era net euronanomed jtc-3 raport stiintific 2012

1

Programul: ERA-Net EuroNanoMed JTC-3 (2011)

Tipul proiectului: COOPERARE INTERNATIONALA

Cod proiect: CHETHERDEL

Contractul de finanţare: UEFISCDI Nr.4-002/3493/27.04.2012

CHEMO-HYPERTHERMAL DELIVERY -

COMBINED CHEMO-HYPERTHERMAL

CONTROL OF HEPATIC TUMORS, BASED ON

MICROWAVE-ACTIVATED SUBENDOTHELIAL-

TARGETED NANO-ASSEMBLIES

Director de proiect: Conf. dr. Gabriel Dimofte

REZULTATE OBTINUTE

RAPORT STIINTIFIC 2012

2

Cuprins

Descrierea proiectului ...................................................................................................................4

Hipertermia si chimioterapia in cancer .......................................................................................5

Obiective an 2012 ...........................................................................................................................7

Rezumatul etapei .........................................................................................................................14

Descrierea stiintifica si tehnica ..................................................................................................15

Sistemul de hipertermie izolata .................................................................................................16

Material si metode .................................................................................................................16

Sistemul de administrare selectivă intrahepatică transarterială la şobolani .............................19


Protocoale experimentale si rezultate ....................................................................................22

Teste de toxicitate acuta ale nanoparticulelor cu Fe3O4 ............................................................25


Rezultate ................................................................................................................................26

Microscopie optica ....................................................................................................................28


Rezultate ................................................................................................................................29

Microscopie cu fluorescenta ......................................................................................................31


Rezultate ................................................................................................................................32

Determinarea calitativă a IL-6 şi a TNF-α prin tehnica RT-PCR .............................................33


Rezultate ................................................................................................................................34

Analiza metodelor imagistice sectionale utilizate in studiul leziunilor hepatice……………...36

Metode de explorare hepatica……………………………………………………………….36

Rolul metodelor imagistice in explorarea tumorilor maligne hepatice……………………...42

Analiza sistemelor de ghidaj stereotaxic bazate pe diferite metode imagistice ............……….45

3

Stabilirea volumetriei corecte a leziunilor tinta si reperajul percutan al acestui volum prin

utilizarea unor repere externe……………………………………………………………………48

Problematica interactiunilii radiatilor electromagnetice cu substanta…………………………52

Comportamentul nanoparticulelor incarcate cu magnetita in cimp electric………………….113

Anexe …………………………………………………………………………………………..117

Concluzii…………………………………………………………………………………….…182

Referinte bibliografice………………………………………………………………………...184

Raport al deplasarilor in strainatate privind activitatea de diseminare si formare

profesionala …………………………………………………………………………………...190

4

DESCRIEREA PROIECTULUI

5

Hipertermia si chimioterapia in cancer

Neoplaziile se afla printre principalele cauze de mortalitate din lume, iar incidenta lor

este in crestere in fiecare zi, in prezent afectand o treime din populatia din tarile dezvoltate si

cauzand decesul a un sfert dintre acestia. Asadar, se impune cercetarea de noi modalitati

terapeutice pentru a minimiza aceste riscuri. O directie inca insuficient explorata in terapia

cancerului este hipertermia.

Hipertermia, asociata oncologiei, reprezinta tratamentul tumorilor maligne prin

administrarea de caldura prin diverse modalitati. Hipertermia, per se, nu este o metoda de terapie

curativa a neoplasmelor, insa in conjunctie cu alte linii de tratament, precum radioterapia sau

chimioterapia, poate aduce un beneficiu net superior utilizarii numai uneia dintre ele.

Se cunosc variate tipuri de aplicare a hipertermiei, printre care hipertermia locala

(interstitiala), regionala, totala sau tehnici de perfuzie hipertermica localizata la un membru

izolat sau peritoneala. Temperaturile selectate pentru experimentele in vivo sunt, in general,

peste 42o C deoarece induc alterari ale fluxului sangvin tumoral si ale micromediului.

Micromediul tumoral este caracterizat prin reducerea fluxului sangvin si a densitatii vaselor, ceea

ce favorizeaza hipoxia, acidoza si deprivarea de energie. Hipertermia de peste 420 C s-a

demostrat a accentua aceste caracteristici, pe langa efectul citotoxic asupra celulelor. Mai mult,

aceste temperaturi par a altera, dar nu deteriora tesuturile normale. La nivel morfologic se

observa edemul endotelial cu pasajul plasmei catre interstitiu, microtromboze datorate activarii

hemostazei si diverse schimbari de vascozitate ale membranelor celulare sangvine. In contrast cu

aceste rezultate se afla efectele aplicarii de temperaturi sub 420 C, care duc la cresterea perfuziei

tumorale si marirea concentratiei de oxigen, ce fac formatiuni tumorale pana atunci neadecvate

tratamentului chimioterapic, sensibile acestuia [1].

Hipertermia asociata chimioterapiei pare a avea un efect sinergic si a mari eficienta

acesteia din urma. Interactiunile citate sunt aditive sau superaditive (crestere liniara odata cu

cresterea temperaturii; ex.: agenti alchilanti, compusi pe baza de platina), interactiune asociata

depasirii unui anumit nivel prag (citoxicitate scazuta sau limitata la temperaturi joase, urmata de

o crestere semnificativa dupa depasirea temperaturii prag; ex.: doxorubicina) sau independente

(ex.: majoritatea antimetabolitilor, alcaloizi vinca, taxani) [2]. De asemenea, chemosensibilizarea

termica, de obicei, poate fi obtinuta fie prin aplicare sincrona, fie la un interval scurt de timp.

Exista, totusi, si exceptii de la aceasta regula, precum medicamentele care refera un metabolism

hepatic complex si necesita aplicarea hipertermiei la cateva ore pentru a obtine efectul combinat

(ex.: ifosfamid).

Cercetarea in scopul gasirii unor metode adecvate de tratament al cancerului hepatic are o

important deosebita, datorita faptului ca ficatul reprezinta localizarea cea mai frecventa a

metastazelor majoritatii tipurilor de neoplasme umane. Un exemplu concludent il reprezinta

pacientii cu cancer colorectal diseminat, in care ficatul este principalul loc de metastazare si

6

reprezinta o cauza majora de mortalitate. Excizia chirurgicala ramane cel mai eficient mijloc de

tratament, totusi, un numar important de pacienti prezinta noduli tumorali raspanditi in aria

hepatica, motiv pentru care terapia clasica nu este o alternativa. Hipertermia asociata

chimioterapiei promite o noua modalitate de tratament adecvata, dupa cum demonstreaza studiile

precendente [3, 4, 13].

Procedurile de administrare a hipertermiei conventionale utilizeaza diverse surse de

energie pentru generarea caldurii intratisulare precum radiofrecventa sau microundele,

ultrasunetele si curentul electric. Aceste tehnici prezinta dezavantajul distributiei inegale a

temperaturii, nereusind generarea selectiva de temperaturi ridicate intratumoral. Asadar, o noua

modalitate de producere a caldurii era necesara. Hipertermia folosind nanoparticule magnetice

(ex.: Fe3O4, γ-Fe2O3 sau Co) sau hipertermia fluida magnetica reprezinta o directie de cercetare

ce pare sa elimine aceste dezavantaje, putand fi folosita inclusiv pentru cancere ce reusesc sa

eludeze tehnicile terapeutice clasice prin insasi distributia lor (glioblastomul multiform, cancerul

prostatic, cancerul metastatic hepatic) [5-7].

Folosind hipertermia fluida magnetica este posibila reducerea dozelor de radioterapie,

respectiv chimioterapie, desi efectul terapeutic este optimizat, astfel reducandu-se efectele

adverse toxice ale acestora. Fluidul magnetic cu nanoparticule magnetice poate fi administrat in

mai multe moduri pentru a ajunge la tinta sa, tumora: prin injectare arteriala, prin injectare

directa intratumorala (pentru rezultate optime nanoparticulele magnetice pot fi sintetizate

impreuna cu un invelis ce contine un anticorp antitumoral, minimizant astfel efectul nociv asupra

celulelor normale), prin implantare in situ (gel) si prin tintire activa (cu ajutorul anticorpilor

antitumorali si concentrarea nanoparticulelor folosind un camp magnetic extern [10-12].

Folosirea unei artere tributare tesutului afectat pentru inocularea nanoparticulelor reprezinta o

modalitate de tratament potrivita pentru neoplasmele hepatice dat fiind faptul ca exista diferente

intre celulele tumorale hepatice si parenchimul normal hepatic (tumorile hepatice sunt nutrite de

sistemul arterial hepatic) [9].

Manifestarile biologice ale hipertermiei selective intracelulare sunt variate, printre ele

numarandu-se si depasirea termotolerantei datorata incalzirii tumorale la temperaturi ridicate si

raspunsul imun antitumoral indus de expresia proteinelor de soc termic (HSPs). Aceste

modificari sugereaza ca acest tip de hipertermie duce la moartea nu numai a tumorilor incalzite,

ci si a celor neincalzite, incluzand si celulele canceroase metastatice [8].

Cancerul reprezinta o problema importanta a societatii moderne. Terapiile actuale nu sunt

suficiente pentru a asigura un efect curativ. Administrarea hipertermiei in paralel cu metodele

conventionale de tratament, precum radioterapia si chimioterapia, pare a avea rezultate

promitatoare, aducand cu sine o imbunatatire a calitatii vietii pacientilor si o crestere a

expectantei de viata.

7

OBIECTIVE AN 2012

8

Obiectiv 1. (WP1) – Raport asupra planului de certificare a calitatii si evaluarea

riscurilor

Activitati:

1. Managementul muncii, rapoarte, drepturi de proprietate intelectuala – realizat conform

planificarii initiale;

2. Managementul demonstrarii, exploatarii, managementul asigurarii calitatii – realizat

conform planificarii initiale;

3. Consilii stiintifice si transferul de informatii – realizat conform planificarii initiale.

4. Realizarea site-ului si diseminarea informatiilor

Rezultate obtinute:

1. Proceduri de management de proiect; Structurarea structurilor de coordonare si

management de proiect conform cu acordul de formare al consortiului (Consortium

Agreement). Astfel s-au constituit Steering Commitee si technical Committee formate din

membri ai tutor partenerilor din proiect. S-au stabilit modalitatile de cooperare si de

transfer al cunostintelor intre partener si modul de pastrare a proprietatilor intelectuale

pentru partenerul care a produs informatia, precum si modalitatea de raportare in comun

in cazul etapelor realizate de mai multi parteneri. In primul an al proiectului au fost doua

intilniri ale partenerilor organizate de coordonator: kick off meeting la Iasi si Joint

Meetting of the Steering Board and Technical Committee la Vienna.

2. Monitorizarea progresului general al proiectului si raportare; In calitate de coordonator al

proiectului am monitorizat modul de desfasurare si progresul experimentelor la toti

partenerii interni si externi, folosind intilniri directe, comunicari electronice si comitetele

de lucru stabilite in Consortium Agreement. Prin intermediul institutiei coorodnatorului

de proiect am monitorizat, in limitele agreementului de colaborare, progresul proiectului

la fiecare partener. In cazul partenerilor in Italia, Franta si Letonia monitorizarea a fost

foarte apropiata, dat fiind ca etapele de cercetare le UMF depind de produsele finale ale

celorlati parteneri. O prima etapa de raportare a fost organizata la Vienna unde ne-am

intilnit pentru a discuta si valida primele rezultate ale experimentelor cu nanoparticule.

UMF Gr. T. Popa a prezentat pe larg primele rezultate despre absorbtia nanoparticulelor

cu magnetita in ficatul de sobolan si primele rezultate legate de toxictatea acuta la

soareci. Un obiectiv esential a fost managementul demonstrarii experimentale, pas la care

au conlucrat toti partenerii implicati, prin discutiile interactive asigurindu-se nu doar un

dialog dar si un mediu critic necesar pentru exemplificarea posibilelor erori aparute in

cursul experimentarii. Managementul asigurarii calitatii a fost stabilit prin protocoale

interne ale fiecarui partnere si prin discutarea libera cu toti cei implicati. Coordonatorul

de program si/sau membri ai echipe coordonatorului de program au vizitat toate centrele

9

implicate si laboratoarele au fost prezentate in vederea stabilirii coordonatelor de

asigurare a calitatii in cercetare.

3. Asigurarea integrarii tuturor activitatilor; UMF GR.T. Popa Iasi a mentinut un contact

permanent cu toti cei implicati in producerea, evaluarea si testarea de nanoparticule

facind posibila o integrare a tuturor participantilor in fiecare etapa a proiectului in

desfasurare. Partnerii care au avut probleme tehnologice au fost pusi in contact si o parte

a testarilor s-au efectuat prin colaborarea intre partneri, rezultat al implicarii manageriale

a coordonatorului de proiect. In permamenta toti partenerii au fost informati cu

dezvoltarea proeictelor fiecarui partnere si cu datele preliminare ale experimentelor de

evaluare. Prin comunicare directa s-au facut modificari structurale si s-au implementat

noi protocoale de vizualizare a nanoparticulelor, integrindu-se munca a trei parteneri.

4. Initierea proiectului si intalniri periodice; initierea proiectului a inclus negocierea

drepturilor de autori cu autoritatile contractante si prima intilnire de la Iasi in care s-au

dezbatut primii pasi de urmat in cadrul proiectului. Conform Consortium Agreement sunt

prevazut un minim de 2 intilniri pe an cu o agenda anuntata in prealabil de catre

coordonatorul proiectului. Ambele intilniri au fost extrem de lucrartive si cu impact

imediat (minutele sunt postate pe site-ul proiectului (www.chetherdel.tuiasi.ro) la

capitolul de diseminare), gazduirea site-ului fiind asigurata de partenerul Universitate

Tehnica Gh. Asachi din Iasi, partner care s-a ocupat predominant de structurarea site-ului

care se dezvolta in continuare.

5. Protectia drepturilor de proprietate intelectuala si procedurile de diseminare; Cosnortium

Agreement reglementeaza toata problematica referitoare la drepturile de autor. Etapa in

care ne aflam nu permite inca publicarea rezultatelor partiale, urmind ca o prima lucrare

sa fie propusa spre publicare in anul viitor. S-a dezvoltat site-ul de prezentare al

proiectului care contine informatii esentiale despre parteneri, documentele fundamentale

de fomrare a consortiului si agreementul stiintific. Sunt prezentate datele de la fiecare

dintre intilnirile de comitete si date generale despre participanti. La acest moment site-ul

este functional in limba romana urmind sa dezvoltam si partea in limba engleza.

Diseminarea a continuat cu prezentarea proiectului la o intilnire de diseminare a

proiectelor la Salonik (reprezentata prin ANCS), un meeting la Iasi la Institutul Petru

Poni unde s-au prezentat date generale despre proiectele cistigate in competitiile

internationale, intilnire initiata de ANCS. A treia prezentare a proiectului a fost in luna

decembrie la UMF „Gr. T. Popa” la zilele UMF unde s-au preznetat intr-o sesiune

speciala toate proiectele cistigatoare in competitii interne si internationale.

6. Luarea eficienta de decizii; fluxul decizional a functionat si functioneaza fara probleme,

datorita capacitatii de comunicare excelente asigurata de toti partenerii.

7. Indeplinirea responsabilitatilor bioetice. Partenerul UMF Iasi a necesitat avizul comisiei

de etica a UMF „GR. T. Popa” din Iasi pentru derularea de experimente pe modele

animale vii. Avizul s-a obitnut fara nici un nfel de amendamente si menegementul

http://www.chetherdel.tuiasi.ro/

10

proiectul a realizat monitorizarea tuturor aspectelor legate de studiu in vederea respectarii

cerintelor etice impuse de standardele internationale.

Obiectiv 2. (WP2) – Dezvoltarea de nano-structuri de tip liposomal incarcate cu agenti

chimioterapeutici

Activitati:

1. Teste de toxicitate in vivo ale nano-structurilor (sobolani) – acute si cronice – in curs de

derulare; rezulatte partiale prezentate in raportul stiintific

2. Evaluarea rezultatelor stiintifice si deciziile de ramificare ale proiectului – in curs de

derulare.

3. Decizie GO/NO GO

Rezultate obtinute:

1. Stabilirea celor mai adecvate formule ale nano-structurilor; in prezent am stabilit ca

nanoparticule incarcate cu fluorocrom prezinta dezavantaje majore legate de mare alor

instabilitate la includerea in parafina, avind date mult mai pertinente la folosirea

incarcaturilor cu magnetita care se va regasi in formula finala si care este mai usor de

evidentiat in sectiunile histologice. Detalii in raportul stiintific

2. Validarea testelor de toxicitate; vezi raportul stiintific

3. Deciziile reusite referitoare la directia proiectului, definirea avantajelor evidente si a

productiei preliminare. Evaluarea etapei s-a facut in cadrul Steering Board and Technical

Committee unde s-au preznetat toate etapele de cercetare care se afla in derulare, ducind

la modificari de protocol decise de parteneri de comun acord. Proeictul a fost ramificat

prin studierea unei mai mari complexitati de particule cu incarcari diferite in vederea

vizualizarii si mai ales in vederea studierii modulu de captare in tesuturi. Deciziile

fiecarui partener sunt luate individual dar cu comunicare protocoalelor la fiecare partnere

implicat, fiind de cele mai multe ori nevoie de doze suplimentare de nanoparticule sau

nanoparticule cu proprietati modificate discret

4. Datele preliminarii sugereaza nivele reduse de toxicitate si posibilitate incorporarii de

citostatice. Decizia a fost de a continua experimentele pe aceasta linie.

Obiectiv 3. (WP3) – Dezvoltarea de nano-structuri magnetice cu anticorpi monoclonali

atasati la nivelul suprafetei

Activitati:

1. Teste de toxicitate in vivo ale nano-structurilor (sobolani) – acute si cronice – realizat si

in derulare conform planificarii initiale;

11

2. Studii farmacocinetice dupa injectarea intrahepatica a bolusului de nano-structuri,

evaluarea rezultatelor si deciziile definitive asupra proiectului – in curs de derulare.

3. Producerea de probe histologice de degradare termica ocntrolata pentru evaluarea si

alegerea celor mai bune site-uri pentru legarea cu anticorpi; realizat in totalitate, vezi

raportul stiintific.

4. evaluarea comportamentului in cimpuri electrice

5. decizie GO/NO GO

Rezultate obtinute:

1. Stabilirea celor mai adecvate structuri ale nano-structurilor care sa permite o buna

vizualizare in probele prelucrate histologic.

2. Indeplinirea cu succes a testelor de tatonare de farmacotoxicitate cu rezultate care suporta

idea de toxicitate minima la doze de administrare mult peste doza necesara in

experimente

3. Deciziile reusite asupra directiei proiectului; s-a hotarit folosirea ca terget primar a doua

site-uri antigenice: colagenul subendotelial si ACE avind ca scop fixarea nanoparticulelor

in spatiul denudad prin incalzire, dar si e suprafata celulelor maligne. Etapa majora se

afla in sarcina partenerului italan care studiaza in acest moment satructurile developate in

cursul incalzirii si urmeaza sa testam fixarea anticorpilor monoclonali pe aceste structuri

prin perfuzie in vitro pe organ izolat in baie de organ

4. Definirea avantajelor evidente pentru studiile clinice, decizie GO. Testele prelimiare arata

o toxicitate minima si posibilitate continuarii testelor folosind nanoparticule

functionalizate cu anticorpi monoclonali. Decizia luata de parteneri a fost de a continua

experimentele in aceasta directie.

5. Modelele experimentale de comportament in cimpuri electrice, desi inca la inceput,

caracterizeaza nanoparticule incarcate cu magnetita si ne sustin ipoteza folosirii acestor

particule in scopul incalzirii specifica in volumul tinta.

Obiectiv 4. (WP4) - Dezvoltarea sistemului terapeutic bazat pe microunde, etapa ce

incepe in decembrie 2012

1. analiza sistemelor de ghidaj stereotaxic bazate pe diferite metode imagistice, pentru a

putea concepe modelul de ghidaj percutan al fascicolului de microunde necesar pentru

termo-chimioterapie

2. stabilirea volumetriei corecte a leziunilor tinta si reperajul percutan al acestui volum prin

utilizarea unor repere externe, in cadrul etapei WP5 – Dezvoltarea sistemului terapeutic

bazat pe microunde, etapa ce incepe in decembrie 2012.

3. problematica interactiunii radiatiei electromagnetice cu substanta

12

Rezultate obtinute

1. detectarea leziunilor focale hepatice și caracterizarea lor (aspect imagistic sugestiv pentru

metastaze, număr, localizare, dimensiuni) – în cadrul stadializării preterapeutice a

tumorilor maligne și a monitorizării evoluției lor;

2. aprecierea rezecabilității, în funcție de localizarea în segmentele hepatice, relația cu

venele hepatice, vena portă, hilul hepatic și diafragmul;

3. realizarea volumetriei leziunilor metastatice și a ficatului;

4. ghidarea tratamentului paliativ (chemoembolizare, alcoolizare percutană), ghidarea

tratamentului de distrucție termică, a chimioterapiei locale sau a tratamentului cu

anticorpi monoclonali prin puncții percutane sau laparoscopice.

Obiectiv 5. (WP8) – Diseminarea, implementarea si strategiile de exploatare clinica

Activitati:

1. Pagina web a proiectului si actiunile de diseminare; realizata partial

2. Campania comuna de demonstrare si actiuni de promovare – in curs de derulare;

3. Raport asupra beneficiilor cooperarii si integrarii fiecarui partener – in curs de derulare;

4. Transferul drepturilor de proprietate intelectuala si solutii de implementare – in curs de

derulare;

5. Fezabilitate si studiu de impact, cu strategii pentru viitoarea exploatare clinica – in curs

de derulare.

Rezultate obtinute:

1. pagina web realizata partial: www.chetherdel.tuiasi.ro urmind sa o upgradam cu datele

detaliate ale partenerilor si accesul in limba engleza.

2. Diseminarea si promovarea extinse; vezi si WP1 am participat la 3 evenimente de

promovare a granturilor de cercetare internationale si o promovare intensiva in cadrul

prezentarilor fiecarui partener pe plan intern.

3. Transferul eficient de informatii catre institutiile clinice si industrie si implementarea in

cadrul partilor participante; transferul de informatii la acest moment sa fec intre parteneri

si partial cu industria – partenerul italian are un subcontractant care va produce anticorpii

monoclonali la scara industriala iar UTI Iasi lucreaza cu un subcontractant la dezvoltarea

sistemului de incalzire cu microunde.

4. Exploatarea tehnologiei cu microunde pentru anumite aplicatii clinice; se face sub

coordonarea UMF de catre partenerul UTI Iasi. Studiul de fezabilitate arata multiple

http://www.chetherdel.tuiasi.ro/

13

posibilitati de dezvoltare industriala, rumind a se contacta partenerii industriali in functie

de rezultatele experimentale folosind prototipul. Costuri versus beneficii si analiza de

impact.

14

REZUMATUL ETAPEI

15

DESCRIEREA STIINTIFICA SI TEHNICA

16

Sistemul de hipertemie izolată

Material şi metode

Toate experimentele au fost realizate pe şobolani Wistar, cu o greutate cuprinsă între 250-

350 gr. menţinuţi la o temperatură ambientală constantă, supuşi unui ciclu de lumină zi/noapte

12h/12h, cu apă şi mâncare ad libitum.

Pentru realizarea acestei etape a fost necesar un sistem închis, care să asigure recircularea

unui fluid ce poate fi controlat şi menţinut la o anumită temperatură, pentru o anumită perioadă

de timp. S-a optat pentru utilizarea acestui tip de sistem pentru ca oferă un control optim asupra

menţinerii temperaturii necesare transferului constant de căldură între componentele sistemului.

Prototipul realizat în cadrul Centrului de Cercetări Biomedicale “Gr.T.Popa” constă din

următoarele componente:

1. baie de apă

2. pompă de recirculare a apei

3. termometru apă

4. termostat

5. padele

6. tubulatură conectare baie de apă-padele.

7. sistem de încălzire corporală externă

8. sursă de lumină rece

17

Padelele au fost realizate special pentru acest experiment utilizând tub de polietilenă cu

diametru exterior de 1.27 mm şi cel interior de 0.86mm, tuburi ce au fost dispuse in sens circular

pe o platformă autoadezivă, obţinând în acest fel 2 padele flexibile cu diametrul de 20mm. După

fixarea tuburilor pe platforma autoadezivă, pasul următor a constat în termoizolarea acestora pe

partea externă. Acest lucru a fost necesar pentru realizarea unui transfer unidirecţional de

căldură, către zona dintre cele 2 padele, astfel încât variaţia maximă de temperatură să fie

focalizată în interiorul ţesutului dintre padele, iar în exteriorul acestora temperatura mediului

învecinat să nu fie influenţată.

Aceste padele au fost conectate la baia de apă prin intermediul unor tuburi de polietilenă

de diametrul egal celor de mai sus, cu lungimea de 45 cm la care a fost adăugat un robinet pentru

18

distribuirea în mod egal a apei la cele 2 padele. De menţionat că există o diferenţă de temperatură

între baia de apă şi padele de aproximativ 2° C.

Pentru cuantificarea temperaturii de la nivelul lobului hepatic al animalului de

experiment s-a utilizat un termometru electronic cu precizie de 0,1° C al cărui traductor flexibil

cu diametrul de aproximativ 1,5 mm a fost introdus în ficat înainte, în timpul încălzirii şi

menţinut aproximativ 2 minute după terminarea acestui proces.

În vederea menţinerii unei temperaturi corporale constante, temperatură ce scade în

cursul laparotomiei efectuată pe şobolani, s-a folosit un sistem de încălzire externă. Aceasta a

fost setată la temperatura de 39 ° C.

19

Sistemul de administrare selectivă intrahepatică transarterială la

şobolani

Material şi metode



12h/12h, cu apă şi mâncare ad libitum.

Pentru injecatrea selectivă a nanoparticulelor la nivelul ficatului, s-a recurs la următoarea

tehnică procedurală:

- anestezierea animalului cu o mixtură de ketamină 65 mg/kgc şi xilazină 15 mg/kgc;

- dezinfecţia tegumentelor de la nivel abdominal şi inghinal cu betadină;

- realizarea unei incizii la nivel inghinal, urmată de disecţia ţesutului celular subcutanat

până la eliberarea planului vasculo-nervos, cu identificarea elementelor acestuia;

- individualizarea cu maximă protecţie a arterei femurale (0,9 mm diametru) ce va fi

expusă cu ajutorul a 2 fire de reper;

- cateterizarea arterei femurale cu un tub de polietilenă cu diametrul exterior de 0,61

mm şi cel interior de 0,28 mm;

- introducerea cateterului pana la nivelul aortei abdominale;

20

Următoarea etapă constă în realizarea laparotomiei Mercedes, în scopul unei bune

expuneri a organelor interne.

Datorită conformaţiei anatomice particulare a şobolanului, pasul următor a constat în

expunerea în totalitate a aortei abdominale. După reperarea acesteia şi a emergenţei trunchiului

21

celiac, s-a dispus disecţia la acest nivel cu ridicarea de pe planul posterior a unui segment din

aortă şi a trunchiului celiac.

Catererul introdus la nivel femural este direcţionat prin aortă în trunchiul celiac unde va fi

ulterior fixat prin ligatură.

Pentru administrarea selectivă a diferitelor substanţe la nivelul ficatului, este necesar să

se individualizeze şi clampeze toate colateralele emergente din trunchiul celiac, excepţie făcând

artera hepatică.

22

Protocoale experimentale si rezultate



12h/12h, cu apă şi mâncare ad libitum. După o prealabilă anestezie cu ketamină şi xilazină,

animalul de experiment a fost aşezat în decubit pe platforma de încălzire externă, ulterior

efectuându-se o laparotomie Mercedes pentru o bună expunere a cavităţii peritoneale. După

izolarea atentă a câmpului operator, se trece la eliberarea ligamentelor hepato-diafragmatice,

hepato-gastrice rezultând în acest fel o mobilizare corespunzătoare a celor 3 lobi hepatici. Pentru

încălzirea ficatului s-a ales lobul inferior, iar ceilalţi 2 au deservit ca lobi de control. Pentru a

putea realiza hipertermia la nivelul ficatului, lobul inferior a fost aşezat între cele 2 padele

încălzite, iar pentru monitorizarea temperaturii din interiorul ficatului s-a introdus sonda

termometrului la acest nivel. După atingerea temperaturii dorite la nivelul lobului hepatic, acesta

a fost scos dintre cele 2 padele şi lăsat să revină lent la temperatură iniţială.

Pentru a determina influenţa diferiţilor parametri (temperatura de expunere, intervalul de

recoltare) asupra structurilor parenchimului hepatic, s-au realizat experimente pe mai multe loturi

de animale.

Primul lot de sobolani analizat a cuprins lobi de ficat incalziti 1 min la 42°C (Fig 1-9),

la 45°C (Fig 10-15) si la 50°C (Fig. 16) si sacrificati după 24 ore. Modificarile constatate sunt

reprezentate de staza si congestie vasculara in jurul spatiilor porto-biliare, arii de hemoragie

localizate subcapsular cu acumulare de PMN-uri si zone de degenerescenta hidropica in jurul

venei centro-lobulare. Alt preparat hepatic in aceleasi conditii a prezentat in plus fata de ariile de

necroza hepatocitara un bogat infiltrat inflamator cu PMN-uri si depozite fibrino-leucocitare pe

capsula hepatica.

Localizarea subcapsulara si prelungirea intraparenchimatoasa a ariilor de necroza

hepatocitara insotite de infiltrat inflamator cu PMN-uri ar putea fi explicata prin friabilitatea

capatata de ficat sub influenta agentului termic. Modificarile certe induse de temperatura sunt

cele reprezentate de degenerescenta vacuolara.

Ficatul incalzit la 45°C ( anexe: Fig. 10-15) a prezentat o arie de necroza hepatocitara

importanta pe jumatate de sectiune , arie de necroza insotita de abundent exsudat cu PMN-uri.

Modificarile necrotice sunt panacinare: aria 1 si 2 a acinului hepatic sunt cu necroza totala, aria 3

doar cu modificari importante de coagulare (citoplasma intens eozinofila si nucleu hipercromatic.

Cealalta jumatate a sectiunii a prezentat discret infiltrat inflamator in spatiile porto-biliare si

degenerescenta hidropica. Se mai remarca importante depozite fibrino-leucocitare pe suprafata

ficatului.

23

Modificarile induse de temperatura pe pereparatele de ficat incalzit la 50°C (anexe Fig.

16) au fost reprezentate de arii intinse de necroza cu infiltrat inflamator acut cu PMN-uri.

Al doilea lot studiat (anexe Fig. 17-22) a cuprins diverse organe: rinichi, cord, creier,

plaman de la sobolani la care incalzirea ficatului s-a realizat la 42 °C si recoltarea organelor la 15

minute. Preparatele de cord, rinichi si creier nu au prezentat modificari histopatologice.

Preparatul din pulmon a prezentat emfizem panacinar. Ficatul incalzit la 42°C a prezentat

importanta degenerescenta hidropica.

Al treilea lot studiat a cuprins preparate din ficat incalzit la 42°C si recoltate la diferite

intervale de timp: 15 min, 24 ore, 48 ore,si la 9 zile.

Preparatul de ficat incalzit la 42 °C si recoltat la 15 min (anexe Fig. 23-26) a prezentat pe

langa degenerescenta vacuolara, infiltrat inflamator limfo-plasmocitar asociind si eozinofile in

spatiile porto-biliare si mici focare de infiltrat inflamator limfo-plasmocitar intraparenchimatos

Preparatul din ficat incalzit la 42°C si recoltat la 24 de ore (anexe Fig. 27-30) a prezentat

arii de necroza hepatociatra intraparenchimatoasa infiltrata cu PMN-uri, depozite fibrino-

leucocitare pe suprafata ficatului si degenerescenta hidropica.

Preparatul din ficat incalzit la 42°C si recoltat la 48 de ore (anexe Fig. 31-33) a prezentat

degenerescenta vacuolara si arii de necroza hepatocitara cu infiltrat inflamator limfo-plasmocitar

cu PMN-uri localizate subcapsular.

Preparatul din ficat incalzit la 42 °C si recoltat la 9 zile (anexe Fig. 34-38) a prezentat

importanta degenerescenta vacuolara, mici agregate limfo-plasmocitare intraparenchimatoase si

in spatiile porto-biliare unde se asociazqa cu eozinofile. Se remarca necroze hepatociatare

intraparenchimatoase insotite de infiltrat inflamator limfo-plasmocitar asociind PMN-uri si

aglomerari de PMN-uri subcapsular.

Se poate concluziona ca ficatul incalzit la 42°C si recoltat la 15 minute, initial apar mici

focare limfo-plasmocitare intraparenchimatoase pentru ca la 24 h, 48 h si 9 zile sa se definitiveze

ariile de necroza hepatocitara ce asociaza infiltrat cu PMN-uri. Degenerescenta hidropica este un

fenomen prezent in toate preparatele indiferent de timpul cand au fost recoltate. Probabil si

depozitele fibrino-leucocitare de pe suprafata ficatului care apar initial la recoltarea de la 24 de

ore se pastreaza si la 48 ore si la 9 zile.

24

Al patrulea lot studiat a fost reprezentat de doua tipuri de preparate:

- ficat (anexe Fig. 39-40) cu nanoparticule injectate inainte de incalzire cu 10 min apoi

ficatul incalzit 1 min la 42°C si sacrificat la 10 – 15 min

- ficat (anexe Fig. 41-43) cu nanoparticule introduse post incalzire la 42 ° C la 5 – 10

min, apoi sacrificare la 10 -15 min.

Ambele preparatele au prezentat importanta degenerescenta hidropica.

Al cincilea lot a fost efectuat pentru a permite o comparatie intre preparatele de ficat

incalzite la 42°C timp de 1 min (anexe Fig 44), 3 minute (Ficat 37), 5 minute (Ficat 47) si 10

minute (Ficat 48) si o comparatie intre rinichiul drept incalzit la 42°C 1 minut (Rinichi 48) si 5

minute (Rinichi 47) si rinichiul stang neincalzit. In paralel a existat o proba de ficat incalzit 3

minute la 43°C.

Ficat incalzit 1 minut la 42°C (anexe Fig.44) a prezentat degenerescenta hidropica

preponderent subcapsular.

Ficatul incalzit 3 minute la 42°C (anexe Fig. 45-47) a prezentat degenerescenta hidropica

in jurul spatiilor portobiliare.

Ficatul incalzit 3 minute la 43°C (anexe Fig. 48-50) a prezentat degenerescenta hidropica

si numeroase arii de necroze hepatocitare intraparenchimatoase cu infiltrat inflamator cu PMN-

uri.

Ficatul incalzit 5 minute la 42°C (anexe Fig. 51-52) a prezentat degenerescenta vacuolara

in jurul venei centrolobulare.

Ficatul incalzit 10 minute la 42°C (anexe Fig. 53-55) a prezentat degenerescenta

vacuolara in tot acinul hepatic.

Se constata degenerescenta hidropica indiferent de durata incalzirii doar localizarea

acesteia variaza de la subcapsulara - ficat incalzit 1 min, in jurul spatiului porto-biliar la 3

minute, in jurul venei centro-lobulare la 5 minute si in tot acinul la 10 minute.

Rinichiul drept incalzit 5 minute la 42°C (anexe Fig. 56-57) a prezentat hemoragii

interstitiale importante fara a putea fi pusa in evidenta degenerescenta hidropica.

Rinichiul drept incalzit 1 minut la 42°C (anexeFig. 59-60) a prezentat degenerescenta

hidropica la nivelul tubilor contorti.

Anexat se regaseste suportul imagistic (pag. 39-69).

25

Teste de toxicitate acuta ale nanoparticulelor cu Fe3O4

Material si metode

Animale

In cadrul experimentului au fost utilizati 6 soareci, masculi, ce provin de la Institutul

Cantacuzino Bucuresti, respectand Protocolul International de Etica privind manipularea

animalelor.

Greutatea soarecilor a fost de 21 2 g, au avut acces nelimitat la hrana si apa, cu ritm de

12h lumina/intuneric conform normelor.

Initial, cu 24 de ore inaintea administrariii substantei de cercetat, soarecii au fost cantariti,

asezati in custi, cate unu pe cusca, li s-a dat apa si hrana. S-au monitorizat parametrii cosiderati

esentiali in cadrul experimentului cu ajutorul unei grile de evaluare.

Grila de evaluare

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Skin and furEyes and mucous membranes

Respiratory system

Circulatory system

Autonomic nervous system

Central nervous system

Somatomotor activity

Behavior pattern

Weight

Water

Food

no no no no no no no

TremorsConvulsions

Salivation

Diarhhea

Coma

Observations

day 7

yes yes

day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 day 6

yesyesyesyesyes

1-good

2-poor

3-very poor

Substanta

Substanta de cercetat in cantitate de 10 mg a fost dizolvata in 0.8 ml ser fiziologic (cea

mai mica cantitate de solvent ce a permis dizolvarea substantei, respectiv aspiratia acesteia in

vederea injectarii intraperitoneale). Aceasta dilutie a fost efectuata in dorinta de a stabili doza

26

letala DL. Dizolvarea substantei s-a facut la agitator. S-a constatat o crestere a densitatii

substantei, astfel incat la dizolvarea completa a acesteia au fost extrasi 0.4 ml solutie.

Din cadrul lotului, la 4 soareci li s-a administrat intraperitoneal substanta de cercetat, in

cantitate de 0.1 ml, cu agitarea in prealabil a solutiei inainte de fiecare injectare, iar la 2 soareci li

s-a administrat ser fiziologic, acelasi volum 0.1 ml intraperitoneal. Imediat dupa injectare a fost

masat locul de punctie. Substanta a fost administrata la ora 14:00.

Ulterior, cu ajutorul grilei de evaluare animalele au fost studiate zilnic, respectiv palpate

la nivelul locului de injectare.

Nu s-au constat modificari ale comportamentului, greutatii, consumului de apa si hrana

intre lotul de cercetat si lotul martor. Deci, intrucat nu s-au constatat modificari (decesul

animalelor), putem spune ca concentratia de substanta gasita este doza maxima tolerata DMT.

Rezultate

Soarece inainte de necropsie Expunerea organelor interne ale soarecelui

Splina soarece Ficat soarece

27

Rinichi soarece Cord si Plamani soarece

Creier soarece

Recoltarea organelor s-a efectuat la 7 zile dupa administrarea intraperitoneala a

nanoparticulelor cu Fe3O4.

Nu s-au observat modificari macroscopice la nivelul zonei de injectare peritoneala sau al

organelor interne ale soarecilor si nici intre soarecii test si cei control.

In asteptarea analizei anatomo-patologice.

28

Microscopie optica

Material si metode

Preparatele pentru microscopie au fost de 3 categorii:

-piese de exereza fixate in formol 10% tamponat, incluse in parafina (cu procesare

conform protocolului standard de morfopatologie, incluzind incubari in etanol,

izopropanol/alcool amilic, parafina la 56oC, xilen), si

-amprente.

-depuneri (pe lame de sticla) de pulbere de nanoparticule in incarcare cu Nile red

asumata a fi stabila.

In cele mai multe dintre cazuri mai multe prelevate au fost asociate in aceeasi cupa de

includere (pentru facilitarea comparatiilor imaginilor de microscopie intre organe diferite sau

intre subiecti donori diferiti, si pentru uniformizarea efectului procesarilor histologice)

Sectiunile microscopice au fost generate la 4 microni pe lame standard 24x75mm; fiind

produse pina la 6 per bloc de includere, grupate fie distinct pe lame, fie in cumul pe aceeasi lama

(pentru minimizarea variatiilor de procesare).

Amprentele de sectiune de organ (ficat) au fost primite in etalari multiple pe aceeasi

lama, cu fixare prin uscare in aer.

Examinarile microscopice au fost realizate in urmatoarele 3 variante:

-fara colorare

-colorare standard Hematoxilina, pentru nuclei

-colorare Hematoxilina-Eozina standard (pentru morfologie); aceasta diversitate servind

la identificarea interferentelor in fluorescenta intre pigmentii (endogeni/de marcare) si

fluorocromul folosit pentru nanoparticule (Nile red).

Destinatia analitica imediata a acestor materiale cuprinde 3 metode (2 disponibile curent,

de evaluare in transiluminare standard, si respectiv de fluorescenta; cea de-a treia – colocalizarea

in fluorescenta – va fi disponibila incepind cu luna octombrie curent). Trei microscoape sint

combinate pentru explorare: Nikon Eclipse E800 (pentru evaluari rapide), Zeiss Observer Z1

(pentru construire imagine digitizata de scanare a preparatelor) si Z2 (pentru detaliere in

fluorescenta la rezolutie si, ulterior, colocalizare). Softurile imagistice ale ultimilor 2 nu sunt

compatibile, ceea ce impune mentinerea separata a evidentelor privind localizarea elementelor in

spatiul sectiunilor.

29

In cadrul unei etape de debut a studiului centrata pe ideea incarcarii selective a spatiilor

subvasculare hepatice termic-indusa cu nanopaticule in suspensie sanghina, intrebarile

experimentale de pornire au fost urmatoarele:

Rezultate

1. Procesarea standard histologica cu includerea in parafina NU este compatibila cu maniera

de examinare in fluorescenta pentru captarea de nanoparticule Nile red – marcate.

Credem ca fluorocromul (liposolubil) este eluat in cursul procesului. In contrast, amprentele

de ficat ne indica imagini corespunzind fluorescentei particulelor tinta.

Propunem testarea a 2 metode complementare de generare a unor preparate histologice, ambele

fezabile in centru.

Prima este criotomia, cu dezavantajul grosimii mari de sectiune – compensata la

examinarea in colocalizare, si cu garantia prezervarii fluorescentei in Nile red. A doua ar fi

includerea in rasini epoxidice (din categoria celor nondure - pentru a menaja lamele de

microtom).

Mentionam ca pentru eventualitatea analizei ulterioare a expresiei genice (fezabila la noi)

ar putea fi necesara fixarea histologica in reactivi menajanti (tip rna-save), si abandonarea

formolului.

2.Nanoparticulele NU sint omogene. Putem descrie in microscopia de fluorescenta cel putin 3

populatii dimensionale; o caracterizare si mai precisa poate fi facuta in citometrie de flux

standard la noi, dar inca nu a fost efectuata.

3.Efectele termoconditionarii nu par a fi nici omogene in masa ficatului, si nici controlabile

cu metodologia utilizata pina in prezent. Atit in morfologie HE, cit si in fluorescenta, putem

identifica distorsiuni de varii grade (de la condensari citoplasmatice la fragmentari celulare si

infiltrate inflamatorii secundare) care au caracter de leziune ireversibila. Putem identifica arii

largi de organe care par sa fi fost neafectate si, distinct, arii vecine cu distorsiuni majore. In

concordanta, putem idenfica un impact endotelial al termoexpunerii care ar putea fi cuantificat

imagistic: scaderea evidenta a numarului de celule endoteliale la nivelul vaselor mici din zonele

lezionale in comparatie cu cele aparent neafectate.

Probabil ca analiza detaliata/exhaustiva la nivel de cimpuri microscopie idividuale pentru

intreaga serie de animale termotratate ar fi necesara.

Recomandam considerarea unui protocol de expunere termica cu un grad de control

superior, si includerea in seria de evaluari microscopice a acelora de imunohistochimie

(realizabile la noi) pentru documentarea clara a termoadaptarii (tintind variatia expresiei in

proteine de soc termic) precum si pentru endotelii.

30

4.Unii dintre sobolanii de experiment prezinta chisturi (paraziti) subcapsulare hepatice - ceea ce

va necesita probabil definirea impactului imunologic (neclar daca neglijabil in contextul curent)

asupra conditiilor de testare ulterioare. Nu stim daca sint disponibile linii tumorale

histocompatibile pentru aceste animale (inbred).

Anexam suportul imagistic pentru aceste rezultate (pag. 70-74).

31

Microscopie cu fluorescenta

Material si metode:

Am utilizat un microscop confocal cu scanare Laser DM 5500Q (microscop

direct) + echipament confocal de tip Leica TCS SPE + accesorii (camera foto), iar

pentru prelucrarea datelor un software LAS AF, sistem de achiziţionare şi

prelucrare imagini - cameră şi adaptor Leica DFC 290 cu soft Leica Application

Suite LAS, versiunea 2.8.1.

Preparatele pentru microscopie au fost de 3 categorii:

- piese de exereza (ficat sobolan) incluse in mediu GSV1 si criofixate cu

tetrafluoroetan – continand nanoparticulele (RG502H si RGP) in

incarcare cu fluorocromul Nile red;

- piese de exereza (ficat sobolan) fixate in formol 10% tamponat, incluse in

parafina (cu procesare conform protocolului standard de

morfopatologie, incluzind incubari in etanol, izopropanol/alcool

amilic, parafina la 56o C, xilen) – continand nanoparticulele in

incarcare cu magnetita (Fe3O4) si colorate cu albastru de Prusia

(coloratia Perls);

- depuneri (pe lame de sticla) de pulbere de nanoparticule in incarcare cu

Nile red asumata a fi stabila (solutiile de adeziune lama-lamela

folosite au fost fie DPX, fie apa distilata).

Sectiunile microscopice criofixate au fost generate la 5-10 microni pe lame

standard 24x75mm; fiind produse pina la 24 per bloc de includere, grupate fie

distinct pe lame, fie in cumul pe aceeasi lama (pentru minimizarea variatiilor de

procesare).

Sectiunile microscopice incluse in parafina au fost generate la 4 microni pe lame

standard 24x75mm; fiind produse pina la 6 per bloc de includere, grupate fie

distinct pe lame, fie in cumul pe aceeasi lama (pentru minimizarea variatiilor de

procesare).

Examinarile microscopice au fost realizate in urmatoarele 2 variante:

- fara colorare – pentru observarea in microscopie cu fluorescenta a

fluorocromului folosit pentru nanoparticule (Nile red);

- colorare Hematoxilina-Eozina standard (pentru morfologie) si colorare cu

albastru de Prusia (coloratia Perls) pentru examinarea Fe3O4

Probele de cercetat au fost examinate cu microscopul in: fluorescenta, contrast

diferential de faza, lumina polarizata, camp luminos, camp confocal.

32

Anexat se regaseste suportul imagistic (pag. 65-82).

Rezultate:

Atat nanoparticulele incarcate cu fluorocromul Nile red, cat si cele incarcate cu magnetita

nu au putut fi observate in microscopie optica pe lamele cu sectiuni din ficatul de

sobolan;

Nu s-au observant diferente intre sectiunile ce contineau nanoparticula cu Fe3O4 cu

administrare cu 10 minute inainte sau cu 5-10 minute dupa incalzirea ficatului;

Pulberea de nanoparticule a putut fi observata prin microscopie optica (cu fluorescenta, in

contrast diferential de faza, in lumina polarizata)

33

Determinarea calitativă a IL-6 şi a TNF-α prin tehnica RT-PCR

Material si metode

2. Principiul metodei

Cu această metodă se poate amplifica selectiv o secvenţa scurtă de ADN, a cărei structură

nucleotidică este cunoscută, sau parţial cunoscută.

Tehnica foloseşte două oligonucleotide de sinteză – primeri - de 18-25 nucleotide fiecare,

complementare capatului 3' a celor două catene, ale segmentului de ADN. Ele declanşează sinteza

ADN, copiind fragmentul de ADN iniţial.

În prima etapă, catenele de ADN sunt denaturate termic (≥ 95oC), obţinându-se un amestec

de fragmente monocatenare.

În a doua etapă, temperatura se scade la 50-60oC, necesară pentru poziţionarea şi hibridarea

primerilor la secvenţele complementare de pe fiecare catenă.

În a treia etapă, are loc polimerizarea nucleotidelor, sub acţiunea unei ADN-polimeraze

termostabile, la 72oC. Fiecare primer este alungit -se o secvenţă

complementară catenei copiate (matriţă).

PCR este o reacţie în lanţ deoarece catenele de ADN nou sintetizate vor acţiona ca matriţe

pentru sinteza ADN în ciclurile următoare. Se produce astfel o amplificare exponenţiala a

cantităţii de ADN.

După N cicluri se obţin teoretic 2N exemplare din segmentul iniţial de ADN. După 30 de

cicluri, se obţin circa un miliard de ampliconi (segmente amplificate). Astfel, plecând de la o

cantitate infimă de ADN (chiar de la o singură celulă) se poate obţine, prin PCR, o cantitate

suficientă de ADN-ţintă. Dezavantajele majore ale PCR sunt:

necesitatea unor informaţii prealabile despre secvenţa ADN ţintă necesară pentru

fabricarea primerilor specifici;

mărimea mică a ampliconului (0.1-5 kb în tehnicile uzuale de PCR) pe care o poate

polimeriza o enzimă;

cantitea limitată de produs final;

infidelitatea copierii ADN (frecvenţa crescută a erorilor de împerechere depinde de

precizia ADN-polimerazei)

Atasat se regasesc protocoalele utilizate (pag.83-95).

34

Rezultate

Probele sunt migrate în următoarea ordine:

Scara de dimensiune 50bp

NTC_IL6

51.0_IL6

51.a_IL6

52.0_IL6

52.a_IL6

53.a_IL6

NTC_TNFα

51.0_TNFα

51.a_TNFα

52.0_TNFα

52.a_TNFα

53.a_TNFα

NTC_GAPDH

51.0_GAPDH

51.a_GAPDH

52.0_GAPDH

52.a_GAPDH

53.a_GAPDH

51.0 - ficat control ( lobul de deasupra celui încălzit la 42 de grade şi recoltat după 15

minute)

35

51.a - ficat încălzit la 42 de grade şi recoltat după 15 minute

52.0 - ficat control ( lobul de deasupra celui încălzit la 42 de grade şi recoltat după după 24

de ore )

52.a - ficat încălzit la 42 de grade, dar recoltat după 24 de ore

53.a – control negativ

În concluzie, în omogenatul de ficat de şobolan IL-6 nu se exprimă în nici o probă, iar

expresia genică a TNFα, se exprimă la intensităti aproximativ egale (Fig.2).

Fig.2

36

Analiza metodelor imagistice sectionale utilizate in studiul leziunilor

hepatice

Acest obiectiv a avut ca scop o revista a literaturii de specialitate pentru analiza

metodelor imagistice sectionale utilizate in studiul leziunilor hepatice, axata pe acuratetea

de diagnostic, avantaje si dezavantaje, limitari ale metodelor. Daca pentru diagnosticul

carcinomului hepatocelular, criteriile de diagnostic imagistic sunt standardizate de Probleme

de diagnostic imagistic pun, in special, leziunile secundare hepatice. Metastazele hepatice

sunt cele mai frecvente leziuni maligne hepatice, cu o incidentă de 20 de ori mai mare decât a

tumorilor maligne primitive . Sursa metastazelor hepatice este, cel mai adesea, o neoplazie

localizată la nivelul tractului digestiv (colon, stomac, pancreas), sânului, plamânului sau

rinichiului. Dar o leziune hepatică la un pacient cu o neoplazie cunoscută nu este obligatoriu

secundară, studiile de autopsie raportând până la 25-50% din leziunile hepatice sub 2 cm la

pacientii cu tumori maligne ca fiind leziuni benigne. De aceea, diagnosticarea corectă a

metastazelor hepatice necesită o explorare imagistică complexă, ce vizează mai multe

obiective.

METODELE DE EXPLORARE IMAGISTICĂ

A. Ecografia este metoda de primă intentie pentru detectarea tumorilor hepatice, fiind

neinvazivă, eficientă si cu cost redus.

Se utilizează două modalităti de examinare:

a. ecografia transabdominală, cu traductor de 2-5 MHz, care permite evaluarea

morfologică a leziunilor focale: contur, dimensiuni, ecostructură, relatia cu vasele

intrahepatice, precum si evaluarea patologiei difuze subiacente: ciroză, hipertensiune

portală. Examinarea în mod B este îmbunătătită, din punct de vedere al rezolutiei

spatiale si de contrast, prin utilizarea armonicilor tisulare. Asocierea tehnicii Doppler

permite caracterizarea vascularizatiei lezionale, dar deoarece metastazele sunt

frecvent hipovascularizate, sunt necesari agenti de contrast cu administrare

intravenoasă, care cresc impedanta acustică a vaselor tumorale si permit evaluarea cu

acuratețe a vascularizatiei tumorale. Dacă pentru ecografia în mod B, sensibilitatea

este de 50-75%, iar specificitatea de 50-65%, utilizarea contrastului creste

sensibilitatea la peste 90% .

37

b. ecografia intraoperatorie combină examinarea ecografică cu inspectia si palparea

intraoperatorie. Utilizează traductor de 5-7,5 MHz, cu forme si dimensiuni ce permit

explorarea în spatii înguste (de exemplu, între grilajul costal si partea laterală a

ficatului).

Are acuratete mare atât pentru detectarea leziunilor, evidentiind leziuni solide de la 3-5 mm,

cât si pentru caracterizarea lor (mai bună localizare la nivelul segmentelor hepatice si mai

bună caracterizare a relatiei cu structurile vasculare, cu identificarea planului vascular de

rezectie), de aceea este considerată metoda cu cel mai mare impact asupra conduitei

intraoperatorii. Sensibilitatea este de peste 95% si specificitatea de 98%, depistând cu 10-

15% mai multe metastaze decât examenul CT si cu 19-32% mai multe decât examenul IRM.

Detectia ecografică a unei leziuni focale depinde de dimensiunile, localizarea, ecogenitatea si

efectul de masă pe care îl determină asupra vaselor intrahepatice si conturului hepatic.

Ecogenitatea este foarte variabilă: leziuni hiperecogene cu halou hipoecogen periferic, leziuni

hipoecogene sau mixte "în cocardă", "bulles eye". Fără a exista o corelatie strictă între

aspectul ecografic si tumora primară, unele aspecte sunt mai frecvent asociate cu o anumită

tumoră: metastaze hiperecogene în cancerul de colon, tumori neuroendocrine, cancerul renal,

coriocarcinom, metastaze hipoecogene în cancerul mamar, pulmonar, pancreatic, metastaze

calcificate în adenocarcinoame mucinoase (colon, ovar, stomac, sân).

Comportamentul la contrast este caracteristic în cele trei faze: faza arterială diferentiază

metastazele hipovascularizate, care sunt hipoecogene, de cele hipervascularizate, care devin

intens ș\si omogen hiperecogene, în timp ce în faza portală si cea tardivă toate metastazele

devin hipoecogene comparativ cu restul parenchimului, care rămâne contrastat. Astfel,

ultimele două faze îmbunătătesc detectia leziunilor cu diametrul sub 1 cm si a celor

izoecogene.

B. CT multidetector

38

Este o metoda utilizată pentru depistarea si caracterizarea leziunilor secundare, stadializarea

preterapeutică si depistarea recurentei după tehnicile de ablatie. De asemenea, este metoda

standard pentru realizarea volumetriei si are rol de ghidaj al unor proceduri percutane.

Examinarea se realizează cu un echipament multidetector, cu colimare de 5 mm si

reconstructie de 5 mm. Achizitia se face după injectarea intravenoasă a contrastului iodat

hidrosolubil (2 ml/kg corp), în timp arterial si portal. Acest protocol de examinare permite

diferentierea metastazelor hipervascularizate de cele hipovascularizate si a leziunilor benigne

de cele maligne. În ultimii ani, pentru a reduce cât mai mult doza de iradiere a pacientilor ce

efectuează examene CT repetate, pentru monitorizarea evolutiei, se recomandă doar achizitia

în fază portală (la 60-70 secunde de la injectare), cu o bună acuratete în depistarea

metastazelor.

Aspectul CT caracteristic este de leziuni nodulare hipodense nativ, ce captează contrast în

timp arterial (omogen, heterogen sau periferic, în functie de gradul de vascularizatie), si devin

hipodense fată de restul parenchimului hepatic în faza portală (Figura a1-3). Aspectul

hipervascularizat in timp arterial pune problema diagnosticului diferential intre un carcinom

hepatocelular si o leziune secundara hepatica (figura a4).

Figura a1. Hepatom segment IV – leziune hipervascularizata in timp arterial si care devine

hipodensa in timp portal.

39

Figura a2. Examen CT abdominal – metastaze hepatice hipodense în faza portală

Figura a3. CT abdomen – metastaze hepatice: caracterizarea raportului cu structurile

vasculare

40

Rata de detecție a metastazelor este de 75-85% comparativ cu explorarea intraoperatorie (cu

examen anatomo-patologic și ecografie intraoperatorie). Rezultatele fals negative se

datorează leziunilor mai mici de 1,5 cm (dificil de depistat și caracterizat). Rezultatele fals

pozitive sunt date de leziuni hepatice benigne (hemangioame, adenoame biliare, hamartoame

biliare, fibroză periportală).

C. Imagistica prin rezonanţă magnetică

Este considerată în unele studii cea mai bună metodă pentru depistarea leziunilor secundare.

Protocolul standard include secvențe ponderate T1 și T2 native și post-contrast. Secvențele

rapide ponderate în T1, de tip ecou de gradient (GRE) sunt utile pentru depistarea infiltrării

adipoase a parenchimului. Pentru secvențele ponderate T2 se preferă cele de tip turbo-spin

echo (TSE). Pe secvențele native T1 metastazele hepatice sunt, în general, ușor hipointense;

ele pot deveni hiperintense față de parenchimul hepatic în prezența hemoragiei și a melaninei

(metastaze de melanom). Pe secvențele T2, metastzale sunt ușor hiperintense, diferența de

semnal fiind accentuată de prezența edemului și a necrozei. Secvențele postcontrast sunt

esențiale în depistarea și caracterizarea leziunilor. Tipul contrastului utilizat, doza și timpul

de scanare sunt factori decisivi pentru acuratețea diagnosticului. Există trei tipuri de

substanțe de contrast utilizate în IRM:

a. contrast extracelular (chelat de gadoliniu), care oferă informații identice cu

cele date de contrastul iodat la CT: metastazele hipervascularizate contrastează

precoce, intens și de scurtă durată în faza arterială, iar cele hipovascularizate

contrastează tardiv; maximul de contrast între parenchimul hepatic și leziuni

este atins în faza portală;

b. substanțe captate în sistemul reticuloendotelial (superparamagnetice), numite

și contrast negativ, care determină scăderea intensității parenchimului hepatic

în secvențele ponderate T2, astfel încât metastazele, care nu conțin celule

Kupffer, apar hiperintense pe secvențele postcontrast;

41

c. substanțe specifice cu captare hepatocitară și excreție biliară, care determină

creșterea intensității parenchimului postcontrast, în timp ce metastazele, care

nu conțin hepatocite, rămân hipointense.

IRM permite o caracterizare mai bună a leziunilor, în special a celor de mici dimensiuni,

comparativ cu examenul CT, precum și o detecție mai bună, dar incă limitată pentru leziunile

infracentimetrice. Mai buna caracterizare scade rata rezultatelor fals pozitive, astfel încât

acuratețea diagnosticului crește spre 93-95% cu utilizarea contrastului superparamagnetic.

Secvențele dinamice oferă informații funcționale asupra țesutului tumoral, evaluarea

vascularizației tumorale fiind utilă atât pentru predicția răspunsului la tratament, cât și pentru

monitorizarea acestui răspuns.

D. PET-CT

Spre deosebire de metodele imagistice secționale, care aduc informații predominant

morfologice, PET-CT este o metodă imagistică ce adaugă informații funcționale localizării

secționale a leziunilor. PET era deja recunoscută ca fiind metoda cea mai sensibilă în

depistarea metastazelor hepatice de la cancerele digestive și în diferențierea leziunilor active

de cele cicatriceale, iar combinarea cu examinarea CT permite localizarea lor cu precizie.

Este utilizată atât pentru depistarea leziunilor secundare, cât și pentru caracterizarea lor din

punct de vedere funcțional, în vederea predicției răspunsului terapeutic la chimioterapie, prin

aprecierea gradului de vascularizație sau hipoxie a țesutului tumoral.

PET-CT este utilă și pentru aprecierea recurenței după ablație, având avantajul identificării

zonelor cu activitate metabolică ridicată în cadrul țesutului tumoral, aspect nu totdeauna

evidențiat corect prin comportamentul la contrast în studiile CT și IRM. Aceste informații

permit ghidarea cu precizie a biopsiilor sau a tehnicilor de ablație, în special pentru leziuni

care nu sunt detectabile prin alte metode imagistice. Metoda are dezavantajul gradului mare

de iradiere.

42

ROLUL METODELOR IMAGISTICE ÎN EXPLORAREA TUMORILOR MALIGNE

HEPATICE

1. Detectarea leziunilor și caracterizarea leziunilor hepatice

Nu există un consens asupra metodei imagistice optime pentru depistarea metastazelor.

Metoda ideală pentru îndeplinirea acestui obiectiv ar trebui să aibă o bună rezoluție spațială,

un contrast optim între leziune și parenchim, un semnal sau o densitate specifice leziunii. De

asemenea, comportamentul caracteristic la contrast ar permite o mai bună caracterizare a

leziunilor, cu evitarea rezultatelor fals pozitive. Depistarea metastazelor hepatice este

esențială pentru alegerea opțiunii terapeutice, evaluarea corectă preoperatorie reducând rata

recidivei.

Cele două metode imagistice care îndeplinesc în mare parte aceste criterii sunt examenul CT

multidetector și IRM (Fig.a4,a5). Utilizarea lor în algoritmul de diagnostic ține cont atât de

acuratețea fiecărei metode (mai mare pentru examenul IRM cu contrast), cât și de costul

explorării, disponibilitatea echipamentelor, iradierea pacienților și contraindicațiile

metodelor sau a substanțelor de contrast.

Figura a4. CT abdominal – metastaze hepatice bilobare

43

Figura a5. IRM hepatic: evidențiază leziunile metastatice și caracterizează relația lor cu

structurile vasculare

2. Aprecierea rezecabilității

Localizarea cu precizie în segmentele hepatice, caracterizarea relației cu venele hepatice,

vena portă, hilul hepatic și diafragmul sunt elemente esențiale pentru alegerea opțiunii

terapeutice optime (rezecția hepatică vs. tehnici de distrucție termică sau chimică percutane

sau laparoscopice). Și pentru acest obiectiv, nu există un consens în privința celor două

metode (CT vs. IRM). Examinarea postcontrast și tehnicile de reconstrucție multiplanară sunt

necesare pentru caracterizarea acestor elemente. Metoda imagistică ce influențează, de multe

ori, decizia chirurgului este ecografia intraoperatorie.

3. Realizarea volumetriei vizează două aspecte:

- aprecierea volumului leziunilor metastatice hepatice, element important pentru evaluarea

corectă preterapeutică și, implicit, alegerea metodei terapeutice optime, precum și pentru

monitorizarea răspunsului la tratament. Calcularea volumului metastazelor se face pe metode

secționale (CT, IRM), fie prin măsurarea celor 3 diametre, fie prin utilizarea unor algoritmi

de calcul;

44

- calcularea volumului hepatic în vederea aprecierii parenchimului restant post-rezecție și a

riscului de apariție a insuficienței hepatice.

4. Ghidarea tehnicilor intervenţionale

-vasculare: embolizarea metastazelor hipervascularizate (chemoembolizare intraarterială

terapeutică);

-puncţii diagnostice cu ac fin: ghidaj ecografic sau CT;

-puncţii terapeutice ghidate ecografic sau CT: injectare intratumorală de alcool absolut

(necroză tisulară intensă) cu ghidaj ecografic sau CT, pentru tumori cu diametrul mai mic de

3 cm; termonecroză percutană (radiofrecvență, vapori apă, microunde); injectare de anticorpi

monoclonali intratumorali; efectuarea chimioterapiei liposomale intratumorală, eventual

asociată cu nanoparticule radioactive.

45

Analiza sistemelor de ghidaj stereotaxic bazate pe diferite metode

imagistice

In acest scop, echipa si-a propus sa realizeze anterior analiza sistemelor de ghidaj stereotaxic

bazate pe diferite metode imagistice, pentru a putea concepe modelul de ghidaj percutan al

fascicolului de microunde necesar pentru termo-chimioterapie

Principiul stereotaxiei si definirea termenilor

Pentru localizarea unei leziuni in cele 3 planuri, se utilizeza un sistem cartezian, care

specifica pozitia unui punct prin raportarea la coordonatele ce reprezinta distanta de la acel

punct la trei planuri perpendiculare unele pe altele.

Un marker de reperaj este un obiect plasat in campul de examinare al unui sistem imagistic,

care apare pe imaginea obtinuta si este utilizat ca punt de referinta sau ca reper pentru

masuratori. Acest reper poate fi plasat pe sau in interiorul corpului examinat.

Pentru efectuarea unei proceduri stereotaxice sunt necesare trei componente:

a. Un sistem de planificare a abordului stereotaxic, care include examenele imagistice

multimodale efectuate anterior procedurii, cu coordonarea leziunilor prin toate aceste

metode, precum si calculele coordonatelor leziunilor ce trebuie abordate;

b. Un echipament de stereotaxie;

c. O procedura imagistica optima pentru plasarea echipamentului de stereotaxie si

efectuarea procedurii.

Toate sistemele moderne de planificare a stereotaxiei sunt computerizate si permit realizarea

unui ”atlas” de stereotaxie, care cuprinde o serie de sectiuni la nivelul structurilor anatomice

de interes vizualizate simultan cu o retea bidimensionala. Astfel, fiecarei structuri ii pot fi

raportate trei coordonate numerice, care vor fi utilizate pentru reperajul ulterior al leziunii.

Cele trei axe sunt latero-laterala (axa X), dorso-ventrala (Y) si cranio-caudala (Z).

46

Prin urmare, pentru realizarea unei proceduri stereotaxice se utilizeaza coordonatele CT

stabilite in timpul examinarii si o retea externa ce permit plasarea cu acuratete a

instrumentului terapeutic in interiorul leziunii, in cazul proiectului nostru acesta fiind

fascicolul de microunde care trebuie centrat pe leziune. Reteaua externa de ghidaj trebuie sa

cuprinda bare gradate si sisteme de fixare pe zona de explorat, pornind de la un punct zero

stabilit anterior. Barele de ghidaj sunt orientate in cele trei planuri.

Utilizarea retelei externe de ghidaj fixata la zona de interes faciliteaza reperajul leziunii si

raportarea la cele trei axe. Trebuie luat in considerare ca reperele anatomice pot avea pozitie

variabila in functie de pozitia pacientului si de tipul respiratiei.

Majoritatea echipamentelor stereotaxice existe pana in prezent sunt destinate biopsiilor

(inspecial cerebrale, dar si mamare, sub ghidaj CT sau mamografic) si procedurilor

terapeutice in sfera neurochirurgiei. Nu exista inca sisteme de ghidaj stereotaxic externe

pentru proceduri hepatice.

Un sistem eficient de ghidaj extern este un sistem care sa poata fi aplicat si fixat pe pacient si

care sa intruneasca urmatoarele conditii :

Sa fie realizat din materiale care sa poata fi detectate pe imaginea CT fara sa produca

artefacte ;

Sa poata fi fixat la masa echipamentului CT fara sa afecteze miscarea acesteia in

timpul scanarii ;

Sistemul de fixare sa nu fir invaziv pentru pacient, dar sa limiteze eficient

mobilitatea ;

Sistemul de fixare trebuie sa fie adaptat la diferite conformatii ale abdomenului si

diferite dimensiuni ale pacientilor ;

Sa aiba un sistem de ghidaj al miscarii barelor gradate care sa permita miscari fine (1

mm) si care sa fie usor de controlat si manipulat ;

Sa aiba un sistem de fixare a echipamentului generator de microunde si sa permita

miscarea acestuia in timpul pozitionarii ;

Sa poata fi usor de inlaturat pentru a permite interoducerea intraarteriala a

nanoparticulelor.

47

In urma analizei facilitatilor tehnice pe care le avem la dispozitie in acest moment legate de

vizualizarea in vivo a unei structuri patologice prin metode imagistice, precum si de

posibilitatea de ”tintire” stereotaxica a unei leziuni, am enuntat cele cateva probleme pe care

le ridica modalitatea de tratament evaluata in prezentul studiu si care reprezinta si planul de

lucru, cu intrebarile la care trebuie sa gasim solutii in urmatoarea etapa a WP5:

Stabilirea volumetriei corecte a leziunilor tinta si reperajul percutan al acestui volum

prin utilizarea unor repere externe;

Ghidarea fascicolului de microunde pe un volum si nu pe o portiune punctiforma de

tesut, cum este cazul biopsiilor stereotaxice;

Focalizarea corecta a fascicolului pe leziunea tinta;

Stabilirea unui algoritm corect de ghidaj in cazul leziunilor multiple ;

Realizarea sistemului de ghidaj stereotaxic extern.

48

Stabilirea volumetriei corecte a leziunilor tinta si reperajul percutan al

acestui volum prin utilizarea unor repere externe

Pentru acest obiectiv enuntat am inceput calcularea coordonatelor CT a leziunilor hepatice pe

cazuri clinice deja explorate (studiu retrospective).

Material. Metoda

Ca material am selectat un lot de 10 de pacienti atat cu leziuni hepatice, dar si fara leziuni

focale hepatice, care au necesitat schimbarea pozitiei de examinare in timpul scanarii. Toti

pacientii au fost explorati prin examen CT abdominal cu achizitie nativa si după injectarea

intravenoasă a contrastului iodat hidrosolubil (2 ml/kg corp), în timp arterial si portal.

Aceasta prima scanare a fost realizata cu pacientul in decubit dorsal, care reprezinta pozitia

standard de scanare. Dupa achizitia acestor secvente, pacientul a fost pozitionat in decubit

ventral sis-a efectuat o noua scanare. Pentru fiecare caz s-au stabilit structurile sau leziunile

de interes (pentru cazurile fara leziuni focale – ramuri de vena porta). S-a calculat pozitia lor

raportata la structuri osoase de reperaj in cele trei planuri, atat pe achizitiile in decubit dorsal,

cat si pe cele in decubit ventral. Am stabilit pentru fiecare caz un numar de trei repere osoase,

usor de identificat si percutan. In acest scop, am folosit : rebordul costal si creasta iliaca, iar

ca linii de reper linia medioclaviculara, linia axilara anterioara, medioaxilara.

Exemplificam cu unul dintre cazurile studiate:

Am ales ca leziune tinta o calcificare localizata subcapsular, la nivelul segmentului

VI, cu dimensiuni de 4 x 2 x 4 mm ;

Pe achizitia in decubit dorsal am calculat pozitia leziunii prin coordinate in planuri

ortogonale, raportata la peretele abdominal anterior, peretele abdominal lateral si

creasta iliaca;

Pe achizitia in decubit ventral am calculate aceleasi repere;

49

a. Pacient in decubit dorsal

b. Pacient in decubit ventral (distante pe axa Z)

50

c. pacient in decubit dorsal (axa X) d. pacient in decubit ventral (axa X)

e. pacient in decubit dorsal (axa Y) f. pacient in decubit ventral (axa Y)

51

Variatia distantei pe axa Y intre marginea anterioara ramului drept portal la origine si peretele

abdominal anterior la examinarea cu pacientul in decubit dorsal (g) si in decubit ventral (h).

Rezultatele preliminare arata ca exista o diferenta de pozitie pe coordonata pe care s-a

efectuat miscarea pacientului (axa Y in cazul exemplificat in care s-a schimbat pozitia

pacientului din decubit dorsal in decubit ventral). Variatiile sunt mai mari pentru structurile

anatomice (ex. vena porta). Pentru celelalte doua axe variatiile sunt minime (1 mm in cazul

exemplificat).

52

PROBLEMATICA INTERACŢIUNII RADIAŢIEI

ELECTROMAGNETICE CU SUBSTANŢA

Există trei modalităţi fundamentale, diferite, de abordare a problematicii interacţiunii radiaţiei

electromagnetice cu substanţa:

1. prin intermediul teoriei microscopice a parametrilor (macroscopici) şi ;

2. prin rezolvarea analitică sau numerică a ecuaţiilor de propagare (de regulă ecuaţiile

Helmholtz);

3. cu ajutorul modelului Schelkunoff care face apel la coeficienţii Fresnel de reflexie

şi transmisie generalizaţi.

Aceste metode sunt complementare şi se aplică în funcţie de problema concretă care

trebuie rezolvată. Deşi tema tratată se bazează pe modelul Schelkunoff, vor fi abordate

sintetic şi celelalte metode teoretice, cu evidenţierea avantajelor şi rezultatelor concrete care

decurg.

Prin TEORIA OSCILATORULUI se înţelege în general studiul oscilatorului de

ordinul doi şi în speţă studiul sarcinii legate sau libere (electron) ca oscilator de ordinul doi.

Ecuaţia diferenţială care descrie ELECTRONUL ca sistem oscilant, sub acţiunea câmpului

electromagnetic, este (analog cu oscilatorul mecanic de ordinul doi):

m x k x m x q E ee e e e

j t 0

(1)

În ecuaţia (1) semnificaţia mărimilor fizice este următoarea:

- me este masa electronului = 9,11x10-31

kg;

- x este deplasarea şi respectiv derivatele temporale ale deplasării;

- mex este termenul corespunzător forţei F = ma;

- ke = me02 este coeficientul forţei electrice de natură elastică (kx) care ia naştere la

deplasarea electronului în sens contrar faţă de atracţia nucleară;

- 0 este pulsaţia de rezonanţă a sarcinii legate (electron);

- are dimensiunile unei frecvenţe şi se defineşte prin -1

care reprezintă timpul

mediu de relaxare a electronului (a curenţilor tranzitorii care apar atunci când câmpul electric

local E0 capătă brusc o altă valoare);

53

- mex este termenul care semnifică disiparea de energie prin fenomenul de

FRÂNARE PRIN RADIAŢIE corespunzător frecării de la oscilatorul mecanic;

- qe este sarcina electronului = 1,6x10-19

C;

- E0 este amplitudinea componentei electrice a câmpului electromagnetic local care constituie

excitaţia oscilatorului;

- este pulsaţia câmpului de excitaţie.

Singura mărime neexplicitată încă în funcţie de mărimi primare este :

Nq

m

e

e cc

p cc

2

0

2

;

p

e

e

Nq

m

2

0

; NN

M

A

A

(2)

În relaţiile de mai sus avem următoarele definiţii ale mărimilor fizice:

- N este numărul de atomi neutri pe unitatea de volum;

- NA este numărul lui Avogadro = 6x1026

kmol-1

;

- cc este conductivitatea electrică de curent continuu;

- este densitatea elementului respectiv;

- MA este masa atomică a elementului respectiv;

- p este pulsaţia de rezonanţă a plasmei (electroni liberi).

Din expresia pulsaţiei de rezonanţă se poate deduce imediat:

f N Np m cm 9 90003 3 (3)

Langmuir şi L.Tonks au arătat în 1928 că plasma reacţionează ca un mediu elastic care

posedă o frecvenţă proprie de oscilaţie (frecvenţa plasmei) proporţională, aşa cum se observă din

relaţia (56), cu rădăcina pătrată a numărului de electroni în unitatea de volum (N), caracterizând

astfel comportarea colectivă a electronilor şi ionilor. Rezultă că N reprezintă în acelaşi timp numărul

de atomi pe unitatea de volum în materialul neexcitat, dar şi numărul de electroni (ioni) care

formează plasma. Din punct de vedere formal fenomenul conductibilităţii electrice şi al polarizării

dielectrice sunt descrise pe baza aceluiaşi model fizic al oscilatorului clasic.

Ecuaţia (1) este folosită ca model matematic pentru descrierea tuturor fenomenelor

fizice care ţin de CONDUCŢIE, POLARIZABILITATE şi DIFUZIE, aşa cum se arată în

sinopticul din pagina următoare. Soluţia acestei ecuaţii (cu toţi termenii) poate fi scrisă ca:

54

22

0

2222

0

2

0000 ;;

tg

e

m

Eqxexx

tj

e

ej

(4)

În Fig.1a sunt reprezentate curbele acestor mărimi ca funcţie de frecvenţă; evident, alura este

aceea cunoscută de la circuitul oscilant RLC. În loc să descriem comportarea unui oscilator în funcţie

de CARACTERISTICA DE AMPLITUDINE şi CARACTERISTICA DE FAZĂ, o putem

face ca SUMĂ DE DOUĂ AMPLITUDINI folosind relaţia din analiza Fourier a semnalelor

(pe baza căreia se face reprezentarea unui semnal printr-o pereche de spectre real/imaginar):

C t A t B t cos sin cos (5)

B

AarctgCBCA

BAC

;cos;sin

;222

A() reprezintă amplitudinea absorbtivă defazată cu 900 faţă de forţa de excitaţie, iar B()

este amplitudinea dispersivă (elastică), în fază cu forţa de excitaţie (Fig.1b). Evident, cele

două reprezentări sunt echivalente, dar în domeniile spectroscopiei şi polarizării se preferă

cea de-a doua deoarece corespunde mărimilor care pot fi efectiv măsurate.

56

Figura 1 Caracterizarea oscilatorului electric de ordinul doi în funcţie de frecvenţă

a) caracteristicile de amplitudine şi fază

b) amplitudinile absorbtivă şi dispersivă (elastică)

Se observă că omiterea termenului kex este proprie fenomenelor în care sunt implicaţi electroni liberi,

fie că este vorba de metale, plasmă sau difuzia de electroni liberi, în timp ce termenul mex se

anulează atunci când ne situăm departe de regiunea de rezonanţă. Un caz deosebit este a treia formă

a ecuaţiei care permite calculul conductibilităţii electrice complexe (cu componentă absorbtivă şi

respectiv elastică). Rezultă că cele două componente (absorbtivă şi elastică) sunt proprii atât

conductibilităţii electrice cât şi permitivităţii electrice . Conform acestei ecuaţii, Cu, de exemplu,

prezintă pentru frecvenţe mai mari decât IR (domeniul frecvenţelor elastice) o conductivitate

complexă, fiind sau REFLECTOR PERFECT sau TRANSPARENT.

CONDUCTIVITATEA ELECTRICĂ ŞI PERMITIVITATEA DIELECTRICĂ

Teoria microscopică explică cu bune rezultate (corectate în unele cazuri de teoria

cuantică) majoritatea fenomenelor din fizica interacţiunii câmpului electromagnetic cu

substanţa. Plecând de la semnificaţia esenţială a permitivităţii dielectrice - mărime

macroscopică care arată “cât de eficient” este un câmp electric E în polarizarea unui material

57

- teoria stabileşte anumite legături între mărimile microscopice şi cele macroscopice, şi ,

care se pot determina experimental. Asemenea relaţii sunt, de exemplu, ecuaţia lui Debye

pentru cazul gazelor nu prea dense şi ecuaţia Clausius-Mosotti pentru materiale dense, adică

relaţiile caracteristice POLARIZĂRII DIELECTRICE (de deformare, ionică şi electronică):

d r dN 1 ecuaţia Debye (6)

r

r

dN

1

2 3 ecuaţia Clausius-Mosotti (7)

unde

d este susceptivitatea electrică (d=r-1 reprezintă relaţia de definiţie), r este permitivitatea

dielectrică relativă, N numărul de atomi (ioni) sau de molecule ionice pe unitatea de volum,

iar d polarizabilitatea electrică (ionică sau/şi electronică) care arată capacitatea unui atom de

a permite inducerea unui moment electric cu ajutorul unui câmp E.

In afară de tipul de polarizare menţionat deja, substanţele cu molecule polare prezintă

permitivităţi dielectrice de valori foarte mari, fenomen descris de POLARIZAREA

PARAELECTRICĂ (de orientare) şi respectiv formula Curie-Langevin:

kT

pNNr

0

2

00000

31

(8)

unde p0 este momentul electric, 0 reprezintă polarizabilitatea de orientare, N0 este numărul

de molecule polare din unitatea de volum iar k şi T reprezintă constanta lui Boltzman

(k=1,38x10-23

J/K) şi respectiv temperatura în grade Kelvin.

Ecuaţia Clausius-Mosotti este susceptibilă de generalizare, referitor la un material

care ar prezenta toate cele 3 tipuri de polarizare (electronică, ionică şi de orientare), dar

numai pentru solide sau gaze sub presiune înaltă:

32

1

N

r

r

(9)

Relaţia (9) este cunoscută ca varianta Debye a ecuaţiei Clausius-Mosotti în care:

N N N Ne e i i 0 0 , indicii e, i şi 0 reprezentând cele 3 tipuri de polarizaţie.

În afară de fenomenele specificate, dielectricii neomogeni mai prezintă o polarizaţie

electrică de neomogenitate, care nu este distinctă faţă de cea de orientare din punct de vedere

al mecanismului microscopic de producere, fiind consecinţa apariţiei unei sarcini electrice

adevărate pe suprafeţele de separaţie ale părţilor omogene (încărcarea electrică a acestor

58

suprafeţe, la stabilirea unui câmp electric exterior). Gamele de frecvenţă în care se pot

manifesta cele patru tipuri de polarizaţie, la dielectrici, sunt:

Pentru frecvenţe mai mari decât 1015

Hz, corpurile nu mai prezintă nici un fel de

polarizaţie. Este important de remarcat că polarizarea de deformare se caracterizează prin

frecvenţele de rezonanţă, în timp ce polarizarea de orientare este caracterizată de frecvenţa

de relaxare. În Fig.2 sunt prezentate curbele caracteristice celor două tipuri de “rezonanţe

dielectrice”şi schemele echivalente care modelează fenomenul.

Din cauza componentei ABSORBTIVE reprezentată de r , defazată cu 900 faţă de

componenta ELASTICĂ, şi deci sinfazică faţă de curentul rezistiv reprezentat de cc, rezultă

că nu se poate face o separare fizică, printr-o măsurătoare de orice tip, a celor două mărimi:

r, cc. De aceea sunt utilizate în mod curent următoarele relaţii:

- pentru dielectrici cu considerarea rezonanţelor dielectrice

n jr r r

2 ' " (10)

- pentru dielectrici conductivi fără considerarea rezonanţelor dielectrice

0

'2

jn rr (11)

sau o combinaţie a relaţiilor de mai sus pentru cazurile complexe, funcţie de structura ecuaţiei

de ordinul doi care modelează fenomenul;

59

Formula de mai sus a conducţiei echivalente în domeniul frecvenţelor pur elastice

provine din expresia conductibilităţii complexe dedusă din a treia formă a ecuaţiei

oscilatorului:

0

2

; jjm

Nq

e

e (12)

60

Fig. 2 Modelul clasic al comportării dielectricilor în funcţie de frecvenţă (caracteristici şi

scheme echivalente):

a) pentru polarizaţiile electronică şi ionică (schema echivalentă redusă este

valabilă în regiunile depărtate de 0); b) pentru polarizaţia de orientare.

Fenomenele (microscopice) din această regiune a spectrului pot fi exprimate prin

două modele macroscopice absolut echivalente în baza celei de-a doua relaţii din (12):

22

2

22

2

e

e

e

e

m

Nqj

m

Nq (13)

Nq

mj

Nq

m

e

e

e

e

2

02 2

2

02 2

1

(14)

61

Se observă din relaţiile de mai sus că partea reală a conductivităţii electrice este mai

mică decât conductivitatea de curent continuu cc, în această regiune a spectrului;

conductivitatea reală (în fază cu câmpul) scade cu creşterea frecvenţei.

ORIGINEA INDICELUI DE REFRACŢIE

Pentru mediile nemagnetice permitivitatea relativă complexă este identică cu indicele

complex de refracţie (n*2

=r* sau n

2=r). În domeniile în care n şi deci r cresc cu frecvenţa,

se spune că materialul prezintă DISPERSIE NORMALĂ, iar dacă n şi respectiv r scad cu

frecvenţa, vom avea DISPERSIE ANORMALĂ. Dispersia undelor electromagnetice este

reprezentată, deci, de dependenţa vitezei de propagare ca funcţie de frecvenţă.

Relaţiile care exprimă componentele elastică şi respectiv absorbtivă derivă din

expresia în complex a lui r* sau n

*. Această expresie reprezintă formula de dispersie a fizicii

clasice. Deşi această formulă se verifică foarte bine în domeniul frecvenţelor utilizate în

ingineria electrică şi de asemenea prezice corect apariţia liniilor spectrale (în experimentele

din domeniile IR, vizibil, UV), totuşi nici intensitatea şi nici valoarea frecvenţelor acestor

linii nu pot fi date exact prin aceste consideraţii clasice.

In teoria interacţiunii câmpului electromagnetic cu substanţa parametrul principal al

formalismului care descrie fenomenele este INDICELE DE REFRACŢIE (mărime complexă

în cazul cel mai general). Acesta este echivalent cu CONSTANTA DE PROPAGARE

(mărime folosită în mod uzual în ingineria electrică) şi cu NUMĂRUL DE UNDĂ (mărime

folosită, ca şi indicele de refracţie, în domeniul radiaţiei electromagnetice de foarte înaltă

frecvenţă - optică, U.V., raze X). Relaţiile de echivalenţă între cele trei mărimi se pot scrie:

n

ckn

cjjk ; (15)

Expresiile care definesc pe *, k

* şi n

* se deduc din ecuaţiile de propagare în diferite

medii, care la rândul lor se obţin din ecuaţiile lui Maxwell scrise pentru acele medii. Viteza

de propagare a radiaţiei electromagnetice este funcţie de indicele de refracţie care la rândul

său este dependent de frecvenţă, în anumite domenii (fenomenul dispersiei) şi de parametrii

macroscopici , , . Aceste dependenţe pot fi exprimate sintetic prin următoarea relaţie:

62

VITEZA DE PROPAGARE, vc

nn f ( , , , ) (16)

(viteza de fază)

Relaţia (16) explică, printre altele, atât “deformarea” semnalelor electrice de-a lungul

liniilor de transmisiuni, la anumite frecvenţe, cât şi descompunerea luminii albe în spectrul

cunoscut, la trecerea printr-o prismă de sticlă. Ambele exemple aparţin fenomenului de

dispersie. În cele ce urmează se va demonstra că modificarea vitezei de propagare în diferite

medii (c/n în loc de c) este dependentă de parametrii macroscopici , , . Aceştia nu

determină efectiv o modificare de viteză, câmpul propagându-se oriunde cu viteza c; viteza

aparentă c/n este rezultatul însumării câmpului iniţial (incident) cu acele câmpuri care

constituie O REACŢIE A MATERIEI (SUBSTANŢĂ / MATERIAL) la radiaţia

electromagnetică. În această concepţie, modificarea vitezei de propagare şi toate celelalte

consecinţe care apar la propagarea radiaţiei se pot deduce din două cauze esenţiale:

a) CÂMPUL ELECTRIC TOTAL POATE FI ÎNTOTDEAUNA REPREZENTAT

PRIN SUMA CÂMPURILOR DATORATE TUTUROR SARCINILOR DIN UNIVERS;

b) CÂMPUL PRODUS DE O SARCINĂ ESTE FUNCŢIE DE ACCELERAŢIA

ACESTEIA, EVALUATĂ ÎNTOTDEAUNA CU O RETARDARE CALCULATĂ CU

VITEZA c.

Pe baza consideraţiilor de mai sus putem evalua câmpul produs de un ecran, adică

exact reacţia materialului respectiv; situaţia descrisă este reprezentată în Fig.3. Dacă câmpul

ES produs de o sursă oarecare are expresia ES=E0ejt

, atunci amplitudinea forţei electrice care

acţionează asupra sarcinilor din material este qeE0.

63

Fig. 3 Ecran plan subţire cvasiinfinit caracterizat de şi .

a) Evaluarea câmpului transmis; b) Diagrama vectorială caracteristică

Soluţia ecuaţiei care descrie fenomenul (modelul Lorentz) este asemănătoare cu

soluţia completă din (4), dar la care putem face abstracţie de termenul ce reprezintă

disiparea de energie prin fenomenul de frânare prin radiaţie:

tj

e

etj em

Eqxex

2

0

2

00 (17)

Cunoscând ecuaţia de mişcare a electronilor din material se poate calcula câmpul

produs de ecran; câmpul produs de un strat de sarcini care se mişcă împreună sub influenţa

unei radiaţii incidente este:

c

ztlasarcinilorviteza

c

NTOTALCAMPUL

02 (18)

unde

N reprezintă, în acest caz, numărul de atomi pe unitatea de arie a ecranului. Deşi câmpul

electromagnetic este proporţional cu acceleraţia sarcinilor, prin procesul de integrare în

expresia (18) apare viteza sarcinilor. Faptul că viteza sarcinilor electrice este considerată la

64

timpul t=t-z/c este consecinţa directă a soluţiei potenţialelor retardate. Astfel, ecuaţia

undelor poate fi scrisă în funcţie de POTENŢIALELE ELECTRODINAMICE:

(19)

(20)

Soluţia generală a acestor ecuaţii (soluţia potenţialelor retardate pentru punctul de

calcul la timpul real t) este o funcţie de două variabile: una spaţială (punctul unde se află

sursa) şi cealaltă temporală reprezentată de timpul t. Acesta este timpul real t din care se

scade timpul necesar radiaţiei pentru a parcurge distanţa de la sursă la punctul de calcul adică

z/c sau z/v.

În concluzie, pentru cazul concret enunţat, câmpul total va fi:

E E

Nq

cj

q E

mecorectie ecran

e e

e

j tz

c

2 0

0

0

2 2

(21)

Aceasta reprezintă o undă suplimentară, generată de ecran, care se propagă spre

dreapta (Fig.3) şi a cărei amplitudine este proporţională cu N şi cu E0; ea depinde de

asemenea de proprietăţile atomice qe, me şi 0.

Câmpul “secundar” emis de placă sub influenţa sursei de câmp electromagnetic poate

fi evaluat şi pe baza unui raţionament complementar. În absenţa ecranului, câmpul în

punctul P ar fi SS Ec

ztEE

cos0

" . Prin introducerea ecranului se constată

experimental că UNDA SE PROPAGĂ CU O VITEZĂ MAI MICĂ prin material

(substanţă). Astfel, dacă în absenţa ecranului, timpul necesar radiaţiei pentru a parcurge

distanţa z ar fi z/c, în prezenţa acestuia se poate scrie zn/c. Diferenţa celor doi timpi de

propagare este:

z n

c

z

cn

z

ct

1 (22)

65

Aceasta ar presupune că termenul de corecţie, Ecorecţie, poate fi substituit cu o retardare

suplimentară -t în expresia câmpului EP:

E E e E e eP

j tz

cn

z

cj t

z

cj n

z

c

0

1

0

1

sau E e EP

j

S " (23)

unde c

zn

1 . Interpretarea matematică a rezultatului obţinut conduce la concluzia că

introducerea ecranului are ca efect RETARDAREA FAZEI cu unghiul ; dacă t este mic,

atunci se poate scrie (în baza relaţiei ex1+x, pentru x mic) :

e j n

z

c

j nz

c

1

1 1

(24)

din care rezultă:

c

ztj

c

ztj

P ezEnc

jeEE 00 1 (25)

Ej

cn zE ecorectie

j tz

c

1 0

Relaţiile (23) şi (25) conduc la reprezentarea vectorială din Fig.3b; aceasta înseamnă

că modificarea fazei vectorului ES” este echivalentă cu adunarea unui alt vector Ecorecţie

(termen reactiv) aproximativ perpendicular pe ES”.

Din identificarea expresiilor (21) şi (25) obţinute pentru Ecorecţie în baza celor două

raţionamente se obţine:

22

00

2

0

21

e

e

m

qNn (26)

unde s-a folosit relaţia Nz=N0, cu N0 reprezentând numărul de atomi pe unitatea de volum a

ecranului. Folosind relaţia n xx

1 12

pentru n 1 (aproximaţie adevărată în cazul

gazelor), vom obţine:

nN q

m

e

e

2 0

2

0 0

2 21

1

LEGEA DISPERSIEI NORMALE (27)

Expresia (27) are o importanţă deosebită, ea fiind practic identică cu expresia

INDICELUI DE REFRACŢIE care se poate obţine prin rezolvarea analitică a ecuaţiei

oscilatorului electric de ordinul doi, şi, în concluzie, cu relaţia componentei elastice pentru

polarizarea de deformare din cazul dielectricilor, conform consideraţiilor de la începutul

66

subcapitolului. Singura diferenţă este că expresia 02-

2 ar trebui să fie 0

2-

2-j, dar

aceasta a fost aproximaţia făcută iniţial şi este valabilă în regiunile depărtate faţă de rezonanţa

ionică sau electronică. Pe de altă parte termenul care lipseşte, corespondentul termenului

mex din ecuaţia oscilatorului, reprezintă transferul de energie de la sarcina oscilantă către

mediu; ea se regăseşte sub formă de ENERGIE DE TRANSLAŢIE şi ROTAŢIE a atomilor

sau VIBRAŢII ale moleculelor şi din punct de vedere macroscopic se numeşte CĂLDURĂ.

De asemenea, din punct de vedere macroscopic apariţia pierderilor în materialul dielectric

înseamnă că vectorii E şi D sau E şi P nu sunt în fază; curentul şi tensiunea (în cazul

condensatorului cu pierderi) sau E şi H în cazul undelor electromagnetice nu mai sunt

defazate cu exact 900 ci cu un unghi mai mic. Diferenţa =90

0- a primit numele de

UNGHI DE PIERDERI. În afara domeniilor de “rezonanţă dielectrică” tangenta unghiului de

pierderi este dată exclusiv de fenomenul conducţiei electrice: tg=/0r. Expresia (27) se

aplică pentru gaze nu prea dense şi pentru unele cristale; în caz contrar se aplică ecuaţia

Clausius-Mosotti.

Expresiile din teoria microscopică clasică (modelul Lorentz) pot deveni identice cu

cele din mecanica cuantică dacă se consideră în locul masei me şi a sarcinii qe nişte valori

efective mi şi qi care nu sunt în mod necesar egale cu cele din teoria clasică. Rezonanţa

electronilor corespunde tranziţiilor cuantice din banda de valenţă în banda de conducţie

(cca. 1014

Hz), iar rezonanţa ionilor corespunde modurilor fononice (cca. 1012

Hz).

Fig. 4 Reflexia şi transmisia undelor la suprafaţa de separaţie a doua medii. Reflexia are

loc numai în primele straturi atomice (d=/2) deoarece în profunzime unda care înaintează

spre stânga este anihilata de cea care înaintează spre dreapta; diferenţa corespunde undei

transmise.

Cu ajutorul modelului reţelei ordonate de oscilatori se poate arăta că reflexia este un

fenomen caracterizat de suprafaţa de separaţie a mediilor respective (constanta secundară Z*

67

- impedanţa de undă complexă) în timp ce transmisia şi absorbţia sunt fenomene care au loc

în masa materialului (caracterizate de constanta secundară *) aşa cum se observă în Fig.4 .

În toate celelalte direcţii (exceptând direcţia undei reflectate/transmise), undele interferă în

mod distructiv, anulându-se reciproc din cauza regularităţii reţelei considerate.

Există o demonstraţie elementară a faptului că modificarea vitezei de propagare într-

un mediu dens implică schimbarea direcţiei de propagare; se poate de asemenea demonstra

legea lui Snell, descoperită iniţial în mod experimental.

Figura 5 Referitor la schimbarea direcţiei de propagare ca fiind consecinţa directă a

modificării vitezei de propagare funcţie de mediu.

Astfel, în relaţia (22), indicele de refracţie n reprezintă factorul care modifică viteza de

propagare a radiaţiei electromagnetice la trecerea din aer (vid) în material (v0 c; v1 = c/n;

v0/v1 = n). În baza relaţiei de definiţie v = f, se poate scrie:

68

v c f vc

nf0 0 1 1 ; (28)

Deoarece frecvenţa se conservă, vom avea succesiv:

fc c

nn

n

0 1

0 1 1

0; ; (29)

adică lungimea de undă în material este mai mică cu factorul n. Faptul că oscilaţiile undei

trebuie să aibă aceeaşi frecvenţă (oscilaţiile întreţinute au aceeaşi frecvenţă cu sursa care le

întreţine) conduce la concluzia că maximele de undă, de ambele părţi ale suprafeţei de

separaţie, trebuie să fie egal distanţate în lungul liniei de separaţie, fiindcă o sarcină trebuie să

oscileze sub influenţa unei singure frecvenţe. Din Fig.5 (partea de jos) se observă că singurul

mod în care undele “se potrivesc” exact la frontieră este acela în care ele se propagă sub un

unghi diferit faţă de aer (vid).

În Fig.5 x reprezintă distanţa cuprinsă între locul în care “prima rază” a fasciculului

atinge suprafaţa de separaţie dintre cele două medii şi locul în care “ultima rază” a acestui

fascicul atinge la rândul său această suprafaţă. În intervalul de timp corespunzător “prima

rază” parcurge în material distanţa l1. În acelaşi interval de timp radiaţia parcurge în aer

distanţa l0. Rezultă : t1t0 sau l1/v1=l0/v0 . Dar v0/v1=l0/l1=n şi ţinând seama de relaţiile

geometrice l0=xsin şi l1=x sin1, rezultă :

x

xn

sin

sin

0

1

0

1

(30)

adică LEGEA LUI SNELL dedusă iniţial în mod empiric. Această relaţie stabileşte legătura

între indicele de refracţie (n) şi unghiurile de incidenţă () şi respectiv de transmisie (1).

CONDUCTIVITATEA ELECTRICĂ

În substanţă curentul electric apare ca urmare a aplicării unei tensiuni electrice sau ca

efect al câmpului electromagnetic; particulele încărcate electric capătă o mişcare ordonată a

cărei cauză este câmpul electric. Astfel, orice substanţă poate conduce în măsură mai mare

sau mai mică dacă conţine particule electrice libere. Cantitativ procesul poate fi descris prin

expresia forţei şi respectiv a densităţii de curent care ia naştere:

69

F q E J Nq ve e m ; (31)

unde

vm reprezintă viteza medie de deplasare a sarcinilor. Aplicând Legea lui Ohm generalizată se

obţine:

Nq v

E

Nq

m

e m e

e

2

; M

v

ENqm

e; M (32)

unde

M este mobilitatea sarcinilor electrice. Relaţiile (32) sunt valabile pentru următoarele tipuri

de conducţie electrică :

a) conducţie electronică (în metale şi grafit, alţi semiconductori, etc.): sarcinile

electrice sunt constituite din electroni;

b) conducţia ionică/electrolitică: sarcinile electrice sunt ioni, părţi de atomi sau

molecule, atomi sau grupuri de atomi având sarcină electrică;

c) conducţie de tip molionic /electroforetic: purtătorii sunt constituiţi în acest caz din

grupuri de molecule (molionii).

Ultimele două tipuri de conducţie sunt caracteristice unor dielectrici şi lichidelor.

Carbonul, de exemplu, prezintă o conducţie electronică de tip metal în forma GRAFIT şi o

conducţie de tip dielectric în forma DIAMANT.

CONDUCTIVITATEA ÎN METALE

Aşa cum am arătat, expresia conductivităţii electrice se poate calcula funcţie de N, qe,

vm, şi E. Sarcina electronului şi câmpul electric sunt valori cunoscute, iar N şi vm se pot

calcula conform principiilor enunţate în continuare. Astfel, numărul de electroni liberi în

unitatea de volum este dat de relaţia:

N

mW W T

W

k

e

F C F

F 2

3

32

2 3

32

h; (33)

unde avem următoarele semnificaţii ale mărimilor:

h - constanta lui Planck;

70

WF - potenţialul Fermi sau nivelul energetic cel mai înalt ocupat cu electroni la T=

00K;

WC - limita inferioară a benzii de conducţie;

k - constanta lui Boltzmann;

TF - temperatura Fermi a metalelor (deoarece TF este de ordinul 104 0K se poate arăta

că în domeniul temperaturilor ambiante WF F unde F este potenţialul chimic al

materialului).

Se poate scrie deci:

N

mF W

e

C 2

3

32

2 3

32

h (34)

In tabelul 1 sunt precizate câteva date caracteristice ale unor metale, pentru WF, TF, şi

N.

În ceea ce priveşte viteza de deplasare medie, aceasta este chiar acceleraţia înmulţită

cu timpul dintre ciocniri, adică:

vq E

m

q E

m

q E

m

l

vm

e

e

e

e

e

e T

~

(35)

Viteza unui electron este egală de fapt cu suma dintre viteza ordonată vE şi viteza de

agitaţie termică vT; deoarece direcţiile vitezei de agitaţie sunt haotice şi deci vT=0, rezultă că

viteza medie a electronului vm vm = vE (vT >> vE; vT 106 m/s iar vE10

-2 m/s). Ţinând

seama de aceste consideraţii putem scrie = l/vT unde l este drumul liber mijlociu al

electronului. Dacă facem o aproximaţie foarte largă şi admitem că ciocnirile electronilor se

produc asemănător cu cele ale moleculelor de gaz, atunci prin folosirea relaţiei

~l N r

2 0

21

în care N0 este numărul de atomi pe unitatea de volum al materialului iar r

este raza activă a unui atom, se obţine:

~; ~l

N kTr

kTsi N

m

3 2

320

0

2 (36)

Din (32) şi (35) şi apoi ţinând seama de (36) se obţine succesiv:

71

Nq

m

l

v

Nq

N v m kT

const

T

e

e T

e

T e

2 2

03 2

~

;. (37)

deoarece vT nu depinde practic de T la temperaturi uzuale. În continuare sunt tabelate câteva

date pe baza cărora se poate calcula conductivitatea metalelor:

Folosind prima relaţie din (37) s-a calculat Cu=6,27x107 -1

m-1

şi Ag = 6,63x107 -

1m

-1, valori aproximativ corecte. Relaţiile (32) şi (37) se pot demonstra conform principiilor

Fizicii statistice.

CONDUCTIVITATEA DIELECTRICILOR

Aşa cum am arătat, conductivitatea în dielectrici se explică tot prin prezenţa unor

sarcini electrice care se supun relaţiei (32). Deşi, în mod ideal, dielectricii nu ar trebui să

prezinte conductibilitate electrică, totuşi în practică se observă un curent slab (curent de

pierderi, curent rezidual) atunci când este aplicată o tensiune electrică. Astfel, deşi foarte

mare, rezistivitatea dielectricilor prezintă o valoare finită. Pentru a defini corect curentul

rezidual, acesta trebuie considerat la un timp suficient de mare după aplicarea tensiunii, deci

practic în regim permanent.

Din punct de vedere teoretic conductivitatea în dielectrici poate fi descrisă separat

pentru elemente pure (cristale) şi respectiv pentru substanţe amorfe/compozite. Astfel,

problema naturii conductibilităţii electrice în dielectrici cristalini este considerată ca o parte

a problemei mai generale a DEFECTELOR IN REŢELE CRISTALINE, adică a producerii

vacanţelor în nodurile reţelei cristaline (lattice). Defectele în reţelele cristaline pot fi de tip

Frenkel sau de tip Schottky (Fig. 7):

tip Frenkel - atunci când vacanţa formată prin plecarea unui atom (care iniţial a

ocupat poziţii în nodurile reţelei) are drept rezultat migrarea în poziţii interstiţiale ale

reţelei;

72

tip Schottky - vacanţele create au drept efect crearea unui strat suplimentar la

periferia cristalului.

Practic, conductivitatea în dielectrici cristalini se calculează cu ajutorul relaţiilor care

dau numărul de vacanţe funcţie de temperatura absolută, constanta lui Boltzmann şi energia

necesară pentru crearea unui defect; concentraţia defectelor de tip Frenkel şi Schottky

depinde exponenţial de temperatură.

Problema conductivităţii electrice a cristalelor este abordată în cadrul Fizicii corpului

solid care clasifică proprietăţile cristalelor astfel:

- PROPRIETĂŢI SCALARE (densitate, capacitate calorică, etc.)

- PROPRIETĂŢI VECTORIALE (conductivitate termică / electrică, etc.)

- PROPRIETĂŢI TENSORIALE (constanta dielectrică relativă, proprietăţi elastice,

etc.)

Cristalele, la rândul lor, spre deosebire de corpurile amorfe (sticla), sunt caracterizate

printr-o dispunere periodică regulată a particulelor constitutive; acestea pot fi:

73

CONDUCTIVITATEA SEMICONDUCTORILOR

A. CONDUCŢIA INTRINSECĂ

Sunt considerate următoarele elemente chimice, caracterizate de energia de activare a

conducţiei intrinseci, cifrele reprezentând eV:

Acestea prezintă valori ale conductibilităţii electrice cuprinse între 10-8

şi 105

-1m

-1.

Conducţia intrinsecă este conducţia electrică a unui semiconductor pur din punct de

vedere electric. Semiconductorii cristalini sunt corpuri solide care au o bandă energetică de

valenţă SATURATĂ cu electroni şi SEPARATĂ de banda de conducţie (vidă la 0K) printr-

un interval de energie relativ îngust (numit bandă interzisă), aşa cum se observă în Fig. 6.c.

Conductivitatea intrinsecă cu electroni (tip n) apare atunci când electronii trec din banda de

valenţă în banda de conducţie cu ajutorul ENERGIEI DE ACTVARE (W0) a conducţiei

intrinseci. Pe lângă conducţia de tip n poate exista şi o conducţie de tip p; aceasta este dată de

mişcarea golurilor care se formează prin plecarea unor electroni din banda de valenţă în

banda de conducţie. Conductivitatea totală este dată de suma conductibilităţilor de tip n şi

respectiv p.

74

= qeN-M- + qeN+M+ (38)

unde N reprezintă concentraţiile de electroni/goluri iar M- şi M+ mobilităţile respective (a se

vedea ultima relaţie din (91)). Conductivitatea a semiconductorilor puri creşte cu creşterea

temperaturii T:

0

20e W kT / (39)

unde

k reprezintă constanta lui Boltzmann.

B.CONDUCŢIA EXTRINSECĂ este generată de prezenţa unor centri de impurităţi,

care pot fi:

- atomi ai unor elemente străine

- atomi excedentari prin comparaţie cu compoziţia stoechiometrică a unor elemente

din compoziţia semiconductorului

- toate defectele posibile din reţeaua cristalină (noduri vide), atomi sau ioni

interstiţiali, dislocări în cristale - LA FEL CA LA CONDUCŢIA IN DIELECTRICI.

Astfel (pentru a analiza doar conducţia extrinsecă datorată impurităţilor) atomii

elementelor străine produc modificări ale câmpului electric periodic al cristalului şi

influenţează mişcarea electronilor şi starea lor energetică. Nivelele energetice ale electronilor

de valenţă aparţinând atomilor de impurităţi nu se vor găsi în benzile de energie permise ale

cristalului principal ci vor constitui nivele energetice dispuse în banda interzisă (nivele

locale). Impurităţile vor servi drept surse complementare de electroni în cristale; ele pot fi

impurităţi DONOARE şi respectiv ACCEPTOARE.

- NIVELE DONOARE (semiconductori tip n): de exemplu un atom de Ge

cuadrivalent este substitutit cu un atom de P, As, Sb pentavalent şi astfel vom avea un

electron superflu al cărui nivel energetic va fi dispus puţin sub banda de conducţie. Energia

necesară pentru ca acest electron să treacă în banda de conducţie este mică (We în cazul Si

cu As este de 0,54 eV) aşa cum se observă în Fig. 6.d.

- NIVELE ACCEPTOARE (semiconductori tip p): de exemplu un atom de Ge

cuadrivalent este înlocuit în reţeaua cristalină printr-un atom cu trei electroni de valenţă (B,

Al, In). Electronul deficitar conduce la formarea unui gol pozitiv; înlocuirea succesivă a

golurilor formate, de către electroni conduce la apariţia unui curent. Nivelele acceptoare sunt

75

dispuse puţin deasupra nivelului superior al benzii de valenţă a cristalului (la diferenţa Wh).

Energia Wh are de asemenea valori mici ( Wh în cazul Si cu B este de 0,08 eV ) aşa cum

se observă în Fig.6.d.

Prin introducerea simultană în masa semiconductorului a impurităţilor donoare şi

acceptoare se obţine o conducţie mixtă (n şi p); oricare ar fi tipul de conducţie, concentraţia

de purtători de sarcină în semiconductori este mult mai mică decât în metale.

In cazul în care potenţialul chimic al materialului (F) se află în interiorul benzii

interzise, semiconductorul este nedegenerat, fiind caracterizat de concentraţii mici ale

purtătorilor de sarcină (max. 1017

cm-3

); dacă F se află într-o bandă permisă, semiconductorul

este degenerat având o comportare similară cu cea a metalelor.

Fig. 6 Diferite tipuri de conducţie electrică explicate prin teoria benzilor energetice

76

Fig.7 Conducţia în dielectrici cristalini explicată prin defecte:

a)LATTICE(fără defect);

b)DEFECT FRENKEL;

c)DEFECT SCHOTTKY

ALTE TIPURI DE CONDUCŢIE ELECTRICĂ

In afara elementelor chimice şi substanţelor care se prezintă sub formă cristalizată

există şi substanţe AMORFE (de exemplu sticla). Pentru această clasă de substanţe nu există

o teorie cantitativă a conductivităţii electrice, dar se consideră că acest fenomen are loc tot

prin intermediul ionilor de impurităţi. Uneori, ionii de impurităţi sau/şi descărcările parţiale

împreună cu electrozii ascuţiţi pot duce la apariţia ARBORESCENŢELOR ELECTRICE;

acestea reprezintă canale foarte fine de material descompus sub acţiunea câmpului electric

local, a căldurii sau a solicitărilor mecanice. Duratele de dezvoltare a arborescenţelor

electrice pot fi de ordinul secundelor până la mii de ore. Procesul este degenerativ ducând în

final la străpungerea dielectricilor solizi.

O teorie aparte (calitativă) există pentru cazul materialelor compozite (de exemplu

cele pe bază de SiC, ZnO folosite la descărcătoare şi varistoare electrice); multe dintre

acestea prezintă neliniarităţi curent-tensiune şi dependenţă pronunţată a conductivităţii

electrice funcţie de temperatură.

Există de asemenea o teorie (calitativă) privind conductivitatea materialelor depuse în

straturi subţiri (filme). De particularităţile conducţiei electrice a straturilor subţiri trebuie să

ţinem seama atunci când sunt implicate materiale de grosimi de ordinul m.

FENOMENOLOGIE MICROSCOPICA

FENOMENE DESCRISE DE TEORIA MICROSCOPICA

77

Teoria electronică clasică consideră substanţa ca un sistem de particule încărcate.

Câmpul electromagnetic armonic produce oscilaţiile forţate ale acestor particule. Frecvenţele

corespunzătoare vizibilului şi U.V. afectează electronii. Ionii şi nucleele atomilor răspund

acţiunii radiaţiei din domeniul I.R. În domeniul frecvenţelor radio şi industriale se manifestă

polarizarea de orientare.

Aşadar, fenomenele care au loc în mediile materiale la interacţiunea cu radiaţia

electromagnetică îşi au explicaţia în structura microscopică (ionică, electronică, moleculară)

modelată cu ajutorul oscilatorului electric de ordinul doi. Astfel, parametrii macroscopici ,

, au un corespondent direct în teoria microscopică (clasică sau cuantică):

ELECTRONI LIBERI curent electric

ELECTRONI LEGAŢI polarizare electrică

ELECTRONI ORBITALI magnetism

În acest capitol s-a făcut abstracţie de pentru simplificarea demonstraţiilor, dar

modul de calcul şi expresiile obţinute sunt analoge cu acelea pentru . Luând în consideraţie

numai parametrii şi se constată că diferenţa dintre dielectrici şi conductori se reflectă

numai în neglijarea termenului kex al ecuaţiei generale; de fapt în ambele situaţii pot avea

loc “rezonanţe” (relativ la sarcini legate şi respectiv libere). Ceea ce face ca în mod obişnuit

să nu se ţină seama de rezonanţele electronilor liberi - situaţie în care () poate deveni

complex sau chiar imaginar, ca în relaţia (13) - este faptul că aceste fenomene apar la

frecvenţe foarte mari, în afara domeniilor de interes pentru electrotehnică ( 1013

Hz).

O exemplificare practică în legătură cu şi este “recepţionarea” radiaţiei termice pentru

două corpuri diferite: dielectric şi conductor. Conductorul se încălzeşte mult mai puternic sub

influenţa radiaţiei electromagnetice datorită faptului că electronii liberi pot oscila într-o gamă

de frecvenţe mult mai extinsă în raport cu dielectricul care prezintă absorbţie/ disipare de

energie termică doar în zona rezonanţelor dielectrice. Expresia cea mai generală a termenului

liber al unei ecuaţii analoge ecuaţiei (1), adică forţa care acţionează asupra unei sarcini

electrice q, într-un mediu izotrop este:

F qE qv

vn E sau F qE qv B 1

1( ) (40)

unde

v1 este viteza sarcinii q, v este viteza de fază a undei electromagnetice şi n este versorul pe

direcţia propagării. Deoarece v1 << v, al doilea termen al expresiei (40) care reprezintă forţa

lui Lorentz este mic în raport cu primul. Rezultă că forţa care acţionează asupra sarcinii

78

depinde în principal de vectorul câmp electric E numit vector luminos în cazul undelor plane

şi al mediilor cu r1.

Din punct de vedere fenomenologic principalele efecte ale impactului radiaţiei

electromagnetice cu substanţa sunt:

1. REFLEXIA = la suprafaţa de separaţie a două medii, o fracţiune din radiaţia

incidentă se întoarce în primul mediu (cu parametrii caracteristici - amplitudine, fază,

eventual polarizare - modificaţi);

2. REFRACŢIA = la suprafaţa de separaţie a două medii, radiaţia transmisă în al

doilea mediu se propagă, în cazul cel mai general, cu amplitudine, viteză şi direcţie

modificate (modificări exprimate prin indicele de refracţie n);

3. DISPERSIA = fenomenul dependenţei indicelui de refracţie n de frecvenţa

radiaţiei (dependenţa parametrilor macroscopici , , de frecvenţă);

4. DIFUZIA = fenomenul de transformare a radiaţiei electromagnetice în substanţă

(medii neomogene) prin variaţia direcţiei de propagare, numit şi împrăştiere, care se

manifestă printr-o luminiscenţă improprie a substanţei; aceasta se produce prin oscilaţiile

forţate ale electronilor în atomi sau ale moleculelor/ionilor mediului difuzant sub influenţa

radiaţiei incidente (fenomene caracteristice unor obstacole cu dimensiuni mici în comparaţie

cu lungimea de undă a radiaţiei);

5. ABSORBŢIA = fenomenul de micşorare a energiei radiaţiei electromagnetice în

substanţă care se produce prin transformarea energiei undei în energie internă a substanţei

(căldură) sau emisie secundară (fotoluminiscenţă), ionizare a atomilor / moleculelor

substanţei respective, reacţii fotochimice, etc.;

6 DIFRACŢIA = fenomenul caracteristic propagării în prezenţa unor aperturi şi

obstacole ale căror dimensiuni sunt mari în comparaţie cu lungimea de undă a radiaţiei.

Este simplu de observat că difuzia (împrăştierea) radiaţiei electromagnetice este un

fenomen universal (proprietate generală a substanţei) şi că reflexia şi refracţia nu sunt decât

difuzii pe o reţea cvasiordonată de oscilatori, astfel încât toate direcţiile sunt anulate cu

excepţia direcţiei radiaţiei incidente (la incidenţă normală).

Teoria microscopică clasică permite modelarea tuturor acestor fenomene cu excepţia

ultimului, aşa cum am arătat la interpretarea ecuaţiei oscilatorului electric de ordinul doi. Din

punct de vedere fizic nu există o deosebire fundamentală între primele cinci fenomene

menţionate; primele patru reprezintă reacţia oscilatorilor elementari la radiaţia incidentă, iar

absorbţia este partea care se transformă în căldură sau în altă formă de energie în masa

materialului. Interpretarea diferită a absorbţiei la frecvenţe relativ joase (radio) şi respectiv la

79

frecvenţe înalte (vizibil, UV) ţine de formalismele fizico-matematice folosite: teoria

electronică clasică (modelul Lorentz) şi respectiv electrodinamica cuantică. Această diferenţă

se bazează însă şi pe o fenomenologie oarecum diferită aşa cum am arătat în capitolele

introductive: în timp ce în domeniul frecvenţelor radio avem o radiaţie continuă,

“monocromatică”, în vizibil, UV, etc. avem o radiaţie cuantificată (fotoni) într-un spectru

relativ extins. Totuşi, deoarece ecuaţiile liniare pentru amplitudinile de probabilitate folosite

în mecanica cuantică sunt foarte asemănătoare cu ecuaţiile liniare pentru oscilatorul armonic

de ordinul doi cele două modele converg în multe domenii; acesta este motivul succesului

teoriei clasice a indicelui de refracţie.

EXPRESIA IN COMPLEX A INDICELUI DE REFRACŢIE

S-a arătat că indicele de refracţie este, în cazul cel mai general, o mărime în complex

care rezultă în urma rezolvării ecuaţiilor de propagare, apărând în expresia exponentului

soluţiei acestor ecuaţii; pătratul acestei mărimi reprezintă chiar permitivitatea electrică

relativă. În cazul în care n este o mărime reală, acesta semnifică chiar modificarea vitezei de

propagare sau a lungimii de undă aşa cum rezultă din expresiile (28) şi (29). Dacă este o

expresie în complex atunci partea reală îşi păstrează semnificaţia de mai sus, iar partea

imaginară reprezintă absorbţia (atenuarea) în interiorul substanţei.

Exemplu de calcul

Fie un mediu cu r rsi j 1 1 3 (pentru o anumită frecvenţă).

Rezultă: n j er r

j 2 31 3 2

.

Expresia indicelui de refracţie va fi: n e j jj

2 2

1

23

1

21 225 0 7076

, , .

Numărul de undă va avea expresia: k nc c

jc

1 225 0 707, , .

Dacă unda iniţială are expresia E E eaer

j t

0

, unda care se propagă în material

este:

80

E E e E e esubst

j kx tx

cj

x

ct

.

, ,

0 0

0 707 1 225

.

Expresia în complex a indicelui de refracţie: n j 1 225 0 707, , va fi interpretată astfel:

a)

aer

subst

aer

subst subst

v

v

c

v. .

, 1 225 ;

b) amplitudinea undei descreşte exponenţial cu distanţa de propagare în material, cu

exponentul -0,707c;

c) de asemenea, în baza relaţiilor de legătură între E şi B valabile în cazul componentelor ce

se propagă în sensurile z:

B z n E

B z n E (41)

vom avea:

cB n E E ey x x

j

2 6

Aceasta înseamnă că c

EB x

y 2 şi de asemenea vectorul B este defazat în urma

lui E cu 300 (absorbţie de energie activă în substanţă).

O altă concluzie deosebit de importantă este faptul că într-un mediu dispersiv viteza

cu care se transportă energia (viteza de grup vg) poate să difere mult de viteza de fază, sau

poate chiar să-şi piardă sensul precis. Dacă folosim relaţia (15) şi considerăm ca funcţie de

numărul de undă k vom avea:

kc

nv

k kck

n k

; ( ) ;( )

(42)

Viteza de fază este dată de expresia:

81

vk

k

c

n kf

( )

( ) (43)

şi poate fi mai mare sau mai mică decât c după cum partea reală a lui n(k) este mai mică

respectiv mai mare decât unitatea. Pentru cele mai multe lungimi de undă optice n(k) este mai

mare decât unitatea în aproape toate substanţele. Astfel, pentru dispersia normală considerând

n ca funcţie de , vom avea:

dn

dn v v cg f

0 1; ; (44)

În regiunile de dispersie anormală, însă, dn/d poate deveni negativ:

dn

dv cf

0 ; (45)

Acesta este cazul razelor X prin substanţe dense (de exemplu sticlă) sau a undelor

radio de frecvenţă mare prin plasmă (electroni liberi, ionosferă) cazuri în care n<1 (mediu

dispersiv). O viteză de fază superioară vitezei luminii în vid nu violează principiile teoriei

relativităţii, deoarece c reprezintă viteza maximă de propagare a energiei şi nu a vitezei de

fază.

REFLEXIA, TRANSMISIA ŞI ABSORBŢIA

În mod tradiţional, ţinând seama şi de fenomenologia diferită, analiza reflexiei,

transmisiei şi absorbţiei se face separat pentru dielectrici, semiconductori (dielectrici

conductivi) şi respectiv conductori.

DIELECTRICI

Situaţia reală implică, la majoritatea substanţelor şi chiar elementelor chimice,

existenţa mai multor electroni în moleculă, fiecare fiind caracterizat de o pulsaţie de

rezonanţă 0i şi respectiv o constantă de amortizare i. În general i<<0i ; rezultă că sunt

valabile relaţiile (26) şi (27) pentru dispersia normală şi că nu vom avea componente

absorbtive (cu excepţia zonelor de absorbţie rezonantă). De asemenea, mai rezultă că la

frecvenţe joase, mai mici decât cel mai mic 0i corespunzător, toţi termenii sumei

(considerând toate relaţiile respective ca sume după 0i şi i ) sunt pozitivi. Pe măsură ce sunt

depăşite valori succesive ale lui 0i, în sumă apar din ce în ce mai mulţi termeni negativi,

82

până când întreaga sumă devine negativă. În consecinţă şi n() şi () devin subunitari. În

plus, în zona absorbţiilor rezonante - dispersie anomală - n() şi () prezintă părţi

imaginare. La frecvenţe foarte înalte, superioare celei mai înalte 0i , relaţia (27) devine:

n r

p2

2

21

(46)

care se poate deduce şi din componenta elastica pentru polarizarea de deformare aplicând

condiţiile >> 0 şi >> .

În cazul dielectricilor, relaţia (46) este valabilă numai pentru cazul 2>>p

2; rezultă,

evident, r1. Numărul de undă, în acest caz, este real şi variază cu frecvenţa ca în cazul

unui mod într-un ghid de undă cu frecvenţa de tăiere p .

DIELECTRICI CONDUCTIVI

Dacă un procent p0 din electronii unei molecule sunt “electroni liberi” (de conducţie),

ceea ce înseamnă că prezintă 0=0, constanta dielectrică fiind singulară în =0. În această

situaţie, la fenomenologia descrisă deja, caracteristică dielectricilor, se adaugă relaţiile (13) şi

(14) caracterisitice electronilor liberi la frecvenţe foarte mari. Acesta constituie în esenţă

modelul lui Drude (1900) pentru conductibilitatea electrică.

Vom avea două zone distincte, determinate de frecvenţa la care pot apare diferitele

fenomene:

a) frecvenţe relativ joase în care se aplică o combinaţie a relaţiilor (10) şi (11) respectiv

termenii r, jr şi j0 ;

b) frecvenţe înalte la care în general termenul jr îşi pierde semnificaţia (nu mai există

absorbţii rezonante dielectrice) şi rămâne numai r şi respectiv termenii definiţi de (13)/(14).

CONDUCTORI

83

La conductori fenomenele caracteristice dielectricilor se păstrează, însă sunt

“mascate” de cele prezentate anterior, astfel încât relaţiile (13) şi (14) îşi păstrează

valabilitatea. Conductibilitatea electrică poate fi explicată pe baza fenomenului difuziei

electronilor liberi prin cristal. Astfel, expresia indicelui de refracţie pentru metale este:

jj

j

jm

Nqn

p

e

er

1

11

111

0

22

2

2

0

22

(47)

Această expresie diferă de (27), caracteristică dielectricilor prin prezenţa lui şi prin

absenţa lui 0, conform consideraţiilor de mai sus (0=0 la conductori). În acelaşi timp relaţia

(47) este în acord perfect cu relaţia (14). Astfel, părţile reală şi imaginară ale permitivităţii

relative complexe pentru metale se pot scrie:

22

2

"

22

2

' ;1

p

r

p

r (48)

Graficele relaţiilor (48) pentru cazul argintului sunt date în Fig.8.

În metale, radiaţia electromagnetică pătrunde numai pe o distanţă foarte mică şi este

aproape în întregime reflectată. Atunci când frecvenţa creşte în domeniul în care () > 0,

metalul poate începe dintr-o dată să transmită radiaţia, reflectivitatea sa modificându-se

substanţial (fenomenul transparenţei în UV a metalelor).

APROXIMAŢIA DE JOASĂ FRECVENŢĂ <<

Dacă este suficient de mic, atunci (47) se poate scrie:

n j n j 2

0 0

12

; (49)

Părţile reală şi imaginară ale lui n fiind egale, rezultă o puternică absorbţie. Pentru

cazul cuprului, de exemplu, aproximaţia de joasă frecvenţă este valabilă pentru f < 1012

Hz (

> 0,3 mm). Expresiei (49) a indicelui de refracţie îi corespunde o adâncime de pătrundere şi o

viteză de propagare:

2 2; v f (50)

84

APROXIMAŢIA DE FOARTE ÎNALTĂ FRECVENŢĂ

La frecvenţe înalte relaţia (48) se poate scrie:

r

p 1

2

2 (51)

unde p este frecvenţa plasmei electronilor de conducţie.

Expresia indicelui de refracţie este:

np2

2

2

0

21 1

(52)

în acord cu relaţia (2). Dacă p, comportarea radiaţiei electromagnetice incidente pe

metal este asemănătoare cu cazul plasmei, undele fiind atenuate datorită părţii imaginare a lui

n (mediu rezistiv dens). Dacă >> p, atunci indicele de refracţie este real şi materialul

devine transparent (mediu dispersiv). Lungimile de undă caracteristice , sub care anumite

metale devin transparente , sunt:

pentru Li < 1550 Ă,

pentru Na < 2100 Ă,

pentru K < 3150 Ă.

Se pot da de asemenea caracteristicile plasmei în diverse cazuri. Astfel, plasma de

laborator conţine 1012

- 1016

electroni/cm3 ceea ce înseamnă p 610

10 - 610

12Hz. Pentru

ionosferă o valoare tipică a densităţii maxime a electronilor liberi este 104 - 10

6 electroni /

cm3 corespunzătoare unei p 610

6 - 610

7Hz. Alte valori caracterisitice sunt: pentru aer p

0,111016

Hz, pentru Ag p 1,361016

Hz, pentru apă p 3,31016

Hz, pentru grafit p

3,61016

Hz. Discuţia de mai sus explică comportamentul undelor radio la impactul cu

ionosfera: undele lungi sunt absorbite sau reflectate, în timp ce undele scurte trec prin

aceasta. În funcţie de relaţia de ordine între p şi putem deosebi două tipuri de

comportament în raport cu creşterea frecvenţei câmpului electromagnetic incident (Fig.9 şi

Tabelul 1) :

85

CAZUL ARGINTULUI : reflector - reflector perfect - transparent

CAZUL GRAFITULUI : reflector - absorbant - transparent

La frecvenţe intermediare trebuie folosită expresia completă a indicelui de refracţie

(47).

Fig.8 Partea reală şi partea imaginară a permitivităţii electrice relative complexe în

cazul metalelor (Ag)

Toate consideraţiile teoretice din acest capitol au un scop precis: evidenţierea acelor

rezultate din TEORIA MICROSCOPICĂ care pot fi folosite la obţinerea unor concluzii

concrete / practice privind interacţiunea câmpului electromagnetic cu substanţa.

Primul exemplu este calculul radiaţiei electromagnetice reflectate de un material

conductor, cum ar fi GRAFITUL, spre exemplu. Pentru o radiaţie cu lungimea de undă de

5500 Ǻ rezultă = 3,42 1015

Hz, şi deci:

86

"'*2

rrr jn iar conform cu (48), vom avea

951,01122

2

22222

0

22

0

2

'

pp

r

36,2

22

2

2222

0

2

"

pp

r

Rezultă:

n2 = 0,951 + j2,36 = 2,55 e

j

unde = arctg 2,36/0,951 680

Indicele de refracţie va fi 89,033,155,2 2 jenj

şi conform:

15,0

"1'

"1'22

222

nn

nnR (53)

ceea ce înseamnă că la această frecvenţă grafitul lustruit va reflecta cca. 15% din intensitatea

radiaţiei electromagnetice, la incidenţă normală.

Pe de altă parte, relaţia (53) a fost prelucrată de F. Hagen şi H. Rubens pentru cazul

materialelor conductoare, obţinându-se expresia reflectivităţii dependentă de lungimea de

undă a radiaţiei şi de conductivitatea materialului:

091,01

2R (54)

Expresia (54) a fost verificată în regiunea I.R. a spectrului obţinându-se o concordanţă

satisfăcătoare. Se consideră că exactitatea creşte cu creşterea lungimii de undă, fiind foarte

bună pentru > 12 m.

Reluând exemplul grafitului, s-a calculat cu relaţia (53) reflectivitatea în cazul unei

radiaţii cu lungimea de undă = 15 m obţinându-se cca. 87%, în timp ce aplicarea relaţiei

(54) conduce la valoarea de 91%, adică o eroare mai mică de 5%. Pentru corectitudinea

calculelor, valoarea conductivităţii grafitului ( = 0,71105

-1m

-1) s-a obţinut din expresia

(2) a lui , unde pentru grafit are valoarea 1,61017

Hz, adică aceeaşi folosită pentru

calculul relaţiei (53).

87

In subsidiar se menţionează că se mai poate determina valoarea factorului de reflexie

şi după LEGEA LUI KIRCHOFF pentru RADIAŢIA TERMICĂ:

t

t

W

WR

0

2 1 (55)

unde:

-Wt este energia emisă de suprafaţa metalului la T0C

-W0t, la fel pentru corpul negru la T0C.

Un alt gen de concluzii sunt cele referitoare la comportamentul general al

conductorilor expuşi la radiaţia electromagnetică, funcţie de frecvenţa acesteia. Astfel:

- dacă frecvenţa este suficient de joasă orice conductor este un mediu rezistiv dens,

adică reflectă practic complet, cu absorbţie foarte mică (cazul 1 din Tabelul 1).

- dacă frecvenţa este suficient de înaltă orice conductor poate fi un mediu dispersiv,

adică este transparent (cazul 3 din Tabelul 1).

- dacă >> p, atunci conductorul prezintă un domeniu în care se comportă ca un

mediu rezistiv diluat, adică absoarbe radiaţia fără reflexie (cazul 2 din Tabelul

1).

- dacă << p, atunci conductorul admite un domeniu de frecvenţă în care se

comportă ca un mediu pur reactiv, adică prezintă reflexie totală, fără absorbţie

(cazul 4 din Tabelul 1).

ULTIMELE DOUĂ CAZURI SE EXCLUD RECIPROC.

- dacă p, materialul nu admite nici domeniul rezistiv diluat nici domeniul pur

reactiv, putând admite în schimb proprietăţile de mediu rezistiv dens sau

transparent.

Aceste concluzii sunt sistematizate în Tabelul 1 pentru Ag şi respectiv pentru Grafit.

In Fig. 9 s-au rezumat grafic proprietăţile de rezonanţă "microscopică" ale

materialelor ca funcţie de frecvenţă. In partea superioară a figurii sunt date rezonanţele

dielectrice (de neomogenitate, de orientare, ionică şi electronică) cu domeniile de frecvenţă la

care acestea apar, iar în partea inferioară rezonanţa conductivităţii "de curent continuu"

care apare pentru Grafit în jurul frecvenţei de 1017

Hz şi respectiv pentru Ag la 1013

Hz.

Această rezonanţă este DISTINCTĂ de pulsaţia de rezonanţă a plasmei, p, care se referă la

UNDE ELECTRICE LONGITUDINALE cu câmp magnetic nul ( 0 E ) faţă de cazul

UNDELOR ELECTROMAGNETICE TRANSVERSALE, discutat în acest capitol.

88

Teoria microscopică prezentată în acest capitol este caracteristică Fizicii / Opticii, dar

ea poate furniza informaţii deosebit de importante şi în cazul interacţiunii câmpului

electromagnetic cu substanţa la frecvenţe de interes în Electrotehnică.

Tabel 1

CARACTERIZAREA MATERIALELOR LA IMPACTUL CU RADIATIA

ELECTROMAGNETICA CONFORM TEORIEI MICROSCOPICE

CLASIFICARE

GENERALA

DENUMIRE;

DEFINIRE

EXPLICATII EXEMPLE

I.

FRECVENTE PUR

REZISTIVE

1. MEDIU REZISTIV

DENS

REFLECTOR

CVASIPERFECT

ω«Г; ω«ωp; ωГ«ωp2

n2 este pur imaginar

n2

= 1

Mediul reflectă

aproape complet, cu

absorbţie foarte

mică. Proprietatea

este valabilă pentru

orice conductor la

frecvenţe suficient

de joase.

ARGINT

pt.f«1013

Hz

(microunde)

GRAFIT

pt. f<1016

Hz

ω«Г 2. MEDIU REZISTIV

DILUAT*

MEDIU "NEGRU"

ωp«Г;

ωp2/ Г« ω « Г

n ≈ 1+j ωp2/ ωГ

Mediul poate

absorbi o undă într-

un anumit domeniu

de frecvenţă, practic

fără reflexie. Un

asemenea conductor

nu admite frecvenţe

pur reactive (reflexie

totală fără absorbţie)

GRAFIT

pt.1016

<f<1017

(raze X)

este numai

aproximativ

"negru"din cauza

domeniului îngust

89

II.

FRECVENTE PUR

ELASTICE

ω»Г

3. MEDIU

DISPERSIV

TRANSPARENT

Г« ωp «ω

n este real; n[0,1]

La frecvenţe

suficient de înalte,

orice conductor este

un mediu dispersiv,

adică este un

material transparent

ARGINT

pt. f»1013

Hz şi

f>1016

Hz

(U.V.îndepărtat

şi raze X)

GRAFIT

pt. f»1017

Hz (raze

X)

ω»Г

4. MEDIU PUR

REACTIV*

REFLECTOR

PERFECT

Г« ω «ωp

n este imaginar

Intr-un anumit

domeniu materialul

prezintă reflexie

totală, fără absorbţie.

Niciodată însă, nu

poate fi un mediu

rezistiv diluat, adică

să absoarbă o undă

plană fără reflexie.

ARGINT

pt.f<217 x 1013

Hz

(include vizibilul)

III.

5. MEDIU cu Г≈ωp Nu admite cazurile 2

şi 4, dar admite

cazurile 1 şi 3

*) Cazuri care se exclud reciproc

ωpAg = 1,36 x 1016

Hz ; ГAg = 2,7 x 1013

Hz

ωpGrafit = 0,36 x 1017

Hz ; ГGrafit = 1,6 x 1017

Hz

SIMULAREA SI MODELAREA ELECTROMAGNETICĂ A ECHIPAMENTELOR

DE MICROUNDE

90

Metodele numerice de calcul au început sa fie utilizate în momentul în care tehnologiile

informatice au oferit suficientă putere de calcul (anii 1980). Aceste metode se aplică în mod

special pentru simularea şi modelarea dispozitivelor electrice şi electronice încă din faza de

concepţie şi proiect pentru a anticipa şi corecta problemele de compatibilitate

electromagnetică, interferenţe între diferite componente, electrostatică. În acest fel este redus

atât timpul cât şi costul de dezvoltare. Metodele numerice se folosesc deasemenea şi la

determinări dozimetrice (ex. SAR) în obiecte tridimensionale (modele complexe).

Acest capitol face o scurtă analiză a celor mai utilizate metode de calcul numeric în

electromagnetism şi se prezintă detaliat metoda diferenţelor finite în domeniul timp FDTD -

fiind preferată în probleme de ecranare electromagnetică şi care va fi utilizată la modelările şi

simulările efectuate în această teză.

Metodele numerice pot fi clasificate în: metode integrale şi metode diferenţiale sau

în metode în domeniul timp şi metode în domeniul frecvenţă.

In ultimii 10 ani, cele mai utilizate metode numerice în electromagnetică au fost:

metoda diferenţelor finite în domeniul timp – FDTD (finite-difference time

domain method);

metoda momentelor – MoM (method of moments);

metoda elementului finit - FEM (finite element method);

metoda matricei liniei de transmisie – TLM (transmission – line matrix

method);

metodele hibride.

Actualitatea utilizării metodelor numerice, în speţă FDTD, MoM şi FEM, TLM pentru

modelarea ecranelor pentru protecţia electromagnetică este certă, fapt dovedit şi de ponderea

determinărilor efectuate, utilizând aceste metode în ultimii 5 ani, aşa cum reiese din

comunicările raportate în conferinţele şi congresele internaţionale din domeniu

Alistair P. Duffy s.a prezintă o sinteză a metodelor numerice de analiză a câmpului

electromagnetic punctând unele avantaje si dezavantaje ale diferitelor tehnici de modelare şi

simulare.

91

Metoda momentelor este utilizată de Zhi Bin Zhao pentru a analiza proprietăţile

ecranării electromagnetice unei incinte dreptunghiulare cu o fantă către semispaţiul

conductor, care poate modela pământul. Obiectele sunt aproximate cu elemente

dreptunghiulare. Este dezvoltată o metodă eficientă de calcul al integralelor Sommerfeld

generalizate. Cu această metodă, funcţia Green se poate obţine rapid şi cu acurateţe.

Validarea metodei se face prin compararea rezultatelor calculate cu rezultatele obţinute prin

măsurare. In final, metoda este aplicată cu succes la calculul eficienţei ecranării unei celule

de relee într-o substaţie.

Hill J. prezintă un caz de utilizare a metodei diferenţelor finite in domeniu timp

(FDTD) intr-un mediu chiral dispersiv.

Metoda diferenţelor finite constă în esenţă din înlocuirea ecuaţiilor diferenţiale în

ecuaţii cu diferenţe finite. Aproximările cu diferenţe finite sunt forme algebrice în care

valoarea unei variabile dependente de poziţia unui punct în spaţiu se înlocuieşte cu valorile

acesteia în punctele învecinate.

Există un număr foarte mare de publicaţii în domeniul metodelor numerice. Un grafic

cu numărul de publicaţii pe tipuri de metode numerice apărute în perioada 1997-2006 este dat

în. Din acest grafic se observă că cele mai multe publicaţi (peste 1000) sunt referitoare la

FDTD, urmată de FEM cu aproximativ 800 de publicaţii, MoM cu aproximativ 400 publicaţii

şi TLM cu mai puţin de 50.

Metoda momentelor (MoM)

Modelarea surselor de câmp se poate face cu succes cu ajutorul metodei momentelor,

care este o metodă pentru rezolvarea ecuaţiilor integrale în domeniul frecvenţă. Această

metodă nu permite însă o discretizare înaltă a modelului tridimensional al ecranului.

Metoda momentelor este o metodă foarte puternică de calcul numeric, indicată în

rezolvarea ecuaţiilor integro-diferenţiale care apar în problemele de radiaţie, difracţie,

92

electrostatică, electromagnetism. În cazul problemelor de dozimetrie a câmpurilor de

radiofrecvenţă, metoda se bazează pe rezolvarea ecuaţiilor integrale în domeniul frecvenţă .

Metoda momentelor oferă un mod general de rezolvare a ecuaţiilor de tipul:

gL

unde L este un operator integro-diferenţial, g este sursa, iar este funcţia ce trebuie

determinată. Acest tip de ecuaţii intervin în cele mai multe probleme din teoria câmpului

electromagnetic şi, în general, sunt foarte greu de rezolvat prin metode analitice.

În principiu, metoda presupune parcurgerea a patru etape:

punerea ecuaţiei date sub o formă integrală;

discretizarea acesteia sub forma unei ecuaţii matriceale folosind funcţiile

elementare şi de ponderare;

evaluarea elementelor matricei;

rezolvarea ecuaţiilor şi determinarea parametrilor solicitaţi.

În general, metoda momentelor foloseşte două categorii de ecuaţii integrale: Fredholm

şi Volterra. Însă, de obicei, ecuaţiile care caracterizează câmpul electromagnetic nu sunt de

forma acestora. De aceea trebuie găsite metode de reducere a ecuaţiilor la ecuaţiile de tip

Fredholm sau Volterra.

Principiul de bază al algoritmului de calcul este următorul: curentul indus într-un

obiect cu anumite caracteristici dielectrice de o formă arbitrară, iluminat cu o undă

electromagnetică (plană), dă naştere unui câmp dispersat, care poate fi echivalat cu o

densitate de curent echivalentă. Utilizând această mărime, se pot obţine componentele

câmpului dispersat, prin rezolvarea ecuaţiilor lui Maxwell. Câmpul electric total în interiorul

corpului este egal cu suma între unda incidentă şi unda dispersată. Transformarea ecuaţiei

câmpului total în formă matriceală (discretizarea) presupune aplicarea metodei momentelor.

A treia etapă este evaluarea elementelor matricei. Pentru elementele care nu sunt pe

diagonala matricei, calculele sunt posibile fără alte artificii, însă elementele de pe diagonală

necesită aproximarea celulei elementare printr-o sferă. În cazul în care forma celulei diferă

foarte mult de cea a unei sfere, aproximaţia făcută poate afecta mult precizia rezultatelor.

93

Ultima etapă de calcul presupune găsirea soluţiei ecuaţiei matriceale - prin inversarea

matricei calculate anterior sau prin metoda de eliminare Gauss-Jordan.

Prin metoda momentelor, câmpurile electromagnetice se obţin calculând curenţii

electrici de suprafaţă – în cazul materialelor conductoare şi respectiv calculând curenţii

electrici şi magnetici de suprafaţă ai solidului dielectric considerat. Aceştia sunt calculaţi

utilizând o combinaţie liniară de funcţii de bază, coeficienţii fiind obţinuţi în urma rezolvării

unui sistem de ecuaţii liniare. Cunoscând distribuţia curenţilor, pot fi apoi calculate câmpurile

apropiate şi îndepărtate, secţiunile transversale radar, directivitatea şi impedanţa de intrare a

antenelor. În cazul dielectricilor, după construcţia modelului şi calculul distribuţiei curenţilor,

se determină rata specifică de absorbţie locală şi distribuţia ei. Exemplele de calcul tratate

prin această metodă demonstrează superioritatea ei în cazul aplicării la calculul surselor de

radiaţie (în speţă a celor de mari dimensiuni), în vreme ce metoda diferenţelor finite se aplică

cu succes în vederea dozării câmpului absorbit in ecrane sau în modelele biologice.

Metoda diferenţelor finite în domeniul timp

Metoda FDTD este folosită tot mai mult în analiza interacţiunii câmpului

electromagnetic cu materia (analiza circuitelor si antenelor microstrip, a ghidurilor de undă,

analiza efectelor biologice ale câmpului electromagnetic. Faţă de alte metode numerice,

tehnica diferenţelor finite se bucură de câteva avantaje, între care:

- Ecuaţiile lui Maxwell pot fi discretizate foarte uşor;

- Ecuaţiile discretizate sunt rezolvate în manieră secvenţială, fiind uşor de implementat

pe un sistem numeric de calcul;

- Metoda se poate aplica problemelor ce implică structuri complexe, care ar fi foarte

greu de rezolvat pe cale analitică sau prin alte metode numerice;

94

- Fiind o metodă de analiză în timp, oferă în mod direct soluţiile de regim tranzitoriu,

putând apoi transforma uşor soluţia din domeniul timp în domeniul frecvenţă. În acest fel

se poate obţine comportarea în frecvenţă a diverselor dispozitive;

- Metoda poate fi aplicată pentru analiza mediilor neomogene, cu pierderi, anizotrope,

dispersive şi cu parametri variabili în timp, ceea ce-i oferă un avantaj net faţă de alte

metode numerice care nu au un spectru de utilizare atât de larg.

- Pentru simulările în care regiunea analizata are întindere infinită, se utilizează condiţii

de absorbţie la frontieră (engl. ABC - Absorbing Boundary Condition), impuse planelor

care delimitează regiunea modelată, plane care apar din cauza trunchierii spaţiului.

Desigur, metoda prezintă şi dezavantaje, care însă pot fi minimizate. Principalele dezavantaje

sunt:

- La capetele domeniului analizat pot apărea false reflexii ale câmpului (din cauza

algoritmului);

- Dispersie numerică a soluţiei poate apărea ca urmare a faptului că discretizarea nu se

face în paşi infiniţi mici;

Totuşi, dezavantajul principal al metodei îl constituie, în cazul problemelor complexe, timpul

mare de calcul si necesitatea de a dispune de spaţiu de memorare mare. Tehnica FDTD poate

fi adaptată pentru modelarea cât mai fidelă a mediilor reale. Una dintre modificările

importante aduse algoritmului iniţial, dezvoltat de K. Yee, a fost implementată de către

Luebbers ş.a. pentru mediile în care parametrii dielectrici depind de frecvenţă, cum este cazul

celor biologice. Metoda propusă de Luebbers, denumită (FD)2-TD, este o îmbunătăţire a

algoritmului FDTD, în care se ţine cont de dependenţa spaţială de frecvenţă. Se poate

determina astfel, cu precizie bună, răspunsul unui mediu la semnale de bandă largă, fără a

creşte semnificativ timpul de calcul. Metoda a fost folosită pentru a determina curentul indus

şi distribuţia SAR într-un model eterogen al corpului uman atunci când este expus unui

impuls electromagnetic de bandă largă. Alte lucrări au folosit diferenţele finite în timp pentru

a modela fantome de corp uman care sunt expuse iradierii cu diferite câmpuri. Parametrii

pentru fantoma de corp uman sunt recomandaţi de standardele internaţionale. Modelul utilizat

este un cilindru de plastic, cu diametru 0,305 m şi înălţime de 3,7 m umplut cu soluţie salină

având permitivitatea 77r şi conductivitatea 0,7 /S m . Rezultatele simulării sunt în

95

concordanţă cu valorile obţinute experimental. Pentru a modela cât mai fidel mediul real în

cazul în care se impune trunchierea acestuia (limitarea simulării la un domeniu restrâns din

spaţiu). J.P. Berenger a modificat algoritmul Yee ţinând cont de condiţiile de absorbţie la

frontieră, introducând conceptul de strat perfect adaptat (engl. PML – Perfectly Matched

Layer). Definirea, în acest fel, a condiţiilor de frontieră pentru domeniile cu întindere

(teoretic) infinită a permis atât îmbunătăţirea rezultatelor cât şi a timpului de calcul la analiza

interacţiunii între câmpul electromagnetic produs de telefoanele celulare şi modelele de cap

uman. Tot din cauza utilizării pe scară largă a telefoanelor mobile, problema interferenţei

electromagnetice între diverse echipamente a devenit tot mai importantă. Fiind tot o problemă

de câmp, se poate trata folosind metoda diferenţelor finite în timp. În se analizează

interferenţa produsă de telefoanele mobile asupra stimulatoarelor cardiace. Şi în acest caz

rezultatele numerice sunt în concordanţă cu cele obţinute pe cale experimentală. În s-au

publicat rezultatele recente ale unui studiu privind efectul câmpului electromagnetic emis de

un telefon mobil asupra unui fetus de 6 luni. Modelul geometric al mamei, fetusului si

interacţiunea acestora cu câmpul radiat de antena telefonului au fost analizate utilizând

metoda FDTD.

Metoda diferenţelor finite în domeniul timp se bazează pe discretizarea spaţio -

temporală a ecuaţiilor lui Maxwell cu rotor, în formă diferenţială. Problema limitării spaţiului

de calcul, în cazul spaţiului liber, este rezolvată prin impunerea unei condiţii de absorbţie la

frontieră. Metoda permite determinarea energiei absorbite în cazul expunerilor totale sau

parţiale, la câmpuri uniforme sau neuniforme, cu variaţie sinusoidală sau tranzitorie.

Utilizarea acestei metode, în condiţiile dezvoltării tehnicii de calcul, este soluţia

optimă în vederea simulării propagării undelor electromagnetice în structuri complexe. Din

exemplele de simulare, rezolvate utilizând un software profesional, se desprind facilităţile şi

flexibilitatea metodei, prin comparaţie cu abordarea analitică. Se pot determina şi reprezenta

sugestiv ratele specifice de absorbţie şi respectiv distribuţia energiei electromagnetice în

structuri tridimensionale definite de către utilizator, atât geometric, cât şi dielectric. Modelele

pot fi definite cu rezoluţia dorită. Sursele de emisie sunt de asemenea definite de către

utilizator, iar modelul poate fi poziţionat atât în câmpul îndepărtat, cât şi în cel apropiat al

unei surse de câmp. Interfaţa grafică permite reprezentări extrem de sugestive ale distribuţiei

de energie în diverse plane de secţiune a modelului.

96

Diferenţe finite

Se consideră o dezvoltare în serie Taylor a funcţiei ntxuu , între punctele din

spaţiu ix şi xxi , la momentul de timp nt :

1

42 32 3 4

2 3 4,

,, , ,

2! 3! 4!i nn

i ni n i n i n

i x tt

x tx t x t t

xx xu u u uu x x u x

x x x x

(3.1)

În ultimul termen al acestei expresii, care constituie termenul eroare, 1 este un punct

care se găseşte undeva în intervalul xxx ii , .

Dacă se consideră, de asemenea, o dezvoltare în serie Taylor până la punctul

xxx ii , la momentul de timp nt :

ninini

nin

txtxtxtxti

x

ux

x

ux

x

uxuxxu

,

3

33

,

2

22

,, 62

ntx

ux

,

4

44

2

24

(3.2)

unde 2 va fi un punct situat undeva în intervalul xxx ii , .

Prin însumarea celor două relaţii (3.1) şi (3.2) se ajunge la relaţia:

nini

ninn

ttx

txtitix

ux

x

uxuxxuxxu

,

4

44

,

2

22

,

3

122

(3.3)

în care 3 care apare în termenul eroare este inclus în intervalul xxxx ii , .

97

Dacă se rearanjează termenii expresiei de mai sus se obţine egalitatea:

2

2

,

2

2 2xO

x

xxuxuxxu

x

u

nni t

iii

tx

(3.4)

unde 2

O x

este o notaţie a termenului eroare de ordinul 2.

Pentru simplificare se consideră ca notaţii: indicele i pentru a specifica poziţia în

spaţiu şi indicele n pentru a specifica momentul de timp pentru care se face calculul. Cu

aceste notaţii ecuaţia (3.4) se poate scrie sub o formă mai simplă:

2

2

11

,

2

2 2xO

x

uuu

x

u

nni t

n

i

n

i

n

i

tx

(3.5)

unde se înţelege că n

iu reprezintă o mărime de câmp calculată în punctul din spaţiu xixi

şi la momentul de timp tntn .

Pentru derivata de ordinul II în raport cu timpul, se păstrează punctul ix fixat şi se

dezvoltă în serie Taylor înainte şi înapoi în raport cu timpul, obţinându-se o relaţie analogă cu

(3.5).

Ecuaţiile lui Maxwell în 3D

Se consideră o regiune din spaţiu în care mediul material poate absorbi energie

electrică sau magnetică. Ecuaţiile lui Maxwell în formă diferenţială sunt:

Legea lui Faraday:

98

MEt

B

(3.6)

AlA

AdMldEAdBt

(3.7)

Legea lui Ampere:

DH J

t

(3.8)

AlA

AdJldHAdDt

(3.9)

Legea lui Gauss pentru câmpul electric:

vD (3.10)

A

D dA (3.11)

Legea lui Gauss pentru câmpul magnetic:

0 B

(3.12)

0A

B dA (3.13)

Unde:

E - intensitatea câmpului electric [V/m]

H- intensitatea câmpului magnetic [A/m]

D- inducţia electrică [C/m2]

99

B - inducţia magnetică [Wb/m2]

M- densitatea de curent magnetic echivalentă [V/m2]

J - densitatea de curent electric [A/m2]

rv -densitatea de sarcina [C/m3]

În mediu liniar, izotrop se poate scrie:

EED r

0 (3.14)

HHB r

0 (3.15)

Trebuie menţionat faptul că J

şi M

se pot comporta ca surse independente ale

energiei câmpului electric şi magnetic, sursaJ

şi sursaM

. De asemenea, se consideră că pentru

materiale cu pierderi electrice şi magnetice izotropice, nondispersive :

EJJ sursa

(3.16)

HMM sursa

(3.17)

Cu aceste observaţii, ecuaţiile lui Maxwell pentru materiale liniare, izotrope,

nedispersive, cu pierderi se pot scrie:

HMEt

Hsursa

11 (3.18)

EJHt

Esursa

11 (3.19)

Dacă se scriu aceste ecuaţii în raport cu axele de coordonate carteziene se obţine un

100

sistem de şase ecuaţii scalare, astfel:

xxsursa

zyx HMy

E

z

E

t

H

1 (3.20.a)

yysursa

xzyHM

z

E

x

E

t

H

1 (3.20.b)

zzsursa

yxz HMx

E

y

E

t

H

1 (3.20.c)

xxsursa

yzx EJz

H

y

H

t

E

1 (3.21.a)

yysursa

zxyEJ

y

H

z

H

t

E

1 (3.21.b)

zzsursa

xyz EJy

H

x

H

t

E

1 (3.21.c)

Acest sistem de şase ecuaţii cu diferenţe finite constituie baza pentru algoritmul

numeric al metodei FDTD pentru interacţiunile undei electromagnetice cu diverse obiecte

tridimensionale. Soluţiile ecuaţiilor lui Maxwell sunt adesea imposibil de exprimat analitic.

K. Yee a dezvoltat o metodă numerică de determinare a soluţiilor ecuaţiilor, în cazul în care

condiţiile de frontieră sunt cele pentru un conductor perfect [91].

Implementarea metodei diferenţelor finite în domeniul timp

Ecuaţia pentru componenta de câmp Ex se poate astfel scrie:

101

xsource

yzx EJz

H

y

H

t

Ex

1 (3.22)

Componentele de câmp electric şi câmp magnetic se consideră ca având orientarea din

figura 3.1. (celula Yee).

Fig. 3.1 Celula Yee

Implementarea metodei diferenţelor finite în domeniul timp (FDTD) presupune

parcurgerea anumitor etape:

- Determinarea dimensiunilor celulelor care formează reţeaua de discretizare.

- Stabilirea pasului de timp.

- Specificarea câmpului incident.

- Construirea reţelei de discretizare pentru obiectul studiat.

- Specificarea condiţiilor de frontieră.

Toate acestea urmărind algoritmul lui Yee care constituie baza metodei FDTD.

După cum este ilustrat şi în figura 3.3. algoritmul lui Yee consideră orientarea

componentelor câmpului electric şi magnetic astfel încât fiecare componentă E este

înconjurată de 4 componente H şi fiecare componentă H să fie înconjurată de 4 componente

102

E. Aceasta constituie o imagine simplă şi foarte reprezentativă al spaţiului 3D în care s-a

aplicat Legile lui Ampere şi Faraday pentru a se stabili sensurile orientărilor vectorilor E şi H

pentru contur.

Determinarea dimensiunilor celulelor care formează reţeaua de discretizare

Se începe prin a discretiza o geometrie simplă, o cavitate a cărei muchii sunt paralele

cu axele sistemului de axe cartezian.

Se definesc punctele Pmin şi Pmax ca fiind punctele aflate la extremităţile diagonalei

după cum este ilustrat în figura 3.2.

Pentru a crea o reţea de discretizare trebuie să se

discretizeze fiecare muchie a cavităţii astfel încât să se

obţină aşa numitele celule. Se vor obţine Nx, Ny şi Nz

diviziuni de-a lungul fiecărei muchii corespunzătoare

axelor x, y şi z. Distanţele dintre diviziuni se notează cu

x, y respectiv z:

xN

PPx xx minmax

yN

PPy

yy minmax

zN

PPz zz minmax

Fiecărui punct al reţelei îi corespunde un index care poate fi scris sub forma unei

variabile de tip matrice si care are trei elemente. Această variabilă indică locul exact al

punctului respectiv în reţea.

INDEX = [i,j,k]

z

y

x

N ..., 2, 1, 0, k

N ..., 2, 1, 0, j

N ..., 2, 1, 0, i

(3.23)

Fig 3.2

103

Asta înseamnă că pentru a determina locul unde se află punctul de coordonate (x,y,z)

trebuie folosite următoarele formule:

xPxix min

yPyjy min

zPzkz min

(3.24)

Conform algoritmul lui Yee, care stă la baza implementării metodei FDTD, pentru

componentele câmpului electric şi magnetic nu se definesc puncte distincte, ci cu ajutorul

ecuaţiilor lui Maxwell aceste componente se calculează în spaţiu şi timp ţinând cont una de

cealaltă.

Fig. 3.3 Celula Yee în 3D

Atunci când se definesc celulele este foarte important să se aleagă dimensiunile

potrivite pentru acestea. Aceste dimensiuni trebuie să fie suficient de mici pentru a permite

obţinerea unor rezultate de o acurateţe cât mai ridicată dar în acelaşi timp trebuie să fie destul

de mari pentru ca resursele de calcul folosite (computerul) să fie capabile să realizeze

calculele necesare.

104

Constrângerea fundamentală care se impune în cazul acestei metode este aceea că

dimensiunea celulei trebuie să fie mult mai mică decât cea mai mică lungime de undă pentru

care se doreşte obţinerea de expresii ale componentelor câmpului electromagnetic. Cea mai

utilizată constrângere este: „10 celule per lungimea de undă”, ceea ce înseamnă că fiecare

faţă a celulei trebuie să fie de 1/10 sau mai puţin pentru cea mai mare frecvenţă pentru care

se face calculul de câmp.

Unele forme geometrice s-ar putea să necesite pentru discretizare celule de

dimensiuni 1/20 sau mai mici, pentru a obţine rezultate satisfăcătoare.

Odată ce dimensiunile celulei au fost determinate, s-a stabilit numărul de celule

necesar discretizării obiectului ales pentru studiu şi s-a ales volumul de vid necesar dintre

obiect şi limita exterioară înseamnă că s-a determinat şi numărul total de celule necesar

discretizării întregului spaţiu considerat de calcul.

Un alt aspect de care trebuie să se ţină seama în această etapă de implementare este că

FDTD este o metodă de calcul volumetric, de aceea se poate întâlni situaţia în care în obiectul

considerat pentru studiu să apară şi părţi de material, de exemplu, conductor; atunci pentru

această regiune va trebui să se folosească lungimea de undă a materialului conductor pentru a

stabili dimensiunile celulei. (figura 3.4.)

.

Fig. 3.4 Interfaţa dintre diferite materiale

Deoarece componentele câmpului sunt definite ca fiind la interfaţa dintre celulele

reţelei asta înseamnă că proprietăţile de material trebuie determinate tot la interfaţa dintre

celule, în cazul în care obiectul discretizat este compus din mai multe materiale.

Întrucât componentele câmpului magnetic sunt centrate pe muchia dintre două celule,

în vederea estimării proprietăţilor de material necesare pentru a realiza un „update” la

componenta de câmp cunoscută, trebuie să se facă o medie între cele două materiale. De

105

exemplu, permeabilitatea magnetică kjiz ,, este una din proprietăţile de material care se

va utiliza pentru a reactualiza componenta de câmp magnetic kjiH z ,, .

Pentru a determina valoarea permeabilităţii magnetice se foloseşte relaţia:

1

, , , , , , 12

z zz zzi j k i j k i j k (3.25)

Analog se determină valorile pentru proprietăţile de material şi în cazul componentelor

câmpului electric.

Permitivitatea electrică , ,z i j k este una din valorile cu care componenta kjiEz ,, trebuie

reactualizată.

1

, , , , , 1, , , 1 , 1, 14

z xx xx xx xxi j k i j k i j k i j k i j k (3.26)

Stabilirea pasului de timp

Odată ce mărimea celulelor ce formează reţeaua de discretizare a fost determinată,

următoarea etapă constă în stabilirea pasului de timp t.

Pentru a indica timpul ,Yee foloseşte un indice n .

t = n t (3.27)

În tehnica FDTD valorile câmpului electric sunt evaluate la pasul de timp t pe când

valorile câmpului magnetic sunt evaluate la t+1/2.

106

1

1 1

2 2

, , , ,

, , , ,

n n

n n

E i j k şiE i j k

H i j k şiE i j k

(3.28)

Avantajul unui astfel de calcul a componentelor de câmp electric şi magnetic, în

raport cu timpul, este acela că permite reactualizarea componentelor de câmp după o tehnică

numită „Time Step Leap-Frogging” şi care este ilustrată în figura 3.5.

Fig. 3.5 „Time Step Leap-Frogging”

Pentru această tehnică Yee foloseşte expresii cu diferenţe finite centrate pentru

derivate în raport cu spaţiul şi timpul.

Dacă se consideră expresia de mai jos pentru derivata de ordinul I a unei funcţii u pe

direcţia x, la momentul de timp tntu :

kjiutkyjxix

u,,,,

(3.29)

Se observă că incrementul 1/2 al indicelui i (pe coordonata x) a funcţiei u, reprezintă

o diferenţă finită a spaţiului de-a lungul lui 1/2x. Yee a ales această notaţie pentru că a vrut

să „intercaleze” componentele E şi H în timp, la intervale de 1/2t cu scopul de a obţine un

algoritm de calcul în care componentele de câmp se determină în raport cu componentele

anterioare, în raport cu timpul şi spaţiul.

107

Realizarea reţelei de discretizare

Conform figurii 3.3, celulele Yee definesc componente de câmp electric doar pe 3

muchii iar componentele de câmp magnetic sunt definite doar pe 3 feţe ale acestor celule ale

reţelei de discretizare. Celulele însă sunt plasate una lângă alta şi una peste cealaltă astfel

încât acestea „umplu” un spaţiu 3D. Asta înseamnă că toate componentele de câmp electric şi

magnetic sunt în interiorul reţelei şi sunt definite corespunzător.

În figura 3.6 se sugerează construirea reţelei, iar în figura 3.7 se prezintă o secţiune prin reţea.

Fig. 3.6 Modul de “construire” al unei reţele de discretizare

Fig. 3.7 Secţiune prin reţeaua de discretizare

Aceeaşi metodă de implementare se foloseşte în realizarea reţelei de discretizare

pentru orice geometrie a corpului studiat.

Condiţii la frontieră

108

În cazul unui conductor perfect, condiţia de frontieră este anularea componentei

tangente a câmpului electric la suprafaţa conductoare. Această condiţie implică şi anularea

componentei normale a câmpului magnetic la suprafaţa conductoare. Suprafaţa conductoare

este aproximată printr-un set de feţe ale unor cuburi, paralele cu axele de coordonate. Feţele

perpendiculare pe axa x se vor alege astfel încât sa contină puncte în care sunt definite Ey si

Ez (figura 3.1). În mod similar se aleg planele perpendiculare pe celelalte axe.

Ecuaţiile cu diferenţe finite folosite pentru derivatele temporale sunt de tip “diferenţe

centrale” şi produc erori de ordinul 2, atât în timp cât şi în spaţiu. Algoritmul nu este disipativ

temporal, adică undele numerice ce se propagă în reţea nu se atenuează, în timp, din cauza

metodei numerice folosite.

Validarea metodelor numerice

Există două principale posibilităţi pentru verificarea credibilităţii rezultatelor obţinute

prin metodele numerice şi anume:

- verificări interne;

- verificări externe.

Verificările interne sunt realizate chiar prin intermediul codului numeric utilizat.

Verificările externe se fac prin comparaţia rezultatelor obţinute prin metodele numerice cu

rezultatele obţinute cu metodele analitice în cazul unor structuri similare simple pentru care

există soluţii analitice, sau cu datele obţinute prin măsurări.

Software / Simulatorul CST Microwave Studio

CST Microwave Studio – prescurtat CST MWS - este un pachet software dedicat

analizei de câmp electromagnetic şi proiectării în domeniul frecvenţelor înalte. Modelarea 3D

este facilitată de existenţa unui nucleu ACIS (software dedicat pentru modelarea 3D). După

109

modelarea obiectului de analizat, se generează, cu ajutorul unui sistem expert, o reţea

tridimensională în care este plasat obiectul. CST MWS utilizează patru tipuri de analiză,

adaptate diferitelor aplicaţii (analiza în domeniul timp, în domeniul frecvenţa, a modurilor de

propagare în ghiduri de undă, a valorilor proprii).

Caracteristici ale CST MWS:

• Se permite importul-exportul datelor 3D din/în alte medii de proiectare (ex.

AutoCAD, STEP etc) şi parametrizarea datelor importate.

• Calcularea, într-o singură simulare, a parametrilor S de bandă largă, a distribuţiei de

câmp în funcţie de timp.

• Se pot analiza materiale izotrope/anizotrope, precum şi materiale ale căror

proprietaţi variază cu frecvenţa.

• Condiţii de radiaţie/absorbţie la frontieră.

• Calcularea diferiţilor parametri de câmp: câmp electric/magnetic, curenţi

superficiali, transfer de putere, densitate de curent, densitate de energie electrică/magnetică,

variaţia în timp şi frecvenţă a tensiunii.

• Calcularea parametrilor de câmp apropiat şi depărtat ai antenelor (câştig,

directivitate etc).

• Calcularea distribuţiei SAR.

• Posibilitatea de a plasa elemente discrete în structura analizată.

• Reflectometrie în timp.

• Semnale de excitaţie predefinite şi configurabile de către utilizator.

• Modificarea adaptivă a reţelei (a densităţii de celule)

Metoda de simulare

110

CST MWS se bazează pe tehnica integrării finite (FIT). Aceasta presupune o schemă

de discretizare valabilă în tot spectrul de frecvenţe şi potrivită atât analizei in domeniul timp,

cât şi analizei în domeniul frecvenţă. FIT presupune discretizarea ecuaţiilor lui Maxwell,

exprimate în forma integrală (ecuaţiile 3.6 - 3.11). Practic este o îmbunătăţire a metodei

FDTD în sensul că elimină eroarea de aproximare prin trepte, prin integrarea unei tehnici

suplimentare, denumite PBA (Perfect Boundary Approximation). În figura 3.8 se prezintă

două dintre tehnicile de discretizare numerică cele mai folosite şi neajunsurile lor

(segmentarea, în cazul FEM şi aproximarea prin trepte, în cazul FDTD), precum şi rezultatul

implementării FIT în cadrul CST MWS.

Fig. 3.8 Ilustrare FEM, FIT+PBA, FDTD

Alte pachete software comerciale pentru modelare electromagnetică

Pentru rezolvarea ecuaţiilor de câmp electromagnetic cât şi pentru modelarea şi

simularea acţiunii acestuia asupra diferitelor obiecte cu anumite caracteristici dielectrice, in

ultima perioadă centrele de cercetare din acest domeniu cât şi unele companii specializate in

producţia de software profesional dedicat, au elaborat diferite pachete de programe care

facilitează cercetarea şi dau posibilitatea cercetătorilor de a ajunge la rezultate mai rapide cu

erori cât mai mici. În tabelul următor sunt prezentate cele mai cunoscute pachete software

111

pentru modelare numerică şi simulare in domeniul electromagnetic cât şi producătorii, preţul

informativ si principalele aplicaţii ale fiecăruia.

Tabel 1 Software de calcul electromagnetic

Producător Preţ

(mii $) Metoda; Sistem

operare Principale aplicaţii; Cerinţe sistem calcul

CST, GmbH

www.cst.de

CST MWS

CST

MICROWAVE

STUDIO®

30-50

Finite Integration

Technique;

UNIX, Windows

95/98/2000/NT4

Windows

95/98/2000/NT4/XP

SAR. CST MWS : up to 20

mil. cells. Optional

temperature analysis.

Microwave Studio: PBA,

non-uniform meshing,

AutoCAD and ACIS

export/ import, CAD

design, optimizer,

multithread solver

ANSYS, Inc.

www.ansys.com

Multiphysics 6.0

25-30

Finite Element

Method;

UNIX, Windows

95/98/2000/NT4/XP

Compatibility with other

ANSYS products. Coupled

HF/thermal solution,

import of major CAD

models, advanced

animation.

Ansoft Corp.

www.ansoft.com

HFSS 8.0

42

Finite Element

Method;

UNIX, Windows

95/98/2000/NT4/XP

SAR (for plane wave).

OSAb optimization. PC-to-

UNIX simulations.

Eigenmode solver for

anisotropic materials

Flomerics

Electromagnetics

Division

www.micro-

strips.com

Micro-Stripes 5.6

49.5

Transmission Line

Method;

Windows

95/98/2000/NT4/XP

SAR. ACIS-based

interface. Non-uniform

meshing. Parallel solver

functionality. Thin films.

Minimum 400 MHz

Processor and 100 MB free

disk space.

IMST, GmbH

www.imst.de

EMPIRE 2.2

12-20

Finite Difference

Time Domain

Method; UNIX,

Linux, Windows 95/

98/2000/NT4/XP

SAR. Auto CAD import

(limited to 3D boxes). 300

MB hard-disk space.

Matra Systèmes &

Information

www.emc2000.org

EMC2000-VF

30-35

Time Domain Finite

Volume Method;

Windows

95/98/2000/NT4/XP

SAR. 4 GB hard-disk

space. HyperMeshc

interface.

Remcom, Inc.

www.remcom.com

15

Finite Difference

Time Domain

SAR. iSIGHT

optimizationd.

112

XFDTD 5.1 Method; UNIX,

Windows

95/98/2000/ NT4/ XP

Multiprocessor for FDTD

QWED

www.qwed.com.pl

QuickWave-3Da

2.1

15

Conformal Finite

Difference Time

Domain Method;

Windows 95/98/

2000/NT4/ XP

SAR. 15 MB hard-drive

space. Non-uniform

meshing, ACIS

export/import, AutoCAD

import, Powell

optimization, multithread

solver. Basic Heating

Module

Zeland Software,

Inc.

www.zeland.com

FIDELITY 3.0

20

Finite Difference

Time Domain

Method; Windows

95/98/2000/NT4/ XP

SAR. Non-uniform

meshing, 1 GB hard-disk

space.

113

COMPORTAMENTUL NANOPARTICULELOR INCARCATE CU

MAGNETITA IN CIMP ELECTRIC

Nanoparticulele cu continut de magnetita au fost testate in cimp electric pentru a studia

comportamenul acestora sub actiunea diverselor cimpuri energetice. Rezultatele

experimentelor sunt exemplificate in diagramele urmatoare

Variatia constantei dielectrice a solutiei 10mg PLGA (acid poli-lactic-co-glicolic)+50 µg oxid fier+1ml

apa bidistilata cu frecventa si temperatura

Variatia constantei dielectrice odata cu temperatura in intervalul de frecventa 10-1 ‒ 101 Hz

114

Variatia pierderilor dielectrice a solutiei10mg PLGA+50 µg oxid fier+1ml apa bidistilata cu frecventa

si temperatura

Variatia pierderilor dielectrice odata cu temperatura in intervalul de frecventa 10-1 ‒ 101

115

Variatia tan δ a solutiei10mg PLGA+50 µg oxid fier+1ml apa bidistilata cu frecventa si temperatura

Variatia conductivitatii solutiei10mg PLGA+50 µg oxid fier+1ml apa bidistilata cu frecventa si

temperatura

10-1

100

101

102

103

104

105

106

107

0.00

1.50x101

3.00x101

4.50x101

6.00x101

7.50x101

9.00x101

1.05x102

1.20x102

1.35x102

1.50x102

1.65x102

1.80x102

1.95x102

2.10x102

Ta

n

Frecv. (Hz)

35C

36C

37C

38C

39C

40C

41C

42C

43C

44C

45C

46C

47C

48C

49C

50C

10-1

100

101

102

103

104

105

106

107

0.000050

0.000055

0.000060

0.000065

0.000070

0.000075

0.000080

0.000085

0.000090

0.000095

0.000100

0.000105

Sig

'

Frecv. (Hz)

35C

36C

37C

38C

39C

40C

41C

42C

43C

44C

45C

46C

47C

48C

49C

50C

116

Observatii: experimentele au aratat:

‒ o scadere brusca a constantei dielectrice in intervalul de frecventa 10-1 ..101 Hz dar in acelasi timp o

cresterea a acesteia odata cu cresterea temperaturii. In domeniul de frecventa 101 ‒ 107 Hz

constanta dielectrica se mentine constanta

‒ o scadere brusca a factorului de pierderi dielectrice odata in intervalul de frecventa 10-1 ..101 Hz dar

in acelasi timp o cresterea a acestuia odata cu cresterea temperaturii.

- o cresterea a factorului de disipare tan δ in intervalul de frecventa 10-1 ‒ 104 Hz si imediat o

scaderea in aceeasi tendinta in intervalul 104 ‒ 107 Hz.

- cresterea conductivitatii odata cu cresterea frecventei si a temperaturii

117

ANEXE

118

Standardizarea metodei pentru modelul de hipertermie izolata

Pentru a verifica eficacitatea sistemului de încălzire, experimentele iniţiale au

constat în setarea unei temperaturi de:

65 ° C la nivelul apei din baie pentru a asigura o temperatură de 62 ° C la

nivelul padelelor, în acest caz dorindu-se a se încălzi ficatul la 50, respectiv 45 °;

de menţionat că în acest caz temperatura dorită la nivelul ficatului a fost atinsă în

medie după 60 secunde, respectiv 58 secunde.

55 ° C la nivelul apei din baie pentru a asigura o temperatură de 62 ° la nivelul

padelelor, în acest caz dorindu-se a se încălzi ficatul la 42 ° C; de menţionat că în

acest caz temperatura dorită la nivelul ficatului a fost atinsă în medie după 28,5

secunde.

Datorită faptului că temperatura ce a fost aleasă iniţial la nivelul padelelor, după

cum a fost descris mai sus, provoca o necroză accentuată la nivelul capsulei hepatice (necroză

documentată în microscopia optică), s-a recurs la ajustarea temperaturilor de la nivelul

sistemului de încălzire, astfel încât transferul de căldură dintre padele şi ficat să se efectueze

pe o perioadă de timp mai îndelungată, într-un mod constant şi fără alterarea ireversibilă a

structurilor parenchimatoase hepatice. Adiţional, în literatura de specialitate s-a găsit faptul

că majoritatea terapiilor hipertermice se realizează în jurul valorii de 42 ° C, fapt corelat cu

rezultatele anatomo-patologice pentru probele încălzite la 45, respectiv 50 ° C (în mare parte

necroză ireversibilă), am recurs la modificarea protocolului mai sus descris, astfel:

47 ° Cla nivelul apei din baie pentru a asigura o temperatură de 45 ° la nivelul

padelelor, în acest caz dorindu-se a se încălzi ficatul la 42 ° C; de menţionat că în

acest caz temperatura dorită la nivelul ficatului a fost atinsă în medie după 88,18

secunde.

120

Standardizarea metodei pentru sistemul de administrare selectivă

intrahepatică transarterială la şobolani

Pentru verificarea şi standardizarea acestei tehnici, s-a recurs iniţial la administrarea

de albastru de metil, conform procedurii mai sus amintite. După administrarea albastrului de

metil s-a putut observa colorarea progresivă a lobilor hepatici.

Suportul imagistic pentru experimentele privind incalzirea ficatului la

sobolani

Primul lot de sobolani

121

Fig. 1 Imagine de ansamblu cu ficat încălzit la 42° C (ob. 2.5)

Fig. 2 Ficat încălzit la 42° C cu zone de hemoragie, acumulare de PMN

subcapsular, stază şi congestie vasculară (ob. 10)

Fig. 3 Ficat încălzit la 42° C cu arie de necroză subcapsulară, hemoragie şi infiltrat cu PMN

(ob. 10)

122

Fig. 4 Ficat încălzit la 42° C cu stază, congestie vasculară şi degenerescenţă hidropică

subcapsulară ( ob.20)

Fig. 5 Ficat încălzit la 42° C cu uşoară degenerescenţă vacuolară în jurul venei centrolobulare

(ob.10)

123

Fig. 6 Ficat încălzit la 42° C cu arie de necroză intraparenchimatoasă asociind infiltrat cu

PMN (ob. 10)

Fig. 7 Ficat încălzit la 42° C cu arii de necroză subcapsulară şi depozite fibrino-leucocitare pe

suprafaţa ficatului (ob. 10)

124

Fig. 8 Ficat incalzit la 42° C cu necroza hepatocitara intrtraparenchimatoasa si infiltrat cu

PMN (ob 20)

Fig. 9 Ficat încălzit la 42° C imagine de ansamblu (ob. 2.5)

125

Fig. 10 Ficat încălzit la 45° C imagine de ansamblu (ob. 2,5)

Fig. 11 Ficat incalzit la 45° C cu arie intinsa de necroza hepatocitara, exsudat cu PMN,

necroza panacinara (ob. 10)

126

Fig. 12 Ficat incalzit la 45° C cu necroze subcapsulare si depozite fibrino-leucocitare pe

suprafata ficatului (ob 10)

Fig. 13 Ficat incalzit la 45° C cu zona de tranzitie dintre aria de necroza si cea de ficat

normal (ob 10)

127

Fig. 14 Ficat incalzit la 45° C cu necroza hepatocitara intraparenchimatoasa si infiltrat

inflamator limfo-plasmocitar (ob 10)

Fig. 15 Ficat incalzit la 45° C cu discret infiltrat inflamator limfo-plasmocitar in spaţiile

porto-biliare (ob 20)

128

Fig. 16 Ficat incalzit la 50° C cu arie de necroza hepatocitara cu infiltrat inflamator limfo-

plasmocitar (ob 20)

Al doilea lot de sobolani

Fig. 17 Cord (ob.20)

129

Fig 18. Creier - fara modificari (ob 10)

Fig. 19 Pulmon - usor emfizem (ob 10)

130

Fig. 20 Rinichi - imagine de ansamblu (ob 2,5)

Fig. 21 Rinichi - fara modificari (ob 10)

131

Fig. 22 Ficat incalzit la 42° C importanta degenerescenta vacuolara (ob 10)

Al treilea lot

Fig. 23 Ficat incalzit la 42° C recoltat la 15 min. - imagine de ansamblu (ob 2,5)

132

Fig. 24. Ficat incalzit la 42° C recoltat la 15 min - mic infiltrat inflamator (Limfocite,

Plasmocite) intraparenchimatos

Fig. 25 Ficat incalzit la 42° C recoltat la 15 min - degenerescenta vacuolara (ob 10)

133

Fig. 26 Ficat incalzit la 42° C recoltat la 15 min infiltrat (Limfocite, Plasmocite, Eozinofile)

in spaţiile portobiliare (ob 20)

Fig. 27 Ficat incalzit la 42° C sacrificat la 24 ore - imagine de ansamblu (ob 2,5)

134

Fig. 28 Ficat incalzit la 42° C sacrificat la 24 ore - o 10 arie de necroza hepatocitara

intraparenchimatoasa si infiltrat cu PMN

Fig. 29 Ficat incalzit la 42° C sacrificat la 24 ore arie de necroza hepatocitara si infiltrat cu

PMN (ob 10)

135

Fig. 30 Ficat incalzit la 42° C sacrificat la 24 ore degenerescenta vacuolara , depozite

fibrino-leucocitare pe suprafata ficatului (ob 10)

Fig. 31 Ficat incalzit la 42° C si sacrificat la 48 ore - imagine de ansamblu (ob 2,5)

136

Fig. 32 Ficat incalzit la 42° C recoltat la 48 ore - degenerescenta vacuolara, necroze

subcapsulare infiltrat cu PMN (ob 10)

Fig. 33 Ficat incalzit la 42° C si sacrificat la 48 ore - degenerescenta vacuolara (ob 10)

137

Fig. 34 Ficat incalzit la 42° C recoltat la 9 zile - imagine de ansamblu cu degenerescenta

hidropica (ob 2,5)

Fig. 35 Ficat incalzit la 42° C sacrificat la 9 zile cu degenerescenta hidropica (ob. 10)

138

Fig. 36 Ficat incalzit la 42° C , recoltat la 9 zile - mici infiltrate inflamatorii limfo-

plasmocitare intraparenchimatos (ob. 20)

Fig. 37 Ficat incalzit la 42° C , recoltat la 9 zile, infiltrat cu Limfocite, Plasmocite si cu

eozinofile in spaţiile porto-biliare si periportal (ob 20)

139

Fig. 38 Ficat incalzit la 42° C , recoltat la 9 zile - infiltrat Limfo-Plasmocitar, cu PMN

intraparenchimatos si cu necroze unicelulare (ob. 40)

Al patrulea lot

Fig. 39 Ficat cu nanoparticulă introdusa inainte de incalzire cu 10 min apoi incalzire la 42° C

şi recoltare la 15 min - imagine de ansamblu (ob 2,5)

140

Fig. 40 Ficat cu nanoparticulă introdusa inainte de incalzire cu 10 min apoi incalzire la 42° C

şi recoltare la 15 min - degenerescenţă hidropică (ob 2,5)

Fig. 41 Ficat cu nanoparticulă introdusa post-incalzire la 42° C la 5-10 min - imagine de

ansamblu (ob 2,5)

141

Fig. 42 Ficat cu nanoparticulă introdusa post-incalzire la 42° C la 5-10 min - imagine de

ansamblu - degenerescenta vacuolara (ob 10)

Fig. 43 Ficat cu nanoparticulă introdusa post-incalzire la 42° C la 5-10 min - degenerescenta

hidropica (ob 20)

142

Al cincilea lot

Fig. 44 Ficat incalzit 1min la 42° C cu degenerescenta hidropica (ob 10)

Fig. 45 Ficat incalzit 3 min la 42° C - degenerescenta hidropica (ob 10)

143

Fig. 46 Ficat incalzit 3 min la 42° C - degenerescenta hidropica


144

Fig. 48 Ficat incalzit 3 min la 43° C cu degenerescenta hidropica si arii de necroze

hepatocitare intraparenchimatoase cu infiltrat inflamator cu PMN

Fig. 49 Ficat incalzit 3 min la 43° C necroze intraparenchimatoase si infiltrat cu PMN (ob

20)

145

Fig. 50 Ficat incalzit 3 min la 43° C necroze intraparenchimatoase si infiltrat cu PMN

Fig. 51 Ficat incalzit 5 min la 42° C - degenerescenta hidropica in jurul venei centro lobulare

(ob 20)

146

Fig. 52 Ficat incalzit 5 min la 42° C - degenerescenta hidropica (ob 10)

Fig. 53 Ficat incalzit 10 min la 42° C - imagine de ansamblu (ob 2,5)

147


Fig. 55 Ficat incalzit 10 min la 42° C - degenerescenta vacuolara (ob 10)

148

Fig. 56 Rinichi drept incalzit 5 min la 42° C - imagine de ansamblu (ob 2,5)

Fig. 57 Rinichi drept incalzit 5 min la 42° C - fara degenerescenta hidropica, doar cu

hemoragii interstitiale (ob 10)

149

Fig. 58 Rinichi stang - fara incalzire si fara modificari

Fig. 59 Rinichi incalzit 1 min la 42° C - degenerescenta vacuolara tubi contorti (ob 20)

150

Fig. 60 Rinichi incalzit 1 min la 42° C - usoara degenerescenta vacuolara la nivelul tubilor

contorti (ob 10)

Fig. 61 Rinichi stg fara incalzire - exista un grad de degenerescenta hidropica si aici (ob 20)

151

Suportul imagistic pentru microscopie optica

Anexa 1: concluzia 2: nanoparticulele Nile-red incarcate sint identificabile cu tehnica

disponibila curent.

Fig. 1; 20x, zND_RGP-

RG502H_05IX.003.A_tricromic_rgp.TIF

Fig. 2: subcimp 20x, zND_RGP-

RG502H_05IX.010.H_rg502h_detaliu_het

ero.TIF

Fig. 1 releva pulberea de nanoparticule etalate pe lama de sticla dupa uscarea suspensiei

apoase de injectare in animal, in expunere de fluorescenta de sumatie (pentru

FITC/DAPI/SpO) la Zeiss Z2. Pentru particule uscate inregistram emisie optima in rosu

(SpO), dar si in canalul spectral pentru TexasRed.

Fig. 2 detaliaza heterogenitatea de tipodimensiuni si mentinerea de eventuale agregate. Cele

mai mici spoturi sint compatibile imagistic cu diametrul declarat de 0.2 microni al

nanoparticulelor.

152

Anexa 2: concluzia 1: A) nanoparticulele fluoromarcate sint detectabile in amprente

Fig. 3: 40x, zND_A001~A.003.A.TIF

Fig. 4, detaliu ,

zND_A001~A.003.A_detaliu.gif

Fig. 5, 40x, zND_A002~A.002.F.gif

Fig. 6, 40x, zND_A002~A.020.A.gif

Amprentele de tesut hepatic au o fluorescenta endogena redusa (dar detectabila); in

concordanta aparitia in fluorescenta a nanoparticulelor (SpOrange) este influentata de acest

fond, dar documentabila.

Anexa 2: concluzia 1: B) nanoparticulele fluoromarcate sint discordant de rar detectabile in

sectiunile de includere in parafina (colorare H)

153

Fig. 7, 40x,

zND_41_Hematioxilina.003.A.TIF

Fig. 8, 40x,

zND_41_Hematioxilina.005.A.TIF

Fig. 9, 40x,

zND_40F_R_Hematoxilina.003.A.TIF

Fig. 10,

zND_40F_R_Hematoxilina.004.A.TIF

Frecventa de identificare a unor elemente fluorescente compatibile cu nanoparticulelor este

discordant de redusa atit la piesele provenite de la animalele non-termotratate, precum in Fig.

7, 8, cit si la acelea termotratate, precum in fig. 9, 10. Este posibil ca pierderea de fluorocrom

Nile red sa fie inegala pentru cele 3 tipodimensiuni de nanoparticule. Toate aceste preparate

provin din piese procesate standard (xilen, alcooli si parafina) si sint montate in mediu xilenic

dupa contracolorare doar cu hematoxilina. Examinarea: spectru de 3 culori

(FITC/DAPI/SpO).

Anexa 2: concluzia 1: C) Eozina in colorare face dificila interpretarea simultana in

fluorescenta

154

Fig. 11, 20x,

zND_353637_HE~A.001.A.gif

Fig. 12, 20x,


Fig. 13, 20x,


Fig. 14, 20x,


Contracolorarea cu E (in combinatia HE pentru morfologie) complica analiza imaginilor de

fluorescenta din cauza cresterii masive a fondului (autofluorescenta); preparate in procesare

standard alcooli/xilen/parafina, colorare HE, examinare in fluorescenta, spectru de 3 culori.

Anexa 3: concluzia 3: Distorsiunile histologice post-termoexpunere in cadrul protocolului

curent folosit (2 placi termale; expunere de ordinul minutului) sint etalate intr-o gama larga

de grade si afecteaza arii tisulare

155

Fig, 15, ND_23-24-25_fHE_23_fHE.gif

Fig. 16, ND_23-24-

25_fHE_23_fHE_detaliu.gif

Imagine HE pentru piesa #23, prezentind interfata dintre 2 arii tisulare cu reactivitate aparent

diferita in cadrul unui lob termoexpus; atit necroza de coagulare, trombi intravasculari,

denudare endoteliala, cit si fragmentare nucleara pot fi intilnite in diversele subregiuni.

Aparent, tesutul din proximitatea venei centrolobulare pare mai protejat termic, spatiul port

fiind cel mai afectat.

156

Suportul imagistic pentru microscopia cu fluorescenta

Ficat sobolan incalzit continand nanoparticula RGP – microscopie cu fluorescenta

Ficat sobolan rece fara nanoparticula cu Fe3O4 - microscopie in contrast diferential de faza

157

Ficat sobolan rece cu nanoparticula cu Fe3O4 - microscopie in contrast diferential de faza

Ficat sobolan rece cu nanoparticula cu Fe3O4 - microscopie in contrast diferential de faza

158

Ficat sobolan incalzit cu nanoparticula Fe3O4 (administrare cu 10 minute inaintea incalzirii) – microscopie cu

fluorescenta

Ficat sobolan incalzit cu nanoparticula cu Fe3O4 (administrare cu 10 minute inaintea incalzirii) – microscopie in

lumina polarizata

159

Control nanoparticula RG502H in pulbere cu DPX – microscopie in contrast diferential de faza


160


Control nanoparticula RG502H in pulbere cu DPX – microscopie in lumina polarizata

161

Control nanoparticula RG502H in pulbere cu apa distilata – microscopie in contrast diferential de faza

Control nanoparticula RG502H in pulbere cu apa distilata – microscopie cu fluorescenta

162

Control nanoparticula RG502H in pulbere cu apa distilata – microscopie in lumina polarizata

Control nanoparticula RGP in pulbere cu apa distilata – microscopie cu fluorescenta

163

Control nanoparticula RGP in pulbere cu DPX – microscopie in lumina polarizata

164

Introducere si protocoale utilizate pentru determinarea calitativă a IL-6 şi

a TNF-α prin tehnica RT-PCR

Tehnica a fost utilizată pentru a determina expresia genică a IL-6 şi a factorului TNF-α în

omogenatul de ficat de şobolan.

IL-6 este o interleukină care posedă proprietăţi pro-inflamatorii şi anti-inflamatorii. Este

secretată de celulele T şi de macrofage pentru a stimula răspunsul imun (post-inflamaţie sau post-

traumă).

TNF (tumor necrosis factor) este o citokină proinflamatorie al cărui nume derivă din

capacitatea de a distruge celulele tumorale şi de a induce necroză hemoragică în tumorile

transplantate la şoarece.

TNF-α este produs nu numai de macrofage şi monocite, ci şi de limfocite, mastocite,

neutrofile, keratinocite, astrocite, microglii, celule musculare netede şi unele linii celulare

tumorale. Cantităţi mari de TNF sunt eliberate la contactul macrofagelor, limfocitelor T

CD4+ şi a celulelor natural-killer (NK) cu lipopolizaharidele, produşii bacterieni şi

interleukina 1 (IL-1).

1. Introducere

Polymerase chain reaction (PCR) este o metodă de biologie moleculară prin care se amplifică o

singură (sau câteva) copii de ADN (sau cADN) cu câteva ordine de mărime, generând mii până la

milioane de copii ale acelui fragment ADN.

A fost dezvoltată în 1983 de către Kary Mullis, pentru ca în prezent să fie cea mai cunoscută şi

utilizată tehnică, în cercetarea medicală cu o foarte largă paletă de aplicaţii: clonarea ADN, secvenţiere,

teste de filogenie bazate pe ADN, analize de expresie genică, diagnosticarea bolilor ereditare,

identificarea markerilor genetici în medicina legală şi în determinarea paternitaţii, detecţia factorilor

patogeni infecţioşi şi mai ales în domeniul oncologiei.

În 1993, Mullis a fost premiat cu premiul Nobel pentru Chimie.

Reacţia de polimerizare în lant (PCR - polymerase chain reaction) permite amplificarea

enzimatică exponenţială a ADN-ului, pornind de la cantităţi foarte mici de material, mimând

mecanismul de bază al replicării ADN. Amplificarea în vitro a ADN prin PCR este un proces

ciclic, ce implică: denaturare, legarea amorselor şi extensia acestora (Fig.1).

Denaturarea se realizează prin încălzirea ADN-ului la peste 90°C timp cel puţin 60 s. În a

două fază, temperatura este redusă la 40-68°C, timp de 60-120s, pentru a permite amorselor

oligonucleotidice să se lege la secvenţele de ADN complementare de pe catenele produse în faza de

denaturare. Ultima fază a unui ciclu constă într-o reacţie de extensie enzimatică, în directia 5’ – 3’, a

primerilor cu producerea unor copii complementare ale ADN-ului bicatenar la care aceştia s-au

165

legat. Această reacţie are loc la 72°C şi durează 60-180s, fiind realizată de o ADN-polimerază

termostabilă denumită Taq, de la bacteria Thermophilus Aquaticus.

Repetarea de 25-40 ori a acestor cicluri duce la amplificarea unei secvenţe originale de

ADN de până la 1.000.000 ori în 1-2 ore.

Reactivii necesari amplificării PCR sunt: ADN polimeraza, amorse oligonucleotidice şi

deoxiribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).

Primerii sunt oligonucleotide (15-30 baze) complementare secvenţelor care flanchează

regiunea ţintă. Confirmarea mărimii produsului amplificat se realizează de obicei prin

electroforeză în gel.

Tehnica PCR este utilizată pentru manipularea genică, deoarece generează cantităţi

mari dintr-un anumit fragment de ADN şi dă posibilitatea de a modifica ADN-ul prin crearea de

noi situsuri de restricţie sau prin producerea de mutaţii în vederea studierii efectelor acestora

asupra funcţiei proteinei modificate.

2.a. Mixul PCR

A fost alcătuit din următoarele componente (per reacţie):

Nuclease free water 15.8μl

dNTP 2,5µM 1μl

Buffer (10x) 15mM, fără MgCl2 5μl

MgCl2 (25mM) 2.5μl

GoTaq Hot Start (5U/µL) 0.25μl

Primer f (100μM) 2.5μl

Primer r (100μM) 2.5μl

Matriţă (cADN) 2μl

2.b. Programul de amplificare

95°C 3 min (denaturare iniţială)

94°C 30 sec (denaturare)

55/57°C 60 s (hibridizare) 31 de cicluri

72°C 60 s (elongare)

72°C 10 min

4°C HOLD

3. Extracţia ARN

Extracţia de ARN s-a realizat în hota de flux laminar dedicată acestei proceduri, cu

consumabile nuclease free, pipete dedicate şi utilizând întotdeauna manuşi (fără talc).

166

Prelevarea ţesutului

o Fragmentele tisulare se prelevă în RNA-later (conservant) în volum de cel puţin 5 ori

mai mare decât volumul fragmentului tisular. Dimensiunile maxime ale fragmentului tisular

trebuie să fie de maxim 5 mm (= distanţa de pătrundere a RNA-later).

Obţinerea omogenatului tisular

o Se cântareste ţesutul (sau după caz se numără celulele dacă se extrage dintr-o

suspensie celulară);

o În hota cu flux laminar se pregăteşte o placă cu 48 godeuri. Se adaugă 100 µl de

guanidin-tiocianat rece de la frigider /godeu (trizolul participă la liza celulelor),

o Se triturează şi se mojarează bine ţesutul în godeu, cu pistonul unei seringi de

insulină.

o După omogenizarea suspensiei tisulare se ajustează volumul cu guanidin-tiocianat

până la 1 ml, într-un Eppendorf nou de 1,5 ml. Un ml de guanidin-tiocianat este suficient pentru

50-100 mg ţesut sau 106-10

7 celule. Dacă se folosesc cantităţi mai mari de ţesut/celule se

utilizează mai mult guanidin-tiocianat.

o Dacă după omogenizare rămân bucăţi mari de ţesut (în special atunci când folosim

ţesuturi “dure” sau foarte elastice ca de ex. piele sau ţesuturi foarte grase) se vortexează bine

trituratul celular şi apoi se lasă 10 min să se aşeze urmat de o centrifugare 10 min la 10000 G la

4 °C. Se recuperează doar supernatantul.

o Omogenatul poate fi păstrat fie la temperatura camerei (se continuă tehnica a

doua zi) sau la 4 °C 24 de ore sau congelat pe termen lung la minim -20°C (cel puţin o

lună)

Extracţia ARN

o Se adaugă peste omogenatul de mai sus 1ml de fenol-cloroform pentru fiecare ml de

guanidin-tiocianat iniţial

o Se agită energic la vortex 30 de secunde (sau chiar mai mult, până când culoarea

virează la roz lactescent) - etapă esenţială; în această etapă se face solubilizarea ARN; cu cât

agitarea este mai energică cu atât liza celulară şi solubilizarea ARN vor fi mai bune.

o Lăsăm 5-10 min în repaus la temperatura camerei.

o Se centrifughează la 14000 G, timp de 15 min la 4°C.

o Lichidul se va separă în 3 faze:

faza inferioară, rosie, conţine cloroform; (şi ADN-ul şi proteinele din probă)

interfaza conţine resturi tisulare sub forma unui inel (a nu se atinge inelul cu vârful

pipetei!)

faza superioară, apoasă, conţine ARN.

o Recuperăm cât mai mult supernatant = faza superioară într-un eppendorf nou

Precipitarea ARN-ului

o Adăugăm peste supernatantul recuperat 500µl etanol absolut pentru fiecare 1ml de

guanidin-tiocianat iniţial,

o Se agită la vortex 5 sec,

o Se lasă în repaus 30 min la -20˚C,

o Se centrifughează la 14000 G, timp de 10 min la 4°C,

o Se înlătură supernatantul

167

o ARN-ul precipitat poate fi păstrat în etanol 75% la -20°C minim un an sau la 4°C o

săptămână.

Spalărea

o Peste sedimentul recuperat se adaugă câte 1 ml etanol de 75% (-20°C) pentru fiecare

ml de guanidin-tiocianat iniţial

o Se agită la vortex 5 sec

o Se centrifughează la 14000 G timp de 5 min la o temperatură cuprinsă între 2-8°C,

după care se elimină supernatantul în totalitate (etanolul inhibă PCR).

Uscarea şi rehidratarea

o Se usucă în hotă până la evaporarea lichidului rămas. Nu se lasă ca ARN-ul să se

usuce complet deoarece resolubilizarea lui va fi dificilă; în acest caz ARN-ul trebuie încălzit 10

min la 55-60°C

o Se resuspendă în 50 µl AD sterila BioMol

o Se congelează la -80°C.

Dozarea (protocol specific spectrofotometrului)

o Se fac 2 diluţii:

prima de 1:50 -într-un Eppendorf punem:

2 µl de probă

98 µl de apă nuclease-free

a doua diluţie de 1:6, cu:

o 10 µl de probă şi

o 50 µl apă nuclease-free

o Folosim un eppendorf cu apă nuclease-free pentru blank

o Se citeşte la spectrofotometrul la λ=260, 280, 320nm

Migrarea

o Cuva pentru migrare şi pieptenele trebuie spalăte cu soluţie de NaOH 0,5M

(20g NaOH în 100 ml AD) timp de 30 minute, după care se clăteşte de două ori cu apă RNA-se

free,

o Preparăm 50 ml de gel de agaroză 0,8% cu 1‰ bromură de etidiu

0,4 g agaroză

50 ml AD

Se pune la fiert până devine lichidul limpede ~3-4 min, la microunde, putere maximă. Se

completează volumul pîna la 50 ml dacă este necesar

50 µl bromură de etidiu (1µg)

Se toarnă gelul în cuvă şi se pune la răcit. Dacă suntem grabiţi putem pune gelul la 4 ºC,

o Se scoate pieptenele şi marginile cuvei, după ce gelul a făcut bine priză,

o Se umple cuva cu buffer TBE 1x (RNA-se free),

o Se pregătesc probele în 3 eppendorf-uri:

De ex: pentru 18 µl volum total vom repartiza câte:

3 µl de tampon de încărcare 6x (Gel loading buffer)

13 µl de AD

2 µl din probă

168

o Se distribuie câte 15 µl probă/lane

o Se fixează aparatul la 120V, 25 mA şi 10-20 minute, apoi se porneşte şi se

aşteaptă migrarea, după care se va citi la Geldoc SYNGENE.

4. Obţinerea de ADN complementar – Reverstranscripţia

Molecula monocatenară de ARN mesager serveşte ca matriţă pentru sinteza unei catene

de ADN complementar (ADNc) realizată de enzima transcriptaza inversă.

A fost folosit kitul de reverstranscripţie Enhanced Avian HS RT-PCR-100 Kit (Sigma-

Aldrich) pentru producerea primei catene de cADN, optându-se pentru folosirea primerilor

Oligo dT, deoarece ţinta pentru amplificările ulterioare a fost mARN (ARN mesager).

Protocolul a fost optimizat pentru obţinerea unei cantităţi cât mai mari de cADN, în

vederea evidenţierii prin amplificare atât a genelor exprimate puternic, dar mai ales, a celor care

se exprimă slab şi foarte slab.

Reverstranscripţia s-a realizat în hota de flux laminar dedicată acestei proceduri, cu

consumabile nuclease free, pipete dedicate şi utilizând întotdeauna mănuşi (fără talc).

Denaturarea zonelor dublu catenare ale RNA

În tuburi de 0.2ml (individual pentru fiecare probă) s-au amestecat cate 1μl primer Oligo

dT, 1μl dNTP’s şi 8μl RNA. După o scurtă centrifugare tuburile au fost puse într-un termociclor

preîncălzit la 70˚C pentru 10 min, iar apoi au fost transferate pe gheaţă pentru 5 minute.

Mixul de reverstranscripţie (RT)

S-a realizat un mix alcătuit (pentru fiecare probă) din următoarele componente:

10x Buffer AMV-RT 2μl

Rnase inhibitor 1μl

H2O 6μl

AMV-RT 2μl

Total 11μl

Mixul RT a fost distribuit (după o pipetare intensă) în tuburile iniţiale cu ARN, primeri şi

dNTP’s, pentru ca apoi să fie puse în termociclor.

Programul RT

25˚C 15min hibridizare primeri

42˚C 50min elongare

169

70˚C 15min inactivare RT

Produşii obţinuti au fost păstraţi la +4˚C până la amplificarea PCR.

5. Setul de primeri

PRIMERUL FORWORD este primerul care se va hibridiza pe catena ANTISENS (şi

este identic cu catena sens).

PRIMERUL REVERSE este primerul care se va hibridiza pe catena SENS (şi este

identic cu catena antisens).

IL-6 (564) mARN [14]

TTCCCTACTTCACAAGTC (18)

CTAGGTTTGCCGAGTAGA (18)

>gi|7549768:1-1045 Rattus norvegicus interleukin 6 (Il6), mRNA

AGCTCATTCTGTCTCGAGCCCACCAGGAACGAAAGTCAACTCCATCTGCCCTTCA

GGAACAGCTATGAAG

TTTCTCTCCGCAAGAGACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGATGTTGTTGAC

AGCCACTGCCTTCC

CTACTTCACAAGTCCGGAGAGGAGACTTCACAGAGGATACCACCCACAACAGA

CCAGTATATACCACTTC

ACAAGTCGGAGGCTTAATTACATATGTTCTCAGGGAGATCTTGGAAATGAGAAA

AGAGTTGTGCAATGGC

AATTCTGATTGTATGAACAGCGATGATGCACTGTCAGAAAACAATCTGAAACTTC

CAGAAATACAAAGAA

ATGATGGATGCTTCCAAACTGGATATAACCAGGAAATTTGCCTATTGAAAATCTG

CTCTGGTCTTCTGGA

GTTCCGTTTCTACCTGGAGTTTGTGAAGAACAACTTACAAGATAACAAGAAAGAC

AAAGCCAGAGTCATT

CAGAGCAATACTGAAACCCTAGTTCATATCTTCAAACAAGAGATAAAAGACTCA

TATAAAATAGTCCTTC

CTACCCCAACTTCCAATGCTCTCCTAATGGAGAAGTTAGAGTCACAGAAGGAGTG

GCTAAGGACCAAGAC

CATCCAACTCATCTTGAAAGCACTTGAAGAATTTCTAAAGGTCACTATGAGGTCT

ACTCGGCAAACCTAG TGTGCTATGCCTAAGCATATCAGTTTGTGGACATTCCTCACTGTGGTCAGAAAAT

ATATCCTGTCGATGG

GTATCTAAATTATGTTGTTCTCTACGAAGAACTGGCAATATGAATGTTGAAACAC

TATTTTAATTATTTT

TAATTTATTGATAATTTAAATAAGTAAACTATAAGTTAATTTATGATTGATATTTA

TACTTTTTATGAAG

170

TGTCACTTGAAATATTATGTTATAGTTTTGAAAAGATAATATAAAAATCTATTTG

ATATGAATATTCTCT

TACCTAGCCAGATGGTTTCTTGCAATATATAAGTTTACCTCAATGAATTGCTAATT

TAAATTTTT

TNF-α (522) mARN [14] AAGTTCCCAAATGGGCTC (18)

TCACAGAGCAATGACTCCAAAG (22)

>gi|260166688|ref|NM_012675.3| Rattus norvegicus tumor necrosis factor (Tnf), mRNA

CACCAAGGGACCAGCCAGGAGGGAGAACAGCAACTCCAGAACACCCTGGTACT

AACTCCCAGAAAAGCAA

GCAACCAGCCAGGCAGGTTCCGTCCCTCTCATACACTGGCCCGAGGCAACACAT

CTCCCTCCGGAAAGGA

CACCATGAGCACGGAAAGCATGATCCGAGATGTGGAACTGGCAGAGGAGGCGCT

CCCCAAAAAGATGGGG

GGCCTCCAGAACTCCAGGCGGTGTCTGTGCCTCAGCCTCTTCTCATTCCTGCTCGT

GGCGGGGGCCACCA

CGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCCCAACAAGGAGGAGAAGTT

CCCAAATGGGCTCCC

TCTCATCAGTTCCATGGCCCAGACCCTCACACTCAGATCATCTTCTCAAAACTCG

AGTGACAAGCCCGTA

GCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGCGGAGGAGCAGCTGGAGTGGCTGAGCCAG

CGTGCCAACGCCCTCC

TGGCCAATGGCATGGATCTCAAAGACAACCAACTGGTGGTACCAGCAGATGGGC

TGTACCTTATCTACTC

CCAGGTTCTCTTCAAGGGACAAGGCTGCCCCGACTACGTGCTCCTCACCCACACC

GTCAGCCGATTTGCC

ATTTCATACCAGGAGAAAGTCAGCCTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCTTGCCCTA

AGGACACCCCTGAGG

GAGCTGAGCTCAAGCCCTGGTATGAGCCCATGTACCTGGGAGGAGTCTTCCAGCT

GGAGAAGGGGGACCT

GCTCAGCGCTGAGGTCAACCTGCCCAAGTACTTAGACATCACGGAGTCCGGGCA

GGTCTACTTTGGAGTC

ATTGCTCTGTGAGGCGACTGGCGTGTTCATCCGTTCTCTACCCAGCCCCTGTCCC

CGACTCTGACCCCCA

TTACTCTGACCCCTTTATCGTCTACTCCTCAGAGCCCCCAATCTGTGTCCTTCTAA

CTTAGAAAGGGAAT

TGTGGCTCTGGGTCCAACTCCGGGCTCAGAATTTCCAACAACTACGATGCTCAGA

AACACACGAGACGCT

GAAGTAGTGGCCTGGATTGCGGGCTGCTCATGAGCCGCCACCGGCAAGGATTCC

AATGGGCTTTCGGAAC

TCACTGGATCCCGGAATGTCGATGCCTGAGTGGATCGGGGGAGTGGAGGGGGGA

GTGGATCAGGCTGCCT

CTGGCTCACAAGGCTGCTGAAGATGTCTCAGGCCTCCCTTCCTTCCTTCCTTCCCT

CCCTCAGAGCTTCC

CAGACTGTTCCCTGAGGCACAGCGCCCAGCCTTCCTTACGGAACCCCCTCTATTT

ATAATTGCACCTGTG

171

ACTATTTATTTATTATTTATTATTTATTTATTTGCTTATGAATGTATTTATTTGGAA

GGCCGGGGCGTCC

TGGAGGACCCAGCGTTGGGAAGCTGTCTTCAGGCCAACATGTTTTCTGTGAAAAC

GGAGCTAAACTACCA

GCTATCCCCATCTGGTCCCCCACCCCTGCCTCGTTGCCTCCCCCCTTTTCTTTTGCT

TATGTTTAAAACA

AGATATTTATCTAACCCAGTTGTCTTAATAATGCTGATTTGGTGACCAGGCTGTC

GCTACATCACTGAAC

CTCTGCTCCCCACGGGAGCCGTGACTGTAATCGCCCTACGGGTCATTGAGAGAAA

TAAAGTTCGCTTGGA

AAAGAAA

TNF-α (955) ADN genomic [14] AAGTTCCCAAATGGGCTC (18)

TCACAGAGCAATGACTCCAAAG (22)

>gi|62750820:3661000-3663618 Rattus norvegicus strain BN/SsNHsdMCW chromosome

20, RGSC_v3.4

CACCAAGGGACCAGCCAGGAGGGAGAACAGCAACTCCAGAACACCCTGGTACT

AACTCCCAGAAAAGCAA

GCAACCAGCCAGGCAGGTTCCGTCCCTCTCATACACTGGCCCGAGGCAACACAT

CTCCCTCCGGAAAGGA

CACCATGAGCACGGAAAGCATGATCCGAGATGTGGAACTGGCAGAGGAGGCGCT

CCCCAAAAAGATGGGG

GGCCTCCAGAACTCCAGGCGGTGTCTGTGCCTCAGCCTCTTCTCATTCCTGCTCGT

GGCGGGGGCCACCA

CGCTCTTCTGTCTACTGAACTTCGGGGTGATCGGTCCCAACAAGGAGGAGGTGAG

TGCCTGGGCAGCGTT

TATTCTCACTCACAAGCAAAGTAGGGTGGGAGGGCAAGAAAGGCAGGAGGGTA

AGGGAAAGAGGTCGGCT

GGTGGGCACAGTAATGTGGAGGAGAGTTGGGGAGGGAGACCTCGGACCCGTGCA

GCCAGTTGTCTAAACA

TCCTTGGGTGGATGCACGGAGGGGCGAATGAACGAACAAGCGTGCGTACACGTG

CAGAGATGTGCAGAGA

CGTGGCCAGGGGAACAGGGAAGAAGCAAGAGATAAAAATTCGAGACGGAGATG

GGAGACGAGGGAGATAA

GGAGATATGAGAGATAAGGAGGGAGATGGAGGGGAAACAACAGATCAAGCACA

GAGGGTACCACAGAAAG

ATGCTGAGGTTGGACGGATAAATGAATGAGGAGGAAAAGCACTGACTGGGGGG

GGGGGGCTGGCAAAGAG

CGGGGAGGCTTCTCCTTTGTGGTGAGTCTGTCTACTAACCTACTTCTTTCCCTACA

CAGAAGTTCCCAAA

TGGGCTCCCTCTCATCAGTTCCATGGCCCAGACCCTCACACTCAGTAAGTGTTCC

CAAGCCTCTCTCTTA

ATTTAGGATGGGGGGCGGGGGACTTAAAGCTTTGGTTTGGGAGGAAAGGGAATA

GGGGTCTAACTACACA

GATGCTTGCTGGGAAACCTAAGGGTCTCATCTCCGCCTTTGTCCCCTTCCAGGAT

CATCTTCTCAAAACT

172

CGAGTGACAAGCCCGTAGCCCACGTCGTAGGTAAGTTTCTTCGCATGTGCCTTGG

GGGGGGGGGTGTGAC

AGGGCAGGATTTTGGGGTCGTGCCAGGCTGAGAGAAGACAAGGGCTCTCAGAGA

CAGCAGGTGAGAGAGT

CAGAGCGGTGATTCAAAGGCAAGGCATTAGGAGGCCACCCCGGACCTCGTAGCC

AATGGGACGTGGAAAG

ACCAGAGGGCGCAGGAACCGGAAGTGAAGTGTGGGTAGAAGTTGAGGTTCAGG

ATGTGGAGTGTGAACTA

AGAGGGTGACACTGACTCAATTCTCCCTCCCTCAGCAAACCACCAAGCGGAGGA

GCAGCTGGAGTGGCTG

AGCCAGCGTGCCAACGCCCTCCTGGCCAATGGCATGGATCTCAAAGACAACCAA

CTGGTGGTACCAGCAG

ATGGGCTGTACCTTATCTACTCCCAGGTTCTCTTCAAGGGACAAGGCTGCCCCGA

CTACGTGCTCCTCAC

CCACACCGTCAGCCGATTTGCCATTTCATACCAGGAGAAAGTCAGCCTCCTCTCT

GCCATCAAGAGCCCT

TGCCCTAAGGACACCCCTGAGGGAGCTGAGCTCAAGCCCTGGTATGAGCCCATG

TACCTGGGAGGAGTCT

TCCAGCTGGAGAAGGGGGACCTGCTCAGCGCTGAGGTCAACCTGCCCAAGTACT

TAGACATCACGGAGTC

CGGGCAGGTCTACTTTGGAGTCATTGCTCTGTGAGGCGACTGGCGTGTTCATCCG

TTCTCTACCCAGCCC

CTGTCCCCGACTCTGACCCCCATTACTCTGACCCCTTTATCGTCTACTCCTCAGAG

CCCCCAATCTGTGT

CCTTCTAACTTAGAAAGGGAATTGTGGCTCTGGGTCCAACTCCGGGCTCAGAATT

TCCAACAACTACGAT

GCTCAGAAACACACGAGACGCTGAAGTAGTGGCCTGGATTGCGGGCTGCTCATG

AGCCGCCACCGGCAAG

GATTCCAATGGGCTTTCGGAACTCACTGGATCCCGGAATGTCGATGCCTGAGTGG

ATCGGGGGAGTGGAG

GGGGGAGTGGATCAGGCTGCCTCTGGCTCACAAGGCTGCTGAAGATGTCTCAGG

CCTCCCTTCCTTCCTT

CCTTCCCTCCCTCAGAGCTTCCCAGACTGTTCCCTGAGGCACAGCGCCCAGCCTT

CCTTACGGAACCCCC

TCTATTTATAATTGCACCTGTGACTATTTATTTATTATTTATTATTTATTTATTTGC

TTATGAATGTATT

TATTTGGAAGGCCGGGGCGTCCTGGAGGACCCAGCGTTGGGAAGCTGTCTTCAG

GCCAACATGTTTTCTG

TGAAAACGGAGCTAAACTACCAGCTATCCCCATCTGGTCCCCCACCCCTGCCTCG

TTGCCTCCCCCCTTT

TCTTTTGCTTATGTTTAAAACAAGATATTTATCTAACCCAGTTGTCTTAATAATGC

TGATTTGGTGACCA

GGCTGTCGCTACATCACTGAACCTCTGCTCCCCACGGGAGCCGTGACTGTAATCG

CCCTACGGGTCATTG

AGAGAAATAAAGTTCGCTTGGAAAAGAAA

GAPDH (495) [15]

173

ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC (21)

GTTGTCATGGATGACCTTGGCC (22)

>gi|110347607|ref|NM_017008.3| Rattus norvegicus glyceraldehyde-3-phosphate

dehydrogenase (Gapdh), mRNA

GGGGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGAGACAGCCGCATCTTCTTGTGCAGTGCC

AGCCTCGTCTCATA

GACAAGATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGGATTTGGCCGTATCGGACGCCTGG

TTACCAGGGCTGCCTTCT

CTTGTGACAAAGTGGACATTGTTGCCATCAACGACCCCTTCATTGACCTCAACTA

CATGGTCTACATGTT

CCAGTATGACTCTACCCACGGCAAGTTCAACGGCACAGTCAAGGCTGAGAATGG

GAAGCTGGTCATCAAC

GGGAAACCCATCACCATCTTCCAGGAGCGAGATCCCGCTAACATCAAATGGGGT

GATGCTGGTGCTGAGT

ATGTCGTGGAGTCTACTGGCGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCTGGGGCTCACCT

GAAGGGTGGGGCCAA

AAGGGTCATCATCTCCGCCCCTTCCGCTGATGCCCCCATGTTTGTGATGGGTGTG

AACCACGAGAAATAT

GACAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAGCCC

CCCTGGCCAAGGTCA

TCCATGACAACTTTGGCATCGTGGAAGGGCTCATGACCACAGTCCATGCCATCAC

TGCCACTCAGAAGAC

TGTGGATGGCCCCTCTGGAAAGCTGTGGCGTGATGGCCGTGGGGCAGCCCAGAA

CATCATCCCTGCATCC

ACTGGTGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCAGAGCTGAACGGGAAGCTC

ACTGGCATGGCCTTCC

GTGTTCCTACCCCCAATGTATCCGTTGTGGATCTGACATGCCGCCTGGAGAAACC

TGCCAAGTATGATGA

CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGGCCGAGGGCCCACTAAAGGGCATCCTGGG

CTACACTGAGGACCAG

GTTGTCTCCTGTGACTTCAACAGCAACTCCCATTCTTCCACCTTTGATGCTGGGGC

TGGCATTGCTCTCA

ATGACAACTTTGTGAAGCTCATTTCCTGGTATGACAATGAATATGGCTACAGCAA

CAGGGTGGTGGACCT

CATGGCCTACATGGCCTCCAAGGAGTAAGAAACCCTGGACCACCCAGCCCAGC

AAGGATACTGAGAGCAA

GAGAGAGGCCCTCAGTTGCTGAGGAGTCCCCATCCCAACTCAGCCCCCAACACT

GAGCATCTCCCTCACA

ATTCCATCCCAGACCCCATAACAACAGGAGGGGCCTGGGGAGCCCTCCCTTCTCT

CGAATACCATCAATA

AAGTTCGCTGCACCCTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

6. Migrarea electroforetică

Separarea fragmentelor de AND prin electroforeza în gel

174

În prezenţa unui câmp electric continuu, fragmentele de ADN vor migra spre anod,

datorită prezenţei grupărilor fosfat, încărcate negativ. În gel frecarea modifică viteza migrării,

astfel că moleculele mai mari se vor deplasa mai încet, deoarece trec mai greu prin pori decât

moleculele mici. Pot fi utilizate trei tehnici de electroforeză în gel: electroforeza în gel de

agaroză, electroforeza în gel de poliacrilamidă şi electroforeza în gel în câmp electric pulsatil

(pulse-field gel electrophoresis). Astfel, pot fi separate fragmente de ADN cu lungimi cuprinse

între 5 nucleotide şi 5000 de nucleotide.

Electroforeza în gel de agaroză

Metoda implică utilizarea unei plăci-suport, introdusă intr-o cuvă de electroforeză, pe

care este fixat gelul de agaroză, la nivelul căruia sunt formate godeuri în care va fi depozitat

ADN-ul. Cuva de electroforeză este conectată la o sursă de curent electric continuu care asigură

migrarea fragmentelor. Trebuie ales un raport optim între tensiunea şi intensitatea sursei de

curent şi dimensiunea cuvei, astfel încât migrarea să se producă suficient de repede, dar benzile

să fie clar conturate.

Eşantioanele de ADN sunt amestecate cu o soluţie tampon ce conţine un colorant (de

exemplu bromura de etidium) pentru detecţia migrării şi sunt introduse, cu o micropipetă, în

godeuri. Benzile obţinute, prin electroforeza în gel, sunt comparate cu cele obţinute la migrarea

unei soluţii martor a căror fragmente au greutate moleculară cunoscută.

Electroforeza în gel de agaroză este folosită în scop analitic (pentru a determina

cantitatea de ADN sau rezultatul unei digestii enzimatice sau a unei reacţii PCR), sau în scop

preparativ (pentru a purifica un fragment de ADN dintr-un complex de produse ale digestiei

enzimatice sau ale PCR).

Protocol gel agaroză:

Soluţia de TrisBorat EDTA (TBE) 10X a fost diluată cu apă distilată până la 1X

Pentru gel 2% în 300 mL TBE.

Se pun într-un vas 300 mL TBE + 6g agaroză. Se fierbe la microunde până devine

omogen. Se răceşte prin agitare manuală pentru a NU face peliculă la suprafaţă. Se adaugă

150 μL bromură de etiliu. Se toarnă în placă (fără pieptene aplicat). Se elimină bulele cu un

vârf de pipetă. Se aplică pieptenele. Se lasă să se răcească. Se pune gelul în cuva cu

godeurile către catod (negru). Se spală godeurile cu TBE (pipetă/pompă). Se conectează firele

(mV): negru – negru / roşu-roşu. Migrare catod-anod (negru → roşu) - 5V/cm.

Pentru migrare se foloseste Lader de 50bp. Dacă bufferul enzimei nu e colorat se adaugă

5 μL Blue/Orange loading Dye la 1 MIX de 50 μL. Se depune în godeu.

Imaginea migrării electroforetice a fost preluată cu geldocul SYGENE.

175

Fig.1 Schema reacţiei de polimerizare în lant (PCR)

176

Structura lipozomilor

(Partener Riga, Letonia)

1,1’-[(3,5-Didodeciloxycarbonyl-4-phenyl-1,4-dihydropyridine-2,6-

diil)dimethylen]bispyridinium dibromide

MW 925.94 g/mol

Mp 156-158°C

Elemental analysis calculated with 3.7% of water:

Found (%): C 61.42 H 7.85 N 4.25

Calculated (%): C 61.18 H 7.86 N 4.37

1H NMR (DMSO-d6, δ): 0.86 (t, 6H, J = 6.6 Hz, 3,5-CH3); 1.17-1.29 (m, 36H, 3,5-(CH2)9);

1.46-1.54 (m, 4H, 3,5-OCH2CH2); 4.00 (t, 4H, J = 6.1 Hz, 3,5-OCH2); 5.02 (s, 1H, 4-H); 5.56

and 6.09 (AB-system, 4H, J = 14.8 Hz, 2,6-CH2); 7.19-7.30 (m, 5H, 4-Ar); 8.10 (dd, 4H, J =

7.8 and 6.6 Hz, 3-H Py); 8.58 (t, 2H, J = 7.8 Hz, 4-H Py); 8.95 (d, 4H, J = 6.6 Hz, 2-H Py);

10.17 (br s, 1H, N-H). MS (+ESI) m/z (relative intensity) 766 (79

Br) ([M-2Br]+, 40%).

Preparation of 1,4-Dihydropyridine liposomes:

46.30 mg (0.05 mmol) of amphiphilic 1,4-dihydropyridine was weighed and 20 ml of

phosphate buffered saline pH 7.4 solution was added. Obtained solution then was heated in

water bath at temperature above 70C and sonicated for 15 min in (COLE PARMER 8890)

ultrasonic bath. Final concentration of 1,4-DHP 2.5 mM.

Preparation of PEGylated 1,4-Dihydropyridine liposomes:

177

46.30 mg (0.05 mmol) of amphiphilic 1,4-dihydropyridine and 0.0025 mol of corresponding

Brij derivative were weighed, and 20 ml of phosphate buffered saline pH 7.4 solution was

added. Obtained solution then was heated in water bath at temperature above 70C and

sonicated for 15 min in (COLE PARMER 8890) ultrasonic bath. Final concentration of 1,4-

DHP 2.5 mM and corresponding Brij 0.125 mM.

PEGylation lipids:

MW 1199 g/mol

MW 1151 g/mol

MW 4670 g/mol

AFM images and vertical profiles of liposomes formed by 1,4-DHP amphiphile and

corresponding Brij compositions adsorbed on a mica plates. The samples were prepared by

sonication in PBS solution at a concentration of 1,4-DHP amphiphile 0.5 mg/mL.

178

Brij 35 PBS 4 weeks

Brij 100 PBS 4 weeks

179

Brij 20 PBS fresh

Brij 20 PBS 4 weeks

180

Brij 100 PBS fresh

Brij 35 PBS fresh

Preparation of polymeric nanoparticles:

(Partener Besancon, Franta)

181

Biodegradable polymeric nanoparticles were prepared by the oil in water o/w emulsion solvent

evaporation technique. The polymer used was poly lactide-co-glycolide (PLGA). PLGA and Nile red as

a fluorescent marker was dissolved in ethyl acetate as an organic solvent. This organic solution was

poured into 10 ml of 0.1% aqueous sodium cholate solution and the coarse emulsion formed was

further homogenized with an ultrasonic cell disruptor for 4 minutes in icebath.

Solvent evaporation was then performed in Buchi Rotavaor RE 120(Buchi, Flawil, Switzerland) with

reducing the pressure stepwise down to 30 mbar with a diaphragm pump.

The resulting nanoparticles suspension was then diluted by distilled water containing 0.5g trehalose

and freeze dried for 24 hours.

For the incorporation of magnetite (iron oxide Fe3O4), a modified w/o/w emulsion solvent

evaporation technique is utilized. 50 µl of magnetite nanoparticles solution was mixed with 50µl

water and emulsified in the organic solution of PLGA for 1 minute at higher power and then the

secondary emulsion is produced as described above. The particles are freeze dried in the same way

and kept under dry conditions until used.

The following figure is a digramatic representation of the prepared nanoparticles where the nile red

is homogenously dispersed in the polymer matrix while the aqueous magnetite is emulsified as

nano-droplets inside the nanoparticles.

Characterization of polymeric nanoparticles:

Different particles were characterized by measuring their particle size and size distribution in terms

of the average volume diameters and polydispersity index by photon correlation spectroscopy using

particle size analyser (Brookhoven Instruments Corporation, New York, USA) at fixed angle of 90° at

25 °C. The nanoparticles suspension was diluted with distilled water before analysis, and samples

were analyzed in triplicate.

Results of particles size analysis have shown that

1. NPs containing magnetite only : average particle diameter = 135.3 ± 10 nm and the

polydispersity index is 0.007

2. NPs containing magnetite and NR: average particle diameter= 180.0 ± 15 and the PDI is 0.09

182

CONCLUZII

183

i. Cea mai adecvata temperatura de expunere a ficatului de sobolan pare a fi 42oC,

producand leziuni de degenerescenta vacuolara la nivelul focarului;

ii. Procesarea standard histologica cu includerea in parafina nu este compatibila cu

maniera de examinare in fluorescenta pentru captarea de nanoparticule Nile red –

marcate, deoarece fluorocromul (liposolubil) este eluat in cursul procesului;

iii. Nanoparticulele nu sint omogene (observat in microscopia cu fluorescenta);

iv. Efectele termoconditionarii nu par a fi nici omogene in masa ficatului si nici

controlabile cu metodologia utilizata pina in present;

v. Nivelul inflamatiei hepatice, manifestat prin cresteri ale valorilor IL-6 si TNFα,

pare a fi neglijabil avand in considerare rezultatele obtinute prin analiza omogenatului

de ficat de sobolan.

184

REFERINTE BIBLIOGRAFICE

185

Hipertermia

1. B. 34 Hildebrandt, P. Wust et al. The cellular and molecular basis of

hyperthermia. Crit Rev Oncol Hematol 2002; 43: 33-56;

2. P. Wust, B. Hildebrandt et al. Hyperthermia in combined treatment of cancer.

Lancet Oncol 2002; 3: 487-97;

3. M. H. Falk and R. D. Issels. Hyperthermia in oncology. Int J Hyperthermia 2001;

17: 1-18;

4. S. K. Jones, J. G. Winter and B. N. Gray. Treatment of experimental rabbit liver

tumours by selectively targeted hyperthermia. Int J Hyperthermia 2002; 18: 117-128;

5. M. Johannsen, U. Gneveckow et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer

using magnetic nanoparticles: presentation of a new interstitial technique. Int J

Hyperthermia 2005; 21: 637-647;

6. A. Jordan, R. Scholz et al. The effect of thermotherapy using magnetic

nanoparticles on rat malignant glioma. J Neurooncol 2006; 78: 7-14;

7. R. Hergt, S. Dutz et al. Magnetic particle hyperthermia: nanoparticle magnetism

and materials development for cancer therapy. J Phys: Condens Matter 2006; 18:

2919-2934;

8. A. Ito, H. Honda and T. Kobayashi. Cancer immunotherapy based on

intracellular hyperthermia using magnetite nanoparticles: a novel concept of ‘‘heat-

controlled necrosis’’ with heat shock protein expression. Cancer Immunol

Immunother 2006; 55: 320-328;

9. B. Thiesen and A. Jordan. Clinical applications of magnetic nanoparticles for

hyperthermia. Int J Hyperthermia 2008; 24: 467-474;

10. S. Laurent, S. Dutz et al. Magnetic fluid hyperthermia: focus on

superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Adv Colloid Interface Sci 2011; 166: 8-

23;

11. S. Power, M. M. Slattery and M. J. Lee. Nanotechnology and its relationship to

interventional radiology. Part II: drug delivery, thermotherapy and vascular

intervention. Cardiovasc Intervent Radiol 2011; 34: 676-690;

12. P. I. P. Soares, I. M. M. Ferreira et al. Application of hyperthermia for cancer

treatment: recent patents review. Recent Pat Anticancer Drug Discov 2012; 7: 64-73;

186

13. A. Gasselhuber, M. R. Dreher et al. Comparison of conventional chemotherapy,

stealth liposomes and temperature-sensitive liposomes in a mathematical model. PLoS

ONE 2012; 7: e47453;

14. P. G. Murphy, J. Grondin et al. Induction of interleukin-6 in axotomized sensory

neurons. J Neurosci 1995; 15: 5130-5138;

15. L. Tao, P. M. Kramer et al. Altered expression of c-myc, p16 and p27 in rat

colon tumors and its reversal by short-term treatment with chemopreventive agents.

Carcinogenesis 2002; 23: 1447-1454;

16. J. Zhang, E. W. Taylor et al. Impact of heat treatment on size, structure, and

bioactivity of elemental selenium nanoparticles. Int J Nanomedicine 2012; 7: 815-

825;

17. P. Lee, R. Zhang et al. Enhancement of anticancer efficacy using modified

lipophilic nanoparticle drug encapsulation. Int J Nanomedicine 2012; 7: 731-737;

18. J. M. Qin, P. H. Yin et al. Anti-tumor effects of brucine immuno-nanoparticles

on hepatocellular carcinoma. Int J Nanomedicine 2012; 7: 369-379;

19. T. Liu, L. Li et al. Pathological mechanisms of liver injury caused by continuous

intraperitoneal injection of silica nanoparticles. Biomaterials 2012; 33: 2399-2407;

20. T. R. Downsa, M. E. Crosby et al. Silica nanoparticles administered at the

maximum tolerated dose induce genotoxic effects through an inflammatory reaction

while gold nanoparticles do not. Mutat Res 2012; 745: 38-50;

21. C. S. Yah, G. S. Simate and S. E. Iyuke. Nanoparticles toxicity and their routes

of exposures. Pak J Pharm Sci 2012; 25: 477-491;

22. S. Wohlfart, A. S. Khalansky et al. Efficient chemotherapy of rat glioblastoma

using doxorubicin-loaded PLGA nanoparticles with different stabilizers. PLoS ONE

2011; 6: e19121;

23. S. Aryala, C. M. J. Hu and L. Zhang. Polymeric nanoparticles with precise

ratiometric control over drug loading for combination therapy. Mol Pharm 2011; 8:

1401-1407;

24. R. Zuchini, H. W. Tsai et al. Electromagnetic thermotherapy using fine needles

for hepatoma treatment. EJSO 2011; 37: 604-610;

25. H. Holback and Y. Yeo. Intratumoral drug delivery with nanoparticulate carriers.

Pharm Res 2011; 28: 1819-1830;

187

26. J. Wang, B. Chen et al. Synthesis and antitumor efficacy of daunorubicin-loaded

magnetic nanoparticles. Int J Nanomedicine 2011; 6: 203-211;

27. K. Higashisaka, Y. Yoshioka et al. Acute phase proteins as biomarkers for

predicting the exposure and toxicity of nanomaterials. Biomaterials 2011; 32: 3-9;

28. Q. Tian, C. N. Zhang et al. Glycyrrhetinic acid-modified chitosan/poly(ethylene

glycol) nanoparticles for liver-targeted delivery. Biomaterials 2010; 31: 4748-4756;

29. S. Naqvi, M. Samim et al. Concentration-dependent toxicity of iron oxide

nanoparticles mediated by increased oxidative stress. Int J Nanomedicine 2010; 5:

983-989;

30. Q. Weili, W. Bochu et al. Improved nanoparticles preparation and drug release

for liver targeted delivery. Irn J Med Hypotheses Ideas 2009; 3: 15-19;

31. H. Nishimori, M. Kondoh et al. Silica nanoparticles as hepatotoxicants. Eur J

Pharm Biopharm 2009; 72: 496-501;

32. C. Yague, M. Moros et al. Synthesis and stealthing study of bare and PEGylated

silica micro- and nanoparticles as potential drug-delivery vectors. Chemical

Engineering Journal 2008; 137: 45-53;

33. J. Sun, S. Zhou et al. Synthesis and characterization of biocompatible Fe3O4

nanoparticles. J Biomed Mater Res A 2007; 80: 333-341;

34. C. Buzea, I. I. Pacheco Blandino and K. Robbie. Nanomaterials and

nanoparticles: sources and toxicity. Biointerphases 2007; 2: 17-172;

35. K. E. Cha and H. Myung. Cytotoxic effects of nanoparticles assessed in vitro and

in vivo. J Microbiol Biotechnol 2007; 17: 1573-1578;

STUDIUL MICROUNDELOR SI RELATIA CU SUBSTANTA

Bibliografie selectiva:

David, A., Weston, Electromagnetic compatibility: principles and applications, Edition: 2,

CRC Press, 2001, ISBN 0824788893

Kenneth, L. Kaiser, Electromagnetic Compatibility Handbook: Circuits, Signals and

Systems, CRC Press, 2004j, ISBN 0849320879

188

Tsaliovich, Anatoly, Electromagnetic Shielding Handbook for Wired and Wireless EMC

Applications, Springer, 1999, ISBN 0412146916

Moses, C., Engheta, N., Electromagnetic wave propagation in the wire medium: a complex

medium with long thin inclusions, Wave Motion, Volume 34, Issue 3, September 2001,

pages 301-317

Biuns, K. J., Lawrenson, P. J., Trowbridge, C. W., The analytical and numerical solution of

electric and magnetic fields, John Wilez&Sons, 1995

Mindru, Gh., Radulescu, M. M., Analiza numerica a campului electromagnetic, Ed. Dacia,

Cluj-Napoca, 1986

Mocanu,C. I., Teoria cimpului electromagnetic, Ed. Didactică şi pedagogică, Bucuresti,

1981

Schwab, A., Compatibilitate Electromagnetica, Editura Tehnica Bucuresti, 1996

Cone, Gabriela, Note de curs - Optica,Universitatea Politehnică Bucureşti, 2006

Emerson, W. H., IEEE Trans. Antennas Propag. 1973, AP-21, 484

Ruck, G. T., Radar Cross Section Handbook; Plenum Press: Newe York, 1970; Vol. II

Vinoy, K. J.; Jha, R. M., Radar Absorbing Materials: From theory to Design and

Characterization; Kluwer Academic Publishers: Boston, 1996

Knott, E. F.; Shaeffer, J. F.; Tuley, M. T. Radar Cross Section, 2Rev. ed ed.; Artech

House: Norwood, 1993

Saville Paul, Trisha Huber, Darren Makeiff - Fabrication of Organic Radar Absorbing

Materials Defence R&D Canada – Atlantic, Technical Report DRDC Atlantic TR 2005-124

Saville Paul - Review of Radar Absorbing Materials Defence R&D Canada –Atlantic,

Technical Memorandum DRDC Atlantic TM 2005-003

Tennant, A., Chambers, B., A Single-Layer Tuneable Microwave Absorber Using an Active

FSS, IEEE Microwave and Wireless Components Letters, Vol. 14, No. 1, Ianuarie 2004

Kaleeba, P. N., Tennant, A.; Chambers, B., Ide, J P., – Electromagnetic Analysis of Active

Radar Absorbers, IEEE 2003

Liu, J.-C., HO S.-S., Bor S.-S.; P.-C. Lu - Tchebyshev approximation method for Salisbury

screen design, IEE Proceedings - H, Vol. 140, No. 5, October 1993

Chambers, B., Optimum design of a Salisbury screen radar absorber, Electronics Letters,

189

Vol. 30, No. 16, August 1994

Fante, R., McCormack, M. T., Reflection Properties of the Salisbury Screen, IEEE

Transactions on Antennas and Propagation, Vol. 36, No. 10, October 1988

Caloz ,C., Tatsuo, Itoh , Electromagnetic metamaterials : transmission line theory and

microwave applications: the engineering approach, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken,

New Jersey 2006

190

RAPORT AL DEPLASARILOR IN STRAINATATE

PRIVIND ACTIVITATEA DE DISEMINARE SI

FORMARE PROFESIONALA

191

1. Kick off meeting Iasi 31 Mai – 1 Iunie 2012

1.0 Purpose

The purpose of this initial meeting (the kick-off meeting) is to build a common understanding

of the goals and objectives for the CheTherDel project, to discuss project implementation in

the future, open job positions, select the best candidates, and all other technical details.

2.0 Outcome

Each member of the project consortium understands specific project objectives, means and

actions leading to their achievement, its respective roles and responsibilities, planned

outputs and outcomes, and agrees with the list of measurable progress indicators in the

project implementation. The Steering Group and the Technical Committee shall be

constituted.

KICK OFF MEETING AGENDA

Project Name:

Chemo-hyperthermal Delivery - Combined

chemo-hyperthermal control of hepatic

tumors, based on microwave-activated

subendothelial-targeted magnetic nano-

assemblies

Page 1/3

Purpose, Objectives and Elements of the Meeting:

To build a common understanding on the goals and objectives for the CheTherDel project within the project consortium, to discuss future project implementation, and all other technical details.

As the agenda indicates, the meeting is divided into three parts. Part I and part II – the morning sessions - contain information of interest to all parties including the project partners, stakeholders, regional and national authorities. These sessions are devoted to the welcome speeches and short presentations of the CheTherDel project and partnering institutions within the consortium. Concluding remarks will be summarized in the frame of part III.

192

Attendees:

1. Dimofte Gabriel, Romania 2. Pieptu Dragos, Romania 3. Radu Iliescu, Romania 4. Bogdan Tamba, Romania 5. Romeo Ciobanu, Romania 6. Cornia Ursulescu, Romania 7. Emanuele Papini, Italy 8. Chiara Fedeli, Italy 9. Alf Lamprecht, France 10. Karlis Pajuste, Latvia 11. Arkadij Sobolev, Latvia

Date:

Place:

31st of May, 1

st of June

2012

Regional Institute of Oncology,

Iasi, Romania

Thursday, May 31st 2012, Iasi

Accommodation of project partners

20.00 Welcome dinner

Friday, June 1st 2012, Iasi

09:00– 9.15 Registration of the participants, Meeting room floor 7 Regional Institute of Oncology Iasi

Part I – Opening and welcome session, short project presentation

193

9.15 – 9.30 Welcome speech

Gabriel DIMOFTE, Project leader and President of the Senat of the University of Medicine and Pharmacy, Gr. T. Popa, Iasi

Dragos PIEPTU, Vice President of the University of Medicine and Pharmacy, Gr. T. Popa, Iasi

9.30-10.00

CheTherDel project presentation

Gabriel DIMOFTE -birth of an idea -principle and potential solutions -goals and strategies -construction of the consortium -main subprojects -potential difficult tasks, go/no go points - potential for future developments

10:00 – 10:30

Coffee break

10:30 – 12:00

Part II – Consortium presentation Short presentations of the project partners :

approx. 15 minutes per institution

10.30-10.45

Tehnical University Gheorghe. Asachi, Iasi, Romania

Romeo CIOBANU

10.45-11.00 University of Padua, Italy

Emanuele PAPINI

11.00-11.15

University of Franche-Comte, Besancon, France

Alf Lamprecht

11.15-11.30

Latvian Institute of Organic Synthesis, Riga

Arkadij Sobolev, Karlis Pajuste

11.30-11.45

Regional Institute of Oncology, Iasi, Romania

Corina URSULESCU

11.45-12.00

University of Medicine and Pharmacy “Gr. T. Popa” Iasi, Romania

Gabriel DIMOFTE

12:00 – 14:30 Lunch break – Unirea Panoramic Restaurant

14.30-16.00 Part III – Working packages (informal discussions regarding technical

194

aspects, foreseen problems and international cooperation)

WP1 - Management

WP2 – Development of liposome type NA filled woth chemotherapeutic agents

WP3- Development of magnetic nanoassemblies coated with MAC

WP4- Development of MW based therapeutic system

WP5- Recognition of tissue antigenic marker + MAC production

WP6- Ex vivo fixation of MAC coated nanoparticles

WP7- Evaluation of HYPEC on induce liver tumors in rats

WP8- Dissemination and implementation strategies

16:15 – 16:45 Part IV – Concluding remarks

16:15 – 16:30 Establishment of the Steering Board and The Technical Committee

16.30 - 16.45 Planning future events and possible cooperations in other projects

16.45-17.00 End of the meeting day - Discussion and Conclusion

17.00-18.30 Tour of the city

19:30 Dinner – Oscar Restaurant

Notes:

1. Official language of the kick-off meeting will be English.

Detailed Meeting Minutes:

195

9.20

Dr. Gabriel DIMOFTE welcomes the participants and opens the session.

9.25

Dr. Dragos PIEPTU presents the history and tradition of the University of Medicine and Pharmacy, Gr. T. Popa, Iasi in

the research sector. The current status of the European and national projects and partnerships is also described,

emphasizing the CheTherDel as the first FP7 project lead by the university.

9.35

Dr. Gabriel DIMOFTE – gives a comprehensive presentation of the CheTherDel project. From the original idea (result of

more than 15 years of clinical practice) to the principle and potential solutions for the hepatic cancer treatment. A

review of the goals and strategies set for the project are listed and explained. A series of comments and discussion

from the participants arose when discussing the subprojects, potential approaches and go/no go points. The potential

for future developments are also presented, including future projects, scientific researches or commercial applications.

10:00 – 10:30

Coffee break

10:30

Dr. Romeo CIOBANU presents the partner: Technical University Gheorghe. Asachi, Iasi, Romania. After a brief

introduction regarding the tradition and experience of the university, the current project approach and technical

details are presented. Clarifying comments and questions from the participants.

10.45

Dr. Emanuele PAPINI presents the partner: University of Padua, Italy. Brief introduction of the university followed by

the experience and expertise in the in-vitro and in-vivo testing and imaging techniques. Several questions from the

participants on better targeting or visualization of the compounds are discussed.

11.00

Dr. Arkadij SOBOLEV and Dr. Karlis PAJUSTE present the Latvian Institute of Organic Synthesis, Riga. The focus of the

presentation is on the liposomes obtained from synthetic lipids (cationic amphiphilic 1,4-dihydropyridines) that the

institute has experience and results as usable drug delivery systems. The participants discuss the potential obstacles

related to the use of the liposomes for the scope of the project and several suggestions are made.

11.15

196

Dr. Corina URSULESCU from the Regional Institute of Oncology, Iasi, Romania presents briefly the institute extensive

experience and its clinical research facilities.

11.30

Dr. Alf LAMPRECHT representing the University of Franche-Comte, Besancon, France, gives and ample overview on the

synthesizing capacities and technologies of his group, especially on PEG stealth nanoparticles. The participants discuss

and propose several criteria and goals that the “ideal” compound should meet. The in-vivo toxicology testing especially

is proposed as secondary to in-vivo targeting in-vitro toxicology.

11.45

Dr. Gabriel DIMOFTE moderates a discussion of the participants and further underlines the main objectives for the

current year of the project and encourages the members of the project to think creatively, out of the box for it is the

different views and skills of each and everyone put to work together that will ensure the success of the project.

12:00 – 14:30 Lunch break

14.30

Dr. DIMOFTE shortly presents each work package of the project. Informal discussions follow regarding the technical

aspects, foreseen problems and possible solutions. Specifically, targeting of inflammatory cells in the liver is proposed.

In this respect, selective targeting of inflammatory phagocytes versus liver Kupfer cells, has been focused as an

important issue to be addressed. It is agreed upon the design of 2 types of nanoparticles to be delivered into the liver,

respectively “stealth” and “non-stealth”. Heparin is proposed to coat nanoparticles for specific targeting of

subendothelial structures, in addition to the already planned coating with collagen ispotype specific (IV) mab or

polyclonal antibodies/Fabs. Also, there is a proposal to load liposomes with an Rx contrast substance like

Lipiodol/Iopamidol for visualization by micro-CT. The immediate steps and actions for each WP are discussed and

agreed upon. Further communication between the project’s members will ensure the smooth running of the WP’s. All

the participants give their input and comments according to the workload and responsibilities within each WP.

16:15 – 16:30

The participants agree for the establishment of the Steering Board

1. Gabriel Dimofte – coordinator 2. Romeo Ciobanu 3. Cornia Ursulescu 4. Emanuele Papini 5. Brigita Vigante 6. Alf Lamprecht

and the Technical Committee

197

1. Gabriel Dimofte, Radu Iliescu, Bogdan Tamba

2. Romeo Ciobanu

3. Cornia Ursulescu

4. Emanuele Papini, Chiara Fedeli, Regina Tavano

5. Brigita Vigante, Arkadij Sobolev, Aiva Plotniece, Karlis Pajuste

6. Alf Lamprecht

16.30

Planning future events and possible cooperation in other projects:

The next FP7 Health call is mentioned as well as other possible European or international cooperation. The next

meeting is set for the month of November in Vienna. Possible other venues (in each participant area) are considered

for future meetings and events.

16.45

Dr. DIMOFTE moderates the final discussions and conclusions with the participants agreeing on the succes of this kick

off meeting and the clear and straight ideas and steps for the immediate future of the project.

2. Meeting operativ cu Universitatea din Padova: Padova 26-29 Septembrie 2012.

Participanti: Conf. Dr. Gabriel Dimofte, Dr. Vlad Porumb, std. Ionut Tudorancea

198

Scopul vizitei a fost evaluarea laboratorului din Padova di discutarea primelor etape in

formularea celor mai bune metode de degradare termica a ficatului de sobolan. Prezenta

membrilor echipei a fost esentiala pentru a discuta etapele experimentale in inducerea

leziunilor prin hipertermie. Au fost transportate probe de tesuturi hepatice din variate

protocoale si s-a explicat pe larg modul de identificare pentru prevenirea erorilor.

S-a vizitat laboratorul Prof. Papini si s-au discutat aspecte idividuale referitor la posibilele

ramificatii ale studiului, in mod particular cu privire la identificarea modcificarilor

metabolice si de expresie ARN la nivelul zonelor expuse termic.

3. Joint Steering Board and Technical Committee, Viena 2-4 Noiembrie 2012

1.0 Purpose

The purpose of this joint meeting of the Steering Board and Technical Committee is to

present current research progresses and problems encountered by partners in achieving the

goals of the CheTherDel project, to discuss future steps and possible changes in the initial

protocol.

2.0 Outcome

Each member of the project consortium should understand better its role and perspectives

while facing technical or scientifically limitations in developing individual parts of the project.

Early results shall be discussed and a critical approach should bring in front problems and

possible solutions.

199

VIENNA SB and TC MEETING AGENDA

Project Name:

Chemo-hyperthermal Delivery - Combined

chemo-hyperthermal control of hepatic

tumors, based on microwave-activated

subendothelial-targeted magnetic nano-

assemblies

Page 1/3

Purpose, Objectives and Elements of the Meeting:

The purpose of this joint meeting of the Steering Board and Technical Committee is to present

current research progresses and problems encountered by partners in achieving the goals of the

CheTherDel project, to discuss future steps and possible changes in the initial protocol.

.

As the agenda indicates, the meeting is divided into two parts. Both contain information of interest to all project partners. These sessions are devoted to presentations of early result by all attending partners, description of models and potential significance of early results. Data from all experiments will be discussed within all parts and potential problems will be outlined.

200

Attendees:

12. Dimofte Gabriel, Romania 13. Radu Iliescu, Romania 14. Vlad Porumb, Romania 15. Emanuele Papini, Italy 16. Alf Lamprecht, France 17. Mona Abdel-Mottaleb, France 18. Karlis Pajuste, Latvia 19. Arkadij Sobolev, Latvia 20. Brigita Vigante, Latvia 21. Aiva Plotniece, Latvia

Date:

Place:

2-4 November 2012

Faberhaft Restaurant

Vienna, Austria

Friday, November 2nd 2012, Vienna

19.00 Partners arrival in Vienna and accommodation

19.30 Welcoming all project partners

20.00 INFORMAL DINNER

Satruday, November 3rd 2012, Iasi

08.00-0.830

Registration of the participants, Seminar room, Faberhaft Restaurant, Vienna

201

Part I – Early results in animal modeling and NP selection and vizualisation

9.00-9.15 Welcome speech

Gabriel DIMOFTE, Project leader

9.15-10.00

G. DIMOFTE R. Iliescu V. Porumb

Rat model for selective injection in hepatic artery

Development a model for localized hyperthermia in a rat model

Producing samples of heated and non heated rat liver for further evaluation by Italian group for best antigenic target selection and effects of short time heating

Early data in evaluating intrahepatic distribution of NPs produced by the French group

In vivo toxicity using provided NPs from the French group

10.00-10.15 Discussions *Critical discussions regarding the models and techniques proposed by the partner

10.15-10.45 E. PAPINI

- toxicity models for ex vivo testing

- early data of toxicity regarding the PLGA NPs produced in France

- technique for future testing on heated samples of rat liver

10.45-11.00 Discussion * Potential problems regarding the level of heating

* Quantification of thermal effect and/or infLammatory response

11.00-11.45

A. LAMPRECHT M. Abdel Mottaleb

- nano-structure of the PLGA particles and the significance it caries regarding positioning of the magnetite or fluorescent tag

- biodegradability of the PLGA NPs

- solutions for better visualization of NPs using a more stable fluorochrome

11.45-12.30 Discussion All partners should present their experience and problems regarding the topics as well as accumulation of data for early publications

12.30-13.00 BREAK

13.00-14.00 Part II – Round table discussion on the field of thermolabile lyposomes and

202

drug delivery

13.00-13.30 K. Pajuste

- technical data regarding production of lyposomes and their PEG-ylation - pharmacotoxicity of compound used in the production of liposomes - liposome stability on time

13.30-13.45

A. Sobolev A. Plotniece B. Vigante

- significance of the carbon chain length for thermal stability of liposomes - problems in the evaluation of thermolability

13.45-14.00

G. Dimofte R. Iliescu V. Porumb

- thermolability requirements - concept of thermolable liposomes in the context of the project

14.00-15.00 Discussion Solutions for the assessment of thermolability in dry or wet mass

15.00-16.00 LUNCH

16.00-16.30 Part IV – Concluding remarks

16.00-16.15 Clear steps for further developments

16-15.16.30 Planning future meetings and common projects

16.30 End of the meeting day - Discussion and Conclusion

Detailed Meeting Minutes:

203

PART I: Early results in animal modeling and NP selection and vizualisation

G. Dimofte presented the results from the partner in Iasi regarding the early results in modeling a technique for

intrahepatic injection with application on rats. Data were shown about the model being developed with significant

benefits and potential drawbacks. The model is valid and it uses a Seldinger type technique associating a large

laparotomy which allows for selective hepatic artery catheterization.

Discussions with E. Papini and R. Iliescu about potential problems arising from hepatic artery ligation. Vaculation of

hepatocytes could partially be produced in non-heated lobes due to this technique.

G. Dimofte presented the prototype developed by I. Tudorancea and V. Porumb for local deployment of heat in the

selected middle lobe. Data were presented regarding local effect and microscopic markers of heating

Discussions with E. Papini about future tests in Padua regarding effects of local hyperthermia.

G. Dimofte presented early results in heating liver lobes, demonstrating the technique. Samples were sent previously in

Padua for antigenic recognition.

Discussion were carried by E. Papini, R. Iliescu and A. Lamprecht regarding the effect of heat on antigenic exposure and

adequate choose of the antigen. Some alternatives for antigen staining were discussed regarding mostly the

intravascular approach for antibody infusion in vitro.

G. Dimofte presented early results with NPs containing Nile red. The team was unsuccessful to visualize the

fluorochorme and possible pitfalls were discussed. The decision was taken to exchange the fluorochrome with cumarin

6 for better stability. Data were also presented regarding magnetite containing NPs. The Iasi team was able to

demonstrate large penetrability in both normal and heated liver and they have showed also a method to quantify the

colorimetric effect using Pearls coloration.

Discussions were extensive regarding the cause of the failure and also the potential of adding cumarine 6 to the

magnetite containing NPs. A decision was also take to send V. Porumb for a knowledge transfer in Besancon to work

with Marta Abdel Mottaleb. R. Ilescu and V. Porumb made comments related to the visualization techniques employed

and A. Lamprecht and Mona Abdel made significant suggestion regarding properties of the NPs and possibilities to

recognize them. K. Pajuste and A. Sobolev informed the group that they can have access to TEM in order to visualize

whole particles in tissue. A decision was taken to send M. Leon with tissue sample in Riga.

E. Papini presented protocols for ex vivo toxicity they are going to use as well as early data for toxicity studies already

in progress. There are data suggesting that NPs produce in France have limited effect on macrophages.

Discussions were extensive with A. Lamprecht, R. Iliescu and G. Dimofte regarding the intended antigenic site we wish

to target and possibility of developing a new model with liver metastatic disease. A. Lamprecht and M. Abdel informed

the group about a model for induce colorectal cancer that might be used for further experiments. V. Porumb was given

the task to learn and implement the model for further use.

204

A. Lamprecht presented the structure of the NPs and probable position of the substances absorbed in the NPs.

Relevant data were presented regarding vizualisation and necessity to obtain high quality images using a scanning

electron microscopy tool. The French team will do that on the NPs in order to better demonstrate the structure.

Discussions – G. Dimofte, R. Iliescu, E. Papini and A. Sobolev discussed numerous aspects about the particles and their

destruction. A significant discussion was carried regarding the fate of the NP in tissue as well as the fate of magnetite

crystals if freed in the interstitial tissue or cell. The panel was very convinced that the particle will maintain integrity for

about a week, but the microcrystals will remain in tissue for much longer.

In the final discussion we decided that there are enough data, almost, for a publication regarding intrahepatic

distribution of NPs containing PLGA.

Part II: Round table discussion on the field of thermolabile lyposomes and drug delivery

The team mostly involved with this task is the team from Riga. They took the leader position in this round table. They

presented the structure of the liposomes they have synthesized for the research project with individual characteristic.

There main problem was assessment of thermolability. A. Lamprecht and M. Abdel offered some practical solutions

and a decision was teaken for samples to be sent in Besancon for testing. Samples of liposomes were also delivered for

Iasi and Padua. K. Pajuste and other team colleagues presented significant data from their research program and also

toxicity data on separated compounds. Cytotoxicity was performed in vitro and toxicity was performed in vivo with

some degree of toxic effect.

Discussions were abundant regarding stability, chemo delivery and fate of liposomes. All participants demonstrated

interest in using their own technology in augmenting the lyposomes and characterizing their thermolability which

should deliver drugs at 42 degrees.

Dr. DIMOFTE moderates the final discussions and conclusions with the participants agreeing on the success of this

meeting and the clear and straight ideas and steps for the immediate future of the project.

4. Stagiu de documentare si meeting operativ la Universitatea din

Besancon, Franta: Dr. Vlad Porumb, 18-24 Noiembrie 2012

205

Stagiu sential in derularea proiectului in mod particular datorita dificultatilor de

resuspensie a nanoparticulelor dupa conservarea prin uscare congelare. Stagiul

s-a axat pe intelegerea modului de producere si dificultatile de conservare si

resuspendare. Definitivarea structurii a fost insotita de introducerea de

magnetite si un fluorocrom relativ stabil. S-a facut perfectionarea in modalitatile

de detectare a fluorocromilor, faza esentiala in detectarea si pozitionarea

nanoparticulelor inainte de degradare. Stagiul a fost essential si a dus la

modificarea modalitatii de conservare si transport si la redefinirea calitatii

optime a solutiei cu suspensie de nanoparticule.

5. Stagiu de documentare si meeting operativ la Institutul de Sinteze Organice

din Riga, Letonia: Dr. Magda Leon, 23 Noiembrie - 1Decembrie 2012

Stagiul a permis o mai buna cunoastere a structurii, a modului de producere si

conservare a lipozomilor transportori, fabricate de partenerul din Riga. Dna dr.

Leon s-a ocupa de intelegerea modului fabricatie si beneficiile modificarilor

lanturilor carbohidrate in vederea alterarii stabilitatii termica a lipozomilor.

Studiile de stabilitate urmeaza a se desfasura impreuna cu partenerul din

Besancon. S-au facut studii paralele de microscopie electronica in vederea

studierii pozitiei nanonparticulelor injectate in vivo referitor la membranele

celulalre si endoteliile vasculare.

Iasi, 03.11.2012

Conferentiar Dr. Gabriel Dimofte

era net euronanomed jtc-3 raport stiintific 2012

Documents