substâncias ativas no SNC, é relatado que a
penetração na barreira hematoencefálica ótima ocorre quando os valores de log P
estão na faixa de 1,5 a 2,7, com um valor médio de 2,1. Entretanto, alguns
medicamentos como os antipsicóticos são consideravelmente mais hidrofóbicos
(média de log P de 4,10) do que antidepressivos (média de log P 3,10) ou hipnóticos
(média de log P 2,20). Surpreendentemente, os anti-inflamatórios são muito
semelhantes aos fármacos antidepressivos no seu perfil de propriedades físico-
químicas (GHOSE et al., 1999; PAJOUHESH; LENZ, 2005).
88
Em alguns casos, moléculas altamente lipofílicas ao invés de serem mais
permeáveis nas membranas ficam retidas na porção lipídica das mesmas, afetando
outros parâmetros farmacocinéticos. O aumento da lipofilicidade também tende a
aumentar a taxa do de metabolização pelos citocromos P450 e outras enzimas, e
nestes casos, para aumentar a biodisponibilidade, os efeitos do metabolismo de
primeira passagem devem ser balanceados (MISRA et al., 2003).
6.2.6 Constante de ionização (pKa)
A constante de ionização (pKa) de um composto é utilizada para calcular o
estado elétrico da molécula a um pH específico. Esta é uma propriedade muito
importante, uma vez que o estado de carga afeta dramaticamente a lipofilicidade e
comportamento farmacocinético (AVDEEF; TESTA, 2002).
Atualmente, existem vários softwares comerciais capazes de estimar valores
de pKa de qualquer estrutura química, utilizando uma variedade de algoritmos de
previsão em combinação com redes neurais artificiais. Entretanto, deve-se
reconhecer que os dados de pKa previstos in silico devem ser aplicados apenas
como estimativas aproximadas da extensão necessária para explicar dados
farmacocinéticos ou de biodisponibilidade, uma vez que os erros da determinação
são próximos de erros experimentais. A predição de pKa é satisfatória quando
utilizada em programas de descoberta de fármacos. Inversamente, se os valores são
necessários para utilização em conjunto com dados físico-químicos mais precisos,
os valores de pKa mal definidos podem resultar na má interpretação destes dados
(ADVEEF, 2012; BRITTAIN; PRANKERD, 2007).
Os valores de pKa foram calculados para o AMA e AMB no presente estudo
com o intuito de colaborar com a interpretação de ensaios farmacológicos gerados
pelo grupo de pesquisa. Também foram estimados com o objetivo de prever
possíveis características biofarmacêuticas para direcionar experimentos futuros. O
AMA apresentou pKa de 4,5 e o AMB de 4,8.
A proporção de compostos não-ionizáveis e ionizáveis com propriedades
semelhantes a fámacos (drug-like) não é bem conhecido, bem como não se tem
conhecimento sobre a relação do pKa com aspectos farmacológicos específicos.
Com o objetivo de adicionar informação em bases de dados para triagem de
substâncias biologicamente ativas, Manallack (2007) avaliou comparativamente o
89
pKa de 582 fármacos já documentados na literatura, classificados como substâncias
ativas e não ativas no sistema nervoso central (SNC). Através da análise de
distribuição de pKa de compostos que apresentam um único grupamento ácido,
assim como o AMA e o AMB, foi observado um comportamento bimodal para
fármacos não ativos no SNC, com predominância de valores entre 1,5-6,5. Para
compostos ácidos ativos no SNC observa-se um maior número de moléculas com
pKa em torno de 8, referente a barbituratos. Isso é justificado, pois em pH fisiológico,
ácidos com valores de pKa inferiores a 4 se apresentam em suas formas ionizadas,
as quais não atravessam facilmente a barreira hematoencefálica (MANALLACK,
2007).
Quando administrados via oral, o pH dos fluidos gastrointestinais constitui
uma das mais importantes influências sobre a solubilidade de saturação de fármacos
ionizáveis. Para ácidos fracos pouco solúveis, como o ibuprofeno (pKa = 4,5) à
medida que aumenta valor do pH, a solubilidade aumenta devido à contribuição da
forma ionizada, sendo assim mais facilmente absorvidos no intestino delgado, onde
o pH encontra-se geralmente entre pH 5 e 6,5 (HÖRTER; DRESSMAN, 2001;
TSUME et al., 2012).
A via dérmica é um tipo de administração também influenciada pela ionização
de compostos. Permeação de um produto químico através do estrato córneo é
basicamente um processo de difusão, pelo qual espécies ionizadas não penetram
muito bem (KIELHORN; MELCHING-KOLLMU; MANGELSDORF, 2006). Entretanto,
mecanismos de pareamento iônico são relatados, como fator que propicia a
penetração de espécies químicas ionizadas no estrato córneo principalmente em pH
no qual a ionização é elevada (HADGRAFT; VALENTA, 2000).
O planejamento e desenvolvimento de uma determinada forma farmacêutica
requer uma compreensão completa das características físicas, químicas e biológicas
da substância ativa. Para que a atividade farmacológica desejada seja atingida,
devem ser consideradas as características de solubilidade, coeficiente de partição,
contante de ionização, forma física e estabilidade do fármaco (ALLEN; POPOVICH;
ANSEL, 2011).
O pH da formulação, geralmente é ajustado para alcançar um determinado
grau de ionização do fármaco, visando melhorias em sua solubilidade, estabilidade e
farmacocinética (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2011; MAHATO; NARANG, 2012). As
substâncias ativas AMA e AMB, por serem ácidos fracos, podem ter seu grau de
90
ionização alterado por influência do pH do meio em que se encontram. Desta forma,
devido ao conhecimento sobre a variação de pH dos fluidos corporais (estômago, pH
1; lúmen do intestino, pH 6,6; plasma sanguíneo, pH 7,4), pode-se direcionar tipo de
forma farmacêutica e a vias favoráveis para administração destes compostos.
Outro fator que representa um desafio para o desenvolvimento de
formulações é a solubilidade de fármacos. Para qualquer via de administração, o
fármaco deve possuir alguma solubilidade aquosa para que ocorra absorção
sistêmica e resposta terapêutica (ALLEN; POPOVICH; ANSEL, 2011; MAHATO;
NARANG, 2012). Para substâncias ativas com elevados Log P consideradas
altamente lipossolúveis, como o AMA e AMB, aprimoramentos na solubilidade em
meio aquoso podem ser obtidos. Algumas das abordagens rotineiramente
empregadas para aumentar a solubilidade de fármacos incluem dispersão sólida,
micronização e formação do sal, além destas, novas técnicas como nanotecnologia,
processamentos supercríticos e tecnologia criogênica podem permitir melhorias na
liberação de fármacos pouco solúveis (KAWABATA et al., 2011; KUMAR et al.,
2011).
6.2.7 Análise por termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial
(DSC).
A termogravimetria (TG) é uma técnica termoanalítica na qual a variação da
massa da amostra (perda ou ganho) é determinada em função da temperatura e/ou
tempo. Esta técnica permite conhecer as alterações que o aquecimento pode
provocar na massa de materiais, determinando sua estabilidade térmica, e também
acompanhando reações de desidratação, oxidação, combustão, decomposição,
entre outros (STORPIRTIS et al., 2009). A calorimetria exploratória diferencial, ou
DSC (Differential scanning calorimetry), é a técnica pela qual se mede a diferença de
energia fornecida à substância e a um material de referência, termicamente inerte,
em função da temperatura, enquanto a substância e a referência são submetidas a
uma programação controlada de temperatura (STORPIRTIS et al., 2009).
Os resultados da análise por termogravimetria e calorimetria exploratória
diferencial dos padrões AMA e AMB estão representados nas Figuras 8a e b.
De acordo com o termograma obtido para o AMA (Figura 8a), observa-se que
essa substância é termicamente estável entre 20 e 150°C. Em 160°C inicia-se um
91
processo de perda de massa mantido até 400°C, atingindo um patamar constante
até 450°C. A determinação do teor de umidade é observada a partir da perda de
massa que ocorre da temperatura ambiente (inicial) até 100°C. Para o AMA, o
resultado evidencia que este composto apresentou pouca umidade (1,42 ± 0,75 %).
A curva DSC para este composto (Figura 8a) mostrou um evento exotérmico em
272,1 ± 9,09 °C típico de processos térmicos associados à etapa de decomposição
térmica que ocorre simultânea e favoravelmente a liberação de calor. Para o AMA
não foi observado o pico referente à fusão da amostra, devido à sua forma física de
óleo, portanto, não foi possível determinar sua pureza por esta técnica.
No termograma obtido para o AMB, apresentado na Figura 8b, observa-se
que essa substância é termicamente estável entre 20 e 200°C, sendo que em 250°C
inicia-se um processo de perda de massa mantido até 350°C, atingindo um patamar
constante até 450°C. Para o AMB, o teor de umidade foi de 0,75 ± 0,01 %. A curva
DSC para este composto (Figura 8b) mostra um evento endotérmico em 123,6 ± 0,1
°C atribuído à fusão da amostra. O evento exotérmico em 298,6 ± 10,30 °C, assim
como para o AMA, corresponde à decomposição térmica da amostra. A pureza
determinada por DSC para o AMB foi de 100,74 ± 0,18%.
92
Figura 8 – Perfis da análise TG e de DSC do AMA (a) e do AMB (b). Condições de análise: N2 50 mL/min, taxa de aquecimento de 1º C/min, 5 mg amostra, aquecimento de 20-450ºC e
célula de alumina.
6.2.8 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
A microscopia eletrônica de varredura (MEV) permite aumentos de alta
resolução alcançando valores na ordem de 1 nm. A MEV possibilita análises
morfológicas e de identificação de elementos químicos de amostras sólidas,
conservando a profundidade de campo, sendo uma técnica compatível com a
observação de superfícies rugosas (DEDAVID; GOMES; MACHADO, 2007;
EGERTON, 2005).
a)
b)
93
A avaliação morfológica por MEV das partículas do AMB cristalizado a partir
de uma solução de hexano: acetato de etila (8:2), evaporado a temperatura
ambiente, permitiu a obtenção das micrografias apresentadas na Figura 9, com
aumentos de 105 (a), 500 (b) e 1000x (c). Nos maiores aumentos (b) e (c) observa-
se o AMB como um composto semicristalino, onde é possível notar a presença
cristais em um sistema aparentemente ortorrômbico. E também nota-se a presença
de algumas partículas sem forma definida, características de um composto amorfo.
Os cristais contêm arranjos ordenados de moléculas e átomos mantidos em
contato por interações não covalentes, constituindo uma cela unitária. Dentre as
celas unitárias, conhecidas como retículos de Bravais, as mais comumente
encontradas entre fármacos estão a triclínica, monoclínica e ortorrômbica. Todas
apresentam três lados com comprimentos diferentes, mas os ângulos entre os lados
diferem (FLORENCE; ATTWOOD, 2006). No sistema ortorrômbico encontrado para
o AMB os ângulos entre os três lados da estrutura são de 90º, como se observa na
Figura 9c.
94
Figura 9 – Fotomicrografia eletrônica de varredura do ácido mirsinóico B. Aumentos de 105x (a), 500x (b) e 1000x (c).
a)
b)
c)
As propriedades físicas, no estado sólido, de fármacos e excipientes
farmacêuticos são de interesse, pois podem afetar tanto a formulação do produto
quanto o comportamento biológico da forma final (FLORENCE; ATTWOOD, 2006).
Compostos podem cristalizar-se sob diferentes hábitos, formando diferentes
polimorfos que podem apresentar empacotamento distinto no retículo cristalino, ou
diferenças na sua orientação e conformação em diferentes sítios do retículo. Os
polimorfos apresentam características físico-químicas diferenciadas, como por
exemplo, propriedades elétricas e ópticas, dureza, ponto de fusão, pressão de
vapor, solubilidade, densidade, grau de higroscopicidade, reatividade no estado
95
sólido, estabilidade física, estabilidade química e comportamento térmico (ARAUJO
et al., 2012; FLORENCE; ATTWOOD, 2006).
A mais importante consequência do polimorfismo na área farmacêutica
envolve sua influência na biodisponibilidade de fármacos, reflexo das alterações na
solubilidade, uma vez que a forma mais estável (menor energia livre) é menos
solúvel. Esta alteração ocorre quando existe dependência entre a velocidade de
dissolução in vivo e a velocidade de absorção afetando principalmente os
parâmetros de concentração plasmática máxima (Cmax) e o tempo necessário para
obtê-la (tmax). Na maioria dos casos as formas menos solúveis irão apresentar menor
velocidade de dissolução e, consequentemente, menor velocidade de absorção
(ARAUJO et al., 2012).
O conceito de solubilidade implica que o processo de dissolução alcançou um
estado de equilíbrio tal que a solução de tornou saturada. A solubilidade intrínseca
de uma substância depende particularmente do estado sólido que está presente.
Uma vez que as energias do retículo das formas físicas (amorfa, polimorfa ou
solvatos) são responsáveis por diferenças de solubilidade e taxas de dissolução, a
maior diferença de solubilidade é observada entre materiais amorfos e cristalinos,
podendo chegar a centenas de vezes, enquanto entre diferentes polimorfos a
diferença de solubilidade é normalmente inferior a 10 vezes (HUANG; TONG, 2004).
Formas amorfas são termodinamicamente metastáveis, o que resulta do
desordenamento da sua estrutura interna a nível molecular. Em comparação com as
fases cristalinas ordenadas, formas amorfas têm melhor mobilidade molecular que
resulta num melhor perfil de dissolução e, portanto, uma melhor biodisponibilidade
oral (KRAYOCHVIL, 2011).
Além da solubilidade, outro fator fortemente influenciado pelas características
do fármaco em estado sólido é a estabilidade química. Para a maior parte das
reações farmacêuticas de degradação, devido à importância da mobilidade
molecular, as taxas de reação são tipicamente maiores no estado líquido ou em
solução e menores no estado cristalino, com taxas de degradação intermediárias
para o estado amorfo. Por este motivo e pela facilidade de manuseio durante as
várias fases do desenvolvimento de produtos farmacêuticos, muitos dos fármacos
existentes encontram-se no estado sólido cristalino. A formação de sais também
pode impactar na estabilidade química de um composto, quando comparado a sua
forma não ionizada, decorrentes de diferentes pH microambientais e diferentes
96
arranjos moleculares em um retículo cristalino (HUANG; TONG, 2004;
VIPPAGUNTA; BRITTAIN; GRANT, 2001). O estado amorfo tem uma energia maior
do que o estado cristalino e, portanto, apresentam redução de estabilidade química
e física (prazos de validade mais curtos) e necessitam maior controle sobre a
produção e o armazenamento (por exemplo, atmosfera inerte). As formas amorfas
tendem a se transformar em cristalinas, processo este que é facilitado por sua
elevada higroscopicidade e a água absorvida atua como um plastificante
aumentando a mobilidade molecular. A transição entre as fases amorfa e cristalina
não é nítida e nesta fase, as chamadas fases semicristalinas aparecem
(KRAYOCHVIL, 2011).
Embora fármacos no estado amorfo possuam maior solubilidade e uma
dissolução mais rápida quando comparada à sua estrutura cristalina, este não é
fisicamente estável, sendo possível sua recristalização durante o período de vida útil
(ALVES et al., 2012). Desta forma, torna-se necessário um estudo cristalográfico
mais aprofundado para o AMB, a fim de estabelecer um melhor método de
cristalização adequado e reprodutível para esse composto. Além do
acompanhamento de sua estabilidade, para verificar possíveis conversões das
partículas amorfas em cristais.
6.2.9 Difração de raios X
Durante as várias fases do desenvolvimento de medicamentos, um aspecto
muito importante a ser controlado é a forma cristalina do fármaco, uma vez que
qualquer mudança de fase devido à presença de polimorfos, solvatos, ou mudanças
no grau de cristalinidade pode alterar a sua biodisponibilidade (VIPPAGUNTA;
BRITTAIN; GRANT, 2001).
O método primário para demonstração da existência de polimorfos de
fármacos, ou espécies solvatadas é a difração de raios X de pós (XRD). A técnica é
baseada na lei de Bragg que descreve a difração de um feixe monocromático de
raios X colidindo em um plano de átomos (BRITTAIN, 1995).
Na maioria dos casos, uma amostra em pó irá apresentar todas as faces
cristalinas possíveis em uma determinada interface, e a difração desta superfície irá,
portanto, fornecer informações de todos os espaçamentos atômicos possíveis (do
arranjo cristalino). A configuração do pó consiste de uma série de picos detectados
97
em vários ângulos de espalhamento. Estes ângulos, e suas intensidades relativas,
são correlacionados com os espaçamentos d, que são a distância entre as camadas
atômicas de um cristal e fornecem uma caracterização cristalográfica completa da
amostra em pó. (BRITTAIN, 1995).
Para verificar a configuração de um pó, uma amostra orientada
randomicamente é preparada de uma forma que exponha todos os planos da
amostra. O ângulo de espalhamento é determinado por uma rotação lenta da
amostra e medindo o ângulo de raios X desviados respectivo ao ângulo do feixe de
luz incidido. Alternativamente, o ângulo entre a amostra e a fonte pode ser mantido
fixo enquanto o detector é movido para determinar o ângulo da radiação espalhada.
Conhecendo o comprimento de onda do feixe de luz incidente, o espalhamento entre
os planos é calculado usando a lei de Bragg (BRITTAIN, 1995).
A configuração de difração de raios X relacionada ao AMB está demonstrada
na Figura 10. De acordo com o difratograma é possível observar um comportamento
semicristalino para a amostra, com uma reflexão evidente a 5,2°, em baixos ângulos
2θ. Estes resultados, unidos aos dados DSC e MEV, indicam que o AMB apresenta
uma estrutura semicristalina.
Figura 10 – Espectro de difração de raios X do ácido mirsinóico B (AMB)
Cristais são compostos por átomos intermitentemente dispostos em um
espaço tridimensional, desta forma, os raios X incididos serão espalhados somente
98
em determinadas direções, gerando os picos de alta intensidade em ângulos
específicos. Em contrapartida, nos materiais amorfos os átomos estão distribuídos
aleatoriamente e, portanto, os raios X são espalhados em várias direções se
distribuindo em uma ampla faixa (2), resultando em fracas reflexões características
de materiais não cristalinos nos difratogramas (CULLITY, 1978; PALERMO;
ANDERSON; DRENNEN, 2012).
6.2.10 Determinação de potência dos padrões e análise por UV/Vis
Os compostos isolados foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) utilizando a metodologia desenvolvida e validada no presente
estudo (Itens 5.3 e 5.4). Os cromatogramas foram analisados em 260 nm para o
AMA e em 270 nm para o AMB.
As purezas dos padrões de AMA e AMB foram determinadas injetando uma
solução a 50 g/mL de cada composto diluído em metanol. Através da relação de
área entre os picos dos marcadores, que apresentaram tempos de retenção (Tr) de
16,135 ± 0,004 e 15,693 ± 0,006 minutos, respectivamente, e a soma das áreas dos
demais picos, calculou-se a pureza em porcentagem. O AMA isolado apresentou
uma pureza de 76,20% e o AMB de 98,90%, considerado altamente puro, cujo
resultado foi confirmado pela análise por DSC (100,74 ± 0,18%).
Os perfis de absorção no UV dos compostos analisados, adquiridos através
do detector por arranjo de fotodiodos, estão representados na Figura 11a e b. Os
perfis são semelhantes devido aos compostos pertencerem à mesma classe de
fitoconstituintes, entretanto, o máximo de absorção observado para o AMA é de 259
nm e para o AMB de 269 nm.
99
Figura 11 – Perfis no UV do ácido mirsinóico A (a) e do ácido mirsinóico (b), obtidos através de análise por CLAE-DAD.
a)
b)
O AMA a 260 nm apresentou uma absortividade específica de 287,2 e o AMB
a 270 nm de 229,0.
6.3 Desenvolvimento das metodologias analíticas por CLAE
O desenvolvimento da metodologia analítica foi baseado inicialmente no
trabalho desenvolvido por Baccarin e colaboradores (2011). Entretanto, como este
se tratava que um método isocrático que não separou de forma eficiente todos os
componentes presentes nos extratos de Rapanea ferruginea, optou-se por utilizar
um método gradiente. A amostra empregada para os testes iniciais de
desenvolvimento de método, foi extrato etanólico 90°GL das cascas de R.
ferruginea, por esta parte da planta apresentar os compostos AMA, AMB e AMC,
conforme estabelecido em estudos anteriores (BACCARIN et al., 2011).
Considerando as características da amostra analisada, que consiste de uma
porção polar e outra apolar de fitoconstituintes, testou-se inicialmente o método
estabelecido por Fucina e colaboradores (2012), cujo gradiente encontra-se descrito
no Quadro 7, a fase estacionária empregada foi uma coluna de fase reversa
Phenomenex® C18 (150 x 4,6 mm x 3 m), utilizando como fases móveis acetonitrila
(ACN) e água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0, o fluxo utilizado foi de 0,7
mL/minuto.
100
Quadro 7 – Gradiente 1 para análise por CLAE.
Tempo (min.)
Acetonitrila (%)
*H20 (%)
0 15 85
5 20 80
8 22 78
12 25 75
20 30 70
22 60 40
25 90 10
40 90 10
43 15 85
50 15 85 *Água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0
Após a injeção da solução extrativa das cascas de R. ferruginea diluída 1:10
em metanol, obteve-se como resultado o cromatograma apresentado na Figura 12, o
qual possui um tempo prolongado de análise, onde eluem substâncias bastante
polares e posteriormente substâncias que só eluem com cerca de 90% de
acetonitrila, com tempos de retenção de 33,05, 33,59 e 34,05 minutos.
Figura 12– Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X
4,6 mm X 3m), fluxo 0,7 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no Quadro 6; 270
nm; volume de injeção 20 L.
Na tentativa de reduzir o tempo de análise e melhorar a separação dos
fitoconstituintes, foi utilizado o método gradiente apresentado no Quadro 8, com
fluxo de 1 mL/min.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min
0
50
100
150
200
250
300
350
400
mAU270nm4nm (1.00)
101
Quadro 8 - Gradiente 2 para análise por CLAE.
Tempo (min.)
Acetonitrila (%)
*H20 (%)
0 5 95
2 7 93
5 10 90
10 30 70
15 60 40
17 80 20
20 85 15
25 90 10
27 93 7
30 95 5
40 5 95
45 5 95 *Água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0
Na Figura 13 está apresentado o cromatograma obtido, no qual se observou
uma redução no tempo de análise, com picos em 26,38 (1) e 27,26 (2) minutos.
Sendo que o pico em aproximadamente 26 minutos apresentou um ombro,
indicando a co-eluição de compostos.
Figura 13 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:10 em metanol. Condições de análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X
4,6 mm X 3m), fluxo 0,7 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no Quadro 7; 270
nm; volume de injeção 20 L.
Avaliando a ordem de eluição e o perfil de absorção no UV dos picos
majoritários identificados (Figura 13) e comparando com os perfis encontrados por
Baccarin e colaboradores (2010), sugere-se que sejam referentes aos ácidos
mirsinóicos B (1), C e A (2).
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
0
25
50
75
100
125
150
mAU270nm4nm (1.00)
1
2
102
Em um próximo teste, injetou-se o mesmo extrato das cascas de R.
ferruginea, agora diluído em metanol na proporção 1:5. E foi adicionado metanol na
fase móvel com o objetivo de melhorar a separação dos compostos de interesse,
identificados pelos perfis de absorção no UV. O fluxo utilizado foi de 0,7 mL/min com
gradiente apresentado no Quadro 9.
Quadro 9 - Gradiente 3 para análise por CLAE.
Tempo (min.)
Acetonitrila (%)
*H20 (%)
Metanol (%)
0 5 80 15
2 7 78 15
5 10 75 15
10 30 55 15
15 60 25 15
17 80 5 15
20 84 1 15
25 84 1 15
27 85 0 15
30 85 0 15
40 5 80 15
45 5 80 15 *Água acidificada com ácido fosfórico a pH 3,0
Como resultado obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 14. Nestas
condições de análise, a separação do pico que apresentou um indício de co-eluição
foi mais eficiente, podendo-se identificar três picos com tempos de retenção de 24,9,
25,08 e 25,22 minutos, porém com baixa resolução.
103
Figura 14 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de análise: coluna Phenomenex® C18 (150 X
4,6 mm X 3m), fluxo 0,7 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 3,00; método gradiente apresentado no Quadro 8;
270 nm; volume de injeção 20 L.
Como não foi possível obter uma separação adequada dos compostos e a
análise estava com um tempo prolongado, testou-se uma coluna cromatográfica
Kinetex ® C18 150 x 4,6 mm, com partículas core-shell com tamanho de 2,6 µm. A
fase móvel testada foi composta de acetonitrila, metanol e água acidificada com
ácido fosfórico pH 2,50 com o gradiente apresentado no Quadro 10 com o fluxo de
0,9 mL/min.
Quadro 10 - Condições cromatográficas para análise por CLAE.
Tempo (min.)
Acetonitrila (%)
*H20 (%)
Metanol (%)
0 5 70 25
2 5 70 25
5 30 45 25
10 60 15 25
12 70 10 20
15 75 10 15
20 84 1 15
25 5 70 25
30 5 70 25
Como resultado obteve-se o cromatograma apresentado na Figura 15, aonde é
possível observar uma melhora na separação dos compostos 1, 2 e 3 com tempos
de retenção de 15,693, 15,832 e 16,134 minutos, respectivamente.
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 min
0
50
100
150
200
mAU270nm4nm (1.00)
104
Figura 15 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm
X 2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,5; método gradiente apresentado no Quadro 9; 270 nm; volume de injeção 20 µL.
Com a adequação da metodologia, foi realizada a análise por CLAE dos
padrões AMA e AMB, injetados na concentração de 50 g/mL. Os cromatogramas
obtidos estão apresentados na
Figura 16, onde observa-se que o AMA (a) é detectado com tempo de
retenção de 16,22 minutos, confirmando sua presença no extrato das cascas de R.
ferruginea, bem como a do AMB, cujo padrão analisado (b) foi detectado com tempo
de retenção de 15,79 minutos.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
mAU270nm4nm (1.00)
105
Figura 16 – Perfis cromatográficos por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B (b).
Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método gradiente apresentado no Quadro 9; 260 nm para o AMA e 270 nm para o
AMB; volume de injeção 20 L.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
0
100
200
300
400
mAU260nm4nm (1.00)
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
0
250
500
750
1000
mAU270nm4nm (1.00)
a)
b)
106
Utilizando a metodologia desenvolvida foi analisado o extrato etanólico 90°GL
dos frutos maduros de R. ferruginea diluído na proporção 1:5 em metanol. O
cromatograma analisado em 260 nm (Figura 17) apresentou dois picos intensos em
16,12 (3) e 17,16 (4) minutos.
Figura 17 – Perfil cromatográfico por CLAE do extrato etanólico 90°GL dos frutos maduros de R. ferruginea diluído 1:5 em metanol. Condições de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X
4,6 mm X 2,6m), fluxo 0,9 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50; método gradiente apresentado no Quadro 9;
260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB; volume de injeção 20 L.
Através da análise comparativa dos tempos de retenção e perfis no UV
(Figura 18) dos compostos identificados nos frutos de R. ferruginea, observa-se que
o pico 3, em 16,12 minutos é referente ao AMA. O pico 4, com tempo de retenção de
17,16 minutos apresentou um perfil de absorção no UV diferente ao dos derivados
de ácidos benzóicos encontrados na literatura. Neste sentido, conhecendo a
composição dos frutos de R. ferruginea, composto majoritariamente pelo AMA e um
triglicerídeo que foi isolado por pesquisadores da UNIVALI (GAZONI, 2009; COSTA,
2010), foi realizada uma investigação na literatura para confirmar a possibilidade de
detecção de triglicerídeos no UV.
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 min
0
100
200
300
400
mAU260nm,4nm (1.00)
16.1
18/1
410165
3
4
107
Figura 18 – Perfis de absorção no UV dos picos majoritários (picos 3 e 4 da Figura 17) no extrato etanólico 90°GL dos frutos de R. ferruginea.
3
4
De acordo com o estudo publicado por Andrikopoulos e colaboradores (1991),
foi desenvolvida uma metodologia por CLAE utilizando como fase estacionária uma
Coluna C18 Nucleosil® (125 x 4 mm, tamanho de partícula de 5m) e a fase móvel
composta de Água + Ácido Fosfórico pH = 3,00, Acetonitrila/Metanol (7:3) e
isopropanol, utilizando um método gradiente e detecção no UV. A metodologia foi
adequada para a separação e análise dos óleos vegetais e seus aditivos, sendo que
os padrões de eluição e os perfis no UV dos triglicerídeos foram importantes indícios
sobre o estado dos óleos, seu grau de insaturação, e mudanças durante o
refinamento e ao aquecimento. Através da comparação dos perfis no UV dos
triglicerídeos, com o perfil do pico 4, encontrado no presente estudo, pode-se dizer
que são semelhantes.
Em outra publicação mais recente (ALLEN; OTT, 2012), foi feita uma
comparação entre duas colunas, uma C18 com partículas porosas Dionex (250 x 4,6
mm, 5 m) e outra C18 core-shell Kinetex XB (100 x 4,6 mm, 2,6 m) para monitorar
o progresso da reação de transesterificação para formação do biodiesel a partir do
óleo de amêndoas. Como resultado, observou-se que a utilização da coluna com
partículas core-shell ocasionou uma melhor separação dos ácidos graxos livres,
ésteres e triglicerídeos com tempo de análise reduzido, equivalente a 50% quando
comparado à coluna convencional. A fase móvel utilizada foi composta de Água,
Acetonitrila e Hexano: Isopropanol (4:5), com um gradiente de análise. Para a coluna
com partículas porosas o fluxo utilizado foi de 1,3 mL/min e para a coluna com
partículas core-shell foi de 1,0 mL/min. A detecção foi feita no UV a 210 nm.
108
Através da análise do extrato dos frutos maduros de R. ferruginea por RMN
¹³C e ¹H, confirmou-se a presença do AMA e do triglicerídeo no mesmo. O
isolamento do triglicerídeo está sendo conduzido, para que o método possa, no
futuro, ser validado também para este composto, que apresenta importante ação
farmacológica frente a doença de Alzheimer (COSTA, 2010).
Diante da eficiência da coluna utilizada foi também desenvolvido um método
isocrático com tempo de análise reduzido para quantificação dos ácidos mirsinóicos
A e B puros incorporados aos nanossistemas desenvolvidos pelo grupo de pesquisa.
As fases móveis utilizadas foram as mesmas do método gradiente estabelecido,
sendo composta por água acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: acetonitrila:
metanol. Foram testadas diferentes proporções do solvente, sendo que a que melhor
separou os compostos com menor tempo de análise foi a proporção 25:60:15,
utilizando um fluxo de 1 mL/min com um tempo total de análise de 10 minutos
(Figura 19). Os ácidos mirsinóicos A e B foram detectados em 5,30 e 4,29 ± 0,01
minutos respectivamente.
Figura 19 – Perfil cromatográfico por CLAE dos ácidos mirsinóicos A (a) e B (b). Condições
de análise: coluna Kinetex® C18 (150 X 4,6 mm X 2,6m), fluxo 1,0 mL/min, temperatura 35ºC; fase móvel: metanol, acetonitrila e água acidificada com ácido fosfórico pH 2,50
(15:60:25 V/V/V); 260 nm para o AMA e 270 nm para o AMB; volume de injeção 20 L.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
0
25
50
75
100
125
mAU260nm4nm (1.00)a)
b)
109
O número de pratos teóricos (N) caracteriza e eficiência de uma coluna
cromatográfica em separar componentes com fatores de separação semelhantes. N
aumenta em função de um melhor empacotamento, comprimento da coluna,
tamanho de partículas e condições ideais e fluxo de fase móvel (WAKSMUNDZKA-
HAJNOS; SHERMA, 2011). Para a maior parte das separações, 5000 pratos teóricos
são necessários (MEYER, 2010). Para o método isocrático desenvolvido os pratos
teóricos calculados foram de 7843 para o AMA e 7403 para o AMB.
6.4 Validação analítica
A validação analítica dos métodos gradiente e isocrático desenvolvidos para os
ácidos mirsinóicos A e B foi realizada conforme descrito no item 4.2.4.
6.4.1 Método gradiente
A especificidade do método gradiente foi demonstrada através da resolução e
pureza dos picos correspondentes aos ácidos mirsinóicos A e B. As resoluções dos
picos do AMA e AMB em relação ao AMC no extrato das cascas de R. ferruginea
foram de 2,98 e 1,39, respectivamente, nos frutos a resolução do pico do AMA em
relação ao do triglicerídeo foi de 10,16. A pureza dos picos do AMA e do AMB, para
o extrato das cascas de R. ferruginea, foram de 99,99% e 99,55%, respectivamente.
Já no extrato dos frutos a pureza do pico correspondente ao AMA foi de 99,99%.
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min
0
100
200
300
400
mAU270nm4nm (1.00)
110
Estes resultados indicam que em ambas amostras avaliadas não há co-eluição de
outros fitoconstituintes com os ácidos mirsinóicos A e B.
A linearidade do método gradiente foi verificada através das curvas analíticas
mostradas nas Figuras 20 e 21. A curva de calibração do AMA foi obtida pela análise
de regressão linear (Figura 20a) cuja equação da reta pode ser representada por y =
28082x - 1880 com o coeficiente de correlação (r) de 0,9997 e coeficiente de
determinação (r²) de 0,9994. Para determinação de significância da regressão foi
aplicado o teste F, em que o valor estatisticamente significativo da razão entre as
médias quadráticas residuais da regressão e dos resíduos (maior do que o valor
tabelado para F) indica a existência de uma relação linear entre as variáveis x e y
(PIMENTEL; BARROS-NETO, 1996). No caso do AMA, o Fcalculado (7705,79) foi muito
superior ao Fcrítico (3,64 x10-9), o que indica uma forte significância do modelo linear.
A análise do gráfico dos resíduos, apresentado na Figura 20b, demonstra uma
distribuição aleatória dos mesmos, com valores positivos e negativos em relação ao
eixo zero, estando assim, livre de tendências. O método foi linear para o AMA na
faixa de concentração de 1 – 100 g/mL.
Figura 20 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 28082x - 1880, referente ao AMA analisado pelo método gradiente.
111
Para o ácido mirsinóico B a curva de calibração obtida (Figura 21a) pode ser
representada pela equação y = 51940x + 6217,2, com coeficiente de correlação (r)
de 0,9998 e coeficiente de determinação de (r²) de 0,9996. Através da análise de
variância, foi confirmada a significância do modelo linear, uma vez que o Fcalculado
(11204,99) foi superior ao Fcrítico (1,43 x 10-9). Os resíduos distribuídos
aleatoriamente, conforme demonstrado no gráfico da Figura 21b, indicam que o
modelo está bem ajustado. O método foi linear para o AMB na faixa de concentração
de 1 – 100 g/mL.
Figura 21 - a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração em μg/mL), para o método gradiente; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
0 20 40 60 80 100
Áre
a (
mA
U)
Conc. (µg/mL)
-50000
-25000
0
25000
50000
0 20 40 60 80 100
Resíd
uo
s
Conc. (µg/mL)
a)
b)
112
o ajuste do modelo y = 51940x + 6217,2, referente ao AMB analisado pelo método gradiente.
A linearidade da solução extrativa das cascas de R. ferruginea também foi
analisada, e os ácidos mirsinóicos A e B foram analisados simultaneamente nas
faixas de concentração de 1- 90 e 1,5 – 100 µg/mL, respectivamente, cada um em 7
níveis. Para o AMA analisado no extrato a curva de calibração obtida (Figura 22a)
pode ser representada pela equação y = 28790x + 8845,8 com o coeficiente de
correlação (r) de 0,9999 e coeficiente de determinação (r²) de 0,9999. A curva de
calibração do AMB (Figura 22a), representada pela equação y = 55256x – 33330
com coeficiente de correlação (r) de 0,9998 e coeficiente de determinação (r²) de
0,9997. Para os dois marcadores o Fcalculado (76612,13 para o AMA e 15291,7 para o
AMB) foi superior ao Fcrítico (2,15 x 10-15 para o AMA e 6,56 x 10-10 para o AMB). Os
resíduos foram dispersos de maneira aleatória para ambos os marcadores avaliados
(Figura 22b e c), indicando a significância e a ausência de tendência no modelo
linear para o extrato analisado.
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 20 40 60 80 100
Áre
a (
mA
U)
Conc. (µg/mL)
-80000
-40000
0
40000
80000
0 20 40 60 80 100
Resíd
uo
s
Conc. (µg/mL)
a)
b)
113
Figura 22 – a) Curva de calibração da solução extrativa das cascas de R. ferruginea, representada pelos marcadores AMA (1) e AMB (2) (Área x concentração em μg/mL), para o método gradiente; Gráficos dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para o ajuste do modelo y = 28790x + 8845,8, referente ao AMA (b) e para o ajuste do modelo y = 55256x
– 33330, referente ao AMB (c) na solução extrativa das cascas de R. ferruginea.
Para o AMA e para o AMB os valores de coeficiente de correlação
encontrados foram próximos de 1, indicando que os resultados de quantificação
obtidos foram diretamente proporcionais à concentração do analito no intervalo de
variação determinado. Os coeficientes de determinação (r²) indicaram que a
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 20 40 60 80 100
Áre
a (
mA
U)
Conc. (µg/mL)
1
-20000
-10000
0
10000
20000
0 20 40 60 80 100
Resíd
uo
s
Conc. (µg/mL)
-60000
-30000
0
30000
60000
0 20 40 60 80 100
Resíd
uo
s
Conc. (µg/mL)
a) 2
b)
c)
114
resposta das equações de reta para os cálculos de concentração dos marcadores no
método gradiente foram superiores a 99,9 % para o AMA e AMB.
A precisão para o método gradiente foi determinada através de seis
determinações de soluções das amostras contendo 100% da concentração do teste
dos ácidos mirsinóicos A e B (extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferrugínea
diluído 1:5 em metanol) nas mesmas condições e pelo mesmo analista. A
determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B nas cascas
de R. ferruginea no ensaio de repetibilidade, esta expressa na Tabela 3.
Tabela 3 – Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B, no extrato etanólico 90°GL das cascas de R. ferruginea na diluição 1:5 em metanol, no ensaio de repetibilidade do método analítico gradiente.
Réplicas Conc (g/mL)
AMB
Conc (g/mL)
AMA
1 54,66 31,17
2 54,58 31,06
3 54,46 30,99
4 54,13 30,77
5 54,2 30,98
6 54,22 30,92
Média 54,38 30,98
s 0,22 0,13
DPR (%) 0,41 0,43
s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.
De acordo com o preconizado pela Resolução nº 899, no ensaio de precisão
os valores de DPR não devem ser superiores a 5% (BRASIL, 2003). Visto que os
DPR obtidos para os marcadores foram inferiores a 1%, verificou-se que o método
gradiente foi preciso para determinação de AMA e AMB no extrato de R. ferruginea.
O limite de detecção do AMA foi de 0,05 µg/mL e do AMB 0,01 µg/mL, os
limites de quantificação determinados foram de 0,5 e 0,05 µg/mL para o AMA e
AMB, respectivamente.
A exatidão do método gradiente foi realizada através do ensaio de
recuperação. Nas Tabelas 4 e 5 estão apresentados os resultados obtidos para o
AMA e o AMB, respectivamente.
115
Tabela 4 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de exatidão para o método analítico gradiente.
Conc. AMA adicionado
(g/mL)
Conc. AMA recuperado
(g/mL) (DPR)
Recuperação (%)
26,45 26,37 (0,28) 99,70
52,90 50,68 (0,09) 95,80
78,03 78,17 (0,29) 100,18
Média ± DPR 98,56 ± 2,44
Tabela 5 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de exatidão para o método analítico gradiente.
Conc. AMB adicionado
(g/mL)
Conc. AMB recuperado
(g/mL) (DPR)
Recuperação (%)
26,66 26,35 (0,30) 98,84
53,33 50,38 (0,06) 94,47
79,99 77,87 (0,31) 97,35
Média ± DPR 96,89 ± 2,29
A exatidão representa o grau de concordância entre os resultados
encontrados em um ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro
(BRASIL, 2003). A exatidão é sempre considerada dentro de certos limites, que
podem ser estreitos em níveis de concentração elevados e mais amplos em níveis
de traços (RIBANI et al., 2004). No Brasil a ANVISA não determina o intervalo de
recuperação a ser atingido, mas conforme o manual da AOAC (1993) as
porcentagens de recuperação podem variar de 97 a 103%, para concentrações de 1
a 9%. Considerando que o método gradiente apresentou níveis de recuperação
próximos a 100% e os DPR foram inferiores a 2%, os mesmos apresentaram boa
exatidão para concentrações baixa, média e alta do AMA e AMB.
Os resultados do teste de robustez para o AMA e AMB nas soluções
extrativas das cascas de R. ferruginea estão apresentados nas Tabelas 6 e 7,
respectivamente.
Tabela 6 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método gradiente para análise do AMA na solução extrativa das cascas de R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5).
Parâmetros AMA nas cascas – Média (DPR %)
116
Tr (minutos) Área Teor (mg/g) Rs
pH da fase
aquosa
2,4 16,099 (0,06) 576424 (0,13) 12,49 (0,13) 3,07 (0,41)
2,5 16,226 (0,04) 578656 (0,23) 12,54 (0,23) 2,91 (0,40)
2,6 16,085 (0,04) 574543 (0,12) 12,45 (0,12) 3,12 (1,40)
DPR (%) 0,48 0,36 0,36 3,60
Fcalc/Fcrit 63,35 2,68 2,68 8,38
Temp. do
forno
34 ºC 16,114 (0,09) 571825 (0,18) 12,39 (0,18) 3,06 (0,19)
35 ºC 16,226 (0,04) 578656 (0,23) 12,54 (0,23) 2,91 (0,40)
36 ºC 16,064 (0,04) 572996 (0,17) 12,42 (0,18) 3,18 (0,18)
DPR (%) 0,52 0,64 0,65 4,43
Fcalc/Fcrit 41,19 6,07 6,07 160,11
Fluxo da
fase móvel
0,8 mL/min 17,098 (0,03) 583742 (0,53) 12,65 (0,54) 2,75 (0,21)
0,9 mL/min 16,226 (0,04) 578656 (0,23) 12,54 (0,23) 2,91 (0,40)
1,0 mL/min 15,380 (0,06) 566824 (0,32) 12,28 (0,33) 3,49 (0,44)
DPR (%) 5,29 1,5 1,53 12,76
Fcalc/Fcrit 9379,80 8,93 8,93 650,43
Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; Rs – resolução entre o pico relativo ao AMA e o AMC; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.
Tabela 7 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método gradiente para análise do AMB na solução extrativa das cascas de R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5).
Parâmetros AMB nas cascas – Média (DPR %)
117
Tr (minutos) Área Teor (mg/g) Resolução
pH da fase
aquosa
2,4 15,658 (0,06) 700666 (0,18) 8,25 (0,22) 1,37 (0,15)
2,5 15,786 (0,03) 704757 (0,20) 8,30 (0,23) 1,39 (0,42)
2,6 15,644 (0,04) 702472 (0,11) 8,27 (0,12) 1,40 (1,38)
DPR (%) 0,50 0,29 0,27 1,10
Fcalc/Fcrit 71,91 1,11 1,11 0,83
Temp.do
forno
34 ºC 15,673 (0,09) 703195 (0,09) 8,28 (0,11) 1,35 (0,43)
35 ºC 15,786 (0,03) 704757 (0,20) 8,30 (0,23) 1,39 (0,42)
36 ºC 15,620 (0,05) 711238 (0,21) 8,37 (0,22) 1,39 (0,42)
DPR (%) 0,52 0,21 0,56 1,70
Fcalc/Fcrit 46,35 4,86 4,86 6,48
Fluxo da fase
móvel
0,8 mL/min 16,645 (0,03) 708613 (0,96) 8,34 (0,98) 1,39 (0,42)
0,9 mL/min 15,786 (0,03) 704757 (0,20) 8,30 (0,23) 1,39 (0,42)
1,0 mL/min 14,950 (0,06) 663403 (0,37) 7,85 (0,03) 1,42 (0,41)
DPR (%) 5,37 3,62 3,34 1,24
Fcalc/Fcrit 9360,45 16,84 16,84 5,25
Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; Rs – resolução entre o pico relativo ao AMB e o AMC; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.
A robustez para o método gradiente foi estimada utilizando a média geral e o
DPR para cada variável. Tanto para o AMA, quanto para o AMB no extrato das
cascas, o Fcalculado foi superior ao Fcritico para tempo de retenção, área, teor e
resolução, indicando que para cada parâmetro variado nem todas as médias
aritméticas obtidas são iguais. O DPR calculado para tempo de retenção, área e teor
foi inferior a 5% para variações de pH de fase aquosa e temperatura do forno.
Quanto a variação de fluxo, o DPR foi superior a 5% para o tempo de retenção de
ambos os marcadores. Para o AMB, o aumento do fluxo resultou em um decréscimo
de tempo de retenção, área e teor com DPR > 3%, como observado na Tabela 7.
Desta forma, para obtenção de resultados consistentes de quantificação do AMB,
deve-se considerar um cuidadoso controle do fluxo de fase móvel. A resolução,
embora tenha sido alterada pelas variações dos parâmetros, permaneceu superior a
1,4.
Os resultados para o AMA nas soluções extrativas dos frutos de R. ferruginea
encontram-se Tabela 8.
118
Tabela 8 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método gradiente para análise do AMA na solução extrativa dos frutos de R. ferruginea de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (0,9 mL/min); temperatura do forno (35 ºC) e pH da fase aquosa (2,5).
Parâmetros AMA nos frutos – Média (DPR %)
Tr (minutos) Área Teor (mg/g) Rs
pH da fase
aquosa
2,4 16,116 (0,04) 3372613 (0,42) 80,09 (0,42) 10,11 (0,65)
2,5 16,234 (0,04) 3335657 (0,54) 79,21 (0,54) 9,99 (0,95)
2,6 16,071 (0,01) 3443144 (0,42) 81,77 (0,41) 9,89 (0,66)
DPR (%) 0,52 1,61 1,62 1,10
Fcalc/Fcrit 149,89 7,18 7,18 1,17
Temp. do
forno
34 ºC 16,124 (0,04) 3427112 (0,40) 81,38 (0,40) 9,98 (0,15)
35 ºC 16,234 (0,04) 3335657 (0,54) 79,21 (0,54) 9,99 (0,95)
36 ºC 16,049 (0,04) 3455230 (0,27) 82,05 (0,27) 9,97 (0,17)
DPR (%) 0,57 1,84 1,84 0,10
Fcalc/Fcrit 120,16 11,32 11,32 0,02
Fluxo da
fase móvel
0,8 mL/min 17,098 (0,02) 3333136 (0,87) 79,15 (0,87) 10,06 (1,37)
0,9 mL/min 16,234 (0,04) 3335657 (0,54) 79,21 (0,54) 9,99 (0,95)
1,0 mL/min 15,379 (0,02) 3318014 (0,15) 78,78 (0,15) 10,33 (1,13)
DPR (%) 5,29 0,29 0,29 1,77
Fcalc/Fcrit 19786,4 0,13 0,13 1,36
Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; Rs – resolução entre o pico relativo ao AMA e o triglicerídeo; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.
Para o AMA no extrato dos frutos de Rapanea ferrugínea, o Fcalculado foi
superior ao Fcritico para tempo de retenção, área, teor e resolução em todos os
parâmetros variados, exceto para a área quando foi variado o fluxo de fase móvel, o
que indica que não há diferença entre as médias obtidas. O DPR calculado foi
inferior a 2% para todos os parâmetros avaliados quanto ao tempo de retenção,
área, teor e resolução, exceto para o tempo de retenção referente à variação de
fluxo da fase móvel.
Considerando os baixos DPR das áreas e teor obtidos em diferentes
condições de análise, considera-se que método gradiente foi robusto para variações
de pH da fase aquosa, temperatura do forno e fluxo da fase móvel quando aplicado
para análise do AMA. Para análise do AMB, o método foi considerado robusto para
variações de pH da fase aquosa e temperatura do forno.
119
6.4.1.1 Estabilidade dos marcadores em solução
A estabilidade dos marcadores em solução foi avaliada em metanol e em
acetonitrila armazenadas a temperatura ambiente, geladeira e freezer, nos tempos
de 0, 4, 8, 24, 48 e 336 horas (14 dias). Os resultados de estabilidade obtidos foram
apresentados em forma de gráfico, relacionando os diferentes tempos de
armazenamento com a porcentagem remanescente dos marcadores expressa em
relação às áreas dos picos observadas no tempo zero de armazenamento.
Para as soluções de AMA e AMB em metanol, os resultados obtidos estão
apresentados na Figura 23. Através da análise das áreas do AMA e AMB nos
diferentes tempos de análise, observa-se que as mesmas permanecem inalteradas
até 336 horas (14 dias) em todos os ambientes em que as soluções foram
armazenadas. Os DPR das áreas obtidas nas diferentes condições de
armazenamento foram inferiores a 2%. Entre os ambientes em que as soluções dos
marcadores em metanol foram armazenadas não se observa diferença de áreas,
sendo que Fcal/Fcrit foi 0,02. A pureza dos picos para todas as condições de
armazenamento pelos diferentes tempos manteve-se em 99,99% e não foram
observadas diferenças entre os perfis cromatográficos obtidos.
Figura 23 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de metanol, armazenados a temperatura ambiente, geladeira e freezer.
Avaliando a estabilidade dos marcadores em acetonitrila, cujo resultado está
apresentado na Figura 24, nota-se que a solução de AMA permaneceu sem
alterações nas áreas até 48 h para todas as condições de armazenamento, e para
os 14 dias apenas permaneceram inalteradas apenas as amostras armazenadas em
0
20
40
60
80
100
120
0 8 16 24 32 40 48
% R
em
an
escen
te
Tempo (horas)
49 336
0
0
20
40
60
80
100
120
0 8 16 24 32 40 48
% R
em
an
escen
te
Tempo (horas)
49 336
0
332336
TA
Geladeira
Freezer
a) b)
120
geladeira e freezer (DPR inferiores a 2%). A solução de AMA em acetonitrila
armazenada na temperatura ambiente pelo período de 336 horas (14 dias)
apresentou uma redução significativa de área, de aproximadamente 90%, o que
sugere a degradação da amostra nestas condições. Não houve diferença entre os
perfis cromatográficos das amostras e a pureza dos picos para todas as condições e
tempo de armazenamento manteve-se em 99,99%, indicando que mesmo na
amostra degradada não houve a co-eluição de impurezas com o AMA.
As soluções do AMB em acetonitrila armazenadas em diferentes ambientes
permaneceram com áreas inalteradas até o período de 336 horas (14 dias) em
estudo (Figura 24b). Os DPR entre os diferentes dias de injeção permaneceram
inferiores a 5%. As áreas obtidas das soluções depositadas em temperatura
ambiente, geladeira e freezer foram consideradas estatisticamente iguais, uma vez
que o Fcal/Fcrit foi igual a 0,18. A pureza dos picos para todas as condições e tempo
de armazenamento manteve-se em 99,99%, bem como os perfis cromatográficos
permaneceram inalterados.
Figura 24 - Estabilidade temporal do AMA (a) e AMB (b) em solução de acetonitrila,
armazenados a temperatura ambiente, geladeira e freezer.
Através dos resultados obtidos pode-se afirmar que os ácidos mirsinóicos A
e B são estáveis em solução de metanol pelo período de 14 dias em que foram
avaliados. Em solução de acetonitrila, o AMB apresentou-se estável até 14 dias e o
AMA estável por pelo menos 48 horas, quando armazenado a temperatura
ambiente. Estas informações são relevantes para subsidiar o uso de tais substâncias
como referência na padronização de extratos de R. ferrugínea, durante o controle de
qualidade, bem como no desenvolvimento de formulações contendo os fitotármacos
ou o extrato padronizado.
0
20
40
60
80
100
120
0 8 16 24 32 40 48
% R
em
an
escen
te
Tempo (horas)
49 336
0
0
20
40
60
80
100
120
0 8 16 24 32 40 48
% R
em
an
escen
te
Tempo (horas)
49 336
0
332336
TA
Geladeira
Freezer
a) b)
121
6.4.2 Método isocrático
Como o método isocrático foi desenvolvido para avaliar apenas os padrões
puros, a especificidade foi determinada por meio da pureza dos picos, que foram de
99,99% para o AMA e 99,99% para o AMB.
Para o método isocrático a linearidade foi verificada através da curva analítica
do AMA demonstrada na Figura 25a. Através da análise de regressão linear,
calculou-se a equação da reta y = 21741x – 794,09, com coeficiente de correlação
(r) de 0,9999 com o coeficiente e coeficiente de determinação de (r²) de 0,9999. Para
validação do modelo e determinação da significância da curva foi realizada a análise
de variância, a partir da qual através do teste F, se constatou a forte relação linear
entre as variáveis x e y, uma vez que o Fcalculado (34152,7) foi superior ao Fcrítico (8,8
x10-11). A distribuição aleatória dos resíduos deixados pelo modelo, representados
graficamente na Figura 25b, indicam que não há tendência. O método foi linear para
o AMA na faixa de concentração de 1 – 100 g/mL.
Figura 25 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico A (Área x concentração em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para
o ajuste do modelo y = 21741x – 794,09, referente ao AMA analisado pelo método isocrático.
122
Na Figura 26a está representada graficamente a curva de calibração para o
AMB no método isocrático, cuja equação da reta pode ser representada por
y=43113x + 1853,4 com coeficiente de correlação (r) de 0,9999 com o coeficiente e
coeficiente de determinação de (r²) de 0,9999. Para esta curva, o valor de Fcalculado
(75493,95) foi superior ao Fcrítico (1,21 x10-11), também demonstrando uma elevada
significância linear. A inspeção dos resíduos não demonstra tendência na dispersão
dos mesmos (Figura 26b). O método foi linear para o AMB na faixa de concentração
de 1 – 100 g/mL.
Figura 26 – a) Curva de calibração do ácido mirsinóico B (Área x concentração em μg/mL), para o método isocrático; b) Gráfico dos resíduos em função da concentração (µg/mL) para
o ajuste do modelo y=43032,28x + 4572,324, referente ao AMB analisado pelo método isocrático.
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0 20 40 60 80 100
Áre
a (
mA
U)
Conc. (µg/mL)
-30000
-15000
0
15000
30000
0 20 40 60 80 100
Re
síd
uo
s
Conc. (µg/mL)
a)
b)
a)
123
O método isocrático apresentou um bom ajuste linear com coeficientes de
correlação próximos de 1 para o AMA e para o AMB. A resposta das equações de
reta para os cálculos de concentração foram superiores a 99,9 % para ambos os
marcadores.
A precisão do método isocrático foi avaliada através da análise de 6 réplicas
dos padrões AMA e AMB na concentração de 50 g/mL nas mesmas condições e
pelo mesmo analistas. Os resultados estão apresentados na Tabela 9.
Tabela 9 – Determinação da variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B na
concentração de 50 g/mL, no ensaio de repetibilidade do método analítico isocrático.
Réplicas Conc (g/mL)
AMB
Conc (g/mL)
AMA
1 50,07 50,53
0
1500000
3000000
4500000
6000000
0 25 50 75 100 125 150
Áre
a (
mA
U)
Conc. (µg/mL)
-30000
-10000
10000
30000
0 25 50 75 100 125 150
Resíd
uo
s
Conc. (µg/mL)
b)
124
2 50,47 50,43
3 49,19 49,71
4 50,78 48,43
5 50,66 49,02
6 50,09 48,24
Média 50,210 49,39
S 0,58 0,99
DPR (%) 1,15 1,99
Através dos resultados obtidos verificou-se que o método isocrático
apresentou-se preciso para análise dos ácidos mirsinóicos A e B puros, visto que os
coeficientes de variação foram inferiores a 2% (BRASIL, 2003).
Para o método isocrático o limite de detecção do AMA foi de 0,05 µg/mL e do
AMB 0,01 µg/mL, os limites de quantificação foram de 0,5 e 0,05 µg/mL para o AMA
e AMB, respectivamente.
A exatidão dos métodos gradiente e isocrático foi.
Para o método isocrático, os resultados da exatidão obtidos através do
ensaio de recuperação para o AMA, estão apresentados na Tabela 10, e para o
AMB, na Tabela 11.
Tabela 10 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMA no ensaio de exatidão para o método analítico isocrático.
Conc. AMA adicionado
(g/mL)
Conc. AMA recuperado
(g/mL) (DPR)
Recuperação (%)
25,52 25,24 (0,18) 98,92
51,04 50,20 (0,89) 98,35
76,56 75,02 (0,68) 97,99
Média ± DPR 98,42 ± 0,48
Tabela 11 – Resultado do ensaio de recuperação do padrão AMB no ensaio de exatidão para o método analítico isocrático.
Conc. AMB adicionado
(g/mL)
Conc. AMB recuperado
(g/mL) (DPR)
Recuperação (%)
23,81 23,70 (0,05) 99,53
47,63 47,34 (0,22) 99,39
125
71,44 70,52 (0,08) 98,71
Média ± DPR 99,21 ± 0,44
De acordo com a AOAC (1993) o método isocrático pode ser considerado
exato, uma vez que as porcentagens de recuperação obtidas para o AMA e AMB
estão dentro da faixa de 97 a 103% estabelecida como aceitável para concentrações
de 1 a 9%.
Os resultados de robustez do método isocrático, nos quais foram avaliados
área e tempo de retenção dos padrões AMA e AMB, estão apresentados nas
Tabelas 12 e 13 respectivamente.
Tabela 12 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método isocrático para
análise do AMA (50 g/mL) de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).
Parâmetros AMA – Média (DPR %)
Tr (minutos) Área
pH da fase aquosa 2,4 5,308 (0,23) 1112042 (1,16)
2,5 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)
126
2,6 5,303 (0,17) 1113717 (0,56)
DPR (%) 0,37 0,40
Fcalc/Fcrit 1,91 0,16
Temp. do forno
34 ºC 5,271 (0,53) 1122489,7 (0,44)
35 ºC 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)
36 ºC 5,214 (0,43) 1129691 (0,33)
DPR (%) 0,63 0,69
Fcalc/Fcrit 1,37 0,75
Fluxo da fase móvel
0,9 mL/min 5,879 (0,11) 1248788 (0,92)
1,0 mL/min 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)
1,1 mL/min 4,807 (0,55) 1055788 (0,05)
DPR (%) 10,11 8,59
Fcalc/Fcrit 592,73 122,61
Proporção da fase
móvel
24:61:15 4,876 (0,08) 1136309 (0,57)
25:60:15 5,272 (0,21) 1122011 (0,19)
26:59:15 5,695 (0,82) 1127919 (0,82)
DPR (%) 7,75 0,64
Fcalc/Fcrit 1425,01 0,68
Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.
Tabela 13 – Parâmetros cromatográficos avaliados na robustez do método isocrático para
análise do AMB (50 g/mL) de acordo com modificações no fluxo de fase móvel (1,0 mL/min); temperatura do forno (35 ºC); pH da fase aquosa (2,5); constituição da fase móvel H2O acidificada com ácido fosfórico pH 2,5: ACN: MeOH (25:60:15).
Parâmetros AMB – Média (DPR %)
Tr (minutos) Área
pH da fase aquosa
2,4 4,297 (0,26) 2052058 (0,92)
2,5 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)
2,6 4,296 (0,11) 2040959 (0,76)
127
DPR (%) 0,30 0,35
Fcalc/Fcrit 1,29 0,15
Temp. do forno
34 ºC 4,275 (0,49) 2041314 (0,61)
35 ºC 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)
36 ºC 4,237 (0,40) 2052125 (0,09)
DPR (%) 0,51 0,34
Fcalc/Fcrit 1,03 0,53
Fluxo da fase móvel
0,9 mL/min 4,748 (0,24) 2132708 (0,77)
1,0 mL/min 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)
1,1 mL/min 3,886 (0,04) 1901517 (0,48)
DPR (%) 10,04 6,18
Fcalc/Fcrit 1513,42 68,68
Proporção da fase
móvel
24:61:15 4,016 (0,07) 2052144 (0,93) 25:60:15 4,274 (0,22) 2054320 (0,03)
26:59:15 4,547 (0,15) 2054349 (0,02)
DPR (%) 6,21 0,06
Fcalc/Fcrit 882,30 0,01
Temp. – Temperatura; Tr – tempo de retenção; DPR = desvio padrão relativo. *Os resultados correspondem à média (DPR) de triplicata de injeção.
Nos resultados de robustez do método isocrático, os resultados para o AMA e
AMB foram semelhantes. Nos dois marcadores o Fcalculado foi superior ao Fcritico para
tempo de retenção em todos os parâmetros variados, e houve diferença entre as
médias das áreas, quando foi variado o fluxo da fase móvel. O DPR calculado para
os tempos de retenção foi inferior a 5% para variações de pH da fase móvel e
temperatura. Com relação as áreas, o DPR foi superior a 5% quando foi variado o
fluxo da fase móvel.
Desta forma, pode-se dizer que o método isocrático foi robusto para pH da
fase aquosa, temperatura do forno, e proporção de fase móvel uma vez que não
houve diferença entre as áreas do AMA e AMB, nas diferentes condições de análise.
6.5 Estudos de degradação forçada
O protocolo experimental para estudos de degradação de novas substâncias
e produtos idealmente, irão resultar em amostras que foram degradadas em
aproximadamente 10% ou foram expostos a uma quantidade de energia
que excede o fornecido as condições de armazenamento (REYNOLDS et al.,
2002).
128
A água utilizada como solvente, ou mesmo a umidade do ar em contato com
formas farmacêuticas é responsável pela degradação da maioria dos fármacos.
Reações hidrolíticas estão entre os processos mais comuns de degradação de
fármacos adicionadas à relação dependente de temperatura e umidade, sendo
frequentemente catalisadas por íons hidrogênio ou íons hidroxila. Normalmente as
drogas susceptíveis a quebra hidrolítica são aquelas derivadas de um ácido
carboxílico ou que contém grupos funcionais baseados nesta classe (FLORENCE;
ATWOOD, 2006; SINGH; REHMAN, 2012; WATERMAN; ADAMI, 2005).
Através da avaliação da labilidade do AMA frente à condição ácida ao qual foi
submetido (Tabela 14) observa-se um percentual de degradação significativo após
15 minutos de exposição ao HCl 1M, aumentando gradativamente com o decorrer do
tempo de exposição, chegando a degradação de 72,22% após 24 horas. Para o
AMB observa-se um comportamento diferente, no qual a degradação ocorre de
maneira significativa (43,44%) apenas após 24 horas de exposição, o que sugere
uma maior estabilidade deste composto em meio ácido.
Tabela 14 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M).
Marcador Tempo
exposição Tr (minutos) Área
Degradação (%)
0 16,025 2909531 0,00
15 min 16,032 2655376 8,74
AMA 30 min 16,027 2461431 15,40
60 min 16,022 2350557 19,21
240 min 16,029 2114281 27,33
129
24 horas 16,064 808138 72,22
0 15,581 5271326 0,00
15 min 15,585 5167367 1,97
30 min 15,576 5163306 2,05
AMB 60 min 15,582 5160320 2,11
240 min 15,583 5152814 2,25
24 horas 15,584 2981595 43,44
A taxa de hidrólise pode depender da concentração das espécies catalíticas,
e em alguns casos onde ocorrem altas conversões do fármaco, a taxa de reação
tende a diminuir devido à acumulação do produto (WATERMAN; ADAMI, 2005).
Analisando os perfis cromatográficos do AMA obtidos após os diferentes
tempos de exposição ao ambiente ácido, apresentados na Figura 27a, foi possível
observar a aparecimento de um pico denominado de impureza (I) com Tr de 12,4 ±
0,01 minutos após 24 horas de exposição em meio ácido. O pico referente a
impureza (II) (Tr 13,9 ± 0,01 minutos), pode ser detectado após 30 minutos de
exposição em meio ácido, aumentando sua intensidade até 24 horas. A impureza
(III) detectada no Tr de 14,8 ± 0,01 minutos, apareceu apenas após o máximo de
exposição ao estresse ácido, bem como a impureza (IV) com Tr de 15,12 ± 0,01
minutos. O pico com tempo de retenção de 15,3 ± 0,03 minutos, denominado
impureza (V) apesar de ser um contaminante conhecido no padrão do AMA, teve
sua intensidade aumentada significativamente após a degradação em meio ácido
por 24 horas, o que sugere que seja também um indicativo de degradação do
marcador.
Os perfis de absorção no UV referentes aos picos das impurezas detectadas
no cromatograma do AMA degradado (Figura 27b) mostraram-se semelhantes ao
perfil do marcador, sugerindo que os produtos de degradação possuem o mesmo
núcleo fundamental cromóforo do AMA.
Figura 27 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260 nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M), nos tempos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (I), (II), (III), (IV) e (V).
130
A análise comparativa dos perfis cromatográficos do AMB após estresse em
ambiente ácido por diferentes tempos está apresentada na Figura 28a. Foi possível
detectar uma maior quantidade de impurezas quando comparado ao AMA submetido
às mesmas condições de estresse. Observa-se com Tr de 11,16 ± 0,01 minutos o
aparecimento da impureza (I’) após 24 horas de exposição, bem como a impureza
(II’) com Tr 12,30 ± 0,01 minutos. Nos Tr de 13,21 ± 0,01e 14,5 ± 0,01 minutos, a
partir de 15 minutos de estresse ácido, embora não tenha degradado intensamente
o AMB, pode-se identificar a presença das impurezas (III’) e (V’), respectivamente,
que aumentaram gradativamente de área até as 24 horas de exposição. A impureza
(IV’) com Tr de 13,4 ± 0,01 minutos pode ser detectada a partir de 60 minutos de
degradação ácida, aumentando sua intensidade até 24 horas. Os picos com tempos
de retenção de 14,7 e 17,1 ± 0,01 minutos, atribuídos às impurezas (VI’) e (VII’)
respectivamente passaram a ter suas intensidades aumentadas após 60 minutos em
HCl 1M.
AMA
Branco
15 min
30 min
60 min
240 min
24 h
0 min
I II
III
IV V
Imp. I AMA
Imp. II
Imp. III
Imp. IV
Imp. V
a)
b)
131
Os perfis de absorção das impurezas detectadas para o AMB após a
degradação em meio ácido estão apresentados na Figura 28b. Assim como para o
AMA todos os perfis foram semelhantes ao do marcador.
Figura 28 - a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm submetida à degradação em meio ácido (HCl 1M) nos tempos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMB e das impurezas (I’), (II’), (III’), (IV’), (V’), (VI’) e (VII’).
Quando o extrato das cascas de R. ferruginea foi submetido a degradação em
meio ácido por 24 horas, nota-se uma degradação significativamente menos intensa
(Tabela 15), de 26,68% e 8,89% dos marcadores AMA e AMB, respectivamente,
quando comparados aos compostos isolados.
Tabela 15 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B no extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas.
Marcador Tempo
exposição Tr (minutos) Área Teor (mg/g)
Degradação (%)
AMA 0 16,032 686967 49,27 0,00
AMB
30 min
60 min
240 min
24 h
0 min
15 min
Branco
I’ II’
III’
IV’ V’
VI’ VII’
AMB
Imp. V’
Imp. II’ Imp. III’
Imp. IV’
Imp. I’
Imp. VI’ Imp. VII’
a)
b)
132
24 horas 16,023 507213 37,60 23,68
AMB 0 15,597 1158495 44,00 0,00
24 horas 15,564 1056715 40,09 8,89
Após a degradação em meio ácido, pode-se observar no perfil cromatográfico
dos extratos mole da cascas (Figura 29) o aparecimento das Impurezas (II) e (IV),
indicativas da degradação do AMA. Picos com os mesmos tempos de retenção e
perfis de absorção da Impurezas (III’) e (V’) também foram identificados, sendo
característicos da degradação do AMB.
Figura 29- Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm, antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas.
Conforme apresentado na Tabela 16, no extrato mole dos frutos de R.
ferruginea submetido a estresse em meio ácido, o AMA apresentou uma menor
degradação, de 32,34%, quando comparado ao composto isolado. O TGL presente
no mesmo apresentou uma degradação de 17,45%.
Tabela 16 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo no extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido ao estresse hidrolítico ácido (HCl 1M) pelo período de 24 horas.
Marcador Tempo
exposição Tr (minutos) Área Teor (mg/g)
Degradação (%)
AMA 0 16,009 1620857 132,97 0,00
24 horas 16,024 1093227 89,97 32,34
AMB AMA III’
V’ II
IV
Não degradado
HCl 1M 24h
133
TGL 0 17,040 7854616 n.a. 0,00
24 horas 17,053 6484207 n.a. 17,45
n.a. = não se aplica.
No perfil cromatográfico da amostra degradada (Figura 30) pode-se notar o
aparecimento de dois picos referentes as impurezas (II) e (IV), indicativas da
degradação do AMA.
Figura 30 - Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm antes e após degradação em meio ácido (HCl 1M) por 24 horas.
Os resultados obtidos sugerem um mecanismo de proteção contra hidrólise
ácida do AMA e AMB mais intenso no extrato das cascas de R. ferruginea,
provavelmente atribuído a sua diferente constituição fitoquímica quando comparado
aos frutos.
Quando os ácidos mirsinóicos A e B foram submetidos a estresse em meio
alcalino, não ocorreu degradação dos mesmos, conforme apresentado na Tabela 17.
Este comportamento pode ser atribuído a interação dos grupamentos ácidos
carboxílicos dos marcadores com o hidróxido de sódio, formando um sal estável.
Tabela 17 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na concentração de 100 µg/mL submetidos ao estresse hidrolítico alcalino (NaOH 1M).
Marcador Tempo
exposição Tr (minutos) Área
Degradação (%)
0 16,027 2619806 0,00
15 min 16,028 2664057 0,00
AMA 30 min 16,033 2698053 0,00
II
IV
Não degradado
HCl 1M 24h
AMA TGL
134
60 min 16,024 2710423 0,00
240 min 16,017 2698615 0,00
24 horas 16,040 2545885 2,82
0 15,596 5209728 0,00
15 min 15,566 5390636 0,00
30 min 15,570 5371749 0,00
AMB 60 min 15,573 5313775 0,00
240 min 15,600 5336665 0,00
24 horas 15,567 5358343 0,00
Como não houve degradação do AMA e AMB em meio alcalino, seus perfis
cromatográficos permaneceram constantes após os variados tempos de exposição,
como pode-se observar nas Figuras 31 a e b.
Figura 31 - Perfis por CLAE das soluções de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260 nm (a) e Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm (b) submetidas à degradação em meio alcalino (NaOH 1M), nos tempos de 0, 15, 30, 60, 240 min e 24 horas.
AMA
Branco
0 min
15 min
30 min
60 min
240 min
24 horas
a)
135
Os ácidos mirsinóicos A e B foram submetidos também ao estresse oxidativo
em meio contendo H2O2 30% por 6h, cujos resultados estão apresentados na Tabela
18. Após decorrido o tempo de exposição, foi possível observar uma degradação
significativamente maior do AMA (36,60%), em relação ao AMB (6,80%).
Tabela 18 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B submetidos à degradação por oxidação (H2O2 30%).
Marcador Tempo
exposição (horas)
Tr (minutos) ± s
Área Degradação
(%)
AMA 0 16,026 2716200 0,00
6 16,025 1722124 36,60
AMB 0 15,573 4980997 0,00
6 15,564 4642120 6,80
A degradação oxidativa de uma substância envolve mecanismos de
transferência de elétrons para formar ânions e cátions reativos. Amidas, sulfetos e
fenóis são suscetíveis à transferência de elétrons. Grupos funcionais com
hidrogênios instáveis como carbonos benzílicos, alílicos, terciários ou -
Branco
0 min
30 min
240 min
24 horas
15 min
60 min
AMB b)
136
posicionados em relação a um heteroátomo são suscetíveis à oxidação para
formação de hidroperóxidos, hidróxidos ou cetonas (BLESSY et al., 2014).
A análise comparativa dos perfis cromatográficos do AMA controle e após
degradação oxidativa está apresentada na Figura 32a. Observa-se que embora
tenha ocorrido uma degradação intensa do marcador, foram detectadas apenas
duas impurezas denominadas (VI) e (VII) com tempos de retenção de 12,63 e 12,88
± 0,01 minutos, respectivamente. Estas impurezas apresentaram perfis de absorção
no UV semelhantes ao marcador AMA (Figura 32b).
Figura 32 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico A (AMA) a 260 nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (VI) e (VII).
H2O
2 30% 6h
VI
VII
Não degradado
a)
AMA
137
O AMB após a degradação em meio oxidante, não demonstrou uma mudança
muito significativa no perfil cromatográfico (Figura 33a), exceto pela presença de
dois picos com tempos de retenção de 14,06 e 14,33 ± 0,01 minutos, denominados
de impurezas (VIII’) e (IX’), respectivamente. Os perfis de absorção no UV foram
semelhantes ao do AMB, conforme mostrado na Figura 33b.
Figura 33 – a) Perfis por CLAE da solução de Ácido Mirsinóico B (AMB) a 270 nm, antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) por 6 horas. b) Perfis de absorção no UV do AMB e das impurezas (VIII’) e (IX’).
AMA
Imp. VI
Imp. VII
VIII’ IX’
Bb H2O
2 30% 6h
Não degradado
b)
a)
AMB
138
Quando o extrato foi submetido às mesmas condições de degradação
oxidante, nota-se que o AMA torna-se muito menos lábil, com 4,34% de degradação,
em relação ao composto isolado, e o AMB permaneceu inalterado, conforme
apresentado na Tabela 19.
Tabela 19 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.
Marcador Tempo
exposição Tr (minutos) Área Teor (mg/g)
Degradação (%)
AMA 0 16,032 686967 50,65 0,00
6 horas 16,007 656782 48,45 4,34
AMB 0 15,574 1152630 43,77 0,00
6 horas 15,549 1167782 44,35 0,00
No perfil cromatográfico da amostra degradada em meio oxidante, não foi
possível notar mudanças, quando comparado ao perfil da amostra não degradada
(Figura 34).
Figura 34- Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.
AMB Imp. VIII’
Imp. IX’
b)
139
Após a exposição do extrato dos frutos de R. ferruginea ao meio oxidante,
nota-se, conforme apresentado na Tabela 20, uma degradação intensa tanto do
AMA, com 42,26%, quanto do triglicerídeo, que degradou 92,90%.
Tabela 20 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido ao meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.
Marcador Tempo
exposição Tr (minutos) Área Teor (mg/g)
Degradação (%)
AMA 0 16,009 1620857 132,96 0,00
6 horas 16,005 928105 76,51 42,26
TGL 0 17,040 7854616 n.a. 0,00
6 horas 17,055 557439 n.a. 92,90
n.a. = não se aplica.
Embora haja uma redução significativa de intensidade dos picos do AMA e
TGL, o perfil cromatográfico da amostra degradada, apresentado na Figura 35, não
apresentou uma diferença pronunciada quando comparado à amostra não
degradada.
Figura 35- Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm antes e após degradação em meio oxidante (H2O2 30%) pelo período de 6 horas.
H2O
2 30% 6h
Não degradado
AMB AMA
140
Após a degradação oxidante é possível notar uma labilidade mais expressiva
do AMA nos frutos da R. ferruginea em relação as cascas.
Um fóton correspondente ao comprimento de onda de 300 nm possui a
energia de 400 kJ mol-1, a qual é de magnitude comparável a energia de ligação de
compostos orgânicos. O fato de muitos fármacos absorverem radiação na região do
espectro eletromagnético do ultravioleta ou visível significa que esta energia
absorvida é suficiente para quebrar uma ligação na molécula. Portanto, a
propriedade de absorção é uma primeira indicação de que um fármaco pode ser
capaz de participar em um processo fotoquímico guiado para sua própria
decomposição ou de outros componentes da formulação (TONNESEN, 2004). As
reações fotoquímicas podem ser divididas em um processo dependente de oxigênio
(foto-oxidações) e aqueles independentes de oxigênio (desidrogenação, rearranjos e
dimerizações) (WATERMAN; ADAMI, 2005).
Condições de estresse fotolítico podem induzir a foto-oxidação pelo
mecanismo de formação de radicais livres. Grupos funcionais como carbonilas,
nitroaromáticos, N-oxidos, alcenos, cloretos de arila, fracas ligações C-H e O-H,
sulfetos e polienos são prováveis de induzir a fotosensibilidade de fármacos
(BLESSY et al., 2014). O oxigênio singleto formado reage com ligações insaturadas,
como alcenos, dienos, hidrocarbonetos poliaromáticos, enquanto o oxigênio tripleto
reage com radicais livres da molécula do fármaco e formar peróxidos. Desta forma, a
luz pode também atuar com um catalizador de reações de oxidação (SINGH;
REHMAN, 2012).
H2O
2 30% 6h
Não degradado
AMA
TGL
141
Para o ensaio de fotodegradação, os marcadores foram submetidos
inicialmente ao mínimo de luz visível de 1,2 milhões de lux/h e radiação ultravioleta
de 200 w.h/m² recomendado pelo FDA (ICH, 1996). O valor de radiação incidida
sobre os marcadores foi duplicado, com a finalidade de ver o comportamento da
amostra frente a um maior estresse fotolítico, quanto ao aspecto físico das amostras,
seus perfis cromatográficos e teor dos marcadores.
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 21, quando submetido
à radiação na região da luz visível com intensidade de 1,2 milhões lux/h o AMA
degradou de forma significativa (34,42). Aumentando a intensidade de exposição é
possível notar um aumento não proporcional na degradação do mesmo, que é de
40,74%, o que indica sua maior instabilidade até o mínimo de radiação incidida.
O AMB quando exposto a radiação visível degradou 6,45% na intensidade de
1,2 milhões lux/h, e 29,93% após duplicar a radiação incidida.
Tabela 21 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B submetidos à degradação a luz visível.
Marcador Intensidade de
luz visível (lux/h)
Tr (minutos) ± s
Área Degradação
(%)
AMA
n.a 16,026 2917611 0,00
1.200.000 16,017 1913502 34,42
2.400.000 16,029 1728849 40,74
AMB
n.a 15,571 5252091 0,00
1.200.000 15,572 4913192 6,45
2.400.000 15,574 3679891 29,93
Avaliando o aspecto dos marcadores após a fotodegração na região do visível
(Figura 36), nota-se uma perda gradativa da coloração amarela do óleo referente ao
AMA com o aumento da intensidade de luz incidida. O oposto ocorre para o AMB,
que sofre um escurecimento, ficando amarelado após a exposição a 2,4 milhões
lux/h.
142
Figura 36 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação na região do visível.
Quanto ao perfil cromatográfico do AMA após degradação na região do visível
(Figura 37a), observa-se o aparecimento de um pico em 14,08 ± 0,01 minutos,
referente à impureza (VIII), cujo perfil de absorção semelhante ao do marcador AMA
está apresentado na Figura 37b. Esta impureza aparece após a dose mínima de 1,2
milhões de lux/h incidida sobre a amostra e permanece com um leve aumento de
intensidade do pico após o aumento da dose de radiação, sendo provavelmente um
produto da modificação da cadeia lateral do AMA.
143
Figura 37 – a) Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser submetido à degradação fotolítica na luz visível; b) Perfis de absorção no UV do AMA e da impureza (VIII).
Nos perfis cromatográficos do AMB após a fotodegradação na região do
visível (Figura 38), é possível identificar a presença dos picos referentes aos
contaminantes (VIII’) e (IX’) após exposição aos diferentes níveis de radiação. Estas
mesmas impurezas foram identificadas também na amostra de AMB após
degradação oxidativa, das quais os perfis de absorção estão apresentados na Figura
26b. Além destes, foi possível notar um acréscimo na intensidade de picos que
constituem uma porção de impurezas conhecidas no padrão presentes na região
entre 13 e 14 minutos, denomidada de Impurezas (X’).
VIII
Não degradado
1,2 mi lux/h
2,4 mi lux/h
a) AMA
AMA
Imp. VIII
b)
144
Figura 38 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, antes e após ser submetido à degradação fotolítica na luz visível.
O extrato mole das cascas de R. ferruginea foi exposto ao máximo de
radiação na região da luz visível a qual os compostos isolados apresentaram
degradação. Foi avaliada a degradação dos marcadores AMA e AMB nestas
condições e não se observou alterações significativas entre as áreas dos compostos
quando expostos e não expostos à luz visível, conforme apresentado na Tabela 22.
Tabela 22 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido à degradação Na luz visível.
Marcador
Intensidade de luz visível (lux/h)
Tr (minutos) ± s Área Teor
(mg/g) Degradação
(%)
AMA n.a 16,021 699175 51,53 0,00
2.400.000 16,032 692787 51,07 0,95
AMB n.a 15,565 1195351 45,41 0,00
2.400.000 15,577 1205234 45,79 0,00
Conforme observado na Figura 39 o perfil cromatográfico da amostra após a
exposição à luz visível não mostrou alterações. Este resultado demonstra que a
constituição química das cascas de R. ferruginea pode auxiliar na proteção dos
marcadores frente a radiação na região da luz VIS.
Não degradado
1,2 mi lux/h
2,4 mi lux/h
X’ VIII’
IX’
AMB
145
Figura 39 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h).
Ao contrário das cascas, o extrato mole dos frutos quando exposto a radiação
visível, demonstrou uma degradação intensa (98,66%) do marcador AMA. Assim
como do TGL que degradou 72,49%, demonstrando uma maior labilidade deste
extrato quando comparado ao das cascas (Tabela 23).
Tabela 23- Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido à degradação a luz visível.
Marcador
Intensidade de luz visível (lux/h)
Tr (minutos) ± s
Área Teor
(mg/g) Degradação
(%)
AMA n.a 16,031 1101088 90,61 0,00
2.400.000 16,035 4145 1,21 98,66
TGL n.a 17,084 ± 0,01 8134937 n.a. 0,00
2.400.000 17,098 2241318 n.a. 72,45
n.a. = não se aplica.
No perfil cromatográfico dos frutos degradados (Figura 40a) observa-se a
significativa redução dos picos do AMA e dos demais constituintes do extrato, com
eluição entre 13 e 16,5 minutos. Além disso, ocorre o aparecimento de três picos
entre 11,3 e 11,7 minutos, denominados de impurezas (IX), e em 15,4 minutos um
pico referente à impureza (X), os perfis de absorção destes picos estão
apresentados na Figura 40b.
Não degradado
2,4 mi lux/h
AMB AMA
146
Figura 40 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm, antes e após degradação na luz visível (2,4 milhões lux/h); b) Perfis de absorção no UV do AMA e das impurezas (IX e X).
Além da exposição dos marcadores a radiação na região do visível, também
foi realizada a fotodegração do AMA e AMB na região do ultravioleta A. Os
resultados encontram-se descritos na Tabela 24. Inicialmente, quando exposto a
radiação UVA na intensidade de 200 W.h/m² os ácidos mirsinóicos A e B sofreram
degradação de 26,6 e 21,73%, respectivamente, quando dobrada a dose de
radiação, observa-se um acréscimo significativo na degradação do AMA que passa
para 45,01%. Quanto ao AMB, com o aumento da intensidade de radiação UVA
incidida para 400 W.h/m² não há alterações significativas na porcentagem de
degradação, a qual permanece em 21,97 %.
Não degradado
2,4 mi lux/h
IX X
AMA
Imp. IX
Imp. X
a)
b)
AMA TGL
147
Tabela 24 - Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B submetidos à degradação a radiação UVA
Marcador Intensidade de radiação UVA
(W.h/m²) Tr (minutos) Área
Degradação (%)
AMA
n.a 16,024 2602566 0,00
200 16,020 1910336 26,60
400 16,020 1431080 45,01
AMB
n.a 15,571 4987323 0,00
200 15,575 3903611 21,73
400 15,574 3891836 21,97
Avaliando o aspecto dos padrões após fotodegradação no ultravioleta A,
apresentado na Figura 41, é possível identificar um escurecimento do óleo referente
ao AMA com o aumento da radiação incidida. Com o AMB, nota-se uma mudança
da cor do pó de branco para um tom de amarelo mais proeminente do que quando o
mesmo marcador foi degradado na radiação visível.
148
Figura 41 - Aspecto físico dos marcadores AMA e AMB após fotodegradação na região do ultravioleta A.
O perfil cromatográfico obtido para o AMA degradado 26,6% na intensidade
de 200 W.h/m², apresentado na Figura 42, não demonstra mudanças significativas
quando comparado com a amostra não degradada. Quando dobrada a dose de
radiação incidida, nota-se o aparecimento do pico com tempo de retenção de 14,08
± 0,01 minutos, referente a impureza (VIII) detectada também no AMA degradado na
luz visível.
Os perfis cromatográficos obtidos para o AMB após a fotodegradação no UVA
(Figura 43), foram semelhantes aos perfis obtidos para a fotólise na região do visível,
com o aparecimento das impurezas (VIII’) e (IX’), e os picos entre 13 e 14 minutos
denominados de impureza (X’) que tiveram um aumento de intensidade.
149
Figura 42 - Perfis cromatográficos do AMA em 260 nm, antes e após ser submetido à degradação fotolítica em radiação UVA.
Figura 43 - Perfis cromatográficos do AMB em 270 nm, expostos e não expostos à degradação fotolítica em radiação UVA.
O extrato mole das cascas de R. ferruginea quando exposto a radiação UVA
apresentou uma degradação menos intensa dos marcadores (Tabela 25), em
comparação com os compostos, na sua forma pura, na mesma intensidade de
radiação.
Não degradado
200 w.h/m²
400 w.h/m²
VIII
X’
VIII’
IX’
Não degradado
200 w.h/m²
400 w.h/m²
AMA
AMB
150
Tabela 25- Parâmetros cromatográficos e degradação dos ácidos mirsinóicos A e B na amostra de extrato mole das cascas de R. ferruginea submetido à degradação em radiação UVA.
Marcador
Intensidade de radiação
UVA (W.h/m²)
Tr (minutos) Área Teor
(mg/g) Degradação
(%)
AMA n.a 16,028 771299 56,77 0,00
400 16,030 713139 52,55 7,43
AMB n.a 15,573 1294480 49,21 0,00
400 15,575 1147966 43,59 11,42
No perfil cromatográfico do extrato das cascas após degradação na radiação
UVA, apresentado na Figura 44, não foi possível identificar nenhuma alteração,
quando comparado ao perfil da amostra não degradada.
Figura 44 - Perfis por CLAE do extrato mole das cascas de R. ferruginea a 270 nm, exposto e não exposto a degradação na radiação UVA (400 W.h/m²).
O extrato mole dos frutos submetidos à radiação UVA obteve uma
porcentagem de degradação do AMA de 46,41%, muito semelhante a do composto
isolado submetido às mesmas condições de estresse fotolítico. O triglicerídeo
presente nos frutos permaneceu estável (Tabela 26).
Não degradado
400 w.h/m²
AMA AMB
151
Tabela 26 - Parâmetros cromatográficos e degradação do ácido mirsinóico A e triglicerídeo na amostra de extrato mole dos frutos de R. ferruginea submetido à degradação em radiação UVA.
Marcador
Intensidade de radiação
UVA (W.h/m²)
Tr (minutos) Área Teor
(mg/g) Degradação
(%)
AMA n.a 16,023 1277442 104,98 0,00
400 16,019 679597 56,26 46,41
TGL n.a 17,084 7711073 n.a. 0,00
400 17,069 7739587 n.a. 0,00
n.a. = não se aplica.
No perfil cromatográfico do extrato dos frutos degradado em radiação UVA
(Figura 45a), observa-se o aparecimento de picos com os mesmos perfis de
absorção no UV (Figura 45b) co-eluindo entre aproximadamente 12,9 e 13,3
minutos, os quais foram denominados de impurezas (XI). Na amostra submetida ao
stress fotolítico notou-se o aparecimento das impurezas (V) e (X), características da
degradação do AMA.
152
Figura 45 - a) Perfis por CLAE do extrato mole dos frutos de R. ferruginea a 260 nm, expostos e não expostos a degradação na radiação UVA (400 W.h/m²); b) Perfis de absorção no UV do AMA da impureza (XI).
O estudo de degradação térmica dos ácidos mirsinóicos A e B foi conduzido
de acordo com o “Guia para a realização de estudos de estabilidade” publicado pela
ANVISA (BRASIL, 2005). Os resultados obtidos foram apresentados em forma de
gráfico (Figura 46), relacionando os diferentes tempos de armazenamento com a
porcentagem remanescente dos marcadores expressa em relação às áreas dos
picos observadas no tempo zero de armazenamento.
De acordo com o observado para os marcadores isolados armazenados na
temperatura de 40 ºC (Figura 46a) é possível notar que a AMB apresentou-se
estável pelo período de 90 dias, com um discreto aumento de área provavelmente
decorrente de um processo de perda de umidade da amostra. O oposto foi
observado para o AMA, que apresentou um decréscimo de área constante até o
Não degradado
400 w.h/m²
XI V
X
AMA
Imp. XI
AMA TGL
a)
b)
153
período de 60 dias de armazenamento, no qual apresentou uma degradação
equivalente a 9,25%.
O extrato mole das cascas de R. ferruginea armazenado na temperatura de
40 ºC e avaliado em diferentes tempos quanto ao teor de AMA e AMB (Figura 46b),
demonstrou um acréscimo significativo na área de ambos os marcadores até os 90
dias de armazenamento. Este resultado foi observado provavelmente devido ao
ressecamento do extrato decorrente da temperatura elevada, com consequente
aumento da concentração dos marcadores na solução amostra analisada.
Para o extrato mole dos frutos de R. ferruginea, cujo resultado está
apresentado na Figura 46c, observou-se uma intensa variabilidade na porcentagem
remanescente do AMA, também provavelmente decorrente do ressecamento do
extrato deixando o marcador que é um óleo, distribuído de forma heterogênea na
amostra submetida a esta condição. Já para o TGL, foi observado um decréscimo de
áreas constante até o período de 90 dias, onde este composto atingiu a
porcentagem de degradação de 48,78%.
154
Figura 46 – Avaliação da estabilidade acelerada dos ácidos mirsinóicos A e B isolados (a) e nos extratos moles das cascas (b) e frutos (c) de R. ferruginea, armazenados a 40°C, pelo período de 15, 30, 60 e 90 dias. Valores expressos em porcentagem remanescente dos marcadores em relação às áreas iniciais medidas (Tempo zero) (100%).
Na análise dos perfis cromatográficos das amostras submetidas ao teste de
estabilidade acelerada nos tempos de 15, 30, 60 e 90 dias, não foram observadas
diferenças em relação às amostras avaliadas no tempo zero, mesmo as que
apresentaram degradação dos compostos avaliados. A pureza dos picos dos
marcadores nos diferentes tempos de armazenamento manteve-se em 99,99%.
6.6 Avaliação do teor dos compostos ativos nas nanoemulsões
Para uma extração eficiente dos ácidos mirsinóicos A e B das nanoemulsões,
foram desenvolvidos e validados diferentes métodos de preparo para cada
nanossistema (listados no item 4.2.6).
Inicialmente, o método isocrático desenvolvido foi avaliado quanto aos
parâmetros de precisão (repetibilidade) e especificidade, quando aplicado à análise
a) b)
c)
155
da nanoemulsão NAMB01, contendo apenas o AMB. De acordo com os resultados
apresentados na Tabela 27, nota-se que o método de preparo de amostra foi
eficiente e preciso, com DPR inferior a 2%, para extração do AMB da nanoemulsão,
obtendo uma recuperação média de 117%.
Tabela 27- Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóico B, na formulação NAMB01 contendo 0,1% do mesmo, no ensaio de repetibilidade do método analítico isocrático.
Réplica Teor (mg/g de formulação)
1 1,14
2 1,14
3 1,18
4 1,19
5 1,18
6 1,16
Média 1,17
s 0,02
DPR% 1,87
s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.
Para avaliação da especificidade do método isocrático quando utilizado para
análise da nanoemulsão NAMB01, foram comparados os perfis cromatográficos do
“branco” da formulação, e da mesma contendo o AMB incorporado. De acordo com
os cromatogramas obtidos analisados a 270 nm (Figura 47) nota-se a ausência de
interferentes da formulação na análise, garantindo desta forma, que o método é
específico para a determinação do AMB incorporado na nanoemulsão NAMB01.
156
Figura 47– Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação NAMB01 (a) e da formulação NAMB01 contendo 0,1% do marcador AMB (b), analisados através do método isocrático, no comprimento de onda de 270 nm.
Para a análise da nanoemulsão NCAS025, contendo o extrato mole das
cascas de R. ferruginea na concentração de 0,25%, foi inicialmente realizada a
análise quantitativa dos marcadores AMA e AMB presentes no extrato mole, cujos
resultados encontram-se descritos na Tabela 28.
Tabela 28 – Teor dos ácidos mirsinóicos A e B no extrato mole das cascas de Rapanea ferruginea.
Composto Teor (mg/g)* ± s
AMA 49,10 ± 0,08
AMB 43,77 ± 0,20
*Teor dos marcadores expressos em mg/g de resíduo seco obtido; s = desvio padrão
Posteriormente foi realizada a análise de repetibilidade do método de preparo
de amostra para a fórmula NCAS025, utilizando o método gradiente desenvolvido. O
DPR dos teores obtidos tanto do AMA quanto para o AMB nas diferentes réplicas
analisadas, apresentados na Tabela 29, indica que o método é preciso para a
extração dos marcadores a partir desta formulação, com recuperações médias de
96,18% para o AMA e 98,93% para o AMB.
a)
b)
157
Tabela 29- Determinação de variação da quantificação dos ácidos mirsinóicos A e B, na formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato mole das cascas de R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método analítico gradiente.
Réplica Teor AMA (µg/g)* Teor AMB (µg/g)*
1 60,40 54,60
2 60,10 55,70
3 60,90 56,10
4 62,20 55,80
5 60,40 56,10
6 58,40 54,10
Média 60,40 55,40
s 1,12 0,77
DPR% 1,86 1,39
*Teor dos marcadores expressos em mg/g de nanoemulsão NCAS025; s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.
Analisando o perfil cromatográfico do branco da formulação, apresentado na
Figura 48a, observa-se a presença de vários picos entre 7 e 18 minutos, que
comparado à formulação contendo o extrato incorporado (Figura 48b), demonstram
a ausência de interferência dos mesmos com os marcadores AMA e AMB. Este
resultado indica que o método é específico para a análise dos marcadores na
formulação NCAS025.
Figura 48 – Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação NCAS025 (a) e da formulação NCAS025 contendo 0,25% do extrato mole das cascas de R. ferruginea (b), analisados através do método gradiente, no comprimento de onda de 270 nm.
6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
uV(x1,000,000)
14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5 17.0 17.5 18.0 18.5 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75uV(x100,000)
AMB
AMA
a)
b)
158
Assim como para a formulação NCAS025, antes da análise da nanoemulsão
NFRUT1 foi realizada a uma análise quantitativa do marcador AMA presente no
extrato mole dos frutos de R. ferruginea, cujo resultado encontra-se descrito na
Tabela 30.
Tabela 30 - Teor dos ácido mirsinóico A no extrato mole dos frutos de Rapanea ferruginea.
Composto Teor (mg/g)* ± s
AMA 149,83 ± 0,94
*Teor dos marcadores expressos em mg/g de resíduo seco obtido; s = desvio padrão
O estudo de repetibilidade do método de preparo de amostra para a
nanoemulsão NFRUT1, apresentados na Tabela 31, indica que o método foi preciso
para a extração do AMA da formulação, uma vez que o DPR foi menor que 2%. A
recuperação média observada para o marcador foi de 104,89%, denotando a
exatidão do método
Tabela 31 - Determinação de variação da quantificação do ácido mirsinóicos A na formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole dos frutos de R. ferruginea, no ensaio de repetibilidade do método de preparo de amostra.
Réplica Teor AMA (µg/g)*
1 709,90
2 696,30
3 732,00
4 731,90
5 711,10
6 716,50
Média 716,28
s 13,84
DPR% 1,93
*Teor dos marcadores expressos em µg/g de nanoemulsão NCAS025; s - desvio padrão; DPR – desvio padrão relativo.
Quando aplicado à análise da nanoemulsão NFRUT1, o método gradiente foi
considerado específico para a análise do marcador AMA (Figura 49), uma vez que
não foi observada nenhuma interferência dos demais componentes da formulação
no tempo de retenção deste marcador. Conforme observado na Figura 49, é possível
identificar picos com os mesmos tempos de retenção (ente 7 e 18 minutos) que os
159
presentes na nanoemulsão NCAS025, que são atribuídos aos parabenos presentes
em ambas formulações.
Figura 49 - Perfis cromatográficos por CLAE do branco da formulação NFRUT1 (a) e da formulação NFRUT1 contendo 1% do extrato mole dos frutos de R. ferruginea (b), analisados através do método gradiente, no comprimento de onda de 260 nm.
6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
uV(x1,000,000)
AMA TGL
a)
b)
160
7 CONCLUSÕES
- O AMA apresentou-se como um óleo de coloração amarela, com
caraterísticas de um ácido fraco lipofílico. Este marcador apresentou pureza
insuficiente para ser considerado uma SQR (< 98%), indicando a necessidade de
etapas futuras de purificação.
- O AMB apresentou-se como um pó branco de comportamento
semicristalino. Apresentou caráter ácido fraco e característica lipofílica. Os testes de
confirmação de identidade química realizados e sua pureza > 98 %, são suficientes
para caracterizá-lo como uma SQR de acordo com a Farmacopéia Brasileira. Além
disso, este marcador demonstrou-se significativamente mais estável que o AMA
frente às condições de degradação a que foram expostos (ácida, oxidativa,
radiações UVA e no visível).
- As propriedades químicas, físicas e físico-químicas do AMA e AMB
determinadas no presente estudo serão úteis para direcionar o desenvolvimento de
novas formas farmacêuticas, bem como irão subsidiar a escolha das melhores vias
de administração para futuros fitofármacos e fitoterápicos. Adicionalmente, a
obtenção de marcadores adequados irá possibilitar o controle de qualidade e
padronização dos derivados vegetais de R. ferruginea e dos compostos AMA e AMB.
- Os métodos analíticos isocrático e gradiente por CLAE desenvolvidos
permitiram uma boa separação cromatográfica, com picos bem resolvidos,
simétricos e sem caudas, capazes de quantificar os ácidos mirsinóicos A e B nos
extratos etanólicos 90 °GL das cascas de frutos de R. ferruginea e em
nanoemulsões. Os métodos desenvolvidos foram específicos, lineares, precisos,
sensíveis, e exatos para a determinação de AMA e AMB puros e nos extratos dos
frutos e cascas de R. ferruginea. O método gradiente desenvolvido pode ser
considerado indicativo de estabilidade dos marcadores AMA e AMB, podendo ser
empregado em estudos de estabilidade de extratos de R. ferruginea e em
formulações a que estes forem incorporados;
- As metodologias de doseamento dos marcadores nas nanoemulsões
avaliadas foram exatas (níveis de recuperação próximos a 100% do valor teórico)
reprodutíveis e específicas, sem interferência dos componentes da formulação.
161
162
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