97

PACLITAXEL (TAXOL’un) ANTİ-KANSER ETKİ MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE

MOLEKÜLER DÜZEYDE İNCELENMESİ

Dr. Erhan Süleymanoğlu

Gazi Üniversitesi,

Eczacılık Fakültesi,

Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı,

Hipodrom,

06330-Ankara

ANKARA

2007

98

İÇİNDEKİLER

Proje Özet Bilgi Formu…………………………………………………………………………………….1 Proje ile ilgili Genel Hususlar……………………………………………………………………………3 Motivasyon ve Ankara’da Bulunan Araştırma Olanakları…………………………………….4

1. Giriş……………………………………………………………………………………………………..7 1.1. Kanser……………………………………………………………………………………….…….7 1.2. Kanserin Tedavi Şemaları……………………………………………………………………………8 1.2.1. Sistemik Tedavinin Temel Prensipleri…………………………………………………………..8 1.2.2. Kemoterapinin Prensipleri…………………………………………………………………………..9 1.2.3. Sistemik Moleküler Hedefli Terapilerin Temel Prensipleri…………………………….19 1.2.4. Gen Aktarımı ve Kanser Tedavilerindeki Rolü………………………………………………22 1.2.5. Gen Tedavisi ve Gen Nakli………………………………………………………………………….24 1.2.6. DNA Kompaktizasyonu ve Nanoparçacık Oluşumunu

Meydana Getiren Bileşenler………………………………………………………………………..33 1.3. Taxol® (Paclitaxel)…………………………………………………….……………………………….43 1.3.1. Kanser Tedavisinde ve Kanserin Önlenmesinde Taxol®‘un Rolü…………………….43 1.3.2. Taxol®’un ve Taxotere™’in Klinik Kullanımı……………………………………………..…..46 1.3.4. Taxol®’un Etki Mekanizması……………………………………………………………………….54 1.3.5. Projemin Bilimsel Dayanağı………………………………………………………………………..58 1.3.6. Literatür Özeti…………………………………………………………………………………………...60 2. Gereç ve Yöntem..………………………………………………………………………………………….61 2.1. Hücre Membranın Yapısı…………………………………………………………………………………61 2.1.1. Biyomembranların İçeriği……………………………………………………………………………..61 2.2. Biyolojik Membranların Sıvı Kristal Özellikleri………………………………………………….66 2.2.1. Lipid Çift Katman…………………………………………………………………………………………66 2.2.2. Membranın Fizikokmyasal Özelliklerini Etkileyen Faktörler…………………………….67 2.2.3. Lipid Fazlarını Etkileyen Faktörler ve Biyosistemlerdeki Önemi……………………….70 2.2.4. İlâçların Biyomembran Akışkanlığı Üzerine Etkisi…………………………………………..71 2.2.5. Biyomembran Akışkanlığının Anlamı……………………………………………………………..73 2.3. Biyomembran ve Model Membran Araştırmalarında

Kullanılan Başlıca Yöntemler……………………………………………………………………………..80 2.3.1. Biyofiziksel Yöntemler……………………………………………………………………………………81 2.3.1.1. Spektroskopik Yöntemler……………………………………………………………………………..81 2.3.1.2. Difference Spectroscopy………………………………………………………………………………84 2.3.1.3. Fourier Transform Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi………………………………………84 2.3.1.4. Raman Spektroskopisi………………………………………………………………………………..85 2.4. Langmuir-Blodgett Monolayer Yöntemi…………………………………………………………….85 2.4.1. Yüzeysel Gerilimin Wilhelmy Plate Yöntemiyle Ölçülmesi…………………………………87 2.4.2. Lipid Tek Katmanların Özelliklerinin İzoterm Yöntemiyle İncelenmesi……………..88 2.4.3. Sub-fazda Madde-Lipid Etkileşmelerinin İncelenmesi ve Lipid Moleküllerinin İşgal Etileri Alanın Ölçülmesi……………………………………………..88 2.4.4. Tek Katmanda Yer Alan Maddeler Arasındaki Etkileşmelerinin İncelenmesi…………………………………………………………………………….89 2.4.5. Tek Katmanlarda Maddelerin Karışım Oluşturma Özelliklerinin İncelenmesi…………………………………………………………………………………90 2.4.6. Tek Katmanlarda Bulunan Moleküllerin Yapısal Değişikliklerinin İncelenmesi……………………………………………………………………………..91 2.4.7. Tek Katmanın Sabitlilik ve Deformasyon Özelliklerinin Hesaplanması……………….92 2.4.8. İzoterm Şekillerinin Analizi ve Yorumlanması…………………………………………………92 2.4.9. Projemdeki Deneysel Tasarım………………………………………………………………………..93 2.4.10. Projemde Geliştirilen Yeni Deneysel Protokol………………………………………………..93 2.4.10.1. Kimyasallar………………………………………………………………………………………………93

99

2.4.10.2. Langmuir-Blodgett Tek Katmanın Oluşturulması………………………………………..94 2.4.10.3. Yüzey Basınç-alan (π-A) İzotermler…………………………………………………………….97 2.4.10.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri…………………………………………………….95 2.4.10.5. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektrometresi……………………………………..95 3. Bulgular……………………………………………………………………………………………………………..97 3.1. FTIR Ölçümleri………………………………………………………………………………………………..98 3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (Differential Scanning Calorimetry) Ölçümleri……………………………………………………112 3.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri………………………………………………………..119 4. Tartışma…………………………………………………………………………………………………………..163 4.1. FTIR Ölçümleri………………………………………………………………………………………………163 4.2. DSC Ölçümleri……………………………………………………………………………………………….173 4.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri……………………………………………………….175 4.3.1. Bu Projede Yapılan Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümlerinin Daha Önce Başka Bir Cihazla Yaptığım Ölçümlerle Kıyaslanması…………………………177 4.4. Taxol®-Fosfolipid Membran Arasında Oluşan Yapı……………………………………………186 4.5. Biyoteknolojik Boyut……………………………………………………………………………………….187 4.6. Hücresel ve Moleküler Biyolojik Boyut……………………………………………………………..192 4.7. Projemde Geliştirilen Tasarımın Diğer Analitik Uygulamalardaki Yeri………………..202 4.7.1. İlâç Ligandlarıın Ayrışımı ve Analizi için İmobilize Lipozom Kromatografisinin Geliştirilmesi………………………………………….202 4.7.2. Projenin Devamı Olarak Yapılması Öngörülen Ortak Çalışmalar……………………..207 4.7.3. Öncü Hipotez………………………………………………………………………………………………209 4.7.4. Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim…………………………………………….213 5. Sonuç……………………………………………………………………………………………………………….216 Eklerα…………………………………………………………………………………………………………………217

α Birçok Ek belge niteliğinde olduğundan bunlara sayfa numarası verilmemiştir.

100

PROJE ÖZET BİLGİ FORMU

Proje Kodu: 02/2005-15

Proje Başlığı: PACLITAXEL (TAXOL’un) ANTİ-KANSER ETKİ

MEKANİZMASININ MODEL LANGMUİR-BLODGETT

BİYOMEMBRAN SİSTEMİ İLE MOLEKÜLER DÜZEYDE

İNCELENMESİ

Proje Yürütücüsü ve Yardımcı Araştırmacılar:

Dr. Erhan Süleymanoğlu

Projenin Yürütüldüğü Kuruluş ve Adresi: Gazi Üniversitesi, Eczacılık

Fakültesi, Merkez Laboratuvarı ve Farmasötik Kimya Anabilim Dalı,

Hipodrom, 06330-Ankara

Destekleyen Kuruluş(ların) Adı ve Adresi: Gazi Üniversitesi, Bilimsel

Araştırmalar Projeleri Daire Başkanlığı

Projenin Başlangıç ve Bitiş Tarihleri: Ekim-2005-Ekim-2007

Türkçe Özet: Bu çalışmada, kemoterapide yoğun olarak kullanılan Taxol® (Paclitaxel) ile farklı

zincir yapılarına ve elektrostatik özelliklerine sahip fosfolipidler arasında oluşan moleküler

etkileşmeler Langmuir-Blodgett tek katman, FTIR ve DSC ölçümleriyle incelenmiştir. Sınır

yüzeylerde oluşturulan lipid tek katman ve lipid veziküllerinde (lipozom) yer alan lipid çift

katmanlar model hücre zarları olarak uygulanmıştır. Neticeler, Taxol® konsantrasyonuna, pH,

T°C, tampon sistemine, hidrofobik ve elektrostatik ortama bağlı olarak açıklanmıştır. İlâç ile farklı

fosfolipid molekülleri arasındaki etkileşmelerinin sonucu olarak meydana gelen “self-assembly”

agregatlarının sekonder yapısal değişiklikleri FTIR spektroskopisi ile incelenmiştir. Elde edilen

veriler, karbonil, fosfat, kolin ve CH2 gruplar seviyesinde değerlendirilmiştir. Tek katmanda

meydana gelen ilâç-fosfolipid etkileşmeleri ara yüzeydeki lipidlerin moleküler alanlarına

bağımlılık göstermektedir. Taxol®’un, fosfatidilkolin türü zwitteriyonik lipidler ile termodinamik

olarak sabit yapılar oluşturduğu DSC ölçümleri ile ortaya çıkarılmıştır. Tek katmanda oluşan söz

konusu yapıları Brewster Angle (BAM), atomik kuvvet (AFM), floresan ve Raman mikroskopi

yöntemleriyle de görüntülemeyi ümit ediyoruz. Bu farmasötik nanoformülasyonlarının in vivo

101

ortamda hücre zarı akışkanlığı üzerindeki muhtemel etki mekanizması ile ilgili yeni bir hipotez de

sunulmuştur.

Bu çalışma Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Daire Başkanlığı tarafından

İngilizce Özet:

Abstract: Introduction: The current study reports our last results of recent project on the role of biomembranes in cancer therapeutics.

Aim: The objective is to emphasize their relevant physicochemical features in depicting molecular mechanisms of action of antineoplastic agents with further implications in drug design.

Methods: Langmuir-Blodgett monolayers were used to simulate lipid surface of cell membranes of both normal and cancer cells trying to approach surface forces governing molecular interactions between various phospholipids and Paclitaxel (Taxol®)-a widely used anticancer drug. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy was applied for following subsequent changes in lipids after drug recognition trying to relate this to its fluidizing effect. This was further studied by Differential Scanning Calorimetric (DSC) measurements, which showed further thermodynamic characteristics of drug-lipid interaction.

Results and Discussion: Biophysical analysis showed that miscible drug-lipid complexes form at air/water interface, followed by instability of the monolayer due to their interaction. Spectroscopic and thermodynaic measurements showed the phase separation, the extend of liquid-condensed phases, as well as microdomain formation in monolayers. We are also trying to apply Atomic Force Microscopy (AFM), Brewster-Angle Microscopy (BAM) and Raman Microscopy to extend our previously proposed model of the role of phospholipid specificity of Taxol® and its cellular effects. Relevant physicochemical reasoning and models will be presented in more detail.

Acknowledgements: This work was supported by Gazi University Research Fund (Project

No: 02/2005-15).

Anahtar Kelimeler: Paclitaxel (Taxol®), Model ve Biyomembranlar, Tümör Hücre

Zarı Akışkanlığı, Langmuir-Blodgett Tekkatman, İlâç-fosfolipid etkileşmeleri.

Projeden Kaynaklanan Yayınlar: 2 makale ve 4 poster sunumunun

yapılması plânlanmıştır. Tüm bunlar hazırlanma aşamasındadır.

Bilim Dalı: İnterdisipliner

Doçentlik B. Dalı Kodu: Yok G. Ü. Akademik Yükseltilme

ve Atanma Ölçütlerine göre puan durumum: 835

102

Proje ile ilgili genel hususlar.

İlâçlarla organizma arasındaki oluşan karmaşık tepkimeler ve yolaklar

hücresel ve moleküler düzeyde yapılan incelemelerinin önemini artırmıştır. Hücre ile

ilâçlar arasında ilk temas noktası biyolojik lipid zarlardır. Bu bağlamda, çeşitli ilâç-

hücre etkileşmelerindeki lipid zarların rolü küçümsenemez ve bunlarla ilgili elde

edilen veriler son derece önemlidir. Bu verilere dayanarak çeşitli ilâçların etki

mekanizmalarının daha iyi anlaşılması sağlanmaktadır. Günümüzde kullanılan

birçok farmasötik formülasyon amfifilik veya katamfifiliktir ve bu özellikler sayesinde

biyolojik zarlarla tepkimelere girmektedirler.

Çeşitli antibiyotiklererin, anti-enflamatuarların ve anestetiklerin model ve

biyolojik membranlar üzerinde etkileri uzun yıllar önce araştırmacıların dikkatini

çekmiş ve ayrıntılı olarak farklı düzeneklerde incelenmiştir. Bu araştırmalar

sayesinde, örneğin anestetiklerin etki mekanizması ile ilgili, halâ geçerliliğini

yitirmemiş lipid teoriler ortaya atılmıştır1 ve birçok farmakodinamik modeller bu

teorilerine dayanmaktadır. Söz konusu modeller farklı ilâçların etki mekanizmalarına

da uyarlanmaya çalıştırmıştır. Diğer yandan, normal hücre ile kanser hücrenin

akışkanlığında önemli farklılıklar ortaya çıkarılmıştır ve bu buluşlar anti-kanser

ilâçların membran üzerinden çalışan bileşenler olarak algılanması gerektiği

konusunu da gündeme getirmiştir.

Sunduğum bu projede de, kemoterapilerde yoğun olarak kullanılan Taxol

(Paclitaxel) ile kanser hücreyi2 modelleyen çeşitli membran modelleri arasında

oluşan etkileşmeler ele alınmıştır. Projemin iki boyutu vurgulanmıştır. Bunlardan ilki

biyoteknolojik boyut olup, çeşitli lipidlere dayalı kontrollü salınım sistemlerdeki

Taxol-fosfolipid komplekslerinin oluşumu üzerine durmaktadır. Günümüzde

kullanılan birçok çok halkalı (heterosiklik) farmasötik formülasyonların hidrofobik

özelliklerinden dolayı çözünürlülük sorunu ortaya çıkmıştır ve bunların biyolojik

1 Bu öncü teoriler için Bk.: Trudell JR. A unitary theory of anesthesia based on lateral phase separations in nerve membranes. Anesthesiology. 1977 Jan;46(1):5-10. Seelig A, Allegrini PR, Seelig J. Partitioning of local anesthetics into membranes: surface charge effects monitored by the phospholipid head-group.Biochim Biophys Acta. 1988 Apr 7;939(2):267-76. Suezaki Y, Tatara T, Kaminoh Y, Kamaya H, Ueda I. A solid-solution theory of anesthetic interaction with lipid membranes: temperature span of the main phase transition. Biochim Biophys Acta. 1990 Nov 2;1029(1):143-8; Jibu M. Theory of cell membrane organizers and pressure reversal of anesthesia. Med Hypotheses. 2001, Jan;56(1):26-32. 2 Kanser hücre yüzeyini (cancer cell surface) olarak ifade edilmesi çok daha doğru olacaktır.

103

sıvılarda uygulama etkinliğini olumsuz etkilemektedir. Bu yüzden, çözünürlülük

sorununu bazı kontrollü salınım sistemleri ile çözmeye çalışılmaktadır. Ancak, bunun

için ilâç-lipid kompleks oluşumunun ön incelemesi gerekmektedir ve bu önemli konu

projemde de ele alınıp değerlendirilmiştir. Bu tür fizikokimyasal verilere dayanarak

daha sonraki ilâç geliştirme aşamalarında yeni, tedavi potansiyeli ve özellikleri

iyileştirilmiş anti-kanser formülasyonlarının geliştirilmesini mümkün kılmaktadır.

Projemin ikinci boyutu ise bu anti-neoplastik ajanın hücre seviyesindeki etki

mekanizması ile ilgilenmekte ve böylece daha fundamental moleküler biyolojik

vurguları içermektedir. Örneğin, günümüzde geçerli olan depolimerizasyona karşı

hücre mikrotübüllerin stabilizasyonunu sağladığı mekanizması3, Taxol‘un tüm

moleküler düzeyde gösterdiği etkileri açıklamak için yeterli değildir. Örneğin, bir

membran proteini olan ve kemoterapiye direnç mekanizmalarının ortaya çıkmasında

sorunlu olan P-glikoprotein (P-gp) tam olarak nasıl çalıştığını ve etki ettiğini

anlayabilmek için, çeşitli anti-neoplastik ilâçların bu gibi ortamda nasıl davrandıkları

konusunun önemini artırmaktadır. Başka bir deyişle, moleküler düzeyde herhangi bir

anti-kanser terapinin geliştirilmesi için bu ilâçlarla kanser hücre membranları

arasında oluşan etkileşmelerinin ortaya çıkarılmasını gerektirmektedir. Bu bağlamda,

Taxol ile fosfolipidler arasındaki moleküler bağlar, güçler ve etkileşmeler

vurgulanmıştır. Bu olayların daha iyi anlaşılması amacıyla ilk önce bu projemin kesin

raporunda geniş bir giriş bölümüne yer verilmiştir. Söz konusu bu bölüm, projemi

inceleyecek olanlara yukarıda bahsedilen bu 2 ayrı boyutu da daha iyi

algılayabilmelerini sağlayacaktır.

Motivasyon ve Ankara’da bulunan araştırma olanakları.

Sunduğum projede, özellikle nanoteknolojik boyut vurgulanmıştır. Bunun için

de çok sağlam dayanaklarım ve ciddi sebeplerim vardı. Her şeyden önce, arzu ettiğim

cihazların yerine Ankara’da mevcut olan imkânları ve üniversitemizin çok kısıtlı proje

bütçesini göz önünde bulundurarak proje konusunu kararlaştırdım. Bu bağlamda,

Fakültemizde çok yetersiz bir altyapı ortamında ve tek başıma yürütebileceğim bir

projeyi tasarladım4. Sonuç olarak, bu proje sayesinde nanoteknolojinin temellerini

3 Taxol‘un etki mekanizmasına aşağıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak yer verilmiştir. 4 Fakültemizde göreve başlar başlamaz daha 04 Şubat 2004 tarihinde yapılan bir Fakülte toplantısında yönetim tarafından benden ve diğer 2 uzman arkadaşımızdan tek başımıza proje çalışması çıkarmamız istenmiştir. Bu toplantıda ayrıca Üniversitemizin herhangi bir uluslararası boyutu olmadığı ve ulusal sıralamada bile yeri

104

oluşturan “self-assembly” olarak meydana getirilen biyomakromolekül komplekslerin

araştırıldığı ve fizikte, kimyada, malzeme biliminde, tıpta ve biyonanoteknolojide

uygulama potansiyeli olan orijinal bir cihaz Fakültemize alınmıştır. Bunun için de

ulusal yükseköğretim stratejileri (Bk.:

http://www.yok.gov.tr/duyuru/strateji_gorus.htm) ve üniversitemizin strateji plan

geliştirme programı (http://www.strateji.gazi.edu.tr/) esas alınmıştır. Projemdeki bu

vurgu uluslararası proje destek programlarına katılmamız bakımından da önemlidir,

çünkü Avrupa Birliği’nin gerek 6cı, gerekse 7ci çerçeve programlarında öncelikli konu

başlıklarına önem verileceği ayrıca vurgulanmaktadır (Bk.: www.fp7.org.tr). Söz

konusu başlıklar arasında genom bilimler ve nanoteknolojiler başı çekmektedir ( Bk.:

cordis.europa.eu/fp7/home_en.html;http://www.innovation.public.lu/servlet/front).

Ancak bu proje destek programlarına Türkiye’den çok az sayıda proje gönderilmiştir.

Bu arada, ülkemizde de ulusal nanoteknoloji stratejileri geliştirilmiştir5. Bu tür

nanoteknoloji çalışmaları da en ileri düzeyde Ankara’da yapılmaktadır. Bunun için de

gereken altyapıyı ve AR-GE olanakları kurulmuştur. Örneğin, O. D. T. Ü.’inde birkaç

seneden bu yana Nanoteknoloji Merkezi faaliyet göstermektedir. Ayrıca, aynı

üniversite Avrupa Birliği kaynaklarından 1.5 milyon EU’luk subvansiyon sayesinde

Merkez Laboratuvaru kurmuştur (Bk.: www.centrallab.metu.edu.tr). Bu Merkez

Laboratuvarın Ocak-2006 tarihinde kurulmuş olup, asıl amacı üniversitelere ve

sanayi kuruluşlarına bilimsel destek ve yürütülmekte olan projelerde öçlüm

olanakları sağlamaktır. Avrupa Birliğinden akreditasyon alan tek kuruluş O. D. T. Ü.

Merkez Laboratuvarıdır. Bu projemin ön ölçüm kısmını oluşturan FTIR ve DSC

ölçümlerini bu laboratuvarda yaptım.

Bunun dışında, Bilkent Üniversitesinde Devlet Plânlama Teşkilâtından alınan

25 Milyon Dolarlık proje ile büyük bir alana yayılmış Ulusal Nanoteknoloji Merkezi

(Bk.: www.nano.bilkent.edu.tr) kurulmuştur ve bunun da 2 yıla kadar tamamlanması

beklenilmektedir. Hacettepe Üniversitesi Beytepe kampüsünde de birçok

nanoteknolojik projenin yürütüldüğü BİYOMEDTEK Merkezi kurulmuştur

(www.biyomedtek.com). Yakın bir tarihte de, Teknopark açılacaktır

(www.teknopark.hacettepe.edu.tr). Buna paralel olarak, Ankara Üniversitesi 5 sene

önce Devlet Plânlama Teşkilâtından almış olduğu 8 Milyon Dolarlık proje desteği ile

istenilen düzeyde olmadığı (bunun için bk.: Ek-1 ve Ek-2) ve Fakültemizde cihazların son derece demode ve eski olduğu gerekçe gösterilerek tarafımdan orijinal proje çıkarmam rica edilmiştir. 5 Bk.: Ek-3.

105

Biyoteknoloji Enstitüsü kurmuştur. Daha sonra, bu enstitüye bağlı Merkez

Laboratuarı da kurulmuştur (Bk.: http://www.biotek.ankara.edu.tr/).

Görüldüğü gibi, Ankara’da bulunan diğer üniversitelerde bu tür büyük

yatırımlar yapılırken üniversitemizde bu ölçekte henüz daha herhangi bir girişim

olmamıştır. Ancak, son yıllarda üniversitemizde de büyük gelişmeler kaydedilmiştir.

Şöyle ki, Yarıiletken Araştırma Merkezine bağlı bir Nano-Club faaliyete başlamıştır.

Ancak, bu birimin biyonanoteknolojiye hitap etmemektedir, daha ziyade mühendislik

bilimleriyle ilgilenmektedir. Ancak, bunun dışında, yakında çok önemli olan Ulusal

Nanotıp Konsorsiyumu üniversitemizde kurulmuştur (Yarıntılı bilgi için Bk: Ek-4) ki,

bu çok isabetli bir gelişmedir. Üniversitemizin6 Teknoparkı da tamamlandığında

uluslararası düzeyde nanoteknolojik araştırmaların yapılabileceği ümit edilmektedir.

Ancak, bu tür merkezleri diğer araştırma merkezlerle yarışabilir düzeyde

tutabilmek için büyük ölçekli, sürekli ve uzun vadeli projeler çıkarmak

gerekmektedir. Projemi de bu amaçla sundum. Şimdiye kadar Fakültemizde herhangi

bir nanoteknoloji başlıklı proje çıkarılmadığı gibi laboratuvar donanımı da son derece

yetersizdir. Projemi de bu iki hususu göz önünde bulundurarak yazdım. Bu

doğrultuda, cihaz alımı ile sonuçlanabilecek bir proje teklifi sunulmuştur. Tüm

zorluklara rağmen, projemi tamamlamış bulunmaktayım. Ancak, bu aşamadan sonra

bunun devamı da gelmelidir. Bu yüzden daha şimdiden ulusal ve uluslararası proje

destekleme kuruşlarına çok daha kapsamlı bir projemi daha sunmak üzereyim (Bk.:

Ek-16).

6 Üniversitemizin büyük çabaları ve girişimleri sayesinde ayrıca Ulusal Kızılötesi ve Sinhrotron Araştırma Merkezi de kurulma aşamasındadır.

106

1. Giriş.

1.1. Kanser7.

Kanser terimi ile, bu projemin kesin raporunun kapsamına ve amacına uygun

olarak hücresel büyümedeki düzenleme mekanizmalarında meydana gelen önemli

hasarlar gösteren birçok hastalık kastedilmektedir. Bu konu son derece hızlı

geliştiğinden ve çok geniş olduğundan, kanser ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için

aşağıdaki dipnotta vermiş olduğum geniş ve güncel kaynakçaya başvurulmalıdır.

Tarihsel olarak, kanser araştırmaları bir hayli deskriptiv olmuştur. Başka bir

deyişle, birçok araştırmacı normal hücrelerle onkogenik hücreler arasında

gözledikleri farklılıkları kataloglaştırmışlardır. Uzun yıllar boyunca hastalığın etkileri

nedenlerinden çok daha iyi incelenmiştir. Son yıllarda, birkaç kanser türü üzerinde

moleküler düzeyde yapılan araştırmalar sayesinde metastaz oluşum mekanizmaları,

tümörlerin bağışıklık sisteminden tanınmaları ve yok edilmeleri gibi çok önemli olan

konular bağlamında, tümör hücrelerinin bazı özelliklerinin anlaşılmasını mümkün

kılmıştır.

Tümör hücreleri intraselüler (hücre içi) haberleşme (intracellular

communication) mekanizmalarında birtakım hasarları içerdiklerinden, bunların

patolojik davranışlarındaki plazma membranının8 da muhtemel rol oynayabileceği

tahmin edilmektedir (Petty, H. R., 1993). Gerçekten de, projemde anti-neoplastik

ilâçların biyoteknolojik uygulamaları dışında, tümör hücre membran akışkanlığı

7 Bu bölümle ilgili daha ayrıntılı bilgiler için özellikle bk.:

1. Advances in Molecular Oncology (Advances in Experimental Medicine and Biology) (Advances in Experimental Medicine and Biology), by Fabrizio d'Adda di Fagagna (Editor), Susanna Chiocca (Editor), Fraser McBlane (Editor), Ugo Cavallaro (Editor); Springer; 1 edition (July 12, 2007).

2. Targeted Molecular Imaging in Oncology, by E. Edmund Kim and David J. Yang (Editors), Springer; 1 edition (January 15, 2001).

3. Principles of Molecular Oncology, by Miguel H. Bronchud, MaryAnn Foote, Giuseppe Giaccone, Olufunmilayo I. Olopade, Paul Workman (Editors), Humana Press; 3rd ed. edition (November 30, 2007).

4. The Molecular Biology of Cancer, by Michael Khan, Stella Pelengaris (Editors), Wiley-Blackwell; 1 edition (February 28, 2006).

5. Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics,by Lauren Pecorino, Oxford University Press, USA; 1 edition (May 21, 2005).

6. F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York.

7. The Biology of Cancer, by Robert A. Weinberg, Garland Science; 1 edition (June 9, 2006). 8 Projemin de hücresel boyutu söz konusu model normal ve tümör plazma membran (zar) akışkanlığı üzerinde odaklanmaktadır. Bunun için özgün bir de öncü hipotez geliştirilmiştir. Daha ayrıntılı bilgiler için bu proje kesin raporumun yorumlar bölümünde yer almaktadır.

107

üzerindeki muhtemel etkilerini vurgulamaktadır. Onkogenler ve kansere yol açan

genlerin ürünleri ligandlar, reseptörler ve sitozolik sinyalleşme aygıtlar gibi normal

büyümeyi sağlayan transmembran sinyal iletim elemanlarının farklı şekillerinden

ibarettir. Bu gen ürünleri, sinyal iletiminin şu ana kadar geliştirilmiş en iyi, ancak

henüz daha yetersiz olan modelini teşkil etmektedir. Bazı tümör hücrelerin membran

taşıyıcıları bunları kemoterapötik ilâçlara karşı korumaktadır. Adherence-promoting

membran proteinlerinin yetersiz ekspresyonu metastaza yol açmaktadır (Petty, H. R.,

1993). Tümör antijenlerinin intraselüler aktarımları ve bunu takiben plazma

membranlardaki ekspresyonları immün sistem trafından indüklenen destrüksyonu

ortaya çıkarmaktadır (Petty, H. R., 1993; Cereijido M, et al., 2007; Chidgey M,

Dawson C., 2007; Ma DW., 2007; Song RX., 2007; Baritaki S. et al., 2007)9. Bu konu,

projemin yorum bölümünde ölçümlerden elde edilen neticeler doğrultusunda tekrar

ele alınmıştır.

1.2. Kanserin Tedavi Şemaları.

1.2.1. Sistemik Tedavinin Temel Prensipleri

Büyüme mekanizmalarının da kontrolden çıkmasını takiben muhtemel olarak

tek hücreden veya birkaç hücreden ortaya çıkan malign tümör genel olarak heterojen

tümör popülasyonundan ibarettir. Bu hücreler daha sonra komşu dokulara göç

ederek bunların da malign tarnsformasyonuna neden olup, kendi vaskülatürünü

geliştirip lenfatik ve hematolojik dağılım göstermek suretiyle metastazlara neden

olmaktadır. Metastaz olan hastalarda kanserin bir sistemik hastalık olarak ele

alınması gerektiği ve cerrahi veya radyoterapi gibi konvansyonel yaklaşımların

yetersiz olacağı açıktır. Bu bağlamda, günümüzde kanser hastaların bakımı cerrahi,

radyoterapi ve sistemik tedavilerini de içeren multidisipliner bir yaklaşımı gerektirir

(Sliifer S ve Stoter G. , 2005).

9 Bk. özellikle: Chapter 9: Membranes in Cancer, In: Howard R. Petty, Molecular Biology of Membranes-Structure and Function, Plenum Pres, New York and London, 1993, pp. 353-377; Cereijido M, Contreras RG, Flores-Benítez D, Flores-Maldonado C, Larre I, Ruiz A, Shoshani L. New diseases derived or associated with the tight junction. Arch Med Res. 2007 Jul;38(5):465-78; Chidgey M, Dawson C. Desmosomes: a role in cancer? Br J Cancer. 2007 Jun 18;96(12):1783-7; Ma DW. Lipid mediators in membrane rafts are important determinants of human health and disease. Appl Physiol Nutr Metab. 2007, Jun;32(3):341-50; Baritaki S, Apostolakis S, Kanellou P, Dimanche-Boitrel MT, Spandidos DA, Bonavida B. Reversal of tumor resistance to apoptotic stimuli by alteration of membrane fluidity: therapeutic implications. Adv Cancer Res. 2007;98:149-90 ve Song RX. Membrane-initiated steroid signaling action of estrogen and breast cancer. Semin Reprod Med. 2007 May;25(3):187-97.

108

Kanser hastalarının 60%’dan fazlasında metastazların görüldüğünden, çoğu

kez sistemik olarak etki eden ajanlarla tedavilere başvurulmaktadır. Bu şekilde

sistemik etki mekanizmasına sahip anti-tümör ajanları 3 ayrı gruba dahil

edilmektedir: sitotoksik ilâçlar, hormonal ajanlar, ve biological responce modifiers

adlı bileşenler. Bu gruplarda yer alan çeşitli ajanlar yıllarca uygulanmışlardır (Sliifer

S ve Stoter G., 2005)10. Daha spesifik olarak temel kanser hücre biyolojisi,

farmakoloji, endokrinoloji konulu araştırmalar, ve yeni bileşenlerin ve yeni tedavi

stratejilerin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır. Bunlara ilâve olarak, başarılı

kanser tedavilerin neticesinde uzun süreli olarak sağlığına kavuşan kişilerin

sayısındaki artış göz önünde bulundurulduğunda, daha sonraları görülen bazı

toksisitelerinin de önemi artmıştır.

1.2.2. Kemoterapinin Prensipleri.

Kemoterapötik ilâçların önemli bir özelliği hızlı bölünen hücrelere hasar

vererek hücre ölümüne yol açmalarıdır. Hücre hasarı farklı etki mekanizmalarına

sahip birkaç tür sitotoksik ilâçlar tarafından meydana getirilir (Bk.: Tablo-1 ve Şekil

1.1)11.

10 Tarihçeleri için bk.: Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514. 11 Projem güncel olan ve çok yoğun olarak kullanılan Taxol® ile ilgilidir. Ancak kemoterapilerde kullanılan birçok antikanser ilâcı daha mevcuttur. Tüm bunlarla ilgili okuyuculara daha ayrıntılı bilgi vermek amacıyla bu kesin raporumun sonunda Ek-14 verilmiştir.

109

Tablo-1: Bazı sitotoksik ilâçlar.

(Kaynak: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F.

Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and

Francis, New York, pp. 35-49).

110

Şekil 1.1. Bazı popüler anti-kanser ilâçların etki mekanizmaları (Bk.:

www.chemotherapy.com; Ayrıca bk.: Danimarka Kraliyet Kanser Araştırmaları

Enstitüsü- www.cancer.dk)12.

12 Kemoterapinin hücresel boyutu ile ilgili aşağıdaki kaynaklara başvurulmalıdır:

1. Gossage L, Madhusudan S., Cancer pharmacogenomics: role of DNA repair genetic polymorphisms in individualizing cancer therapy. Mol Diagn Ther. 2007;11(6):361-80.

2. Mandal S, Varma K, Jain S., Cutaneous manifestations in non-Hodgkin's lymphoma. Acta Cytol. 2007 Nov-Dec;51(6):853-9.

3. Hamm C, Verma S, Petrella T, Bak K, Charette M; On behalf of the Melanoma Disease Site Group of Cancer Care Ontario’s Program in Evidence-based Care. Biochemotherapy for the treatment of metastatic malignant melanoma: A systematic review. Cancer Treat Rev. 2007.

4. Cordes N, Park CC., β1 integrin as a molecular therapeutic target. Int J Radiat Biol. 2007;83(11):753-760.

5. Nicolson GL, Conklin KA. Reversing mitochondrial dysfunction, fatigue and the adverse effects of chemotherapy of metastatic disease by molecular replacement therapy. Clin Exp Metastasis. 2007 Dec 5.

6. Korbelik J, Cardeno M, Matisic JP, Carraro AC, MacAulay C., Cytology microarrays. Cell Oncol. 2007;29(5):435-42.

7. Cellular Oncology, Mol Diagn Ther. ve Cancer dergileri son derece faydalı bilgiler içermektedir.

8. Vattemi E, Claudio PP. Tumor suppressor genes as cancer therapeutics. Drug News Perspect. 2007 Oct;20(8):511-20.

9. Xi Y, Edwards JR, Ju J. Investigation of miRNA Biology by Bioinformatic Tools and Impact of miRNAs in Colorectal Cancer-Regulatory Relationship of c-Myc and p53 with miRNAs. Cancer Inform. 2007;3:245-253.

10. Hoskin DW, Ramamoorthy A., Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 2007 Nov 22.

11. Cuzick J, Cafferty FH, Edwards R, Møller H, Duffy SW. Surrogate endpoints for cancer screening trials: general principles and an illustration using the UK Flexible Sigmoidoscopy Screening Trial. J Med Screen. 2007;14(4):178-85.

12. Singh VK, Jia Z. Targeting synuclein-gamma to counteract drug resistance in cancer. Expert Opin Ther Targets. 2008 Jan;12(1):59-68.

111

Söz konusu sitotoksil ajanların bu hücre hasarını hangi boyutta ve şiddette

meydana getirdikleri ise genel olarak hücresel ve farmakolojik özelliklere bağlıdır.

Sitotoksik tedaviye karşı bazı tümörlerin duyarlılığını etkileyen faktörler arasında

şunlar sıralanabilir:

- Hücre döngüsü zamanı ve “doubling time”.

- Büyüme fraksiyonu

- Sitotoksik ilâçlara karşı duyarlılık

- Tümör heterojenliği.

Bir ilâcın anti-tümör etkinliğini tayin eden farmakolojik özellikler ise

şunlardır:

- İlâç konsantrasyonu

- İlâca maruziyet zamanı.

Başlangıçta, kemoterapinin tümör hücrelerini nasıl etkilediği konusunda

lösemi L1210 deneysel sıçan (murine) modeli kullanılarak önemli veriler elde

edilmiştir (Skipper H. E., 1979). Bu modele göre, bir tümör eksponensiyel olarak sabit

bir “doubling time” ile ilerler ve yarı logaritmik kağıt üzerine büyüme hızı çizildiğinde

Şekil 1.2-(A)’daki eğriyi oluşturur.

13. Johansson Swartling F. Identifying candidate genes involved in brain tumor formation. Ups J Med Sci.

2008;113(1):32-71. 14. Cheng HY, Obrietan K. Revealing a Role of MicroRNAs in the Regulation of the Biological Clock.

Cell Cycle. 2007 Oct 1;6(24). 15. Lo AS, Zhu Q, Marasco WA. Intracellular antibodies (intrabodies) and their therapeutic potential.

Handb Exp Pharmacol. 2008;(181):343-73. 16. Namiki M, Ueno S, Kitagawa Y, Konaka H, Mizokami A, Koh E, Fukagai T. Hormonal therapy. Int J

Clin Oncol. 2007 Dec;12(6):427-32. 17. Keeble JA, Gilmore AP. Apoptosis commitment--translating survival signals into decisions on

mitochondria. Cell Res. 2007 Dec;17(12):976-84. 18. Tejpar S. The use of molecular markers in the diagnosis and treatment of colorectal cancer. Best Pract

Res Clin Gastroenterol. 2007;21(6):1071-87. 19. McGrogan BT, Gilmartin B, Carney DN, McCann A. Taxanes, microtubules and chemoresistant breast

cancer. Biochim Biophys Acta. 2007 Nov 12. 20. Jacob K, Sollier C, Jabado N. Circulating tumor cells: detection, molecular profiling and future

prospects. Expert Rev Proteomics. 2007 Dec;4(6):741-56. 21. Kischel P, Waltregny D, Castronovo V. Identification of accessible human cancer biomarkers using ex

vivo chemical proteomic strategies. Expert Rev Proteomics. 2007 Dec;4(6):727-39.

112

Şekil 1.2. (A): Yarı logaritmik kağıt üzerine çizilmiş eksponensiyel tümör

büyüme kinetiği. (B): Bu şekilde büyüyen bir tümörün antineoplastik ilâçla

muamelesi. Ok işaretleri ilâcın uygulanma sıklığını göstermektedir (Bk.: Sliifer

S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H.

Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis,

New York, pp. 35-49).

Şekil 1.2.’de, tümörlerin beli bir yüzdeliğinin öldürüldüğünü göstermektedir ve

bu olay “fractional cell killing” olarak adlandırılır. Bu şekilde, ilâç konsantrasyonunun

yükseltilmesi öldürülen tümörlerin yüzdeliğini de etkilemektedir. Bu modele göre,

öldürülen hücrelerin oranı tümör hücrelerin toplam sayısına bağımlılık

göstermektedir. Bu modele göre, ilâç uygulaması yeterli miktarda ve sıklıkta yapıldığı

takdirde, bir tümörü tamamen yok etmek mümkündür.

Ancak, daha sonra, bu model, hastalar için pek uygun olmadığı ortaya

çıkmıştır (Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F.

Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and

Francis, New York, pp. 35-49). Sitostatik ilâçların genelde hızla bölünen hücreler

fraksiyonuna karşı çok etkili olduklarından, tümör hücrelerinin önemli bir bölümü

etkilenmeyecektir. Prensip olarak, tümör hücre büyüme faktörlerinin uygulanması

113

tümör hücre bölünmesini de artıracaktır ki, bu olaya “recruitment” veya “priming of

tumor cells” adı verilmektedir.

L1210 modeli ile katı tümörler arasındaki ikinci önemli fark ise büyüme

fraksyonu ile “doubling time” arasındaki ilişki sabit olmadığı ve tümör büyüklüğüne

göre farklılaştığı gözleminden ileri gelmektedir.

İlk başta, bir tümör L1210 modelinde olduğu gibi eksponensiyel büyüme hızı

gösterir. Ancak, daha sonra, tümörün büyüklüğü artığında henüz daha

açıklanamayan nedenlerden dolayı büyüme hızı durur. Büyüme hızı ile zaman

arasındaki bu tür ilişki, Gompertz tipi olarak da adlandırırılan sigmoidal eğri ile ifade

edilmektedir (Şekil 1.3-A). Büyüme hızı ile tümör büyülüğü arasındaki bu ilişki

kemoterapi şemalarının geliştirilmesinde önemli bir motivasyon sebebini

oluşturmuştur.

Şekil 1.3. (A): Sigmoidal tümör büyüme hızı. (B) Sigmoidal büyüme hızına

sahip bir tümörün belli bir ilâç dozuyla uyarlanması. Kemoterapiden kaynaklanan

tümör büyüklüğündeki azalma, büyüme fraksyonu artırmakta ve geriye kalan

tümörlerin büyüme hızındaki artış meydana gelmektedir (Bk.: Sliifer S ve Stoter G.

Chapter 2: Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye

(Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).

Kemoterapinin etkinliğini etkileyen başka bir faktör de tümör hücrelerinin

konsantrasyonudur (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic

114

Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical

Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49). İlâçlara karşı direncin meydana

gelmesi birkaç mekanizmayla açıklanmaktadır. Tümör hücrelerinde P-glikoprotein ve

multidrug-related protein (MRP) gibi ilâç pompalarının ekspresyonu kemoterapiye

karşı direncin gelişmesindeki başlıca nedenidir. Diğer direnç mekanizmaları tümör

hücrelerince alınan ilâç miktarındaki düşüş, ilâç detoksifikasyonu veya tümör

hücrelerinin kemoterapiden kaynaklanan DNA hasarını onarım kapasitesini

artırmaları sayesinde meydana gelmektedir (Bk.: Tablo-2).

Tablo-2. Hücresel İlâç Direncinin ve etkilenen Sitotoksik İlâçların Etki

Mekanizmaları (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic Therapy.

In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor

and Francis, New York, pp. 35-49 ).

Ancak, şimdiye kadar sıralanan mekanizmalardan, en önemlisi apoptoza13 yol

açan hücresel yolaklardaki patolojilerdir. Son yıllarda kemoterapiden kaynaklanan

programlanmış hücre ölümünü14 indükleyen mekanizmalar hakkında önemli bilgiler

13 Programlanmış hücre ölümü. 14 Programlanmış hücre ölümü kavramı 1989li yıllarda Almanya’da Heidelberg Üniversitesinde Catastrophy

Theory’nin bir matematiksel modeline dayanmaktadır. İlk önce normal hücre döngüsünde scenescence

doğrultusunda ilerleyen hücre bölünme olaylarını açıklamak için ele alınmıştır. Daha sonra İskoçya’da Glasgow Üniversitesinde Dr. Renato Baserga’nın ve diğer birçok araştırmacının geliştirdiği kanser hücre kültürü düzenekleri sayesinde bu hücresel olay kanser gibi patolojik olaykara da aktarılmıştır. Bu konuda yığınlarca yayın bulunmaktadır. Ancak bu kesin raporun amacı için şunlara başvurulması tavsiye edilebilir:

115

elde edilmiştir. Kemoterapiden kaynaklanan ilk olay çoğu kez tümör hücresinin DNA

hasarıdır (Gossage, L. ve Madhusudan, S., 2007), ancak mikrotübüller gibi diğer

hücresel makromoleküller de hasarın hedefi olabilmektedir (McGrogan et al., 2007).

Tümör hücresi tarafından bu hasar tespit edildiğinde, ancak hasarın

oranılmadığında, kaspazlar, Bcl-2 grubu proteinleri veya p53 onkogenlerin önemli rol

oynadığı birkaç yolak aktive edilir (Vattemi, E. ve Claudio, PP., 2007 ). Bu olaylarda

mitokondrinin de rol oynadığı ortaya çıkarılmıştır (Nicolson, GL ve Conklin, KA.,

2007; Xi, Y. Ve Edwards, JR, 2007; Keeble, JA ve Gilmor, AP, 2007). DNA’yı

parçalayan endonükleazların aktivasyonundan sonra (Gossage, L. ve Madhusudan,

S., 2007), hücrede kromatin kondenzasyonu ve hücresel fragmentasyon gibi olaylar

meydana gelmektedir°.

Bu projemin de temelini oluşturan kemoterapi ile bağlantılı olarak gelişen

apoptoza özgü hücresel membran bleb15 oluşumları son yıllarda araştırmacılarının

1. Eberle J, Kurbanov BM, Hossini AM, Trefzer U, Fecker LF. Overcoming apoptosis deficiency of melanoma-Hope for new therapeutic approaches. Drug Resist Updat. 2007 Dec 1. 2. Kooistra K, Zhang YH, Noteborn MH. Viral elements sense tumorigenic processes: approaching selective cancer therapy. Mini Rev Med Chem. 2007 Nov;7(11):1155-65. Bu derleme özellikle yeni anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesi ile ilgilidir. 3. Ohnishi T. The role of the p53 molecule in cancer therapies with radiation and/or hyperthermia. J Cancer Res

Ther. 2005 Jul-Sep;1(3):147-50. 4. McConkey DJ. Therapy-induced apoptosis in primary tumors. Adv Exp Med Biol. 2007;608:31-51. 5. Seynhaeve AL, Eggermont AM, ten Hagen TL. TNF and manipulation of the tumor cell-stromal interface: "ways to make chemotherapy effective". Front Biosci. 2008 Jan 1;13:3034-45. 6. Klampfer L. The role of signal transducers and activators of transcription in colon cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2888-99. 7. Bertazza L, Mocellin S. Tumor necrosis factor (TNF) biology and cell death. Front Biosci. 2008 Jan. 1;13:2736-43. 8. Havelka AM, Berndtsson M, Olofsson MH, Shoshan MC, Linder S. Mechanisms of action of DNA-damaging anticancer drugs in treatment of carcinomas: is acute apoptosis an "off-target" effect? Mini Rev Med Chem. 2007 Oct;7(10):1035-9. Bu derleme özellikle yeni anti-kanser ilâç formülasyonlarının geliştirilmesi ile ilgilidir. 9. Van Brocklyn JR. Sphingolipid signaling pathways as potential therapeutic targets in gliomas. Mini Rev Med

Chem. 2007 Oct;7(10):984-90. Bu derleme özellikle projeminin de temelini oluşturduğu kanserde fosfolipidlerin rolüüzerine odaklanmaktadır. Projemde yoğun olarak ben de glikosfingolipidleri uyguladım. Bunun için Bk.: bu proje metninin Neticeler bölümünü. 10. Moran E, Nencioni A. The role of proteasome in malignant diseases. J BUON. 2007 Sep;12 Suppl 1:S95-9. ° Bu konu ile ilgili bk.: Sjakste N, Sjakste T. Possible involvement of DNA strand breaks in regulation of cell differentiation. Eur J Histochem. 2007 Apr-Jun;51(2):81-94.; Evenson DP, Kasperson K, Wixon RL. Analysis of sperm DNA fragmentation using flow cytometry and other techniques. Soc Reprod Fertil Suppl. 2007;65:93-113; Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol. 2007;35(4):495-516; Yoshida A, Pommier Y, Ueda T. Endonuclease activation and chromosomal DNA fragmentation during apoptosis in leukemia cells. Int J Hematol. 2006 Jul;84(1):31-7; Hewitson TD, Bisucci T, Darby IA. Histochemical localization of apoptosis with in situ labeling of fragmented DNA. Methods Mol Biol. 2006;326:227-34. 15 Apoptoza bağlı olarak gelişen membran bleb’lerle ilgili bk.:

1. Larsen AK, Lametsch R, Elce JS, Larsen JK, Thomsen B, Larsen MR, Lawson MA, Greer PA, Ertbjerg P. Genetic disruption of calpain correlates with loss of membrane blebbing and differential expression of RhoGDI-1, cofilin and tropomyosin. Biochem J. 2007 Dec 12.

116

dikkatini çekmektedir. Önümüzdeki yıllarda da apoptotik membran bleb oluşumları

moleküler onkolojik araştırmalarının önemli bir bölümünü teşkil edeceği açıktır.

Tümörlerin kemosensitivesini (kemoterapiye karşı duyarlılığını) etkileyen

diğer faktör ise genomik instabilitedirϒ. Muhtemelen bir tümörün tek bir hücreden

ortaya çıktığı bilinse de, bir tümörün genomik instabiliteden kaynaklanan

sebeplerden dolayı, birkaç hücre döngüsünden sonra, çok heterojen bir tümör hücre

popülasyonunu oluşturduğu ortaya çıkmıştır. Bu gibi çeşitli hücrelerden oluşan

popülasyonuna kemoterapi uygulandığında, duyarlı olan tümör hücreleri apoptoza

zorlanacaklardır, daha az duyarlı hücreler ise büyüme hızını devam ettireceklerdir.

Kemoterapi birkaç kez tekrar edildiğinde, tedavi etkinliği sıfırlanacak, çünkü tümör

popülasyonu tamamen ilâca-dirençli hücrelerden oluşacaktır. Bu gerçek de çok iyi

çalışan matematiksel modellerle kanıtlanmıştır (Bk.: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2:

Principles of Systemic Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.):

Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).

2. Tournaviti S, Hannemann S, Terjung S, Kitzing TM, Stegmayer C, Ritzerfeld J, Walther P, Grosse R,

Nickel W, Fackler OT. SH4-domain-induced plasma membrane dynamization promotes bleb-associated cell motility. J Cell Sci. 2007 Nov 1;120(Pt 21):3820-9.

3. Özellikle bk.: Charras GT, Coughlin M, Mitchison TJ, Mahadevan L. Life and Times of a Cellular Bleb. Biophys J. 2007 Oct 5.

4. Schultz H, Hume J, Zhang de S, Gioannini TL, Weiss JP. A novel role for the bactericidal/permeability increasing protein in interactions of gram-negative bacterial outer membrane blebs with dendritic cells. J

Immunol. 2007 Aug 15;179(4):2477-84. 5. Sheetz MP, Sable JE, Döbereiner HG. Continuous membrane-cytoskeleton adhesion requires

continuous accommodation to lipid and cytoskeleton dynamics. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006;35:417-34.

6. Nusbaum P, Lainé C, Seveau S, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. Early membrane events in polymorphonuclear cell (PMN) apoptosis: membrane blebbing and vesicle release, CD43 and CD16 down-regulation and phosphatidylserine externalization. Biochem Soc Trans. 2004 Jun;32(Pt3):477-9.

7. Martínez MC, Kunzelmann C, Freyssinet JM. Plasma membrane remodelling and cell stimulation. Med

Sci (Paris). 2004 Feb;20(2):189-95. 8. Hamill OP, McBride DW Jr. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-

clamp recording. Annu Rev Physiol. 1997;59:621-31. 9. Uchiyama Y. Apoptosis: The history and trends of its studies. Arch Histol Cytol. 1995 Jun;58(2):127-

37. 10. Verkleij AJ, Post JA. Physico-chemical properties and organization of lipids in membranes: their

possible role in myocardial injury. Basic Res Cardiol. 1987;82 Suppl 1:85-91. 11.

ϒ Bu konu ile ilgili olarak daha ayrıntılı bilgi için bk.: Calcagnile O, Gisselsson D. Telomere dysfunction and telomerase activation in cancer--a pathological paradox? Cytogenet Genome Res. 2007;118(2-4):270-6; Wang Y. Chromosome instability in yeast and its implications to the study of human cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2091-102; Cheung AL, Deng W. Telomere dysfunction, genome instability and cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2075-90; Gasparini P, Sozzi G, Pierotti MA. The role of chromosomal alterations in human cancer development. J Cell Biochem. 2007 Oct 1;102(2):320-31; Oberdoerffer P, Sinclair DA. The role of nuclear architecture in genomic instability and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Sep;8(9):692-702. Venkitaraman AR. Chromosomal instability in cancer: causality and interdependence. Cell Cycle. 2007 Aug;6(19):2341-3. 2007 Jul 18.

117

Kemosensitivite, anti-tümör aktivitesinin prognostik gösterge olduğundan, bu

aktiviteyi önceden belirlemek amacıyla birçok yönteminin geliştirilmesi günümüzde

büyük bir önem taşımaktadır. Bu konuda sitopatolojik, moleküler genetik ve

moleküler onkolojik, mikroskopik vs. moleküler tıp konularına giren yığınlarca

yöntem mevcuttur16. Tümörlerin kemosensitivitesini etkileyen diğer önemli faktörler

arasında farmakolojik özellikler başı çekmektedir. Bunlar arasında, göğüs ve prostat

16 Ancak, projem bunlarla ilgilenmemektedir. Sunduğum proje, biyoteknolojik boyutu

dışında, daha fundamental hücresel etki mekanizmalarının modellemesi üzerine odaklanmaktadır.

Böyle bir yaklaşımın çok daha rasyonel olduğu açıktır. Bunun da sebepleri şunlardır. Her şeyden

önce yukarıda adı geçen moleküler yöntemleri Fakültemizde uygulayabilmek için uzun vadeli proje

desteğine, özellikle buradaki araştırmacı statümün özerkliğine ve en önemlisi uluslararası

ortaklarımın katılımlarına ve katkılarına ihtiyaç vardır. Ülkemizde her ne kadar da moleküler

genetik yöntemlerinin gerçekleştirilmesi için gereken birtakım cihazlar alınmışsa da, bunların çoğu

çalıştırılamamaktadır. TÜBİTAK çalıştaylarında bu gerçekler defalarca dile getirilmiştir.

Fakültemizdeki durum da pek farklı değildir. Fakültemizde maddî olanaksızlardan dolayı bu olmasa

da, diğer üniversitelerde bu yüzden yurt dışından çok büyük paralar ödenerek pratik seminerlerde

bu yöntemleri göstermek amacıyla firma temsilcileri getirilmektedir. Bu konuda eğitilmiş ve bu

konularda bağımsız olarak proje yürütebilecek akademisyenlerin sayısı da bir hayli yetersizdir.

Avrupa Birliği destekli FP7 çerçeveye veya TÜBİTAK proje destekleme birimlerine gönderilen

moleküler genetik konulu proje sayısına bakacak olursak bu gerçek de ortaya çıkacaktır. En önemli

engel ise, bu yöntemlerin dayanağı olan tümör hücre kültürü düzenekleri ise Fakültemizde mevcut

olmamasıdır. Mevcut olsaydı bile, son birkaç sene yaşanan bitmek tükenmek bilmeyen elektrik

kesintileri ve özel hücre kültürünün gerektirdiği basınçlı kapılarla donatılmış aseptik ortamın

bulunduğu laboratuvarlarının olmaması yüzünden bunları çalıştırmak zaten imkânsızdır. Bunların

Fakültemizde kurulabilmesi için şu anda tam olarak nasıl olacağı kestirilemeyen uzun vadeli parasal

ve teknik desteğe ihtiyaç vardır. Fakültemizde hücre kültürü düzeneğini kurulması için, sadece bir

düzeneğin kurulması yeterli değil, bir de söz konusu hücrenin hangi hücre döngüsü evresinde

bulunduğunu tespit etmek için henüz daha ne flow sitometre (akım sitometresi), ne fluorescently

activated cell sorter (FACS), ne de başka güvenilir bir cihaz vardır. Bu bağlamda, bu yöntem ve

yaklaşımlarının seçiminde büyük zorlukların yaşanacağı aşikârdır, çünkü bu yaklaşımların birçoğu

biopsiden alınan ve buradan üretilen tümör hücrelerinin kullanımına dayanmaktadır. Ayıca da,

Fakültemizdeki sıfatım gereği şu anda bu projeyi bu tür uluslararası boyuta hedeflendirmeyi

mümkün kılmıyor. Bu bağlamda, tarafıma sadece yazılı olarak görev verildiği ve projeme müdahale

edilmeyeceği sözü yazılı olarak verildiği takdirde bu proje konusunu da moleküler genetik

boyutunda gerçekleştirmeyi uygun görüyorum. Çünkü bu konuda yurt dışında ihtisas yaptım. Yurt

dışından tarafıma doktora bursu verilirken de mezun olduktan sonra Türkiye’de bu yeni teknolojiyi

ancak oturttuğum kaydıyla verilmiştir.

118

kanser vakalarda olduğu gibi endokrin terapilerin rolünü vurgulamak gerekir. Bunun

dışında, immünoterapi, adjuvant systemic treatment (kemoradyoterapi ve

kemoimmünoterapi, kemoterapi ile paralel hipertermi) vs. terapi programları

uygulanmaktadır. Bu çok önemli konulara bu kesin raporumun bu giriş bölümünü

daha fazla uzatmamak amacıyla burada yer verilmemiştir. Ancak, bu konularla ilgili

daha ayrıntılı bilgi www.chemotherapy.com sitesinden ve ilgili güncel kitaplardan

edinilebilir (Bk. örneğin: Sliifer S ve Stoter G. Chapter 2: Principles of Systemic

Therapy. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical

Oncology, Taylor and Francis, New York, pp. 35-49).

1.2.3. Sistemik Moleküler Hedefli Terapilerin Temel Prensipleri.

Son yıllarda sistemik kanser tedavileri17 sitotoksik kemoterapinin kullanımına

dayandırılmıştır. Bu tedavilerin prensiplerine bir önceki bölümde yer verilmiştir.

Seçiciliğin (selectivity) olmadığından, kemoterapi sadece kanser hücrelerini değil,

normal hücreleri ve dokuları da öldürüp, geniş spektrumlu yan etkilere yol

açmaktadır.

Biyolojik ve moleküler araştırmalar hücre çekirdeğinin dışında bulunan ve

karsinojenezde ve kanser oluşumlarında çok önemli rol oynayan birçok olayı ortaya

17 Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bk.:

1. Sharma SV, Settleman J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy. Genes Dev. 2007 Dec 15;21(24):3214-31.

2. Bianco R, Damiano V, Gelardi T, Daniele G, Ciardiello F, Tortora G. Rational combination of targeted therapies as a strategy to overcome the mechanisms of resistance to inhibitors of EGFR signaling. Curr Pharm Des. 2007;13(33):3358-67.

3. Hideshima T, Anderson KC. Preclinical studies of novel targeted therapies. Hematol Oncol Clin North Am. 2007 Dec;21(6):1071-91.

4. Rojo F, Dalmases A, Corominas JM, Albanell J. Pharmacodynamics: biological activity of targeted therapies in clinical trials. Clin Transl Oncol. 2007 Oct;9(10):634-44.

5. Bhatti M, Yahioglu G, Milgrom LR, Garcia-Maya M, Chester KA, Deonarain MP. Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody fragments. Int J Cancer. 2007 Oct 31.

6. Voltz E, Gronemeyer H. A new era of cancer therapy: Cancer cell targeted therapies are coming of age. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(1):1-8.

7. Goldenberg DM. "Targeted therapy with monoclonal antibodies: the new generation of pharmaceuticals". Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006;1:nil21-2.

8. Garman KS, Nevins JR, Potti A. Genomic strategies for personalized cancer therapy. Hum Mol Genet. 2007 Oct 15;16 Spec No. 2:R226-32.

9. Dittmer DP, Krown SE. Targeted therapy for Kaposi's sarcoma and Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus. Curr Opin Oncol. 2007 Sep;19(5):452-7.

10. Korfel A, Thiel E. Targeted therapy and blood-brain barrier. Recent Results Cancer Res. 2007;176:123-33.

11. Kalyn R. Overview of targeted therapies in Oncology. J Oncol Pharm Pract. 2007 Dec;13(4):199-205.

119

çıkarmıştır. Bu olaylar hücre sitoplazmasında, hücre membranında18 veya

ekstraselüler ortamda meydana gelmektedir. Şu ana kadar gösterildiği üzere, bu

olayların normal fizyolojik şartlar altında fazla görülmemeleri veya aktivitelerinin çok

düşük düzeylerde olmasına karşın, kanserde önemli rol oynadıkları tespit edilmiş, bu

olayları spesifik olarak baskılayan ilâç formülasyonlarının geliştirilmesi ise bir

sonraki anti-kanser ilâç jenerasyonun (neslinin) tasarımlarında büyük önem

kazanacaktır (Bk.: Şekil 1.4).

Şekil 1.4. Hedeflendirilmiş Tedavilerinin genel gösterimi (Bk.: Ferry A. I. M.

Eskens and Jaap Verweij, Chapter 3: Principles and Examples of Systemic Molecular

Targeted Therapies. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of

Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pg. 51).

Eğer moleküler hedeflendirilmiş terapiler seçici ve spesifik olarak bu kansere

özgü olaylara müdahale edebilseydi ve böylece spesifik olmayan sitotoksik

18Söz konusu projemin hücresel boyutu da membranlarla ilgilidir, ancak apoptozdan çok antineoplastik ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki muhtemel etkilerini vurgulamaktadır. Bu konuda da ilgili öncü hipotez ve model sunulmuştur. Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Yorum bölümüne başvurulmalıdır.

120

kemoterapilerin yan etkiler engellenebilseydi, anti-kanser tedavilerinin çok daha

başarılı yapılabileceği açıktır.

Bu konu çok geniş olduğundan buna bu kesin raporumda daha fazla yer

verilmeyecektir. Ancak bu çok önemli konu ile ilgili son derece güncel bilgiler için

Bk.: Ferry A. I. M. Eskens and Jaap Verweij, Chapter 3: Principles and Examples of

Systemic Molecular Targeted Therapies. In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye

(Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, pg. 51.

Kanser hastalarının 60%’dan fazlasında metastazların görüldüğünden, çoğu

kez sistemik olarak etki eden ajanlarla tedavilere başvurulmaktadır. Bu şekilde

sistemik etki mekanizmasına sahip anti-tümör ajanları 3 ayrı gruba dahil

edilmektedir: sitotoksik ilâçlar, hormonal ajanlar, ve biological responce modifiers

adlı bileşenler. Bu gruplarda yer alan çeşitli ajanlar yıllarca uygulanmışlardır (Sliifer

S ve Stoter G., 2005)19. Daha spesifik olarak temel kanser hücre biyolojisi,

farmakoloji, endokrinoloji konulu araştırmalar, ve yeni bileşenlerin ve yeni tedavi

stratejilerin geliştirilmesinin temelini oluşturmaktadır. Bunlara ilâve olarak, başarılı

kanser tedavilerin neticesinde uzun süreli olarak sağlığına kavuşan kişilerin

sayısındaki artış göz önünde bulundurulduğunda, daha sonraları görülen bazı

toksisitelerinin de önemi artmıştır.

Sitotoksik terapiden farklı olarak, kansere özgü olayların işlevsel ve yapısal

özelliklerinin ortaya çıkarılması, bu olayları spesifik olarak baskılayan ajanların

rasyonel olarak geliştirilmesiyle sonuçlandırılacak hedefe-bağlı (a target-based

approach) bir yaklaşımı mümkün kılmaktadır.

Şimdiye kadar ortaya çıkarılan hedefler arasında varlıkları sayesine kontrolden

çıkan hücre bölünmesine (proliferasyona) yol açan genelde proteinler veya işlevi

hasar gören reseptörler veya sinyal proteinleri başı çekmektedir. Moleküler

hedeflendirilmiş tedaviler kanser hücreye özgü bir hedef ile buna bağlı olarak ve

rasyonel olarak tasarlanan ilâçlar arasında spesifik tepkimenin ortaya çıkmasına

19 Tarihçeleri için bk.: Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514.

121

bağlıdır ve bu şekilde normal hücreleri görmeyip, sadece kanser hücrelerini seçici

olarak etkilemeleri amacıyla gündeme getirilmiştir20.

Moleküler hedeflendirilmiş tedaviler RNA ve DNA replikasyonu

etkilemediğinden, aküt hücre ölümü olmamaktadır, ancak hücrelerin kontrol dışı

proliferativ aktiviteleri baskılanmaktadır ve bunlar “quiescence”21 denilen duruma

geçmektedir. Bu hedefe-bağlı kavram seçici olmayan ve tersinir olmayan DNA

hasarının meydana geldiği ve aküt hücre ölümünün gerçekleştiği normal ve kanser

hücrelerinin eşit olarak etkilendiği (Bk.: bir önceki bölüm) konvansiyonel sitotoksik

anti-kanser yaklaşımından tamamen farklıdır.

1.2.4. Gen Aktarımı ve Kanser Tedavilerindeki Rolü

İnsan gen tedavisi, birçok otoimmün ve kalıtsal hastalıkların ve kanser

patolojilerinin tedavisinde şimdiye kadar uygulanan konvansyonel yaklaşımlar

dışında bu hastalıkların tedavilerinde yeni bir umut olarak ortaya çıkmıştır

(GREGORIADIS, 1993; MOLDAWER, 1999; KIRBY, 1999, STONE, et. al., 2000;

FLOTTE, 2001; TEMPLETON, 2003; EL-ANEED, 2004; KOBAYASHİ, et. al., 2005;

MEIDAN, 2006; PELISEK, et. al. 2006) . Gen tedavisi, son yıllarda moleküler biyoloji

ve biyoteknolojideki gelişmeler sayesinde mümkün olmuştur. Olağanüstü öneme

sahip ve uluslararası boyutta olan insan genomun gen dizilişinin ortaya çıkarılması

projesi (Human Genome Sequencing Project) bu yeni tedavi yöntemini, birçok

hastalığın moleküler düzeyde incelenmesini gerçekleştirerek bu doğrultuda yeni

veriler ortaya çıkararak desteklemektedir. Bu gibi çok değerli genetik bilgilerin elde

edilmesiyle, gen tedavisinin yakın gelecekte moleküler tıp alanında önemli

yöntemlerden birini oluşturacağı inanılmaktadır. Gen tedavisinin amacı hastalığa

neden olan genetik bozukluklarının tedavi edilmesidir (TEMPLETON, 2003).

20 Bk.: Chapter 3. Ferry , A. L. M,, Eskens and Jaap Verweij, Principles and examples of systemic molecular targeted therapies, In: F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Ed.): Textbook of Medical Oncology, Taylor and Francis, New York, 2005). 21 Apoptoz olaylarının önemli bir bölümünü teşkil eden “scenescence” olayı doğrultusunda ortaya çıkmaktadır.

122

DNA dizilişindeki nokta mutasyonları teorik olarak tedavisi mümkün olan

birçok hastalığa neden olmaktadır. Genomlarda, nokta mutasyonlarını ortadan

kaldırmak için çok sayıda yaklaşım uygulanmaktadır. Bunlardan hibrid (veya

chimeric) RNA-DNA oligonükleotid veya söz konusu DNA dizilişinin kesilmesi

(deletion of DNA sequences) her ne kadar gelecek vaat eden yöntemler olarak

sunulmuşsa da frekans olarak meydana gelme olasılıkları çok düşük olduğundan,

henüz daha uygulamaları söz konusu değildir. Sonuç olarak, gen tedavisinin amacı

genetik düzenlemelerinin gerçekleştirilmesi olduğundan ve bu da klinik ortamlarda

yapılması bir hayli zor olduğundan, günümüzde gen tedavi yaklaşımların birçoğu

işlevsel genlerin ortama katılmasına dayanmaktadır. Bu yaklaşımda, terapötik genler

farmasötik bileşenler olarak tasarlanırlar ve ortama verilirler. Söz konusu genlerin

hedeflendirildikleri hücre içi bölgeye ulaşma yollarındaki olağanüstü sitoplazmik

engellerin bulunduğundan, in vivo ortamda, yeni ve kontrolü mümkün olan özellikler

taşıyan, güvenilir ve tekrarlanabilir gen tedavi deneysel protokollerin geliştirilmesi

gerekmektedir. Gen yer değişimi tedavinin (Gene Replacement Therapy) dışında, in

vivo gen naklindeki başarı, antijenik proteinin optimal imün cevaba neden olacak

şeklinde naklinin gerçekleştirildiği, DNA aşıların geliştirilmesini de mümkün

yapacaktır GREGORIADIS, 1993; KIRBY,1999; TEMPLETON 2003; KOBAYASHI,

et. al., 2005).

Gen, ilk önce haberci RNA (mRNA)’ya nükleuste transkribe olmakta, daha

sonra ribozomlarda peptide translasyonu gerçekleştirilmektedir; bu peptid daha

sonra katlanma ve glikozilasyon aracılıyla multimerik şekillere dönüşüp işlevsel

protein olarak gen ekspresyonuna katılmaktadır. Sadece DNA nükleotid dizilişindeki

kodları bulunan genlerin tedavi işlevlerini gerçekliştirmeden önce

transkripsyonlarına ihtiyaç duyulur. Ancak, bunlar dışında genelde gen tedavi

olaylarında yer alan tüm diğer durumlarda, kodlanan genlerin transgen

ekspresyununun (rekombinant gen ifadesi) gerçekleşmesi gerekmektedir. Böylece,

nakledilen genin ulaştırılması hedeflenen nükleusa ulaşıncaya kadar herhangi bir

işlevsel biyolojik önemi yoktur. Enjekte edildiği bölgeden nükleusa ulaşıncaya kadar

tedavi amacıyla sentezlenen ve istenilen nükleotidleri içeren yeni kodlayan DNA,

birkaç biyolojik engelle karşılaşır ki bunlar çoğu kez başarılı gen naklini

engellemektedir (Şekil 1.5). Bu engelleri geçmek için, etkili DNA taşıyıcıların

tasarlanması için çok sayıda yaklaşım uygulanmaktadır.

123

1.2.5. Gen Tedavisi ve Gen Nakli

Günümüzde, gen nakli viral ve viral olmayan sistemlerle gerçekleştirilmektedir

(DE LAPORTE, et. al.,2006) (Şekil 1.5-1.8). Taşıyıcılar genel olarak polimerler,

lipidler veya polisakkaridler22 içerip hücresel nükleazlar tarafından muhtemel

degrdasyonu engelleyecek ve daha küçük boyutlu ve daha az miktarda negativ yük

taşıyan ve böylece hücreler tarafından alımı kolaylaştırılmış olan ve intraselüler

haberleşmeyi gerçekleştirebilecek şekilde olmalıdır. Bu doğrultuda, taşıyıcıya

ekstraselüler ve intraselüler engelleri aşmak için uygun fonksiyonel gruplar da

eklenebilir. Bunlar, taşıyıcının serum bileşenleriyle tepkimeye girmesini engeller ve

hücre veya doku türüne özgü bağlanmayı kolylaştıran gruplardır. Söz konusu gruplar

DNA’nın çekirdeğe girmesini endozomlardan kaçışı veya çekirdeğin porlarından

geçişi sağlayarak da kolaylaştırmaktadır. Belirli patojenin veya tümörün antijenini

kodlayan DNA vektörleri önleyici veya terapötik kullanım imkânı sağlayarak bu

patolojilere karşı DNA aşısı geliştirilmesinde önemli rol oynayabilirler

(GREGORIADIS, 1993; KIRBY, 1999). Ex vivo gen tedavisi hastadan söz konusu

hücrelerin ayrıştırılmasını ve bunları daha sonra in vitro olarak terapötik gen ile

değişime uğratılmasını kapsamaktadır (TEMPLETON, 2003; KOBAYASHI, et. al.

2005). Bu şekilde manipüle edilen edilen hücreler daha sonra tekrar hastaya

nakledilmektedir (Şekil 1.6). Diğer yandan, in vivo gen tedavisi (Şekil 1.5 ve 1.6),

direkt olarak önceden tasarlanmış genin hastanın dokularına nakledilmesinden

ibarettir. Her iki yöntemde de, henüz daha başarılmış olmayan ilgili nükleotid

dizilişinin istenilen ekspresyonunu gerçekleştirecek spesifik hedef hücrelere yeterli

miktarda aktiv ve işlevsel DNA’nın nakli konusu çözümünü beklemektedir.

Günümüzde, ilgili hedef hücrelere DNA transferi için birkaç yöntem geliştirilmiştir.

Bunlar fiziksel ve kimyasal (sentetik) yöntemler adı altında iki ayrı gruba ayrılmakta.

22

Ancak çözünürlükleri çok düşük olduğundan, polisakkaridlerin gen taşıyıcı tasarımlarında kullanımları çok kısıtlıdır.

124

Şekil 1.5. Viral ve viral olmayan gen nakli tasarımları. Kaynak:

http://homepages.strath.ac.uk/.../ BGT/BGT12/BGT12.html

Şekil 1.6. Doğrudan ve hücresel gen nakli tasarımları. Kaynak: http://

http://stemcells.nih.gov/info/scireport/chapter11.asp

125

Şekil 1.7. Viral gen taşıyıcı tasarımlarının genel şeması. Yeni gen adenovirüs

vektörüne enjekte edilmekte ve bu modifiye edilen DNA’nın daha sonra ilgili insan

hücresine hedeflendirilmesi için kullanılmaktadır. Tedavinin başarılı olması

durumda, bu şekilde nakledilen genin ürünü olan işlevsel proteinin sentezi

gerçekleşecektir.

126

Şekil 1.8. Çeşitli lipozomal veya polimere dayalı gen taşıyıcılarının hücre içi

(intraselüler) yolu. Burada (a–c) ile gösterilmiş yol, daha sonra böylece tasarlanan

gen taşıyıcının yapı-aktivite özelliklerini de değişterebilen DNA ile komplex

oluşturma yoludur. (d) Taşıyıcı kesitinden gözüken DNA. (e) Taşıyıcılar endositoz ile

hücre içine alınmakta ve daha sonra engel olarka işlev yapan endosomları aşarak

nükleusa girme özelliklerine sahip olmalılar. Bunu takiben tüm kompleks disosiye

olup nuklus içindeki transkripsiyona katılırlar. Kaynak: Laura De Laporte, Jennifer

Cruz Rea, Lonnie D. Shea, Design of modular non-viral gene therapy vectors,

Biomaterials, 27 (2006) 947–954.

127

Şekil 1.9: İntravasküler (sol) veya doku (sağ) enjeksyonundan sonra plazmid

DNA’nın in vivo akıbeti. Uygulandıktan sonra, plazmid DNA makrofajlar gibi tek

hücreli, olan mononükleer fagositlerin de aralarında bulunduğu çeşitli hücreler

tarafından alınmaktadır. Ayrıca, plazmid DNA plazma proteinleri ve ekstraselüler

matriks bileşenleri ile de etkileşmelere girmektedir. Bazı durumlarda, plazmid

DNA’nın ulaşması gereken hedef hücreyi tanıması içinintravasküler yol

(extravasation) veya doku enjeksyonu (difüzyon)’un gerçekleştirilmesi

gerekemektedir. Gen nakli için kullanılan araç ve nakil protokolüne bağlı olarak,

DNA’nın hücrelerce alınması endositotik yol ile (kalın oklar) ve/veya endositotik

olmayan yol (kesintili oklar) ile gerçekleşir. Endositozun gerçekleştiği durumlarda, bu

plazmid DNA enzimatik olarak parçalanacağınan, bu endositozu engellemek

gerekmektedir. Sadece nükleusa ulaşan plazmid DNA’nın terapötik protein

sentezleme şansı vardır (KOBAYASHI, et. al., 2005).

128

Şekil 1.10: Polipleksler ve Lipoplekslerin transfeksyon esnasında hücresel

farklı akıbetlerinin özeti. Lipopleksler ve polipleksler, kırmızı renkli ( lipid veya

polimeri gösteren) ve yeşil (plazmid DNA’yı gösteren) disk veya elips olarak

gösterilmiştir. (1) Serumun yokluğunda her iki vektör türünün de hücreye

bağlanmaları birçok elektrostatik etkileşmelere dayanır. Serum varlığında, vektörlere

bağlanan proteinler kendilerine özgü hücre yüzeyinde bulunan reseptörlerce

tanınmaktadır (bu moleküler tanınma olayı gösterilmemiştir). (2) Bazı lipozomların

katmanıyla plazma membran arasında füzyon meydana gelebilir, ancak bu DNA’nın

hücre içi geçmesiyle her zaman sonuçlanmayabilir. (3) Poliplekslerin veya

lipoplekslerin hücre içi geçiş mekanizması olarak en genel yolun endositozis

üzerinden gerçekleştirildiği bilinmektedir. (4) Polipleks veya lipoplekslerde

enkapsüle olarak bulunan terapötik DNA plazma membranının yakınında bulunan

endozomlardan çok erken salınıma uğramaktadır ve bu olay neticesinde

hedeflendirildikleri çekirdekten (nükleustan) çok uzakta kalmaları yüzünden

intraselüler nükleazlar tarafından degradasyona uğratılmaktadır. 5) Endozomların

sitoplazmik taşınımları rekombinant ve transfektant nükleik asitlerin perinükleer

bölgeye söz konusu DNA’nın daha başarılı bir şekilde çekirdeğe ulaştırılmasında

önemli rol oynamaktadır. Genel olarak buradaki amaç DNA’nın nükleusa ulaşmadan

önce söz konusu endozomlardan kaçışı sağlanmasından ibarettir. Bu kaçışı polipleks

ve lipopleks gen taşıyıcı tasarımları farklı yollar takip ederek meydana getirmektedir.

Lipoplekslerde, örneğin bu füzyon gibi (6) ve (6V ) lipid taşınımı ve membran

destabilizasyonu sayesinde gerçekleştirilmektedeir. Polipleks tasarınmları ise (en

azından polietilenimin (PEI) gibi amin içeren polikatyonlarda veya dendrimerlerde)

tamamen hidrofilik olduklarından (8) endozomların osmotik boşaltımı sayesinde

129

bunu gerçekleştirmektedir. Vektörle DNA’nın birbirinden ayrılmasıyla sonuçlanan

lipopleks disosyasyonu (7) endozomlardan kaçış prosedürü esnasında veya (7V )

sitoplazmada salınıma uğratılan lipoplekslerin Endoplazmik Retikulum gibi

sitoplazmik membran ağı ile füzyonu sonrası meydana gelmektedir. (9) Poliplekslerin

sitoplazmada disosyasyonları henüz daha bilinmeyen başka bir mekanizmaya

gerçekleşir. (10) Endozomlardan kaçışı başaramayan lipopleksler ve polipleksler

lizozomlarca dagrade edilmektedir. Lipoplesklerden veya poliplekslerden ayrılan

transfektant DNA hücre döngüsünün mitozis evresi esnasında nükleer membranın

degradasyonunun olduğu zamanda nükleusa ulaşabilir (şemada gösterilmemiştir).

Bu pasiv nükleer lokalizasyon olayı hücre döngüsünün aktivitesine ve sitoplazmada

plazmidin aktiv kalma süresine bağlıdır. (11) Aktiv, enerji harcanarak gerçekleşen

nükleusa geçiş mekanizması da mevcuttur. Bu da nükleusa geçişi kodlayan,

transkripsyon faktörleri veya DNA-protein kompleksleri gibi makromoleküler

bileşenlerin plazmidte bulunan genleri sayesinde meydana gelmektedir. Ayrıca

lipozomlarla dolu endozomların membranları direkt olarak nükleus membranı ile

füzyon yapabilmektedir (şemada gösterilmemiştir). Kaynak: Abdelatif Elouahabi and

Jean-Marie Ruysschaert Formation and Intracellular Trafficking of Lipoplexes and

Polyplexes, Mol. Therapy, Vol. 11, No. 3, March 2005, 336-347.

Şekil 1.11. Lipozom-DNA veya lipozom-plazmid DNA ile hedef hücre arasında

oluşan elektrostatik etkileşmelerinin şeması. Kaynak: : www.ph.nagasaki-u.ac.jp/.../

doc/photo/main3e.htm

130

Fiziksel gen nakli yöntemlerinden elektroporasyon uygulanmaktadır (MOHR,

et. al., 2002, TEMPLETON, 2003). Ancak bu yaklaşımda kullanılan elektrik

alanlarının DNA’yı parçalayabileceklerinden bu yöntem çok problematiktir. Diğer bir

yaklaşım ise Particle-mediated Gene Transfer (PMGT) yöntemidir ve burada “gene-

gun” olarak bilinen yöntem kullanılmaktadır. Her iki yöntemde de yüksek frekanslı

elektrik akımlarının kullanıldığı son derece ustalık gerektiren yaklaşımlardır. Son

yıllarda fiziksel yöntemler arasında direkt DNA enjeksyonu yöntemi de yerini

almıştır. Ancak bu yaklaşım daha başlangıc aşamısndadır. Bu problemler yüzünden,

günümüzde kimyasal (sentetik) gen taşıyıcı tasarımları tercih edilmektedir

(TEMPLETON, 2003; KOBAYASHI, et. al., 2005).

Hayvan hücresini hedef alarak tasarlanan böyle bir gen nakli genelde şu yolu

takip etmektedir. Küçük DNA içeren nanoparçacıkların oluşumu; bu parçacıkların

hücreler tarafından alınması; parçacıkların hücre membranından geçip sitoplazmaya

girmeleri; DNA’nın çekirdeğe girmesi ve son olarak nakledilen genlerin çekirdekte

gerçekleşen gen ekspresyonu23 (Bkz.: Şekil 1.5-1.11).

Gen nakli görüldüğü gibi etkili DNA veya oligonükleotidlerin hücre zarı

üzerinden geçişine bağlı olarak gerçekleştirilmektedir. Bu olay son derece etkisizdir

ve temelini oluşturan mekanizmalar henüz daha açıklanamamıştır. Ancak, virüsler

evrim boyunca enfekte ettikleri çeşitli hücrelerle beraberce (simbiyotik) bir yaşam

sürdürdüklerinden nanopartiküler yapılarından dolayı ve viral zarının yapısında

bulunan proteinlerce gerçekleştirilen hücre membranı üzerinden geçişi son derece

etkili bir şekilde meydana getirebilirler (STRAYER, 1999; ROBBINS, 1998;

WALTHER, et. al., 2000; SILMAN, 2000; WILSON,et. al., 2002; RITTER, et. al.,

2002; PASSİNİ, et. al., 2004; YOUNG, et. al., 2006; ZHANG, et. al., 2006). Bu

bakımdan, gen nakli için retrovirüsler, adenovirüsler, adeno-associated virüsler

(AAV) gibi birçok virüs türü gen nakli için birçok araştırmacı tarafından klinik

uygulamaya konulmuştur (Şekil 1.7). Gen naklini çok etkili bir şekilde

23

Son iki şemada gösterilen DNA genelde plazmid DNA, oligonükleotid, poliribonükleotid veya diğer model DNA’lardan biridir. Bu nükleik asit türleri arasında her ne kadar moleküler ağırlık ve konformasyon bakımından farklılıklar bulunsa da diğer bileşenlerle kompleks oluşumundaki fizikokimyasal etkenler genelde aynıdır. Bu şemalar, bu yüzden herhangi bir nükleik asit (bunlara antisense ribonukleotid tedavisi veya small interference RNA (siRNA)’ya dayalı tedavilerde olduğu gibi, RNA da dahil olmak üzere) için geçerlidir.

131

başarabildiklerine karşın, viral partiküller bağışıklık sistemini tetiklemekte ve antikor

ve diğer önemli proteinlerin sentezlenmesine neden olmaktadırlar (KAPLITT, et. al.,

1997; BUELER, 1999; HOLT, et. al., 1999; KOOTSTRA, et. al., 2003; FALKNER, et.

al., 2004; HENDRIE, et. al., 2005; HENDRIKS; et. al., 2004). Bu bağlamda,

istenilmeyen proteinlerin sentezlenmesi, klinik uygulamalarında ölümle sonuçlanan

birçok yan etkilere neden olmuşlardır. Bu yüzden, birçok üniversite ve araştırma

merkezi viral olmayan gen taşıyıcıların sentezlenmesine yönelmişlerdir. Viral

olmayan gen taşıyıcılarının geliştirilmesi fizyolojik iyonik ve pH ortamında negativ

yüklü DNA fisfat grupları ile birkaç positiv yüklü gruplar veya polimerik zincirler

arasında oluşan elektrostatik etkileşmelere ve makromoleküllerin yapısal

özelliklerine bağlı olarak hidrofobik etkileşmelere dayanmaktadır. DNA paketlenmesi

veya kondanzasyonu olarak da bilinen bu olay yoğun olarak araştırılmaktadır. Birçok

DNA kondanzasyon olayında, doğal poliamin putresin (H2N(CH2)4NH2), spermidin

(H2N(CH2)3NH(CH2)4NH2) ve spermin’in (H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2)

türevleri olan bazı katyonik moleküller ile gerçekleştirilmektedir. Genel olarak,

nükleik asit kondanzasyonu morfolojik olarak özgün DNA nanoparçacıkların

oluşmasıyla ortaya çıkarılır. Bu dynamic light scattering (DLS) yöntemi dişinda,

elektron ve floresan mikroskopik ve son yıllarda atomik kuvvet mikroskopik

incelemeleriyle teyit edilmiştir. Ancak, bu küçük katyonik molekülleriyle DNA

arasında oluşan bileşenler çoğu zaman sabit değildir ve serum gibi fizyolojik iyonik

ortamlarda bu gibi kompleks oluşumları disosiasyonla sonuçlanmaktadır

(TEMPLETON, 2003; KOBAYASI, et. al., 2005). Bu yüzden, gen taşıyıcıları olarak,

daha yüksek valanslı poliaminler ve spermidin ve sperminin türevleri sentezlenmiştir.

Bu gibi sentetik polikatyonlar DNA’yı nanopartiküllere dönüştürüp hücre içi geçişi

kolaylaştırmaktadır. Katyonik poliaminler ve polimerler büyük hacimli DNA

moleküllerini işlev düzenleyici gen bölgesini de içerecek şeklinde daha küçük boyutlu

parçacıklara dönüştürebilmektedirler. Sonuç olarak, viral olmayan sentetik taşıyıcı

tasarımlarından birtanesi DNA’yı elektrostatik etkileşmeler sayesinde kondanze eden

ve böylece hücre içi geçişini kolaylaştıran polikatyonik polimerlerin kullanımına

dayanmaktadır (JULIANO, 1991; DRITSCHILO, et. al., 1992; ROMANCZUK, et. al.,

1999; GEBHART, et. al., 2001; ANWER, et. al., 2003; JANG, et. al. 2004). Bir diğer

yaklaşım ise H-bağlar ile DNA’ya bağlanabilen ancak nükleik asit kondanzasyonu ile

sonuçlanmayan, nötr amfifilik polimerleri kullanmakta (GEBHART, et. al., 2001;

ANWER, et. al., 2003). Günümüzde, viral sistemlere nazaran, her iki yöntemin de

132

dezavantajı çok düşük transfeksyon oranlarının olmasıdır (JANG, et. al. 2004).

Yukarıda adı geçen sentetik polimer yapılardan başka, üç ayrı polimer türü

kullanılmaktadır: çeşitli poliamin türevleri, poliamidler ve polivinil türü polimerler.

Bu polimerlerin transfeksyon kabiliyetleri bir birinden çok farklıdır. Ayrıca, yapıları

itibariyle sentezlenmeleri kolay olmakla birlikte, kullanılmakta olan sentetik

polimerler doğal bileşenler olmadıklarından, elektrostatik ve hidrofobik özelliklerinin

kontrolü bir hayli güç olup, bağışıklık sistemini aktive etmektedirler. Viral olmayan

taşıyıcılar ayrıca işlevsel organik grupları da içerebilirler ki bu hücre türüne özgü

hedeflendirmeyi (cell-specific targeting) ve nükleer localizasyonu da

kolylaştırmaktadır. Bu tür yaklaşımlarda en önemli husus, DNA’yı enzimatik

degradasyondan koruyacak şekilde toksik olmayan ve biyolojik olarak yok

edilebilinen (biyodegradable) gen taşıyıcılarının tasarlanmasıdır. Ayrıca, bu

taşıyıcılar membran reseptörlerce meydana getirilen hücresel alımı kolaylaştırıp,

DNA’nın endozomal salınımını da gerçekleştirebilmektedirler (KOBAYASHI, et. al.,

2005).

1.2.6. DNA Kompaktizasyonu ve Nanoparçacık Oluşumunu

Meydana Getiren Bileşenler

Poliaminler.

Poliaminlerden spermidin ve spermin ve bunların sentetik türevleri DNA

kompaktizasyonunu meydana getiren moleküller arasında en etkili olanlar arasında

gösterilmektedir (Şekil 1.12). Poliamin ve analoglarının DNA kondazasyon ve

kompaktizasyon reaksyonlarının >89%’nda bunu yük nötralizasyonu olarak meydana

getirmektedir. Diğer yaklaşımlarda, katyonik poliaminlerden olan cobalt heksamin3+

kullanılmaktadır. EtBr displacement assay kullanarak poliamin homologlarının

DNA’ya farklı afinite gösterdikleri ortaya çıkarılmıştır. Tetravalent poliaminlerin

DNA’yı hücre içi geçiş olayında çok etkili olmamalarına rağmen, heksaminler gibi

daha yüksek valanslı poliaminler bu geçişi daha başarılı bir şekilde

gerçekleştirmektedirler.

133

Şekil 1.12: Doğal poliamin olan sperminin (3−4-3) ve çeşitli türevlerinin

kimyasal yapıları. Poliamin türevleri primer ve sekonder amino gruplarını birleştiren

metilen gruplarının sayısını gösteren numalandırma sistemi ile kısaltılarak

gösterilmiştir (SANTHAKUMARAN et. al., 2005).

Nötr Lipidler

Nötr lipidler (Şekil 1.13) genelde önemli yardımcı bileşen rolü üstlendikleri

katyonik lipid formülasyonlarının bir parçasıdır. Bu bileşiklerde sıkça kullanılan üç

nötr lipid dioleil fosphatidiletanolamin (DOPE), kolesterol ve dioleoil fosfatidil

kolin’dir (DOPC). Birçok durumda, DOPE ile katyonik lipid’in 1:1 oranında

kullanılması en etkili transfeksyon neticelerini vermiştir (PITARD, 2002; ZHANGA,

et. al. 2004). DOPE lipid katmanlarını destabilize ettiği ve endozomal degradasyonda

rol oynadığı bilinmektedir. Katyonik lipid-DNA kompleksleri hücreye endozomal yolu

takip ederek girmektedir ve DOPE’nin işlevi endozomal membranı destabilize

etmekten ibarettir. Kolesterol gibi nötr lipidlerin kullanımı sayesinde, in vivo

transfeksyon düzeyleri yükseltilebilmiştir. Diğer lipozomlara kıyasla, kolesterol içeren

lipozomların uygulandığında birçok organda gen ekspresyon profilleri yükseltilmiştir.

İnsan hepatoma hücrelerinden biri olan, HepG2 ile yapılan deneylerde, DOPE içeren

lipozomlar ve galaktozil türevleri ile konjüge edilmiş kolesterol içeren lipozomlar

daha düşük toksisite ve daha yüksek transfeksyon etkinliğine sahip oldukarı

görülmüştür (PITARD, 2002; ZHANGA, et. al. 2004; SANTHAKUMARAN et. al.,

2005).

134

Transfeksyon etkinliğindeki bu artış karaciğerin parenhimal hücrelerine

spesifik asyaloglikoprotein reseptörlerine karşı yüksek afiniteleriyle açıklanmaktadır

(SANTHAKUMARAN et. al., 2005). Bazı araştırmacılar, kolesterolün in vivo

uygulandığında katyonik lipopoliamin pcTG90 ile nötr lipid olarak konjüge edilmiş

DOPE’ye nazaran, DOPE’nin türevi olan, kısmen florine edilmiş

gliserofosfoetanolamin (F-PE) in vitro ve in vivo gen nakil potansiyeli göstermiştir.

Bu, d-florine edimliş T lipoplekslerin in vivo uygulamalar için DOPE’nin etkin bir

alternatifi olduğunu göstermektedir.

Şekil 1.13. Nötr lipidlerden gen taşıyıcı tasarımlarında bazı sıkça kullanılan

örnekler: dioleyl phosphatidylethanolamine

(DOPE), cholesterol and dioleoyl phosphatidyl choline (DOPC); A partially

fluorinatedglycerophosphoethanolamine (F-PE),.

Katyonik Lipidler

Gen tedavisinin klinik öncesi araştırmalarda DNA naklini başarılı bir şekilde

gerçekleştiren moleküller arasında katyonik lipidler dikkati çekmektedir (AKHTAR,

et. al., 1991; ZHANG, 2004; AZZAM, et. al., 2004; HART, 2005; IGARASHI, et. al.,

2006). Bu moleküller hidrofobik ve polar grup olmak üzere 2 ayrı kısımdan

oluşmaktadır. DNA transfeksyonu için çok sayıda sentetik katyonik lipid

geliştirilmiştir (Şekil 1.14). Bunlar DNA transfeksyon ajanları adı altında ticari olarak

piyasadan da edinilebilir. Bu moleküller lipidin pozitiv yüklü polar baş grubu ile

DNA’nın negativ yük taşıyan fosfat grubu arasında elektrostatik etkileşmeye neden

olup DNA nanoparçacıklarının oluşmasına neden olmaktadır. DNA nanoparçacıklarla

135

lipidler arasında bu şekilde oluşan kompleks sayesinde, DNA’nın hücresel engelleri

daha kolay aştığı ve hücre kültürü ortamında enzimatik degradasyona daha dirençli

olduğu tespit edilmiştir (ZHANGA, 2004). Bu nanopartiküllerin boyutları 50 ile 1000

nm arasında değişmektedir. DNA kompaktizasyonu çok etkili bir şekilde

gerçekleştirmelerine rağmen, piyasada ticari ürün olarak bulunan birçok katyonik

lipid toksiktir. Sıçan ve makaklarla yapılmış deneylerden elde edilmiş veriler yüksek

dozlarda birkaç defa üst üste uygulandıklarında katyonik lipidlerin akciğer

patolojilerine neden oldukları göstermektedir (AKHTAR, et. al., 1991; ZHANGA,

2004; AZZAM, et. al., 2004; HART, 2005; IGARASHI, et. al., 2006).

Şekil 1.14: Katyonik lipidlerden bazı örnekler: lipopoliamin RPR120535,

dioctadesildiamonium bromid

(DODAB), dioleoiltrimetilammonium propan (DOTAP), ve bisguanidinium

tren kolesterol

(BGTC), (N-[1-(2,3-dioleyloxy) propyl]-N,N,N-tri-methylammoniumchloride

(DOTMA). (Bruno Pitard, Supramolecular Assemblies of DNA

Delivery Systems, Somatic Cell and Molecular Genetics, Vol. 27, Nos.1/6,

November 2002; Shubiao Zhanga, Yingmei Xua, Bing Wanga, Weihong Qiaob,

Dongliang Liub,

Zongshi Lib, Cationic compounds used in lipoplexes

and polyplexes for gene delivery, Journal of Controlled Release 100 (2004)

165–180).

136

Polivalent Katyonik Lipidler

DOTAP ve DOTMA’nın gen naklindeki başarısını takiben, birçok başka lipid

hazırlanmıştır. Aralarında, dioktadesilamidoglisilspermin (DOGS veya

ddtransfectamTT) gibi yapıların da örnek olarak gösterilebileceği, polivalent katyonik

lipidler yoğun ilgi çekmişlerdir. Diğer popüler örnekler DOSPA, DPPES, (C8)2Gly

Sper3+ ve (C18)2Sper3+’dir (Şekil 1.15). DOGS, DOTMA’dan DNA ile bağlanma

mekanizması bakımından farklılık göstermektedir. DOGS’un baş grupları poliamin

grubu aracılıyla DNA’nın minor groove ile etkileşmeye girmektedir. DOGS

fazlalığında, DNA’nın paketlendiği, nucleozom benzeri yapı oluşmaktadır. Bundan

farklı olarak, DOTMA sıvı çözeltide lipozomların meydana gelmesine neden

olmaktadır. Bunlar kendiliğinden negativ yüklü DNA molekülleriyle agregatlar

oluşturmaktadır (KOBAYASI, et. al., 2005).

Şekil 1.15: Polivalent Lipidler ve Kolesterol Türevi.

137

Polietilenimin

Polietilenimin (PEI) farklı hücre kültürlerinde ve hayvan modellerinde

oligonükleotidlerin ve plazmid DNA’nın hücre sitozolüne geçişinde etkili rol oynayan

sentetik polimerler grubunun bir bölümünü teşkil etmektedir (Şekil 1.16). Lineer ve

zincirli şeklindeki PEI DNA’yı nanoparçacıklara dönüştürmektedir. DNA

kondanzasyonunda ve transfeksyon etkinliğinde PEI’nin kullanılan şekli ve moleküler

ağırlığı rol oynamaktadır. Fizyolojk pH’da PEI/DNA bileşiklerinin endozomal

degradasyonu daha kolayca aşabildikleri gösterilmiştir. Ancak, bu nanopartiküllerin

çok düşük olan çözünürlülüğü gen naklinde kullanımlarını kısıtlamıştır.

Şekil 1.16: Lineer, zincirli ve polietilen glikol ile konjuge edilmiş

polietileniminler (SANTHAKUMARAN et. al., 2005).

Dendrimerler

Poliamidoamin (PAMAM) ve polipropilenimin (PPI) dendrimerleri (Şekil 1.17)

DNA nanopartiküllerini etkili bir şekilde oluşturma ve DNA naklini kolaylaştırma

kaabiliyetleri dikkati çekmiştir. Lineer ve zincirli polimerlerle kıyaslandıklarında

dendrimerlerin monodispers olmaları ve kontrol edilebilen işlevsel yüzeye sahip

138

olmaları bu molekülleri gen taşıyıcı tasarımlarında kullanılmaları konusu gündeme

getirilmiştir.

Şekil 1.17: Polipropilenimin dendrimerlerinin beş ayrı çeşidinin kimyasal

yapıları. Dendrimerlerin artan karmaşıklığı G1-G5 numaralandırma sistemi ile

gösterilmiştir (SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).

Proteinler ve Polipeptidler

Hücrede DNA nanoparçacıkların oluşumu DNA’nın histonlar ve protaminler

gibi katyonik proteinler veya peptidler ile etkileşimi neticesinde

gerçekleştirilmektedir (Şekil 1.18 ve 1.19). Spermde ve bazı virüslerde bulunan DNA

nükleik asitin fosfodiester kısmıyla bağlanabilen Arginine (Arg) zengin bölgeler

içeren protamin tarafından kondanze edilmektedir.

139

Şekil 1.18: (a) Protaminde amino asit dizilişinin şematik çizimi. (b) Argininin

yan gruplarını ayıran alternativ bir yapının gösterimi. Bu şeliyle protaminin DNA ile

etkileşmelere girdiği düşünülmektedir. (c) Protaminin bir diğer olası helikal yapısı.

(Kaynak: F. P. OTTENSMEYER, R. F. WHITING, AND A. P. KORN, Three-

dimensional structure of herring sperm protamine Y-I with the aid of dark field

electron microscopy, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72, No. 12, pp. 4953-4955,

December 1975).

Protamin aracılıyla gerçekleştirilen DNA kondanzasyonu arginin grupların

DNA sarmalın her iki zincirini de kilitleyerek nükleik asiti transkripsyonel olarak

aktiv olmayan konformasyona dönüştürmektedir.

Bir katyonik polipeptid olan, polilizin (poly-L-lysine, PLL), DNA ile

etkileşmelere girip nükleik asit nanoparçacıklarınınoluşumuna neden olan ek proton

içeren amin gruplarını yapısında bulundurmaktadır (Şekil 1.20). Bu şekilde

oluşturulan nanoparçacıkların büyüklüğü PLL yapısal özelliklerine (lineer veya

zincirli) ve ortamın iyonik özelliklerine bağımlılık göstermektedir. DNA naklinde çok

etkili olmamasına rağmen, reseptörlere bağlanma kaabiliyeti gen taşıyıcı

potansiyelini artırmaktadır. Ayrıca, PLL-DNA kompleks oluşumu, DNA’yı hücresel

ortamda enzimatik degradasyondan koruduğuna dait raporlar bulunmaktadır

(SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).

140

Şekil 1.19: Hering protaminin (protamine (clupeine) Y-I.) yapısı.

Şekil 1.20: Lineer ve zincirli poli-L-lizinin kimyasal yapıları

(SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).

Polimerler.

Kitosan (Chitosan) doğal bir polimer olup glikozidik bağlarla birbirleriyle

bağlanan D-glükozamin ve N-asetil-D-glükozamin moleküllerini içeren iki alt

141

biriminden oluşmaktadır (Şekil 1.21). Nispeten daha az toksiktir ve DNA

nanopartikül oluşmasını takiben transfeksyon etkinliği oldukça yüksektir. Böylece,

kitosan ve çeşitli türevleri gen nakli konusunda gelecek vaat eden bileşikler olarak

görülmektedir.

Şekil 1.21: Kitosan (Chitosan)’ın kimyasal yapısı (SANTHAKUMARAN, et. al.,

2005).

Poli(etilen glikol) (PEG) ve poli(etilen oksid) (PEO) gibi nötr polimerler de

yüksek pI’de DNA kondanzasyonuna neden olmaktadır. Bu yük taşımayan ve esnek

polimerler “excluded volume mechanism” adıyla bilinen mekanizma ile etki

gösterirler. DNA kondanzasyonunun satbilitesini ve transfeksyon etkinliğini artırmak

amacıyla, çoğu zaman PEG PEI, folat reseptörleri ve poli-L-lizin ile konjuge edeilir

(SANTHAKUMARAN, et. al., 2005).

Sonuç olarak, üniversitelerde ve sanayii kuruluşlarının araştırma-geliştirme

(AR-GE) merkezlerinde, DNA ile reaksyona giren ve DNA nanoparçacıkların

oluşumuna neden olan çok sayıda sentetik veya doğal bileşenin viral olmayan gen

taşıyıcıların tasarlanmasındaki kullanım olasılıkları yoğun olarak araştırılmaktadır.

142

1.3. Taxol® (Paclitaxel).

1.3.1. Kanser Tedavisinde ve Kanserin Önlenmesinde Taxol®’un

Rolü

Konvansiyonel ilâç geliştirmesi genelde deneysel hayvanların ve hücre kültürü

düzeneklerinin kullanıldığı faz-1, faz-2 ve faz-3 olarak adlandırılan aşamaları içeren

klinik öncesi araştırmaları takip etmektedir. Genel olarak da, faz-3 çok sayıda

gönüllünün iştirak ettiği klinik deneylerinden ibarettir. Söz konusu aşamalı prosedür

çoğu zaman komplementer veya alternativ tedavilerle sonuçlanmamaktadır. Buna

ilâve olarak, etkili konsantrasyonları önceden ayarlanabilen total olarak sentezlenmiş

bileşenler dışında, doğal bitkisel kökenli malzemeden izole edilen aktiv olan etken

madde miktarları genelde çok düşüktür. Aynı şekilde, komplementer ve alternativ

terapilerle sonuçlanabilecek klinik öncesi araştırmalar çok nadir olup, double-blind

klinik araştırmalar da son derece nadir olarak uygulanmaktadır (Stohs, S.J., 2005).

Bu tür komplementer ve alternativ terapilerin izlediği aşama ve gelişmelerden farklı

olarak porsuk ağacından (Pacific Yew Tree, Taxus brevifolia, bk. Şekil No: 1.22) izole

edilen ve günümüzde antikanser tedavierinde çok başarılı bir şekilde yoğun olarak

kullanılan Taxol® (Paclitaxel24)’in buluşu ve geliştirilmesi olmuştur.

24 Jenerik ismi (Bk.: Stohs, S.J., 2005). Bu raporumda her iki (ticari ve jenerik) isim de kullanılmıştır.

143

Şekil 1.22.: Porsuk ağacının farklı türleri, Taxus brevifolia, Taxus baccata vs. (www.turkforum.net; www.conifers.co.nz; home.scarlet.be ve çok prestijli Max-Plank

Enstitüsü-caliban.mpiz-koeln.mpg.de sitelerinden alınmıştır).

Taxol®‘un saflaştırılması, karakterizasyonu, klinik öncesi ve klinik araştırma

süreçleri Food and Drug Administration (FDA)’nın konvansiyonel ilâç geliştirme ve

piyasaya sunma stratejilierini takip etmiştir (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995; Harlan,

Jr., W.R., 2001; Stohs, S.J., 2005)25.

1960’larda, National Cancer Institute (NCI) U. S. Department of Agriculture

(USDA) tarafından rastgele bitkisel kökenli örneklerin toplandığı ve bunların

antineoplastik aktivitelerinin tarandığı bir program başlatmıştır. Toplanan bitkiler

arasında, Washington Eyaletinden getirilen T. brevifolia’nın gövdesinden kısımlar,

yapraklar ve meyveler de bulunmaktaydı (Stohs, S.J., 2005). Bunlarla yapılan ilk

taramalar çeşitli neoplastik hücrelere karşı potansiyel aktivite endeksi olarak da

25 Bk.: Harlan, Jr. W. R., New opportunities and proven approaches in complementary and altenative medicine research at the National Institutes of Health. J. Altern. Compl. Med., 7, S53, 2001; Wall, ME.. and Wani, M.C., Camptothecin and taxol: discovery to clinic (13th Bruce F. Caine Memorial Award Lecture), Cancer Res., 55, 753, 1995; Wall, ME.. and Wani, M.C., Camptothecin and taxol: from discovery to clinic. J. Ethopharmacol., 51, 239, 1995- Taxol® ‘un geliştirme tarihçesini ve klinik kullanımını özetleyen bir derlemedir.

144

kabul edilen, T. brevifolia ekstraktlarının 9KB hücrelere karşı yüksek bir

sitotoksisiteye sahip olduğu saptanmıştır (Stohs, S.J., 2005)26.

1964 yılında, Research Triangle Institute, Research Triangle Park, N. C.,’da

bulunan Wall’un laboratuvarı, National Cancer Institute tarafından gönderilen ilk T.

brevifolia bitkisel malzemeleri incelemek üzere kabul etmiştir. Saflaştırma ve

sitotoksisite prensipleri Walker WM katı tümör inhibisyonunu içeren biyoaktivite

göstergeleri kullanarak yapılmıştır (Stohs, S.J., 2005). Kasım 1966’dan itibaren, Wall

ve Wani (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995) bu bitkiden çok yüksek sitotoksik aktiviteye

sahip bir fraksyon izole etmişlerdir. 2 yıllık bir saflaştırma sürecini takiben, standart

etanol ekstraksyonu, H2O ile kloroform arasında oluşan etanol kısmının faz ayrımını

sonucu counter current dağlımını içeren aktiv bileşen izole edilmiştir. Taxol ismi, söz

konusu molekülün hidroksil grupları içerdiği (-ol) ve taxane çekirdeğinin bulunduğu

yapıya dayanarak (Bk.: Şekil 1.26.), T. brevifolia’dan izole edilmiş bileşene verilen bir

isimdir.

Taxol®‘un yapısal analizi, ultraviyole (UV; morötesi), kızılötesi (IR) ve kütle

spektrometresi ölçümleriyle yapılmıştır ve 1971 yılında (Wani et al., 1971) bu yapı

ayrıntılı olarak aydınlatılmıştır27. Taxol®‘un (Paclitaxel’in) yapısı Şekil 1.26’da

verilmiştir. 1960’lı yıllarda yapılan araştırmalarda Taxol®‘un L1210 ve 1534 türü

lösemi hücrelere karşı aktivitesi bulunduğu gösterilmiştir. Taxol®‘un ayrıca birçok

katı tümöre karşı aktiv olduğu gösterilmiştir (Wall, M.E ve Wani, M.C., 1995; Stohs,

S.J., 2005).

Taxol®‘un etki mekanizmasının aydınlatılması, bu sitotoksik ajanın klinik

araştırmalarda kullanılmasında önem taşımıştır. İlk araştırmalar, bir mitotik

inhibitör olarak etki ettiği ve böylece yeni ve daha başka örneği bulunmayan bir

mekanizma söz konusu olduğunu kanıtlamıştır28. Taxol®‘un yapısı ve fizikokimyasal

özellikleri Ek-7 verilmiştir. Daha ayrıntılı bilgi için Ek-7’e başvurulmalıdır.

26 Bk.: Stohs, S.J., Taxol in CCncer Treatment and Chemoprevention. In: Phytopharmaceuticals in Cancer Chemoprevention, Debasis Bagchi and harry G. Preuss (Eds.), CRC Pres, Boca Raton, London, New York, Washington D. C., 2005, pp. 519-524. 27 Bk.: Wani, M.E., Taylor, H.L. Wall, M.E., Coggan, P. and Mc Phail, A.T., Plant antitumor agents VI: the isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia, J. Am. Chem. Soc. 93, 2325, 1971. 28 Bk.: Fuchs, D. A ve Johnson, R. K. Cytologic evidence that taxol, an antineoplastic from Taxus brevifolia, acts as a mitotic spindle poison, Cancer Treat. Rep., 62, 1219, 1978.

145

Ancak, daha sonraki araştırmalar söz konusu mekanizmanın mikrotübülleri

stabilize ettiğinden ve bunların tekrar tübüline geri depolimerizasyonunu

engellediğinden, yani kolisin, vinkristin, vinblastin ve podofilotoksin gibi diğer

antimitotik ajanların etki mekanizmalarının aksine çok farklı bir yol takip ettiğini

göstermiştir (Schiff, P. B., et al. 1979; Horwitz, S. B., 1992)29.

Hayvanlar üzerinde deneyler 1982 yılında yapılmış olup, faz-1 klinik aşaması

1983-84, faz-2 ise 1983-86 yıllarında tamamlanmıştır (Wall, M. E. ve Wani, M. C.,

1995; Stohs, S. J., 2005). ABD Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) 1991 yılında yeni ilâç

uygulama şemasını elde ettiğinden dolayı Cooperative Research and Development

Award (CRADA) adlı ödülü Bristol-Myers Squibb şirketine vermiştir.

Taxol® ilk olarak son derece yavaş büyüyen Taxus brevifolia’nın kabuğundan

izole edilmiştir. Taxol® çok düşük miktarlarda bu ağacın kabuğunda bulunmaktadır

ve bundan dolayı uzun süre klinik kullanımı sorun olmuştur. Bu sorun, başka taxus

türlerinde, örneğin T. baccata’nın yapraklarında çok daha yüksek miktarlarda

bulunan baccatin III veya 10-deacetylbaccatin III’ten Taxol®’un yarısentezini

gerçekleştiren Bristol-Myers Squibb şirketince çözülmüştür (Bk.: Şekil 1.24).

Taxol®’un total sentezi ile ilgili bk.: Ek-8. Taxol®’un total sentezi iki ayrı grup

tarafından yapılmıştır. Yapısından da anlaşılacağı üzere (Şekil 1.26), çok sayıdaki

asimetrik C-atomu total sentezi son derece güçleştirmektedir. Taxol®’un söz konusu

total sentezi bu ilâcın pratik olarak stoklanması anlamına gelmemesine rağmen, o

yıllarda Taxol®’un kimyası hakkında önemli bilgiler vermiştir. Bunun dışında,

Taxol®’un analoğu olan Taxotere™ (Docataxel) (Şekil 1.27) hazırlanmıştır, test

edilmiştir ve her ikisinin de klinik olarak kullanılabilecekleri kararına varılmıştır

(Stohs, S. J., 2005).

1.3.2. Taxol®’un ve Taxotere™’in Klinik Kullanımı.

Rahim karsinom ve non-small-cell lung kanser vakalarında radyoterapi veya

cerrahi müdahalelerin uygun görülmediği hastalarda cisplatin ile birlikte Taxol® ilk

başvurulan çok etkili bir ilâçtır (Bk.: Şekil 1.25). Aynı şekilde, refraktor metastatik

29 Bk.: Schiff, P. B., Fant, J. ve Horwitz, S. B., Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol, Nature, 22, 665, 1979: Horwitz, S. B., Mechanism of action of taxol, Trends Pharmacol. Sci., 13, 134, 1992.

146

rahim karsinom vakalarında ve kombinasyon terapinin başarısızlıkla

sonuçlandığında metastatik hastalık için veya adjuvant kemoterapi sonrası dönemler

için bu ilâç birinci derecede önem kazanmıştır. Bunun dışında, AIDS’e bağlı Kaposi

sarkomlarda ikinci derecede önemlidir (Stohs, S. J., 2005).

Ayrıca, standard tedavi yöntemlerden şimdiye kadar üstünlüğü kanıtlanmış olsa

bile, head and neck karsinomlarda Taxol®’un yine etkili bir şekilde kullanılmaktadır.

4-hidroksitamoxifen ile birlikte kullanıldığında, estrojen-reseptör-negativ barsak

kanserine ve akciğer kanser hücre kültürlerinde etkili olduğu gösterilmiştir (Stohs, S.

J., 2005). Bu kombinasyon, tek başına kullanıldığı zaman gösterdiği etkiden çok daha

yüksek bir potansiyeli olduğu gösterilmiştir (Stohs, S. J., 2005).

Taxol®’un çok sitotoksik olduğundan, bu ilâçla tedavi edilen hastalarda yan

etkilerinin de görülmesi beklenmektedir. Tek başına Taxol® ile tedavi edilen katı

tümörlü hastalaın 90%’nında nötropeni ve lökopeni gibi omur iliği baskılanmaları

görülmüştür. Bu ilâçla tedavi edilen hastaların 75%’inde ise anemi görülmektedir.

Sonuç olarak, Taxol®’un fizikokimyasal özelliklerini optimize etmek suretiyle bu yan

etkileri azaltmak mümkün olacaktır. Bu amaçla, bu ilâçın çeşitli kontrollü salınım

sistemleriyle denenmesi gerekmektedir. Projemde yer alan Taxol®-fosfolipid

kompleks oluşumunun incelenmesi de bu hususu vurgulamaktadır. Bu tür lipide

(lipozomal) bağlı formülasyonlarının geliştirebilmesi kuşkusuz Taxol® ‘un yan etkileri

ve çözünürlülük problemleri çok daha azaltılmış olarak uygulama fırsatı yaratacaktır.

147

Şekil 1.23. Taxol’un popülaritesini gösteren bir şekil. Dünya üniversitelerin 80%’inde kullanılan Genel Kimya ders kitabının kapağında yer almaktadır (Bk.: General, Organic, and Biochemistry (Hardcover); by Katherine J Denniston, Joseph J

Topping, Robert L Caret, McGraw-Hill Science/Engineering/Math; 4 edition (Mar 4 2003).

148

1.24. Bristol-Myers Squibb tarafından yayımlanan monografi (Kaynak: www.ja-text.de/Print.php).

149

(Kaynak: www.brandinstitute.com/NEWS/MEDAD_11_04.HTM)

150

1.25. Üst kısım: Kuzey Amerika’da klinik kullanımda olan en popüler ilâçları gösteren bir kıyaslama tablosu. Alt kısım: Taxol® tedavisinin etkinliği (Kaynak: www.rmj.ru/articles_3834.htm)31. Bu şekil daha önce verilen Şekil 1.2 ve 1.3 ile

kıyaslanmalıdır.

30 Bu sonuçlar aşağıdaki yayınlara dayanmaktadır: 1. Pazdur R., Kudelka A.B., Kavanagh J.J., et al. // The taxoids: paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere). // Cancer Treat. Rev. 1993, 19:351–386. 2. Gelmon K. // The taxoids: paclitaxel and docetexel. // Lancet, 1994, 344:1267–1272. 3. Bissery M.C., Nohynec G., Sanderink G.J., Lavelle F. // Docetaxel (Taxotere): a review of preclinical and clinical experience. Part 1: preclinical experience. // Anticancer Drugs. 1995, 6:339–368. 4. Hortobagyi G.N. // Recent progress in the clinical development of docetaxel. // Sem. Oncol. 1999, 26 (3 Suppl.9):32–36. 5. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte–Volgelein F., Lavelle F. // Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a taxol anologue. // Canc. Res. 1991; 51:4845–4852. 6. Harrison S.D., Dykes D.J., Shepherd R.V., Bissery M.C. // Response of human xenografts to taxotere. // Proc. AACR 1992, 33:526. 7. Bruno R., Hille D., Thomas L., et al. // Population pharmacokinetics/ pharmacodinamics of docetaxel (Taxotere) in phase II studies. // Proc. ASCO 1995, ab. 147. 8. Fumoleau P., Chevallier B., Kerbrat P., et al. // Current status of taxotere as a new treatment in breast cancer. // Br. Canc. Res. Treat. 1994; 33:39–46. 9. Cortes J.E., Pazdur R. // Docetaxel. // J. Clin. Oncol., 1995:2643 10. Vikeljia S.J., Baker W.J., Burris H.A. III, et al. // Peridoxine therapy for palmarplantar erythrodysesthesia associated with taxotere. // N.Nat. Canc. Inst. 1993; 85:1432. 11. New P.Z., Jackson S.E., Rinaldi D., et al. // Peripherial neurotoxicity secondary to docetaxel. // Neurology 1996; 46:108. 12. Semb K.A., Aamdal S., Oian P. // Capillary protein leak syndrome appears to explain fluid retention in cancer patients who receive docetaxel treatment. // J. Clin. Oncol. 1998; 16:3426. 13. Lembersky S., Anderson R., Smith A. et al. “Phase II Trial of Doxorubicin and Docetaxel for Locally Advanced and Metastatic Breast Cancer: Preliminary Results from NSABP BP–57.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 403. 14. Raab G., Wilke H., Eidtmann H. et al. “Phase II Stady of Docetaxel and Epirubicin as First Line Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 442.

151

15. Tubiana–Hulin M., Bonneterre J. et al. “Better survival with epirubicin–docetaxel (ET) combination as first–line chemotherapy in patients with metastatic breast cancer (MBC): final results of a phase II randomized study.” // Pr. ASCO.– 2003.– Vol. 23.– P182. 16. Горбунова В.А. «Таксаны в новых лекарственных комбинациях». // Мат. Конф. «Новые противоопухолевые препараты в лечении рака». – Москва.– 28–30 сентября 1999г. 17. Nabholtz J.M., et al. // A phase III trial comparing doxorubicin and docetaxel (AT) to doxorubicin and cyclophosphamide (AC) as first line therapy for MBC. // Proc. ASCO, 1999; 18:1279. 18. Marty M., et al. // Randomized Phase II trial of the Efficacy and Safety of Transtuzumab Combined with Docetaxel in Patients with Human Epidermal Growth Factor Receptor Z–Positive Metastatic Breast Cancer Administered As First–Line Treatment. The M77001 Study Group. // J. Clin. Oncol. 23:4265–4274, 2005. 19. Sato et al. // High pathological response with the combination of docetaxel and transtuzumab as preoperative systemic treatment in breast cancer patients overexpressing Her2. A multicenter phase II study of JECBC. // Abctract ESMO 067, 152 p. 20. Nabholtz J.M., Plenkowski T., Mackey J., et al. // Phase III trial comparing TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) with FAC (5–fluororacil, doxorubicin, cyclophosphamide) in the adjuvant treatment of node positive breast cancer patients: interim analysis of the BCIRG 001 Study. // Proc. ASCO 2002, ab. 141. 21. Aura A Erazo Valle–Solis et al. // Cost–effectiveness analysis of adjuvant docetaxel, doxorubicin and cyclophosphamide regimen (TAC) versus 5–fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide (FAC) in early breast cancer at the Mexican social security inctitut (IMSS) Mexico. // Abstract ESMO 062, 294 p., 2006. 22. Martin M., Pienkowski T., Mackey J., et al. // Adjuvant docetaxel for node–positive breast cancer. // N. Engl. J. Med., 2005; 352:2302–13. 31 Bu sonuçlar aşağıdaki yayınlara dayanmaktadır: 1. Pazdur R., Kudelka A.B., Kavanagh J.J., et al. // The taxoids: paclitaxel (Taxol) and docetaxel (Taxotere). // Cancer Treat. Rev. 1993, 19:351–386. 2. Gelmon K. // The taxoids: paclitaxel and docetexel. // Lancet, 1994, 344:1267–1272. 3. Bissery M.C., Nohynec G., Sanderink G.J., Lavelle F. // Docetaxel (Taxotere): a review of preclinical and clinical experience. Part 1: preclinical experience. // Anticancer Drugs. 1995, 6:339–368. 4. Hortobagyi G.N. // Recent progress in the clinical development of docetaxel. // Sem. Oncol. 1999, 26 (3 Suppl.9):32–36. 5. Bissery M.C., Guenard D., Gueritte–Volgelein F., Lavelle F. // Experimental antitumor activity of Taxotere (RP 56976, NSC 628503), a taxol anologue. // Canc. Res. 1991; 51:4845–4852. 6. Harrison S.D., Dykes D.J., Shepherd R.V., Bissery M.C. // Response of human xenografts to taxotere. // Proc. AACR 1992, 33:526. 7. Bruno R., Hille D., Thomas L., et al. // Population pharmacokinetics/ pharmacodinamics of docetaxel (Taxotere) in phase II studies. // Proc. ASCO 1995, ab. 147. 8. Fumoleau P., Chevallier B., Kerbrat P., et al. // Current status of taxotere as a new treatment in breast cancer. // Br. Canc. Res. Treat. 1994; 33:39–46. 9. Cortes J.E., Pazdur R. // Docetaxel. // J. Clin. Oncol., 1995:2643 10. Vikeljia S.J., Baker W.J., Burris H.A. III, et al. // Peridoxine therapy for palmarplantar erythrodysesthesia associated with taxotere. // N.Nat. Canc. Inst. 1993; 85:1432. 11. New P.Z., Jackson S.E., Rinaldi D., et al. // Peripherial neurotoxicity secondary to docetaxel. // Neurology 1996; 46:108. 12. Semb K.A., Aamdal S., Oian P. // Capillary protein leak syndrome appears to explain fluid retention in cancer patients who receive docetaxel treatment. // J. Clin. Oncol. 1998; 16:3426. 13. Lembersky S., Anderson R., Smith A. et al. “Phase II Trial of Doxorubicin and Docetaxel for Locally Advanced and Metastatic Breast Cancer: Preliminary Results from NSABP BP–57.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 403. 14. Raab G., Wilke H., Eidtmann H. et al. “Phase II Stady of Docetaxel and Epirubicin as First Line Chemotherapy in Metastatic Breast Cancer.” // Pr. ASCO.– 2000.– Vol. 19.– abstr. 442. 15. Tubiana–Hulin M., Bonneterre J. et al. “Better survival with epirubicin–docetaxel (ET) combination as first–line chemotherapy in patients with metastatic breast cancer (MBC): final results of a phase II randomized study.” // Pr. ASCO.– 2003.– Vol. 23.– P182. 16. Горбунова В.А. «Таксаны в новых лекарственных комбинациях». // Мат. Конф. «Новые противоопухолевые препараты в лечении рака». – Москва.– 28–30 сентября 1999г. 17. Nabholtz J.M., et al. // A phase III trial comparing doxorubicin and docetaxel (AT) to doxorubicin and cyclophosphamide (AC) as first line therapy for MBC. // Proc. ASCO, 1999; 18:1279.

152

Şekil: 1.26. Taxol®‘un kimyasal yapısı. Molekülün diterpen kısmı sarı renkle gösterilmiştir. Daha iyi renkli bir görünüm için bu proje raporumla

birlikte sunduğun CD’ye bakınız. Bu diğer şekiller için de geçerlidir.

Şekil 2.27. Docataxel veya Taxotere™ (Kaynak: chimie.scola.ac-paris.fr/Sitedechimie/chi_org...).

18. Marty M., et al. // Randomized Phase II trial of the Efficacy and Safety of Transtuzumab Combined with Docetaxel in Patients with Human Epidermal Growth Factor Receptor Z–Positive Metastatic Breast Cancer Administered As First–Line Treatment. The M77001 Study Group. // J. Clin. Oncol. 23:4265–4274, 2005. 19. Sato et al. // High pathological response with the combination of docetaxel and transtuzumab as preoperative systemic treatment in breast cancer patients overexpressing Her2. A multicenter phase II study of JECBC. // Abctract ESMO 067, 152 p. 20. Nabholtz J.M., Plenkowski T., Mackey J., et al. // Phase III trial comparing TAC (docetaxel, doxorubicin, cyclophosphamide) with FAC (5–fluororacil, doxorubicin, cyclophosphamide) in the adjuvant treatment of node positive breast cancer patients: interim analysis of the BCIRG 001 Study. // Proc. ASCO 2002, ab. 141. 21. Aura A Erazo Valle–Solis et al. // Cost–effectiveness analysis of adjuvant docetaxel, doxorubicin and cyclophosphamide regimen (TAC) versus 5–fluorouracil, doxorubicin and cyclophosphamide (FAC) in early breast cancer at the Mexican social security inctitut (IMSS) Mexico. // Abstract ESMO 062, 294 p., 2006. 22. Martin M., Pienkowski T., Mackey J., et al. // Adjuvant docetaxel for node–positive breast cancer. // N. Engl. J. Med., 2005; 352:2302–13.

153

1.3.4. Taxol®’un Etki Mekanizması.

Taxol®’un hücresel mikrotübüllerdeki32 bağlanma bölgesi hücresel işlevi

bilinmeyen bir farmakolojik hedeftir. Mikobakteri kaynaklı epotilonlar, deniz yosunu

kaynaklı diskodermolidler ve yumuşak mercanlardan elde edilen elenterobinler ibi

doğal bileşenler, mikrotübüllerdeki bağlanma bölgesine yerleşerek Taxol®’un

sitotoksik etkilerine benzer etki göstermektedirler. Mikrotübülleri stabilize eden

bileşenler adı verilen bu moleküller, mikrotübüllere bağlanarak dinamiklerini bloke

etmekte ve böylece hücre bölünmesini sonlandırmaktadırlar (Bk.: Şekil 1.28-1.31).

Taxol® ve türevleri yumurtalık kanseri, metastatik göğüs kanseri, head and neck

kanseri ve böbrek kanseri tedavilerinde başvurulan başlıca ilâçtır (Bk. özellikle Şekil

1.25. Ayrıca bk.: Şekil 1.2 ve 1.3). GTP aracılıyla Taxol®’un mikrotübüllere bağlanma

noktası olarak mikrotübül lumeninin (boşluğunun) β – tubulin altbirimi

belirlenmiştir (Bk.: Şekil 1.31).

Taxol®’un bağlanma kinetiğini ve ligandlara karşı afininitesini incelemek için

en duyarlı yöntem olarak floresan işaretli taxoid Flutax-2’in kullanılması olmuştur

(Şekil 1.32). Görüldüğü üzere, floresan mikroskopik inceleme taxoidlerin çözeltideki

mikrotübüllere doğrudan bağlandığını göstermektedir. Cyclostreptin hücre

mikrotübülleri stabilize eden ilk moleküldür ve bunlara kovalent olarak bağlanarak

tersinir olmayan bir etki yapmaktadır. Bu ligandı kullanarak, Taxol®’un

mikrotübüllere bağlanma mekanizması ve ayrıca da biden fazla bağlanma noktası

bulunduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu kovalent bağlanma, P-glikoproteini eksprese

eden hücre kültürlerinde bu ilâcı aktiv hale getirmektedir.

32 Hücre mikrotübülleri hakkında daha ayrıntılı bilgi için Moleküler Hücre Biyolojisi ders kitaplarına başvurulmalıdır.

154

Şekil. 1.28. Taxol®’un hücre bölünmesi üzerine etkisi (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).

Şekil 1. 29. Taxol®’un mikrotübül dinamiği üzerindeki etkisi (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).

155

Şekil 1. 30. Taxol®’un hücre mikrotübüller üzerinde ve programlanmış hücre ölümüne (apoptoza) yol açan çeşitli etkileri. (Kaynak: biologyofcells.blogspot.com/2007/12/microtubu...).

156

Şekil 1.31. Taxol®’un mikrotübül dimerlerine bağlanma şekli (Kaynak: pubs.rsc.org/ej/CC/2001/b100070p/).

157

Şekil 1.32. Mikrotübül stabilize edici moleküllerin hüceresl mekanizmaları. PtK2 hücrelri during 7 saat boyunca cyclostreptin yokluğunda (A) veya 5 µM (B) ve 10 µM paclitaxel (C) varlığında. Hücreler daha sonra yıkanıp, bu hücre kültüründe 16 saat boyunca bu şekilde bırakılmışlardır, kontrol (D), 5 µM cyclostreptin (E) ve 10 µM

paclitaxel(F). (Kaynak: biologyofcells.blogspot.com/2007/12/microtubu...).

1.3.5. Projemin Bilimsel Dayanağı.

Yukarıda ayrıntılı olarak verilen Taxol® etki mekanizması uyarınca,

mikrotübüllerin iç yüzeyinde meydana gelen bu tür üç boyutlu bağlanma şekli,

prensip olarak uzay geometrisi engelleri bakımından bağlanmayı çok zor bir hale

getirmektedir. Bu yüzden Taxol®‘un bağlanma afinitesi, kinetiğini ve üç boyutlu

şekilleri hakkında ek bilgilere ihtiyaç vardır. Çünkü bu tür bilgiler daha ileriki

aşamalarda Taxol®‘un hem daha etkili farmasötik terapötik formülasyonlarının

geliştirilmesini, hem de hücre seviyesindeki Taxol®‘un etki mekanizmasını çok daha

iyi bir şekilde anlaşılmasını mümkün kılacaktır. Bu her iki nokta da projemde

özellikle vurgulanmıştır. Bu bağlamda da, şu ana kadar teklif edilen etki

mekanizmasına muhtemel alternativler sunulmalıdır. Tarihsel olarak da zaten, aynı

mantık ve düşünce tarzı anestetiklerin etki mekanizmaları için de izlenmiştir.

Örneğin, anestetiklerin33 etkileri sadece Meyer veya Overton yasalarına dayanarak

Octanol-Water Partitioning sabitlerini hesaplayarak açıklanamamıştır. Çok daha

33 Aynı gerekçeler diğer ilâçlar için de geçerlidir.

158

sonraları bunların etki mekanizmalarına projemde de olduğu gibi lipid teorileri dahil

edilmiştir34.

Bu projemde de zaten Taxol®‘un bu etki mekanizmalarını aydınlatacak niteliği

taşıyan ek bir öncü hipotez sunulmuştur. Çünkü söz konusu etki mekanizması,

kullanılan tümör hücre kültürü türüne göre de farklılıklar göstermektedir. Projemde

öncü hipotez olarak Taxol®‘un hücre zarının akışkanlığını düzenleyerek ve dolayısıyla

da buradaki ilâç difüzyonlarını ve reseptörlerin dinamiğini kontrol ederek etki

mekanizması teklif edilmiştir. Literatür taraması da gösteriyor ki35, şu ana kadar

böyle bir bağlantı çalışılmamıştır. Bu bakımdan projemin orijinalliği tartışılamaz hale

getirilmiştir. Bu hususları Bilimsel Araştırma Proje Birimine daha projemin ilk sunuş

metninde açıkça ifade edilmiştir. Daha çok ayrıntı için bu proje teklifim

incelenmelidir. Söz konusu hipotezim de normal hücrelerle tümör hücreleri

arasındaki membran akışkanlığında gözlenen farklılıklarına dayanmaktadır36. Bu

konuya ayrıca Yorum bölümünde de ayrıntılı olarak değenilmiştir.

Multidrug Resistance (MDR) adı verilen antineoplastik ajanlara karşı gelişen

direnç mekanizmalarının ortaya çıkması sonucu Taxol® ile gerçekleştirilen

kemoterapilerde her zaman tatmin edici sonuçlar alınmamaktadır. Söz konusu MDR

olayları P-glikoprotein (P-gp) gibi membran pompapalarının aşırı ekspresyonu

sonucu meydana gelmektedir ve kemoterapötik ilâçları sitoplazmadan hücre dışına

pompalayarak bunların intraselüler konsantrasyonunu ve böylece de kemoterapilerin

etkinliğini düşürmektedir. P-gp de membran glikoproteini olduğundan Taxol® ile

hücre zarları arasında oluşan moleküleretkileşmelerinin önemini vurgulamaktadır.

Projemde de bu etkileşmeler çeşitli fosfolipid molekülleri kullanarak model hücre zarı

yüzeyleri ile modellenmiştir. MDR hücre türlerini öldürebilen Taxol® ligandlarını

bulmak için bu projemde elde edilen verilere dayanarak daha sonraki aşamalarda bu

modelleri dirençli ve dirençsiz hücre kültürleri üzerinde denenebilir. Bu amaçla, bu

projemde geliştirilen etkileşme modellerine dayanarak Taxol®’un bazı tümör hücre

kültürlerinin hücre mikrotübülleri üzerinde, hücre bölünmesi ve hücre döngüleri

üzerindeki etkileri incelenebilir. Ancak bu şekilde bu ligandların afinitelerinden yola

34 Bu konularla ilgili özellikle bk.: Drug-Membrane Interactions. Analysis, Drug Distribution, Modeling. J. K.

Seydel and . Wiese (Eds.)., Methods and Principles in Medicinal Chemistry, Vol. 15, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Germany, 2002, 35 Bk.: Ek-5 ve Ek-6. 36 Bu çok önemli konu için bk.: Chapter 9: Membranes in Cancer. In: Howard R. Petty, Molecular Biology of

Membranes. Structure and Function, Plenum Press, New York and London, 1993, pp. 353-374.

159

çıkarak araştırılan maddelerin Taxol® ve türevlerinin bağlanma noktasındaki

sitotoksisitelerini ortaya çıkaracaktır ve böylece yüksek afiniteli bileşenlerinin

tasarımını ve sentezini mümkün kılacaktır. Bu hususlar projemin moleküler hücresel

boyutunu teşkil etmektedir.

Bunun dışında projemin bir de daha pratik biyoteknolojik boyutu da vardır.

Sunduğum projenin nanofarmasötik biyoteknolojik boyutu olarak, model hücre

yüzeyi - Taxol® nanometrik bileşenlerin fizikokimyasal özelliklerinin yeni bir

laboratuvar protokolü geliştirerek şu ana kadar çok az uygulanan Langmuir-Blodgett

tek katman (lipid monolayer) düzeneği ile incelenmesi ile ilgilidir. Şimdiye kadar

yayımlanan deneysel tasarımlardan farklıdır ve kanımca orijinal bir yaklaşımdır. Şu

ana kadar yayımlanmış çalışmalarda, Taxol® - hücre membran lipid modellerini

teşkil eden antineoplastik ajan veya bir başka model terapötik formülasyon ve

katiyonik lipidlerle girdikleri tepkimeler neticesinde elde edilen bileşenlerin daha

sonraki intraselüler penetrasyon deneyler esnasında hücre kültüründe terapötik

bileşenlerin uygun bir şekilde taşınma kapasiteleri ile ilgili olarak, ön biyofiziksel

ölçümlere ve bunu takip eden morfolojik karakterizasyonlardan ibarettir. Ancak, söz

konusu katiyonik lipidler sitotoksik olduklarından, in vivo ortamda serum

stabiliteleri son derece düşüktür. Sunduğum projede ise, orijinal bir alternativ olarak

katiyonik lipidler yerine zwitteriyonik (nötr) fosfolipidlerin kullanılmasını

önermekteyim. Bunlar arasında aynı amaçla tasarlanan nükleik asitlere dayalı

formülasyonlarının fizikokimyasal sabitlilikleri ve termodinamik özellikleri

yayımlanmıştır. Ancak, aynı modelin daha küçük hacimli antineoplastik ajanlar ile de

geçerli olup olmadığı henüz daha araştırılmamıştır. Ayrıca, sekonder yapıları ve bu

dinamik yapılardaki meydana gelen değişikliklerin hücre içi geçiş yaparak hücre

çekirdeğindeki DNA’ya bağlanma potansiyellerini nasıl etkilediği konusu henüz daha

bilinmemektedir.

1.3.6. Literatür Özeti

Taxol®’un etki mekanizmasıyla ve tedavi potansiyeli ile bir hayli fazla yayın

bulunmaktadır. Bunların en güncel olanları Ek-5’te verilmiştir. Bunun dışında ilâç

tedavilerine paralel olarak son yıllarda çok popüler olan gen aktarım yöntemleriyle

kanser tedavi profilleri de Ek-6’da verilmiştir.

160

2. GEREÇ VE YÖNTEM

Bu projemde Taxol® (Paclitaxel) ile model hücre yüzeyleri arasında oluşan

moleküler etkileşmelerin simüle edilmesini mümkün kılan bir düzeneğin

tasarlanması amaçlanmıştır. Söz konusu düzeneği anlayabilmek için yüzey kimya ve

kolloid kimya kavramlarını çok iyi bilmek lâzım. Özellikle hücre membranın yapısı ve

fizikokimyasal özellikleri ile yüzeysel aktivite kavramları çok önemlidir. Bu amaçla,

bu proje raporumu inceleyecek olanlara yardımcı olmak amacıyla aşağıdaki bölümde

ilk önce hücre membran yapısı ile ilgili güncel bilgiler verilmiştir. Daha sonra da

projemde geliştirilen deneysel protokole ayrıntılı olarak yer verilmiştir. Bu protokole

dayanarak, başka ilâçların da membran afiniteleri incelenebilir.

2.1. HÜCRE MEMBRAN YAPISI

2.1.1. Biyomembranların İçeriği

Membranlar hücre işlevlerinin yerine getirilmesinde hayati bir rol oynar.

Plazma membranı hücreyi çevrileyerek iç hacminde bulunan sitozol ile dış çevre

arasındaki önemli farklılıklarını muhafaza eder. Hücre içi ortamda farklı bileşen, yapı

ve işleve sahip birçok organel ve cisimcik bulunur. Organeller yerine getirdikleri

işlevlerine göre farklı olarak isimlendirilirler ve böylece eukaryot hücrelerde

endoplazmik retikulum, Golgi cismi, mitokondri, kloroplastlar ve membrana-bağlı

organeller ayırt edilmektedir (Şekil 2.1).

161

Şekil 2.1. Hücre membranı (www.microscopy-uk.org.uk/.../membranes.html

sitesinden alınmıştır).

Membranlar her organelin iç hacmindeki içeriği ile sitozol arasında bulunan

karakteristik farklılıkları muhafaza eder. Hücre membran yapısının kavramı Singer

ve Nicholson tarafından (Şeki 2.2) teklif edilen ve sıvı-akışkan veya “fluid-mozaic”

membran modeli olarak da adlandırılan lipid çift katman (lipid bilayer) yapıya

dayanmaktadır. Günümüzde hücre membranı kavramı karbonhidratlar, pigmentler,

antikorlar, reseptörler ve diğer proteinleri de içerecek şeklinde geliştirilmesine

rağmen (Şekil 2.3), hala geçerliliğini koruyan fluid-mozaic membran modeline göre,

hücre membranlarını oluşturan fosfolipidler amfipatik olup suya afinitesi yüksek olan

(hidrofilik) ve sudan uzaklaştırılan (hidrofobik) kısımları içerir.

162

Şekil 2.2. Biyomembranların günümüzde geçerli olan Singer ve Nicholson modeli

(www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm).

163

Şekil 2.3. Biyolojik membranların yapısı

(www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm).

Şekil 2.4. Biyomembran yapısında yer alan fosfolipidlerden tipik bir görünüm (Bk.:

www.umass.edu/microbio/rasmol/cutlips.htm ve

www.agen.ufl.edu/.../lect/lect_06/lect_06.).

Bu makromoleküller birçok hayvan hücre membran hacminin yarısını

oluşturup, geriye kalanı ise proteinlerden oluştuğu bilinmektedir. Fosfolipidlerin

çift katmanlar (bilayers, Şekil 2.4) söz konusu lipidlerin bu amfipatik doğasından ve

şekillerinden kaynaklanmaktadır. Böylece, lipid moleküllerin su tarafından

çevrildiklerinde hidrofobik kısımlarının iç hacminde ve hidrofilik başlar da suya

doğru yer alacak şekilde çeşitli agregatlar ve toplaşımlar (self-assemblies) meydana

getirirler.

164

Hücre membranların lipid çift katmanları (Şekiller 2.2-2.4) fosfolipidler,

kolesterol ve glikolipidler gibi üç ayrı çeşit membran lipid molekülü içermektedir.

Hücre membranının iç ve dış tek katmanları (monolayers) lipid içeriği bakımından

birbirinden farklıdır. Buna benzer farklı lipid karışımları eukaryotik hücrelerin

çeşitli organel membranlarında da mevcuttur. Böyle bir asimetrik membran lipid

çift katman modeli söz konusu lipidlerin iki boyutlu lipid molekülleri içinde

yerleşmiş membran proteinlerin bulunduğu yapısal tasarımına dayanmaktadır.

Böylece, bazı membran proteinleri işlevlerini yerine getirmek için spesifik baş

gruplarına ihtiyaç duyar. Aynı şekilde, suyun proteinler için bir üç-boyutlu çözücü

rölü oynar ki böylece birçok enzim bu çözeltilerde aktiviteleri için seçici olarak bir

metal iyona gereksinim duyar.

Biyolojik membranların temel yapısı lipid çift katmana dayanmasına rağmen,

spesifik işlevlerin çoğu proteinlerce gerçekleştirilmektedir. Bu doğrultuda,

membranda yer alan proteinlerin miktarı ve türü geniş sınırlar içinde

değişmektedir. Sinir hücresi aksonlarda elektrik yalıtkanlığı görevi yapan proteinler

membran kütlesinin 25%’den daha düşük bir miktarı oluştururken, mitokondrinin

ve kloroplastlarda iç membranların enerji iletimi görevi üstlenen zarda ise ~75%’i

proteindir. Genel olarak, plazma membranın içeriğinin 50% proteinlere düşer.

Protein moleküllere kıyasla lipid molekülleri daha küçük olduklarından her zaman

hücresel ortamlarda proteinlerden daha fazla oranda lipid molekülleri bulunur. Bu

oranı genelde membranlarda her proteine karşılık olarak 50 lipid molekülün

bulunduğu gerçeğiyle de açıklanır.

Membran proteinleri birçok işlev görür. Plazma membranında dış uyarılara

sensör cevabını gerçekleştiren proteinler bulunur. Bu şekilde bu protein sensörleri

veya reseptörleri bilgi taşınımında da görev yapar. Diğer membran proteinleri

zarlar arasındaki iyon gradyantlarını meydana getirir. Bu gradyantlar ATP

sentezinde, önceden seçilmiş maddelerin transmembran taşınımında, veya kas ve

sinir hücrelerinde elektrik sinyallerin iletiminde kullanılır. Değişik işlevlerine

rağmen, tüm biyolojik membranlar genel bir yapıya sahiptir-her biri lipid ve protein

moleküllerince oluşturulan ince film tabakasıdır (Şekiller 2.2-2.4).

165

Biyolojik membranların iki boyutlu akışkanlar olduğu kavramı membranın

yapı-aktivite ilişkisinin ortaya çıkarılmasında büyük bir rol oynamıştır. Ancak,

membranı sadece lipid denizinde serbestçe yüzen proteinlere dayanan model bir

hayli basitleştirilmiş olduğu ortaya çıkmıştır. Birçok hücre meydana getireceği

işlevin kolaylaştırılması doğrultusunda birçok lipid ve protein molekülü lipid çift

katmanı üzerindeki belli bir yüzeyde yoğunlaştırır. Böylece membran domenler ve

membran dinamiği kavramları geliştirilmiştir. Bu kavramlar, şimdiye kadar

vurgulanan membran proteinlerin öneminin yanı sıra membran lipid türlerinin

oluşturduğu domenlere (lipid rafts) dikkati çekmektedir. Örneğin, birçok lipid

molekülü membran proteinlerden farklı olarak çift katmanı oluşturan iki ayrı tek

katmanlar arasında yer değiştirmektedir. Membran proteinleri ise membran içinde

lateral olarak hareket eder. Sonuç olarak, hem lipidlerin hem de proteinlerin bu

hareketliliği membranın çok dinamik bir yapı olduğu ve hücre membran

akışkanlığının biyolojik önemini ortaya koymuştur. Örneğin, çift katman

viskozitesini laboratuvar deneylerinde suni olarak belli bir seviyenin üzerine

çıkartarak tamamen ortadan kalktığı gözlenmiştir. Lipid çift katmanın akışkanlığı

lipidlerin içeriğine ve ortam ısısına bağlıdır. Böylece, çift katmanın sıvı fazdan jel

faza geçişini gösteren karakteristik freeze noktasında daha kısa hidrokarbon

zincirlerinin veya çift bağ içerildiğinde bu nokta daha düşüktür.

2.2. Biyolojik Membranların Sıvı Kristal Özellikleri

2.2.1. Lipid Çift Katman

Lipid-protein çift katman hidrofobik etkileşmeler sayesinde meydana gelen bir

supramoleküler yapıdır. Bu etkileşmeler molekülleri imobilize etmek için yeterince

güçlü olmadıklarından çift katman fizyolojik ortamda sıvı özellikleri gösteren, aynı

zamanda da yapısal olarak kristal şekilleri alabilmektedir. Söz konusu sıvı kristal

fazı tüm molekülleri kapsamamaktadır. Sıvı kristal fazını oluşturan moleküller

genelde uzun zincirli olup moleküler ağırlıkları MW=200-500 Da’dan birkaç bin Da

arasında değişmektedir. ESR spektroskopisini kullanarak ilk defa Hubbel ve

McConnel37 çift katmanın üst ve alt kısmında bulunan lipid hidrokarbon zincirinin

hareketliliğinin yüksekliğini gözlemişlerdir. Bu olay daha sonra Levine ve Seelig

tarafından 2H- ve 13C-NMR spektroskopisi kullanarak teyit edilmiştir. Bu

37 Hubbel, W. L. and McConnel, H. M. (1971): Molecular Motion in Spin-Labelled Phospholipids and Membranes, J. Amer. Chem. Soc., 93: 314-326.

166

araştırmalar neticesinde yağ asitlerinin son kısmında bulunan metil gruplarının

hareketli olduğunu ortaya çıkarılmıştır.

2.2.2. Membranın Fizikokimyasal Özelliklerini Etkileyen Faktörler

Fosfolipidler, glikolipidler ve diğer basit amfifiller faz değişimi ısısı (phase

transition temperature veya Tm) adı verilen bir ısı seviyesinde endotermik sıvı

kristal↔katı (jel) faz değişimine uğrarlar (Şekiller 2.5-2.6 ve Tablo-4).

167

Şekil 2.5. (A) Fosfolipid faz değişim geçişleri (phase transitions) ve bunlara

kolesterolün etkisni gösteren bir diferansiyel taramalı kalorimetrik (DSC)

termogram; (B) Fosfolipid konfigürasyonlarının katı ve sıvı fazları.

Lipidlerin katı fazda düzenli, sıvı-kristal fazda ise nispeten düzensiz

olduklarından, bu ısı noktasına ayrıca düzen-düzensizlik geçiş noktası (order-

disorder transition temperature) adı da verilmektedir. Her lipidin kendine özgü bir

Tm değeri vardır (Bk. Tablo-2.1).

Şekil 2.6. Bir maddenin faz değişimleri.

168

Tablo-2.1. Biyomembranlarda Bulunan Bazı Fosfolipidlerin Faz Değişim Isıları.

169

Lipidlerin sıvı-kristal şekilleri Lα fazını oluştururlar. Katı fazı ise Lβ şekli olarak

adlandırılır. Lβ şeklinde moleküller çift katman eksenine doğru hidrokarbon

zincirlerin tam olarak uzunluğunu muhafaza edip all-trans konfigürasyonu ve

quasi-heksagonal toplaşımlar oluşturur (Şekil 2.5-B).

Lipidlerin faz değişim mekanizmaları çeşitli fizikokimyasal yöntemler

kullanarak katı fazdaki çift tabakada ve lipid moleküllerin paketlemelerinde

(elektron mikroskopla görüntülenen “grain borders” in freeze frakture replicas)

düzensizliklerin ve defektlerin olduğunu ortaya çıkararak tespit edilir. Söz konusu

defektlerin doğal entropinin (düzensizliğin) ifadesi olduğundan, meydana gelme

olasılığı ısının yükselmesiyle artar. Faz değişimi noktasında, defektler lipidin ilk

erime noktaları olarak kabul edilirler ve bunlar akışkan lipid moleküllerinde küçük

domenler oluştururlar. Bu yüzden, faz değişimi noktasında hem akışkan hem de

katı domenler aynı anda (eşzamanlı) meydana gelir. Bu ısının Tm değeri üzerine

yükseltildiğinde geride kalan katı faz lipidleri hızlı bir şekilde eriyip akışkan faza

geçerler. Faz değişimi noktasında üç ayrı faz aynı anda meydana gelmektedir: katı

faz, sıvı-kristal faz ve interfacial lipid phase adı verilen ara faz. Interfacial lipid

phase katı ve sıvı-kristal fazları arasında yer alır ve faz değişimin meydana

gelmesinde en önemli rolü üstlenir.

Bu üç fazda yer alan lipidler hidrokarbon zincirleri arasında eşzamanlı

olmayan paketlenme olasılıkları yüzünden faz değişimi noktasında lipid çift

tabakanın geçirgenliğinin artmasına neden olur. Faz değişim noktasının üzerinde

bulunan lipidler sıvı-kristal fazında bulunur.

2.2.3.Lipid Fazlarını Etkileyen Faktörler ve Biyosistemlerdeki

Önemi

Lipid faz geçişleri ortaya çıkarıldıktan sonra bu konu ayrı bir bilim dalı

olarakgelişmiştir. Söz konusu geçişler fizikte “lyotropic phase transitions” olarak

adlandırılan teori ile açıklanmaktadır. Bu konuyla ilgili çok iyi matematiksel

ifadeler de geliştirilmiştir. Burada bunlardan projemizin amacına uygun bir şekilde

170

ve sadece lipidlerde görünen olgulardan çok kısa bahsedilecektir38. Lipid fazlarını

etkileyen faktörler kısaca şunlardır.

Çift bağların varlığı, özellikle cis-çift bağlar, CH-zincirlerinin all-trans

paketlemelerine engel olmaktadır ve Tm’i düşürmektedir. Çift bağların sayıları ve

CH-zincirlerinin pozisyonları da ayrıca Tm’i etkilemektedir. Genel olarak, Tm

hidrokarbon zincirin uzunluğuna bağlı olarak değişim gösterir. Diğer etmenler

arasında fosfolipid baş grubunun yükü ve konformasyonu, hidrokarbon zincirinde

yer alan C-atomlarının sayısı, iyonik ortam ve yüzeysel pH fosfolipid çift tabaka

akışkanlığını etkileyen faktörlerdir.

2.2.4. İlâçların Biyomembran Akışkanlığı Üzerine Etkisi

İlâç – hücre membranı etkileşmeleri uzun yıllardan beri araştırma gruplarının

ilgisini çekmektedir. Bu ilginin başlıca nedenleri kısaca şöyle özetlenebilir. Biyolojik

veya farmakolojik aktivitesi olan herhangi bir molekül kendine özgü

lipidçözünürlülüğüne göre hücrelerin hidrofobik bölgelerine yerleşip, ve buralarda

etkili konsantrasyonlarda bulunuyorsa, lipid çift katmanın yapısında

deformasyonlara neden olacaktır. Bazı ilâçlar, sıvı ortamında çeşitli ligandlarla bağ

yapacaklarından hiç bir zaman bu etkili konsantrasyonlara ulaşamayacaklardır. Söz

konusu ilâçlar membranı çok daha düşük konsantrasyonlarda etkileyebilmektedir

ve bu yüzden bu etkileri sadece in vitro olarak gözlenebilmektedir. Basit kimyasal

yapılar olarak ilâçlar sıvı ortamında pek etkili olmadıklarından ve yeterli

miktarlarda membrana bağlanmayınca zararlı etki gösteremeyeceklerinden büyük

bir ihtimalle membranların parçalanmasına neden olabilmektedir.

Bu ilâçların bazıları çok yüksek lipid çözünürlülüğüne sahiptir, ancak yüksek

lipid çözünürlülüğü membran üzerine etki göstermek için yeterli olmayabilir. Bu

olayda tek gereken şey söz konusu membranın daha düşük dozlarda bulunan

ilâçların etkilenmemesidir. Bu konu ile ilgili elde edilen veriler ve bunlara

dayanarak geliştirilen modeller anestetikler ve alkoller gibi ve bunlara benzerlik

gösteren ilâçlara dayanmaktadır. Bu ilâçlarla ilgili uzun yıllardan beri lipid yapısı ve

lipid faz değişimleri üzerine etkileri araştırılmıştır ve birçok veri elde edilmiştir. Bu

38 Bu konu ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için Fizikokimya ders kitaplarına başvurulmalıdır.

171

sınıfa giren ilâçlardan anestetikler etki mekanizmaları bilinen tek grup olmamakla

birlikte en iyi bilinen bileşenlerdir.

İlâç – hücre membranı etkileşmeleri ile ilgili olarak geliştirilen teoriler ve

modeller ilâçların membran lipidleriyle veya membran proteinleriyle

gerçekleştiğine dair Overton dağılım kurallarına uygun olarak iki ana grupta

toplanmaktadır. İlâçların membran lipidlerine mi yoksa membran proteinlerine mi

etki ettikleri konusu uzun süredir bilimsel tartışma konusudur. Bu konu ile ilgili,

herhangi bir hidrofobik fazda meydana gelen ve ölçülebilen fiziksel değişim ilgi

çekicidir. Yüksek lipid çözünürlülüğüne sahip ilâçların membran lipidlerin ve

proteinlerin her ikisinin de hidrofobik kısımlarıyla etkileşmeye girecekleri açıktır.

Ancak, bu durumda bile hidrofobik etkileşmelerinin hücre işlevlerini nasıl bir

şekilde ve hangi yönde etkilediklerini açıklamak son derece güçtür. Bu hususları

açıklığa kavuşturmak için ilâç-hücre etkileşmeleriyle ilgili daha fazla

araştırmalarının yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Bu beklenti araştırılmakta olan

ilâcın hem hücre membran lipidleriyle hem de membran proteinleriyle etkileşmeye

gireceği varsayımına dayanmaktadır. Ancak, bu durumda çok muhtemel olarak bazı

lipidler ve proteinler diğerlerine kıyasla daha çok etkilenecektir. Bu yüzden, bunları

tespit etmek ve söz konusu ilâcın bu moleküllere göre neden daha yüksek afinite ve

seçicilik gösterdiğini ortaya çıkarmak en önemli hedefler arasındadır. Çünkü bunu

başarılı bir şekilde ortaya çıkarmak ve her durumda çalışan bir model ve teoriyle

destekleyerek, hem genel bir etki mekanizmasının keşfedilmesine, hem de daha

etkili ilâç tedavi yöntemlerinin geliştirilmesine yardımcı olacaktır.

Bazı ilâçlar hücre üzerinde kendilerine özgü reseptörleri bulunsa bile

hidrofobik etkileşmeye girebilmektedir. Örneğin, bazı benzodiazepinler ve

nöroleptikler yüksek lipid çözünürlülüğüne sahip olup bölgeye özgü mekanizmaları

doğrultusunda etki ederler. GABA veya dopamin gibi bazı ajanların doğal

ligandlarının çok yüksek hidrofilisiteye sahip olduklarından mutlaka sıvı ortamda

etkileşmeye girdikleri bilinmesine rağmen, gerçek etki bölgesi sıvı ortamı mı yoksa

membranın mı olduğu henüz daha tam olarak bilinmemektedir.

Lipofilik ilâçların membran içi konsantrasyonları sıvı ortamdaki

konsantrasyonlarından birkaç bin defa daha yüksektir ve bu gerçek afinite ligand

172

bağlanma deneylerinde her zaman göz önünde bulundurulmaktadır. Bu ilâçların

bağlanma afiniteleriyle ilgili farmakokinetik denklemler ve matematik modeller

ortaya konulmuş ve uygulanmakta olmasına rağmen bu konu hala yeterince

çalışılmış değildir.

2.2.5. Biyomembran Akışkanlığının Anlamı

Genel olarak, membran akışkanlığı membran bileşenlerinin çeşitli hareket

biçimlerine verilen isimdir. Matematiksel olarak bazı varsayımlardan yola çıkarak

1/viskozite olarak da ifade edilir. Bu hareketler kısaca şunlardır: açil zincirlerinin

fleksibilitesi ve esnekliği, membran ekseni istikametinde moleküllerin lateral

difüzyonu, bir tek katmandan diğer tek katmana moleküllerin tersine difüzyonu ve

lateral faz farklılaşmasıyla sonuçlanan faz değişimleri (phase transitions). Tüm bu

olaylar anizotropik hareketler olup ve akışa mukavemet ve izotropik direnç gücü

olarak bilinen viskozite ile ifade edilemez. Bu moleküler hareketlerin her biri çeşitli

ilâçlar tarafından etkilenmektedir.

Daha genel anlamda, bir hayli fazla farmasötik ajanı membranları daha

akışkan veya daha düzensiz hale getirmektedir. Bu özellikle lipofilisitesi yüksek olan

fenol halkaları içeren heterosiklik yapılarda görülmektedir. Biyomembranın daha

akışkan veya daha düzensiz hale gelmesi kuşkusuz membran lipidlerin ve membran

proteinlerin işlevleri üzerine tersinir olmayan önemli etkileri meydana

getirmektedir.

173

Şekil 2.7. Langmuir-Blodgett düzeneklerden genel bir görünüm.

174

Şekil 2.8. DMPE (1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-phosphoethanol- amine)

fosfolipidin 20°C’deki izotermi. Air-water ara yüzeyinde DMPE

monomolecular film (monolayer) olarak ortaya çıkan farklı fazlar gösterir.

Görülen plato non-ordered liquid-expanded (LE) fazdan ordered liquid-

condensed (LC) faza geçişten ibarettir. Hidrofilik silikon substratına yavaşça

transferi esnasında DMPE tek katmanın kondanze olduğu noktada basınç

değişimi kırmızı çizgi ile gösterilmiştir.

175

Şekil 2.9. Langmuir-Blodgett tek katmanlardaki bir fosfolipidin uğradığı faz

değişimleri. Tipik bir izoterm gösterilmiştir. Yüzey üzerindeki fosfolipid

moleküllerin hareketliliği açıkça gözükmektedir.

Şekil 2.10. Langmuir-Blodgett tek katmanlarda Wihelmy plate ile ölçülen

yüzey basınç yönteminin bir görünümü.

176

Şekil 2.11. Farklı Langmuir-Blodgett tek katman ve çok katman düzenekleri.

177

Tek katman ( Bk.: Şekiller 2.7-2.11)39, birtakım organik moleküllerin sıvı ara

fazına uygulanmasıyla oluşturulur. Projemde uygulanan fosfolipidler genelde

Şekil 2.10 ve Şekil 2.13 gösterildiği şekilde hidrofilik baş kısımları su fazına

doğru, hidrofobik kuyruk kısımları ise gaz (hava) faza doğru yerleşir ve tek

katman bu şekilde oluşturulur. Söz konusu moleküller su yüzeyine40 ilk olarak

uygulandıklarında çok fazla serbestliğe sahip olarak yüksek bir hareketlilik

gösterirler. Bu su üzerinde her moleküle düşen alan çok fazladır ve yüzey

basınç düşüktür. Bu yüzey basınç genelde sensör sistemine bağlı Wilhelmy

palte (Bk.: Şekil 2.10 ve Şekil 2.11) adı verilen düzenekle ölçülür. Yüzeysel

basınç hesaplamalarının matematiksel ifadeleri için özellikle bk.:

www.kibron.com, www.ksvltd.com, www.nima.co.uk43,44. Bu yüzeysel basınç birbirine

karşı hareket ettirilen 2 bariyer sayesinde yükseltilmektedir (Şekiller 2.7-2.11).

Yüzey basıncın çok fazla yükselmeye başladığı bir noktaya varılır ki bu lipidin

sıvı faza geçişini göstermektedir (Bk.: Şekil 2.8 ve Şekil 2.9). Bariyerlerin

birbirine karşı istikamette daha ileri hareket ettirildiklerinde, katı fazın

değişikliğe uğradığı, yüzey basıncın daha hızlı bir şekildeki artışından da

gözlenmektedir (Şekil 2.8).

39 Bu bölümde, bu proje raporumu inceleyenlere kolaylık sağlanması amacıyla, fosfolipidlerle oluşturulan tek katmanlarla ilgili çok kısa ön bilgiler verilmiştir. Ancak, fosfolipid yüzey kimya ve kolloid teorileri matematiksel olarak da karmaşık olduğundan, bu konu ile ilgili çok daha ayrıntılı bilgilere ulaşmak için bk.: Ek-13. 40 Projemde elde edilen neticelerin tekrarlanabilirliğini test edilmesi bakımından suya ek olarak 2 ayrı tampon da denenmiştir. 41 Ayrıca Bk.: Ek-13. 42 Ancak şu anda piyasada satılan modern Langmuir-Blodgett tek katman cihazlarında son derece

uygun software programları yüklenmiş olup söz konusu hesaplamalar interaktiv olarak bilgisayar

üzerinde gösterilmektedir. Bunun için bu proje raporumun Bulgular bölümünde yer alan neticeler ve

buradaki izoterm eğrilerinin bulunduğu çıktılar incelenmelidir. 43 Ayrıca Bk.: Ek-13. 44 Ancak şu anda piyasada satılan modern Langmuir-Blodgett tek katman cihazlarında son derece

uygun software programları yüklenmiş olup söz konusu hesaplamalar interaktiv olarak bilgisayar

üzerinde gösterilmektedir. Bunun için bu proje raporumun Bulgular bölümünde yer alan neticeler ve

buradaki izoterm eğrilerinin bulunduğu çıktılar incelenmelidir.

178

Şekil 2.12. Bir reseptörün Langmuir-Blodgett tek katman üzerinde

imobilizasyonu.

Langmuir-Blodgett tek katmanların farklı düzenekleri yukarıdaki şekillerde

gösterilmiştir. Şekil 2.12 ise Langmuir-Blodgett tek katmanların farmakolojik ve

biyolojik anlamı çok daha yüksek olan bir düzeneği-bir reseptörün oluşturulan

fosfolipid tek katman üzerinde imobilizasyonunu göstermektedir. Bu şekilde

imobilize edilen reseptörlerin bunlarla bağlanan ilâç ve diğer ligandlarının bağlanma

kinetiğinin ölçülmesinde çok orijinal bir ölçüm imkânı vermektedir. Bu projemde bu

boyut amaçlanmamıştır. Çünkü böyle bir düzeneğinin kurulması için ek cihazlara

ihtiyaç vardır. Ancak fakültemizdeki bundan sonraki projelerim böyle bir düzeneğin

kurulmasını kapsamaktadır. Bu hususlara ayrıntılı olarak Ek-16’da yer verilmiştir.

179

2.3. Biyomembran ve Model Membran Araştırmalarında Kullanılan

Başlıca Yöntemler45

Günümüzde, biyomembran ve yapay membran modelleri araştırmalarında

birçok fizikokimyasal, moleküler biyolojik ve biyokimyasal yaklaşımlar

uygulanmaktadır. Bunlardan fizikokimyasal yöntemler çeşitli spektroskopik

ölçümlerden ibarettir. Bunlar hem biyomembran, hem model membranlarla

gerçekleştirilmektedir. Moleküler biyolojik yöntemler genelde biyomembranların ve

membran kanal proteinlerinin cDNA dizilişini ortaya çıkararak voltage-gated iyon

kanal ölçümleri veya tek kanal üzerinden geçişi takip eden patch-clamp tekniği gibi

yöntemlerin de yardımıyla membran gözeneklerinden gerçekleşen çeşitli iyon

geçişlerini hücre kültürleri üzerinde göstererek ortaya koyan yaklaşımlara dayanır.

Biyokimyasal yaklaşımlar da buna benzer şekilde membran yapısında yer alan ve

araştırılması istenilen makromoleküllerin saflaştırılıp tekrar yapay membran

modeline rekonstitüe edilmesine dayanır. Böyle bir in vitro rekonstitüsyon yöntemi

biyolojik sistemin in vitro ortamlarda da çalıştırıldığı takdirde incelenen biyosistemin

gerçek etki mekanizmasını ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, birçok reseptör-ligand

bağlanma kinetiğinin ortaya çıkarılması, söz konusu reseptörlerin biyolojik hücreden

saflaştırılıp yapay membranlara rekonstitüe edilip ligand bağlanma afinitelerini

takibine dayanır. Yapay membran sistemleri genelde üç gruba ayrılır. Bunlardan

biyomembranlara ilk yaklaşım olarak lipid monolayer (Langmuir-Blodgett film-bk.:

Şekil 2.13-üst kısım) düzeneği geliştirilmiştir. Bu iki boyutlu membran yaklaşımı

birçok biyolojik ve farmakolojik etkisi olan moleküllerin model hücre üzerinden

intraselüler penetrasyon mekanizması incelenmektedir. Diğer bir iki boyutlu model

sistemi ise Black Lipid Membrane (BLM) sistemidir. Bu düzenekte dikey Pt veya

teflon plâkaları arasında bulunan boşlukta çift katman oluşturulmaktadır (Bk.: Şekil

2.13-orta kısım ve özellikle Şekil 2.14). Bu yöntem tarihsel olarak büyük önem

taşımıştır. Örneğin, ilk membran elektrofizyolojik olayları bu yaklaşımla ortaya

çıkarılmıştır. Ancak, bu yöntem çok karmaşık mikroskopik incelemelerini de

gerektirdiğinden, son derece deneyimli personelin çalışmasına bağlıdır. Üçüncü

yaklaşım ise lipid veziküllerin (lipozomların) kullanımına dayanır (Bk.: Şekil 2.13 alt

45 Bu bölümde projemi inceleyecek olanlara sadece çok kısa ön bilgilerin verilmesi amaçlanmıştır. Biyomembran düzenekleri ile daha ayrıntılı bilgi edinmek için Moleküler Hücre Biyolojisi, Hücre Fizyolojisi ve Biyofizik ders kitaplarına başvurulmalıdır.

180

kısım ve Şekil 2.15)46. Bu veziküller bir üç boyut kazandırdığından, yine üç boyutlu

olan doğal hücreye diğer iki model membran sisteminden çok daha iyi bir yaklaşım

teşkil etmektedir. Biyomembran incelemelerine geçmeden önce, araştırılmakta olan

makromoleküllerin ilk önce saflaştırılmış şekillerinin fizikokimyasal özelliklerinin

takip edilmesi gerekmektedir. Bu da çeşitli fizikokimyasal ve biyofiziksel

yaklaşımlarının önemini vurgulamaktadır. Bunlara aşağıda kısaca değinilmiştir.

2.3.1. Biyofiziksel Yöntemler

2.3.1.1. Spektroskopik Yöntemler

Aşağıda adı geçen spektroskopik yöntemler biyomembran araştırmalarda

membran bileşenlerinin yapı ve aktiviteleri ile ilgili bilgilerin elde edilmesinde çok

önemli rol oynamıştır. Bu yöntemler hızlı ve invaziv veya destrüktiv değildir. Bu

bakımdan bunların tümü fizyolojik ortamlara yaklaşan ve bu sistemleri simüle eden

koşullarda uygulanabilmektedir. Ayrıca, bunlarla membranlarda meydana gelen çok

hızlı tepkimelerin ve konformasyon değişikliklerinin kinetiğini de incelemek

mümkündür.

46 Lipozomlarla ilgili çok ayrıntılı ve güncel bilgilere Ek-9’da yer verilmiştir.

181

Şekil 2.13. Kolloid ve yüzey kimyasal araştırmalarda bir hücre yüzeyini

modellemek için kullanılan düzenekler. Sırasıyla Langmuir-Blodgett tek

katman (monolayer), Black Lipid Films (BLMs) ve lipozom sistmleri

gösterlmiştir.

182

Şekil 2.14. Biyomembran araştırmalarda bir hücre yüzeyini modellemek için

kullanılan düzenekler. Çeşitli tek katmanlı ve çok katmanlı fosfolipid

düzenekleri gösterilmiştir. Burada özellikle farklı BLM formasyonları

vurgulanmıştır.

183

Şekil 2.15. Lipozomların genel yapısı.

2.3.1.2. Difference Spectroscopy

Bazı durumlarda belli bir membran kromoforun ve çevresindeki

moleküllerin absorbsyon spektrumunda meydana gelen spektral değişikliklerinin söz

konusu olduğunda kromoforun tek başına gösterdiği konformasyon değişikliğinden

ziyade, tüm toplam spektrumdaki değişikliklerin ölçülmesi daha uygundur. Bu işlem

çift-ışınlı spektrofotometre ile yapılmaktadır. Bu yöntemle meydana gelen

tepkimelerin kinetiğinin ölçülmesi elektron taşıyıcılarının indirgenme-oksitlenme

olaylarına bağlı olduğu gibi, NMR, ESR ve termodinamik yöntemlerinden farklı

olarak moleküllerin konformasyonu hakkında çok kısıtlı bilgiler vermektedir. Ancak,

bu yöntemi kullanarak makromolekül-ligand bağlanma afinitesi ve kinetiği hakkında

çok önemli bilgiler edinebilinir.

2.3.1.3. Fourier Transform Kızılötesi (FTIR) Spektroskopisi

Bir titreşim spektroskopisi olan FTIR spektrometresi kompleks

oluşumu esnasında tepkimeye giren biyomakromoleküllerin sekonder yapıları

hakkında çok önemli bilgiler vermektedir. Tepkimeye giren fonksiyonel gruplar

184

hakkında çok önemli bilgiler de vermektedir. Nuclear Magnetic Resonance (NMR),

Electron Spin Resonance (ESR) veya Floresans Spektroskopisi vb. gibi yöntemlerin

aksine çok fazla örneğe gereksinim duyulmadığı bu ölçüm yöntemi ayrıca da çok

hacimli etiket moleküllerinin de katılmasını gerektirmemektedir ve “scattering”’ten

kaynaklanan artefaktlar da burada engellenmektedir. Ayrıca, FTIR spektrometresi

katı ve sıvı fazda bulunan örneklerle çalışma fırsatı da sunmaktadır.

2.3.1.4. Raman Spektroskopisi

Bir titreşim spektroskopik yaklaşımı olarak bu spektroskopik yöntem

moleküllerin iradyasyonunu takiben gözlenen moleküler titreşimlerin ölçülmesine

dayanmaktadır. Bu yöntem, örneğin kolesterolün fosfolipid jel-sıvı kristal faz geçişi

üzerindeki etkisinin araştırılmalarında uygulanmaktadır. Raman spektroskopisi

ayrıca Fe-S taşıyan proteinlerde (örneğin transferinde) Fe-S karşılıklı etkileşmeleri

veya hem proteinlerdeki porfirin-protein etkileşmeleri, veya çeşitli organik

moleküllerinde (örneğin, karotenoidler, vitaminler, antibiyotikler, steroidler ve

polisakkaridler) C-C titreşimleri ile ilgili çok önemli bilgiler vermiştir.

2.4. Langmuir-Blodgett Monolayer Yöntemi

Monomoleküler katmanların (tek katmanların veya monolayer’ların)

incelenmesi, membranda yer alan bileşenlerin hakkında çok önemli yapı-aktivite

bilgilerini verdiği gibi, monolayer yüzeysel basıncı, incelenmekte olan molekülün

lipid tek katmanda işgal ettiği moleküler alanı, bu moleküler alanın yüzeysel basınç

üzerindeki etkisi hakkında da bilgiler vermektedir. Bu düzenek böylece molekülün

biyomembran yüzeyinde ve hacminde nasıl paketlendiği konusunda da bilgiler

vermektedir. Bu yaklaşım böylece, yeni farmakolojik ajan-biyomembran

etkileşmelerinin yeni modellerinin de geliştirilmesinde katkıda bulunmaktadır.

Membran ortamında başka maddelerle karışım içinde bulunan bileşiklerin

karışımdaki tek tek özelliklerini, stereokimyasını ve etkileşme enerjilerini, suda

çözünen bileşiklerin lipidlere karşı gösterdikleri afinitelerini de ortaya çıkarmak

mümkündür. Monolayer yöntemi çok katmanlı oriente edilmiş (oriented multilayers)

sistemlerinin ve içeriği ve topolojisi önceden belirlenen membran sistemlerinin

oluşumunun temelini oluşturmaktadır. Monolayer yöntemini ayrıca daha pratik

amaçlarla, örneğin ortam saflılığının tayininde ve kontrolünde, ekolojik

uygulamalarda ve son yıllarda kemosensör ve biyosensör teknolojisinde

185

mikroçiplerin orientasyonu ve toplaşımı için mikroelektronik sanayide de

kullanılmaktadır.

Gaz-sıvı sınırında oluşan yüzeysel basınç veya pozitiv serbest enerji yüzeyler

arasında bu sınırın oluşturulmasının temelini teşkil etmektedir. Bu gibi yüzey

sınırlarının yüzeysel basıncı γ; γ=∆F/∆S olarak ifade edilir. Burada ∆F-serbest

enerjinin değişimi, ∆S ise – yüzey alanının değişimidir.

Yüzeyler arasında oluşan serbest enerjinin ortaya çıkmasını sıvı moleküllerinin

hacimsel olarak (sub-phase) fazlar arasındaki sınıra taşınmaları için yapılan işe

benzetilebilir. Bu taşınımın gereksinimi, ara fazda (subfazda) belli bir molekül

üzerinde diğer moleküller tarafından uygulanan ve etkili olan güçlerin kompanse

edilmeleri, yüzeyler sınırında bulunan bir moleküle ise sadece subfaz tarafından

çekim güçlerinin etkili olduğundan ortaya çıkmaktadır.

Yüzeyler arasındaki kompanse olmayan güçlerin katmandaki derinlikleri su

moleküllerin etkileşme özelliklerine göre tayin edilir. Çeşitli iyonların yokluğunda,

söz konusu güçler Van der Waals etkileşme güçleridir ve bunların intansitesi

moleküller arasında mesafenin x7 oranında propoprsiyonel olarak azalır. Böylece,

kompanse edilmeyen etkileşmelerin alanı veya bölgesi birkaç molekül çapından fazla

değildir.

Gibbs denklemine göre, faz ayrımındaki adsorpsyonu için yüzeysel dansite

parametresi şu şekilde ifade edilir:

Γ=-[a/(RT)].(δγ/δa).

Burada Γ – maddenin yüzeysel dansitesi, a –subfazda maddenin aktivitesidir.

Eğer maddenin yüzeyler arasında birikirse, o zaman δγ/δa negativtir, çünkü

örneğin lipidler için yüzey arasındaki adsorpsyon ölçülebilen yüzeysel basıncın

düşmesine neden olmaktadır. Bu durumda γ0-γ farkı (burada γ0-“saf” su yüzeyinde

oluşan yüzeysel basınçtır; γ-örneğin lipid için yüzeyler arasında adsorbsyonundan

186

sonra oluşan yüzeysel basınçtır) adsorbe edilmiş plâkanın yüzeysel basıncı olarak

tayin edilir.

Faz sınırlarında oluşan tek katmanın yüzeyinde ortaya çıkan basıncın yüzeysel

basınca eşit olduğu bir plâka olarak da tasavvur edilebilinir:

YB= γSu-γçözelti

Burada YB-yüzeysel basınç; γSu ve γçözelti – suyun ve çözeltinin yüzeysel

gerilimleridir.

2.4.1. Yüzeysel Gerilimin Wilhelmy Plate Yöntemiyle Ölçülmesi

Yüzeysel gerilimin ölçümlerinde su veya sıvı çözeltilerinin yüzeyine dik

dörtgen şeklinde küçük bir plâka temas ettirilmektedir. Bu plâka, organik çözeltilerin

önceden belli bir muameleyle uzaklaştırıldığı plâtin malzemesinden üretilir. Ancak,

bunun yanı sıra, cam ve diğer malzemeler de ölçüm amacına göre kullanılmaktadır.

Faz ayrımının sınırında bu plâkaya yüzeysel gerilim kuvvetleri etkilidir (Şekil 2.16).

Şekil 2.16. Langmuir-Blodgett tek katmanlarda Wihelmy plate ile ölçülen yüzey

basınç yönteminin bir görünümü. Bu şematik çizim daha önce verilen Şekil

2.10.’a dayanmaktadır.

187

Bu kuvvetler sayesinde plâkanın sıvı yüzeyine teması sağlanmaktadır ve bu

kuvvetin şiddetini mekanik kuvveti elektrik sinyaline dönüştürebilen ve mekanotron

adı verilen bir cihazla ölçülmektedir (Şekil 2.19). Plâkanın ölçülen kütlesi şu şekilde

tayin edilir:

wtoplam = wplâka+γ.cosθp,

Burada γ-çözeltinin yüzeysel gerilimi; p-plâkanın boyutu; wplâka – plâkanın

gerçek kütlesi.

Yüzeyler sınırında çok az miktarda maddenin uygulandığında, γ çözelti veya su

subfazının yüzeysel gerilimine eşittir. Yüzeyler arası ayrımının alanının azaldığında,

wtoplam düşmektedir.

2.4.2. Lipid Tek Katmanların Özelliklerinin İzoterm Yöntemiyle

İncelenmesi

2.4.3. Sub-fazda madde-lipid etkileşmelerinin incelenmesi ve lipid

moleküllerinin işgal ettikleri alanın ölçülmesi

Tek katmanın en önemli parametresi lipidin moleküler alanıdır (A.). Diğer bir

değişle bu bir molekülün işgal ettiği alandır. Kondanze olan katmanlardaki A değerin

tayini çift koordinatlı potansiyometre ile ölçülen yüzeysel basınç – tek katman alanı

ilişkisini x-eksenine yerleştirilmesiyle ekstrapolasyonuna dayanmaktadır. Böylece,

monolayer yöntemi ile bir tek katmanda lipidin işgal ettiği alanı ve kesitini

hesaplamak mümkündür. Bu çok önemli bir bilgidir, çünkü doğrudan doğruya doğal

biyolojik hücre membranında çeşitli makromoleküllerinin nasıl paketlendiğini

göstermektedir.

Fosfolipidler için söz konusu kesit lipidin baş kısmının türü ve içerdiği doymuş

veya doymamış yağ asitlerin oranına bağlı olarak değişmektedir. Tek katmanın

188

bileşenleri arasındaki etkileşmelerinin spesifikliği ve ayrıca da moleküllerin hidrofil

kısmı ile subfazın A değerini etkilemektedir. İyonlar ve subfaz moleküllerinin suya

etki ettikleri ve sınır bölgesindeki katmanda lipid baş gruplarının paketlenmelerini de

etkiledikleri bilinmektedir.

2.4.4. Tek Katmanda Yer Alan Maddeler Arasındaki Etkileşmelerinin

İncelenmesi

Bu yaklaşımda, tek katmanın oluşturulmasında kullanılan ve incelenmekte

olan maddeden çeşitli oranlarda hazırlanan madde-lipid örnekleriyle seri şeklinde

birkaç izoterm ölçümü yapılır. Elde edilen neticelerden, karışımda yer alan A-

değerinin konsantrasyonu Mol (M) olarak ifade edilen madde içeriği arasındaki ilişki

diyagram çizilir. Bu diyagramın bir örneği Şekil 2.17 gösterilmiştir. Bu diyagramlar

kolesterol ve diheksadesilfosfatidilkolin ile oluşturulan tek katmandaki kompleks

oluşturmaları hakkında bilgiler içermektedir. Ancak bu şekildeki eğriler başka

biyolojik veya farmakolojik aktiviteye sahip bir makromolekülün fosfolipid

membranla oluşturduğu bir kompleks için de geçerlidir.

189

Şekil 2.17. Polikremnik asidin varlığında diheksadesilfosfatifilkolin ile kolesterol

arasında etkileşmeler: I-Kolesterol-diheksadesilfosfatifilkolin tek katmanın izoterm’i:

1-kolesterol; 10-diheksadesilfosfatifilkolin; 5-kolesterol-diheksadesilfosfatifilkolin 1:1

oranında karışımı; 8-kolesterol-diheksadesilfosfatifilkolin 2:8 oranında karışımları.

Diğer oranda hazırlanan karışımlar arada izoterm eğirleri olarak gösterilmiştir. II.

Tek katman içeriğine bağlı olarak karışımlarının tek katmandaki moleküler alanın

değişmesi: 1-SiO2 grupların varlığına dayanarak 5 mM konsantrasyonundaki

polikremnik asidin varlığında; 2-polikremnik asidin yokluğunda; 3 ve 4-karışım

olarak oluşturulan tek katmanların aditiv moleküler alanlar (additive molecular

areas).

1:1 ve 4:1 stokiometriye sahip kompleksler adı geçen maddelerin varlığında

meydana gelir, ancak subfaz’a polikremnik asidin katıldığında sadece 1:1

stokiometriye sahip kompleksler oluşur.

2.4.5. Tek Katmanlarda Maddelerin Karışım Oluşturma Özelliklerinin

İncelenmesi

Bir tek katmanda iki bileşiğin karışım oluşturma özelliklerinin tayininde faz

kuralı (the phase rule) uygulanmaktadır. Basıncın ve sıcaklığın veya ortam ısısının

sabit olması koşuluyla izotermler çizilir. Ancak, bu yöntem daha çok malzeme

bilimcileri tarafından uygulandığından ve biyolojik önemi pek olmadığından, bu

190

yaklaşım projemizde öngörülmemiştir. Söz konusu yaklaşım, çözünürlükleri

hakkında bilgi bulunmayan iki ayrı maddenin biyolojik ortamda tek katmandaki

karışım oluşturma özelliklerinin tayininde uygulanmaktadır. Birçok düzenekte

olduğu gibi, projemde hem Taxol®’un, hem de kullandığımız fosfolipidlerin karışım

oranları önceden tasarlanmıştır.

2.4.6. Tek Katmanlarda Bulunan Moleküllerin Yapısal Değişikliklerinin

İncelenmesi

Lipid tek katmanlarının izoterm eğrilerinde yüzey sınırında yer alan

moleküllerinin oriyentasyonlarındaki değişikliklerinin göstergesi olan yapısal

değişikliklerinin de görmek mümkündür. Uzun hidrokarbon zincirin ucunda iki

hidrofil grubu içeren moleküller için örneğin floresan işareti olarak yoğun kullnılan

16 (9-antroiloksi)-palmitik asidin durumunda olduğu gibi, bu lipid ile oluşturulan tek

katmanın kondanze olmasıyla, ölçülen izoterm eğrisinin türevinin (slope) de değiştiği

bilinmektedir. Söz konusu değişiklik, oluşan yüzey sınırında bu işaretin hidrofil

gruplarından biri olan COOH grubunun yer değiştirmesi ve tüm molekülün tek

katmandaki konformasyonunun hareketliliği ile açıklanmaktadır. Yüzey basıncın

düşük olduğu durumlarda, bu molekül yüzey sınırında su ile en uçtaki COOH-

grubunun ve antranil döngüsüne komşu olan CO-grubunun temas yapacak şekilde

yerleşir. Bu yaklaşım, özellikle Langmuir-Blodgett tek katman ve floresan

mikroskopik araştırmalarında yoğun olarak uygulanmaktadır (Şekil 2.18).

191

Şekil 2.18. Çeşitli lipidlerin tipik π-A izoterm eğrileri.

2.4.7. Tek Katmanın Sabitlilik ve Deformasyon Özelliklerinin

Hesaplanması

Tek katmanların lateral kompaktizasyonu parametresi c=-(1/A)(δA/δπ)T

olarak ifade edilir. Söz konusu hesaplar için bu sabitin resiprokal veya tek katmanın

Gibbs deformasyonu da kullanılır:

E=-A(δπ/δA)T.

2.4.8. İzoterm Şekillerinin Analizi ve Yorumlanması

Farklı lipidlerin tek katmanları için ortam ısısını belli sınırlar içinde değiştiği

koşullarda elde edilen izotermlerde bir plato’nun oluştuğu görülmektedir: Alan (A)

değerinin azalmasıyla yüzeysel basınç değeri hafifçe yükselmektedir. Elde edilen

izoterm eğrilerden biyolojik anlamı çok yüksek olan, bir molekülün modellenen bir

192

hücre yüzeyinde nasıl paketlendiğini gösterir. Bu da, ilâç-hücre etkileşmelerin

araştırmalarında çok önemli bilgiler vermektedir.

Şekil 2.19. Bir Langmuir-Blodgett tek katman cihazının şematik şeması. Bu cihazlarla

ve çalışma prensibiyle ilgili olarak daha detaylı bilgi için bk.: www.langmuir.com veya

www.nima.co.uk. Ayrıca bk.: Ek-12 ve Ek-13.

2.4.9. Projemdeki Deneysel Tasarım

2.4.10. Projemde Geliştirilen Yeni Deneysel Protokol

2.4.10.1. Kimyasallar.

Tüm fosfolipidler Sigma Chem. Co., MI (A. B. D.) veya alt birimlerinden veya

Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, A. B. D.)’den satın alınmıştır. Özellikleri çok

farklılık gösterdiğinden, bu özellikleri test etmek amacıyla Paclitaxel™ çeşitli

kaynaklardan alınmıştır47.

Tüm kimyasallar en yüksek kalitede ve saflıkta alınmıştır. Kloroform (≥99.8%;

HPLC grade) ve etanol (≥99.9%; HPLC grade) kullanılmıştır. Tüm deneylerde

kullanıma hazır olarak satılan ve rezistansı 18.2 MΩ olan Milli-Q saf su kullanılmıştır.

47 Bk.: Ek-18

193

2.4.10.2. Langmuir-Blodgett Tek Katmanın Oluşturulması.

Langmuir-Blodgett cihazı NIMA Technology Ltd (The Science Park, Coventry

CV4 7EZ, İngiltere; Model 112D) ürünüdür48. Bu cihazı üreten diğer firmalara49

nazaran NIMA Technology Ltd.’in piyasaya sürdüğü son derece popüler ve çok amaçlı

modeller50 ve özellikle de bu firma temsilcilerinin tarafımıza yapmış olduğu çok

düşük fiyat teklifleri bu firma ürününün alınmasında rol oynamıştır. Söz konusu

cihazın teknik özellikleri Ek-12‘de verilmiştir. Bu cihaza diferansiyel taramalı

mikrokalorimetre (DSC), Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektpmetresi ve

Floresan Mikroskopi sistemlerinin de uygulanıyor olabilmesi son derece önemlidir ve

çok yönlü ölçümlerin yapılmasını mümkün kılmaktadır. Söz konusu cihaz 40 cm2

esas alanı, 2 elektromekanik olarak hareket ettirilen bariyer, yüzey basınç sensörü,

inverted mikroskopisi için sapphire pencere sistemi, dipper mekanizması ve

bilgisayara bağlı software versyon 5.16 içermektedir.

Tek katmanların yüzeysel temizliliği kriteri olarak bariyer testi uygulayarak 3

ayrı tekrardan elde edilen izotermler arasındaki farkın ±0.1 mN/m’den daha fazla

olmamasına dayanmaktadır.

2.4.10.3. Yüzey basınç-alan (π-A) izotermler.

Tek katmanlar air-water (hava-su ara sınır) ara yüzeye kloroformu çözücü

olarak kullanarak uygulanmıştır. Fosfolipidler ve Paclitaxel™ stock çözeltileri ilk önce

ekvimolar (1:1) 0.2 mM’ lık konsantrasyonlarda hazırlanmıştır. Daha sonra,

bunlardan istenilen oranlarda karışımlar hazırlanmıştır. Her uygulamadan önce

Hamilton şırıngası 3 kez kloroform ile yıkanmıştır. Bunu takiben ara yüzeye birkaç

damla örnek uygulanmıştır. 10 dakika solvent evaporasyonu için beklendikten sonra,

yüzey basınç-alan (π-A) izotermleri elde edilmiştir ve kaydedilmiştir. Neticelerin

tekrarlanabilirliği bakımından güvenilir olup olmadıkları en az 3 tekrar yaparak

değerlendirilmiştir.

48 Bk.: Ek-11 ve www.nima.co.uk. 49 Kibron Ltd (www.kibron.com) ve KSV Ltd. (www.ksvltd.com)-Helsinki, Finlandiya. 50 Bk.: Ek-11.

194

2.4.10.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik (Differential Scanning

Calorimetry) Ölçümleri.

Lipid vezikülleri ilk önce geleneksel ince tabaka film (thin-film) yöntemine

göre hazırlanmıştır. Bunun için, lipid ve Paclitaxel stock çözeltileri kloroform ile

hazırlanıp, bunlardan istenilen miktarlar balon jojelere aktarılmıştır. İyi bir karışım

elde etmek için bunlar vortekslenip, gaz N2 ile solvent evaporasyonu uygulanmıştır.

Böylece balon jojenin iç cam yüzeyine ince tabaka lipid film oluşturulmuştur. Bu film

gece boyunca vakum desikatör ile muamele edilmiştir ve böylece son kloroform

kalıntı miktarları da uzaklaştırılmıştır. 1ml saf su veya adı geçen tampon ile balon

jojeye aktarılıp 1 dakika boyunca vortekslenmiştir. Balon joje daha sonra söz konusu

lipidin faz değişim ısı noktasından daha yüksek bir sıcaklığa ayarlanan sonikatörde

tutulmuştur. 5-10 dakikalık bir süreyle sonikasyon uygulanmıştır. Daha sonra bu

balon joje shaking su banyosuna 37°C’de 1 saat boyunca bırakılmış ve böylece iyi bir

ilâç-lipid karışımı hazırlanmıştır. DSC ölçümleri Perkin-Elmer Pyris Marka DSC

cihazı ile Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında yapılmıştır.

Referans olarak hermetik kapanabilinen boş alüminyum kaplar kullanılmıştır. Lipid

konsantrasyonu olarak 20 mg/ml kullanılmıştır ve bundan 10 µl lipozom

süspansyonu hermetik alüminyum kaplara konulmuştur ve bunlar böylece

kapatılmıştır. Termogramlar gösterilen sıcaklık aralığında elde edilmiştir.

2.4.10.5. Fourier Transform Infrared (FTIR) Spektrometresi.

Bu ölçümler Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarında

yapılmıştır. Bu ölçümlerde tüm spektrum çekimleri ve direkt ölçüm yöntemi

uygulayarak gerçekleştirilmiştir.

Esas Langmuir-Blodgett tek katmanla gerçekleştirilen yüzey basınç

ölçümlerine geçilmeden önce FTIR ve DSC ölçümleri yapılmıştır. Bunun için

uluslararası standartlara uyulmuştur. Bu yaklaşımlar uyarınca ilk önce bir

formülasyonunun ön fizikokimyasal özellikleri iyi bir şekilde incelenmesi

gerekmektedir. Bununla ilgili deneysel tasarımlar aşağıdaki Tablo-2.2’de verilmiştir.

Projemde de bu hususlar aynen uygulanmıştır. Bu doğrultuda, ilk önce Paclitaxel™-

fosfolipid kompleks oluşumunun ön termal ve spektrometrik incelenmesi yapılıp tek

katman ölçümlere geçilmiştir.

195

Tablo-2.2. Ön formülasyonlarda öngörülen fizikokimyasal incelemeler*,51.

*(Kaynak: Pharmaceutical Preformulation and Formulation. A Practical Guide from Candidate Drug Selection

to Commercial Dosage Form. Mark Gibson (Ed.), Interpharm/CRC, Boca Raton Fl, 2004, pp. 23).

51 Önformülasyonlar hakkında özellikle bk.: Pharmaceutical Preformulation and Formulation. A Practical

Guide from Candidate Drug Selection to Commercial Dosage Form. Mark Gibson (Ed.), Interpharm/CRC, Boca Raton Fl, 2004.

196

3. BULGULAR

197

3.1. FTIR Ölçümleri

198

Şekil 3.1. L-α-Fosfatidilkolin’in toplam kızılötesi (IR) spektrumu.

199

Şekil 3.2. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:2 oranındaki kompleks oluşumu.

200

Şekil 3.3. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:3 oranındaki kompleks oluşumu.

201

Şekil 3.4. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:5 oranındaki kompleks oluşumu.

202

Şekil 3.5. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:7 oranındaki kompleks oluşumu.

203

Şekil 3.6. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ 1:10 oranındaki kompleks oluşumu.

204

Şekil 3.7. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ tüm karışımlarınnın üst üste getirildikten sonra görünen toplam IR spektrumları.

205

Şekil 3.8. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar kompleksi. Toplam IR spektrumu verilmiştir.

206

Şekil 3.9. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar kompleksi. 700-1500 cm-1 IR aralığı verilmiştir.

207

Şekil 3.10. Fosfatidilkolin’in toplam IR spektrumu. Farklı cihaz kullanıldığından Şekil 3.1. ile kıyaslanmalıdır.

208

Şekil 3.11. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar (1:1) karışımı. Üstte fosfatidilkolinin tek başına IR spektrumu verilmiştir.

Taxol® ile 1:1 kompleksi ise aşağıdaki IR spektrumudur.

209

Şekil 3.12. Fosfatidilkolin-Paclitaxel™ ekvimolar (1:1) karışımının toplam IR spektrumu.

210

Fig. 3.13. Fosfatidilkolin-Mg2+ ikili bileşenlerinin IR absorpsiyon spektrumları.

211

3.2. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Ölçümleri

212

Şekil 3.14. Kontrol olarak Fosfatidilkolin’in tek başına çekilen termogramı. Temodinamik parametreler termogram

üzerinde belirtilmiştir.

213

Şekil 3.15. 1.28% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram

üzerinde belirtilmiştir.

214

Şekil 3.16. 10% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram

üzerinde belirtilmiştir.

215

Şekil 3.17. 16% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram

üzerinde belirtilmiştir.

216

Şekil 3.18. 20% ilâç içeren Fosftidilkolin-Paclitaxel™ karışımın termogramı. Temodinamik parametreler termogram

üzerinde belirtilmiştir.

217

Şekil 3.19. Kontrol olarak Paclitaxel™’in termogramı.

163

3.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri

164

Şekil 3.20 Hava-su (air-water interface) ara yüzeyinin kirliliĝi.

165

Şekil 3.21 Yüzey kirliliĝinin giderilmesi.

166

Şekil 3.22: Yüzeydeki kirliliğin giderilmesi.

167

Şekil 3.23. Yüzeydeki kirliliğin giderilmesi. Basıncın aşamalı olarak düşürülmesi kirliliğin giderilmesinin işaretidir.

168

Şekil 3.24. Yüzeydeki parçacıklardan kaynaklanan kirliliğin giderilmesi. Basıncın aşamalı olarak düşürülmesi kirliliğin giderilmesinin işaretidir.

169

Şekil 3.25. Yüzeydeki toz ve parçacık kirliliğinin giderilmesi.

170

Şekil 3.26. Yüzeydeki parçacık ve ortam kirliliğinin giderilmesi.

171

Şekil 3.27. Ölçüm öncesi elde edilen son derece temiz ortamın göstergesi. Basınç “0”’ra çok yakın bir değerdedir.

172

Şekil 3.28. 0.2 mM Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC)’in konsantrasyon profilleri. Konsantrasyonlar yukarıya doĝru iki misli artırılmıştır. Ölçümler

için en yukarıdaki konsantrasyon esas alınmıştır.

173

Şekil 3.29. Kontrol olarak 0.2 mM Taxol®’un tek başına çekilen yüzey basınç-

Alan (π-A) izotermi.

174

Şekil 3.30. DPPC-Taxol®’un 1/5 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım

yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

175

Şekil 3.31. DPPC-Taxol®’un 1/4 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım

yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

176

Şekil 3.32. DPPC-Taxol®’un 1/3 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım

yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

177

Şekil 3.33. DPPC-Taxol®’un 1/2 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım

yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

178

Şekil 3.34. DPPC- Taxol®’un 1/1 oranındaki karışımın π-A izotermi. Karışım

yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

179

Şekil 3.35. DPPC- Taxol®’un 1/3 (alt) ve 1/1 (üst) karışım izotermlerinin

karşılaştırılması. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

180

Şekil 3.36. DPPC- Taxol®’un 1/3 ¼ 1/5. Karışımlar yüzey üzerinde

oluşturulmuştur.

181

Şekil 3.37. DPPC- Taxol®’un ½ karışımın alan başına molekül (Area/molecule)

olarak elde edilen izotermi. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

182

Şekil 3.38. DPPC- Taxol®’un 1/3 karışımın alan başına molekül

(Area/molecule) olarak elde edilen izotermi. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

183

Şekil 3.39. DPPC- Taxol®’un 1/5 karışımın alan başına molekül

(Area/molecule) olarak elde edilen izotermi. Karışımlar yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

184

Şekil 3.40. DPPC- Taxol®’un 1/3 vs ¼ karışımın alan başına molekül (Area/molecule) olarak elde edilen izotermlerin karşılaştırılması. Karışımlar

yüzey üzerinde oluşturulmuştur.

185

Şekil 3.41. 1/3 vs ¼ oranında hazırlanan DPPC-Taxol® karışımları. Karışımlar

önceden Eppendorf tüplerde hazırlanarak bu şekilde uygulanmıştır.

186

Şekil 3.42. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/8 oranındaki π-A izotermi, kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

187

Şekil 3.43. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/4 oranındaki izotermi,

kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

188

Şekil 3.44. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/2 oranındaki izotermi,

kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

189

Şekil 3.45. Taxol®-Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) 1/2 oranındaki izotermi,

kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi.

190

Şekil 3.46.Saf yüzey sinyalinin elde edilmesi.

191

Şekil 3.47. Yüzeyin saflık testi. Son derece temiz bir yüzey elde edilişinin kanıtı.

192

Şekil 3.48. 0.2 mM Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC)’in π-A izotermi.

193

Şekil 3.49. o.2 mM Dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC)’in kırılma noktasi

ve geriye doĝru izotermi.

194

Şekil 3.50. 1/8 oranındaki Taxol®-DPPC kompleksin izotermi. Karışım

önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

195

Şekil 3.51. 1/8 oranındaki Taxol®-DPPC kompleksin kırılma noktası ve

geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

196

Şekil 3.52. Taxol®-DPPC 1/8, 1/6, 1/4, 1/2 ve 1/1 (en alt) oranlardaki izotermleri. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

Düz çizgiler ekstrapolasyonu göstermektedir.

197

Şekil 3.53. 1/6 oranındaki Taxol®-DPPC kompleksin kırılma noktası ve

geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

198

Şekil 3.54. Her deneyden önce elde edilmesi gereken yüzey saflıĝı sinyali.

Bu saflık sinyalinin gayet iyi olmasından, diĝer ölçümlere geçilebilmektedir.

199

Şekil 3.55. Saf yüzey sinyalinin elde edilmesinden sonra, esas ölçümlere geçilmeden önce, ilk önce dipalmitoylfosfatidilkolin (DPPC)’in uyumlu

izotermi bu şekilde olmalıdır.

200

Şekil 3.56. Dipalmitoylfosfatidilkolin (DPPC)’in kırılma noktası ve geriye

doĝru izotermi.

201

Şekil 3.57. Taxol®-DPPC (1/4) kompleksin bu konsantrasyondaki

yüzeysel basınç (π-A) izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

202

Şekil 3.58. Taxol®-DPPC (1/4) kompleksin bu konsantrasyondaki kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde

hazırlanmıştır.

203

Şekil 3.59. Taxol®-DPPC (1/2) oranındaki kompleks oluşumunun yüzeysel basınç izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde

hazırlanmıştır.

204

Şekil 3.60. Taxol®-DPPC (1/2) kompleksin bu orandaki kırılma noktası

ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde hazırlanmıştır.

205

Şekil 3.61. Taxol®-DPPC ekvimolar (1/1) oranındaki kompleks oluşumunun yüzeysel basınç izotermi. Karışım önceden Eppendorf

tüplerde hazırlanmıştır.

206

Şekil 3.62. Taxol®-DPPC ekvimolar (1/1) kompleksin bu orandaki kırılma noktası ve geriye doĝru izotermi. Karışım önceden Eppendorf tüplerde

hazırlanmıştır.

207

4. TARTIŞMA

Bu projemde, çok etkili bir antikanser ilâcı olan Taxol® (Paclitaxel) ile model

membran fosfolipidler arasında oluşan moleküler etkileşmeler ele alınmıştır103. Bu

konu ile ilgili elde edilecek olan bulgular, daha sonraki aşamalarda yeni ve özellikleri

iyileştirilmiş kemoterapötik formülasyonlarının geliştirilmesini mümkün kılacaktır.

Bu doğrultuda Taxol® ile tümör hücre zarı arasında meydana gelen etkileşmelerinin

incelenmesi amaçlanmıştır. Bunun için tümör hücre yüzeyi Langmuir-Blodgett tek

katman ve fosfolipid yüzeyleriyle modellnmiştir. Bu ölçümlerden elde edilen yüzey

kimyasal parametrelerine dayanarak daha sonra in vivo ortamda ilâç-hücre etkileşim

modellerinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Projemde deneysel tasarım olarak ilk önce

ön fizikokimyasal inceleme yapılmıştır. Bunun bilimsel dayanakları ve gerekçelri

Tablo-4.1.’de verilmiştir. Ayrıca da, bundan önce sunduğum ara raporlarda da bu

hususların önemi vurgulanmıştır. Bu doğrultuda, FTIR spektroskopik ve DSC

termodinamik ölçümleri yapılmıştır. Bu cihazların Fakültemizde bulunmaması

sebebiyle söz konusu ölçümler yeni kurulan Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkezi

Laboratuvarında yapılmıştır.

4.1. FTIR Ölçümleri

FTIR spektroskopisi fosfolipidlerle bağlanmasını takiben Taxol®’un

morfolojisinin değişip değişmediğini ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Bunun

özellikle yüksek ilâç konsantrasyonlarda ilginç olacağı düşünülmüştür. İlâcın katı

fazdaki (solid state) özelliklerinin kontrol edilmesi günümüzde farmasötik

endüstrinin başlıca amaçları arasında gösterilmektedir. Birçok ilâcın kendisine ait

farklı katı fazına bağlı olarak farklı uygulamaları söz konusudur. Bazen, bir ilâcın

sudaki veya başka çözücülerdeki çözünürlülüğü ilâcın hidrasyon seviyesi gibi katı

fazdaki özelliklerine bağlıdır. Ayrıca bir ilâcın sabitliliği (stabilitesi) bu ilâcın

morfolojik olarak birkaç farklı şekil arasında gösterdiği dönüşümüne bağlıdır. Bu

bakımdan, ilâcın katı faz kontrolleri ve karakterizasyonları önemlidir. Bu, özellikle

Taxol® için geçerlidir. Bu ilâç, karmaşık organik bileşen olup birkaç katı faz yapısı

göstermektedir (Bk.: Şekil 1.26). 4 farklı morfolojik şeklinden 3’ü-dihidrat, anhidrid

103 Projenin amacı ile ilgili daha ayrıntılı bilgi için bk.: Bölüm-2: Gereç ve Yöntem.

208

ve amorf şekilleri sabittir (Şekil 4.1). Projemde de, fosfolipidlerle tanınmasını

(recognition) takiben Taxol®’daki morfolojik değişikliklerinin meydana gelip

gelmediği konusu ele alınmıştır.

Kızılötesi (IR) spektroskopisi katı fazların incelenmesi için çok uygun bir

yaklaşımdır, çünkü ölçümler için incelenen maddenin çok az miktarını

gerektirmektedir. Bu projemde, FTIR spektroskopisi fosfolipidlerle tanınma

olayından sonra Taxol®’un meydana gelen morfolojik şekillerin incelenmesi için

uygulanmıştır.

Elde edilen bulgular Şekil 3.1-3.13’te gösterilmiştir. Şekil 3.2-3.7 gösterildiği

üzere, daha yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, Taxol®’un amorf şeklinin

anhidrid şekline dönüştüğünü göstermektedir.

Şekil 3.1. 500 ile 4000 cm-1 aralığında L-α-fosfatidilkolinin tüm IR

spektumunu göstermektedir. 15’e yakın frekans bandı bu fosfolipid yapısıyla ilgili

önemli spektral ve bilgiler vermektedir (Bkz.: ayrıca Tablo-4.1). Bunların en önemli

olanları CH titreşimlerine ait olan 2750-3100 cm-1 ve CH2 wagging progression ve CH2

makaslama titreşimlerini kapsayan 1150-1400 cm-1 ve 1465-1475 cm-1 (PEVSNER ve

DIEM, 2003). Bunlardan ilki lipid açil zincirlirindeki konformasyonel düzen

hakkında, diğer ikisi ise açil zincirlerinin paketleme etkileri hakkında önemli bilgiler

vermektedir. 1258 cm-1 görülen ve PO2- titreşimlerine ait karakteristik frekans burada

1242 cm-1 ‘de görülmektedir. Aradaki 16 cm-1’lik fark kalan su etkileriyle

açıklanmaktadır104.

Taxol® 1600-1750, 1180-1300 ve 630-770 cm-1 büyük IR bandlarına sahiptir

(Bk.: Şekil 3.7, Şekil 4.1 ve Tablo 4.1). Çok küçük kaymalar dışında, tüm bu bandlar

ilâç-fosfolipid spektrumlarında da mevcuttur. Bu da, söz konusu bu komplekste

Taxol®’un bulunduğunu ve lipidle bağ oluşturduğunu göstermektedir. Tek başına

lipidin spektrumu ile ilâç-fosfolipid spektrumları karşılaştırıldığında (Şekil 3.1 ile

Şekil 3.7) Taxol®’un 1736 cm-1’daki karbonil stretching titreşimi hafifçe 1732 cm-1’ ye

104

Bu konu ile ilgili çok daha ayrıntılı bilgi Nanomedicine dergisine sunduğumuz makalemizde bulunmaktadır.

209

gitmektedir ki bu da ilâç ile fosfolipid arasında kompleks oluştuğunun bir başka

kanıtıdır. Bu, her yeni ve daha yüksek ilâç konsantrasyonlarının kullanıldığında (Şekil

3.2-3.7; Karbonil IR bandı 1736 cm-1’den→ 1707.39 cm-1’ye kaymaktadır) da

görülmektedir. Ayrıca, 3300-3500 cm-1’deki güçlü bandlar H-bağlarla bağlı olan OH

gruplarına aittir. 2880-3000 cm-1’deki karakteristi 2 band ise çok tipik bir fosfolipid

–CH ve –CH2 gruplarına aittir. İlâç ile fosfolipid arasında kompleks oluşmasını

takiben, söz konusu bandların intansitesinde önemli düşüşlerin olduğu ve ek band

kaymalarının meydana geldiği görülmektedir (Bk.: Şekil 3.1-3.7). Söz konusu

hidroksil bandları 3424 cm-1’den→ 3512 cm-1’ye kaymaktadır. Fosfolipid –CH ve –

CH2 gruplarına ait bandlar ise gittikçe yükselen Taxol® konsantrasyonlarda tamamen

yok olmaktadır (Bk.: Şekil 3.7). İlâcın tek başına ve fosfolipid kompleksindeki IR

spektrumları kıyaslandığında, 1647 cm-1’dekiC=C ve C=C’un shoulder yok olmakta ve

pik hafifçe daralmaktadır. Bu muhtemelen ilâç ile bağ yapması neticesinde, fosfolipid

tarafından alınan konformasyonlarda bir kısıtlamanın meydana geldiğinin işaretidir.

Bu da, Taxol®’un esnkeliğinde (flexibility) bir düşüşün olduğunun göstergesidir.

Ancak, bu bölgede henüz daha açıklanmayan ilâç yapılarının meydana gelebileceğini

de göstermektedir. Bu durumda, bu spektrum bölgesindeki değişikliklerden yola

çıkarak çok sağlıklı bir aypabilmek için “ağı su” (D2O) FTIR ölçüm yöntemi

uygulanmalıdır105.

Sonuç olarak, projemde kullanılan KBr tablet yöntemindeki suyun

uzaklaştırılması sonucu ilâç ile fosfolipid arasında kompleks oluşmasında genelde

fosfolipidin –CH ve –CH2 grupları ve H-bağlı yüzey OH grupları önemli ölçüde rol

oynamaktadır. İlâcın da PO2-, C=O, C=C ve CH2 grupları da bağ oluşumunda yer

almakatdır. Taxol® ile fosfolipid arasındaki kompleks oluşumundan sonra hidroksil

bandların değişikliğe uğraması, önceden varolan H-bağların koptuğunu ve bu da ilâç-

lipid kompleksinin oluştuğunun yeni bir kanıtı olarak kabul edilebilmeltedir.

Şekil 3.13. biyolojik önemi çok büyük olan lipid-metal katyon kompleks

oluşumunu göstermektedir. Burada metal katyonlar membran akışkanlığını

tetikleyen faktörler olarak incelenmiştir. Görüleceği üzere, Mg2+ ‘un sırasıyla fosfat,

105 Bu konunun önemi için Bk.: Helene Gaussier, Thierry Lefevre, and Muriel Subirade, Binding of Pediocin PA-1 with Anionic Lipid Induces Model Membrane Destabilization. Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2003, Vol. 69, No. 11, 6777–6784.

210

karbonil ve CH2 titreşimlerine etkilerini daha iyi bir şekilde yansıtılması amacıyla üç

ayrı IR spektral bölgeye yer verilmiştir. Bu ilk iki etki, şeklin üst ve orta kısmında yer

almaktadır. Burada fosfatidilkolin üzerinde (1000-1175 cm-1) çok az bir etki

görülmektedir. Bundan farklı olarak H-bağlar ve bağlanmış ve bağlanmamış karbonil

gruplar üzerindeki etki (1635.3 ve 1734.5 cm-1 ‘de) çok daha belirgindir. Karboniller

üzerinde bu etki, karbonil grupların su moleküleriyle azalan etkileşmelere bir cevap

olarak H-bağlardaki azalmalardan kaynaklanmaktadır. Fosfat titreşim bölgesini

takiben 1467.6 cm-1 ‘de yeni bir band ortaya çıkmaktadır. Bu band, heksagonal

paketlemeye geçişi işaret eden önceden daha yüksek olan bağ frekansının

düşürülmesindeki Mg2+ iyonların etkisini göstermektedir. Şeklin alt kısmında yer

alan spektrum, 720 cm-1 ‘de görülen ve değişime uğramamış CH2 rocking

hareketlerine özgü ve lipid zincirin hareketliliğini düşürüldüğünün ve zincir düzenin

artırdığının göstergesi olan sinyalin görülmesine rağmen, lipid CH2 sinyallerinde

sadece çok hafif bir değişiminin meydana geldiğini ve lipid zincir düzeni ile ilgili

bunlardan çok az bilgi alınabileceğini göstermektedir (BINDER ve ZSCHÖRNIG,

2002). Jel fazda bulunan νas PO2- üzerindeki Mg2+’un fosfat gruplarını dehadrasyona

uğratma doğrultusundaki beklenilen etkisi burada görülmemektedir. Bu, 1115 ve 1137

cm-1 ‘de çıkması beklenilen sinyallerin yokluğundan ortaya çıkmaktadır (HAUSER,

1991; BINDER ve ZSCHÖRNIG, 2002). Fosfatidilkolinin karbonil grubunun

absorpsyon spektrumu üzerine ilginç etkilerin meydana geldiği görülmektedir. 1736.6

cm-1 ‘de görülen pik su ile etkileşmeye giren H-bağ ile bağlanmış karbonillerin

bulunduğunu göstermektedir. Mg2+ iyonları νC=O daha düşük dalga numaralarına

doğru götürmektedir. Bu etki, karbonil gruplarının iyonların hidrasyon tabakalarında

yer almalarından dolayı su molekülleri tarafından daha kolayca ulaşabilmelerinden

kaynaklanmaktadır. Buna bir alternativ olarak, bu etkinin lipidlerin polar fazlar arası

bölgede bulunduğundan, beraberinde lipid yapılarının faz değişimlerini de getirdiği,

karbonil gruplarında etkeleşme neticesinde meydana gelen konformasyonel

değişikliklerinden kaynakalanabileceği fikri de geçerli olabilir.

Mg2+ ile bağlanma, ayrıca lipidteki CH2 titreşimlerine de etki eder. Yukarıda

bahsedildiği üzere, yüzeysel su oluşumu, lipid-metal katyon ikilisinin oluşuşumunun

da önemli bir parçasıdır ve etkisi söz konusu spektrumda 3000-4000 cm-1

aralığındaki piklerden görülmektedir. Bu IR absorpsyonu, bu yüzeysel su oluşumuna

211

bağlıdır (POHLE, et. al., 2000). Lipid örneğinde kalan suyun etkisi, L-α-

fosfatidilkolinin difaransiyel taramalı kalorimetrik (DSC) termogramı ile de teyit

edilmiştir106.

Şekil 4.1. Taxol®’un çeşitli katı faz şekilleri. (Bk.:Jeong Hoon Lee, Un-Sook Gi, Jin-Hyun

Kim, Yongae Kim, Seon-Ho Kim, Hunseung Oh, and Bumchan Min. Preparation and

Characterization of Solvent Induced Dihydrated, Anhydrous, and Amorphous

Paclitaxel, Bull. Korean Chem. Soc. 2001, Vol. 22, No. 8, 925-928).

106 Termodinamik teyit ile ilgili yorum ayrıca bu projenin ara raporunda da yer almaktadır.

212

Lipid yapısındaki polar kısmına özgü sinyaller veren C-H absorpsyon

bandlarıyla polar olmayan bölgede bulunan C-H grup titreşimlerinden kaynaklanan

sinyallerin birbiriyle örtüştüğünden, yaklaşımımda söz konusu spektrum

kıyaslamaları sadece Taxol® ve L-α-fosfatidilkolinin sinyallerinin (fosfat, karbonil ve

CH titreşimleri) çakışmadığı IR bölgelerinde yapılmıştır. Bu şekilde ayrıca, ikili

kompleks iki ayrı kompleks oluşumu ile (Taxol®-fosfolipid ve fosfolipid-Mg2+)

karşılaştırılmıştır. Tüm ikili kompleks oluşum IR absorpsyon spektrumları Şekil 3.2-

3.7 ve Tablo-4.1’de verilmiştir.

FTIR ölçümlerinde katı fazda ve sıvı fazda hazırlanan örneklerle çekilen

spektrumlarının kıyaslanması gerektiğine dair gerekçelerden daha önce

bahsedilmişti. KBr yönteminin ortamdan yan sinyallere neden olan suyun

uzaklaştırması gerektiğinden, bu tür FTIR ölçümlerinde önemli br yeri vardır.

Bunların geçerliliği ile ilgili hususlara daha önce verdiğim projemin ara raporlarında

yorumlar bölümünde de değinilmiştir. Projemizde şimdiye kadar yer verdiğim

neticeler KBr tablet yöntemiyle hazırlanan örneklerle elde edilmiştir. Ancak, hücresel

ortam katı değildir. Söz konusu hücresel ortamın sıvı ve akışkan olduğunu göz

önünde bulundurarak, tasarımımda yer alan aynı ölçümleri sıvı örneklerle kontrollü

nem ortamında hazırlanan ince tabaka lipid filmi ile çekilen FTIR spektral

analizleriyle devam etmek arzusundayım. Sıvı örnekleri için: Characterization of a

Cationic Lipid-DNA Complex and Its Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2,

4642-4650, (2000)., FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein

Struture in KBr Pellets by Infrared Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141,

(1998) yayınlarda yer alan prosedürleri bir sonraki projemde esas alarak uygulamak

gerekmektedir107.

107 FTIR ölçümlerinde KBr pellet (tablet) ve sıvı örneklerin önemini vurgulayan ve birbirini tutmaları konusunda yapılan deneylerle ilgili şu kaynaklarda çok önemli protokol ayrıntıları bulunmaktadır: ANCHORDOQUY, T. J., Dean Allison, S., Molina, M. D. C., Girouard, L. G., and Carson, T. K., Physical

Stability of DNA-Based Therapeutics, Drug Disc. Today, 6, 463-470, (2001).

BANYAY, M., Sarkar, M. and Gräslund, A., A Library of IR Bands of Nucleic Acids in Solution,

Biophys. Chem., 104, 477-488, (2003).

213

BINDER, H., and Zschörnig, O., The Effect of Metal Cations on the Phase Behavior and Hydration

Charactersitics of Phospholipid Membranes, Chem. Phys. Lipids, 115, 39-61, (2002).

BLOOMFIELD, V. A., Crothers, D. M., and Tinoco, I. Jr., Nucleic Acids-Structures, Properties, and

Functions. University Science Books, Sausalito, CA 94965 (2000), Pp: 210-212.

BRUNI, P., Cingolani, F., Iacussi, M., Pierfederici, F. , and Tosi, G., The Effect of Bivalent Metal Ions

on Complexes DNA-Liposome: a FT-IR Study, 565-566, 237-245, (2001).

CLEMENT, J., Keifer, K., Kimpfler, A., Garidel, P., and Peschka-Süss, R., Large-Scale Production of

Lipoplexes With Long Shelf-Life, Eur. J. Pharmaceut. Biopharm., 59, 35-43, (2005).

FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein Struture in KBr Pellets by Infrared

Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141, (1998).

GARIDEL, P., Blume, A., and Hübner, W., A Fourier Transform Infrared Spectroscopic Study of the

Interaction of Alkaline Earth Cations With the Negatively Charged Phospholipid 1,2-dimyristoyl-sn-

glycero-3-phosphoglycerol,. Biochim. Biophys. Acta, 1466, 245-259, (2000).

GAUGER, D.R., Selle, C., Fritzsche, H., and Pohle, W., Chain-Length Dependence of the Hydration

Properties of Saturated Phosphatidylcholines as Revealed by FTIR Spectroscopy, J. Mol. Structure,

565-566, 25-29, (2001).

GÜNZLER, H. and Gremlich, H.-U., IR Spectroscopy. An Introduction, Wiley-VCH Verlag GmbH,

69469, Weinheim (Germany), (2002).

HACKL, E. V., Kornilova, S. V., Kapinos, L. E., Andrushchenko, V. V., Galkin, Vi L., Grigoriev, D. N.,

and Blagoi, Yu. P., Study of Ca2+, Mn2+ and Cu2+ Binding to DNA in Solution by Means of IR

Spectroscopy, J. Mol. Structure, 408/409, 229-232, (1997).

HAUSER, H., Effect of Inorganic Cations on Phase Transitions, Chem. Phys. Lipids, 57, 309-325,

(1991).

HÜBNER, W. and Blume, A., Interactions at the Lipid-Water Interface, Chem. Phys. Lipids, 96, 99-

123, (1998).

JOHNSTON, S. F., Fourier Transform Infrared – A Constantly Evolving Technology, Ellis Horwood

Limited, (1991).

214

LAI, E., van Zanten, J. H., Evidence of Lipoplex Dissociation in Liquid Formulations, J. Pharm. Sci.,

91, 1225-1232, (2002).

Le BIHAN, T., and Pézolet, M., Study of the Structure and Phase Behavior of

Dipalmitoylphosphatidylcholine by Infrared Spectroscopy: Characterization of the Pretranstion and

Subtransition, Chem. Phys. Lipids, 94, 13-33, (1998).

LEWIS, R. N. A. H., Winter, I., Kriechbaum M., Lohner, K. and McElhaney, R. N. Studies of the

Structure and Organization of Cationic Lipid Bilayer Membranes: Calorimetric, Spectroscopic, and X-

ray Diffraction Studies of Linear Saturated P-O-ethyl Phosphatidylcholines, Biophys. J., 60, 1329-

1342, (2001).

LEWIS, R.N.A.H. and McElhaney, R.N., Fourier Transform Infrared Spectroscopy in The study of

Hydrated Lipids and Lipid Bilayer Membranes. in: H.H. Mantsch and D. Chapman (Eds.), Infrared

Spectroscopy of Biomolecules. Wiley-Liss, New York, (1996), Pp: 159-202.

PEVSNER, A., and Diem, M., IR Spectroscopic Studies of Major Cellular Components. III. Hydration

of Protein, Nucleic Acid, and Phospholpid Films, Biopolymers (Biospectroscopy), 72, 282-289,

(2003).

POHLE, W., Gauger, D.R., Fritzsche, H., Rattay, B., Selle, C., Binder, H., and Böhlıg, H., FTIR-

Spectroscopic Characterization of Phosphocholine-Headgroup Model Compounds, J. Mol. Structure,

563-564, 463-467, (2001).

POHLE, W., Selle, C., Gauger, D. R., Zantl, R., Artzner, F., and Rädler, J. O., FTIR Spectroscopic

Characterization of a Cationc Lipid-DNA Complex and Its Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2,

4642-4650, (2000).

RUTHVEN, N. A., Lewis, H. and McElhaney, R. N., The Structure and Organization of Phospholipid

Bilayers as Revealed by Infrared Spectroscopy, Chem. Phys. Lipids, 96, 9–21, (1998).

SAENGER, W., Principles of Nucleic Acid Structure, Chapter 17: Water and Nucleic Acids. Mir

Publishers, Moscow, (1987), Pp: 63, 393-412 (The Russian translation).

SELLE, C. and Pohle, W., Fourier Transform Infrared Spectroscopy as a Probe for the Study of the

Hydration of Lipid Self-assemblies. II. Water Binding Versus Phase Transitions, Biospectroscopy, 4,

281-294, (1998).

215

SELLE, C., Pohle, W. and Fritzsche, H., FTIR Spectroscopic Features of Lyotropically Induced Phase

Transitions in Phospholipid Model Membranes, J. Mol. Structure, 480-481, 401-405, (1999).

SILVESTRO, L. and Axelsen, P. H., Infrared Spectroscopy of Supported Lipid Monolayer, Bilayer, and

Multibilayer Membranes, Chem. Phys. Lipids, 96, 69-80, (1998).

SORGI, F., and Huang, L., A Dry Powder Formulation for Gene Therapy, Pharm. Res., 12, S266,

(1995).

TAILLANDIER, I.E. and J. Liquier. (2002), in: J.M. Chalmers and Griffith (eds.), Handbook of

Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, Chichester, Vol. 5, Chapter 2, Pp. 3465-3480.

van der WEERT, M., Haris, P.I., Hennink, W.E., and Crommelin, D.J.A., Fourier Transform Infrared

Spectrometric Analysis of Protein Conformation: Effect of Sampling Method and Stress Factors, Anal.

Biochemistry, 297, 160-169, (2001).

ZUNDEL, G. Polar Interactions, Hydration, Proton Conduction and Conformation of Biological

Systems – Infrared Results, , in: W. Hoppe, W. Lohmann, H. Markl, H. Ziegler (Eds.), Biophysics,

Springer-Verlag, Berlin, Hedelberg, New York, Tokyo, (1983). Pp: 243-254.

216

Tablo 4.1 FTIR ölçümlerinde görülen önemli IR band titreşimleri.

Fosfolipid 3424.9

2922

2852.2

1736.6

700 – 1500

1467.4

1378.1

1242.6

1091.5

970.4

927.0

826.9

721.8

Su band

νs[(CH3)4]

νs[(CH3)4]

νs[C=O]

δ[C-H]

scissoring δ[(CH2)n]

δ[CH2]

νas[PO2-]

ν[PO2-]

asimetrik [+N-(CH3)3] stretching

bölgesi

ν[C-C-N]

ν [P(-O-C)n]

rocking ν[(CH2)n]

Phospholipid-Mg2+ 975.7

1095.4

1467.6

1635.3

1734.5

2261.5

2852.9

2923.3

3241.4

3405.5

ν[C-C-N]

ν[PO2-]

scissoring δ[(CH2)n]

H-bağlı olmayan CO

H-bağlı CO

CH stretching

CH2 stretching

CH2 stretching

Yüzeysel (Interstitial) su

Bağlı su

Taxol® 3064

1735

1709

1647

1072

-C-H

ester

keton

amid

Finger print

217

1244

708

Finger print

Finger print

Fosfolipid- Taxol® 709

969

1095

1245

1467

1647

1737

2853

2923

3441

Finger print

Asimetrik [+N-(CH3)3] stretching

Simetrik νs[PO2-]

Antisimetrik νas[PO2-]

Scissoring CH2δ (hexagonal)

C=O; simetrik alil C=C

C=O stretching

Simetrik νs[(CH3)4]

Simetrik νs[(CH3)4]

H-bağlı OH grupları

4.2. DSC Ölçümleri

Bu ölçümler, Taxol®’un fosfolipid yüzeyine ve faz değişimlerine etkisini ortaya

çıkarmak için yapılmıştır. Önceden hazırlanan fosfolipid türlerinin tek başına veya

farklı oranlarda Taxol® içeren komplekslerinin DSC termogramları bu raporumun sf.

113’te bulunan Şekil 3.14-3.19 verilmiştir.

Genel olarak, Taxol®’un sisteme katılması fosfatidilkolin moleküllerinde

birtakım perturbasyonlara veya daha muhtemel olarak mikrodomenlere yol

açmaktadır. Egg fosfatidilkolin kullanıldığında çok düşük oranda - 1.28% Taxol®

oranı bile glass transitiom (Tg) ısı değişim noktasının değişmesine yol açmaktadır

(Şekil 3.15). İkinci bir pikinise 56.19°C’de ortaya çıkması muhtemel olarak birden

fazla faz oluştuğunun işaretidir. Muhtemelen Taxol®’un katılmasından kaynaklana

mikrodomen oluşumunun işaretidir. Söz konusu faz değişiminin (Tg) fosfolipidlerin

polar kısmındaki yabancı moleküllerin bulunmasına son derece duyarlı olduğundan,

bu noktanın değişime uğraması sadece spesifik moleküler değişimlerle açıklanamaz.

10% Taxol® içerildiğinde, esas faz değişim ısısı (main phase transition temperature-

Tm) 26.16°C’den 28.25°C’ye gitmektedir, ancak etrafındaki termgram piki simetriktir.

Ancak, Tm piki daralmaktadır ve yüksekliğ düşmektedir. 1.28% Taxol®’un

içerildiğinde, esas faz değişimi ısı noktası (Tm) hafifçe daha düşük değerlere

218

gitmektedir (Şekil 3.15; 26.16°C→21.68°C), ancak etrafındaki termogram piki

simetrik kalmaktadır. Bu pikin genişliği daralmakatdır. Bu etki, söz konusu faz

değişimi ısı noktasının (Tm) kooperativitesinin arttığını ve fosfolipidlerin

esnekliğinidüşürmektedir. Bu durumda, çok düzenli olan all-trans hidrokarbon

fosfolipid zincir konformasyonu mevcuttur. Daha yüksekbir rotasyon serbestliğe yol

açan gauche (kinked) konformasyon ise söz konusu değildir. Taxol® içeriğinin 10%

faz değişim noktası (Tm) daha düşük değere değil, daha yüksek değerlere gitmektedir

(Şekil 3.16; 26.16°C→28.25°C). 56.19°C’deki ikinci pik artık görülmemektedir. Tm

piki ise simetrik değildir-sağ tarafında ikinci bir ufak pik belirmektedir. Bu da,

Taxol®’un daha yüksek konsantrasyonlarda fosfolipidlere karşı bir şekilde afinitesinin

arttığını göstermektedir. Tm‘e kıyasla glass transition temperature (Tg) pikinde daha

belirgin etkiler görülmektedir. Başka bir deyişle, Tg Taxol® varlığında daha büyük

değişime uğramaktadır. 1.28% Taxol® varlığında, Tg -19.75°C→-22.61°C gitmektedir

ve ayrıca da belirgin bir şekilde genişlemektedir. Aynı neticenin, 10%, 16% ve 20%

görülmesi (Şekil 3.16-3.18) görülmesi ise son derec ilginçtir. Bu neticeler, 0-10%

aralığındaki Taxol® varlığının fosfatidilkolin akışkanlğını arttırmaktadır (Tm‘i

düşürmektedir) ve esas faz değişimi noktasının (Tm) kooperativitesini arttırmaltadır

(faz geçişini daraltmaktadır). 10% Taxol® varlığında ise farklı bir durum öne

çıkmaktadır. Tm yükselmektedir ve 2nci pik yok olmaktadır. Ancak, 16% Taxol®

varlığı akışkan fazın (Tm azalmış durumdadır) tekrar ortaya çıkmasına neden

olmaktadır. Akışkan faz Şekil 4.2’de gösterilmiştir.

219

Şekil 4.2. Fosfolipid çift katmanların akışkanlığının meydana gelmesi.

20% Taxol® varlığında ise sadece Tg üzerindeki etki görülmektedir. Başka bir

deyişle, daha yüksek Taxol® konsantrasyonlarda fosfatidilkolin dispersiyonu daha

akışkan bir hale gelmektedir. Bu noktalarda glass transition noktası (Tg) esas faz

değişimi noktasından (Tm) daha önemli bilgiler vermektedir. Bu neticeler, Taxol®’un

diğer fosfolipid molekülleriyle etkileşmelerini inceleyen araştırmalardaki durumdan

çok farklıdır. Bu egg fosfatidilkolinin diğer fosfatidilkolin türlerine kıyasla farklılıklar

gösterdiğini ortaya çıkarmaktadır. Bu, Taxol®’un yapısından kaynaklanmaktadır (Bk.:

Şekil 1.26). Çok hacimli bir molekül olduğundan, Taxol® fosfolipid moleküllerinin iç

bölgelerine kadar ulaşamaz. Hidrofobik bölgelere penetrasyonu kısıtlıdır ve lipidlerin

ilk birkaç açil zinciri ile bağ yapmaktadır. Ancak, bu durum gerçekten lup olmadığı

paramanyetik özellikleri olan etiketler kullanarak Electron Spin Resonance

Spektroskopisi (ESR) ile teyit edilmelidir.

4.3. Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümleri

30°C hava/su (air/water) tek başına ve Taxol® ile kompleks halindeki

fosfolipidlerin π-A bu raporun sf. 119’da bulunan 3.3. “Langmuir-Blodgett Tek

Katman Ölçümleri” başlıklı bölümde verilmiştir. Daha önce de bahsedildiği üzere

esas ölçümlere başlamadan önce, ortamın ve özellikle de söz konusu ara yüzeyin

temiz hali sağlanmalıdır. Bu yüzeyin temiz hale getirilmesi sırasıyla Şekil 3.20-

220

3.27’de gösterilmiştir. Temiz ara yüzeyin elde edilişi özellikle Şekil 3.27’de ve Şekil

3.47’de açıkça görülmektedir-bunun kriteri olarak yüzey basıncın 0 ile 1 arası olması

gerektiği hususu esas alınmaktadır (Bk.: www.nima.co.uk).

Yük taşımayan (zwitterionic, nötr) lipidlerin π-A izotermleri belirtilen

konsantrasyonda Şekil 3.28’den itibaren başlamaktadır. Bunlar gibi bir birine çok

benzeyen ve aralarında aynı polar baş grubuna sahip ve sadece hidrokarbon zincir

kısmında bir-CH2 grubu gibi çok küçük hacimli bir grupla farklılaşan fosfolipidlerde

bile farklı izotermler izlenmektedir.

Yüksek yüzey basınç bölgesinde izotermlerin şiddetli bir şekilde yükselişleri

açıkça görülmektedir (<50 Å2). Fosfolipidler arasında gözlenen bu eğri farkı, daha

uzun alifatik zincirli lipid hidrokarbom kısımların arasında meydana gelen daha

güçlü van der Waals kuvvetleri ve etkileşmeleri ile açıklanmaktadır. Daha geniş

moleküler alan, daha uzun alifatik zincire karşılık geldiği de açıkça görülmektedir.

Başka bir deyişle, bu durumda yüzey basıncın yükselmesi için daha fazla lipid

molekülleri gerekmektedir.

Şekil farklılıklarından başka, farklı fosfolipidlerde izotermlerin dikey olarak

yükseliş şekilleri arasında da (the sttepness of the isotherms) önemli farklılıklar

gözlenmektedir. Bu olgu, söz konusu lipidlerin hava/su ara yüzeyi üzerinde

oluşturdukları tilt angle ile açıklanabilir. Çünkü bu durumda geniş yüzey basınç (π)

aralığında bile bazı lipidler daha sıvı halde iken (liquid-expanded phase), başka lipid

türlerinin tek katmanları sıvı-kondanze (liquid-condensd phase) fazdadır. Bu

gerekçenin doğruluğu, bir lipidlerin açil zincir kısmı ne kadar daha uzunluğuna bağlı

olarak bu lipidin daha hdrofobik özellikleri kazanması hususu göz önünde

bulundurulduğunda açıkça ortaya çıkmaktadır.

Şekil 3.28 bir lipidin konsantrasyon ayarlanması deneylerini göstermektedir.

Şekil 3.28’den başlayarak Şekil 3.62’ye kadar farklı deneysel tasarımlar gösterilmiştir.

Örneğin, Şekil 3.30-Şekil 3.39 arasında verilen izotermler, önceden belirlenen

konsantrasyonlardaki Taxol®-fosfatidilkolin karışımlarının doğrudan Langmuir-

Blodgett tek katman üzerinde oluşturularak elde edilmiştir. Şekil 3.40 sonraki

221

şekillerde ise söz konusu karışımlar önceden Eppendorf tüplerde hazırlanıp tek

katmana uygulanmıştır. Aynı bölümde, π-A izotermleri, lipidin ulaştığı kırılma

noktası (collapse point) ve geriye doğru izotermleri gösterilmiştir. Bu şekilde molekül

başına düşen alanı (Area/molecule) hesaplamak çok daha kolaylaşmaktadır. Çünkü

bu şekilde monolayer compression-extension eğrileri kıyaslayarak tek katman

üzerindeki lipid molekülünün veya ilâç karışımının ne kadar alan kapsadığını

hesaplamak mümkündür.

Şekil 3.48 ise dipalmitoylphosphatidil choline’in (DPPC) tipik bir izotermidir.

Bu izoterm diğer lipidlere göre farklıdır, çünkü bu tipik liquid expanded→liquid-

condensed faz değişimlerini göstermektedir. Bu bakımdan, bu değişimler first-order

olarak adlandırılmaktadır.

Tek başına fosfatidilkolin’den başka bir diğer kontrol eğri de tek başına

Taxol®’un eğrisi elde edilmiştir ve Şekil 3.29’de gösterilmiştir. Görüldüğü üzere,

lipidlere kıyasla Taxol®’un izotermi son derece düzgün bir şekilde ve dalgalanma

göstermeksizin gradient olarak yükselmektedir. Bu da, Taxol®’un yüksek bir

kompresibiliteye sahip olduğunun bir göstergesidir. Başka bir deyişle, air/water ara

yüzeylerde Taxol®’un yüzeysel basıncı lipidlere göre çok daha düşüktür ve bu da

ilâcın çok düşük bir yüzey aktiviteye sahip olduğunu göstermektedir. Yüzey basıncın,

yüzey gerilimin yüzey aktivitesine sahip moleküller tarafından düşürülmesinin ifadesi

olduğundan, Taxol®’un su yüzeyinde ekspansiyonu lipidlere göre çok daha düşük

olduğu hususu ortaya çıkmaktadır. Bu da mantıklıdır, çünkü lipidlerin amfifilik

doğasından dolayı baş gruplaru su yezeyi ile tams etmek durumundadır ve zincirleri

ise hava fazına doğru yönelirler. Taxol® ise çok hidrofobiktir. Lipidler gibi air/water

ara yüzeylerde aynı eğilimi göstermemektedir. Bu yüzden, Taxol® gibi bir molekülün

yüzey basıncını çok daha düşük değerlere götürmektedir.

4.3.1. Bu Projede Yapılan Langmuir-Blodgett Tek Katman Ölçümlerinin

Daha Önce Başka Bir Cihazla Yaptığım Ölçümlerle Kıyaslanması

Bu bölümde bu projemde elde edilen neticelerin daha önce çok daha temiz

ortamlarda başka bir Langmuir-Blodgett cihazıyla ve çok deneyimli araştırmacıların

kontrolü altında yapmış olduğum deneylerle kıyaslamalara yer verilmiştir. Bu şekilde

222

bu projemde elde edilen verilerin geçerliliği ve tekrarlanabiliriliği hususu

vurgulanmaktadır. Ayrıca da, bu tür araştırmalarda farklı cihazların aynı neticeyi

verip vermediğini inceleyerek cihazlar arasında ölçüm hassasiyetinin de kontrol

edilmesi çok önemlidir.

Aşağıda gösterilen neticeler, 1998 yılında konuk araştırmacı olarak

bulunduğum Bergen Üniversitesi, Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Bölümünde

yürütülen EU destekli “Acyl Specificity and Compartmentation in

Glycerophospholipid Metabolism During Signal Transduction in Brain” başlıklı

proje kapsamında elde edilmiştir. Bu neticeleri henüz daha yayımlamadım ve bu

raporumda bunlara söz konusu sağlıklı kıyaslamaları yapabilmek amacıyla yer

verilmiştir. Söz konusu projede nörokimyasal özellikleri olan klorpromazin ilâcı ile

model lipid tek katmanlar arasındaki moleküler etkileşmeler incelenmiştir.

Taxol® ile ilgili projemde elde ettiğim neticelerle bunların kıyaslandığında çok

iyi bir örtüşmenin söz konusu olduğu ortaya çıkmaktadır. İlk önce, Fakültemizde

yaşadığım ortam temizliği sorunu Norveç’teki çok iyi donanımlı üniversite

laboratuvarında da yaşanmıştır. Bu sorun, Şekil 4.3 ve 4.4 izotermlerine de

yansıtılmıştır. Bu çok büyük sorunu minimuma indirmek amacıyla Fakültemize

NIMA Technology’nin ürettiği Langmuir-Blodgett tek katman cihazı108 yanında

sunulan koruyucu konteyner ile alınmıştır. Bu çok tozlu olan 422 No’lu Merkez

Laboratuvarımızdaki ortamdan uzaklaşarak deneylerin temiz bir ortamda

yapılmasında çok faydalı olmuştur. Fakülteye getirdiğim cihazın bazı rakip firmaların

ürettiği (www.kibron.com ve www.ksvltd.com) üstünlükleri de vardır. Örneğin, son

derece “user-friendly” software sayesinde neticeleri doğrudan üst üstte getirip

inceleme fırsatı sunmaktadır. Ancak, yine de bu projemde elde ettiğim verileri Excel®

gibi uygun bir grafik çizim programına dönüştürüp yayın yapmak üzere tekrar

grafikleri elde edilecektir. Fakültemize getirdiğim cihaza ayrıca da çok uygun bir su

sirkülatörü monte edilmiştir. Bu şekilde sıcaklık kontrolü altında Şekil 4.10-4.11’de

gösterilen ortam sıcaklığının önemi bir kez daha vurgulanmıştır. Bu konunun önemi

daha önce çözeltilerin pH kontrolü (Bk. Şekil 4.7) ve 4.8 ve saf suyun kullanılmasının

(Bk.:Şekil 4.9) önemi ile birlikte ara raporlarımda ayrıntılı olarak ifade edilmiştir.

108 Bk.: www.nima.co.uk veya www.langmuir.com.

223

Şekil 4.3. Kibron marka (www.kibron.com) Langmuir-Blodgett cihazıyla yapılmış bir

deney. Ara yüzeyin temizlilik testi gösterilmektedir. Üstte, kirli bir yüzeyin neden

olduğu anlamsız izotemler görülmektedir. Altta verilen oklarla

dpalmitoilfosfatidilserin (DPPS) çok düzgün bir (π-A) izotermi görülmektedir.

224

Şekil 4.4. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazıylayüzey temizliliği testinden sonra

(üstteki eğriler) elde edilen düzgün bir lipid izoterminin elde edilişi (altta).

225

Şekil 4.5. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazıyla elde edilen dipalmitoylphoshpatidyl

choline-chlopromazine (DPPS-chlorpromazine) bileşimlrinin izotermleri. Farklı

orandaki karışımlar gösterilmiştir.

226

Şekil 4.6. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazıyla yapılmış başka bir lipid-

chlopromazine etkileşmeleri deneyleri. Yüzey basınç (π)-moleküler alan (apparent

surface molecular area (MMA)) ilişkisi, oda sıcaklığında çeşitli lipidlerle meydana

gelen etkileşmeler gösterilerek ortaya çıkarılmıştır. 0 (a), 1 (b), 10 (c), 100

(d), and 1000 mM (e) subphase Chlorpromazine konsantrasyonları.

227

Şekil 4.7. Yukarıdaki izotermler üzerie Na+ iyonun etkisi. Deneyler Kibron marka

Langmuir-Blodgett cihazı ile yapılmıştır. Lipid alanındaki artış açıkça görülmektedir.

Lipid olarak DPPS kullanılmıştır ve monolayer’ı oda sıcaklığında uygulanmıştır; (A) 1

mM CPZ and (B) 20 mM CPZ subphase with 0 (a),

2 (b), and 150 (c) mM NaCl.

228

Şekil 4.8. 150 mM NaCl, DPPS izotermler üzerine etkisi. Tüm izotermler plato ile biten

faz değişimi göstermektedir. Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazı kullanılmıştır;

0 mM cations (1),

2 mM NaCl (2), 2 mM LiCl (3), 150 mM LiCl (4), and 150 mM NaCl (5).

Söz konusu iyon etkileri aşağıdaki çizimde daha ayrıntılı bir şekilde göterilmiştir109:

109 Burada sadece modelin algılanması için veridiğinden ve daha sonra buna atıfta bulunulmadığında bu şekle numara verilmemiştir.

229

Şekil 4.9. Milli-Q saf su ile yapılmış tek katman deneyleri. Kibron marka Langmuir-

Blodgett cihazı kullanılmıştır. Diğer ortam parametreleri şunlardır: Surface

pressure/area curve for a DPPS monolayer spread on

milli-Q water (1), 1 mM CPZ (2), 10 mM CPZ (3), 1 mM CPZ

(4), 10 mM CPZ (5), 1 mM CPZ (6), and 10 mM CPZ (7).

10 mM CPZ.

Şekil 4.10. Farklı sıcaklıklarda elde edilen DPPS monolayer izotermleri. Moleküler alanlar

π= 20 mN/m ortam sıcaklığı ıskalasına göre çizilmiştir. Deneyler Kibron marka

Langmuir-Blodgett cihazı ile sıcaklık kontrol sistemi kullanarak yapılmıştır.

230

Şekil 4.11. Farklı sıcaklıklarda yapılan DSPS monolayer izotermleri. Moleküler alan

hesaplamaları π= 20 mN/m’ında yapılmıştır ve ortam sıcaklığı ıskalasına göre

çizilmiştir. Deneyler Kibron marka Langmuir-Blodgett cihazı ile sıcaklık kontrol

sistemi kullanarak yapılmıştır.

4.4. Taxol®- Fosfolipid Membran Arasında Oluşan Yapı

Bu projemde kullanılan ölçümler sayesinde ortaya çıkarılan Taxol®-fosfolipid

etkileşmelerine dayanarak şu model geliştirilmiştir (Şekil 4.12).

Şekil 4.12. Moleküler düzeyde oluşan Taxol®-model membran fosfolipid yaıları.

Sağda (B) şeklinde verilen model bu projemde elde edilen neticelere bakacak

olursak çok daha muhtemeldir. Bu hususlara daha önce çok detaylı olarak yer

231

verilmiştir. Ayrıca da, bu model projeden kaynaklanacak olan makalelere de

yansıtılacaktır. Bu yüzden, bu konuya burada çok kısa olarak değenilmiştir.

4.5. Biyoteknolojik Boyut

Bu projemin 2 ayrı boyutundan biridir. Taxol®’un hidrofobik özeklerinden

kaynaklanan çözünürlülük problemleri ile ilgilidir. Şimdiye kadar geliştirilen

taşıyıcıları ile ilgili verilere dayanarak, bu formülasyonlarının lipide dayalı kontrollü

sistemlerin geliştirilmesinde önemli bir motivasyonu teşkil etmektedir. Bu bölümde,

projemde geliştirilen Taxol®-membran fosfolipid etkileşme modellerinin

biyoteknolojik tasarımlarını vurgulamaktadır. Bu boyut son derece geniş olduğundan

burada sadece önemli şekillere yer verimiştir. Buradaki modeller daha önce

hazırladığım ders notlar olarak Anabili Dalımızın isteği üzere Fakültemize bunların

bir ders olarak vermem konusunda 16.11.2007 tarihinde yazılı olarak bir başvurum

olmuştur. Ancak bu dilekçeme herhangi bir cevap (oumlu veya olumsuz, sözlü veya

yazılı) verilmemiştir. Bu modelleri istenildiği takdirde raportörlerimize seminerler

vererek açıklayabilirim. Bunları burada açıklamak bu raporumun hacmini çok

arttıracaktır. Bu modeller projeden kaynaklanacak olan makalelere de

yansıtılacağında, bunlara burada fazla yer verilmeyecektir. Burada yer alan tüm

şekillere renkli olarak www.interscience.wiley.com’dan ulaşmak mümkündür.

232

Şekil 4.13. Lipidlere dayalı antineoplastik formülasyonlarının geliştirilmesi. (Bk.: Gerben

A. Koning and Gerard C. Krijger, Targeted Multifunctional Lipid-Based Nanocarriers

for Image-Guided Drug Delivery, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2007,

7, 425-440).

233

Şekil 4.14. Hücre içi (intraselüler) antikanser formülasyonlarının akıbeti. (Bk.: Gerben A.

Koning and Gerard C. Krijger, Targeted Multifunctional Lipid-Based Nanocarriers for

Image-Guided Drug Delivery, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 2007, 7,

425-440).

Şekil 4.15 Nanotıp konuları doğrultusunda antikanser ilâçların kullanım perspektifleri

(Bk.: Yiyao Liu, Hirokazu Miyoshi and Michihiro Nakamura, Nanomedicine for drug

delivery and imaging: A promising avenue for cancer therapy and diagnosis using

targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer. 120, 2527–2537 (2007).

234

Şekil 4.16. Bu projemde de ele alınan antikanser ilâç formülasyonlarının bastleştirilmiş

hazırlanma şemaları.

Şekil No. 4.17. Taxol® gibi çözünürlülük sorunları olan antikanser ilâçlarının

hedeflendirilmiş tedavi uygulamaları (Bk.: Yiyao Liu, Hirokazu Miyoshi and

Michihiro Nakamura, Nanomedicine for drug delivery and imaging: A promising

avenue for cancer therapy and diagnosis using targeted functional nanoparticles, Int.

J. Cancer. 120, 2527–2537 (2007).

.

235

Şekil 4.18 In vivo kanser kemoterapilerde kullanılmak üzere geliştirilmiş hedfelendirlimiş

antikanser tedavi profileri ve biyokonjuge Qdot’ların uygulanma presipleri (Bk.:

Yiyao Liu1, Hirokazu Miyoshi and Michihiro Nakamura, Nanomedicine for drug

delivery and imaging: A promising avenue for cancer therapy and diagnosis using

targeted functional nanoparticles, Int. J. Cancer. 120, 2527–2537 (2007)110.

110 Şekil 4.18-b)’de gösterilen in vivo görüntüleme sisteminin Fakültemize getirilmesi için proje hazırlanmıştır-bk.: Ek-17.

236

4.6. Hücresel ve Moleküler Biyolojik Boyut

Bu konu, projemin ikinci boyutunu oluşturmaktadır ve daha çok hücresel

biyolojik teorilere dayanarak Taxol®’un günümüzde gerçerli olan etki mekanizmasına

ek bilgiler katmak amacıyla geliştirilmiştir. Bu konu ile ilgili olarak aşağıda bir öncü

hipotez de sunulmuştur. Buradaki modeller, antikanser ilâçların membran

akışkanlığı üzerindeki etkilerine dayanmaktadır (Şekil 4.19-4.20 ve Tablo-4.2-4.4).

Şekil 4.19. Antikanser ilâçların hücresel hedefleri ve kanser ile bağlantı noktaları (Bk.:

Petty, 1993).

237

Tablo-4.2 Hücre zarı akışkanlığı ve kanserle bağlantısı. Tablo DPH floresan

spektroskopik ölçümlere dayanarak yapılmıştır (Bk.: Petty, 1993).

Tablo-4.3. Neoplazmik Transfromasyon ve Hücrelerdeki Morfolojik Değişiklikler (Bk.:

Petty, 1993).

238

Tablo-4.4. Neoplazmik Transformasyona Yol Açan Bazı Membran Proteinleri (Bk.: W.

Petty, 1993).

239

Şekil 4.20. Hücre membranı ve neoplazmik oluşumlarındaki rolü (Bk.: W. Petty, 1993).

240

Şekil 4.21. Taxol®’un sinyal iletim mekanizmalarındaki yeri.

241

Şekil 4.22. Taxol®’un sinyal iletim mekanizmalarındaki yeri. Ceramid’in merkezi rolü

özellikle vurgulanmıştır.

Bu bağlamda, şu ana kadar çok az sayıda araştırılan antikanser ilâcın

membran üzerindeki etkileri araştırlmıştır, ancak konu popularitesini korumaktadır.

Bununla ilgili olarak, projemde de Taxol®’un da muhtemelen böyle bir hücre

membran üzerinden çalışan ek bir mekanizması üzerine yoğunlaşılmıştır. Taxol®’un

mebran üzerindeki sinyal iletim mekanizmalarına muhtemel etki noktaları Şekil 4.21

ve 4.22’de gösterilmiştir. Projemde kullanılan fosfolipid türleri çok dikkatlice

seçilmiştir. Zwitterionic lipid türlerinin önemine daha önce ayıntılı olarak yer

verilmiştir. Bunun dışında Ceramid (C16) gliserofosfolipid türleri de denenmiştir.

Bunun seçimi Ceramid’in Şekil 4.23-4.26 gösterilen merkezi rolünden

242

kaynaklanmaktadır. Bundan farklı olarak bir de negativ yüklü fosfatidilserin lipidleri

de incelenmiştir. Bunları seçimi de Şekil 4.27’de gösterildiği üzere söz konusu

fosfatidilserininin tümör oluşumlarında önemli olan membran lipid raftlardaki

rolünden kaynaklanmaktadır. Çünkü birçok kanser hücre membranında normal

hücrelerden farklı olarak fosfatidilserin ekspresyonu çok önemli artışlar

göstermektedir.

Şekil 4.23. Ceramid’in hücresel fosfolipid metabolizmasındaki merkezi rolü.

243

Şekil 4.24. Ceramid’in hücresel fosfolipid metabolizmasındaki merkezi rolünü gösteren başka bir şema.

244

Şekil 4.25. Ceramid’in hücresel apoptoz olaylarında ve bununla bağlantılı olarak lipid

raftların oluşumundaki rolü.

Şekil 4.26. Ceramid’in hücre mitokondri membranıyla bağlantı noktaları ve apoptozda oynadığı önemli rol.

245

Şekil 4.27. Fosfatidilserin’in antineoplazmik oluşumlarındaki rolü.

Tüm bu konular, projemden kaynaklanacak yayınlarda ele alınacağından bunlara burada daha fazla yer verilmeyektir.

246

4.7. Projemde Geliştirilen Tasarımın Diğer Analitik

Uygulamalardaki Yeri

4.7.1. İlâç Ligandlarının Ayrışımı ve Analizi için İmobilize Lipozom

Kromatografisinin Geliştirilmesi

Bu doğrultuda ilâç-fosfolipid arasındaki tanıma (drug-phospholipid

recognition) ile ilgil bu şekilde elde edilen önemli fizikokimyasal parametreler çok

yakın bir gelecekte çeşitli yapı ve işlevlere sahip farmasötik formülasyonlarının

ayrıştırılması, saflaştırılması ve analizleri için yeni ve analitik özellikleri iyileştirilmiş

kromatografik stasyoner fazların üretilmesinde ve uygulamasında kanımızca

kullanılabileceklerdir.

Projemde, bu bağlamda çeşitli katyonların da varlığında ilâç

konformasyonlarına spesifik olarak ve gerektiğinde spesifik olmayan bir şekilde

çeşitli tepkilemelerde önem taşıyan yapı-aktivite ilişkisi araştırmalarında bu

bileşenlerde moleküler ve yüzeysel etkileşmelerinin sıvı, çift-fazlı sistem olarak

kullanılmalarını vurgulamaktayız. Kromatografik kolonun jel matrikslerine böyle

kovalent olarak bağlanmış lipozomlarla çeşitli ilâç türlerinin veya plazmidler arasında

kompleks oluşumunun stabilite, bağlanma afiniteleri ve daha sonra meydana gelen

konfmasyon değişikliklerinin ortaya çıkarılmasında çok daha kolay

kullanılabilecekleri gibi lipozomlarla bağ yapan, reaksyona giren ve bileşkler

oluşturan birçok biyolojik ve farmakolojik özellikleri olan etkin makromoleküllerin de

yapılarının aydınlatılması kolaylaşacaktır. Kanımızca, böyle tasarlanmış sistemler

önemli biyospesifik tanıma olaylarında kantitativ analizleri mümkün kılacaktır ve

daha sonra diğer parametreler dışında, önemleri bu projemde de vurgulandığı gibi,

özellikle ortam sıcaklığı, pH, pI ve tampon içeriğine bağlı olarak membrana-bağlı

ilâçların nasıl değişime uğradıklarını ve bunun nasıl bir biyolojik önemi olduğunu

açıklayacaktır. Bu şekilde elde edilen verilerle biyomembran üzerinden hücre

sitozolüne geçiş yapan çeşitli ilâçları ve tedavi amaçlı sentezlenen farmasötik

formülasyon bileşenlerinin farklı boyut ve lipid türüne sahip hücre membranlarla

247

kompleks oluşumunun diğer önemli parametrelerini ve özellikle biyolojik neticeleri

olan membran akışkanlığı ve bu bağlamda patolojik durumların ortaya çıkması ile

ilgili konular aydınlatılacaktır.

Bu şekilde kolayca modifiye edilen lipozomlar, sıvı fazı olan ve stasyoner fazı

teşkil eden biyomakromoleküllerin spesifik olarak ayrıştırılması için bir model

oluşturan lipozomun iç hacmini içeren kısım ile bir çeşit sıvı çift fazlı sistem olarak

algılanmaktadır. Böylece, imobilize lipozom kromatografisi sıvı-sıvı partition

kromatografisinin (liquid-liquid partition chromatography) bir çeşidi olarak

görülmektedir. Bu tasarımımızda, lipozomun sıvı iç hacmi ile dış sıvı fazı arasında

çeşitli moleküler ağırlığa sahip maddelere karşı yüksek geçiş özelliklerine sahip olan

vezikül katmanı sayesinde bir faz farklılığı oluşmaktadır. Bu sistem, elektrostatik ve

hidrofobik bağ kuvvetlerini kullanarak konformasyonel değişiminin de meydana

geldiği veya tercihe göre getirilmediği durumlarda ilâçların imobilizasyonunda

kullanılabilmektedir. Projemde, bu bağlamda, bu çift fazlı sistem konformasyona

spesifik olarak veya tercihe göre olmayarak fosfolipidlerle nükleik asitler arasında

kompleks oluşumunun araştırılması konusu, Mg2+ veya diğer çift değerli katyonların

(Me2+) da varlığında ele alınmıştır. Lipidlerin faz değişimi ve faz geçiş sıcaklığının

üzerinde ve altındaki ısı değelerinde çalışarak, bu sistemin termostatik kontrolü de

mümkündür. Ayrıca, lipozom ve farmasötik bileşenlerinin bu yaklaşım sayesinde

değişime uğratılarak lipid membranlarının hidrofobik ve elektrostatik baş gruplarını

(membrane phospholipid head groups) yerel erişimi yükseltilir.

Lipid vezikülleri ile farklı ilâçlar arasında oluşan komplekste, bu gibi

konformasyon değişikliği parametreleri ayrıntılı olarak henüz daha araştırılmamıştır

ve hedefendirilmiş ilâç taşıyıcılarının yapı aydınlatılmasında kullanılmaları kanımca

çok ilginç olmalıdır. Bu bağlamda, söz konusu farmasötik formülasyonlarının yük

taşımayan (zwitterionic, nötr) fosfolipidlerin çeşitli katyonların varlığında membran

füzyonu meydana getirip getirmedikleri araştırılabilir. Böylece, bu şekilde kovalent

olarak kromatografik kolonun jel matriksine bağlanan lipozomların kendi

akışkanlıklarını ve yüzey tanıma özelliklierini de kontrol ettikleri fikri substrat olarak

ele alınan farklı boyut ve konformasyona sahip ilâçlar için de bu soyut varsayımlar ve

somut parametreler incelenebilecektir. Buradaki amaç, bu şekilde sterik olarak

248

stabilize edilen veziküllerin elektrostatik etkileşme kaabiliyetlerini kullanarak

lipozom yüzeyinde ilâç moleküllerinin adsorbsiyonunu gerçekleştirmektir.

Söz konusu lipid fazın içeriğini doğal hücre membranlarda bulunan bileşiklere

benzerlik gösterecek şekilde seçerek ve tampon içeriğini, pH, pI ve T°C gibi

fizikokimyasal parametreleri de bu doğal hücre ortamında ölçülen değerlerde tutarak,

çeşitli lipid’e-bağlı ilâç konformasyonları araştırılabilir. Bu şekilde kovalent olarak

imobilize edilmiş lipozomların stabiliteleri, çeşitli ilâç ve terapötik nükleik asitlerin111

membranlara bağlanma afiniteleri ve fosfolipidlere bağlı nükleik asitlerin

kompaktizasyon özellikleri incelenmektedir. Bu tasarımımız, çok katmanlı

(multilamellar vesicles, MLV) veya tek katmanlı (unilamellar vesicles, ULV)

lipozomların veya veziküllerin kromatografik kolon jel matriksine (chromatographic

gel beads) kovalent bağlama süretiyle enjektör, pompa ve UV-detektör ile donatılmış

yüksek performanslı sıvı kromatografisi (high perfomance liquid chromatography,

HPLC) ile söz konusu fizikokimyasal parametrelerinin incelenmesine dayanmaktadır.

Bu şekilde kovalent112 olarak stabilize edilmiş fosfolipid vezikülleri çok daha

akışkandır ve doğal hücre membranlarına çok daha iyi bir yaklaşım ve modeli teşkil

edip, ilâçların membran akışkanlığı üzerindeki etkilerini incelemek için çok daha

uygun bir sistemdir. Fosfolipidler, jel’e fosfatlarıyla fosfodiester bağ ve aktiv grubun

karbonat kısmıyla nükleofilik fosfat katalizi ile bağlanmaktadır. Biyomembran

ortamına yaklaştığı için imobilize edilmiş veziküllerde heterojen lipid katmanın elde

edilmesi tercih sebebidir. Bu tasarımda, tek lipid veya birkaç lipid karışımının

kullanıldığında genelde elektrostatik ve hidrofobik etkileşmeler meydana

gelmektedir. Böylece, bu tasarım sayesinde membran-ilâç arasında oluşan

kompleksin oluşma kinetiğini de incelemek mümkündür. Ayrıca, bu tasarım, serbest

iyonların ve membrana bağlı olarak işlev yapan çeşitli yüklü deterjanların nükleik asit

kondanzasyonu ve kompaktizasyonu gerçekleştiren ajanlar olarak lipid’e bağlı gen

taşıyıcı tasarımlarda da, fizikokimyasal özellikleri iyileştirilmiş moleküller olarak

111 Günümüzde birçok uluslararası bilimsel terminolojide olduğu gibi, bu projemizde de ilâç ile terapötik nükleik asit kavramları eş anlamlı olarak kullanılmaktadır. 112 Kovalent bağlanma adı altında burada sadece kromatografik jel matriksine lipozomların bağlanması kastedilmektedir. Bu yöntem ile ilgili çok sayıda protokol ve tasarım vardır. Projemizde ise yenilik olarak bu tasarıma dayanarak kovalent olarak imobilize edilmiş lipozomal stasyoner faza bir de elektrostatik veya hafif kuvvetler veya hidrofobik etkileşmeleri kullanarak çeşitli katyonlar varlığında ilgili ligandları (ilâç, nükleik asit, protein vs.) bağlayarak elüasyonlarını sağlayarak spesifik olarak bu makromolekülleri saflaştırılması yer almaktadır.

249

diziliş ve konformasyon’a bağlı nükleik asitlerin saflaştırmasındaki yeri de

incelenebilmektedir.

Bu konu özellikle gen aktarımı öncesi yüksek miktarlarda saflaştırılması

gereken plazmid türleri için geçerlidir. Farmasötik formülasyonlarda kullanımları

için büyük ölçüde, miktarda ve saflıkta plazmid DNA’nın üretilmesi insan gen

tedavisi gibi birçok biyoteknolojik uygulamalar için esastır. Özellikle plazmid DNA

saflığı söz konusu olunca, plazmidleri daha yüksek bir dinamik bağlama kapasitesine

sahip ve iyileştirilmiş ve optimize edilmiş kromatografik kolon matrikslerinin

tasarımı çok büyük bir önem kazanır. Şu ana kadar saflştırma amacıyla uygulanmakta

olan poröz matrikslere bir alternativ olarak tasarımımızda geleneksel malzemelere

nazaran iyileştirilmiş hidrodinamik özelliklere sahip membran özellikli matrikslerin

uygulamaya yönelik hususlar vurgulamaktadır. Bu bağlamda, çeşitli nükleik asit

konformasyonları fizikokimyasal ve stereokimyasal olarak ayrıştırabilen kontrollü

DNA presipitasyonlarını gerçekleştirerek tasarımımızda tek ve çift zincirli DNA’ların

saflaştırmasına da yer verilmiştir. Böylece DNA işlevsel yüzeyin yaratılmasında ve

daha sonra bu lipozomal yüzeyinde nükleik asit imobilizasyonu için kullanılabilir.

Genomik ve plazmid DNA veya RNA arasındaki ayrışım kullanılan katyona bağlı

olarak farklı kompaktizasyon globülü meydana geleceğinden mümkün olmaktadır. Bu

tasarım, yine negativ yüklü DNA ile yüksüz (nötr) veya pozitiv yüklü lipidleri çift

valanslı katyonlar (Mg2+, Ca2+, vs.) aracılıyla bir araya getiren elektrostatik

etkileşmelerinin uygulanmasına dayanmaktadır. Diğer yandan, elektrostatik

kuvvetler dışında DNA-lipid oluşumu bazlarla matriksteki ligand-taşıyan gruplar

arasında hidrofobik etkileşmeler sayesinde de meydana gelidiğinden söz konusu

konformasyonlar arası ayrışım ters-fazlı sıvı kromatografisi (Reverse Phase Liquid

Chromatography, RPLC) ile de inclenebilinmektedir. Bu durumda, bağlı olan

polinükleotidler hidrofobik bir özellik olan yükselen hidrofobisiteye göre elüe

olmaktadırlar. Böylece, daha yüksek moleküler ağırlığa sahip nükleik asitler RPLC

kolonunda daha uzun bir süre kalacaklardır. Sonuç olarak, bu tasarım sayesinde tek

sarmallı DNA’yı plazmid DNA’dan ve çift sarmallı DNA’dan saflaştırmak mümkün

olur. Süpersarmallı plazmid DNAlar genelde gen nakli için en uygun malzeme

olduklarından kromatografik yaklaşımların en önemli amacı bu konformasyonu diğer

plazmid konformasyonlardan ayrıştırmak ve saflaştırmaktır.

250

Nükleotid bazlar kromatografik kolon bağlayıcıya (colon linker) şeker, baz

veya fosfat kısmındaki çeşitli pozisyonlarda bağlanmaktadır. Gen transkripsiyonu, ve

translasyounu, virüs-hücre etkileşmeleri, nükleositoplazmik transport ve hücre

bölünmesi gibi çok önemli hücresel olaylarda rol oynayan proteinlerin büyük bir

bölümü öncelikli olarak tek zincirli veya çift zincirli nükleik asit dizilişlerine

bağlanmayı tercih ederler. Bu olaylarda önemli rol oynayan makromoleküller

membrana-bağlı olarak işlev yapmaktadır. Böylece, bu olayların moleküler

mekanizmalarını ortaya çıkarmak, bu kilit moleküllerin saflaştırmasına bağlıdır. Bu

da yeni nükleotid dizilişi ve konformasyona spesifiklik gösteren kromatografik

nükleik asit saflaştırma tasarımlarını zorunlu kılar. Mekanizmaya özgü bir afinite

kromatografi tasarımını şematik olarak geliştirebilmek son derece önemlidir.

İmobilize afinite lipozom-ilaç ve lipozom-nükleik asit kromatografisi konusunda

çalışmalarım yoğun olarak devam etmektedir ve yeni bir araştırma projesi olarak

sunulacaktır.

251

4.7.2. Projenin Devamı Olarak Yapılması Öngörülen Ortak

Çalışmalar

Bu projemle ortaya çıkarılan Taxol®-membran fosfolipid etkileşmelerinden

yola çıkarak burada sunulan modelleri in vivo ortamda denemek. Amacım, bu şekilde

karakterize edilen antikanser ilâç-lipid bileşenlerinin fizikokimyasal parametrelerine

dayanarak bu kontrollü ilâç taşıyıcı tasarımını lipidler aracılıyla gerçekleştirilen in

vivo deneylerde denemek suretiyle iyi ve güvenilir bir model terapötik Taxol®

formülasyonu elde etmek. Bunun için uluslararası düzeyde ortak çalışmalara girmeyi

ümit etmekteyim. Ancak, in vitro ve in vivo ortamda söz konusu formülasyon

çalışmalara girmenin koşulu ilk önce bu formülasyonların fizikokimyasal

karakterizasyonudur ki bunu da projemiz yüzey kimyasal, kolloid ve biyofiziksel

yaklaşımlar kullanarak başarıldığını inanmaktayım. Bu ön verilere dayanarak bu

konuyu çok daha iddialı boyutlara taşımayı arzuluyorum. İleriye yönelik yurt dışı

ortaklarımızla yapmayı planladığımız deneyler kısaca şunlardır:

• Öncelikle, fakültemizde şu ana kadar atık sorunu tehlikesi yüzünden

radyoaktiv bileşenlerle çalışmaların mümkün olmadığından, sözü edilen lipozom-

hücre etkileşmelerinin radyoaktiv lipid markerleri kullanarak incelemeyi

planlamaktayım. Örneğin, lipozomları radyoaktiv [3H]kolesteril ester ve kolesteril

[14C]-oleat işaretleriyle çifte işaretleyerek lipozomların intraselüler akıbeti hakkında

çok önmeli bilgiler elde edilebilir. Radyoaktiv işaretleme yöntemine bir alternativ

olarak piyasada uzun yıllardan beri bulunan lipidlere spesifik floresan işaretler

kullanılabilinir. Ayrıca, lipozomların iç hacminde enkapsüle edilmiş şekilde bulunan

DNA’nın kompaktizasyonu konvansyonel floresan mikroskopisi ile veya konfokal

lazer taramalı mikroskopisi (confocal laser scanning microscopy) ile incelemek çok

önemli bilgiler vermektedir. Örneğin, lipozom lipidlere spesifik olan FM 4-64

uygulandığında bu biyomoleküllerin dinamiği hakkında bilgiler vermektedir

(SÜLEYMANOĞLU, 2002).

• Projemin bir sonraki aşaması hücre kültürlerinin kullanılması ile ilgilidir.

Ancak, bu konu ile ilgili uygulanacak olan protokol hücre türüne göre spesifiklik

252

gösterdiğinden, in situ olarak elde edilecek olan neticeleri çok dikkatlice

değerlendirilmeli, çünkü her hücre türü kendine özgü ilâç internalizasyon kinetiği

göstermektedir. Diğer yandan, hücre kültürlerinin kullanılmasının büyük avantajı bu

hücre kültürlerini piyasadan edinebilme kolaylığı ve yapılmakta olan deneylerin

kontrol edilebilme fırsatıdır. Örneğin, hücre kültürü düzeneğini kullanarak kan ve

kan bileşenlerinin (serum, plazma ve çeşitli proteinler) veya farklı reseptörlerin

lipozom-hücre etkileşmelerine etkilerini ortaya çıkarmayı planlamaktayım.

• Bu projemde, nötr fosfolipidlerlerin yanı sıra negativ yüklü fosfatidilserin-

veya fosfatidilgliserol içeren lipozomların çeşitli hücre kültürleri ve türleri ile yapılan

araştırmalarca farklı hücre-lipozom etkileşmelerinin ve özellikle bağlanma

afinitelerin söz konusu olduğu ortaya çıkarılmıştır. Bu yüzden bu projede yapılan tüm

ön fizikokimyasal ölçümlerini farklı yük taşıyan lipidleri kullanarak lipozom

bileşenlerinin bağlanma afiniteleri, intraselüler salınımları ve hücre içi akıbetlerini

incelemeyi hedefliyorum.

• In vitro protokoller ortam sıcaklığına göre son derece duyarlıdır ve anlamlı

deneylerin yapılabilmesi için ortam sıcaklığının optimize edilmesi gerekmektedir.

Örneğin, bazı hücre kültürleri 4°C en etkili ilâç internalizasyon oranı gösterirken

diğer hücre türleri 37°C’de en yüksek oran gösterirler. Bu bakımdan, in vitro

deneylerini farklı ortam sıcaklığında gerçekleştirerek termodinamik olarak en etkili

transfeksyon ortamını tespit etmeyi düşünmekteyim. Bu kısmen bu projemde de

sirkülatörlü su pompasının alınmasıyla yapılmıştır.

• Ortaklarımızla müşterek olarak yapmayı planladığım projemizin ileriye

dönük boyutlardan biri de elde edilen in vitro verilerini in vivo ortamda denemektir

ve böylece in vitro – in vivo korelasyonlarını incelemektir. Bunun için sıçan ve rat

modellerini kullanarak in vivo ortamda lipozomların klirıns hızı ile ilgili

farmakokinetik veriler elde edilebilinir. Bunun için bröşürü Ek-17’e verilen in vivo

imaging cihazlarının alımı da uygun görülmüştür.

• Bir sonraki aşama olarak, projenin gidişatına göre lipozomların kinetiğini ve

doku dağılımlarını ve intra-organ dağılımlarını radyoaktiv ve/veya floresan işaretleri

kullanarak araştırmayı hedefliyorum.

253

Bu uzun vadeli çalışmalara dahil edilebilmemiz için bir önkoşul olan söz

konusu bileşenlerinin fizikokimyasal karakterizasyonu doğrultusunda, ilâç-lipid

kompleks oluşumunun daha mütevazı ancak çok orijinal bir yaklaşım olan FTIR

spektroskopisi, termodinamik ve yüzey kimyasal ölçümleri kullanarak elde etmiş

bulunmaktayım. Bu ölçümlere dayanarak, daha uzun vadeli ve uluslararası boyutu

olan projelere katılmayı ümit ediyorum. Bu konuda daha önce çalıştığım çok iyi

laboratuvar donanımlı araştırma grupları ile temas edilmiş ve çok olumlu yanıtlar

alınmıştır∇. Böylece, projemin ara raporunda da bahsedildiği gibi çalışmalarımızın

nanoteknolojik boyutuna ulaşılmış olunacak ki, bu Avrupa Birliğinin 7ci Çerçeve

Programında proje öncelik sıralamasında ilk yerlerde bulunan bir konu olarak bize

uluslararası projelere de dahil edilmemizi sağlayacaktır ∏.

4.7.3. Öncü Hipotez

Projemde geliştirilen hipotez ile ilgili burada sadece genel bilgiler

verilmektedir. Bu hipotezin dayanaklarına burada geniş olarak yer verildiği takdirde

bu raporun hacmi çok fazla artacaktır. Ancak, buradaki kısa bilgiler bile bu hipotezin

iyi anlaşılmasına yeterli olacağı kanısındayım.

Bu projemde geliştirilen Taxol®-hücre membranı etkileşme modellerine

dayanarak bu ilâcın yeni etki mekanizmalarının ortaya çıkarılması hedeflenmiştir. Bu

bağlamdai bu antikanser ilâcın membran akışkanlığını düzenleyerek başka bir etki

mekanizmasının daha mümkün olabileceği öngörülmektedir. Bunun için, bu ilâcın

sitotoksisitesini wild-type ve multidrug resistant (MDR) hayvan hücrelerinde

inceleyerek önemli kemoduyarlılık mekanizmalarının ortaya çıkarabilme imkânlarına

bağlıdır. Bu bağlamda, hipotez modelini oluşturmak için önce literatürde bulunan

mevcut bulgulara dayanarak ve ileride bu tür düzeneklerin Fakültemizde de

kurulmasıyla bu tür modellerin geçerliliğini inceleme fırsatı bulunacaktır. Örneğin,

hipoteze göre, Taxol®’un P-glikoprotein (Şekil 4.28) üzerinden değil de, farklı bir

mekanizma ile kemoduyarlılık sitotosisitenin meydana gelmesinde rol oynamaktadır.

∇ Bu konu ile ilgili çok kapsamlı uluslararası projem Ek-16’da verilmiştir. ∏ Projemizin uluslararası boyutu ve bu konuda hedeflerimiz ve beklentilerimiz ile ilgili ayrıntılı gerekçelere ayrıca ara raporumuzda yer verilmişti.

254

Bu modeli test etmek için reserpine ve verapamil gibi birçok kemoduyarlılığı

meydana getiren molekül kullanılabilir. Eğer bunların uygulanması, P-gp

bulundurmayan karsinom hücrelerindeki Taxol®’un birikmesine yol açtıkları tespit

edilebilirse bu teklif edilen mekanizmanın bir kanıtı olarak sunulabilecektir. Çünkü

bu bulgular, kemoduyarlılık yolları üzerinden etki gösteren ve P-gp’inden bağmsız

olarak ortaya çıkan membran geçirgenliğinin artmasına ilişkin başka verilele de

desteklenecektir. Ancak, bunu ortaya çıkarmak çok iyi çalışılmış Taxol®-

biyomembran etkileme incelemelerine dayanmaktadır. Bunların bir başlangıç

nktasını bu proje ile başlamış bulunmkatayız. Bu projemde vurgulanan hususlar

doğrultusunda membran akışkanlığını arttıran bazı moleküller gibi kemoduyarlılığı

arttıran moleküller (chemosensitizers) de doza ve konsantrasyona bağlı olarak söz

konusu akışkanlığının artmasına neden olmaktadır. Bu olgu, örneğin DPH

polarizasyon gibi floresan spektroskopik yöntemlerle hem lipozomlarda hem d ewild-

type ve MDR hayvan ve insan hücre membranları üzerinde test edilebilir. Böylece, bu

tür chemosntitizer moleküllerin lipid katmanlatın geçirgenliğini arttırıcı etkileri ile

anti-kanser ilâçlar karşı başlattıkları sitotoksiste arasında önemli korelasyonlar

bulunmaktadır. Sonuç olarak, bu hipotezde chemosentisizerler aracılıyla

biyomembranların yapılarında akışkanlığın değişime uğraması ve geçirgenliklerinin

artması gibi olayların, bu tür hücrelerde Taxol®’un sitotoksisitesini ortaya

çıkmasında önemli rol oynayabildiklerini teklif edilmeltedir. Bu konuda yapılacak lan

ek incelemelerin yeni tedavi profillerinin de geliştirilmesine katkı sağalayacaktır

(Şekil 4.29).

255

Şekil 4.28. P-glikoprotein (P-gp) membran üzerinden hücre dışına ilâç

moleküllerini pompalayarak kemotedavilerinin etkinliğini önemli ölçüde

düşürmetedir.

256

Şekil 4.29. Antikanser ilâç-tümör hücre etkileşmeleri.

257

4.7.4. Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim

Fakültemizde göreve başladığım tarihten hemen sonra, 04.Şubat.2004 günü

bir Fakülte toplantısı düzenlenmiş, bu toplantıda o zamanki yönetim tarafından

tarafıma ve beraber çalıştığım diğer 2 uzman arkadaşıma mevcut laboratuvar

durumumuzun çok kötü olduğundan somut projeler üretmemiz konusunda talimatlar

verilmiştir. Ayrıca da, bu projelerde suiistimalleri engellemek amacıyla kesinlikle

öğretim üyelerinin yazılmaması gerektiği talimatı da tarafımıza verilmiştir. Bana

verilen bu talimatları aynen uygulayıp bu proje hazırlanmıştır. Fakültemizdeki tüm

kürsülerimize hizmet veren Merkez Laboratuvarın mevcut altyapısını güçlendirmek

amacıyla, cihaz alımı ile sonuçlanabilecek bir proje olmasına özen gösterilmiştir.

Cihaz seçiminde de son derece dikkatli davranılmıştır. Her kürsünün istifade

edebileceği bir cihaz projesi hazırlanmıştır. Bu benim Türkiye’de ilk projem

olduğundan daha kısa süreli bir proje olarak hazırlanıp, bu projede elde edilen

bulgulara dayanarak çok daha kapsamlı, uzun vadeli, yüksek bütçeli ve uluslararası

katılımlı bir proje daha hazırlanmıştır (Bk.: Ek-16). Bunun için tarafıma yurt içinden

ve yurt dışından yapılan ortak çalışma başvurularını da (Bk.: Ek-15) değerlendirip

ulusal ve uluslararası proje sponsorlarına başvurulması uygun görülmekteyim. Ancak

bu şekilde, uzun vadeli bir proje desteği ile şu andaki durum (Bk.: Ek-1 ve Ek-2)

iyileştirilebilecektir. Bu doğrultuda, bu projemle alınan Langmuir-Blodgett cihazına

eklenebilecek bazı cihazların alımı ile bu çalışmalarımın niteliği yükseltilebilecektir.

Bu bağlamda, daha 2 sene önce bu cihaza eklemek üzere yine yüzey analizlerde yoğun

olarak kullanılan Atomik Kuvvet Mikroskopu (Atomic Force Microscopy-AFM) veya

yüzeylerde faz değişimlerinin araştırılmasında kullanılan Brewster Angle Microscopy

(BAM) sistemlerinin alınması ile ilgili projeler hazırladım. Ancak, söz konusu

mikroskopi sistemleri temiz bir ortama bağlı olarak çalıştırılmaktadır. Oysa

Fakültemizde henüz daha temiz (tozsuz) bir odamız yoktur. Bu yüzden bu projelerimi

böyle bir odanın yapımından sonrası için ertelenmiştir. O zamana kadar Fakültemize

daha faydalı olabilecek ve çok orijinal alternativler üzerinde çalıştım ve bundan böyle

geliştirmek istediğim laboratuvar donanımını şöyle sıralamaktayım. Tüm ilgili

bröşürler sırasıyla E-17’de verilmiştir.

İlk önce, bu projemle alınan Langmuir-Blodgett sistemine ek olarak bir Dip

Coaters parçalarının alınması uygun olur. Söz konusu parçalar, çalışılan düzenek

258

çözeltilerine son derece hassas olarak substratların uygulanmasını sağlamaktadır.

Böyle bir ek sistemin monte edilmesi çalışmalarımızdaki hassasiyeti arttıracaktır.

Çalışmalarımıza termodinamik boyut kazandırmak amacıyla termal analiz

cihazlarının getirilmesi için gereken girişimlerde bulunulmuştur. Bu doğrultuda bir

Isothermal Titration Calorimeter cihazın alınması için başka bir proje

hazırlanacaktır. Söz konusu cihaz şu ana kadar kullandığım Differential Scanning

Calorimetry cihazlarından çok önemli üstünlüğü vardır. Örneğin, Isotehrmal

Titration Calorimetry ile ligand bağlama kinetiği ölçülmektedir ve bu çok önemli

bilgiler vermektedir.

Bir sonraki proje hedefim bir Confocal Fluorescence Microscopy

sistemidir. Söz konusu mikroskopi sistemi, bu proje ile alınan Langmuir-Blodgett tek

katman sistemine inverted versiyonu olarak eklenebilmektedir. Bu sisteme ayrıca

da Epifluorescence Microscopy sistemi de eklenebilmektedir. Bu

mikroskopilerin eklenmesi model tek katman membran çalışmalarında son derece

önemli bilgiler verecektir, çünkü bu sistemler uygun floresan işaretlerin yardımıyla

doğrudan fosfolipid akışkanlığının incelenmesini mümkün kılacaktır. Bunun bilimsel

gerekçeleri de şöyle sıralanabilir. Daha 1960lı yıllarda Almanya’da Ruska’nın

keşfettiği elektron mikroskopisi hücre biyolojisinde çok önemli rol oynamıştır.

Örneğin, virüs ve fajların bakteri yüzeyindeki yapılarını incelenmesini mümkün

kılmıştır ve birçok intraselüler organellin yapısını aydınlatmıştır. Ultrasantrifüjün

kullanıma girmesiyle bu mikroskopi yöntemi moleküler hücre biyolojisinin ve

biyokimyanın gelişmesine olağanüstü bir katkıda bulunmuştur. Ancak daha sonraları

araştırıcılar tarafından bazı uygulamaları kuşku uyandırmıştır. Örneğin, bu

mikroskopi sisteminde kullanılan sert muameleler (-94°C ortamı ve OsO4 ile

fiksaksiyon işlemleri) birçok biyolojik molekülleri olumsuz etkilemektedir. Çünkü

doğada böyle ortamlar zaten yoktur. Her nekadar elektron mikroskopisinin TEM

(Transmission Electron Microscopy) versiyonu özellikle boyut analizi için günümüzde

de kullanılıyorsa da, bu mikroskopilerle elde edilen görüntüler bu sebeplerden dolayı

artefakttır (yapaydır). Buna karşılık, floresan mikroskopisinin çok önemli üstünlüğü

bulunmaktadır. Örneğin, Gren Fluorescence Protein (GFP)-plazmidlerle klonlanan ve

hücresel ekspresyonu gerçekleştirilen bir proteinin söz konusu hücreyi hiç

öldürmeden hücre kültürü ortamında protein dinamiğini live cell imaging olarak

259

görüntülemek mümkündür. Anlaşılacağı üzere yaşayan hücrelerle çalışmak çok

önemlidir. Ayrıca da, BODIPY türü gibi lipid floresan işaretler kullanarak fosfolipid

veziküllerin (lipozomların) (Bk.: Ek-9) şeklini ve akışkanlığını incelemek mümkün

olmaktadır. Şimdiye kadar adı geçen cihazlar Langmuir-Blodgett tek katman

sistemine doğrudan eklenebilinmektedir. Bu sistem ile elde edilen veriler ve

geliştirilen modeller daha sonra in vivo ortamda uygulanabilmelidir ve geçerlilikleri

ispat edilmelidir.

Bu bakımdan, Fakültemizde bir hücre kültürü düzeneğinin kurumasından

sonraki proje amacım Raman Mikroskopi sisteminin getirilmesi. Bunu da, uzun

vadeli proje desteği ve Avrupa’daki eski hocalarımın da projelere katılımıyla bir İlâç-

Hücre Etkileşmeleri konulu uluslararası proje kapsamında getirilmesini uygun

görmekteyim, çünkü böyle bir sistem 220 000 Avro’luk bir desteği de gerektirecektir.

Ancak bu pahalı sistemin çok önemli avantajları vardır. Örneğin, her ne kadar

floresan mikroskopisi yaşayan hücredeki yapıları görüntülüyor olsa da bu yöntemde

ortaya çıkan “photobleaching” olayı tek başına hücreleri öldürebilmektedir. Bu

yüzden, bir yapı görüntülenir görüntülenmez hemen başka bir bölgeye mikroskopi

okularının yönlendirilmesi gerekmektedir. Dolayısıyla da deneyimli personele ihtiyaç

vardır. Kanımca, buna alternativ olarak böyle bir sorunu olmayan Raman

Mikroskopisi teklif edilmelidir.

Buraya kadar adı geçen cihazların her biriyle ilgili uluslararası tecrübem

bulunmaktadır ve herhangi bir eğitim için zaman kaybedilmeyecektir (Ek-18). Ancak,

tüm bu projelerin başarıyla tamamlanması Fakültemizdeki statümün özerkliğine ve

suiistimallerin engellenebilmesine bağlıdır. Herkesin projelere müdahale ettiği ve

suiistimal etmeye çalıştığı bir noktada zaten Avrupa’daki ortaklarımın bunlara

katkıda bulunmaları söz konusu olamaz.

260

5. SONUÇ

Bu projemde, kemoterapilrde yoğun olarak kullanılan Taxol®’un (Paclitaxel’in)

model olarak uygulanan fosfolipid yapılarıyla etkileşmeleri moleküler düzeyde

incelenmiştir. Yüzeyin fizikokimyasal karakterizasyonu ve farklı ilâç-lipid

bileşimlerinin yapı ve termodinamik özelliklerinin aydınlatılması için Langmuir-

Blodgett tek katman, Fourier Transfrom Infrared (FTIR) Spektroskopi ve

Diferansiyel Taramalı Kalorimetrik ölçümlerinde yararlanılmıştır. Örneğin

hazırlanmasının, lipid türünün, ilâç konsantrasyonunun gözlemlenen bu özellikler

üzerinde belirleyici etkileri vardır. Fosfatidilkolin tarafından Taxol®’un tanınması,

lipid baş gruplarınca yüzeyin tanınması, başlangıç, değişim öncesi ve ana faz değişim

dereceleri ve açil zincir gruplaşması gibi sonuçlara yol açarak model membran

yüzeylerinin fiziksel parametreleri üzerinde sıvılaştırıcı ve akışkanlığı arttırıcı etkileri

olduğu ortaya çıkarılmıştır.

Projemdeki vurgu Taxol®’un model hücre membranlar üzerindeki etkileri

hakkında yoğunlaşmış olmasına rağmen, tümör tedavisi denemelerinde hayati önem

taşıyan ilâcın etki mekanizmasındaki biyofiziksel olguların anlaşmasına katkı

sağlayabilecek sonuçlar elde edildiğini ümit etmekteyim. Bu iki yaklaşımın doğasına

uygun olarak kullanılan deneysel tasarıma uygun düşen bir öncü hipotez ve öneriler

de ayrıca tanımlanmıştır.

Projemi de önceden öngörülen zaman içerisinde gecikme yaşanmaksızın

tamamlamış bulunmaktayım. Benden kaynaklanan herhangi bir gecikme söz konusu

değildir. Tüm eksikliklere ve özellikle de temiz (tozsuz) ortamın olmamasına rağmen,

projemin başarıyla tamamlanmış olması da buaradaki neticelerin, bu raporumda yer

verdiğim ve daha önce böyle tozsuz ortamda yapmış olduğum ölçümlerle

kıyaslamalarından da görülmektedir. Sonuç olarak, yapılması son derece zor olan

ölçümler tamamlanmış olup, yeni bir düzenek Fakültemize başarıyla kurulmuştur ve

sadece Fakültemizde değil, Ankara’da bulunan diğer araştırmacılara da hizmet

vermek üzere hazır tutulmaktadır.

261

Ekler Listesi

Ek-1: Öğretim Elemanı Başına Düşen Makale Sayısına Göre Üniversite Sıralamasındaki Üniversitemizin Yeri Ek-2: Bologna Süreci Durum Değerlendirme Raporu, 2005-2007 Ek-3: Tübitak Avrupa Birliği 7. Çerçeve Programı: Nanobilimler, Nanoteknolojiler, Malzemeler ve Yeni Üretim Teknolojileri Ek-4: Gazi Üniversitesinde Nanotıp Üssünün Kurulması ile ilgili Karar Ek-5: Taxol® (Paclitaxel) ile ilgili Güncel Referanslar Ek-6: Gen Aktarımı ile ilgili Güncel Referanslar Ek-7 Taxol® (Paclitaxel’in) Fizikokimyasal Özellikleri Ek-8 Taxol®’un Sentezi Ek-9 Lipozom Hazırlama Yöntemleri Ek-10 Tek Katmanlı Lipozomların Hacmi, Çapı, Sayıları, Alanları ve Lipid Ağırlığı Arasındaki İlişkiyi Gösteren Bir Nomogram Ek-11 NIMA Technology Ltd.’in ürettiği Langmuir-Blodgett cihazları Ek-12 Langmuir-Blodgett Tek Katman Cihazın Teknik Özellikleri

Ek-13 Langmuir-Blodgett Yüzey Kimyasal ve Kolloid Düzeneklerin Teorisi

Ek-14 Kemoterapilerde Kullanılmakta Olan Diğer Güncel Anti-Kanser İlâçlar

Ek-15 Tarafıma Yurt İçinden Ve Yurtdışından Gelen Ortak Çalışma Başvuruları

Ek-16 Avrupa Birliği Destekli Proje Çerçevesine Hazırladığım Çok Katılımlı

Uluslararası Ve Uzun Vadeli Proje

Ek-17 Fakültemizde Bundan Sonraki Proje Hedeflerim

Ek-18 Projemle İlgili Tüm Evraklar ve Faturalar

Ek-19 Özgeçmiş

262

Ek-5: Taxol® (Paclitaxel) İLE İLGİLİ GÜNCEL REFERANSLAR

Abernethy DR. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of amlodipine.

Cardiology. 1992;80 Suppl 1:31-6.

263

Adv Cancer Res. 2007;98:149-90 ve Song RX. Membrane-initiated steroid

signaling action of estrogen and breast cancer. Semin Reprod Med. 2007

May;25(3):187-97.

Advances in Molecular Oncology (Advances in Experimental Medicine and

Biology) (Advances in Experimental Medicine and Biology), by Fabrizio d'Adda di

Fagagna (Editor), Susanna Chiocca (Editor), Fraser McBlane (Editor), Ugo Cavallaro

(Editor); Springer; 1 edition (July 12, 2007).

AMA Council Report. Guidelines for Handling Parenteral Antineoplastics. J.

Amer. Med. Assoc. 1985; 253 (11): 1590-1592.

American Society of Hospital Pharmacists Technical Assistance Bulletin on

Handling Cytotoxic and Hazardous Drugs. Am J Hosp Pharm 1990; 47:1033-1049.

Aster RH. Drug-induced immune thrombocytopenia: an overview of

pathogenesis.

Barbato F, di Martino G, Grumetto L, La Rotonda MI. Prediction of drug-

membrane interactions by IAM-HPLC: effects of different phospholipid stationary

phases on the partition of bases. Eur J Pharm Sci. 2004 Jul;22(4):261-9.

Baritaki S, Apostolakis S, Kanellou P, Dimanche-Boitrel MT, Spandidos DA,

Bonavida B. Reversal of tumor resistance to apoptotic stimuli by alteration of

membrane fluidity: therapeutic implications.

Benie AJ, Blume A, Schmidt RR, Reutter W, Hinderlich S, Peters T.

Characterization of ligand binding to the bifunctional key enzyme in the sialic acid

biosynthesis by NMR: II. Investigation of the ManNAc kinase functionality. J Biol

Chem. 2004 Dec 31;279(53):55722-7.

Berquand A, Fa N, Dufrene YF, Mingeot-Leclercq MP. Interaction of the

macrolide antibiotic azithromycin with lipid bilayers: effect on membrane

organization, fluidity, and permeability. Pharm Res. 2005 Mar;22(3):465-75.

264

Berquand A, Mingeot-Leclercq MP, Dufrene YF. Real-time imaging of drug-

membrane interactions by atomic force microscopy. Biochim Biophys Acta. 2004

Aug 30;1664(2):198-205.

Bhatti M, Yahioglu G, Milgrom LR, Garcia-Maya M, Chester KA, Deonarain MP.

Targeted photodynamic therapy with multiply-loaded recombinant antibody

fragments. Int J Cancer. 2007 Oct 31.

Bianco R, Damiano V, Gelardi T, Daniele G, Ciardiello F, Tortora G. Rational

combination of targeted therapies as a strategy to overcome the mechanisms of

resistance to inhibitors of EGFR signaling. Curr Pharm Des. 2007;13(33):3358-67.

Biochem Pharmacol. 1999 Mar 1;57(5):503-10.

Biochim Biophys Acta. 2000 Nov 23;1508(1-2):210-34.

Bordi F, Cametti C, Motta A, Diociaiuti M, Molinari A. Interactions of

anthracyclines with zwitterionic phospholipid monolayers at the air-water interface.

Bioelectrochem Bioenerg. 1999 Oct;49(1):51-6.

Byrnes RW, Antholine WE, Petering DH. Interactions of 1,10-phenanthroline and

its copper complex with Ehrlich cells. Free Radic Biol Med. 1992;12(6):457-69.

Calcagnile O, Gisselsson D. Telomere dysfunction and telomerase activation in

cancer--a pathological paradox? Cytogenet Genome Res. 2007;118(2-4):270-6.

Caldwell GW, Masucci JA, Evangelisto M, White R. Evaluation of the immobilized

artificial membrane phosphatidylcholine. Drug discovery column for high-

performance liquid chromatographic screening of drug-membrane interactions.

Capobianco JO, Zakula D, Frost DJ, Goldman RC, Li L, Klein LL, Lartey PA.

Cellular accumulation, localization, and activity of a synthetic cyclopeptamine in

fungi. Antimicrob Agents Chemother. 1998 Feb; 42(2): 389-93.

265

Carrozzino JM, Khaledi MG. Interaction of basic drugs with lipid bilayers using

liposome electrokinetic chromatography. Pharm Res. 2004 Dec;21(12):2327-35.

Castaing M, Loiseau A, Dani M. Designing multidrug-resistance modulators

circumventing the reverse pH gradient in tumours. J Pharm Pharmacol. 2001

Jul;53(7):1021-8.

Castaing M, Loiseau A, Dani M. Thermal dependence of multidrug-resistant-

modulator efficiency: a study in anionic liposomes. J Pharm Pharmacol. 2000

Oct;52(10):1171-8.

Castaing M, Loiseau A, Djoudi L. Effects of cholesterol on dye leakage induced by

multidrug-resistance modulators from anionic liposomes. Eur J Pharm Sci. 2003

Jan;18(1):81-8.

Castaing M, Loiseau A, Mulliert G. Interactions between verapamil and neutral

and acidic liposomes: effects of the ionic strength. Biochim Biophys Acta. 2003 Apr

1;1611(1-2):107-14.

Castaing M, Loiseau A, Mulliert G. Multidrug resistance modulator interactions

with neutral and anionic liposomes: membrane binding affinity and membrane

perturbing activity. J Pharm Pharmacol. 2005 May;57(5):547-54.

Cauchetier E, Loiseau PM, Lehman J, Rivollet D, Fleury J, Astier A, Deniau M,

Paul M. Characterisation of atovaquone resistance in Leishmania infantum

promastigotes.

Cereijido M, Contreras RG, Flores-Benítez D, Flores-Maldonado C, Larre I, Ruiz

A, Shoshani L. New diseases derived or associated with the tight junction. Arch Med

Res. 2007 Jul;38(5):465-78.

266

Chakraborty H, Banerjee R, Sarkar M. Incorporation of NSAIDs in micelles:

implication of structural switchover in drug-membrane interaction. Biophys Chem.

2003 May 1;104(1):315-25.

Charras GT, Coughlin M, Mitchison TJ, Mahadevan L. Life and Times of a Cellular

Bleb. Biophys J. 2007 Oct 5.

Chen WM, Zhang PL, Wu B, Zheng QT. Studies on the chemical constituents of

Taxus yunnanensis. Yao Hsueh Hsueh Pao 1991;26(10):747-54.

Chen YJ, Chen CY, Shen YC, New taxoids from the seeds of taxus chinensis. J Nat

Prod 1999 Jan;62(1):149-51.

Cheung AL, Deng W. Telomere dysfunction, genome instability and cancer. Front

Biosci. 2008 Jan 1;13:2075-90.

Chidgey M, Dawson C. Desmosomes: a role in cancer? Br J Cancer. 2007 Jun

18;96(12):1783-7.

Chiquero MJ, Perez-Victoria JM, O'Valle F, Gonzalez-Ros JM, del Moral RG,

Ferragut JA, Castanys S, Gamarro F. Altered drug membrane permeability in a

multidrug-resistant Leishmania tropica line. Biochem Pharmacol. 1998 Jan

15;55(2):131-9.

Clinical Oncological Society of Australia. Guidelines and Recommendations for

Safe Handling of Antineoplastic Agents. Med J Australia 1983; 1:426-428.

Deo N, Somasundaran T, Somasundaran P. Solution properties of amitriptyline

and its partitioning into lipid bilayers. Colloids Surf B Biointerfaces. 2004 Apr

1;34(3):155-9.

Dingemans AM, Pinedo HM, Giaccone G. Clinical resistance to topoisomerase-

targeted drugs. Biochim Biophys Acta. 1998 Oct 1;1400(1-3):275-88.

267

Dittmer DP, Krown SE. Targeted therapy for Kaposi's sarcoma and Kaposi's

sarcoma-associated herpesvirus. Curr Opin Oncol. 2007 Sep;19(5):452-7.

Dubielecka PM, Trusz A, Diakowski W, Grzybek M, Chorzalska A, Jazwiec B,

Lisowski M, Jezierski A, Sikorski AF. Mitoxantrone changes spectrin-

aminophospholipid interactions. Mol Membr Biol. 2006 May-Jun;23(3):235-43.

F. Cavalli H. H. Hauser ve S. B. Kaye (Eds.): Textbook of Medical Oncology,

Taylor and Francis, New York, 2004.

Fa N, Ronkart S, Schanck A, Deleu M, Gaigneaux A, Goormaghtigh E, Mingeot-

Leclercq MP. Effect of the antibiotic azithromycin on thermotropic behavior of DOPC

or DPPC bilayers. Chem Phys Lipids. 2006 Oct;144(1):108-16.

Fan J, Tang g, Shu G, Xu X, On the conservation and regeneration of Taxus

resources. Chung Kuo Chung Yao Tsa Chih. 1996 Jul;21(7):389-91, 446.

Fardel O, Payen L, Sparfel L, Vernhet L, Lecureur V. Drug membrane transporters

in the liver: regulation of their expression and activity. Ann Pharm Fr. 2002

Nov;60(6):380-5.

Ferte J. Analysis of the tangled relationships between P-glycoprotein-mediated

multidrug resistance and the lipid phase of the cell membrane. Eur J Biochem. 2000

Jan;267(2):277-94.

Fox CB, Horton RA, Harris JM. Detection of drug-membrane interactions in

individual phospholipid vesicles by confocal Raman microscopy. Anal Chem. 2006

Jul 15;78(14):4918-24.

Fresta M, Furneri PM, Mezzasalma E, Nicolosi VM, Puglisi G. Correlation of

trimethoprim and brodimoprim physicochemical and lipid membrane interaction

properties with their accumulation in human neutrophils. Antimicrob Agents

Chemother. 1996 Dec;40(12):2865-73.

268

Fresta M, Panico AM, Bucolo C, Giannavola C, Puglisi G. Characterization and in-

vivo ocular absorption of liposome-encapsulated acyclovir. J Pharm Pharmacol. 1999

May;51(5):565-76.

Fukushima M, Takeda J, Fukamiya N, Okano M, Tagahara K, Zhang SX, Zhang

DC, Lee KH. A new taxoid, 19-acetoxytaxagifine, from Taxus chinensis. J Nat Prod

1999 Jan;62(1):140-2.

Gallois L, Fiallo M, Garnier-Suillerot A. Comparison of the interaction of

doxorubicin, daunorubicin, idarubicin and idarubicinol with large unilamellar

vesicles. Circular dichroism study. Biochim Biophys Acta. 1998 Mar 6;1370(1):31-40.

Garman KS, Nevins JR, Potti A. Genomic strategies for personalized cancer

therapy. Hum Mol Genet. 2007 Oct 15;16 Spec No. 2:R226-32.

Gasparini P, Sozzi G, Pierotti MA. The role of chromosomal alterations in human

cancer development. J Cell Biochem. 2007 Oct 1;102(2):320-31.

Goldenberg DM. "Targeted therapy with monoclonal antibodies: the new

generation of pharmaceuticals". Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2006; 21-2.

Hamill OP, McBride DW Jr. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity:

a limitation of patch-clamp recording. Annu Rev Physiol. 1997;59:621-31.

Hendrix MJ. A morphological characterization of melanoma tumor cell

interaction with a basement membrane model in the absence and presence of an

anticancer agent. Scan Electron Microsc. 1984; (Pt 4): 1973-82.

Hideshima T, Anderson KC. Preclinical studies of novel targeted therapies.

Hematol Oncol Clin North Am. 2007 Dec;21(6):1071-91.

Howard R. Petty, Molecular Biology of Membranes-Structure and Function,

Plenum Press, New York and London, 1993, pp. 353-377.

269

Int J Parasitol. 2002 Jul;32(8):1043-51.

J Chromatogr A. 1998 Mar 27;800(2):161-9.

J Chromatogr A. 2001 Apr 13;913(1-2):123-31.

J Pharm Sci. 1998 Aug;87(8):960-6.

Johansson E, Engvall C, Arfvidsson M, Lundahl P, Edwards K. Development and

initial evaluation of PEG-stabilized bilayer disks as novel model membranes. Biophys

Chem. 2005 Feb 1;113(2):183-92.

Jones RB, et al: Safe Handling of Chemotherapeutic Agents: A Report from the

Mount Sinai Medical Center. Ca-A Cancer Journal for Clinicians 1983; (Sept/Oct)

258-263.

Korfel A, Thiel E. Targeted therapy and blood-brain barrier. Recent Results

Cancer Res. 2007;176:123-33.

Kozin SV, Gerweck LE. Related. Cytotoxicity of weak electrolytes after the

adaptation of cells to low pH: role of the transmembrane pH gradient. Br J Cancer.

1998 May; 77 (10): 1580-5.

Larsen AK, Lametsch R, Elce JS, Larsen JK, Thomsen B, Larsen MR, Lawson MA,

Greer PA, Ertbjerg P. Genetic disruption of calpain correlates with loss of membrane

blebbing and differential expression of RhoGDI-1, cofilin and tropomyosin. Biochem

J. 2007 Dec 12.

Li Y, Liu J, Pan D, Hopfinger AJ. A study of the relationship between cornea

permeability and eye irritation using membrane-interaction QSAR analysis. Toxicol

Sci. 2005 Dec;88(2):434-46.

270

Liang J, Kingston DG. Two new taxane diterpenoids from Taxus mairei. J Nat

Prod 1993 Apr;56(4):594-9.

Liang JY, Min ZD, Iinuma M, Tanaka T, Mizuno M, Two new antineoplastic

diterpenes from Taxus mairei. Chem Pharm Bull (Tokyo) 1987 Jun;35(6):2613-4.

Liang Y, Liu LR, Zhang QQ. Structure and degradation property of the PVA-

collagen complex drug membrane. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2004

Feb;26(1):18-23.

Liu H, Carter GT, Tischler M. Immobilized artificial membrane chromatography

with mass spectrometric detection: a rapid method for screening drug-membrane

interactions. Rapid Commun Mass Spectrom. 2001;15(17):1533-8.

Liu XY, Nakamura C, Yang Q, Kamo N, Miyake J. Immobilized liposome

chromatography to study drug-membrane interactions. Correlation with drug

absorption in humans. J Chromatogr A. 2002 Jun 28;961(1):113-8.

Liu XY, Yang Q, Kamo N, Miyake J. Effect of liposome type and membrane

fluidity on drug-membrane partitioning analyzed by immobilized liposome

chromatography.

Lundquist A, Engvall C, Boija E, Kurtovic S, Chattopadhyaya J, Hagglund CL,

Lundahl P. Interactions of drugs and an oligonucleotide with charged membranes

analyzed by immobilized liposome chromatography. Biomed Chromatogr. 2006

Jan;20(1):83-7.

Luxo C, Jurado AS, Custodio JB, Madeira VM. Toxic effects of tamoxifen on the

growth and respiratory activity of Bacillus stearothermophilus. Toxicol In Vitro. 2001

Aug-Oct;15(4-5):303-5.

Ma DW. Lipid mediators in membrane rafts are important determinants of

human health and disease. Appl Physiol Nutr Metab. 2007, Jun;32(3):341-50.

271

Ma JY, Barger MW, Ma JK, Castranova V. Inhibition of respiratory burst activity

in alveolar macrophages by bisbenzylisoquinoline alkaloids: characterization of drug-

cell interaction. Exp Lung Res. 1992 Nov-Dec;18(6):829-43.

Ma W, Stahlhut RW, Adams TL, Park GL, Evans WA, Blumenthal SG, Gomez GA,

Nieder MH, Hylands PJ. Yunnanxane and its homologous esters from cell cultures of

Taxus chinensis var. mairei. J Nat Prod 1994 Sep;57(9):1320-4.

Majd S, Mayer M. Hydrogel stamping of arrays of supported lipid bilayers with

various lipid compositions for the screening of drug-membrane and protein-

membrane interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2005 Oct 21;44(41):6697-700.

Chakraborty H, Roy S, Sarkar M. Interaction of oxicam NSAIDs with DMPC

vesicles: differential partitioning of drugs. Chem Phys Lipids. 2005 Dec;138(1-2):20-

8.

Malheiros SV, Brito MA, Brites D, Meirelles NC. Membrane effects of

trifluoperazine, dibucaine and praziquantel on human erythrocytes. Chem Biol

Interact. 2000 May 1;126(2):79-95.

Mao JJ, Sun J, He ZG. Biopartitioning micellar chromatography: its application in

evaluating drug membrane transport and activity. Yao Xue Xue Bao. 2005

Oct;40(10):865-70.

Martínez MC, Kunzelmann C, Freyssinet JM. Plasma membrane remodelling and

cell stimulation. Med Sci (Paris). 2004 Feb;20(2):189-95.

Mavromoustakos T, Zoumpoulakis P, Kyrikou I, Zoga A, Siapi E, Zervou M,

Daliani I, Dimitriou D, Pitsas A, Kamoutsis C, Laggner P. Efforts to understand the

molecular basis of hypertension through drug:membrane interactions. Curr Top Med

Chem. 2004;4(4):445-59.

272

Meng QC, Johansson JS, Eckenhoff RG. Chromatographic approach for

determining the relative membrane permeability of drugs. J Chromatogr B Analyt

Technol Biomed Life Sci. 2002 Jul 5;774(1):89-95.

Middleton DA, Reid DG, Watts A. Combined quantitative and mechanistic study

of drug-membrane interactions using a novel 2H NMR approach. J Pharm Sci. 2004

Feb;93(2):507-14.

Min ZD, Jiang H, Liang JY. Studies on the taxane diterpenes of the heartwood

from Taxus mairei. Yao Hsueh Hsueh Pao 1989;24(9):673-7.

Molecular Biology of Cancer: Mechanisms, Targets, and Therapeutics,by Lauren

Pecorino, Oxford University Press, USA; 1 edition (May 21, 2005).

Montenez JP, Van Bambeke F, Piret J, Brasseur R, Tulkens PM, Mingeot-Leclercq

MP. Interactions of macrolide antibiotics (Erythromycin A, roxithromycin,

erythromycylamine [Dirithromycin], and azithromycin) with phospholipids:

computer-aided conformational analysis and studies on acellular and cell culture

models. Toxicol Appl Pharmacol. 1999 Apr 15;156(2):129-40.

National Study Commission on Cytotoxic Exposure - Recommendations for

Handling Cytotoxic Agents. Available from Louis P. Jeffrey, ScD, Chairman, National

Study Commission on Cytotoxic Exposure. Massachusetts College of Pharmacy and

Allied Health Sciences, 179 Longwood Avenue, Boston, Massachusetts, 02115.

Nusbaum P, Lainé C, Seveau S, Lesavre P, Halbwachs-Mecarelli L. Early

membrane events in polymorphonuclear cell (PMN) apoptosis: membrane blebbing

and vesicle release, CD43 and CD16 down-regulation and phosphatidylserine

externalization. Biochem Soc Trans. 2004 Jun;32(Pt3):477-9.

Oberdoerffer P, Sinclair DA. The role of nuclear architecture in genomic

instability and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Sep;8(9):692-702.

273

Ornskov E, Gottfries J, Erickson M, Folestad S. Experimental modelling of drug

membrane permeability by capillary electrophoresis using liposomes, micelles and

microemulsions. J Pharm Pharmacol. 2005 Apr;57(4):435-42.

OSHA Work-Practice Guidelines for Personnel Dealing with Cytotoxic

(Antineoplastic) Drugs. Am J Hosp Pharm 1986; 43:1193-1204.

Pajak B, Molnar J, Engi H, Orzechowski A. Preliminary studies on phenothiazine-

mediated reversal of multidrug resistance in mouse lymphoma and COLO 320 cells.

In Vivo. 2005 Nov-Dec;19(6):1101-4.

Pajeva I, Todorov DK, Seydel J. Membrane effects of the antitumor drugs

doxorubicin and thaliblastine: comparison to multidrug resistance modulators

verapamil and trans-flupentixol. Eur J Pharm Sci. 2004 Feb;21(2-3):243-50.

Paulussen JJ, Fischer MJ, Zuidam NJ, v Miltenburg JC, de Mol NJ, Janssen LH.

Influence of the antiallergic drug oxatomide and derivatives on membrane structures:

relation with inhibition of calcium influx in rat basophilic leukemia cells.

Porcar I, Codoner A, Gomez CM, Abad C, Campos A. Interaction of quinine with

model lipid membranes of different compositions. J Pharm Sci. 2003 Jan;92(1):45-

57.

Principles of Molecular Oncology, by Miguel H. Bronchud, MaryAnn Foote,

Giuseppe Giaccone, Olufunmilayo I. Olopade, Paul Workman (Editors), Humana

Press; 3rd ed. edition (November 30, 2007).

Rabow AA, Shoemaker RH, Sausville EA, Covell DG. Mining the National

Cancer Institute's tumor-screening database: identification of compounds with

similar cellular activities. J Med Chem. 2002 Feb 14; 45(4): 818-40.

Rakotomanga M, Saint-Pierre-Chazalet M, Loiseau PM. Alteration of fatty acid

and sterol metabolism in miltefosine-resistant Leishmania donovani promastigotes

274

and consequences for drug-membrane interactions. Antimicrob Agents Chemother.

2005 Jul;49(7):2677-86.

Recommendations for the Safe Handling of Parenteral Antineoplastic Drugs.

NIH Publication No. 83-2621. For sale by the Superintendent of Documents, US

Government Printing Office, Washington, DC 20402.

Robertson IG, Atwell GJ, Baguley BC. The relationship between lipophilic-

hydrophilic balance, uptake and anti-bacteriophage lambda activity of experimental

anti-tumour bisquaternary salts. Chem Biol Interact. 1988; 65(1): 85-95.

Rodrigues C, Gameiro P, Reis S, Lima JL, de Castro B. Derivative

spectrophotometry as a tool for the determination of drug partition coefficients in

water/dimyristoyl-L-alpha-phosphatidylglycerol (DMPG) liposomes. Biophys Chem.

2001 Dec 11;94(1-2):97-106.

Rodriguez-Casado A, Molina M, Carmona P. New accessory for studies of

isotopic 1H/2H exchange and biomolecular interactions using transmission infrared

spectroscopy. Anal Bioanal Chem. 2006 May; 385(1): 134-8.

Rojo F, Dalmases A, Corominas JM, Albanell J. Pharmacodynamics: biological

activity of targeted therapies in clinical trials. Clin Transl Oncol. 2007 Oct;9(10):634-

44.

Schop H, Wiese M, Cordes HP, Seydel JK. Partial resistance of E. coli mutants

against 2, 4-diamino-5-benzylpyrimidines by interactions with bacterial membrane

lipopolysaccharides. Derivation of quantitative structure-binding relationships.

Schreier S, Malheiros SV, de Paula E. Surface active drugs: self-association and

interaction with membranes and surfactants. Physicochemical and biological aspects.

Schultz H, Hume J, Zhang de S, Gioannini TL, Weiss JP. A novel role for the

bactericidal/permeability increasing protein in interactions of gram-negative

bacterial outer membrane blebs with dendritic cells. J Immunol. 2007 Aug

15;179(4):2477-84.

275

Semin Hematol. 1999 Jan;36(1 Suppl 1):2-6.

Shanghai Kou Qiang Yi Xue. 2004 Aug;13(4):252-5.

Sharma SV, Settleman J. Oncogene addiction: setting the stage for molecularly

targeted cancer therapy. Genes Dev. 2007 Dec 15;21(24):3214-31.

Sharp SY, O'Neill CF, Rogers P, Boxall FE, Kelland LR. Retention of activity by

the new generation platinum agent AMD0473 in four human tumour cell lines

possessing acquired resistance to oxaliplatin. Eur J Cancer. 2002 Nov;38(17):2309-

15.

Sheetz MP, Sable JE, Döbereiner HG. Continuous membrane-cytoskeleton

adhesion requires continuous accommodation to lipid and cytoskeleton dynamics.

Annu Rev Biophys Biomol Struct. 2006;35:417-34.

Shen YC, Chen CY, Kuo YH. A new taxane diterpenoid from Taxus mairei. J

Nat Prod 1998 Jun 26;61(6):838-40.

Shen YC, Chen CY. Taxane diterpenes from Taxus mairei. Planta Med 1997

Dec;63(6):569-70.

Shen YC, Tai HR, Chen CY. New taxane diterpenoids from the roots of Taxus

mairei. J Nat Prod 1996 Feb;59(2):173-6.

Shi QW, Oritani T, Sugiyama T, Yamada T. Isolation and structural

determination of a novel bicyclic taxane diterpene from needles of the Chinese yew,

Taxus mairei. Biosci Biotechnol Biochem 1999 Apr;63(4):756-9.

Shi QW, Oritani T, Sugiyama T. Kiyota H. Three novel bicyclic 3,8-secotaxane

diterpenoids from the needles of the chinese yew, taxus chinensis var. mairei. J Nat

Prod 1998 Nov;61(11):1437-40.

276

Shi QW, Oritani T, Sugiyama T. Three novel bicyclic taxane diterpenoids with

verticillene skeleton from the needles of Chinese yew, Taxus chinensis var. mairei.

Planta Med 1999 May;65(4):356-9.

Shi QW, Oritani T, Sugiyama T. Two bicyclic taxane diterpenoids from the

needles of taxus mairei. Phytochemistry 1999 Feb;50(4):633-6.

Skipper H. E. Historic milestones in cancer biology: a few that are important to

cancer treatment. Semin. Oncol., 1979, 6: 506-514.

Skrede S, Holmsen H. A role for antipsychotic agents in the membrane

hypothesis of schizophrenia? Tidsskr Nor Laegeforen. 2003 Sep 25;123(18):2568-70.

Srinivasan V, Ciddi V, Bringi V. Shuler ML, Metabolic inhibitors, elicitors, and

precursors as tools for probing yield limitation in taxane production by Taxus

chinensis cell cultures. Biotechnol Prog 1996 Jul-Aug;12(4):457-65.

Sugawara M, Takekuma Y, Yamada H, Kobayashi M, Iseki K, Miyazaki K. A

general approach for the prediction of the intestinal absorption of drugs: regression

analysis using the physicochemical properties and drug-membrane electrostatic

interaction.

Sun J, Zhang T, He Z. Immobilized artificial membrane chromatography and

its application in profiling the drug membrane transport. Se Pu. 2005 Jul;23(4):378-

83.

Targeted Molecular Imaging in Oncology, by E. Edmund Kim and David J.

Yang (Editors), Springer; 1 edition (January 15, 2001).

The Biology of Cancer, by Robert A. Weinberg, Garland Science; 1 edition

(June 9, 2006).

The Molecular Biology of Cancer, by Michael Khan, Stella Pelengaris

(Editors), Wiley-Blackwell; 1 edition (February 28, 2006).

277

Thein-Han WW, Stevens WF. Transdermal delivery controlled by a chitosan

membrane. Drug Dev Ind Pharm. 2004 Apr;30(4):397-404.

Tokes ZA, Rogers KE, Rembaum A. Synthesis of adriamycin-coupled

polyglutaraldehyde microspheres and evaluation of their cytostatic activity. Proc Natl

Acad Sci U S A. 1982 Mar; 79(6): 2026-30.

Tournaviti S, Hannemann S, Terjung S, Kitzing TM, Stegmayer C, Ritzerfeld J,

Walther P, Grosse R, Nickel W, Fackler OT. SH4-domain-induced plasma membrane

dynamization promotes bleb-associated cell motility. J Cell Sci. 2007 Nov 1;120(Pt

21):3820-9.

Uchiyama Y. Apoptosis: The history and trends of its studies. Arch Histol

Cytol. 1995 Jun;58(2):127-37.

Venkitaraman AR. Chromosomal instability in cancer: causality and

interdependence. Cell Cycle. 2007 Aug;6(19):2341-3. 2007 Jul 18.

Venter BR, Venter JC, Kaplan NO. Affinity isolation of cultured tumor cells by

means of drugs and hormones covalently bound to glass and Sepharose beads. Proc

Natl Acad Sci U S A. 1976 Jun; 73(6): 2013-7.

Vereb G Jr, Panyi G, Balazs M, Matyus L, Matko J, Damjanovich S. Effect of

cyclosporin A on the membrane potential and Ca2+ level of human lymphoid cell

lines and mouse thymocytes. Biochim Biophys Acta. 1990 Aug 30;1019(2):159-65.

Verkleij AJ, Post JA. Physico-chemical properties and organization of lipids in

membranes: their possible role in myocardial injury. Basic Res Cardiol. 1987;82

Suppl 1:85-91.

Voltz E, Gronemeyer H. A new era of cancer therapy: Cancer cell targeted

therapies are coming of age. Int J Biochem Cell Biol. 2008;40(1):1-8.

278

Wang Y. Chromosome instability in yeast and its implications to the study of

human cancer. Front Biosci. 2008 Jan 1;13:2091-102.

Wang YJ, Sun J, He ZG. Liposome electrokinetic chromatography and its

application in evaluating drug-membrane interactio. Yao Xue Xue Bao. 2006

Jul;41(7):583-8.

Wiese M, Pajeva IK. Molecular modeling study of the multidrug resistance

modifiers cis- and trans-flupentixol. Pharmazie. 1997 Sep;52(9):679-85.

Yang Q, Liu XY, Ajiki S, Hara M, Lundahl P, Miyake J. Avidin-biotin

immobilization of unilamellar liposomes in gel beads for chromatographic analysis of

drug-membrane partitioning. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 1998 Apr 10;707(1-

2):131-41.

Yang Q, Liu XY, Yoshimoto M, Kuboi R, Miyake J. Covalent immobilization of

unilamellar liposomes in gel beads for chromatography. Anal Biochem. 1999 Mar

15;268(2):354-62.

Yoon KA, Burgess DJ. Mathematical modelling of drug transport in emulsion

systems. J Pharm Pharmacol. 1998 Jun;50(6):601-10.

Zhang S, Chen WM, Chen YH. Isolation and identification of two new taxane

diterpenes from Taxus chinensis (Pilger)Rehd. Yao Hsueh Hsueh Pao

1992;27(4):268-72.

Zhang S, Tung-Ling Lee C, Kashiwada Y, Chen K, Zhang DC, Lee KH,

Yunantaxusin A, a new 11(15-->1)-abeo-taxane from Taxus yunnanensis. J Nat Prod

1994 Nov;57(11):1580-3.

Zhao L, Feng SS. Effects of lipid chain unsaturation and headgroup type on

molecular interactions between paclitaxel and phospholipid within model

biomembrane. J Colloid Interface Sci. 2005 May 1;285(1):326-35.

279

Zhao L, Feng SS. Effects of cholesterol component on molecular interactions

between paclitaxel and phospholipid within the lipid monolayer at the air-water

interface. J Colloid Interface Sci. 2006 Aug 1;300(1): 314-26.

280

EK-6: GEN AKTARIMI İLE İLGİLİ GÜNCEL REFERANSLAR

281

ADRIAN-SCOTTO M, Vasileva D., Mallet G., Vasilescu D., About Hydration of Mg2+:

a quantum DFT study, Internet Electron. J. Mol. Des., 1, 1-13, (2003).

AHMAD R., Arakawa H., Tajmir-Riahi H. A., A Comparative Study of DNA

Complexation with Mg(II) and Ca(II) in Aqueous Solution: Major and Minor Grooves

Bindings, Biophys. J., 84, 2460-2466, (2003).

AKAO T., Fukumoto T., Ihara H., Ito A., Conformational Change in DNA Induced by

Cationic Bilayer Membranes, FEBS Lett., 391 (1-2), 215-8, (1996).

AKHTAR, S., Basu, S., Wickstrom, E., Juliano, R. L., Cationic liposome-mediated

transfection with lipofection reagent Methods of Molecular Biology, 91-98, (1991).

ANGELOVA M. I., Tsoneva I., Interactions of DNA with Giant Liposomes, Chem.

Phys. Lipids, 101, 1, 123-137, (1999).

ANCHORDOQUY, T. J., Dean Allison, S., Molina, M. D. C., Girouard, L. G., and

Carson, T. K., Physical Stability of DNA-Based Therapeutics, Drug Disc. Today, 6,

463-470, (2001).

ANWER K. B,, Rhee G., Mendiratta S.K., Recent Progress in Polymeric Gene Delivery

Systems, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier. Syst., 20(4), 249-293, (2003).

AVRAMOVIC-ZIKIC O., Colbow K., Turbidity Changes of Lipid Vesicles Near the

Phase Transition Temperature as an Indication of Fusion, Biochim Biophys Acta, Sep

11, 512(1), 97-104, (1978).

AZZAM T., Domb A. J., Current Developments in Gene Transfection Agents, Curr

Drug Deliv., Apr;1(2), 165-93, (2004).

BALKRISHNAN K., Mehdi S. Q., McConnell H. M., Binding and Mobility of Anti-

Dinitrophenyl Monoclonal Antibodies on Fluid-like Langmuir-Blodgett Phospholipid

Monolayers Containing Dinitrophenylated Phospholipids, Biochim. Biophysic. Acta,

1064, 219-228, (1991).

282

BANYAY, M., Sarkar, M. and Gräslund, A., A Library of IR Bands of Nucleic Acids in

Solution, Biophys. Chem., 104, 477-488, (2003).

BARTOSCH B., Cosset F. L., Strategies for Retargeted Gene Delivery using Vectors

Derived from Lentiviruses, Curr Gene Ther., Dec;4(4), 427-43, (2004).

BICHENKOV E. E., Budker V. G., Korobeinicheva I. K., Savchenko E. V., Filimonov

V. V., DNA Interaction with Phosphatidylcholine Liposomes. Melting of DNA and

Phase Transition of the Lipid Membrane in the Complex, Biologicheski Membrani, 5,

8, 843-851 (1988).

BINDER, H., and Zschörnig, O., The Effect of Metal Cations on the Phase Behavior

and Hydration Charactersitics of Phospholipid Membranes, Chem. Phys. Lipids, 115,

39-61, (2002).

BLOOMFIELD V. A., Crothers D. M., Tinoco I. Jr., Nucleic Acids-Structures,

Properties, and Functions, University Science Books, Sausalito, California, (2000).

BRAUN C. S., Kueltzo L. A., Midaugh C. R., Ultraviolet Absorption and Circular

Dichroism Spectroscopy of Nonviral Gene Delivery Complexes, In: Methods in

Molecular Medicine, vol. 65: Nonviral Vectors for Gene Therapy, M. A. Findeis (Ed.),

Humana Press Inc., Totowa, NJ., (2001), pp.253-284.

BRUNI, P., Cingolani, F., Iacussi, M., Pierfederici, F. , and Tosi, G., The Effect of

Bivalent Metal Ions on Complexes DNA-Liposome: a FT-IR Study, 565-566, 237-245,

(2001).

BUELER H.,Adeno-Associated Viral Vectors for Gene Transfer and Gene Therapy,

Biol Chem., Jun;380(6), 613-22, (1999).

BURCKBUCHLER V., Wintgens V., Lecomte S., Percot A., Leborgne C., Danos O.,

Kichler A., Amiel C., DNA Compaction into New DNA Vectors Based on Cyclodextrin

283

Polymer: Surface Enhanced Raman Spectroscopy Characterization, Biopolymers, Apr

5;81(5), 360-70, (2006).

BURTON E. A., Fink D. J., Glorioso J. C., Gene Delivery Using Herpes Simplex Virus

Vectors, DNA Cell Biol., Dec;21(12), 915-36, (2002).

CAFFREY M., Lipidat, CRC Press, Inc. (1993).

CARACCIOLO G., Pozzi D., Amenitsch H., Caminiti R., Multicomponent Cationic

Lipid-DNA Complex Formation: Role of Lipid Mixing, Langmuir, Dec 6; 21 (25),

11582-7, (2005).

CASTELLI F., Raciti G. ,A Calorimetric Study of the Influence of Divalent Cations on

the Thermotropic Behaviour of some Phosphatidylcholines, Thermochim. Acta, 186,

205-215, (1991).

CHABAUD P., Camplo M., Payet D., Serin G., Moreau L., Barthelemy P., Grinstaff M.

W., Cationic Nucleoside Lipids for Gene Delivery, Bioconjug Chem., Mar-Apr;17(2),

466-72, (2006).

CHALIKIAN T. V., Völker G., Plum E., Breslauer K. J., A More Unified Picture for the

Thermodynamics of Nucleic Acid Duplex Melting: A Characterization by Calorimetric

and Volumetric Techniques, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 7853-7858, (1999).

CHONG C. S., Colbow K., Light Scattering and Turbidity Measurements of Lipid

Vesicles, Biochim. Biophys. Acta, 436, 260-282, (1976).

CHU D., Sullivan C. C., Weitzman M. D., Du L., Wolf P. L., Jamieson S. W.,

Thistlethwaite P. A., Direct Comparison of Efficiency and Stability of Gene Transfer

into the Mammalian Heart Using Adeno-Associated Virus Versus Adenovirus

Vectors, J. Thorac Cardiovasc Surg., Sep;126(3), 671-9, (2003).

284

CLEMENT, J., Keifer, K., Kimpfler, A., Garidel, P., and Peschka-Süss, R., Large-Scale

Production of Lipoplexes With Long Shelf-Life, Eur. J. Pharmaceut. Biopharm., 59,

35-43, (2005).

CONWAY J. E., Zolotukhin S., Muzyczka N., Hayward G. S., Byrne B. J.,

Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Replication and Packaging is Entirely

Supported by a Herpes Simplex Virus Type 1 Amplicon Expressing Rep and Cap., J.

Virol., Nov;71(11), 8780-9, (1997).

DANG J. M., Leong K. W., Natural Polymers for Gene Dlivery and Tissue

Engineering, Adv Drug Deliv Rev., Jun 6; (2006).

DASS R., Cytotoxicity Issues Pertinent to Lipoplex-Mediated Gene Therapy In-Vivo,

J. Pharm. Pharmacol., 54, 593-601, (2002).

de GENNES P-G., Problems of DNA Entry into a Cell, Physica A, 274, 1-7, (1999).

DRITSCHILO, A., Thierry, A.R., Rahman, A., Targeted delivery of DNA by liposomes

and polymers, J. of Contr. Release, 19, 269-274, (1992).

DUGUID J. G., Bloomfield V. A., Aggregation of Melted DNA by Divalent Metal Ion-

Mediated Cross-Linking, Biophys J., 69, 2642-2648, (1995).

EGBARIA K., Weiner N., Hydroxylated Nylon Polymers Hydroxylated Nylons Based

on Unprotected Esterified D-Glucaric Acid by Simple Condensation Reactions, J.

Amer. Chem. Soc., 116, 571-578, (1994).

EL-ANEED A., An Overview of Current Delivery Systems in Cancer Gene Therapy, J.

Control Release., Jan 8;94(1),1-14, (2004).

ESPONDA P., Goldstein M., Witkin S. S., In Vitro Transfection of the Human Vas

Deferens Using DNA-Liposome and DNA-Neutral Lipid Complexes, Fertility and

Sterility, 81;1, 171-175, (2004).

285

FALKNER F. G., Holzer G. W., Vaccinia Viral/Retroviral Chimeric Vectors, Curr

Gene Ther., Dec;4(4), 417-26, (2004).

FELGNER P. L., Liposomes for the transformation of eukaryotic cells, Biochim.

Biophysica Acta, 1097, 1-17, (1991).

FLETCHER S., Ahmad A., Perouzel E., Heron A., Miller A. D., Jorgensen M. R., In

Vivo Studies of Dialkynoyl Analogues of DOTAP Demonstrate Improved Gene

Transfer Efficiency of Cationic Liposomes in Mouse Lung, J. Med Chem., Jan 12; 49

(1), 349-57, (2006).

FLETCHER S., Ahmad A., Perouzel E., Jorgensen M. R., Miller A. D., A Dialkynoyl

Analogue of DOPE Improves Gene Transfer of Lower-Charged, Cationic Lipoplexes,

Org Biomol Chem., Jan 21; 4 (2), 196-9, (2005).

FLOTTE T. R., Laube B. L., Gene Therapy in Cystic Fibrosis, Chest., Sep;120(3

Suppl), 124S-131S, (2001).

FORATO, L.A., Bernardes-Filho, R. and Colnago, L.A., Protein Struture in KBr

Pellets by Infrared Spectroscopy, Anal. Biochemistry, 259, 136-141, (1998).

FRAÚSTO DA SILVA J. J. R., Williams R. J. P., The Biological Chemistry of the

Elements. The Inorganic Chemistry of Life, Chapter 9: The Biological Chemistry of

Magnesium:Phosphate Metabolism, 2nd. ed., Oxford University Press, Oxford, New

York, (2001), pp. 251-276.

FUJII G. ,To Fuse or Not to Fuse: The Effects of Electrostatic Interactions,

Hydrophobic Forces, and Structural Amphiphilicity on Protein-Mediated Membrane

Destabilization, Adv Drug Deliv Rev., 20; 38(3), 257-277, (1999).

GAMON B. L., Virden J. W., Berg J. C., The Aggregation Kinetics of an

Electrostatically Stabilized Dipalmitoyl Phosphatidylcholine System, J. Coll. Interf.

Science, 132, 1, 125-138, (1989).

286

GARIDEL, P., Blume, A., and Hübner, W., A Fourier Transform Infrared

Spectroscopic Study of the Interaction of Alkaline Earth Cations With the Negatively

Charged Phospholipid 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol,. Biochim.

Biophys. Acta, 1466, 245-259, (2000).

GAUGER, D.R., Selle, C., Fritzsche, H., and Pohle, W., Chain-Length Dependence of

the Hydration Properties of Saturated Phosphatidylcholines as Revealed by FTIR

Spectroscopy, J. Mol. Structure, 565-566, 25-29, (2001).

GEBHART C. L., Kabanov A. V., Evaluation of Polyplexes as Gene Transfer Agents, J.

Contr. Releas., 73, 401-416, (2001).

GEILEN C. C., Wieder T., Haase A., Reutter W., Morre D. M., Moore D. J.,

Pharmacokinetic Behavior and Antineoplastic Activity of Liposomal-

Hexadecylphosphocholine, Cancer Chemotherapy & Pharmacology, 34, 393-398,

(1994).

GELBART W. M., Bruinsma R. F., Pincus P. A., Parsegian V. A., DNA-Inspired

Electrostatics, Physics Today, Sep., 38-44, (2000).

GODBEY W. T., Atala A., In Vitro Systems for Tissue Engineering, Ann N Y Acad Sci.,

Jun;961, 10-26, (2002).

GRDADOLNIK J., Hadzi D., Conformational Effects of Metal Salt Binding to the

Polar Head of Phosphatidylcholines iIvestigated by FTIR Spectroscopy, Chem. Phys.

Lipids, 65, 121-132, (1993).

GREGORIADIS G. (Ed.)., Liposome Technology, Vol 1, 2, and 3, CRC Press, Inc.,

(1993).

GUNSTONE F. D., Harwood J. L.and Padley, F. B., The Lipid Handbook, 2nd Ed.,

CRC Pres., (1994).

287

GÜNZLER, H. and Gremlich, H.-U., IR Spectroscopy. An Introduction, Wiley-VCH

Verlag GmbH, 69469, Weinheim (Germany), (2002).

HACKL, E. V., Kornilova, S. V., Kapinos, L. E., Andrushchenko, V. V., Galkin, Vi L.,

Grigoriev, D. N., and Blagoi, Yu. P., Study of Ca2+, Mn2+ and Cu2+ Binding to DNA in

Solution by Means of IR Spectroscopy, J. Mol. Structure, 408/409, 229-232, (1997).

HART S.L. Lipid Carriers for Gene Therapy, Curr Drug Deliv., Oct; 2 (4), 423-8,

(2005).

HAUSER H., Effect of Inorganic Cations on Phase Transitions, Chem. Phys. Lipids ,

57, 309-325, (1991).

HENDRIE P. C., Russell D. W., Gene Targeting with Viral Vectors, Mol Ther.,

Jul;12(1), 9-17, (2005).

HENDRIKS W. T., Ruitenberg M. J., Blits B., Boer G. J., Verhaagen J., Viral Vector-

Mediated Gene Transfer of Neurotrophins to Promote Regeneration of the Injured

Spinal Cord, Prog Brain Res., 146, 451-76, (2004).

HERMANSON, G. T., Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Pres,

(1996).

HINRICHS W. L., Mancenido F. A., Sanders N. N., Braeckmans K., De Smedt S. C.,

Demeester J., Frijlink H. W., The Choice of a Suitable Oligosaccharide to Prevent

Aggregation of PEGylated Nanoparticles During Freeze Thawing and Freeze Drying,

Int J Pharm., Mar 27; 311 (1-2), 237-44, (2006).

HOLT J. R., Johns D. C., Wang S., Chen Z. Y., Dunn R. J., Marban E., Corey D. P.,

Functional Expression of Exogenous Proteins in Mammalian Sensory Hair Cells

Infected with Adenoviral Vectors, J. Neurophysiol., Apr;81(4), 1881-8, (1999).

HUD N. V. Polak M., DNA – Cation Interactions: The Major and Minor Grooves are

Flexible Ionophores, Curr Opin Struct Biol., 11, 293-301, (2001).

288

HUG P., Slight, R. G., Liposomal delivery as a new approach to transport antisense

oligonucleotides, Gene Regulation, Erickson, R. P. & Izant, G., (Eds.), (1992), Raven

Press, New York., Pp: 147-161.

HÜBNER, W. and Blume, A., Interactions at the Lipid-Water Interface, Chem. Phys.

Lipids, 96, 99-123, (1998).

IGARASHI S, Hattori Y, Maitani Y, Biosurfactant MEL-A Enhances Cellular

Association and Gene Transfection by Cationic Liposome, J. Control Release, May

30; 112(3), 362-8, (2006).

IVANOV I. I., Chapter V: Calorimetric Methods of Studying Biopolymers and

Membrane Systems, in: Modern Methods of Biophysical Investigations – a Practicum

of Biophysics, Ed. A. B. Rubin, Vishaya Shkola, Moscow, (1988), pp 203 – 216.

JANG J. H., Houchin T. L., Shea L. D., Gene Delivery from Polymer Scaffolds for

Tissue Engineering, Expert Rev Med Devices, Sep;1(1),127-38, (2004).

JANOFF, A. S. (Ed.), Liposomes: Rational Design, Marcel Dekker (1998).

JEWELL C. M., Hays M. E., Kondo Y., Abbott N. L., Lynn D. M., Ferrocene-

Containing Cationic Lipids for the Delivery of DNA: Oxidation State Determines

Transfection Activity, J. Control Release, May 1; 112(1), 129-38, (2006).

JOHNSTON, S. F., Fourier Transform Infrared – A Constantly Evolving Technology,

Ellis Horwood Limited, (1991).

JULIANO R. L., Peptide and protein drugs: I. Therapeutic applications, absorption

and parenteral administration, Inter. J. Pharm., 75, 97-115, (1991).

JULLIEN L., Cottet H., Hamelin B., Jardy A., Thermodynamic Behaviour of a

Supramolecular System Self-Assembled by Electrostatic Interaction in Aqueous

289

Solution. Results and Theoretical Analysis, J. Phys. Chem. B, 103, 10866-10875,

(1999).

KABANOV A.V., Kabanov V. A., DNA Complexes with Polycations for the Delivery of

Genetic Material into Cells, Bioconjug Chem., Jan-Feb;6(1), 7-20, (1995).

KAMIYA H., Akita H., Harashima H., Pharmacokinetic and Pharmacodynamic

Considerations in Gene Therapy, Drug Discov Today, 1; 8(21), 990-6, (2003).

KAPLITT M. G., Makimura H., Defective Viral Vectors as Agents for Gene Transfer in

the Nervous System, J. Neurosci Methods, Jan;71(1), 125-32, (1997).

KARMALI P. P., Majeti B. K., Sreedhar B., Chaudhuri A., In Vitro Gene Transfer

Efficacies and Serum Compatibility Profiles of Novel Mono-, Di-, and Tri-

Histidinylated Cationic Transfection Lipids: A Structure-Activity Investigation,

Bioconjug Chem., Jan-Feb; 17(1):, 59-71, (2006).

KAUFMANN-KOLLE P., Drevs J., Berger M. R., Kotting J., Marschner N., Unger C.,

Eibl H., Topical Administration of Hexadecyl-Phosphocholine in Patients with

Cutaneous Lymphomas: Results of a Phase I/II study, J. of the American Academy of

Dermatology, 29, 963-970, (1993).

KAWAKAMI S., Ito Y., Fumoto S., Yamashita F., Hashida M., Enhanced Gene

Expression in Lung by a Stabilized Lipoplex Using Sodium Chloride for Complex

Formation, J Gene Med., Dec; 7 (12), 1526-33, (2005).

KEILY D. E., Chen, L., Lin T. H., Alkyl Phosphocholine Structure of Glucagon-Like

Peptide (7-36) Amide in a Dodecyl-Phosphocholine Micelle as Determined by 2D

NMR, Biochemistry, 33, 3532-3539, (1994).

KHALIL I. A., Kogure K., Akita H., Harashima H., Uptake Pathways and Subsequent

Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery, Pharmacol Rev., Mar; 58(1), 32-

45, (2006).

290

KHARAKOZ D. P., Khusainova R. S., Gorelov A. V., Dawson K. A., Stoichiometry of

Dipalmytoilphosphatidylcholine-DNA Interaction in the Presence of Ca2+: a

Temperature-Scanning Ultrasonic Study, FEBS Lett., 446, 27-29, (1999).

KHAZANOV E., Simberg D., Barenholz Y., Lipoplexes Prepared from Cationic

Liposomes and Mammalian DNA Induce CpG-Independent, Direct Cytotoxic Effects

in Cell Cultures and in Mice, J. Gene Med., (2006).

KIRBY C. J., Gregoriadis G., Liposomes, in: E. Mathiowitz (Ed.), Encyclopedia of

Controlled Drug Delivery, Vol. 1, John Wiley &Sons, Inc., (1999), pp. 461-492.

KOBAYASHI, N., Nishikawa, M., and Takakura, Y., Gene Therapy and Gene Delivery,

In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and

Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 305-318.

KOOTSTRA, N. A., Verma I. M., Gene Therapy with Viral Vectors, Ann. Rev.

Pharmacol. Toxicol., 43, 413-39, (2003).

KOYNOVA R., Koumanov A., Tenchov B., Metastable Rippled Gel Phase in Saturated

Phosphatidylcholines: Calorimetric and Densitometric Characterization, Biochim.

Biophys. Acta, 1285, 101-108, (1996).

KOYNOVA R., Wang L., Tarahovsky Y., MacDonald R. C., Lipid Phase Control of

DNA Delivery, Bioconjug Chem., Nov-Dec;16 (6), 1335-9, (2005).

KUVITCHKIN V. V., Sukhomudrenko A. G., Interaction of Natural and Synthetic

Polynucleotides with Liposomes in the Presence of Divalent Cations, Biophysics,

XXXII, 4, 628-633 (1987).

LAI, E., van Zanten, J. H., Evidence of Lipoplex Dissociation in Liquid Formulations,

J. Pharm. Sci., 91, 1225-1232, (2002).

LAM M. I., Cullis P. R., Calcium Enhances the Transfection Potency of Plasmid DNA-

Cationic Liposome Complexes, Biochim. Biophys. Acta, 1463, 279-290, (2000).

291

LAMBERT G., Fattal E., Couvreur P., Nanoparticulate Systems for the Delivery of

Antisence Oligonucleotides, Adv. Drug Del. Rev., 47, 99-112, (2001).

LASIC D. D. & Yechezkel B., Handbook of Nonmedical Applications of Liposomes,

Vol. I, II, III, & IV, CRC Press, Inc., (1996).

LASIC D. D. (Ed.), Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, Inc., (1997).

LASIC D. D. and Papahadjopoulos D. (Ed.), Medical Applications Of Liposomes,

Elsevier Press.

LASIC D. D. and Templeton N. S. (Ed.), Gene Therapy: Therapeutic Mechanisms

and Strategies, Marcel Dekker (2000).

LASIC, D. D., Targeted liposomes and intracellular delivery of macromolecules,

Progress in Clinical and Biology Research, 343, 95-102, (1990).

Le BIHAN, T., and Pézolet, M., Study of the Structure and Phase Behavior of

Dipalmitoylphosphatidylcholine by Infrared Spectroscopy: Characterization of the

Pretranstion and Subtransition, Chem. Phys. Lipids, 94, 13-33, (1998).

LESERMAN, L., Machy, P., Leonetti, P., Jilhaud, P. G., Degols, G., Lebleu, B.,

Liposomal Drug Delivery System, Polymembrane Preparation ,Vol. 31, 159-160,

(1990).

LEVENTIS R., Silvius J. R., Systemic Gene Expression After Intravenous DNA

Delivery in Adult Mice, Science, 261, 209-211, (1993).

LEWIS, R. N. A. H., Winter, I., Kriechbaum M., Lohner, K. and McElhaney, R. N.

Studies of the Structure and Organization of Cationic Lipid Bilayer Membranes:

Calorimetric, Spectroscopic, and X-ray Diffraction Studies of Linear Saturated P-O-

ethyl Phosphatidylcholines, Biophys. J., 60, 1329-1342, (2001).

292

LEWIS, R.N.A.H. and McElhaney, R.N., Fourier Transform Infrared Spectroscopy in

The study of Hydrated Lipids and Lipid Bilayer Membranes. in: H.H. Mantsch and D.

Chapman (Eds.), Infrared Spectroscopy of Biomolecules. Wiley-Liss, New York,

(1996), Pp: 159-202.

LIN A. J., Slack N. L., Ahmad A., George C. X., Samuel C. E., Three-Dimensional

Imaging of Lipid Gene-Carriers: Membrane Charge Density Controls Universal

Transfection Behaviour in Lamellar Cationic Liposome-DNA Complexes, Biophys. J.,

84, 3307-3316, (2003).

LIU F., Huang L., Development of Non-Viral Vectors for Systemic Gene Delivery, J.

Contr. Release, 78, 259-266, (2002).

Liposome Preparation, Pharmaceutical Manufacturing of Liposomes, Martin F. J.

(1990), In: Liposomes as Drug Delivery Systems, Part I: Preparation,

Pharmaceutical Technology Volume 16, (1992), Pp: 96-106.

LOBO B. A., Rogers S. A., Wiethoff C. M., Choosakoonkriang S., Bogdanovich-Knipp

S., Middaugh C. R., Characterization of Cationic Vector-Based Gene Delivery Vehicles

Using Isothermal Titration and Differential Scanning Calorimetry, in: Methods in

Molecular Medicine, Vol. 65, Nonviral Vectors for Gene Therapy, Eds. M. A. Findeis,

Humana Press Inc., Totowa, New Jersey, USA, (2001), pp 319-348.

LOHMEYER M., Bittman R., Uptake, Subcellular Distribution and Metabolism of the

Phospholipid Analogue Hexadecylphosphocholine in MCDK Cells, Biochemica et

Biophysica Acta, 1211, 14-22, (1994).

LOPEZ-BARCONS L. A., Polo D., Llorens A., Reig F., Fabra A., Targeted Adriamycin

Delivery to MXT-B2 Metastatic Mammary Carcinoma Cells by Transferrin

Liposomes: Effect of Adriamycin ADR-to-Lipid Ratio, Oncol Rep., Nov; 14 (5), 1337-

43, (2005).

293

LOSER P., Huser A., Hillgenberg M., Kumin D., Both G. W., Hofmann C., Advances

in the Development of Non-Human Viral DNA-Vectors for Gene Delivery, Curr Gene

Ther., May;2(2), 161-71, (2002).

MACDONALD P. M., Leisen J., Marassi F. M., Responce of Phosphatidylcholine in

the Gel and Liquid-Crystalline States to Membrane Surface Charges, Biochemistry,

30, 3558-3566, (1991).

MACDONALD R. C., Gorbonos A., Momsen M. M., Brockman H. L., Surface

Properties of Dioleoyl-sn-Glycerol-3-Ethylphosphocholine, A Cationic

Phosphatidylcholine Transfection Agent, Alone and in Combination with Lipids or

DNA, Langmuir, Mar 14; 22(6), 2770-9, (2006).

MAH C., Byrne B. J., Flotte T. R., Virus-Based Gene Delivery Systems, Clin

Pharmacokinet., 41(12), 901-11, (2002).

MAHESHRI N., Koerber J. T., Kaspar B. K., Schaffer D. V., Directed Evolution of

Adeno-Associated Virus Yields Enhanced Gene Delivery Vectors, Nat Biotechnol.,

Feb;24(2):198-204, (2006).

MARSH D., Handbook of Lipid Bilayers, CRC Press, Inc., (1990).

MARUYAMA, K., Kennel, S. & Huang, L., Liposomes designed to avoid the

reticuloendothelial system, Progress in Clinical and Biological Research, 343, 85-93,

(1990).

MATSUZAKİ K. O., Murase K., Sugishita S., Yoneyama K., Akada M., Ueha A.,

Nakamura Kobayashi S., Optical Characterization of Liposomes by Right Angle Light

Scattering and Turbidity Measurement, Biochim. Biophys. Acta, 1467, 219-226,

(2000).

MAXWELL I. H., Spitzer A. L., Long C. J., Maxwell F., Autonomous Parvovirus

Transduction of a Gene Under Control of Tissue-Specific or Inducible Promoters,

Gene Ther., Jan;3(1), 28-36, (1996).

294

McCULLOUGH, H. N, Juliano, R. L., Liposomes: a pulmonary perspective,

In:Liposomes as Drug Carriers, Gregoriadis, G., (Ed.), (1988), Pp: 679-694.

Measured by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, Biophys. J., 58,

1235-1249, (1990).

MEIDAN V. M, Glezer J., Salomon S., Sidi Y., Barenholz Y., Cohen J. S., Lilling G.,

Specific Lipoplex-Mediated Antisense Against Bcl-2 in Breast Cancer Cells: A

Comparison Between Different Formulations, J. Liposome Res., Mar;16(1), 27-43,

(2006).

MEL'NIKOV S. M., Dias R., Mel'nikova Y. S., Marques E. F., Miguel M. G., Lindman

B., DNA Conformational Dynamics in the Presence of Catanionic Mixtures, FEBS

Lett., 453, 113-118, (1999).

METZ M. Z., Best D. M., Kane S. E., Harvey Murine Sarcoma Virus/MDR1 Retroviral

Vectors: Efficient Virus Production and Foreign Gene Transduction Using MDR1 as a

Selectable Marker, Virology, Apr 20;208(2), 634-43, (1995).

MIHALKO P., Schreier, H., Abra, R. M., Liposomes for pulmonary applications, In:

Modern Medicine of Canada, Volume 45, (1990), Pp: 233-237.

MILLER A. D., Nonviral Liposomes. Methods Mol. Med., 90, 107-38, (2004).

MILLER D., The Problem with Cationic Liposome/Micelle-Based Non-Viral Vector

Systems for Gene Therapy, Curr. Med. Chem., 10, 1195-1211, (2003).

MOHR L., Geissler M., Gene Therapy: New Developments, Schweiz Rundsch Med

Prax., Dec 18;91(51-52), 2227-35, (2002).

MOLDAWER L. L, Edwards P. D., Josephs M., Minter R. M., Copeland E. M. 3rd,

MacKay S. L., Application of Gene Therapy to Acute Inflammatory Diseases, Shock,

Aug;12(2), 83-101, (1999).

295

MORET-TATAY I., Sanmartin I., Marco F. M., Diaz J., Alino S. F., Nonviral

Therapeutic Cell Vaccine Mediates Potent Antitumor Effects, Vaccine, May 1; 24(18),

3937-45, (2006).

MÖNKKÖNEN J., Urtti A., Lipid Fusion in Oligonucleotide and Gene Delivery with

Cationic Lipids, Adv. Drug Deliv. Rev., 34, 37-49, (1998).

NICOLAU C.,Cudd A., Amphipathic Antigens Availability of Dinitrophenylated Lipids

Haptens for Specific Antibody Binding Depends on the Physical Properties of Host

Bilayer Membranes, J. Biol. Chem., 257, 6434-6439, (1982).

NICOLAU, C. & Cudd, A., Interactions of antisense DNA oligonucleotide analogs with

phospholipid membranes (liposomes), Nucleic Acids Research, 19, 5551-5559, (1991).

OKADA T., Caplen N. J., Ramsey W. J., Onodera M., Shimazaki K., Nomoto T., Ajalli

R., Wildner O., Morris J., Kume A., Hamada H., Blaese R. M., Ozawa K., In situ

Generation of Pseudotyped Retroviral Progeny by Adenovirus-Mediated

Transduction of Tumor Cells Enhances the Killing Effect of HSV-tk Suicide Gene

Therapy In Vitro and In Vivo, J. Gene Med., Mar;6(3),288-99, (2004).

OPANASOPIT P., Nishikawa M., Hashida M., Factors Affecting Drug and Gene

Delivery: Effects of Interaction with Blood Components, Crit Rev Ther Drug Carrier

Syst., 19(3), 191-233, (2002).

OTTOVA-LEITMANNOVA, A. and Tien H. Ti, Membrane Biophysics: As Viewed

from Experimental Bilayer Lipid Membranes (Planar Lipid Bilayers and Spherical

Liposomes)., Elsevier, (2001).

PAASONEN L., Korhonen M., Yliperttula M., Urtti A., Epidermal Cell Culture Model

with Tight Stratum Corneum as a Tool for Dermal Gene Delivery Studies, Int J

Pharm., Jan 13; 307 (2), 188-93, (2006).

PALMER J. A., Branston R. H., Lilley C. E., Robinson M. J., Groutsi F., Smith J.,

Latchman D. S., Coffin R.S., Development and Optimization of Herpes Simplex Virus

296

Vectors for Multiple Long-Term Gene Delivery to the Peripheral Nervous System, J.

Virol., Jun;74(12), 5604-18, (2000).

PAPAHADJOPOULOS, D. & Gabizon, A., Encapsulation/Delivery of DNA

Interactions of cationic lipid vesicles with negatively charged phospholipid vesicles

and biological membranes, Biochemistry, 27, 3917-3925, (1988).

PASSINI M. A., Watson D. J., Wolfe J. H., Gene Delivery to the Mouse Brain with

Adeno-Associated Virus, Methods Mol Biol.,;246, 225-36, (2004).

PEETERS L., Sanders N. N., Braeckmans K., Boussery K., Van de Voorde J., De

Smedt S. C., Demeester J., Vitreous: A Barrier to Nonviral Ocular Gene Therapy,

Invest Ophthalmol Vis Sci., Oct; 46 (10), 3553-61, (2005).

PELISEK J., Gaedtke L., DeRouchey J., Walker G. F., Nikol S., Wagner E., Optimized

Lipopolyplex Formulations for Gene Transfer to Human Colon Carcinoma Cells

Under In Vitro Conditions, J Gene Med., Feb; 8 (2), 186-97, (2006).

PETERS A. R., Dekker, N., van den Berg, L., Boelens, R., Kaptein, R., Slotboom, A. J.,

de Haas G. H., Antitumor ether lipids and alkyl phosphocholines, Drugs of the

Future, 19, 1021-1037, (1994).

PEVSNER, A., and Diem, M., IR Spectroscopic Studies of Major Cellular

Components. III. Hydration of Protein, Nucleic Acid, and Phospholpid Films,

Biopolymers (Biospectroscopy), 72, 282-289, (2003).

PHILLIP R., Liggitt D., Phillip M., Dazin P., Debs R., Liposomes as carriers of DNA,

Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst., 6, 239-271, (1989).

PISARCHICK M. L., Thompson N. L., Immune Clearance of Liposomes Inhibited by

an Anti-FC Receptor Antibody in vivo, Proc. Nat. Acad. Sci. USA,83, 2699-2703,

(1986).

297

POHLE, W., Gauger, D.R., Fritzsche, H., Rattay, B., Selle, C., Binder, H., and Böhlıg,

H., FTIR-Spectroscopic Characterization of Phosphocholine-Headgroup Model

Compounds, J. Mol. Structure, 563-564, 463-467, (2001).

POHLE, W., Selle, C., Gauger, D. R., Zantl, R., Artzner, F., and Rädler, J. O., FTIR

Spectroscopic Characterization of a Cationc Lipid-DNA Complex and Its

Components, Phys. Chem. Chem. Phys., 2, 4642-4650, (2000).

RASMUSSEN U. B., Benchaibi M., Meyer V., Schlesinger Y., Schughart K, Novel

Human Gene Transfer Vectors: Evaluation of Wild-Type and Recombinant Animal

Adenoviruses in Human-Derived Cells, Hum Gene Ther., Nov 1;10(16), 2587-99,

(1999).

REMAUT K., Lucas B., Braeckmans K., Sanders N. N., Demeester J., De Smedt S. C.

Protection of Oligonucleotides Against Nucleases by Pegylated and Non-Pegylated

Liposomes as Studied by Fluorescence Correlation Spectroscopy, J. Control Release,

Dec 10; 110 (1), 212-26, (2005).

RITTER T., Lehmann M., Volk H. D., Improvements in Gene Therapy: Averting the

Immune Response to Adenoviral Vectors, BioDrugs,;16(1),3-10, (2002).

ROBBINS P. D., Ghivizzani S. C., Viral Vectors for Gene Therapy, Pharmacol Ther.,

Oct; 80(1), 35-47, (1998).

ROMANCZUK H., Galer C. E., Zabner J., Barsomian G., Wadsworth S. C., O'Riordan

C. R., Modification of an Adenoviral Vector with Biologically Selected Peptides: A

Novel Strategy for Gene Delivery to Cells of Choice, Hum Gene Ther., Nov 1;10(16),

2615-26, (1999).

ROMOREN K., Fjeld X. T., Poleo A. B., Smistad G., Thu B. J., Evensen O.,

Transfection Efficiency and Cytotoxicity of Cationic Liposomes in Primary Cultures of

Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) gill cells, Biochim Biophys Acta, Nov 10; 1717

(1), 50-7, (2005). BOULANGER C., Di Giorgio C., Vierling P., Synthesis of Acridine-

Nuclear Localization Signal (NLS) Conjugates and Evaluation of Their Impact on

298

Lipoplex and Polyplex-Based Transfection, Eur J Med Chem., Dec; 40 (12), 1295-306,

(2005).

RUTHVEN, N. A., Lewis, H. and McElhaney, R. N., The Structure and Organization

of Phospholipid Bilayers as Revealed by Infrared Spectroscopy, Chem. Phys. Lipids,

96, 9–21, (1998).

SAENGER W., Principles of Nucleic Acid Structure, Springer-Verlag, Berlin,

Heidelberg, MIR Publishers, Moscow, (1987).

SAFINYA C. R., Structures of Lipid-DNA Complexes: Supramolecular Assembly and

Gene Delivery, Curr. Opin. Struct. Biol., Aug. 11 (4), 440-8, (2001).

SALVATI A., Ciani L., Ristori S., Martini G., Masi A., Arcangeli A., Physico-Chemical

Characterization and Transfection Efficacy of Cationic Liposomes Containing the

pEGFP Plasmid, Biophys Chem., Apr 20; 121 (1), 21-9, (2006).

SANTEL A., Aleku M., Keil O., Endruschat J., Esche V., Durieux B., Loffler K.,

Fechtner M., Rohl T., Fisch G., Dames S., Arnold W., Giese K., Klippel A., Kaufmann

J., RNA Interference in the Mouse Vascular Endothelium by Systemic Administration

of siRNA-Lipoplexes for Cancer Therapy, Gene Ther., Apr 20, (2006).

SARAF A., Mikos A. G., Gene Delivery Strategies for Cartilage Tissue Engineering,

Adv Drug Deliv Rev., Jun 9, (2006).

SATO Y., Nomura S.-I., Yoshikawa K., Enhanced Uptake of Giant DNA in Cell-Sized

Liposomes, Chem, Phys. Lett., 380, 279-285, (2003).

SAVVA M., Chen P., Aljaberi A., Selvi B., Spelios M., In Vitro Lipofection with Novel

Asymmetric Series of 1,2-dialkoylamidopropane-Based Cytofectins Containing Single

Symmetric Bis-(2-dimethylaminoethane) Polar Headgroups, Bioconjug Chem., Nov-

Dec;16 (6), 1411-22, (2005).

299

SELLE, C. and Pohle, W., Fourier Transform Infrared Spectroscopy as a Probe for the

Study of the Hydration of Lipid Self-assemblies. II. Water Binding Versus Phase

Transitions, Biospectroscopy, 4, 281-294, (1998).

SELLE, C., Pohle, W. and Fritzsche, H., FTIR Spectroscopic Features of Lyotropically

Induced Phase Transitions in Phospholipid Model Membranes, J. Mol. Structure,

480-481, 401-405, (1999).

SHEK P. N., Barber R. F., Jurimaromet, M., Topical Applications of Liposomes, In:

Liposomes as a topical drug delivery system, Polym. Mater. Sci. Eng., 63, 59-63,

(1990).

SILMAN N. J., Fooks A. R., Biophysical Targeting of Adenovirus Vectors for Gene

Therapy, Curr Opin Mol Ther., Oct;2(5), 524-31, (2000).

SILVESTRO, L. and Axelsen, P. H., Infrared Spectroscopy of Supported Lipid

Monolayer, Bilayer, and Multibilayer Membranes, Chem. Phys. Lipids, 96, 69-80,

(1998).

SIMOES S., Filipe A., Faneca H., Mano M., Penacho N., Duzgunes N., de Lima M. P.,

Cationic Liposomes for Gene Delivery, Expert Opin Drug Deliv., Mar;2 (2), 237-54,

(2005).

SINGH M., Ariatti M., A Cationic Cytofectin with Long Spacer Mediates Favourable

Transfection in Transformed Human Epithelial Cells, Int J Pharm., Feb 17; 309 (1-2),

189-98, (2006).

SORGI, F., and Huang, L., A Dry Powder Formulation for Gene Therapy, Pharm.

Res., 12, S266, (1995).

SMALL D., Handbook of Lipid Research Vol. 4, The Physical Chemistry of Lipids,

Plenum Pres, (1986).

300

SMITH J. G., Walzem R. L., German G. B., Liposomes as Agents of DNA Transfer,

Biochim. Biophys. Acta, 1154, 327-340, (1993).

SOROKIN V. A., Valeyev V. A., Gladchenko G. O., Blagoi Yu. P., Features of the

Interaction of Bivalent Metal Ions with Homopolynucleotides in the Multichain

Conformation, Biophysics, 1994; 39,5, 821-832, (1996).

STEBELSKA K., Dubielecka P. M., Sikorski A. F., The Effect of PS Content on the

Ability of Natural Membranes to Fuse with Positively Charged Liposomes and

Lipoplexes, J. Membr Biol., Aug; 206(3), 203-14, (2005).

STONE D., David A., Bolognani F., Lowenstein P. R., Castro M. G., Viral Vectors for

Gene Delivery and Gene Therapy Within the Endocrine System, J. Endocrinol.,

Feb;164(2), 103-18, (2000).

STRAYER D. S., Viral Gene Delivery, Expert Opin Investig Drugs., Dec;8(12), 2159-

2172, (1999).

SÜLEYMANOĞLU E., Turbidimetric Study of Interaction Between

Polyribonucleotides, Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, NATO-Advanced

Study Institute Proceedings: Trafficking of Intracellular Membranes: From Molecular

Sorting to Membrane Fusion, June 19-30, (1994), Espinho, Portugal.

SÜLEYMANOĞLU E., M. Sc. Thesis, Middle East Technical University, Ankara,

Turkey, (1995).

SÜLEYMANOĞLU E., Preparation and Phase Behaviour of Surface-Active

Pharmaceuticals: Self-Assembly of DNA and Surfactants with Membranes.

Differential Adiabatic Scanning Microcalorimetric Study, Farmaco, 60, (8), 701-10,

(2005).

SÜLEYMANOĞLU E., Fluorescence Microscopy of Condensed DNA Conformations

of Bacterial Cells, J. Microbiol., 40, (4), 319-326, (2002).

301

SÜLEYMANOĞLU, E., A Nanoscale Polynucleotide-Neutral Liposome Self-

Assemblies Formulated for Therapeutic Gene Delivery, Electron. J. Biomed., 2, 13-35,

(2004).

SZOKA, Jr. F. & Papahadjopoulos, D. Comparative Properties and Methods of

Prepartaion of Lipid Vesicles (Liposomes), Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467-508,

(1980).

TAILLANDIER, I.E. and J. Liquier. (2002), in: J.M. Chalmers and Griffith (eds.),

Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, Chichester, Vol. 5,

Chapter 2, Pp. 3465-3480.

TAKAHASHI T., Harada A., Emi N., Kono K., Preparation of Efficient Gene Carriers

Using a Polyamidoamine Dendron-Bearing Lipid: Improvement of Serum Resistance,

Bioconjug Chem., Sep-Oct; 16 (5), 1160-5, (2005).

TALSMA, H & Crommelin, D. J. A., Liposomes as Drug Delivery Systems, Part III:

Stabilization, Pharmaceutical Technology, Volume 17, (1992), Pp: 48-59.

TALSMA, H. & Cormmelin, D. J. A., Liposomes as Drug Delivery Systems, Part II:

Characterization, Pharmaceutical Technology, Volume 16, (1992), Pp: 52-58.

TALSMA, H. & Crommelin, D. J. A., Drug Delivery Overview: Liposomes: Synthetic

lipid microspheres serve as multipurpose vehicles for the delivery of drugs, genetic

material and cosmetics, American Scientist, 80, 20-31, (1992).

TARAHOVSKY Y. S., Khusainova R. S., Gorelov A. V., Nikolaeva T. I., Deev A. A.,

Dawson A. K., Ivanitsky G. R., DNA Initiates Polymorphic Structural Transitions in

Lecithin, FEBS Lett., 390, 133-136, (1996).

TATULIAN S. A., Gordeliy V. I., Sokolova A. E., Syrykh A.G., A Neutron Diffraction

Study of the Ions on Phospholipid Membrane Interactions, Biochim. Biophys. Acta,

1070, 143-151, (1991).

302

TEMPLETON N S., Gene and Cell Therapy-Therapeutic Mechanisms and Strategies,

2nd Ed., Marcel Dekker, (2003).

TEMPLETON N. S., Developments in Liposomal Gene Delivery Systems, Expert

Opin. Biol. Ther., 1, 1-4, (2001).

TEMPLETON N. S., Liposomal Delivery of Nucleic Acids In Vivo. DNA Cell Biol., 12,

857-867, (2002).

THIERRY A. R., Abes S., Resina S., Travo A., Richard J. P., Prevot P., Lebleu B.,

Comparison of Basic Peptides- and Lipid-Based Strategies for the Delivery of Splice

Correcting Oligonucleotides, Biochim Biophys Acta, Mar; 1758 (3), 364-74., (2006).

THORNTON K., Gorenstein D.G., Conformational changes in phospholipase A2 upon

binding to micellar interfaces in the absence and presence of competitive inhibitors.

A 1H and 15N NMR study, Biochemistry, 31, 10021-10030, (1992).

UHRIKOVA D., Rapp G., Kunst B. H., Balgavy P., Interaction of DNA with DPPC

Bilayers in the Presence of Mg (II) Ions, 1998; EMBL DESY Outstation – Hamburg;

Project No: ML-98-6.

ULRICH A. S., Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles,

Bioscience Rep., 22, 2, 129-149, (2002).

van der WEERT, M., Haris, P.I., Hennink, W.E., and Crommelin, D.J.A., Fourier

Transform Infrared Spectrometric Analysis of Protein Conformation: Effect of

Sampling Method and Stress Factors, Anal. Biochemistry, 297, 160-169, (2001).

VARGA C. M, Wickham T. J., Lauffenburger D. A., Receptor-Mediated Targeting of

Gene Delivery Vectors: Insights from Molecular Mechanisms for Improved Vehicle

Design, Biotechnol Bioeng., Dec 20; 70(6), 593-605, (2000).

VLASSOV V. V., Balakireva L. A., Yakubov L. A., Transport of Oligonucleotides

Across Natural and Model Membranes, Biochim Biophys Acta, 1197, 95-108, (1994).

303

WALTHER W., Stein U., Viral Vectors for Gene Transfer: A Review of Their Use in

the Treatment of Human Diseases, Drugs, Aug;60(2), 249-71, (2000).

WANG X. T., Liu P. Y., Xin K. Q., Tang J. B., Tendon Healing In Vitro: bFGF Gene

Transfer to Tenocytes by Adeno-Associated Viral Vectors Promotes Expression of

Collagen Genes, J. Hand Surg [Am]. Nov;30(6), 1255-61, (2005).

WANG, Binghe, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), Drug Delivery:

Principles and Applications, John Wiley & Sons, Inc., (2005).

WANG, G., Liposomes as Drug Delivery Vehicles, In: Drug Delivery: Principles and

Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley

& Sons, Inc., (2005), Pp: 411-434.

WASUNGU L., Scarzello M., van Dam G., Molema G., Wagenaar A., Engberts J. B.,

Hoekstra D., Transfection Mediated by pH-Sensitive Sugar-Based Gemini

Surfactants; Potential for In Vivo Gene Therapy Applications, J. Mol Med., Jun 8,

(2006).

WHITTLESEY K. J., Shea L. D., Nerve Growth Factor Expression by PLG-Mediated

Lipofection, Biomaterials, Apr; 27 (11), 2477-86, (2006).

WILSON D. R., Viral-Mediated Gene Transfer for Cancer Treatment, Curr Pharm

Biotechnol., Jun;3(2), 151-64, (2002).

YOUNG L. S., Searle P. F., Onion D., Mautner V., Viral Gene Therapy Strategies:

From Basic Science to Clinical Application, J. Pathol., Jan;208(2), 299-318, (2006).

ZHANG X., Godbey W.T., Viral Vectors for Gene Delivery in Tissue Engineering, Adv

Drug Deliv Rev., Jun 6, (2006).

ZHOU X, Huang L., Improved encapsulation of DNA in pH sensitive liposomes for

transfection, Liposome Research, 2, 125-139, (1992).

304

ZHOU X. H., Po, A. L. W. Pulmonary Delivery of Drugs Organ-selective action of an

antitumor drug: pharmacologic studies of liposome-encapsulated beta-cytosine

arabinoside administered via the respiratory system of the rat, J. Natl. Cancer Inst.,

63, 727-731, (1979).

ZHOU X., Klibanov A. L., Huang L., Encapsulation/Delivery of Proteins Interactions

of proteins and drugs with liposomes, In: Liposomes, Ostro M., (Ed.), Marcel Dekker,

New York, (1983) Pp: 53-86.

ZHU N., Liggitt D., Phillip M., Dazin P., Debs R., In Vivo Gene Delivery. Efficient

Transfection of T lymphocytes in Adult Mice, J. Biol. Chem., 268, 16087-16090,

(1993).

ZUNDEL, G. Polar Interactions, Hydration, Proton Conduction and Conformation of

Biological Systems – Infrared Results, , in: W. Hoppe, W. Lohmann, H. Markl, H.

Ziegler (Eds.), Biophysics, Springer-Verlag, Berlin, Hedelberg, New York, Tokyo,

(1983). Pp: 243-254.

305

Gen Taşıyıcı Tasarımlarında Kullanılan Çeşitli DNA Kompaktizasyon

Molekülleri

Tablo yapımında kullanılan kaynaklar62:

[1] http://www.wiley.co.uk/wileychi/genmed/clinical/index.html.; [2] ZIAUDDIN J.,

Sabatini D. M., Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature,411 (6833),

107–10, (2001). [3] MARTIN-HERRANZ A., Ahmad A., Evans H. M., Ewert K.,

Schulze U., Safinya C. R., Surface functionalized cationic lipid-DNA complexes for

gene delivery: PEGylated lamellar complexes exhibit distinct DNA-DNA interaction

regimes. Biophys J 86(2), 1160–8, (2004). [4] BOULANGER C., Di Giorgio C.,

Gaucheron J., Vierling P., Transfection with fluorinated lipoplexes based on new

fluorinated cationic lipids and in the presence of a bile salt surfactant. Bioconjug

Chem 15(4), 901–8, (2004). [5] SEGURA T., Shea L. D., Materials for non-viral gene

delivery, Annu Rev Mater Res, 31, 25–46, (2001). [6] Anderson D. G., Lynn D. M.,

62

Tablo takibi daha kolay olması açısından burada yer alan kaynaklar Yararlanılan Kaynak Listesine dahil edilmemiştir.

306

Langer R., Semi-automated synthesis and screening of a large library of degradable

cationic polymers for gene delivery, Angew Chem Int Ed Engl, 42(27), 3153–8,

(2003). [7] EWERT K., Ahmad A., Evans H. M., Safinya C. R., Cationic lipid–DNA

complexes for non-viral gene therapy: relating supramolecular structures to cellular

pathways. Expert Opin Biol Ther, 5(1), 33–53, (2005). [8] TRANCHANT I.,

Thompson B., Nicolazzi C., Mignet N., Scherman D., Physicochemical optimisation of

plasmid delivery by cationic lipids. J Gene Med, 6 (Suppl 1), S24–35, (2004). [9]

BOUSSIF O., Lezoualc’h F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B.,

et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and

in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad Sci USA, 92(16), 7297–301, (1995). [10]

BRAUN C. S., Vetro J. A., Tomalia D. A., Koe G. S., Koe J. G., Russell Middaugh C.,

Structure/function relationships of polyamidoamine/DNA dendrimers. as gene

delivery vehicles. J Pharm Sci , 94 (2), 423–36, (2005). [11] WANG J., Zhang P. C.,

Mao H. Q., Leong K. W., Enhanced gene expression in mouse muscle by sustained

release of plasmid DNA using PPE-EA as a carrier, Gene Ther,9 (18), 1254–61,

(2002). [12] AKINC A., Lynn D. M., Anderson D. G., Langer R., Parallel synthesis and

biophysical characterization of a degradable polymer library for gene delivery, J Am

Chem Soc, 125 (18), 5316–23, (2003). [13] NEU M., Fischer D., Kissel T., Recent

advances in rational gene transfer vector design based on poly(ethylene imine) and

its derivatives, J Gene Med, 7 (8), 992–1009, (2005). [14] SCHAFFER D. V.,

Fidelman N. A., Dan N., Lauffenburger D. A.. Vector unpacking as a potential barrier

for receptor-mediated polyplex gene delivery, Biotechnol Bioeng., 67(5), 598–606,

(2000). [15] AGARWAL A., Unfer R., Mallapragada S. K., Novel cationic pentablock

copolymers as non-viral vectors for gene therapy. J Control Release,;103 (1), 245–58,

(2005). [16] REINEKE T. M., Davis M. E., Structural effects of carbohydrate-

containing polycations on gene delivery. 1. Carbohydrate size and its distance from

charge centers, Bioconjug Chem, 14 (1), 247–54, (2003). [17] POPIELARSKI S. R.,

Mishra S., Davis M. E.. Structural effects of carbohydrate-containing polycations on

gene delivery. 3. Cyclodextrin type and functionalization, Bioconjug Chem,14 (3),

672–8, (2003).

Ek-9 LİPOZOM HAZIRLAMA YÖNTEMLERİ63,64

63

Bu bölümde lipozomlarla ilgili sadece genel bilgiler yer almaktadır. Modern farmasötik biliminde çok sayıda kullanım alanlarıyla ilgili güncel makalelerin ve derlemelerin de bulunduğu Referanslar listesine başvurulmalıdır.

307

Lipid Vezikülleri (Lipozom) Hazırlama Yöntemleri

Lipozomlar veya veziküller üç boyutlu olmaları itibariyle doğal hücrelere

benzeyen fosfolipidler gibi amfifilik (Şekil E5.1) moleküllerin kendi kendine

oluşturdukları (self-assembling) yapılara sahip yuvarlak agregatlardır. Lipozomlar ilk

olarak A. D. Bangham65,66 1960lı yıllarda keşfedildiler. Yüksek biyoyararlılıkları ve

çeşitli molekül ve maddelerin vezikül hacmi içinde yüksek miktarda enkapsüle

64 Bu bölümün hazırlanmasında: Wang, G., Liposomes as Drug Delivery Vehicles, In: Drug Delivery:

Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John Wiley & Sons,

Inc., (2005), Pp: 411-434; Kobayashi, N., Nishikawa, M., and Takakura, Y., Gene Therapy and Gene Delivery,

In: Drug Delivery: Principles and Applications, Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), John

Wiley & Sons, Inc., (2005), Pp: 305-318; Binghe Wang, Teruna Siahaan, and Richard Soltero (Eds.), Drug

Delivery: Principles and Applications, John Wiley & Sons, Inc., (2005)’dan yararlanılmıştır.

65

Bangham, A. D., Horne, R. W., Nature, 196, (1962), 952-953. 66

Bangham, A. D., Horne, R. W., J. Mol. Biol., 8, (1964), 660-668.

308

edilebilmeleri bakımından, lipid vezikülleri o yıllarda mükemmel bir ilâç taşıma aracı

olarak değerlendirilmişlerdir.

Lipozomların çeşitli türleri (MLV, SUV, LUV, FRV) uygulanmakta olan birçok

yöntemi kullanarak hazırlamak mümkündür (Şekil E5.2 ve E5.6). Projemizde çok

popüler bir yöntem olan “hand-shaken vesicles preparation” yöntemi uygulanmıştır.

Lipozomların herhangi bir formülasyonunu hazırlamak için lipid moleküllerini önce

sıvı ortamına aktarmak gerekmektedir. Orijinal prosedüre uygun olarak, ince tabaka

lipid filmi yuvarlak balon jojeye konulmak suretiyle bunların daha sonra sıvı

ortamında çalkalanması ve çözülmesi sağlanmaktadır (Şekil E5.3 ve E5.4).

İlâç formülasyonları, gen taşıyıcıları ve kanser tedavilerinde kullanılan çeşitli

farmasötik bileşenlerinin enkapsülasyonu gibi alanlardaki uygulanmaları dışında,

lamelar veziküller biyomembran modelleri olarak da çok önem kazanmışlardır

(WANG, et. al., 2005; KOBAYASHI, et. al, 2005 WANG, et. al., 2005). Lipozomlar

özellikle bağışıklık sisteminin fagositlerine yönelik ilâç hedeflendirilmesinde etkilidir.

Lipozomlara dayalı ilâç taşıyıcısistemleri terapötik endeksi ve biyoyararlılığı

iyileştirebildikleri gibi, kontrollü salınım sistemlerinin etkinliğini artırırlar ve

toksisiteyi düşürürler. Bu bileşenler, antikanser, DNA ve proteinlerin, diabet ve

kardiyovasküler hastalıklara karşı ilâçların taşıyıcıları olarak kullanılmışlardır.

Keşfedildiklerinden itibaren, birçok lipozomal formülasyon klinik araştırmalarda

uygulanmıştır ve birkaç başarılı lipozom’a dayalı ilâç formülasyonu patent olarak

Food and Drug Administration (FDA) tarafından kabul edilmiş ve

ruhsatlandırılmıştır. Bunlar arasında doxorubicin (Doxil ve Myocet), daunorubicin

(DaunoXome) gibi antikanser ilâçları ve mantarlara karşı kullanılan amphotericin B

(AmBisome, Amphotect, ABELCET) formülasyonları örnek olarak verilebilir. Bu

ilâçların lipozomal formülasyonları önemli ölçüde toksisiteyi düşürmüşlerdir ve etken

maddelerin etkinliğini korumuş veya yükseltmişlerdir.

Son yıllarda lipozomlar viral olmayan gen taşıyıcı tasarımlarında da yoğun

olarak yer almakta ve uygulanmaktadır67.

67 Bkz: Referanslar listesini.

309

Ancak, lipozomal ilâç ve gen taşıyıcı sistemlerinin terapötik potansiyellerine tam

olarak henüz daha ulaşılamamıştır. Bunun nedenlerinden biri, bu taşıyıcı sistemlerle

karşılaşılan birçok tasarım ve uygulama sorunlarının olmasıdır. Bu sorunlar arasında

sabitlilik, salınım zamanı ve hızı, formülasyon maaliyeti, kısa süren biyoyararlılık ve

birçok ilâçla etkisiz etkileşmelerin olduğu durumlar sayılabilir. Ayrıca, sirkülasyonda

sabitliliğini destekleyerek aynı zamanda söz konusu ilâçın hedef dokudaki

biyoyararlılığını seçici olarak artırmak çok güçtür (WANG, 2005).

1. Vezikül Oluşumunun Mekanizması.

Lipozomlar (lipid vezikülleri) ince tabaka lipid filmlerinin veya diğer lipid

yüzeylerinin hidrasyonu sonucu oluşurlar (Şekil E5.1). Bu yapılarda sıvı kristal

şeklinde bulunan lipid katmanları akışkan hale gelir. Hidrasyonu meydana gelmiş

lipid katmanların agitasyon ve çalkalama esnasında bulundukları balon jojenin veya

kabbın iç yüzeyinden ayrılırlar ve daha büyük yuvarlak çok katmanlı veziküller (Large

Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur. Kenarlarda katmanın hidrokarbon kısmının su

ile etkileşmeleri engellendiğinden, bu yapı termodinamik açıdan da bakılacak olursa

çok sağlam ve sabittir. Parçacıkların oluşumundan sonra boyutlarının

düşürülmesisonik enerjinin (sonication) veya mekanik enerjinin (extrusion)

harcanmasını gerektirmektedir.

2. Lipozom Hazırlama Yöntemleri.

Lipid formülasyonların özellikleri lipid içeriğine (katyonik, anyonik veya nötr

lipidler) bağlıdır, ancak, aynı hazırlama prosedürü tüm lipid veziküllerin

hazırlanmasında lipid türü önem taşımaksızın uygulanabilmektedir (Şekil E5.2).

Genel olarak, prosedür hidrasyon için lipidin hazırlanması, eşzamanlı

gerçekleştirilen hidrasyon, agitasyon ve çalkalama ve veziküllerin homojen

dağlımının sağlanması için yapılan boyutlandırma aşamalarından ibarettir.

310

Şekil E5.1: Lipozomların genel yapısı. Kaynak: www.cem.msu.edu/~reusch/

VirtualText/lipids.htm

Şekil E5.2: Çeşitli lipozom formülasyonlarının hazırlama yöntemlerini özetleyen

genel klasifikasyon. SUV, small unilamellar vesicles; MLV, multilamellar vesicles;

LUV, large unilamellar vesicles; FRV, freeze-drying rehydration vesicles. Kaynak:

LASCH, J. Weissig, V. and Brandl, M. Preparation of liposomes, In: Liposomes. A

311

Practical Approach, 2nd Ed. (Torchilin Vl. P. And Weissig, V., Eds.), Oxford

University Press, (2003), Pp: 3-29.

a. Hidrasyon İşlemi.

Lipid karışımlarından oluşan lipozomları hazırlarken, lipidler ilk önce organik

çözgende çözülmeli ve homojen lipid karışımının elde edilmesi için iyice

karıştırılmalıdır. Genelde, bu işlem kloroform veya kloroform:metanol karışımı

kullanılarak gerçekleştirilir (TORCHILIN, et. al., 2003). Burada amaç, lipidlerin tam

olarak karışımını sağlamak için temiz lipid çözeltinin elde edilmesidir. Genel olarak,

lipid çözeltileri 10-20 mg lipid/ml organik çözgen konsantrasyonunda hazırlanır.

Ancak, lipid çözünürlülüğü veya lipidlerin tam olarak karışımı isteniliyorsa, daha

yüksek konsantrasyonlarla çalışmak avantajlıdır (TORCHILIN, et. al., 2003). Organik

çözgende lipidlerin çözülmesinden sonra, bu çözücüyü azot veya argon gazı ile

uzaklaştırarak ince lipid filmi elde edilir. Daha küçük organik çözgen hacimleri ile

çalışılıyorsa (<1 ml), bu işlem iyi neticeler verir (TORCHILIN, et. al., 2003). Daha

büyük organik çözgen hacimlerinin söz konusu olduğunda ise uzaklaştırma işlemi

rotary evaporator ile gerçekleştirilir. Her iki işlem sonucunda da balon jojenin

dibinde ince lipid filmi veya tabakası oluşmaktadır. Muhtemelen bu ortamda kalan

organik çözgeni uzaklaştırmak amacıyla, bu film daha sonra bir gece boyunca vaküm

pompa ile kurutulur. Kloroform kullanımı tercih edilmiyorsa, onun yerine lipidleri

tersiyer butanol veyasikloheksanda çözmek de mümkündür. Lipid çözeltisi kaplara

aktarılır ve kuru buz veya kuru buz-aseton karışımıyla veya alkol (etanol veya

metanol) banyosuna konularak dondurulur. Banyoda konulduğu takdirde, ani ısı

değişiklerinden kaynaklanabilecek olan muhtemel kap çatlamasını engellemek için

dikkat edilmeli. Tam olarak dondurulduktan sonra, lipidin içinde bulunduğu kap

vaküm pompaya bağlanır ve lipid filminin kuruyuncaya kadar liyofilize edilir. Bu

işlem elde edilmesi istenilen lipid hacmine göre değişir ve genelde 1 ile 3 gün arasında

sürer. Bunun ardından, kurutulmuş lipid filmi bulunduran balon joje vaküm

pompadan çıkarılır ve tekrar bir sonraki hidrasyon için dondurulmuş vaziyette

muhafaza edilir.

b. Lipid Filminin Hidrasyonu.

Kuru lipid filminin hidrasyonu basitçe sıvı ortamın veya tampon çözeltisinin

lipidin bulunduğu balon jojeye katarak ve çalkalayarak gerçekleştirilir. Hidrasyon

312

ortamının ısısı kullanılan lipidin genel jel-sıvı kristal faz geçiş ısısından (Tc veya Tm)

daha yüksek olmalı. Bu işlemden sonra lipid süspansiyonu, bulunduğu kendi ortam

ısısının söz konusu Tm ‘in üzerinde olacak şekilde muhafaza edilmelidir. Yüksek faz

geçişine sahip lipidler için bu işlemi balon joje içinde bulunan lipidleri rotary

evaporator sistemine bağlayarak vaküm kullanılmaksızın gerçekleştirmek

mümkündür. Daha sonra, bu balon jojeyi yine önceden lipid süspansyon ısısısnın

üzerinde bulunan bir ısı ortamında ısıtılmış su banyosuna aktarılarak ve çalkalayarak

lipidin hidrasyonunu gerçekleştirerek lipidlerin akışkan fazı elde edilmiş olur. Lipid

türüne bağlı olarak hidrasyon için gereken zaman değişmekte, ancak bu işlemin

çalkalama ve vorteksleme zamanları ile birlikte, genelde bir saati aşmamasına özen

gösterilir. Bazı durumlarda, veziküllerin boyut dağılımı ve homojeniteleri

iyileştirildiğinden, bundan sonraki aşama olan vezikül boyutlandırma işlemine

geçmeden önce, lipid süspansyonu bu şekilde bir gece bekletilir68.

Hidrasyon ortamını genelde lipid veziküllerin uygulama amacı tayin eder. Uygun

hidrasyon ortamı, distile su, tampon çözeltileri, tuzları, ve şeker çözeltileri gibi

elektrolit olmayan bileşenleri içerir. In vivo uygulamalar için fizyolojik osmolalitede

(290 mOsm/kg) çalışmak tavsiye edilir (TORCHILIN, et. al., 2003). Bu

gereksinimleri karşılayan genel olarak kullanılan bir çözelti: 0.9% tuz, 5% dekstroz ve

10% sukroz’u içerir. Hidrasyon esnasında, bazı lipidler yapılarına özgü kompleksler

oluştururlar. Yüksek düzeyde yük taşıyan lipidlerin hidrasyonları esnasında ve düşük

pI’e sahip çözeltilerde, vis köz jel oluşturdukları görülmüştür (TORCHILIN, et. al.,

2003). Bu sorun, ortama tuzların katılması veya vezikül boyutlarının düşürülmesiyle

giderilebilir. Fosfatidiletanolamin gibi hidrasyonu zor olan lipidler kendi kendine

agregatlar oluştururlar. >60% fosfatidiletanolamin içeren veziküller vezikül etrafında

oluşan düşük hidrasyon tabakasına sahiptir. Bu durumda bu fosfolipidten oluşan

veziküller arasında uzaklaştırıcı kuvvetlerin zayıflaması sonucu birbirine çok yaklaşıp

birbirleri bağlanarak daha büyük agregatlar oluştururlar (). Bu parçacıklar çözeltide

daha büyük dispers flokülasyonlar olarak meydana gelir. Hidrasyonun sonucunda,

büyük çok katmanlı veziküller (Large Multilamellar Vesicles, LMV) oluşur.

Katmanlar arasında bulunan lipid yüzeyleri su katmanı ile çevrilidir. Aralarında

oluşan mesafe lipid katmanlarındaki lipid içeriğine bağlıdır. Örneğin, polihidre 68

Bu olay “aging” olarak da adlandırılmaktadır. Ancak, lipid hidrolizinin meydana gelme olasılığının yüksek derecelerde artığından, bu işlem yüksek faz geçişine sahip lipidlere uygulanması tercih edilmez (TORCHILIN, et. al., 2003).

313

katmanlar, elektrostatik uzaklaştırma neticesinde oluşan yüklü lipid katmanlarına

göre birbirine daha yakın bir mesafede oluşurlar. Sabit, hidrasyonu gerçekleştirilmiş

çok katmanlı veziküllerin (Large Multilamellar Vesicles, LMV) elde edilmesinden

sonra, bu parçacıkların boyutları sonication ve extrusion gibi birçok yöntem

kullanılarak düşürülür (TORCHILIN, et. al., 2003).

c. Lipid Süspansyonlarının Boyutlandırılması

Sonication

LMV süspansyonlarının sonik enerji (sonication) kullanarak parçalanması

tipik olarak çapları 15-50 nm arasında değişen küçük, tek katmanlı veziküllerin (SUV)

oluşmuuna neden olur. Bunu gerçekleştirmek için kullanılan cihazlar “probe tip

sonicators” olarak bilinmektedir. Ancak bu yöntem birçok tercih edilmeyen yan

etkilere de sahiptir. Örneğin, bu yöntemi kullanarak elde edilen küçük tek katmanlı

veziküller sabit değildir ve zamanla agregasyonlar neticesinde çapları daha büyük

olan agregatlara dönüşürler. Sonuç olarak, elde edilen lipozom formülasyonları son

derece heterojendir. Ayrıca, sonikasyon lipid peroksidasyonlara da neden olmuştur.

Bu peroksidasyonları engellemek amacıyla araştırmacılar lipozom formülasyonlarına

lipid koruyucu ve antioksidan etkilerine sahip α-tokoferol (Vitamin E) katmışlardır.

Ancak bu vitaminin büyük hacmi lipozomların daha sonraki boyut incelemelerini ve

spektroskopik araştırmalarını çok sayıda yan sinyal verdiklerinden olumsuz olarak

etkilemştir. Bu yüzden günümüzde tek katmanlı lipid veziküllerinin elde edilmesinde

kullanılan diğer bir yöntem olan extrusion yöntemi tercih edilmektedir.

Extrusion

Bu yöntemde lipid süspansyonu önceden bilinen ve tercih edilen por

büyüklüğüne sahip 2 polikarbonat filtre üzerinden 10 defa geçirilerek bu por

büyüklüğüne yakın boyuttaki tek katmanlı veziküller elde edilir. Bu yöntem

sayesinde ortalama olarak söz konusu tek katmanlı veziküllerin boyut dağlımı son

derece homojendir. Şimdiye kadar bahsedilen tüm diğer lipozom boyutunun

düşürülmesinde kullanılan yöntemlerde olduğu gibi burada da bu işlem lipidin faz

geçiş derecesinin üzerinde bir değerde çalışılması gerekmektedir. Aksi takdirde, bu

derecenin altında lipidlerin rijid olduklarından ve bu yüzden de polikarbonat

filtresindeki porlara yapışıp tıkanmalarına neden olduklarından, bu işlem

314

başarısızlıkla sonuçlanacaktır. 100 nm por büyüklüğüne sahip filtreden

geçirildiklerinde MLV genelde ortalama olarak çapları 120-140 nm arasında değişen

büyük, tek katmanlı (large unilamellar vesicles (LUV))’i meydana getirir. Bu işlem

sunucunda, elde edilen lipozomların boyutu particle sizer cihazıyla teyit edilir. Bu

ortalama partikül boyutu ayrıca lipid içeriğine bağlıdır ancak son derece

tekrarlanabilir bir prosedürdür.

Şekil E5.3 Çok katmanlı veziküllerin hazırlanması enasında oluşan fosfolipid yapıları.

Kaynak: http://www.avantilipids.com

315

Şekil E5.4 MLV’lerin hazırlanmasındaki üç aşamanın şematik gösterimi. 1: Önceden

oluşturulan kurutulmuş ince tabaka lipidlere sıvı fazın katılması; 2: Balon jojeyi

çalkalama ve ısıtma neticesinde lipid filmin erimesi ve çözülmesi; 3: Ekvilibre edilmiş

MLVlerin sütsü süspansyonu. Kaynak: http://www.avantilipids.com

316

Şekil.E5.5: Makromoleküler enkapsülasyon amaçlı tasarlanan çeşitli lipozomlar.

Kaynak: www.unizh.ch/ onkwww/lipos.htm

317

Şekil E5.6: Çeşitli Lipozom boyutları. Kaynak: www.azonano.com/details.

asp?ArticleID=1243

EK-10 TEK KATMANLI LİPOZOMLARIN HACMİ, ÇAPI, SAYILARI, ALANLARI

VE LİPİD AĞIRLIĞI ARASINDAKI İLİŞKİYİ GÖSTEREN BİR NOMOGRAM69

69 Johnes, G. R. and Cossins, A. R., Lposomes-A Practical Approach, IRL Pres, (1990)’tan alınmıştır.

318

319

Ek-18 ÖZGEÇMİŞ

320

CURRICULUM VITAE

Name and Surname: Erhan Süleymanoğlu

Date of Birth: 22.03.1967 in Sofia, Bulgaria.

Citizenship: The Netherlands, Bulgaria and Turkey (Trial Citizenship)

Home Address:

Gazi Mahallesi,

Polatlı Caddesi, No:115/5,

Yenimahalle,

06560-Ankara,

Turkey

Tel.: (00-90)-5423527265

Home tel.: (00-90-312)-211-19-47

E-mail: esuleymanoglu@gazi.edu.tr,

erhan@berlin.com

and erhans@mail.ru

http://erhan.boom.ru

Non-academic Affiliations:

November 1992-January 1993: Official translator and consultant on Russian

Federation of Sutek Trade and Construction Co. Ltd.- Ankara, Turkey.

1993-present: Authorized translator of 9th Notarial Service - Ankara, Turkey.

2001-2002: Foreign Affairs Officer of DEM İLÂÇ PHARMACEUTICALS Co. Ltd. -

official distributor of Instituto Grifols, S.A. (Barcelona, Spain) in Turkey and advisor

on authorization of medicinal products to be submitted to The Turkish Ministry of

Health for further approval.

2004-present: Member of The Editorial Board of Electronic Journal of Biomedicine

(University Hospital Yägue-Burgos, Spain): http://biomed.uninet.edu

321

2006-present: Member of The Editorial Board of International Journal of

Biomedical Sciences (www.ijbs.org).

Primary Education:

1974-1985: Russian Language High School - Sofia and in parallel UNESCO English

Language School - Sofia, Bulgaria.

Academic Achievements and Research Experience:

1989: B.Sc. Programme in Biotechnology - The Biotechnology Centre of The Sofia

University - Sofia, Bulgaria.

1992: B.Sc. in Biology - Middle East Technical University, Department of Biology -

Ankara, Turkey.

1995: M.Sc. in Biochemistry, Institute of Natural and Applied Sciences, Department

of Biochemistry - Middle East Technical University - Ankara, Turkey (M.Sc. Thesis

Topic: "Effect of Metal Ions on Interaction Between Nucleic Acid, Protein (Melittin)

and Drug (Tamoxifen) with Model Membranes").

Predoctoral Training:

October 1996-March 1997: University of Vienna, Medical Faculty, VIENNA

BIOCENTER, Molecular Virology Group - Vienna, Austria (Research Topic: "Study of

the Interaction Between Neutralizing Antibodies with Human Rhinoviruses from the

Minor Receptor Group").

2001: Ph.D. in Biochemsitry, Institute of Biochemistry, University of Vienna, Medical

Faculty, VIENNA BIOCENTER (Ph.D. Thesis Topic: "Cloning and Characterization of

Human Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein (hnRNP) A3 - a Novel Member of

the hnRNP A/B Family"; Abstract available at: www.arcs.ac.at/dissdb/rn036425).

322

Post-doctoral Research:

January 2000-September 2001: Swammerdam Institute for Life Sciences, Section of

Molecular Cytology, University of Amsterdam, BioCentrum Amsterdam -

Amsterdam, The Netherlands (Research Topic: "Prokaryotic DNA Organization:

Balancing Physical and Physiological Forces").

Assistantships and Other Research Appointments:

1. September 1994-April 1996: Research assistantship at Gazi University, Medical

Faculty, Department of Biophysics - Ankara, Turkey (Duties included teaching

general physics with laboratory section to medical students and performing research

on effects of electromagnetic fields on living cells and tissues).

2. January-February 1997: Guest scientist at University of Bergen, Faculty of

Medicine, Pre-clinical Institutes, Institute of Biochemistry and Molecular Biology -

Bergen, Norway (Research Topic: "Acyl Chain Specificity in Phospholipid Metabolism

and Signal Transduction in Brain" - The European Union supported project).

3. June 1997: Guest scientist at J.A. Comenius University, Faculty of Pharmacy,

Department of Physical Chemistry, Biophysics Section - Bratislava, Slovakia, and at

The Slovak Academy of Sciences, Institute of Experimental Physics, Department of

Biophysics - Kosice, Slovakia (Research Topic: "Differential Scanning Calorimetric

Studies on the Effect of Metal Ions on Interaction Between Phospholipid Membranes

with Nucleic Acids, Immunomodulators and Surfactants").

4. April-May 1999: Guest researcher at Institut Curie, UMR-216 du CNRS - Genetique

et Chemie des Genomes Eucaryotes; bat. 110, Centre Universitair Paris - Sud, Orsay

Cedex - France (Research Topic: "Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy

of RNA-Protein Folding Patterns in Ribonucleoprotein Particles and Their Role in

Autoimmune Diseases").

5. March 1999: Guest researcher at Institute of Chemical Technology, NMR

Laboratory - Prague, Czech Republic (Research Topic: "NMR Spectroscopy of RNA-

Protein Recognition in hnRNP particles - Implications for Disease Specific Epitope

Formation").

323

6. October 2000 - February 2001: Guest researcher at Department of Molecular Cell

Physiology and Mathematical Biochemistry, BioCentrum Amsterdam, Free

University of Amsterdam - Amsterdam, The Netherlands (Research Topic: "Physics

and Molecular Physiology of DNA Supercoiling").

Scholarships Awarded:

1. 1985-1989: Scholarship of The Chemicopharmaceutical Research Institute

(НИХФИ-СОФИЯ) - Sofia, Bulgaria.

2. 1993-1995: Scholarship of The Technical and Research Council of Turkey

(TÜBİTAK) for research on protein folding and denaturation mechanisms of citrate

synthase - in collaboration with University of Bath - United Kingdom.

3. 1996-1999: Ph. D. Scholarship of The Austrian Government.

Publications:

1. Severcan, F., Süleymanoğlu, E., Boyar, H. Turbidity studies of the effect of divalent

cations on Tamoxifen - model membrane interactions. Biochem. Soc. Trans., 25 (3):

493S, (1997).

2. Huber, W., Süleymanoğlu, E., et. al. The hnRNP-D/AUF proteins - a novel group of

autoantigens in rheumatology - In: Pathogenesis and Diagnostic Relevance of

Autoantibodies; Report on the 4th Dresden Symposium on Autoantibodies, hold in

Dresden - Germany on Octomber 21-24, (1998); Conrad, K., Humbel, R-L., Muerer,

M., Shoenfeld, Y., E.M.T., (Eds.) PABST Publishers.

3. Skriner, K., Huber, W., Süleymanoğlu, E., Smolen, J., Steiner, G. Are mRNA decay

complexes target structures in systemic autoimmune diseases? Arthritis and

Rheumatism, 43 (9), Suppl. S, Sept. (2000).

4. Cunha, S., Odijk, T., Süleymanoğlu, E., Woldringh, C.L. Isolation of Escherichia

coli nucleoid. Biochimie, Feb., 83 (2): 149-154, (2001).

324

5. Süleymanoğlu, E. Electrorelease of Escherichia coli nucleoids. Folia Microbiol. 47

(4): 365-370, (2002).

6. Süleymanoğlu, E. Fluorescence microscopy of condensed DNA conformations of

bacterial cells. J. Microbiol. 40 (4): 319-326, (2002).

7. Steiner, G., Cervenak, Z., Skriner, K. and Süleymanoğlu, E. Molecular cloning,

expression and immunochemical properties of new human hnRNP A/B type

autoantigen, Biomedica, 19: 8-17, Jul.-Dec. (2003).

8. Süleymanoğlu, E. Molecular phylogenetics and functional evolution of major RNA

recognition domains of recently cloned and characterized autoimmune RNA-binding

particle, Geno., Prot. & Bioinfo. 1 (4): 310-320, (2003).

9. Süleymanoğlu, E. Circular dichroism and fluorescence spectroscopic study of RNA-

protein folding patterns in human hnRNP A3 and their implications in human

autoimmune diseases. Prog. Biochem. Biophys. 31 (3): 219-224, (2004).

10. Süleymanoğlu E. Preparation and phase behaviour of surface-active

pharmaceuticals: self-assembly of DNA and surfactants with membranes. Differential

adiabatic scanning microcalorimetric study. Il Farmaco, Aug; 60 (8): 701-710,

(2005).

11. Süleymanoğlu E. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Energetics of DNA-

Mg2+-Phosphatidylcholine Ternary Complex Formation and its Further Compaction

as a Gene Delivery Formulation, PDA J. Pharmaceut. Sci. Technol. 60 (4): 218-231,

(2006).

12. Phoshpolipid-Nucleic Acid Recognition: Developing an Immobilized Liposome

Chromatography for DNA Separation and Analysis, PDA J. Pharmaceut. Sci.

Technol. 60 (4): 232-239, (2006).

15. Manavbasi Y, Suleymanoglu E., Probing Taxol (TM) (Paclitaxel)-cell membrane

interactions with Langmuir-Blodgett monolayer, Fourier transform infrared

spectroscopy and differential scanning calorimetry, FEBS JOURNAL 273: 354-354

Suppl. 1, JUN (2006).

325

16. Manavbaşı Y. and Süleymanoğlu E., Nucleic acid-phospholipid recognition:

Fourier transform infrared spectrometric characterization of ternary phospholipid-

inorganic cation-DNA complex and its relevance to chemicopharmaceutical design of

nanometric liposome based gene delivery formulations. Arch Pharm Res., Aug; 30

(8): 1027-40, (2007).

17. Karl Skriner, Wolfgang Hueber, Erhan Süleymanoglu, Elisabeth Höfler, Veit Kren,

Josef Smolen and Günter Steiner, The Regulator of TNFα mRNA Decay AU-rich

Element Binding Factor 1 is Targeted by Autoantibodies of Patients with Systemic

Rheumatic Diseases, (accepted for publication in Rheumatism and Arthritis-2007).

Books:

Hayriye S. Yenisoy, Nergiz Aksoy and Erhan Süleymanoglu, Contemprorary

Bulgarian, published by Kurmay Yayınevi (www.kurmayyayinevi.com)-2007.

Conferences and Workshops Attended:

1. Intensive Course on Protein Structure, Function and Stability, April 18-22, 1994,

Ankara - Turkey; Organized by Middle East Technical University - Ankara, Turkey

and University of Bath - United Kingdom.

2. Turbidimetric Study of Interaction Between Polyribonucleotides,

Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, NATO Advanced Study Institute:

Trafficking of Intracellular Membranes: From Molecular Sorting to Membrane

Fusion, June 19-30, 1994, Espinho, Portugal.

3. Spectrophotometric Study of the Interaction Between Polyribonucleotides,

Phosphatidylcholine Vesicles and Metal Ions, VIth National Biophysical Congress,

September 28-30, 1994, Silivri - Istanbul, Turkey.

4. Calcium/Magnesium Specificity in Modulation of Phospholipid Phase Transition

Induced by Tamoxifen, NATO Advanced Study Institute: Molecular Dynamics of

Biomembranes, June 19 - July 1, 1995, Cargese, Corsica, France.

5. Self-Assembly of Lipid Vesicles and Polyribonucleotides - An Inorganic

Perspectives for the Origin of Life, NATO Advanced Study Institute: Solvents and

Self-Organization of Polymers, July 23, 1995, Belek, Antalya, Turkey.

326

6. Self-Assembly of Lipid Droplets and Polyribonucleotides or Primordial Soup

Revisited, ISSOL'96: International Conference on The Origin of Life, July 7 - 12,

1996, Orleans, France.

7. Self-Association of Melittin with Model Membranes, Winter School of Biophysics:

Biophysical Aspects of Protein Folding; Organized by Stockholm Graduate School in

Biophysics, as a joint programme between The Karolinska Institute, The Royal

Institute of Technology and Stockholm University, April 1 - 4, 1997.

8. International Workshop on Modern Spectroscopic Techniques in Biophysics, June

1 - 5, 1998, Neptun, Romania.

9. 1998 Joint Meeting and Symposium of Clinical Biochemistry: New Trends in

Clinical Biochemistry of Transplantation, Artis Tower Hotel - Vienna, Austria;

Organized by Austrian Society for Clinical Chemistry and Instituto di Semiotica

Medica, Universita degli Studi Padova - Italia and Society Italiana Di Biochemica

Clinica.

10. The hnRNP-D/AUF Proteins - A Novel Group of Autoantigens in Rheumatology,

National Scientific Meeting, Arthritis and Rheumatism - Abstract Supplement, Vol.

41, No: 9, Sept. S349, November 8-12, 1998, San Diego, California, U.S.A.

11. The hnRNP-D/AUF Proteins - a Novel Group of Autoantigens in SLE, MCTD and

RA, XVIII European Workshop for Rheumatology Research, March 12 - 15, 1998,

Athens, Greece.

12. ISPPP98 - 18th International Symposium on the Separation and Analysis of

Proteins, Peptides and Polynucleotides, November 1 - 4, 1998, Hilton Hotel - Vienna,

Austria.

13. The hnRNP A/B type proteins - major molecular targets in rheumatic

autoimmune disease, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27

June, 1999, University of Edinburgh, Scotland.

14. Cloning of a novel hnRNP A/B type protein highly homologous to hnRNP-A3

from X. laevis, RNA'99: The 4th Annual Meeting of the RNA Society, 23-27 June,

1999, University of Edinburgh, Scotland.

327

15. Identification of a novel autoantigen highly related to hnRNP-A2/RA33, The

19th European Workshop for Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway.

16. Epitope Mapping of hnRNP-D/AUF-1 proteins, The 19th European Workshop for

Rheumatology Research, 1999, Oslo, Norway.

17. The hnRNP-D/AUF-1 Proteins - Novel Autoantigens in Rheumatology, 4th

European Conference on Systemic Lupus Erythematosus; Organized by Vienna

Academy of Postgraduate Medical Education and Research, January 23 - 26, 1999,

Vienna, Austria.

18. Thermodynamics of nucleic acid-membrane-self-assembly as a precellular

precursors and the emerging role of Ca2+ and Mg2+ as condensing agents, 12th

International Conference on the Origin of Life and 9th ISSOL Meeting, 11-16, 1999,

San Diego, California, U.S.A.

19. Are mRNA stability complexes target structures in systemic autoimmunity?,

14th European Immunology Meeting, EFIS, Sept. 23-27, 2000, Poznań, Poland.

20. Confocal Light Microscopy: Fundamentals and Biological Applications;

BioCentrum Course with practical training; University of Amsterdam, May 8-12,

2000, Amsterdam, The Netherlands.

21. Visualizing Cellular Processes, 8 June, 2000, Free University of Amsterdam,

Amsterdam, The Netherlands.

22. Analysis of Compaction Forces and Supercoil Content of Isolated E. coli

nucleoids, International Summer School on DNA and Chromosomes: Physical and

Biological Approaches, July 31 - August 12, 2000, Cargese, Corsica, France.

23. Analysis of DNA Compaction within the Bacterial Cell, EMBO Workshop: The

Cell Cycle and Nucleoid Organization in Bacteria; Netherlands Institute for Sea

Research (NIOZ), September 2-6, 2000, Island of Texel, The Netherlands.

24. AiK (The Association for Physics Students) Symposium: Complex Systems,

November 3, 2000, Free University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands.

328

25. Fall Symposium of The Dutch Society for Biochemistry and Molecular Biology:

Into the Living Cell and Beyond, November 7, 2000, BioCentrum Amsterdam - Free

University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlands.

26. Autoantibodies to the mRNA destabilizing protein hnRNP-D/AUF1 in patients with systemic autoimmune diseases, 21st European Workshop for Rheumatology Research, Parkhotel Schönbrunn, Vienna, Austria. 1-4 March 2001, published in Arthritis Res. 2001, 3(Suppl A): P012.

26. Symposium on Live Cell Imaging; Organized by PerkinElmer Life Sciences and

hold at Institute of Molecular Pathology, April 10, 2001, Vienna, Austria.

27. IMMPC - 1: First International Meeting on Medical and Pharmaceutical

Chemistry, September 25-28, 2002, Hotel Ankara Dedeman - Ankara, Turkey.

28. Circular Dichroism and Fluorescence Spectroscopy of RNA - Protein Folding

Patterns and Their Role in Autoimmune Diseases, The Inaugural Austral - Asian

Biospectroscopy Conference: Organized by Monash University - Australia and hold at

the Suranaree University of Technology, Nakhon Ratchasima (Korat) - Thailand,

February 3-7, 2003.

29. Fluorescence Microscopy of Polymer - Induced Phase Separation and Divalent

Cation - Dependent Compaction and Structural Integrity of Bacterial Chromosome,

Bionanotechnology - EuroConference on Biomolecular Devices - Granada, Spain, 9-

14 July, 2003.

30. Macromolecular Crowding and Bacterial DNA Cytoarchitecture - Conference

for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on Moleculur Biology and

Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30 anniversary of the

Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of

Ukraine, 25 - 27 September 2003, Kiev-Ukraine.

31. Adiabatic Differential Scanning Microcalorimetric Study of Divalent Cation -

Induced Neutral Lipid - DNA Nanocondensate Formation Assambled for Gene

Delivery - Conference for Young Scientists, Ph. D. Students and Students on

Moleculur Biology and Genetics - Dedicated to 50 years of the double helix and 30

329

anniversary of the Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy

of Sciences of Ukraine, 25 - 27 September 2003, Kiev-Ukraine.

32. Light Microscopy of Polyethylene Glycol-Induced Phase Separation and

Divalent Cation-Dependent Compaction of Prokaryotic Nucleoids - ELSO-2003:

European Life Scientist Organization - 2003, Dresden, Germany.

33. On-line Dissolution, Advanced Detection Methods and Authomated Method

Development. Workshop organized by Waters Corporation (U.S.A.), Gazi University,

Faculty of Pharmacy 11.03.2004, Ankara, Turkey.

34. Biophysical Aspects of RNA-protein Folding Features in A/B Type hnRNP

Proteins and Their Implications in Human Systemic Autoimmune Pathology, 30th

FEBS Congress and 9th IUBMB Conference - The Protein World, 2 - 7 July, 2005,

Budapest, Hungary.

35. Workshops of Middle East Technical University-Central Laboratory, 1.

Rheological Characterization of Materials; 2. Particle Size Measurement Using

Laser Diffraction Technique; 3. Particle Size Measurement Using Dynamic Light

Scattering Techniques and Zeta Potential Measurement; 4. Thermal Analysis

Techniques, 30.11.2005-21.12.2005, Ankara, Turkey.

36. Thermal Analysis and Rheological Applications in Polymer Field, Workshop

organized by TA Instruments (UK), Gazi University, Faculty of Pharmacy, 21.12.2005,

Ankara, Turkey.

37. Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with Langmuir-Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Differential Scanning Calorimetry, 1st Multidisciplinary Cancer Research Symposium, Uludağ-Bursa, Turkey, 2006.

38. Preparation and Physicochemical Characterization of Biomolecular DNA-

Zwitterionic Phospholipid Self-Assemblies and Their Implications in

Chemicopharmaceutical Design of Liposome Based Gene Delivery

Nanoformulation, NanoTR-II: NanoScience and NanoTechnology 2006, 3-5 May

2006, Middle East Technical University, Ankara, Turkey.

39. Assessment of Structures of Poly(ribo)nucleotide-Phospholipid Self-Assemblies and Their Implıcations in Gene Transfection and DNA Chromatography, 8th

330

International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8), 13-16 June, 2006, Ankara, Turkey.

40. Probing Taxol™ (Paclitaxel)-Cell Membrane Interations with Langmuir-

Blodgett Monolayer, Fourier Transform Infrared Spectroscopy and Differential

Scanning Calorimetry, FEBS-2006, Istanbul, Turkey.

41. METU-CENTER WORKSHOP on Modern Electron Paramagnetic Resonance

(EPR) Spectroscopy, 6-9 November 2006, Middle East Technical University (METU)

Central Laboratory.

42. Fluorescence Microscopy and Interfacial Characterization of DNA

Condensation, Compaction and Release from Stable Virus-Resembling

Phospholipid-Nucleic Acid Self-Assemblies and Their Implications as Non-Viral

Gene Delivery Nanopharmaceuticals, NANO-TRIII 2007-Bilkent University, Ankara,

Turkey.

43. An FTIR Spectrometric Study of the Physicochemical Characteristics of Nucleic

Acid-Phospholipid Nanoformulations Designed for Gene Delivery at the Molecular

Level, X. National Congress of Spectroscopy, 04-07 July 2007, Izmir Institute of

Technology, Urla, Izmir.

44. Applying multilayer films and planar lipid bilayers (BLMs) for designing

nucleic acid nanobiosensors: some examples of bioengineering at the molecular

level, NANOMAT 2007, International Workshop on nanobiotechnology & Genome

Technologies, October 31-November 03, 2007, Antalya, Turkey.

Memberships:

Member of The New York Academy of Sciences, The Biophysical Society, The British

Biophysical Society, The Society for Mathematical Biology, The European Society of

Neurochemistry, The Austrian Society of Clinical Chemistry, The International

Society for the Study of the Origin of Life, Metbio™.

331

Fluency in Foreign Languages:

Excellent fluency in English, Russian, Bulgarian, Turkish and week knowledge of

German.