Esperto in gestione depuratori biologici e trattamento fanghi

ASPETTI MICROBIOLOGICI

Istituto Tecnico Industriale

Stanislao Cannizzaro

Catania

Evoluzione della normativa

La legislazione italiana sulle acque reflue è stata scarsa e confusa fino al 1976, anno in cui è stata approvata e pubblicata la Legge 319/76, meglio conosciuta come "Legge Merli".

• Vengono indicate le determinazioni di ordine chimico, chimico-fisico e batteriologico da seguire, gli standard da applicare, nonché le metodiche e le modalità tecniche di prelievo e la frequenza dei campionamenti

• Vengono indicate le norme tecniche generali per la regolamentazione dell’istallazione e dell’esercizio degli impianti di acquedotto e di depurazione

D.P.R. 24 maggio 1988, n. 236

“Attuazione della direttiva CEE n. 80/778 concernente la qualità delle acque destinate al consumo umano, ai sensi dell’art. 15 della legge 16.4.1987 n. 183” (15).

•In 22 articoli vengono stabiliti i requisiti di qualità delle acque destinate al consumo umano al fine di tutelare la salute pubblica e migliorare le condizioni di vita e vengono introdotte le misure finalizzate a garantire la difesa delle risorse idriche.

•Definisce oltre 60 parametri per classificare le acque destinate al consumo umano.

Evoluzione della normativa

Elenco dei parametri previsti dal D.P.R. 236/88 per definire i Elenco dei parametri previsti dal D.P.R. 236/88 per definire i requisiti di qualita’ delle acque destinate al consumo umanorequisiti di qualita’ delle acque destinate al consumo umano

Sostanze indesiderabiliSostanze indesiderabili

Sostanze tossicheSostanze tossiche

Parametri microbiologiciParametri microbiologici

Modelli e frequenze delle analisi delle Modelli e frequenze delle analisi delle acque destinate al consumo umanoacque destinate al consumo umano

• concentrazione massima ammissibile (CMA) rappresenta un livello di rischio a cui l’uomo non può essere sottoposto nemmeno per un breve periodo di tempo. Pertanto tale valore non deve essere superato in alcun caso;

• valore guida (VG) rappresenta il livello di sicurezza che dovrebbe essere mantenuto costantemente, ossia è il valore ottimale al quale deve tendere l’Ente preposto alla potabilizzazione.

I I concetticoncetti più importanti introdotti dalla legge sono: più importanti introdotti dalla legge sono:

Sostituisce la Legge Merli e detta le disposizioni correttive del precedente decreto in materia di tutela delle acque dall’inquinamento

D.leg. 11 maggio 1999, n. 152

“Disposizioni sulla tutela delle acque dall’inquinamento e recepimento della Direttiva 91/271/CEE concernente il trattamento delle acque reflue urbane della Direttiva 91/676/CEE relativa alla protezione delle acque dall’inquinamento provocato dai nitrati provenienti da fonti agricole”.

a) prevenire e ridurre l’inquinamento e attuare il risanamento

dei corpi idrici inquinati;

b) conseguire il miglioramento dello stato delle acque ed

adeguate protezioni di quelle destinate a particolari usi;

c) perseguire usi sostenibili e durevoli delle risorse idriche, con

priorità per quelle potabili;

d) mantenere la capacità naturale di autodepurazione dei corpi

idrici nonché la capacità di sostenere comunità animali e

vegetali ampie e ben diversificate.

Obiettivi:Obiettivi:

La normativa si sviluppa con la seguente articolazione:La normativa si sviluppa con la seguente articolazione:

• obiettivi di qualità

• tutela dei corpi idrici e disciplina degli scarichi

• strumenti di tutela

• sanzioni

• monitoraggio e classificazione delle acque in funzione degli obiettivi di qualità ambientale

• classificazione dei corpi idrici a specifica destinazione

il D.Lgs. 152/99 classifica le acque superficiali in tre categorie di qualità decrescenti (A1, A2, A3), in base a determinati valori-limite fissati per 46 parametri relativi a caratteristiche fisiche, chimiche e microbiologiche (art. 7).

Prevede, quindi, in relazione alla categoria di appartenenza, specifici trattamenti di potabilizzazione di complessità crescente.

•CATEGORIA A1 = trattamento fisico semplice e disinfezione;

•CATEGORIA A2 = trattamento fisico e chimico normale e disinfezione;

•CATEGORIA A3 = trattamento fisico e chimico spinto, affinazione e disinfezione

Parametri igienico-sanitariParametri igienico-sanitari

Parametro A1 A2 A3

Coliformi totali

ufc/100ml 50 5000 50.000

Coliformi fecali

ufc/100ml 20 2000 20.000

Streptococchi fecali

ufc/100ml 20 1000 10.000

Salmonelle Assenza in 5lt

Assenza in 1lt

-

Il regolamento stabilisce le norme tecniche per il riutilizzo delle acque reflue domestiche, urbane ed industriali attraverso la regolamentazione delle destinazioni d'uso e dei relativi requisiti di qualità, ai fini della tutela qualitativa e quantitativa delle risorse idriche, limitando il prelievo delle acque superficiali e sotterranee, riducendo l'impatto degli scarichi sui corpi idrici recettori e favorendo il risparmio idrico mediante l'utilizzo multiplo delle acque reflue.

Decreto 12 Giugno 2003, n. 185

“Regolamento recante norme tecniche per il riutilizzo delle acque reflue in attuazione dell'articolo 26, comma 2, del decreto legislativo 11 maggio 1999, n. 152”

Art. 3.

Destinazioni d'uso ammissibili

1. Le destinazioni d'uso ammissibili delle acque reflue recuperate sono le seguenti:

a) irriguo: per l'irrigazione di colture destinate sia alla produzione di alimenti per il consumo umano ed animale sia a fini non alimentari, nonchè per l'irrigazione di aree destinate al verde o ad attività ricreative o sportive;

b) civile: per il lavaggio delle strade nei centri urbani; per l'alimentazione dei sistemi di riscaldamento o raffreddamento; per l'alimentazione di reti duali di adduzione, separate da quelle delle acque potabili, con esclusione dell'utilizzazione diretta di tale acqua negli edifici a uso civile, ad eccezione degli impianti di scarico nei servizi igienici;

c) industriale: come acqua antincendio, di processo, di lavaggio e per i cicli termici dei processi industriali, con l'esclusione degli usi che comportano un contatto tra le acque reflue recuperate e gli alimenti o i prodotti farmaceutici e cosmetici.

Art. 7.

Controllo e monitoraggio degli impianti di recupero

1. L'impianto di recupero delle acque reflue è soggetto al controllo da parte dell'autorità competente, ai sensi dell'articolo 49 del decreto legislativo n. 152 del 1999, per la verifica del rispetto delle prescrizioni contenute nell'autorizzazione di cui all'articolo 6. Il controllo, su disposizione dell'autorità competente e sulla base del programma di controllo di cui all'articolo 49, comma 1, del decreto legislativo n. 152 del 1999, può essere effettuato dal titolare dell'impianto di recupero.

2. Il titolare dell'impianto di recupero deve, in ogni caso, assicurare un sufficiente numero di autocontrolli all'uscita dell'impianto di recupero, comunque non inferiore a quello previsto dalla normativa regionale in rapporto alle specifiche utilizzazioni. I risultati delle analisi devono essere messi a disposizione delle autorità di controllo..

Art. 11.

Monitoraggio delle attività di riutilizzo

1. Il titolare della rete di distribuzione effettua il monitoraggio ai fini della verifica dei parametri chimici e microbiologici delle acque reflue recuperate che vengono distribuite e degli effetti ambientali, agronomici e pedologici del riutilizzo. L'autorità sanitaria, nell'esercizio delle attività di prevenzione di propria competenza e in relazione a quanto stabilito dall'articolo 4, comma 2, valuta gli eventuali effetti igienico-sanitari connessi all'impiego delle acque reflue recuperate.

2. I risultati del monitoraggio sono trasmessi alla regione con cadenza annuale.

Requisiti di qualità delle acque reflue Requisiti di qualità delle acque reflue recuperate destinate ad uso agricolorecuperate destinate ad uso agricolo

ParametroUnità di misura

Valore limite tab.AValore limite lagunaggio e fitodepurazione

E.coli UFC/100ml10 (80% campioni)100 (valore puntuale max)

50(80% campioni)200 (valore puntuale max)

Salmonella Assente (100% campioni)

APPLICAZIONI DI ACQUE REFLUE RIGENERATEAPPLICAZIONI DI ACQUE REFLUE RIGENERATE

Vantaggi

Ambientali:riduzione del carico inquinante sversato nei corpi idrici superficiali

Agronomici: nuova fonte di approvvigionamento idrico per l’irrigazione

ImpieghiLavaggio strade e auto, irrigazioni campi di golf, realizzazione di compost, arricchimento terreni “poveri”, utilizzo nei processi industriali,…….

L'acqua rappresenta il mezzo di diffusione di tutte quelle malattie infettive dette a circuito oro-fecale, cioè malattie dovute all'ingestione di acqua venuta a contatto con deiezioni di animali a sangue caldo, tra questi l'Uomo.

Tra le malattie infettive conosciute molte sono determinate da organismi parassiti che trovano nell'intestino la loro preferenziale localizzazione.

Tra gli organismi patogeni trasmessi per via idrica vi sono i batteri, virus e protozoi.

L’ACQUA E LE MALATTIE INFETTIVEL’ACQUA E LE MALATTIE INFETTIVE

QUALITÀ IGIENICO-SANITARIA DELLE ACQUE

Analizzare un'acqua dal punto di vista microbiologico significa valutare qualitativamente e quantitativamente l’eventuale presenza in essa di microrganismi patogeni di natura batterica e/o virale.

Tuttavia, se da una parte il loro rilevamento in un'acqua é indice della loro presenza, dall'altra non si può dire che un risultato negativo deponga sicuramente per la loro assenza.

Superegno: PROCARIOTIorganismi sprovvisti di membrana nucleare

CLASSIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI

Superegno: EUCARIOTIorganismi provvisti di membrana nucleare

VIRUS

Batteri

Cianobatteri

Funghi

Lieviti e muffe

Alghe

ProtozoiPiante Animali

BATTERI PATOGENI IN AMBIENTE IDRICO

sopravvive fino a 40 giorni

la presenza può essere dovuta ad infiltrazioni di liquami per dissesti nella rete di distribuzione, ad

inquinamento della sorgente, a cattivo funzionamento degli impianti di potabilizzazione

Salmonella Typhi

è più resistente dei coliformi fecali nell’ambiente esterno

resiste all’azione del cloro

Staphylococcus aureus

ha una resistenza variabile in rapporto a fattori diversi (temperatura, umidità, presenza di sostanze organiche, ecc.) in particolare nell’acqua potabile può resistere da 7 a 13 giorni

Vibrio cholerae

MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI)MORFOLOGIA BATTERICA (COCCHI)

COCCHI COCCHI SINGOLISINGOLI

DIPLOCOCCHIDIPLOCOCCHI

TETRADITETRADI

SARCINESARCINE

STREPTOCOCCHISTREPTOCOCCHI

STAFILOCOCCHISTAFILOCOCCHI

MORFOLOGIA BATTERICA (BACILLI)

BACILLIBACILLI

COCCOBACILLICOCCOBACILLI

DIPLOBACILLIDIPLOBACILLI

STREPTOBACILLISTREPTOBACILLI

VIBRIONI

(es. V. cholerae)

SPIRILLI

SPIROCHETE

MORFOLOGIA BATTERICA (SPIRALE)

COCCHICOCCHI

BACILLIBACILLI

SPIRILLISPIRILLI

ESEMPIESEMPI

STREPTOCOCCHISTREPTOCOCCHI

STAFILOCOCCHISTAFILOCOCCHI

MORFOLOGIA BATTERICA

E. COLIE. COLI

S. TYPHIS. TYPHI

TREPONEMA PALLIDUMTREPONEMA PALLIDUM

V. CHOLERAEV. CHOLERAE

BORRELIA BURGDOFERIBORRELIA BURGDOFERI

MORFOLOGIA BATTERICA

STREPTOCOCCHISTREPTOCOCCHI

STAFILOCOCCHISTAFILOCOCCHI

MORFOLOGIA BATTERICA

PRINCIPALI DIFFERENZE NEGLI INVOLUCRI ESTERNI DEI PRINCIPALI DIFFERENZE NEGLI INVOLUCRI ESTERNI DEI BATTERI GRAMBATTERI GRAM– E GRAM +– E GRAM +

Peptidoglicano

Membrana citoplasmatica

Peptidoglicano

Membrana citoplasmatica

Periplasma

Membrana esterna

MOLTIPLICAZIONEMOLTIPLICAZIONE

SCISSIONESCISSIONE • Cellula madre 2 cellule figlie

• Separazione completa

• Separazione incompleta (catene, grappoli, palizzate, ecc.)

GEMMAZIONEGEMMAZIONE Produzione di protuberanze che si staccano dalla cellula madre

SPORIFICAZIONESPORIFICAZIONE

Spore: forma di resistenza (a numerosi agenti fisici e chimici) caratterizzata dall’assenza di ogni attività metabolica (es. Clostridium tetani, C. botulinum).

In condizioni favorevoli: GERMINAZIONE (passaggio alla forma vegetativa).

D.P.R. 236/88

* il valore di sicurezza al cui raggiungimento deve tendere l’ente preposto alla potabilizzazione

** la concentrazione che non può essere superata in alcun caso rappresentando un livello di rischio per l’uomo

Per le acque disinfettate i valori all’uscita degli impianti di disinfezione devono essere nettamente inferiori ai valori riscontrati prima del trattamento

-100 u.f.c.Conta batterica a

22°C

Ogni superamento di tali valori che persiste durante i prelievi successivi richiede indagini e accertamenti appropriati

-10 u.f.c.Conta batterica a

36°C

0-Clostridi solfito-riduttori

0-Enterococchi

0-Coliformi fecali

Non più del 5% dei campioni esaminati nell’arco dell’anno e non più di 2 campioni consecutivi possono eccedere tale limite; comunque mai il contenuto di C. totali può essere superiore a 5/100ml.

0-Coliformi totali

OSSERVAZIONI

Conc. massima ammissibile (CMA)**

Valore guida (VG)*

INDICATORI

La presenza di spore e/o di forme vegetative può fornire indicazione di inquinamento remoto o intermittente e risulta quindi utile, accanto ai classici indicatori di contaminazione fecale, ai fini del controllo dello stato igienico-sanitario delle acque potabili e delle condizioni delle reti idriche

Clostridi

Rappresentano dei buoni indicatori di contaminazione fecale recente e dell’efficienza dei trattamenti di potabilizzazione delle acque; indicano una contaminazione in prevalenza di origine animale

Enterococchi

Rappresentano dei buoni indicatori di contaminazione fecale in atto e indicano una contaminazione in prevalenza di origine umana

Coliformi fecali

Non possono essere considerati indicatori di contaminazione di sicura origine fecale; utili come indicatori dell’integrità delle reti idriche

Coliformi totali

Indica lo stato microbico generale dell’acquaCarica batterica

SIGNIFICATOINDICATORI

COLIFORMI

Fermentano il lattosio con produzione di gas e acido

Rappresentano un gruppo eterogeneo a cui appartengono le specie dei generi Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella

Si sviluppano a temperature tra 25-45°C (optimum a 37°C)

Microorganismi appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae

Bacilli Gram negativi, di forma bastoncellare

Escherichia coli

Microorganismo appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae

Bacillo Gram negativo, di forma bastoncellare

E’ un ospite normale dell’organismo umano

Si differenzia dagli altri coliformi in quanto fermenta il lattosio a 44°C

Produce indolo da triptofano (Reazione di Kovacs)

Si può trovare nel latte, nei formaggi, nel pollame

La concentrazione infettante minima è 106-108 ufc/ml

Esistono ceppi (O157:H7) responsabili di gravi epidemie

Rappresentano un gruppo eterogeneo a cui appartengono E. faecalis subsp. faecalis, E. faecalis subsp. faecium, E. faecalis subsp. liquefacens, S. bovis, S. equinus, ecc.

STREPTOCOCCHI FECALI

E. faecalis ed E. faecium sono le specie più frequentemente isolate dal tratto gastrointestinale e quindi la loro presenza nell’ambiente è correlabile con certezza a contaminazione fecale

Gli Enterococchi si identificano come quelle specie incluse nel nuovo genere Enterococcus

Appartengono al gruppo D della classificazione di Lancefield

Cocchi Gram positivi

Appartengono alla flora batterica degli animali a sangue caldo

Salmonelle

Bacilli gram negativi, anaerobi facoltativi

Appartengono alla famiglia delle Enterobacteriaceae

Il genere comprende oltre 2000 sierotipi

Fermentano il glucosio

Producono idrogeno solforato

La temperatura ottimale di crescita è 35-37°C

Non resistono al calore: 75°C per 10’

La loro presenza nell’ambiente indica l’esistenza di una contaminazione fecale primaria (immissione diretta di acqua di scarico) o secondaria (dilavamento di suoli)

Il trattamento di disinfezione delle acque ne riduce le concentrazioni (99% rimozione)

Listeria monocytogenes

Batterio Gram positivo, aerobio

Mobile per mezzo di flagelli

Sono ubiquitarie, possono trovarsi nell’acqua, nell’uomo, negli animali e in altre sorgenti ambientali

Non produce spore

Crescono anche a basse temperature

Sono in grado di produrre tossine, ma la patogenicità è dovuta alla capacità di moltiplicarsi nell’organismo

Pericolosa per le donne in gravidanza e per anziani

Pseudomonas aeruginosa

Bacillo gram negativo

Diffuso nel suolo, nell’acqua, nell’aria ma anche nelle feci ,nei liquami e negli ambienti umidi

E’ considerato indicatore degli scarichi (essendo più abbondante nei liquami che nelle feci)

La presenza di questo microrganismo non è legata a quella dei più usuali indicatori di inquinamento fecale

Ha la capacità di proliferare in mezzi minimi

Il fattore che determina il potere patogeno è la sua resistenza ad un gran numero di antibiotici, antisettici e disinfettanti

Si sviluppa anche in regime di frigo-conservazione

Presente nelle acque confezionate indicano scadenti condizioni igieniche dell’ambiente di imbottigliamento

La sua presenza è indice di inefficaci trattamenti di potabilizzazione

Aeromonas hydrophila

Batterio gram negativo, anaerobio facoltativo L'intervallo di temperatura per la crescita di Aeromonas hydrophila è compreso tra 4 e 42°C con optimum a 28°C I valori di pH sono compresi tra 6.5 e 7.2 con tolleranza da 4.5 a 8.8 Aeromonas hydrophila si moltiplica anche in atmosfera modificata (azoto, argon,ecc.) o sottovuoto Si sviluppa anche in regime di frigo-conservazione

• Le matrici alimentari più frequentemente associate a casi di gastroenterite da Aeromonas spp. sono acqua, vegetali conservati a lungo in frigorifero comprese le insalate pronte al consumo (IV gamma), crostacei e molluschi, gelati, insalate con maionese, piatti freddi

• Il genere Aeromonas comprende 3 specie mobili correlate a gastroenteriti: Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae e Aeromonas sobria. Il meccanismo patogenetico non è ancora del tutto chiarito.

ELMINTI

• Nelle acque reflue vengono ricercate le uova vitali mediante metodo della sedimentazione, flottazione e osservazione con vetrino di McMaster

• Sono animali microscopici, invertebrati senza appendici, con corpo cilindrico, arrotondato, fusiforme, posteriormente allungato in una coda.

• Il ciclo vitale comprende lo stadio di uovo, quattro stadi larvali ed uno adulto

• Hanno diffusione cosmopolita, vivono nelle acque dolci, nel mare e nel suolo

• Resistenza ai sistemi di clorazione e capacità di entrare nei sistemi di distribuzione

Isolamento di microrganismi responsabili di malattie infettive

1. RACCOLTA DEI CAMPIONE:

• Il campione deve provenire dalla zona dove è in atto l’infezione

• Si devono stabilire i periodi ottimali per la raccolta del campione onde avere maggiore possibilità di isolamento dei microrganismi patogeni

• Si deve prelevare una quantità di materiale sufficiente per permettere l’esecuzione delle tecniche di coltura richieste

• Si devono impiegare dispositivi di raccolta, contenitori per campioni e terreni di coltura idonei onde garantire un isolamento ottimale dei microrganismi

2. TRASPORTO DEL CAMPIONE

I campioni devono essere inviati in laboratorio il più presto possibile (max

2 ore) ed è necessario evitare condizioni ambientali sfavorevoli

(l’esposizione al caldo o al freddo eccessivi o l’essiccamento)

Enterococchi 12 (18)

Batteri e spore di Clostridi solfito-riduttori 48 (72)

Batteriofagi 48 (72)

Salmonella e altre Enterobatteriacee 12 (18)

Enterovirus 48 (72)

Cisti/oocisti di Giardia/Cryptosporidium 48 (72)

Amoebae 48 (72)

Staphylococcus 8 (12)

Pseudomonas aeruginosa 8 (12)

Legionella 48 (72)

Cianobatteri 48 (72)

Campylobacter 6 (8)

Uova di Elminti (a pH 2,0) 48 (72)

•Semina su terreno

liquido

solido

•Metodo MPN: semina di quantità scalari di campione

in superficie

per inclusione

•Filtrazione su membrana

3. ANALISI MICROBIOLOGICA ATTRAVERSO L’IMPIEGO DI

TERRENI DI COLTURA

ESAME MORFOLOGICO

…..Consiste

Nell’isolamento dei batteri presenti in un materiale impiegando in terreni più adatti allo sviluppo della specie di cui si desidera accertare la presenza

Si usano dei terreni solidi e il materiale viene seminato per strisciamento sulla superficie dell’area di semina, ciò consente di ottenere delle colonie sufficientemente distanziate per procedere poi alla loro identificazione

Dalle colture isolanti, soprattutto se eseguite su terreni selettivi ed indicatori si ottengono alcune informazioni che possono orientare e sul numero di specie batteriche presenti e sulla loro identificazione

Molto utili sono le caratteristiche cromatiche e l’aspetto delle colonie

IDENTIFICAZIONE MORFOLOGICA

Test di Kovacs

Test con KOH al 3%

•Colorazione di Gram: osservazione al microscopio

•Test rapidi

•Terreni selettivi ad opportune temperature di incubazione

Metodi analitici

Metodo delle diluizioni seriali

Metodo MPN (Most

Probable Number)

Metodo MPN (Most

Probable Number)

Ricerca quali-quantitativa nelle acque

FILTRAZIONE SU MEMBRANA

VANTAGGI

•Analisi di grandi volumi di acqua

•Conteggio diretto dei microrganismi presenti nel campione

•Minor tempo di incubazione

•Procedure di laboratorio semplificate