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Entwicklung und Evaluierung eines In-vitro-Testsystemszur Überprüfung der Wirkung von Schwermetallionen und Gossypolauf Sertoli-Zellen der Ratte

Inaugural-Dissertationzur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizindes Fachbereichs Humanmedizinder Justus-Liebig-Universität Gießen

vorgelegt von Udo Winterstein

aus Kassel

Gießen 2000

Aus dem Medizinischen Zentrum für Dermatologie und Andrologie

Leiter: Prof. Dr. Dr. med. habil. W.-B. Schilldes Klinikums der Justus-Liebig-Universität Gießen

Betreuer: Dr. rer. nat. Th. Monsees

Gutachter: Prof. Dr. Dr. med. habil. W.-B. Schill

Gutachter: Prof. Dr. med. W. Weidner

Tag der Disputation: 20. Dezember 2001

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 1

1.1 AUSWAHL DER SCHADSTOFFE 71.1.1 BLEIAZETAT 71.1.2 NICKELAZETAT 91.1.3 KOBALTCHLORID 91.1.4 HEXACHLOROPLATINSÄURE 101.1.5 GOSSYPOL 11

1.2 AUSWAHL DER UNTERSUCHTEN ZELLPARAMETER 131.2.1 LAKTATPRODUKTION DER SERTOLI-ZELLEN 131.2.2 INHIBINPRODUKTION DER SERTOLI-ZELLEN 141.2.3 MTT-ASSAY 14

2 AUFGABENSTELLUNG 16

3 MATERIAL UND METHODEN 17

3.1 VERWENDETE NOXEN 173.2 VERWENDETE MEDIEN 18

3.3 PRÄPARATION PRIMÄRER SERTOLI-ZELLEN 203.3.1 RATTENHODENPRÄPARATION 203.3.2 ENZYMATISCHE ZELLISOLATION 213.3.3 ANLEGEN DER ZELLKULTUR 233.3.4 BEHANDLUNG DER ZELLEN MIT HYPOTONER LÖSUNG 243.3.5 ÜBERPRÜFUNG DER REINHEIT DER ZELLKULTUR 26

3.4 TOXIKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER ZU TESTENDEN

SUBSTANZEN 303.4.1 LAKTATBESTIMMUNG 313.4.2 INHIBINBESTIMMUNG 333.4.3 MTT-MESSUNG 353.4.3 PROTEINBESTIMMUNG 36

3.5 OPTIMIERUNGEN 373.6 STATISTIK 41

4 ERGEBNISSE 42

4.1 VITALITÄT DER SERTOLI-ZELLEN NACH ZUGABE DER ZU

UNTERSUCHENDEN SUBSTANZEN 424.1.1 GOSSYPOL 434.1.2 SCHWERMETALLSALZE 44

4.2 LAKTATPRODUKTION DER SERTOLI-ZELLEN NACH ZUGABE

DER ZU UNTERSUCHENDEN SUBSTANZEN 474.2.1 GOSSYPOL 474.2.2 SCHWERMETALLSALZE 47

4.3 INHIBINSEKRETION DER SERTOLI-ZELLEN NACH ZUGABE DER

ZU UNTERSUCHENDEN SUBSTANZEN 514.3.1 GOSSYPOL 514.3.2 SCHWERMETALLSALZE 52

4.4 ERGEBNISSE DER OPTIMIERUNG 55

5 DISKUSSION 57

5.1 DISKUSSION DES TESTSYSTEMS 575.2 DISKUSSION DER ERGEBNISSE 62

6 ZUSAMMENFASSUNG 80

7 VERÖFFENTLICHUNGEN 83

7.1 PUBLIKATIONEN 837.2 PUBLIZIERTE ABSTRACTS 83

8 LITERATURVERZEICHNIS 84

9 LEBENSLAUF 100

10 DANKSAGUNG 102

Abkürzungsverzeichnis

ABP Androgenbindendes Protein

AP Alkalische Phosphatase

ATP Adenosin-Tri-Phosphat

BSA Rinder-Serum-Albumin

cAMP Zyklisches Adenosin-Mono-Phosphat

cis-Platin Cis-Diaminodichlor-Platin

DBCP 1,2-Dibrom-3-Chlorpropan

DMSO Dimethylsulfoxid

EGF Epidermaler Wachstumsfaktor

ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EtOH Ethanol

FSH Follikelstimulierendes Hormon

GGT Gammaglutamyltranspeptidase

GPT Glutamat-Pyruvat-Transaminase

GnRH Gonadotropes Releasinghormon

IGF Insulinähnlicher Wachstumsfaktor

LH Luteinisierendes Hormon

MTT 3-[4,5-dimethyl-2]-2,5-diphenyl-2H-

tetrazolium Bromid

NAD Nikotinamid-adenin-dinukleotid

NBT Nitro-Blue Tetrazolium

TGF Transformierender Wachstumsfaktor

TM-Zellen Transformierte Mäusezellen

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Infertilität und ungewollte Kinderlosigkeit sind längst nicht mehr nur Prob-

leme der davon betroffenen Paare. Die Präsenz dieser Fragen in den Medien

zeigt, daß es sich dabei um einen Sachverhalt von außerordentlichem ge-

sellschaftlichen Interesse handelt. Ging man lange davon aus, daß die Ursa-

che von Unfruchtbarkeit bei Paaren in den weitaus meisten Fällen bei der

Frau liegt, so ist mittlerweile anzunehmen, daß in etwa 40% der Fälle die

Gründe beim Mann zu suchen sind.

Epidemiologische Studien in den letzten Jahrzehnten deuten an, daß es

möglicherweise zu einer stetigen Abnahme der Spermienqualität bei der

männlichen Bevölkerung in den Industrienationen gekommen ist (Seibert,

1996). Die umfangreichste Arbeit zu diesem Thema zeigt anhand der retro-

spektiven Analyse von 61 Untersuchungen an einem Gesamtkollektiv von

14.947 Männern einen durchschnittlichen Rückgang der Spermienzahl um

etwa 50% und eine Abnahme des Ejakulatvolumens um etwa 20% inner-

halb der letzten 50 Jahre (Carlsen et al., 1992). Die Zunahme von Tumoren

und Mißbildungen der männlichen Reproduktionsorgane, die nicht nur beim

Menschen, sondern auch bei wildlebenden Tieren beobachtet wurden, sind

in gleichem Zusammenhang zu sehen. Die Inzidenz für das Auftreten von

Hodenkrebs stieg beispielsweise in Deutschland von 1962 bis 1988 um das

Dreifache (Adami, 1994). Die Häufigkeit von Kryptorchismus bei 3 Monate

alten Säuglingen in England hat sich von den fünfziger Jahren bis in die

achtziger Jahre knapp verdoppelt (Ansell et al., 1992).

Die angeführten Studien haben zu einer breiten wissenschaftlichen und ge-

sellschaftlichen Diskussion über die Umweltfaktoren geführt, die für all

diese Phänomene verantwortlich gemacht werden. Eine besondere Rolle

scheinen dabei Schadstoffe zu spielen, die über die Nahrungskette, durch

die Atemluft oder die Haut in den menschlichen Organismus gelangen. Die

Wirkung dieser Schadstoffe auf die Reproduktionsorgane des Mannes steht

1 Einleitung 2

derzeit im Mittelpunkt des Interesses. Zahlreiche Untersuchungen zeigen

eine Schädigung der Spermienproduktion bei Männern, die chronisch sol-

chen Schadstoffen exponiert waren. Der jahrelange Umgang mit dem Pesti-

zid DBCP (1,2-Dibrom-3-Chlorpropan) führte beispielsweise zu Infertilität

bei Arbeitern eines Chemieunternehmens in den USA (Eaton et al.,1986).

Die Spermatogenese ist ein komplexer Prozeß, der nur durch das Zusam-

menspiel aller Zellpopulationen des Hodengewebes, der somatischen Zellen

und der Keimzellen möglich wird. Die wichtigsten somatischen Zellen sind

hier die Leydig-Zellen und die Sertoli-Zellen. Die sogenannten Leydig-

schen Zwischenzellen liegen außerhalb der Hodentubuli eingebettet in eine

komplexe extrazelluläre Matrix (Dym and Fawcett, 1970), die im wesentli-

chen aus Bindegewebe besteht. In diesem Bindegewebe verlaufen außer-

dem Blut- und Lymphgefäße, die zur Versorgung des Hodens mit

Nährstoffen und Sauerstoff beitragen. Leydig-Zellen sind die endokrin ak-

tivsten Zellen des Hodens. Die von ihnen unter dem Einfluß von in der Hy-

pophyse produziertem LH freigesetzten Androgene sind essentiell für die

Hodenfunktion. Die Peritubulär-Zellen umgeben die Hodentubuli und tra-

gen so zu deren struktureller Integrität bei.

Im basalen Bereich der Tubuli liegen die Sertoli-Zellen in dichtem Zellver-

band. Sie sind über „tight junctions“ miteinander verbunden. Es besteht

demnach keine direkte Verbindung zwischen den interstitiellen Strukturen

und den haploiden Keimzellen innerhalb der Hodentubuli. Für diese struk-

turelle Besonderheit, wie sie ähnlich auch im zentralen Nervensystem vor-

kommt, wurde der Begriff der „Blut-Hoden-Schranke“ geprägt (vgl. S.3f).

Eine Schädigung der Sertoli-Zellen könnte für einen Teil der beobachteten

Effekte verantwortlich sein. Unterschiedliche Substanzen wurden in den

letzten Jahren auf ihren Einfluß auf die Sertoli-Zell-Funktion hin unter-

sucht. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf sogenannte Umweltgifte

1 Einleitung 3

gelegt, d.h. Stoffe anthropogenen Ursprungs die teils bei industriellen Pro-

zessen freigesetzt, teils als Inhaltsstoffe von Verpackungsmaterialien ver-

wendet werden oder aber als Pestizide bzw. Herbizide in die Umwelt

gelangen und dort aufgrund ihrer oft inerten chemischen Zusammensetzung

in den Nahrungsketten und im menschlichen Organismus kumulieren. Zu

diesen Substanzen gehören beispielsweise Schwermetalle wie Cadmium,

Quecksilber oder Blei, aber auch Phtalatester, chlorierte Kohlenwasserstof-

fe und Nitroaromate (Nolte et al., 1994). Stachel et al. (1989) weisen das

Vorkommen dieser und anderer Umweltschadstoffe in der Samenflüssigkeit

nach und stellen einen Zusammenhang zwischen deren Konzentration und

beruflicher Exposition bzw. außergewöhnlicher Umweltbelastung her.

Zu Beginn der Forschung auf diesem Gebiet wurden vor allem In-vivo-

Testsysteme verwendet. Hierbei wurden Versuchstieren definierte Mengen

einer Noxe oral bzw. parenteral zugeführt und dann die Reproduktionsfä-

higkeit der Tiere überprüft oder aber morphologische Studien an den ent-

sprechenden Organen durchgeführt (Russel, 1993). Diese Studien dienten

vor allem dem Zweck, eine quantitative Beziehung zwischen potentiellem

Schadstoff und dem männlichen Reproduktionssystem herzustellen. Aussa-

gen über den genauen Mechanismus der Schädigung können mit diesen

komplexen Testsystemen nur beschränkt gemacht werden. Wirkmechanis-

men, wie z.B. die spezifische biochemische Leistung der einzelnen Zelle,

die beeinflußt wird, sind dagegen bei In-vitro-Testsystemen weitaus besser

zu untersuchen.

Sertoli-Zellen wurden erstmals in den späten siebziger Jahren in solchen In-

vitro-Systemen verwendet. Dies hatte verschiedene Gründe.

Die Sertoli-Zelle hat als sogenannte Ammenzelle eine zentrale Bedeutung

innerhalb der Spermatogenese. Durch eine epithelartige Auskleidung der

Hodentubuli und die engen Interzellularkontakte – tight junctions – bilden

die Sertoli-Zellen das morphologische Substrat der Blut-Hoden-Schranke

1 Einleitung 4

(Skinner, 1987). Sie schaffen dadurch eine spezifische geschützte Umge-

bung für die Spermatogenese. Die Produktion von Laktat als wichtigstem

Energieträger für die sich entwickelnden Keimzellen stellt eine ihrer we-

sentlichen metabolischen Funktionen dar. Bei der Untersuchung von Mor-

phologie, Sauerstoffverbrauch und Proteinsynthese der Spermatozyten und

Spermatiden zeigt sich eine direkte Abhängigkeit dieser Parameter vom

Laktatangebot in der Umgebung. Abwesenheit von Laktat führt zu frühzei-

tiger Degeneration und irreversiblem Abfall der Proteinsynthese, während

sich unter Laktatzufuhr keine Veränderung dieser Meßgrößen einstellt.

Laktat führt dabei zu einem Anstieg des ATP-Gehaltes der Keimzellen

(Grootegod et al., 1984). Die Keimzellen sind nicht in der Lage, Glukose

als energetisches Substrat zu nutzen (Nicolet et al., 1981).

Eine Vielzahl von Stoffen führt zu einer Stimulation der Laktatproduktion

durch die Sertoli-Zellen. Dazu gehört nicht nur das FSH (Jutte et al., 1983),

sondern auch cAMP und seine Agonisten (Le Gac et al., 1983), Insulin

(Oonk et al., 1989), IGF-I (Oonk et al., 1989), EGF (Mailea et al., 1986)

und TGF-ß (Esposito et al., 1991). Alle diese Stoffe werden schon unter

physiologischen Bedingungen in mehr oder weniger großen Mengen vom

Körper produziert. Sie haben so auch in vivo einen Einfluß auf die Sper-

matogenese.

Die enzymatische Ausstattung der Sertoli-Zellen umfaßt neben den für die

Laktatproduktion entscheidenden Enzymen der Glykolyse (unter anderem

verschiedene LDH-Isoenzyme) noch die Alkalische Phosphatase, die Crea-

tinkinase und die Gamma-Glutamyl Transpeptidase (GGT). Die GGT

scheint dabei in Hinblick auf die im Hoden vorkommenden Zellpopulatio-

nen recht spezifisch für die Sertoli-Zellen zu sein (Carreau, 1996).

Durch die Abgabe verschiedener Proteine, u.a. Transferrin (Skinner and

Griswold, 1980), Plasminogen Aktivator (Lacroix et al., 1977), Androgen-

Binding-Protein (ABP; Fritz et al., 1974) und Inhibin (Moore, 1993), zeigt

sich die sekretorische Leistung dieser Zellen. ABP, das zur Vermittlung der

1 Einleitung 5

Androgenwirkung im Hodengewebe notwendig ist, wurde in zahlreichen

Studien als Sertoli-Zell-Marker beschrieben. Ein Abfall der ABP-

Produktion wurde dabei als Indikator für eine gestörte Sertoli-Zellfunktion

beobachtet (Chapin et al., 1988).

Sertoli-Zellen stehen unter dem Einfluß von FSH, das in der Hypophyse

produziert wird und über das Blut den Hoden erreicht. Sie stellen im Ho-

dengewebe die einzige Zellart, die in nachweisbarer Größenordnung FSH-

Rezeptoren besitzt. FSH steigert die metabolische Aktivität der Sertoli-

Zellen. Die Vermittlung der Wirkung vollzieht sich dabei über die Aktivie-

rung der Adenylatcyclase und die Produktion von cAMP (Fakunding et al.,

1976; Steinberger et al., 1979).

Die Zellen selbst produzieren das Hormon Inhibin, das durch einen negati-

ven Feedback-Mechanismus zu einer Abnahme der Gonadotropin-

Produktion in der Hypophyse führt (Moore, 1993). FSH führt demzufolge

zu einer Steigerung der Inhibinsekretion der Sertoli-Zellen (in vitro um et-

wa 40%; Carreau, 1995). Die chemische Struktur des Inhibins ist seit weni-

ger als zehn Jahren bekannt (Eramaa et al., 1992). Inhibin ist ein 32 kDa

Glykoprotein mit dimerer Struktur. Es besteht aus einer Alpha-Untereinheit

und einer von zwei möglichen Beta-Einheiten (ßA oder ßB).

Es existiert jedoch noch eine weitere Substanz aus diesen Bausteinen, deren

Wirkung der des Inhibins entgegengesetzt ist: das Aktivin. Es entsteht

durch die Kombination zweier Beta-Untereinheiten und existiert daher in

drei möglichen Formen: ßA/ßA, ßA/ßB und ßB/ßB (Moore et al., 1993).

Aktivin führt zur Stimulation der FSH-Produktion von hypophysären Zel-

len, sowohl in vitro (Ling et al., 1986) als auch in vivo (McLachlan et al.,

1989). Inhibin und Aktivin scheinen zudem entscheidende Bedeutung in der

parakrinen Regulation der Spermatogenese zu haben (Mather et al., 1992).

Beide führen zur Modulation der Funktion der interstitiellen Zellen und

zum Anstieg der Spermatogonienproliferation in vitro (Moore et al., 1993).

1 Einleitung 6

Das Wissen um die parakrine Funktion der Sertoli-Zellen, also insbesonde-

re ihre Interaktion mit den Keimzellen oder auch den Leydig-Zellen via

Botenstoffen, ist insgesamt gesehen allerdings noch sehr lückenhaft. Wäh-

rend die einzelnen Sekretionsprodukte und deren Produktionsort bekannt

ist, weiß man doch sehr wenig über die Wirkungsmechanismen. Zur Ver-

deutlichung soll folgendes Schema dienen:

• Abb. 1.1: Schema der „cell-to-cell“ Interaktionen und Sertoli-Zellfunktionen im menschlichen Hoden (modifiziert nach Carreau, 1995).ABP=Androgenbindendes Protein; NGF=Nervaler Wachstumsfaktor; EGF=EpidermalerWachstumsfaktor; IGF=Insulinähnlicher Wachstumsfaktor; LDH=Laktatdehydrogenase;AP=Alkalische Phophatase; CK=Kreatinkinase; GGT=Gammaglutamyltranspeptidase

1 Einleitung 7

Betrachtet man die vielfältigen spezifischen Leistungen der Sertoli-Zellen

so wird deutlich, wie wichtig die Integrität dieser Zellen für den Ablauf der

Spermatogenese ist. Eine Modulation der Zellfunktionen wird sich

zwangsläufig auf die Entwicklung der Keimzellen auswirken.

1.1 Auswahl der Schadstoffe

Schwermetalle sind, wie oben bereits angeführt, in besonderem Maße ge-

eignet, die toxische Potenz von Umweltgiften in Hinblick auf die Sertoli-

Zelle zu überprüfen. Zum einen belegt eine Vielzahl von in vivo Studien

deren Einfluß auf das Reproduktionssystem, zum anderen sind diese Stoffe

in der Umwelt mittlerweile tatsächlich ubiquitär vorhanden, so daß ihre

Untersuchung auch praktische Relevanz besitzt. Ein weiterer Vorteil liegt in

dem einfachen Umgang mit diesen Substanzen, da sie fast ausnahmslos als

wasserlösliche Salze vorhanden sind und somit die Herstellung von Lösun-

gen im Kulturmedium und ihre Verwendung in der Zellkultur problemlos

durchführbar ist. Zur Anwendung kommen in dieser Arbeit die Schwerme-

tallsalze Bleiazetat (Pb(CH3COO)2), Nickelazetat (Ni(CH3COO)2), Kobalt-

chlorid (CoCl2) sowie Hexachloroplatinsäure (H2[PtCl6]).

1.1.1 Bleiazetat

Aus der Gruppe der Schwermetalle ist Blei die wohl am besten untersuchte

Substanz – die Toxizität von Blei ist schon seit Jahrzehnten bekannt. Seine

Eigenschaften machen es jedoch in vielen Bereichen der industriellen Ferti-

gung und des täglichen Lebens zu einem kaum ersetzbaren Werkstoff. Zur

Anwendung kommt es in Akkumulatoren, als Bestandteil von Farben, in

Holzschutzmitteln und als Inhaltsstoff von Benzin. Letzteres ist zwar seit

1 Einleitung 8

einigen Jahren in Europa verboten, findet allerdings in weiten Teilen der

Welt nach wie vor Anwendung. Erste Berichte über die gesundheitlichen

Folgen vor allem beruflicher Bleiexposition datieren aus dem letzten Jahr-

hundert (Scanlon, 1975). Die Giftwirkung des Bleis wurde in Frankreich als

colica pictonum, in England als Devonshire Kolik, in Deutschland als Hüt-

tenkrätze beschrieben (Seidel, 1991). Mehrere Studien belegen die In-vivo-

Toxizität auf das männliche Reproduktionssystem. Blei in hohen Konzent-

rationen führt zur Störung der Spermiogenese (Lancranjan et al., 1975).

Eine Untersuchung an 2469 Arbeitern einer Bleischmelze zeigt eine positi-

ve Korrelation zwischen erhöhten Bleikonzentrationen im Serum und einer

Reduktion der Spermiendichte im Ejakulat. Ein deutlicher Effekt ist dabei

ab einer Serum-Bleikonzentration von 40 µg Blei/dl zu erwarten, was in

etwa 1µM entspricht (Alexander et al., 1996). Azoospermie und Oli-

gospermie zeigten sich bei einer großen Zahl von Arbeitern mit Bleiintoxi-

kationen (Braunstein et al., 1978; Cullen et al., 1983). Der Zusammenhang

von abnormer Spermienmorphologie und Bleiexposition konnte bei Arbei-

tern einer südafrikanischen Batteriefabrik nachgewiesen werden (Robins et

al., 1997).

Der Schädigungsmechanismus, der diesen Veränderungen zu Grunde liegt,

ist zur Zeit noch Gegenstand der Diskussion. Sowohl ein direkter Effekt auf

die testikuläre Funktion (Assennato et al., 1986) als auch eine Beeinflus-

sung der hypothalamisch-hypophysären Achse (Klein et al., 1994; Thoreux-

Manlay et al., 1995) werden diskutiert.

Ein schädigender Einfluß von Blei auf die Spermatogenese gilt demnach als

gesichert. Die Schädigung scheint sowohl auf direkten zytotoxischen Ef-

fekten als auch auf Störungen der endokrinen Funktionen zu beruhen. Die

Rolle der Sertoli-Zellen in diesem Zusammenhang ist unklar. Möglicher-

weise kann diese Arbeit etwas zur Beantwortung dieser Frage beitragen.

1 Einleitung 9

1.1.2 Nickelazetat

Nickel und seine Verbindungen finden Anwendung vor allem bei der Her-

stellung von korrosionsfesten Stahllegierungen, bei chirurgischen Prothe-

sen, der Münzproduktion, in der synthetischen Chemie, bei der Batterie-,

Keramik- und Glasproduktion. Als Spurenelement scheint es außerdem es-

sentiell für einige Spezies zu sein. Während die allergenen und kanzeroge-

nen Eigenschaften des Nickels lange bekannt sind (Seidel, 1991; Clayton

and Kaldor, 1987), ist das hier verwendete Nickelazetat in bezug auf seine

reproduktionstoxikologische Bedeutung nur wenig untersucht. Die verfüg-

baren Studien zeigen bei Ratten die Induktion von Spermiendegeneration

durch Nickelsulfat (Sobti and Gill, 1989). Bei Nickelchlorid kommt es nach

intraperitonealer Injektion zur Abnahme der Fertilität und zur Reduktion

des Hodengewichtes (Xie et al, 1995).

Neueste Untersuchungen machen überdies eine Beeinflussung der männli-

chen Fertilität durch Nickelionen sehr wahrscheinlich (Das and Dasgupta,

1997; Kakela et al. 1999; Pandey et al., 1999). Eine generelle Beurteilung

der Reproduktionseffekte ist jedoch aufgrund der wenigen Daten und der

unterschiedlichen chemischen Eigenschaften der Verbindungen – vor allem

in Hinblick auf ihre Wasserlöslichkeit – nicht möglich.

1.1.3 Kobaltchlorid

Das Metall Kobalt und seine Verbindungen finden breite Anwendung z.B.

bei der Herstellung von Werkzeugen, Autos, elektrischen Geräten, Flug-

zeugtechnik, Farben, Glas oder Zement. Biologische Bedeutung erhält das

für den Menschen essentielle Element als Cofaktor für Vitamine (Vit. B12)

oder Enzyme (Karlson, 1988; Kpt. 5). Bisherige Studien zeigen einen nega-

tiven Einfluß von Kobalt auf das männliche Reproduktionssystem. Es führt

1 Einleitung 10

nach oraler Gabe bei Ratten zu einem Rückgang der Spermatogenese, testi-

kulärer Atrophie und zu Beeinflussung der Testosteronproduktion, wobei

chronische Effekte eine weitaus größere Bedeutung haben als akute (Pedigo

et al., 1988; Corrier et al., 1985). Weiterhin scheinen sowohl direkte zyto-

toxische als auch indirekte Mechanismen an den Schädigungen beteiligt zu

sein (Andersson et al., 1992; Mollenhauer et al, 1985).

1.1.4 Hexachloroplatinsäure

Hexachloroplatinsäure, ein wasserlösliches Platinat, wird vor allem als a-

nalytisches Reagenz und zur Herstellung anderer Platinverbindungen ver-

wendet. Der Kontakt mit dieser Substanz in fester und flüssiger Form oder

als Aerosol kann akut zu Irritationen der Augen, der Haut, der Schleimhaut

und des Respirationstraktes führen. Chronische Exposition führt zu einer

allergischen Typ-III-Reaktion. Dieses als „Platinosis“ bezeichnete Krank-

heitsbild geht einher mit allergischem Asthma und allergischer Kontakt-

dermatitis (ACGIH, 1986). Die intravenöse Gabe von Hexachloro-

platinsäure führt bei Ratten zur Entwicklung einer hämolytischen Anämie

(Kolpakov and Kolpakova, 1974). Über die reproduktionsbiologischen

Auswirkungen der Hexachloroplatinsäureexposition ist nur wenig bekannt.

Platinstaub selbst führt zu einem geringfügigen Rückgang der Spermien-

motilität bei menschlichen Spermien in vitro (Kesseru and Leon, 1974).

Eine In-vitro-Studie mit Hexachloroplatinsäure an humanen Spermatozoen

zeigt eine Induktion der Akrosomenreaktion (Köhn et al., 1995).

Die Bedeutung von Platin in diesem Zusammenhang liegt allerdings in sei-

ner Verwendung als Grundlage für Chemotherapeutika zur Behandlung

testikulärer Tumore. Die älteste und meistverwendete Verbindung darunter

ist das cis-Platin (cis-Diaminodichlor-Platin). Sein Einsatz als Chemothera-

peutikum ist verbunden mit zahlreichen Nebenwirkungen, wobei auch und

vor allem das männliche Reproduktionssystem betroffen ist. Dies konnte

1 Einleitung 11

tierexperimentell bestätigt und die Sertoli-Zelle als ein möglicher Angriffs-

punkt lokalisiert werden (Mizoguchi et al., 1990; Pogach et al., 1989).

1.1.5 Gossypol

Gossypol nimmt eine Sonderstellung bei der Auswahl der untersuchten

Substanzen ein. Zum einen handelt es sich beim Gossypol nicht um einen

Umweltschadstoff im eigentlichen Sinne, zum anderen sind seine Wirkun-

gen auf das männliche Reproduktionssystem recht gut erforscht, sowohl

was seinen Einfluß in vivo als auch in vitro – hier im besonderen die Schä-

digung der Sertoli-Zelle – angeht. Daher erscheint die Analyse der durch

Gossypol hervorgerufenen Effekte besonders geeignet, die Aussagekraft

des Testsystems zu überprüfen.

Die Möglichkeit, durch Verwendung von Gossypol (einem Polyphenol, das

aus dem Öl des Baumwollsamens isoliert wird) Sterilität beim Mann aus-

zulösen, ist schon seit Ende der fünfziger Jahre bekannt (Liu, 1957). Man

geht davon aus, daß sich Naturvölker diese Wirkung schon weitaus früher

zur Geburtenkontrolle zu nutze machten. Im Zuge der sich etablierenden

restriktiven Familienpolitik im kommunistischen China sah man in Gossy-

pol eine praktische und kostengünstige Alternative zur Verwendung der

Antibabypille oder anderer kontrazeptiver Maßnahmen.

Zahlreiche Studien wurden daher zu Beginn der siebziger Jahre in Angriff

genommen, um die Anwendungsmöglichkeiten dieser „Pille für den Mann“

näher zu untersuchen. Der erste klinische Test 1972 zog groß angelegte

Versuche in den folgenden Jahren mit insgesamt annähernd 9000 Testper-

sonen nach sich. Gossypol erwies sich dabei als potentes männliches

Kontrazeptivum mit einer Effizienz von 99%. Im Rahmen dieser Studien

kam es allerdings auch zum Auftreten von wesentlichen Nebenwirkungen.

Bei etwa 10% der Männer persistierte die ausgelöste Azoo- bzw. Oligo-

zoospermie mit der Folge einer Zeugungsunfähigkeit für einen Zeitraum

1 Einleitung 12

zwischen vier Monaten bis zu 3,5 Jahren nach Absetzen des Gossypols. Bei

weiteren 10% kam es zum Auftreten von teilweise lebensbedrohlichen Hy-

pokaliämien (National Coordinating Group on Male Antifertility Agents,

1978; Qiang et al., 1980). Die einzige außerhalb Chinas durchgeführte Un-

tersuchung zeigt eine Effizienz von 83% und eine Irreversibilitätsrate von

33%. Hypokaliämien oder weitere relevante Nebenwirkungen traten dabei

nicht auf (Coutinho, 1984). Möglicherweise sind diese Unterschiede durch

die verwendete geringere Dosis und die kleinere Gruppe von Testpersonen

bedingt (n=12). Weitere chinesische Studien zu Beginn der achtziger Jahre

mit geringerer Dosis bestätigten die zuvor gemachten Erfahrungen, wobei

für die aufgetretenen Hypokaliämien nephrotoxische Wirkungen des Gos-

sypol verantwortlich gemacht werden (Liu, 1987; Liu et al., 1987). Gossy-

pol scheint also nach wie vor nicht geeignet, in der klinischen Anwendung

andere kontrazeptive Maßnahmen zu ersetzen (Matlin, 1994).

Aufgrund seiner Eigenschaften ist Gossypol jedoch in besonderem Maße

geeignet, eine Referenzsubstanz für das hier verwendete Testsystem darzu-

stellen. Gossypol ist ein Racemat, wobei nur die (L-) Form reproduktions-

toxische Potenz besitzt (Wang and Lei, 1979).

• Abb. 1.2: Chemische Struktur von Gossypol

1 Einleitung 13

1.2 Auswahl der untersuchten Zellparameter

Die Auswahl der untersuchten Zellparameter sollte der komplexen Funktion

und Aufgabe der Sertoli-Zelle gerecht werden, ohne dabei praktische Ge-

sichtspunkte wie Reproduzierbarkeit, Möglichkeit der Standardisierung,

Untersuchung einer großen Anzahl von Proben und Wirtschaftlichkeit au-

ßer acht zu lassen.

1.2.1 Laktatproduktion der Sertoli-Zellen

Als metabolischer Parameter wurde die Laktatproduktion der Zellen be-

stimmt. Wie oben bereits angeführt, dient Laktat als energiereiches Substrat

für die sich entwickelnden Spermatozyten. Der Nachweis von Laktat mit

Hilfe eines gekoppelten Enzym-Assays ist ein in der klinischen Chemie seit

langem verwendetes und standardisiertes Verfahren (Noll, 1984). Die Ver-

änderung der Laktatproduktion ist ein sensitiver Marker für die Störung der

Sertoli-Zellfunktion in vitro (Williams and Foster, 1988). Zahlreiche Unter-

suchungen über den Einfluß verschiedener Phtalatester und ihrer Metaboli-

ten auf die Sertoli-Zellen konnten das zeigen (z.B. Chapin et al., 1988;

Allenby et al., 1989; Stuart et al., 1990). Die Studien belegen außerdem,

daß es eine Korrelation zwischen der bei diesen Substanzen bekannten In-

vivo-Toxizität (morphologische Alterationen an den Sertoli-Zellen, Rück-

gang der Spermiogenese) und der Laktatproduktion gibt. Die potentesten

Noxen in bezug auf die Schädigung des Reproduktionssystems führen zu

den größten Veränderungen des Zellmetabolismus. Interessanterweise

kommt es dabei ausschließlich zu einer Steigerung der Laktatproduktion

(Moss et al., 1988) – ein Phänomen, das auch bei Gossypol (s.o.), DBCP

(Miller et al., 1985) und weiteren Substanzen zu beobachten ist und das

später zu diskutieren sein wird.

1 Einleitung 14

1.2.2 Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen

Inhibin als Referenz für die endokrine Funktion der Zellen kann erst seit

einigen Jahren nachgewiesen werden (Moore et al., 1993). Die Detektion

dieses nur in minimalen Konzentrationen produzierten, aber für die Sertoli-

Zelle hochspezifischen Hormons erfordert die Verwendung eines Radi-

oimmuno-Assays. Nach Beendigung der Versuchsreihe kam ein Testkit auf

den Markt, das in der Lage ist, in einem ELISA die ß-Kette des Inhibin se-

lektiv und äußerst sensitiv nachzuweisen (Inhibin-B Dimer Assay Kit, Fa.

Serotec Oxford, England). Neueste Untersuchungen zeigen, daß nur Inhi-

bin-B beim Mann biologisch aktiv ist (De Kretser et al., 1996; Illingworth

et al., 1996). Der hier verwendete RIA weist dagegen die Alpha-Kette nach,

die in allen Inhibin-Formen auftritt.

In Hinblick auf die Beeinflussung der Inhibinproduktion durch unter-

schiedliche Schadstoffe gibt es zur Zeit nur wenig Daten. Cadmium führt in

hoher Dosierung zur Abnahme der Inhibinproduktion in vitro, wahrschein-

lich bedingt durch direkte zytotoxische Wirkung (Janecki et al., 1992).

1.2.3 MTT-Assay

Die beiden relativ speziellen Parameter dieser Testreihe Laktat und Inhibin,

werden ergänzt durch die Anwendung des MTT-Assays. MTT, ein gelber

Farbstoff, wird von den Zellen aufgenommen und zu einem blauen Forma-

zanprodukt umgewandelt. Dieser Prozeß benötigt die Aktivität von mito-

chondrialen Dehydrogenasen und findet ausschließlich in lebenden Zellen

statt. Die Ausbeute an blauem Farbstoff, die auf photometrischem Wege

bestimmt wird, ist ein direktes Maß für die Vitalität der untersuchten Zell-

population. Sie ist direkt proportional zur Zellzahl und zur Zahl der Mito-

chondrien und nimmt in nonvitalen Zellen/Zellverbänden rapide ab. Da die

1 Einleitung 15

Zahl der Mitochondrien in der Sertoli-Zellkultur relativ stabil bleibt (Kelly

et al., 1991), reflektiert eine Veränderung der Farbstoffmenge eine Verän-

derung der Zellzahl, der Zellvitalität oder beider Parameter (s. Kpt. 3.4.3).

Der MTT-Assay wurde außerdem gewählt, da er eine relativ sensitive Me-

thode ist, um einen Vitalitätsabfall zu detektieren. Bei der Untersuchung

zeigen sich morphologische Veränderungen an Sertoli-Zellen erst, wenn es

im MTT-Assay zu einem Abfall der Werte auf etwa 50% der Ursprungsak-

tivität gekommen ist. Auch beim DNA-Gehalt der Zellen kommt es später

als beim MTT-Assay zu statistisch signifikanten Veränderungen (Janecki,

1992).

2 Aufgabenstellung 16

2 Aufgabenstellung

1. Ziel dieser Arbeit ist es nun, ein Testsystem zu entwickeln und zu eva-

luieren, das den Einfluß von Noxen auf biochemische Parameter von

Sertoli-Zellen überprüft.

2. Für die untersuchten Stoffe sollte dabei eine In-vivo-Wirksamkeit auf

das Reproduktionssystem bereits nachgewiesen, zumindest jedoch als

sehr wahrscheinlich gelten.

3 . Die untersuchten Parameter sollten möglichst umfassend die Zell-

funktionen repräsentieren und deren Modulation darstellen können.

4. Anhand der gewonnenen Ergebnisse sollte es möglich sein, eine Aussa-

ge darüber zu machen, ob die Sertoli-Zelle eine potentielle Zielzelle für

die jeweils untersuchte Substanz darstellt.

5. Bei der Entwicklung des Testsystems sollten die Aspekte der Praktikabi-

lität und der Wirtschaftlichkeit besondere Berücksichtigung finden. Das

Fernziel stellt dabei die Etablierung einer effizienten reproduktions- to-

xikologischen Screeningmethode dar.

3 Material und Methoden 17

3 Material und Methoden

Für die Zellkultur wurden Sertoli-Zellen von 18 Tage alten Spraque-

Dawley Ratten (Fa. Harlan Winkelmann, Borchen) verwendet. Die Ratten

wurden jeweils unmittelbar vor der Präparation geliefert. Die Versuche

wurden beim Regierungspräsidium Gießen unter dem Geschäftszeichen

17a-19c 20/15(c) gemäß § 8 Abs. 1 Tierschutzgesetz angezeigt. Alle Che-

mikalien wurden, soweit nicht explizit erwähnt, in der höchsten erhältlichen

Qualität eingesetzt (pro analysi oder biochemisch rein). Für die Primärkul-

tur der Sertoli-Zellen wurden speziell für die Zellkultur getestete Medien

und Zusätze benutzt.

3.1 Verwendete Noxen

Gossypol (Racemform, Sigma, Nr. G4382) wurde in 95% Reinheit (laut

HPLC) als äquimolarer Komplex mit Essigsäure eingesetzt. Nach Einstellen

der jeweiligen Endkonzentration an Gossypol zeigte sich keine Verände-

rung des pH-Wertes der gepufferten Zellkultur-Medien. Ein Einfluß dieser

geringen Menge freigesetzter Essigsäure auf die untersuchten Parameter

kann daher ausgeschlossen werden.

Die verwendeten Metallsalze wurden von Merck, Darmstadt bezogen:

Blei(II)-acetat-Trihydrat (Nr. 107372, krist. reinst, BPC)

Kobalt(II)-chlorid-Hexahydrat (Nr. 102539, z. Analyse, ACS)

Nickel(II)-azetat-Tetrahydrat (Nr. 12278, z. Analyse)

Hexachloroplatin(IV)-säure-Hexahydrat (Nr. 807340, 40% Pt, z. Synthese)


3.2 Verwendete Medien

1. Basismedium (Medium zum Herstellen der Kulturmedien unter Verwen-

dung entsprechender Zusätze, Waschmedium)

Dullbecco’s Modified Eagle’s Medium:Ham’s F-12 Medium

(DMEM:Ham’s F-12; 1:1; Gibco, 31330-038)

2. Kulturmedium A

500 ml Basismedium mit folgenden Zusätzen (angegeben ist die je-

weilige Endkonzentration im Basismedium):

• Cytosin Arabinosid (2 µg/ml; Sigma, Deisenhofen, C-1768)

• L-Glutamin (2 mM; Gibco, USA, 04305030-H)

• Penicillin-Streptomycin Lsg. (100 µg/ml; Sigma, P-3539)

• Epidermal Growth Factor (EGF; 10 ng/ml; Sigma, E-1257)

• Apo-Transferrin (5 µg/ml; Sigma, T-1147)

• Humaninsulin (2 µg/ml; Sigma, I-1882)

• Hydrocortison (10-8 M; Sigma, H-0135)

• D-alpha-Tocopherol (Vitamin E; 200 ng/ml; Serva, Heidelberg, 3656)

• All-trans-Retinol (Vitamin A; 200 ng/ml; Serva, 38280)

• Testosteron (10-7 M; Sigma, T-5641)

• FSH (100 ng/ml; Sigma, F-4520)

3. Kulturmedium B

Entspricht Medium A ohne Zusatz von Cytosin-Arabinosid

4. Kulturmedium C

Entspricht Medium A ohne Cytosin-Arabinosid und ohne FSH


Bei der enzymatischen Isolation der Sertoli-Zellen wurden die nachfolgen-

den Medien verwendet:

1. Isolationsmedium A

20 ml Basismedium unter Zusatz von

• 20 mg Kollagenase (Sigma, C-0130) und

• 0,4 mg DNAse (Sigma, DN-25)

2. Isolationsmedium B

20 ml Basismedium mit

• 40 mg Kollagenase,

• 40 mg Hyaluronidase (Sigma, H-3506) und

• 0,4 mg DNAse

3. Stopmedium

50 ml Medium A mit

• 20 mg Trypsininhibitor aus Sojabohnen (Sigma, T-9003)

• 100 mg Rinderserumalbumin (Sigma, H-7825)


3.3 Präparation primärer Sertoli-Zellen

Bei der Präparation und im Umgang mit der Zellkultur wurde besonders auf

die Verhinderung möglicher mikrobieller Kontamination geachtet. Dies

bedeutet keimarmes Arbeiten unter der Sicherheitswerkbank (Klasse 2),

Verwendung von sterilen Einmalartikeln bei Kunststoffröhrchen, Petri-

schalen, Pipettenspitzen, Pinzetten, Skalpellen, Handschuhen und Zellkul-

turschalen. Alle Kulturmedien und sonstige verwendete Lösungen wurden

durch Ultrafiltration (0,2 µm, Sigma) sterilisiert. Zum Anlegen der primä-

ren Sertoli-Zellkultur wurden im wesentlichen die Methoden von Hadley et

al. (1985) und Onoda et al. (1990) angewendet. Dabei wurde in folgenden

Schritten vorgegangen:

3.3.1 Rattenhodenpräparation

3.3.2 Enzymatische Isolation der Sertoli-Zellen

3.3.3 Anlegen der Zellkultur

3.3.4 Behandlung der Zellen mit hypotoner Lösung

3.3.5 Überprüfung der Reinheit der Zellkultur

3.3.1 Rattenhodenpräparation

Die Tiere wurden in einen geschlossenen Kunststoffbehälter gesetzt und für

ca. 10 min mit CO2 begast. Anschließend wurden die getöteten Ratten

durch Eintauchen in 70% Ethanol äußerlich desinfiziert, um bei der Präpa-

ration mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Es wurde nun die Bauch-

höhle eröffnet, die noch nicht deszendierten Hoden wurden entnommen und

in mit Gentamycin versetztem Basismedium (2 ml Medium + 1 ml Genta-

mycin; Sigma, G-3527) gewaschen. Anschließend wurde die Tunica Albu-


ginea der Hoden entfernt und der herausgeschabte Inhalt mit dem Skalpell

zu einem feinen Brei zerkleinert.

3.3.2 Enzymatische Zellisolation

Kollagenase spaltet das Kollagen der Interzellularverbindungen, ohne die

einzelnen Zellen allzu stark zu schädigen, während Hyaluronidase beson-

ders kollagenreiche Zellverbände der Bindegewebszellen auftrennt. Die

DNAse hydrolysiert freigesetzte DNA, die sonst die Aggregation von Ein-

zelzellen fördern würde. Der im Stopmedium enthaltene Trypsin-Inhibitor

und das Rinderserumalbumin inaktivieren das Enzym Kollagenase.

1. Schritt

• Gabe des zerkleinerten Hodengewebes in ein 50 ml Zentrifugationsröhr-

chen (Falcon, New Jersey, USA) mit 20 ml Isolationsmedium A

• 15 min Schüttelwasserbad (37°C)

• Herausnehmen, 7 min bei Raumtemperatur stehen lassen, Absaugen des

Überstandes

2. Schritt

• Zugabe von 25 ml Stopmedium auf das Pellet

• Schütteln und 7 min stehen lassen

• Absaugen des Überstandes

3. Schritt

• Zugabe von 20 ml Isolationsmedium B zum Pellet

• Mischen und für 30 min ins Schüttelwasserbad stellen

• Zentrifugieren für 30 s bei 500 U/min (35xg)



4. Schritt

• Zugabe von 25 ml Stoplösung zum Pellet

• Mischen und bei 500 U/min (35xg) 1 min zentrifugieren


5. Schritt

• Zugabe von 20 ml Isolationsmedium B zum Pellet

• Mischen und für 15 min ins Schüttelwasserbad stellen

• 45 s bei 1000 U/min (130xg) zentrifugieren


6. Schritt

• Zugabe von 30 ml Kulturmedium A

• Mischen

• Gabe der gesamten Menge in einen Homogenisator (sog. „Potter“, ein

Glasgehäuse mit einem teflonüberzogenen Edelstahlstab)

• Homogenisieren durch 10maliges Auf- und Abbewegen des „Potters“

7. Schritt

• Filtern der Zellsuspension durch ein 70 µm Nylonsieb (Falcon)

Die letzten beiden Schritte dienen dabei der nochmaligen mechanischen

Trennung der Zellen und der Gewinnung möglichst vieler Einzelzellen.


3.3.3 Anlegen der Zellkultur

Die Zellzahl wurde in einer handelsüblichen Zählkammer bestimmt und

durch Zugabe einer entsprechenden Menge Kulturmedium A auf eine

Dichte von 106 Zellen pro ml Suspension eingestellt. Die Zellen wurden

anschließend auf 24er Kulturplatten (Falcon) mit je 1 ml Suspension pro

Vertiefung (Well) ausplattiert (entsprechend 106 Zellen/Well bzw. 0.5x106

Zellen/cm2). Das in Kulturmedium A enthaltene Mitosezellgift Cytosin-

Arabinosid hemmt die Proliferation und unterdrückt damit das Wachstum

von kontaminierenden Zellpopulationen (hauptsächlich Peritubular-Zellen).

Die Sertoli-Zellen werden dabei nur wenig beeinflußt, da sie bei 18 Tage

alten Ratten praktisch keine Mitosen mehr durchlaufen (Russel et al., 1993).

Vor Anlegen der Kultur wurden die Zellkulturplatten mit Matrigel (Colla-

borative Research Inc., Bedford, USA) sehr dünn beschichtet. Als extra-

zelluläre Matrix verbessert Matrigel die Anhaftung der Sertoli-Zellen an

den Kulturplatten und beeinflußt auch das Zellwachstum positiv. Es er-

möglicht so die Ausbildung eines gleichmäßigen einschichtigen Zellrasens.

Das Gel wurde bei -18°C im Eisschrank aufbewahrt und vor Verwendung

langsam (über Nacht) im Kühlschrank aufgetaut. Die benutzten Materialien

(Schalen, Pipetten, Medium) mußten auf etwa 4°C abgekühlt werden, weil

sich Matrigel bei höheren Temperaturen sehr schnell verfestigt. Das Vorge-

hen bei der Beschichtung sah folgendermaßen aus:

• Ansetzen der benötigten Menge Matrigel im Verhältnis 1:4

(Matrigel:Gebrauchsmedium)

• Verteilen des Matrigels auf den Kuturplatten (je 500 µl pro Well)

• Sofortiges Absaugen (Durch das sofortige Absaugen gelingt es, eine sehr

dünne Matrigelschicht auf den Kulturplatten zu erzeugen)


Die Reinheit der Zellkultur wurde regelmäßig morphologisch und histo-

chemisch überprüft (s. Kpt. 3.3.5). Dazu wurden jeweils 100 µl Sertoli-

Zellsuspension (400.000 Zellen/ml) auf jede Vertiefung der teflonbe-

schichteten Objektträger gegeben. Diese wurden vor Gebrauch wie oben

beschrieben mit Matrigel beschichtet. Die Objektträger wurden anschlie-

ßend in einem Brutschrank in angefeuchteter 5%iger CO2-Atmosphäre bei

34°C aufbewahrt. Nach 24 Std. wurde das Medium erstmals gewechselt.

3.3.4 Behandlung der Zellen mit hypotoner Lösung

Nach 48 Std. wurden die Zellen mit einer hypotonen Lösung (20 mM Tris-

HCl, pH 7,5) behandelt. Die Osmolarität dieses Tris-Puffers beträgt nur 90

mOsmol/kg gegenüber 300 mOsmol/kg des normalen Zellkulturmediums.

Dieser sogenannte „hypotone Schock“ läßt die Sertoli-Zellen relativ un-

beeinflußt, führt jedoch zum Absterben der in der Kultur vorhandenen

Keimzellen (Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatiden; Galdieri et

al., 1981). Die Behandlung der Zellen wurde folgendermaßen durchgeführt:

• Auflösen von 240 mg Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan; Sigma

6791) in 100 ml Aq. dest.

• Titrieren der 20 mM Tris-Lösung auf den pH Wert von 7,5 mit HCl

• Steril-Filtration

• Erwärmen auf 34°C im Schüttelwasserbad

• Absaugen des Mediums von den Zellkulturschalen und Zugabe von

1 ml Tris-HCl pro Well

• Inkubation für 5 min

• Absaugen der Lösung

• Waschen der Zellen mit 1 ml Gebrauchsmedium pro Well


• Zufügen von je 1 ml Kulturmedium B (ohne Cytosin Arabinosid)

Die Zellen wurden anschließend wieder in den Brutschrank gegeben.

• Abb. 3.1: Zellkultur am zweiten Tag nach Präparation vor Behandlungmit hypotoner Lösung (Vergrößerung 310fach). Die Keimzellkontaminati-on ist deutlich zu erkennen.

• Abb. 3.2: Zellkultur am sechsten Tag nach Präparation nach Behandlungmit hypotoner Lösung (Vergrößerung 310fach)


3.3.5 Überprüfung der Reinheit der Zellkultur

Zur Überprüfung der Reinheit der Zellkultur wurden die mit Matrigel und

Zellsuspension präparierten Objektträger verwendet, die zeitgleich mit den

Kulturplatten angelegt worden waren. An Tag 1-6 der Kultur wurden diese

Objektträger in Petrischalen mit Medium gelagert und entsprechend den

Kulturplatten behandelt (Mediumwechsel, Aufbewahrung im Brutschrank,

hypotoner Schock nach 48 Std.). Am sechsten Tag wurde die Kultur dann

durch spezifische Färbung und Mikroskopie auf das Vorhandensein von

fremden Zellpopulationen untersucht.

Leydig-Zellen wurden durch Färbung auf 3ß-Hydroxysteroid Dehydrogena-

se (nach Welsh et al., 1975) nachgewiesen. Das Färbemedium setzt sich

folgendermaßen zusammen:

• 2 ml PBS (Phosphate Buffered Saline, 10 mM Na2HPO4/KH2PO4,

136 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,42 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,3;

Oxoid, Unipath Ltd., England)

• 0,25 ml Nitro-Blue Tetrazolium (NBT; 0,25 mg/0,25 ml Aq. dest; Sigma,

N-6876)

• 0,5 ml NAD (2,5 mg/0,5 ml Aq. dest.; Sigma, H-7825)

• 0,25 ml Etiocholan-3ß-ol-17-one (0,4 mg/ml propyleneglycol-ethanol,

1:1; Sigma, E-5251)

• Einstellen des pH Wertes auf 7,7 mit ca. 200 µl 0,1 M Na2HPO4

Das Kontrollfärbemedium enthielt Aq. dest. anstelle von NBT. Die mit

Zellsuspension versehenen Objektträger wurden bei Raumtemperatur für

40 min in der Feuchtkammer angefärbt und anschließend mit PBS gewa-

schen. Mit der hier beschriebenen Methode konnten keine Leydig-Zellen in

der Zellkultur nachgewiesen werden, so daß eine Kontamination mit dieser

Zellart auszuschließen ist.


Peritubuläre Myoidzellen wurden durch Färbung auf alkalische Phosphatase

(Anthony et al., 1987), die im wesentlichen in diesen Zellen lokalisiert ist,

dargestellt. Das Färbemedium wurde folgendermaßen angesetzt:

• 10 mg Naphtol AS-biphosphoric acid (Sigma, N-2250) werden in

40 µl DMSO (Serva) gelöst und mit 5 ml Aq. dest. verdünnt

• Zugeben von 5 ml 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP)-Puffer: 25 mM

AMP (1,11 g/500 ml Aq. dest.; Sigma) mit 1,25 mM MgCl2

(0,127 g/500 ml), pH 8,9 (mit 37 % HCl einstellen)

• Kurz vor der Inkubation werden 10 mg Fast Red Violet LB (Sigma, F-

3381) hinzugefügt und das gesamte Medium durch einen 0,2 µm Spritz-

filter (Sigma) gegeben

Vor der Färbung wurden die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min mit

einer Lösung aus 4% (V/V) Formaldehyd in 100 mM Phosphatpuffer fi-

xiert. Zur Färbung wurden 600 µl Reagenzlösung pro Objektträger appli-

ziert und dann für 30 min in die Feuchtkammer gegeben. Danach wurden

die Zellen mit PBS gewaschen. Bei der Mehrzahl der Präparationen war der

Anteil AP-positiver Zellen <5%.

• Abb 3.3: AP-Färbung mit Darstellung von peritubulären Myoidzellen. Inder Umgebung niedrige Zelldichte (Vergrößerung 190fach)


Sertoli-Zellen wurden durch Anfärben des intermediären Filamentproteins

Vimentin nachgewiesen (Wrobel et al., 1995). Vimentin kommt in allen

somatischen Zellen vor, d.h. im Testis werden neben Sertoli-Zellen auch

Peritubular- und Leydig-Zellen angefärbt. In isoliertem Keimepithel aller-

dings wird Vimentin nur von Sertoli-Zellen exprimiert. Keimzellen zeigen

dagegen keine immunhistochemische Anfärbung. Dazu waren folgende

Schritte notwendig:

1. Tag:

• Nach Absaugen des Mediums Spülen mit PBS (pH 7,5)

• Inkubation in 3%igem H2O2 für 5 min bei Raumtemperatur

• 3maliges Waschen mit PBS für 5 min

• Präinkubation der Objektträger für 60 min bei Raumtemperatur in nor-

malem Kaninchenserum (Dako, USA, X-902) 1:5 in PBS verdünnt plus

5% BSA

• Inkubation der Zellen über Nacht mit dem 1. Antikörper: 1:1000 Mo-

noklonaler Anti-Vimentin Antikörper von Mäusen (Sigma, V-6630) in

PBS plus 1% BSA bei 4°C

2. Tag

• 3maliges Waschen in PBS für 5 min

• Inkubation der Zellen für 60 min bei Raumtemperatur mit dem 2. Anti-

körper: Peroxidase-konjugierter Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Dako, P-

260), 1:100 mit PBS plus 1% BSA

• 3maliges Waschen in PBS, 5 min

• Einmaliges Waschen in Tris-HCl (pH 7,3) für 5 min

• Inkubation in DAB (Sigma, D-5905), 1 Tbl. in 15ml Tris-HCl plus

1% NiCl2


• Abb. 3.4: Anfärbung der Zellkultur auf Vimentin sieben Tage nach Prä-paration (Vergrößerung 310fach). Die Sertoli-Zellen färben sich deutlichan.

• Abb. 3.5: Gleiches Präparat wie Abb. 3.4. Darstellung des Randbereichsder Kultur.

Die hier beschriebenen biochemischen und histochemischen Methoden und

die mikroskopische Kontrolle der Morphologie zeigten eine Reinheit der

Zellkultur von 90-95%.


3.4 Toxikologische Untersuchung der zu testenden Substanzen

Am 6. Tag wurde das Medium abgesaugt und durch je 500 µl Kulturmedi-

um C pro Well, in dem verschiedene Konzentrationen des jeweiligen Agens

enthalten waren, ersetzt. Die Schwermetallsalze Bleiazetat (Pb

(CH3COO)2), Nickelazetat (Ni(CH3COO)2), Kobaltchlorid (CoCl2) sowie

Hexachloroplatinsäure (H2[PtCl6]) wurden für jede Versuchsreihe frisch in

Kulturmedium C gelöst und fünf Lösungen zu je 5/10/25/50 und 100 µM

hergestellt (zur Spezifizierung der Metallsalze s. Kpt. 3.1). Gossypol wurde

in 100% Ethanol gelöst und fünf Stammlösungen in Ethanol zu

0,6/1,2/1,8/2,4 und 3 mM angesetzt. Die Kulturplatten mit 24 Wells wurden

folgendermaßen behandelt:

• Absaugen des Mediums

• Well 1-4 (Kontrolle): 1. Metalle – 500 µl Kulturmedium C

2. Gossypol – 500 µl Kulturmedium C

(bei Kontrolle + 2,5 µl EtOH 100%)

• Well 5-24: 1. Metalle – 500 µl Metallsalzlösung (s.o.) zu

5/10/25/50/100 µM (4 Wells/Konzentration)

2. Gossypol – 500 µl Kulturmedium C + 2,5 µl

Gossypol Stammlösung zu 0,6/1,2/1,8/2,4/3 mM

(Endkonzentration: 3/6/9/12/15 µM Gossypol;

4 Wells/Konzentration)

Die Zellen wurden nun im Brutschrank inkubiert. Nach 24 Std. wurden

Proben des Mediums (250 µl/Well) für die Laktat- und Inhibinbestimmung

entnommen (weiteres Vorgehen s. Laktat- und Inhibinbestimmung). Das

restliche Medium wurde vorsichtig abgesaugt und der Proteingehalt der

Zellen bestimmt (s. Kpt. 3.4.3). Bei der MTT-Messung wurde ohne vorhe-


rige Probenentnahme das gesamte Medium abgesaugt und die Zellen ent-

sprechend weiterbehandelt (s. Kpt. 3.4.3).

3.4.1 Laktatbestimmung

Die Messung der Laktatkonzentration im Medium erfolgte basierend auf

der Methode nach Noll (1974) unter Verwendung eines gekoppelten En-

zym-Assays. Bei diesem Assay wird im ersten Schritt L-Laktat durch Ni-

kotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) in Gegenwart von L-Laktatdehydro-

genase (LDH) zu Pyruvat oxidiert.

(1) Laktat NAD Pyruvat NADH HL LDH+ ⊕ ← → + + ⊕−

Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt weitgehend auf der Seite des Lak-

tat. Es kann jedoch durch Abfangen des Pyruvats mit Hilfe der nachge-

schalteten Reaktion mit dem Enzym Glutamat-Pyruvat-Transaminase

(GPT) in Gegenwart von L-Glutamat auf die Seite von Pyruvat verschoben

werden:

(2) Pyruvat L Glutamat L Alanin OxoglutaratGPT+ − ← → − + −2

Die in der ersten Reaktion gebildete NADH-Menge ist äquimolar zu dem in

der Lösung enthaltenen Laktat. NADH ist Meßgröße und wird aufgrund

seiner Absorption bei 339 nm photometrisch bestimmt. Die große Anzahl

von Proben bei dieser Arbeit machte es notwendig, die in der Literatur be-

schriebene Methode wie folgt zu modifizieren.

Nach 24-stündiger Inkubation mit frischem bzw. schadstoffhaltigem Medi-

um wurden je 250 µl des Zellüberstandes entnommen, für 5 min auf 95°C

erhitzt, zentrifugiert und bei -18°C tiefgefroren. Die Proben wurden dann

innerhalb einer Woche weiterverarbeitet. Für die Laktatbestimmung wurden

folgende Lösungen benötigt:


1. Glutamat-Puffer (0,52 M, pH 8,9)

• Auflösen von 55,75 g L-(+)-Glutamat (Merck, Darmstadt) in 380 ml

1 M NaOH (Merck) und Auffüllen zu

500 ml mit Aq. dest.

• Einfrieren bei -18°C

• Vor Durchführung des Assays Zugabe von 470 µl 1 M NaOH pro ml

Lösung

2. ß-NAD-Lösung

• Auflösen von 50 mg ß-NAD (Sigma, H-7825) in 2 ml Aq. dest.

3. GPT-Lösung (833 U/ml; Sigma, H-9530)

4. LDH-Lösung (4166 U/ml; Sigma, H-9568)

5. Laktatstandardlösung

• Auflösen von 8 bzw. 16 mg L(+)Laktat (Sigma, H-5706) in 100 ml Kul-

turmedium B (s. Kpt. 3.2)

Zur Durchführung des Assays wurden in eine 1-ml-Kunststoffküvette bei

Raumtemperatur folgende Lösungen pipettiert:

• 80 µl Probe (bzw. Standardlaktatlösung)

• 30 µl ß-NAD-Lösung

• 250 µl Glutamat-Puffer

• 18 µl Glutamat-Pyruvat-Transaminase (15 U)

• 700 µl Aq. dest.

Der Ansatz wurde vermischt und nach 10 Minuten die Extinktion (E1) bei

340 nm am Spektralphotometer DU 68 (Beckmann, München) bestimmt.

Um die Reaktion zu starten, wurden anschließend jeweils 11 µl Laktatde-

hydrogenase (21 U) hinzugegeben, wiederum gemischt und bei Raumtem-

peratur 2 Stunden inkubiert. Nach dieser Zeit wurde abermals die

Extinktion (E2) bestimmt und aus der Extinktionsdifferenz (∆E=E2-E1) die

Laktatkonzentration mittels folgender Formel berechnet:


CE MG V

d Vg / l]= × ×

× ××∆ 1

21000

ε[

Hierbei gilt:

C=Laktatkonzentration=gesuchte Größe

MG=Molekulargewicht von Laktat=90,1 g/mol

V1=Testvolumen=1,089 ml

ε=Extinktionskoeffizient von NADH bei 340 nm=6,3 [l x mmol-1 x cm-1]

d=Schichtdicke=1 cm

V2=Probenvolumen=0,08 ml

Bei jeder Bestimmung wurde der Laktatgehalt zweier Lösungen mit stan-

dardisierter Konzentration (s.o.) mitbestimmt. Die Messung verlief linear

im Konzentrationsbereich von 2 bis 20 mg Laktat/100ml (=20-200 µg/ml).

3.4.2 Inhibinbestimmung

Die Bestimmung der Inhibinkonzentration im Medium erfolgte mit dem

Inhibin Radioimmuno-Assay Kit (Peninsula Laboratories Inc., Belmont,

USA) und wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Dieser

kompetitive Radioimmuno-Assay (RIA) beruht auf der Bindung eines vom

Kaninchen produzierten Antikörpers an die 1-32 Aminosäuresequenz des

N-terminalen Endes der α−Untereinheit des Inhibins. Die Probenentnahme

aus der Zellkultur erfolgte 24 Std. nach Zugabe frischen Mediums, in dem

verschiedene Konzentrationen des zu untersuchenden Agens gelöst waren.

Die Proben (je 250 µl) wurden bei -80°C tiefgefroren und innerhalb einer

Woche auf folgende Weise weiterverarbeitet:


1. Tag

• Vorbereiten der Proben (je 100 µl Probe pro Messröhrchen in Doppelbe-

stimmung)

• Ansetzen der Standards in Konzentrationen von 1-128 pg Inhibin pro

Röhrchen

• Zugabe einer definierten Menge des Antikörpers (1. Ak) gegen die Alpha

Untereinheit des Inhibins

• Inkubation für 24 Std. bei 4°C

2. Tag

• Zugabe von radioaktiv markiertem Inhibin (125J-Inhibin). Das markierte

und das in den Proben und Standards enthaltene nicht markierte Inhibin

konkurrieren um die limitierten Bindungsstellen des spezifischen Anti-

körpers; je mehr Inhibin in der Probe enthalten ist, desto weniger125J-Inhibin kann an den Antikörper binden (Prinzip des kompetitiven

Radioimmuno-Assays)

• Inkubation für 24 Std. bei 4°C

3. Tag

• Zugabe eines Antikörpers (2. Ak) gegen den inhibinspezifischen Anti-

körper (1. Ak). Daraufhin fällt ein Komplex aus, der aus erstem Antikör-

per, zweitem Antikörper und Inhibin besteht

• Zentrifugieren bei 4°C und 3000 Upm (75xg)


• Messung der verbleibenden Radioaktivität im Multi Crystal Counter LB

2104 der Fa. Berthold, Wildbad. Die gemessene Radioaktivität ist umso

geringer, je mehr nicht markiertes Inhibin in der Probe enthalten ist


Aus den Werten der Standards wurde nun eine Eichkurve bestimmt, aus der

die Inhibinkonzentration der einzelnen Proben ermittelt werden konnte.

Die Sensitivität dieses Assays betrug 1 pg Inhibin/Probe bzw. 0,2 pg Inhi-

bin/100 µg Protein/24 Std.

3.4.3 MTT-Messung

Die Vitalität der Zellen wurde mit dem MTT-Assay bestimmt. MTT (3-

[4,5-Dimethyl-2]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromid), ein gelber was-

serlöslicher Farbstoff, wird durch mitochondriale Dehydrogenasen zu ei-

nem blauen, wasserunlöslichen Formazan-Produkt reduziert. Diese

Umwandlung vollzieht sich ausschließlich in lebenden Zellen. Die Kon-

zentration des reduzierten blauen Farbstoffes wird photometrisch gemessen.

Für diese Bestimmung wurden die Zellen für 24 Std. bei 34°C mit verschie-

denen Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen inkubiert und

folgendermaßen weiterbehandelt.

1. Absaugen des Mediums und Zugabe von je 1 ml PBS (pH 7,3) und

100 µl MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS gelöst; Serva, Heidelberg)

2. Inkubation für 1 Std. bei 34°C

3. Absaugen des Überstandes und Auflösen des reduzierten MTT in je

500 µl Dimethylsulfoxid (DMSO; Serva)

4. Entnahme von je 200 µl Probe und Messung der Absorption in Doppel-

bestimmung bei 550 nm unter Subtraktion der Hintergrundabsorption bei

620 nm in Mikrotiterplatten im MTP Reader EAR 400 ATC (SLT Labin-

struments, Österreich)


Je höher der gemessene Extinktionswert, desto größer die Konzentration

des Farbstoffes und damit der Anteil an vitalen Zellen in der untersuchten

Probe. Die Ergebnisse wurden als prozentualer Anteil vitaler Zellen im

Vergleich zur Kontrollgruppe unbehandelter Zellen dargestellt:

% Vitalität Extinktion (Test)

Extinktion (Kontrolle)= x 100

3.4.3 Proteinbestimmung

Der Proteingehalt der Zellen wurde als Bezugswert für die Parameter Laktat

und Inhibin verwendet. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem BIO-Rad

Protein Assay (Hercules, CA, USA, 500-0116), basierend auf der Methode

von Lowry (1951).

Dazu wurde das Kulturmedium entfernt, und die Zellen wurden mit jeweils

200 µl 1 M NaOH unter Zusatz von 0,1% SDS (Natrium-dodecylsulfat;

Serva; entsprechend 1 g SDS/l Natronlauge) pro Well versetzt. Nach

2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde jeweils eine Probe von

20 µl für die Messung in Doppelbestimmung auf Mikrotiterplatten verwen-

det. Zu diesem Zeitpunkt waren mikroskopisch keine Zellbestandteile mehr

nachweisbar. Die Messung verlief wie folgt:

1. Zugabe von 200 µl Reagenz A zu je 20 µl Probe (dabei bindet der Farb-

stoff unspezifisch an die Aminogruppen der in der Probe enthaltenen

Proteine)

2. Zugabe von je 25 µl Reagenz B (Auslösen einer Farbreaktion, die umso

stärker ausfällt, je mehr Protein vorhanden ist)

3. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur


4. Messung der Absorption der Lösung am MTP-Reader EAR 400 ATC

(SLT Labinstruments, Österreich) bei λ=690 nm und Bestimmung des

Proteingehaltes mittels Standardkurve

Die Standardkurve wurde mit in NaOH + SDS (s.o.) gelöstem Rinder-

serumalbumin (BSA; Sigma, H-9568) ermittelt und verlief im Bereich von

200-1400 µg/ml linear. Die untere Nachweisgrenze lag bei 200 µg/ml. Die

gemessenen Proteinmengen lagen zwischen 60 und 100 µg Zellprotein pro

Well bzw. pro 106 Zellen.

3.5 Optimierungen

Beim Anlegen der Zellkulturen und der Durchführung der verschiedenen

Assays traten immer wieder Probleme auf, die teils umfangreiche Vorver-

suche bzw. Veränderungen der in der Literatur beschriebenen Methoden

notwendig machten. Der Zeitaufwand für diese Optimierungen war dabei

oft größer als für die eigentliche Messung.

Beim Ausplattieren fiel auf, daß die Sertoli-Zellen möglicherweise auf-

grund ihrer Oberflächeneigenschaften zu Klusterbildung neigen. Dies hatte

zur Folge, daß beim Auszählen einzelner Proben einer Präparation (s. Kpt.

3.3.3) die Zelldichte stark variierte. Die gewonnenen Daten wurden zwar

auf die jeweilige Proteinmenge bezogen, dennoch ist davon auszugehen,

daß sich das Verhalten der Zellen in Abhängigkeit von der Struktur und

Größe des Zellverbandes verändert. Die Klusterbildung führte zudem zu

einer mikroskopisch sichtbaren inhomogenen Verteilung der Zellen auf den

einzelnen Vertiefungen der Zellkulturschale. Dies hatte weiterhin zur Folge,

daß die gemessenen Werte (Protein, Laktat und Inhibin) stark variierten,

was die Erstellung verschiedener Standardkurven notwendig machte, bzw.


daß die Proben entsprechend verdünnt werden mußten. Im ungünstigsten

Fall lagen die Werte außerhalb der Nachweisgrenze. Um dieses Problem zu

beheben, wurden Nylonmembranen unterschiedlicher Maschenweite be-

nutzt, wobei eine Weite von etwa 70 µm am besten geeignet schien, mög-

lichst viele Einzelzellen zu gewinnen, ohne einen relevanten Zellverlust zu

bedingen. Diese Nylonmembranen mußten allerdings von Hand zuge-

schnitten und einzeln sterilisiert werden. Bei den abschließenden Präparati-

onen verwendeten wir schließlich sterile Einmal-Siebe der Firma Falcon

mit einer Maschenweite von 70 µm.

Der Versuch, die Zellen auf unbeschichteten Platten anzuzüchten, mißlang.

Die Zellzahl reduzierte sich deutlich im Verlauf der Kultur, so daß nach

mehrfachem Mediumwechsel die Proteinmenge deutlich abgesunken war.

Dies war bei den mit Matrigel beschichteten Platten in wesentlich geringe-

rem Umfang der Fall.

Zu Beginn der Versuchsreihen sollte nicht die Proteinmenge, sondern der

DNA-Gehalt der Zellen die Referenzgröße für die Stoffwechselparameter

darstellen. Moderne sensitive Verfahren zur Bestimmung des DNA-

Gehaltes beruhen auf fluoreszierenden Farbstoffen, die an DNA binden

(Labarca and Paigen, 1980). Zur Messung ist ein Fluoreszensspectrometer

nötig, welches allerdings nicht zur Verfügung stand. Eine ältere Methode

(Burton, 1956) die auf einem colorimetrischen Nachweis der DNA beruht,

erwies sich als zu unempfindlich und war darüber hinaus sehr aufwendig.

Daher wurde auf die Proteinbestimmung nach Lowry (Lowry et al., 1951)

zurückgegriffen. Anfangs wurde zum Auflösen der Zellen Dispase verwen-

det. Dazu mußten die Zellen mehrfach im Brutschrank inkubiert und der

Zellrasen anschließend mit einem sog. „Rubber Policeman“ vom Unter-

grund abgelöst werden. Der Überstand wurde dann mehrfach zentrifugiert

und auf Eis sonifiziert, bevor mit dem eigentlichen Assay begonnen werden

konnte. Dieses Vorgehen war sehr zeitaufwendig. Das Auflösen in ver-

dünnter Natronlauge stellte hier eine einfache und praktische Alternative


dar. Einige Zellbestandteile lösten sich allerdings nur sehr schlecht in der

verwendeten Natronlauge. Bei den abschließenden Versuchen wurde daher

das Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) zugesetzt.

Bei der Vitalitätsbestimmung mittels MTT-Assay wird in der Originalvor-

schrift das Auflösen der Zellen und das Lösen des Formazanproduktes in

salzsaurem Isopropanol empfohlen. Nach einigen Versuchen zeigte sich,

daß schon nach kurzer Zeit durch Verdunstung Fehler in der photometri-

schen Bestimmung des Proteingehaltes auftraten. Daher wurde letzlich

DMSO als Lösungsmittel verwendet. Aufgrund des wesentlich höheren

Siedepunktes sind hier Fehler durch Verdunstung des Lösemittels zu ver-

nachlässigen.

Die Optimierung des Laktat-Assays gestaltete sich schwierig. Eine Ver-

wendung der handelsüblichen Kits zur Laktatmessung war nicht praktika-

bel, da zum einen das erforderliche Probenvolumen zu groß war und zum

anderen durch die erhebliche Anzahl an Proben der Kostenfaktor berück-

sichtigt werden mußte. Daher wurde das Originalverfahren nach Noll den

Versuchsbedingungen angepaßt. Das erforderliche Volumen mußte von

ursprünglich 3 ml auf 1 ml reduziert werden, da das Volumen des zur Ver-

fügung stehenden Zellkulturüberstandes begrenzt war. Die Messung konnte

in 1 ml Kunstoffküvetten durchgeführt werden. Für eine 24-Well-

Zellkulturplatte waren dabei etwa 52 Einzelmessungen (Doppelbestimmung

+ Standards) nötig. Es zeigte sich, daß bei Verwendung der Enzyme GPT

und LDH in der für das geringere Probenvolumen vorgeschriebenen Menge

die für die Reaktion notwendige Zeit größer war als zuvor angenommen.

Daher wurden der Anteil der Enzymlösung am Versuchsansatz erhöht und

die Proben nach Zugabe der Enzyme vorsichtig durchmischt. Die Reaktion

konnte dadurch erheblich beschleunigt und der Zeitaufwand reduziert wer-

den. Die Vorbehandlung des Überstandes mit Perchlorsäure erwies sich als

unnötig. Ein Erhitzen der Proben auf 95°C, anschließendes Zentrifugieren

sowie Lagerung bei -18°C erfüllten den gleichen Zweck.


Bei der Durchführung des Inhibin-Assays fiel auf, daß die Konzentration

des Hormons bei vielen Proben so gering war, daß es nicht mehr detektiert

werden konnte. Die Ursache sahen wir zum einen im unterschiedlichen Al-

ter der Versuchstiere (s.Kpt. 5) und zum anderen in der Lagerung der Pro-

ben vor der Durchführung des Assays. Die Proben wurden daher

unmittelbar nach Versuchsende bzw. innerhalb einer Woche nach Gewin-

nung weiterverarbeitet. Für die eigentlichen Experimente wurde das End-

volumen pro Well auf 500 µl verringert, wodurch sich die Konzentration

des Inhibin deutlich erhöht. Beide Maßnahmen führten zu einer optimierten

Bestimmung der Inhibin-Werte.

Das Auflösen der Schwermetalle im Medium war dank deren guter Was-

serlöslichkeit unproblematisch. Gossypol dagegen ist stark lipophil. Die

Löslichkeit in reinem DMSO war gut. Allerdings mußte bis zur vollständi-

gen Auflösung eine Wartezeit von einigen Stunden in Kauf genommen

werden. Bei einer Endkonzentration von 0,3% im Zellkulturmedium zeigte

sich im MTT-Assay keine signifikante Beeinflussung der Zellvitalität durch

DMSO. In Ethanol löst sich Gossypol wesentlich schneller. Damit die zu-

gesetzte Menge gering sein konnte, mußte reiner Alkohol verwendet wer-

den. Die Endkonzentration des Ethanol im Medium betrug 0,5%. Ein

Einfluß auf die Vitalität der Zellen konnte in Vorversuchen auch hier nicht

beobachtet werden. Aufgrund der einfacheren Handhabung wurde daher

Ethanol als Lösungsmittel verwendet.


3.6 Statistik

Die Experimente zur Laktat- und MTT-Messung wurden mindestens drei-

mal wiederholt. Dabei ergaben sich vergleichbare Ergebnisse. Die darge-

stellten Resultate entsprechen jeweils einem repräsentativen Experiment;

durchgeführt an je zwei Kulturplatten mit insgesamt acht Wells pro unter-

suchter Schadstoffkonzentration. Die Experimente zur Untersuchung der

Inhibinsekretion wurden je einmal wiederholt. Die Ergebnisse zeigen eines

dieser Experimente, durchgeführt an einer Kulturplatte mit vier Wells pro

Konzentration. Die statistische Auswertung erfolgte mit dem zweiseitigen

Student’s t-Test.

Die Werte in den Diagrammen des Ergebnisteils (Kpt. 4) entsprechen dem

Mittelwert ± der Standardabweichung. Die Symbole (***), (**) und (*)

kennzeichnen dabei ein Signifikanzniveau von (p<0.001), (p<0.01) und

(p<0.05) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Angaben zu den Maß-

einheiten finden sich am jeweiligen Diagramm.

Die EC50-Werte wurden durch graphische Extrapolation aus den entspre-

chenden Dosis-Wirkungs-Diagrammen ermittelt. Der EC50-Wert entspricht

derjenigen Schadstoffkonzentration, bei der eine Abnahme der Meßgröße

auf 50% des Kontrollwertes (unbehandelte Probe) beobachtet wurde.

4 Ergebnisse 42

4 Ergebnisse

4.1 Vitalität der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchen-den Substanzen

Die Sertoli-Zellkultur wurde für 24 Stunden mit verschiedenen Konzentra-

tionen des jeweiligen Schadstoffes inkubiert. Direkt im Anschluß wurde die

Vitalität der Zellen mit Hilfe des MTT-Assays bestimmt. Dabei wird MTT,

ein gelber Farbstoff, von den Zellen aufgenommen und zu einem blauen

unlöslichen Formazanprodukt reduziert. Dieser Prozess benötigt die Akti-

vität von mitochondrialen Dehydrogenasen und findet ausschließlich in le-

benden Zellen statt. Die Ausbeute an blauem Farbstoff, die auf

photometrischem Wege bestimmt wird, ist ein direktes Maß für die Vitalität

der untersuchten Zellpopulation (s. Kpt. 3.4.3). Die Diagramme 4.1-4.5 zei-

gen die Ergebnisse dieser Untersuchung.

Die Werte in diesen und den folgenden Diagrammen entsprechen dem

Mittelwert ± der Standardabweichung. Die Symbole (***), (**) und (*)

kennzeichnen dabei ein Signifikanzniveau von (p<0.001), (p<0.01) und

(p<0.05) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (zur statistischen Aus-

wertung s. Kpt. 3.6).

4 Ergebnisse 43

4.1.1 Gossypol

Diagramm 4.1: Vitalität der Zellen nach Zugabe von Gossypol

Die Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung in Prozent (%) der Kontrolle.(***), (**) und (*) kennzeichnen ein Signifikanzniveau von (p<0.001), (p<0.01) und (p<0.05).n=8

Niedrige Konzentrationen von Gossypol hatten keinen (3 µM) oder nur ge-

ringen (6 µM) Einfluß auf die Vitalität der Sertoli-Zellen. Höhere Konzent-

rationen (9-15 µM) führten jedoch zur Abnahme der Zellvitalität um 70%.

Für einen Rückgang der MTT-Reduktionskapazität der Zellen auf 50%

(EC50-Wert) war eine Gossypolkonzentration von 7,6 µM nötig (EC50=

7,6 µM).

0

20

40

60

80

100

120

0 3 6 9 12 15

Gossypol [µM]

Vita

lität

(in

%)

***

***

*** ***

4 Ergebnisse 44

4.1.2 Schwermetallsalze

Die Untersuchung der Schwermetallsalze zeigte, daß nur Bleiazetat die

Zellvitalität negativ beeinflußt. Bei höheren Konzentrationen (25 und

50 µM) kam es hier zu einem signifikanten Rückgang um 12% bzw. 30%

im Vergleich zur Kontrolle. Bei Konzentrationen von 100 µM nahm die

Vitalität der Sertoli-Zellen um 58% ab. Der EC50-Wert war bei 82 µM Blei-

azetat erreicht.

• Diagramm 4.2: Vitalität der Zellen nach Zugabe von Bleiazetat


0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 25 50 100

Bleiazetat [µM]

Vita

lität

(in

%)

**

***

***

4 Ergebnisse 45

• Diagramm 4.3: Vitalität der Zellen nach Zugabe von Nickelazetat


Im untersuchten Konzentrationsbereich zeigten Nickelionen in Form von

Nickelazetat keinen meßbaren Einfluß auf die Zellvitalität.

Kobaltchlorid und Hexachloroplatinsäure steigerten demgegenüber die

MTT-Reduktionskapazität der Zellen um bis zu 36% (Kobaltchlorid,

25 µM) bzw. 20% (Hexachloroplatin, 50 µM).

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 25 50 100

Nickelazetat [µM]

Vita

lität

(in

%)

4 Ergebnisse 46

• Diagramm 4.4: Vitalität der Zellen nach Zugabe von Kobaltchlorid

• Diagramm 4.5: Vitalität der Zellen nach Zugabe von Hexachloroplatin-säure


40

60

80

100

120

140

160

0 5 10 25 50 100

Kobaltchlorid [µM]

Vita

lität

(in

%)

****

**

**

*

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 25 50 100

Hexachloroplatinsäure [µM]

Vita

lität

(in

%)

*** *****

4 Ergebnisse 47

4.2 Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu un-tersuchenden Substanzen

Die Laktatproduktion der Zellen wurde mit Hilfe eines gekoppelten Enzym-

Assays bestimmt. Nach einer Inkubationszeit von 24 Std. wurde das Medi-

um entfernt und dessen Laktatgehalt photometrisch ermittelt.

4.2.1 Gossypol

Gossypol hatte den weitaus größten Einfluß auf die Laktatproduktion.

Schon geringe Konzentrationen führten zu einer massiven Zunahme der

Laktatkonzentration im Zellkulturüberstand um das bis zu 15fache der

Kontrolle (6 µM). Bei höheren Gossypolkonzentrationen (9-15 µM) kam es

im Vergleich dazu zu einem geringeren Anstieg des Laktatgehaltes (5facher

Anstieg bei 15 µM). Diese relative Abnahme der Laktatmenge ist auf eine

verringerte Vitalität der Sertoli-Zellen zuruckzuführen, da hier parallel eine

verringerte mitochondriale Aktivität gemessen wurde (s. Diagramm 4.1).

• Diagramm 4.6: Laktatproduktion nach Zugabe von GossypolDie Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung. (***), (**) und (*) kennzeichnenein Signifikanzniveau von (p<0.001), (p<0.01) und (p<0.05). n=8

****

***

***

***

0

50

100

150

200

250

300

0 3 6 9 12 15

Gossypol [µM]

mg

Lak

tat/1

00 µ

g Pr

otei

n/24

h

4 Ergebnisse 48


Im Vergleich zum Gossypol wurde bei den Metallsalzen erst bei höheren

Konzentrationen des jeweiligen Agens ein Einfluß auf die Laktatproduktion

der Sertoli-Zellen beobachtet. Hier zeigte sich eine signifikante dosis-

abhängige Zunahme der Laktatkonzentration im Zellkulturüberstand. He-

xachloroplatinsäure hatte dabei den größten Effekt mit einer Zunahme des

Wertes im Medium um das 2,6fache bei 100 µM. Kobaltchlorid und Ni-

ckelazetat führten bei dieser Konzentration zu einem 1,6 bzw. 1,3fachen

Anstieg des Laktatspiegels. Unter dem Einfluß von Bleiazetat konnte keine

Änderung der Laktatproduktion beobachtet werden.

• Diagramm 4.7: Laktatproduktion nach Zugabe von Bleiazetat

Die Werte sind dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung. (***), (**) und (*) kennzeichnenein Signifikanzniveau von (p<0.001), (p<0.01) und (p<0.05). n=8

0

1020

3040

50

6070

0 5 10 25 50 100

Bleiazetat [µM]

mg

Lak

tat/1

00µ

g Pr

otei

n/24

h

4 Ergebnisse 49

• Diagramm 4.8: Laktatproduktion nach Zugabe von Nickelazetat

• Diagramm 4.9: Laktatproduktion nach Zugabe von Kobaltchlorid


0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 25 50 100

Nickelazetat [µM]

mg

Lak

tat/1

00µ

g Pr

otei

n/24

h

****

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 25 50 100

Kobaltchlorid [µM]

mg

Lak

tat/1

00µ

g Pr

otei

n/24

h

***

******

4 Ergebnisse 50

• Diagramm 4.10: Laktatproduktion nach Zugabe von Hexachloroplatin-säure


0

10

20

3040

50

60

70

80

90

100

0 5 10 25 50 100


mg

Lak

tat/1

00µ

g Pr

otei

n/24

h

***

***

***

***

4 Ergebnisse 51

4.3 Inhibinsekretion der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu un-tersuchenden Substanzen

Das Polypeptid Inhibin ist ein spezifischer Parameter für die Funktion der

Sertoli-Zelle. Dieses Hormon wird nur in sehr geringen Mengen produziert

und abgegeben. Zur Detektion war darum die Verwendung eines hochsen-

sitiven Radioimmuno-Assays nötig. Nach einer Inkubationszeit von 24 Std.

wurde das Medium entfernt und der Inhibingehalt bestimmt. Die Sensitivi-

tät des Assays betrug 0,2 pg Inhibin/100 µg Protein/24 Std. (s. Kpt. 3.4.2).

Die Untersuchung zeigte folgende Ergebnisse:

4.3.1 Gossypol

Steigende Konzentrationen von Gossypol führten zu einer stetigen Abnah-

me der Inhibinproduktion. Bei 6 µM kam es im Vergleich zur Kontrolle zu

einer Reduktion um 83%. Bei 12 µM und 15 µM Gossypol sank der Inhi-

binspiegel unter die Nachweisgrenze.

• Diagramm 4.11: Inhibinsekretion nach Zugabe von Gossypol


05

1015202530354045

0 3 6 9 12 15

Gossypol [µM]

pg I

nhib

in/1

00 µ

g Pr

otei

n/24

h

*** ***

4 Ergebnisse 52


Bei der Untersuchung der Schwermetalle zeigten sich abhängig von der

Substanz unterschiedliche Resultate. Als Reaktion auf die Zugabe von Blei-

azetat kam es ähnlich wie bei der Verwendung von Gossypol zu einer kon-

zentrationsabhängigen Reduktion der Inhibinproduktion. Obwohl statistisch

nicht signifikant, zeigte sich schon bei niedrigen Konzentrationen (5 und 10

µM) eine tendenzielle Abnahme des Inhibins. Bei 50 µM ging die Sekretion

hochsignifikant auf 27%, bei 100 µM bis auf 18% der Kontrolle zurück.

Dies wird jedoch in diesem Konzentrationsbereich am ehesten durch die

zytotoxische Wirkung von Blei verursacht (vgl. Diagramm 4.2).

• Diagramm 4.12: Inhibinsekretion nach Zugabe von Bleiazetat


0

5

10

15

20

25

30

35

0 5 10 25 50 100

Bleiazetat [µM]

pg I

nhib

in/1

00 µ

g Pr

otei

n/24

h

******

4 Ergebnisse 53

Kobaltchlorid und Hexachloroplatinsäure führten im Gegensatz zu Gossy-

pol und Bleiazetat bei geringen Konzentrationen (ab 5 µM) zu einer Zu-

nahme der Inhibinproduktion. Kobaltchlorid konnte die Inhibinsekretion bis

auf das Doppelte der Kontrolle steigern (25 µM). Bei höheren Konzentrati-

onen (50 und 100 µM) fiel der Inhibinspiegel wieder ab, unterschied sich

dabei jedoch nicht signifikant von der Vergleichsgruppe.

• Diagramm 4.13: Inhibinsekretion nach Zugabe von Kobaltchlorid


Bei Zugabe von Hexachloroplatinsäure erreichte die Inhibinproduktion bei

5 µM ihr Maximum (1,6fache der Kontrolle). Danach zeigte sich ein signi-

fikanter Abfall des Inhibinspiegels bis in den Bereich der Nachweisgrenze.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 5 10 25 50 100

Kobaltchlorid [µM]

pg I

nhib

in/1

00 µ

g Pr

otei

n/24

h

**

**

4 Ergebnisse 54

• Diagramm 4.14: Inhibinsekretion nach Zugabe von Hexachloroplatin-säure

Nickelazetat zeigte dagegen im verwendeten Konzentrationsbereich keinen

meßbaren Einfluß auf die Sekretion von Inhibin.

• Diagramm 4.1: Inhibinsekretion nach Zugabe von Nickelazetat


0

10

2030

40

50

60

70

80

90

0 5 10 25 50 100


pg I

nhib

in/1

00 µ

g Pr

otei

n/24

h **

***

***

***

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 25 50 100

Nickelazetat [µM]

pg I

nhib

in/1

00 µ

g Pr

otei

n/24

h

4 Ergebnisse 55

4.4 Ergebnisse der Optimierung

Der erste Schritt zur Verbesserung der Testmethode war die Verwendung

von Einmal-Nylonsieben mit 70 µm Maschenweite zur mechanischen Zell-

separation. Damit gelang es, die Klusterbildung der Zellen zu minimieren

und eine homogene Verteilung der Population auf den einzelnen Wells zu

erreichen. Das Ergebnis war ein gleichmäßiger Monolayer, wie er auf Abb.

3.2 und 3.4 zu sehen ist.

Die Bestimmung des DNA-Gehaltes der Zellkultur als Referenzwert für die

gemessenen Parameter erwies sich für die praktische Anwendung als un-

brauchbar. Stattdessen wurde die Proteinmenge mit einem handelsüblichen

Kit bestimmt. Die Proteinbestandteile des Matrigel stellten dabei keine we-

sentliche Fehlerquelle dar, da ihr Anteil zu gering war, um auf die Messung

Einfluß zu nehmen. Dies konnte in mehrfachen Testreihen nachgewiesen

werden. Die Proteinmenge lag zwischen 60 und 100 µg pro Well.

Die schlechte Löslichkeit der Zellen machte die Anwendung eines Deter-

genz (SDS) notwendig. Hiernach waren mikroskopisch keine sichtbaren

Bestandteile in der Probe mehr zu erkennen.

Durch das Auflösen der Zellen und des Farbstoffes in DMSO statt in I-

sopropanol konnten Verdunstungsfehler vermieden und die Handhabung

des MTT-Assays erleichtert werden.

Beim Laktat-Assay mußte die umfangreiche Vorbehandlung der Proben

und der notwendige Messansatz verändert bzw. optimiert werden. Dazu

wurde das Volumen der einzelnen Substanzen (Puffer, Substrate) entspre-

chend verändert und die Enzymmengen optimiert. Im Ergebnis konnte so

der Assay an die Versuchsgegebenheiten (kleines Probevolumen, große

Zahl der Proben, Kostenfaktor) angepaßt werden. Sowohl der Zeitaufwand

als auch die Kosten wurden durch diese Vorgehensweise im Vergleich zu

einem handelsüblichen Verfahren um etwa 50% reduziert.

4 Ergebnisse 56

Der aufwendigste Teil der Messungen war die Durchführung des Inhibin-

Assays. Obwohl die Empfehlungen des Herstellers befolgt wurden, kam es

schon nach kurzer Lagerung der Proben zu relevanten Veränderungen der

Messwerte, so daß nach umfangreichen Vorversuchen die Proben unmittel-

bar bzw. innerhalb einer Woche weiterverarbeitet wurden. Das Absinken

der Messwerte unter die Nachweisgrenze trat so nicht mehr auf.

5 Diskussion 57

5 Diskussion

5.1 Diskussion des Testsystems

Primäre Aufgabe dieser Arbeit ist es, ein Testsystem als mögliches Scree-

ning-Verfahren zu etablieren, das es ermöglicht, die reproduktionstoxische

Potenz einer Noxe innerhalb kurzer Zeit beurteilen zu können. Die Bewer-

tung eines Testsystems erfolgt nicht zuletzt aufgrund der bei der prakti-

schen Tätigkeit auftretenden Probleme. Zu Beginn der Diskussion soll

daher eine Betrachtung dieser Probleme stehen, die vor allem im Bereich

der Standardisierung und Optimierung auftraten.

Beim Anlegen der Zellkultur konnte auf die schon bestehenden Erfahrun-

gen der hiesigen Arbeitsgruppe zurückgegriffen werden, die in entspre-

chenden Arbeiten veröffentlicht sind (Monsees et al., 1996). Das

wesentliche Problem lag in der Zellseparation. Die Gewinnung von Einzel-

zellen stellte sich zu Beginn als schwierig dar, war aber notwendige Vor-

aussetzung, um eine möglichst gleich große Zellpopulation in den einzelnen

Kulturschalen zu erhalten. Die Verwendung eines 70 µm Nylonsiebes nach

enzymatischer und grober mechanischer Trennung führte zwar zu einer Re-

duktion der Gesamtzahl gewonnener Zellen, konnte aber die Auflösung von

Adhäsionen und Zellklustern gewährleisten, so daß im wesentlichen Einzel-

zellen gewonnen wurden. Daher wurde dieser Schritt bei der Zellpräparati-

on hinzugefügt, der so in den Publikationen nicht beschrieben ist (Hadley et

al., 1985; Onoda et al., 1990).

Bei der Anwendung der einzelnen Assays ergaben sich grundsätzliche

Probleme. Die Detektion von Laktat ist zwar eine seit vielen Jahren in der

Biochemie verwendete Methode, die erhältlichen Testkits arbeiten jedoch

mit weitaus grösseren Volumina, als sie bei dieser Arbeit zur Verfügung

5 Diskussion 58

standen. Es war nötig, den Assay auf die vorhanden Probenvolumina zu

standardisieren und zur weiteren Vereinfachung den Meßbereich an die zu

erwartenden Laktatmengen anzupassen. Dadurch war keine weitere Ver-

dünnung bzw. Konzentration der Proben, die in nicht unerheblichem Um-

fang anfielen, nötig. In Vorversuchen, die am Überstand von unbehandelten

Zellen durchgeführt wurden, wurde vor Testbeginn die Reproduzierbarkeit

der Ergebnisse überprüft. Es zeigte sich dabei, daß unter Einbeziehung der

jeweiligen Zellproteinmengen als Referenzwert vergleichbare Ergebnisse

erzielt werden konnten.

Das wesentliche Problem bei der Inhibinbestimmung lag zum einen in der

äußerst geringen Konzentration des Inhibins in den Proben; zum anderen in

der durch das komplizierte und langwierige Testverfahren verursachten

Störanfälligkeit des Assays. In Vorversuchen zeigte sich, daß es trotz Ein-

haltung der vom Hersteller des Assays angegebenen Methode zur Konser-

vierung der Proben durch Einfrieren bei -80°C zu einem relevanten Abbau

des Inhibins nach etwa 14 Tagen gekommen war. Die Proben wurden daher

möglichst unmittelbar nach Versuchsende bzw. innnerhalb einer Woche

weiter bearbeitet. Je nach Zellpräparation zeigte sich außerdem, daß die

basale Inhibinsekretion der Zellen stark variierte, wobei die Standardabwei-

chung des Inhibingehaltes der Proben einer Präparation konstant blieb. Zum

Teil lagen die gesamten Meßwerte einer Versuchsreihe unterhalb der

Nachweisgrenze. Möglicherweise sind schon minimale Altersunterschiede

bei den Versuchstieren verantwortlich für dieses Phänomen. Es wurde ge-

zeigt, daß junge Ratten eine deutlich höhere Inhibinproduktion haben als

ältere Tiere (Rivier et al., 1988).

Kurz nach Beendigung der praktischen Tätigkeit an dieser Arbeit kam ein

Testsystem auf den Markt, das mit Hilfe eines ELISA Inhibin nachweist.

Dieses System ist weniger sensitiv als der RIA, kommt allerdings mit einem

5 Diskussion 59

geringeren Zeitaufwand aus. Zur Optimierung müßte hier mit einer größe-

ren Zellzahl gearbeitet werden.

Die Proteinbestimmung erfolgte mit der Methode nach Lowry (1951). Die

Werte lagen relativ konstant (allerdings abhängig von der jeweiligen Präpa-

ration) zwischen 60 und 100 µg pro Well in einem Volumen von 1 ml und

bei einer Zellzahl von 106 Zellen/ml (s. Kpt. 3.3.3). Auffallend ist, daß in

vorausgegangenen Studien meist mit größeren Zellzahlen gearbeitet wurde.

Williams und Foster (1988) verwendeten beispielweise 4-5x106 Zellen pro

ml Medium, allerdings ohne die Angabe der Proteinmenge.

Chapin et al. (1988) arbeiteten dagegen bei einer Studie über den Einfluß

von Phtalatestern auf Sertoli-Zellkulturen mit einem Volumen von 26 ml

pro Well und einem Proteingehalt von 1,8-2,5 mg. Dies entspricht 70-100

µg Protein pro ml. Leider finden sich hier keine Angaben zur Zellzahl. Bei

einer ähnlichen Arbeit wurden 15x106 Zellen in 5 ml Volumen mit 3,5 mg

Zellprotein pro Well verwendet (Gray and Beamand, 1984). Dies sind

3x106 Zellen/ml mit einem Proteingehalt von 230 µg pro 106 Zellen. Die

Differenz ist dadurch zu erklären, daß in dieser Arbeit keine Sertoli-Zell-

Monokulturen sondern lediglich mit Sertoli-Zellen angereicherte Kulturen

verwendet wurden und daß die Proteinmessung vor dem Anlegen der ei-

gentlichen Kultur erfolgte. Wie in Kpt. 3.5 schon angedeutet, kommt es

durch mehrfachen Mediumwechsel zu Zellverlusten, die am sinkenden

Proteingehalt abzulesen sind.

Das gesamte Testsystem „Sertoli-Zelle“ zeigte sich insgesamt weniger stör-

anfällig als vor Versuchsbeginn angenommen. Im praktischen Umgang er-

wies es sich – was Handhabung, Zeitaufwand und Wirtschaftlichkeit angeht

– den Anforderungen gewachsen. Es ist möglich, innerhalb von etwa 10

Tagen das gesamte Testsystem mit einer Testsubstanz durchzuführen. Da-

bei entfallen etwa 6 Tage auf die Präparation und das Anlegen der Zellkul-

5 Diskussion 60

tur, die verbleibenden 4 Tage auf die Durchführung der einzelnen Assays.

Der Inhibin-Assay verursacht durch lange Inkubationszeiten den größten

Zeitaufwand. Bei Verwendung des oben erwähnten neuen Testkits könnte

der Zeitbedarf auf nur 8 Tage reduziert werden. Um statistisch sichere Er-

gebnisse zu erhalten, wurden diese Experimente aber noch mindestens

zweimal wiederholt.

Abgesehen von den praktischen Belangen zeigt sich bei der Interpretation

der Ergebnisse, daß sich die Auswahl und vor allem die Kombination der

Testparameter vorteilhaft auf die Aussagekraft des Testsystems auswirkte.

In vorausgegangenen Studien wurden meist morphologische Gesichts-

punkte als Referenz für die Vitalität der Zellkulturen verwendet. Diese be-

sitzen natürlich nur eine geringe Trennschärfe, so daß Korrelationen zu den

gemessenen biochemischen Parametern nur bedingt möglich sind.

Die Verwendung des MTT-Assays bietet die Möglichkeit der Ermittlung

von subtoxischen Konzentrationen der verwendeten Schadstoffe, bei denen

wohl die Zellfunktion, nicht aber die Vitalität signifikant beeinflußt wird.

Damit ist auch eine ungefähre Aussage darüber möglich, ob das nachgewie-

sene Laktat bzw. Inhibin aus stoffwechselaktiven lebenden oder aus avita-

len lysierten Zellen stammt.

Insgesamt zeigen sich beim Vergleich mit In-vivo-Studien auch die Gren-

zen in der Verwendung von Monozellkulturen. Wie im dritten Kapitel er-

sichtlich, wurde dem Kulturmedium nur bis zum Tag vor Versuchsbeginn

FSH hinzugefügt. Diese Stimulation sollte bei den eigentlichen Untersu-

chungen keine Rolle spielen, um nur den tatsächlichen Einfluß der Noxe zu

messen. Die Relevanz der Ergebnisse wird aber durch diese unphysiologi-

schen Verhältnisse eingeschränkt. In bezug auf hormonelle Interaktionen

der Zellen, gerade bei Betrachtung der Inhibinproduktion, ist keine Aussage

möglich. Eine Lösung wäre dabei das Anlegen von Co-Kulturen (z.B. Ser-

5 Diskussion 61

toli- und Leydig-Zellen), wie es mit Sertoli-Zellen auch schon durchgeführt

worden ist (Foucault et al., 1994). In der Praxis können dafür primär Mono-

zellkulturen angelegt werden, welche dann mit Hilfe eines Zwei- oder

Mehrkammersystems zu einer Co-Kultur vereinigt werden. Getrennt wer-

den diese Kammern durch eine Membran, die die Interaktion der Zellpopu-

lationen ermöglicht. Hiermit konnte beispielsweise nachgewiesen werden,

daß es in einer Cytochrom-P450-abhängigen Reaktion in Leydig-Zellen zu

einer Potenzierung der toxischen Wirkung der für Sertoli-Zellen ohnehin

schädlichen Substanz Tri-o-crescyl-Phosphat kommt (Chapin et al, 1990).

Sertoli-Zellen selbst enthalten nur sehr wenig Cytochrom-P450.

Das Anlegen einer Sertoli-Keimzell-Co-Kultur ist dazu geeignet, morpho-

logische Parameter wie z.B. die Loslösung der Keimzellen von den Sertoli-

Zellen (sog. Detachement) zu untersuchen (Reader and Foster, 1990). Hier-

für ist es notwendig, die entsprechenden Schritte zur Sertoli-Zell-Separation

(hypotoner Schock) bei der Präparation wegzulassen (s. Kpt. 3.3.4). Der

Nachteil einer solchen Kultur liegt sicher in der unvorhersehbaren Zusam-

mensetzung der Zellpopulation auch in Abhängigkeit vom Alter des Tieres.

Die Verwendung von Co-Kulturen bietet somit die Möglichkeit, spezielle

Fragestellungen zu untersuchen, bei denen die Interaktion von Zellpopulati-

onen eine Rolle spielen. Dabei sollte allerdings beachtet werden, daß auch

Co-Kulturen nur eine Annäherung an die physiologischen Bedingungen

darstellen.

5 Diskussion 62

5.2 Diskussion der Ergebnisse

Innerhalb der letzten 50 Jahre soll in den Industrienationen ein Rückgang

der durchschnittlichen Spermienzahl bei Männern um etwa 50% zu be-

obachten sein (Carlsen et al., 1992). Trotz heftiger Kritik an dieser groß

angelegten retrospektiven Studie (Übersicht in Nieschlag, 1998) kam es in

der Folge zu einer breiten wissenschaftlichen Auseinandersetzung über die

möglichen Ursachen. In der aktuellen Diskussion im Bereich der Repro-

duktionsbiologie werden gerade Umweltschadstoffe für den vermeintlichen

Rückgang der Fertilität bei Männern verantwortlich gemacht. Die Wirkung

dieser Schadstoffe auf die Reproduktionsorgane des Mannes steht im Mit-

telpunkt des Interesses. Zahlreiche Untersuchungen bei chronisch expo-

nierten Männern zeigen eine Schädigung der Spermienproduktion (Seibert,

1996).

Ziel dieser Arbeit war es, ein In-vitro-Testsystem zu entwickeln, das den

Einfluß von Umweltnoxen auf die Funktion testikulärer Zellen überprüft.

Basierend auf bereits vorhandenen Untersuchungen (Zhuang et al., 1983;

Corrier, 1985; Chapin et al., 1988) und den oben angeführten Studien wur-

den hierfür Sertoli-Zell-Monokulturen verwendet, da die Integrität dieser

Zellen essentiell für einen ungestörten Ablauf der Spermatogenese ist. Mar-

ker der Zellfunktion stellten unspezifische sowie spezifische biochemische

Parameter der Zellen dar; die Produktion von Laktat als Nährstoff für die

sich entwickelnden Spermatozyten und die Sekretion von Inhibin, das im

endokrinen System zu einer Abnahme der FSH-Abgabe der Hypophyse

führt.

Ein wichtiges Ergebnis dieser Arbeit ist die Ermittlung subtoxischer Kon-

zentrationen der verwendeten Substanzen, d.h. mit Einfluß auf die bioche-

mischen Leistungen der Zellen ohne Beeinflussung der Vitalität. Dies läßt

in begrenztem Umfang den Vergleich mit In-vivo-Studien zu, bei denen

5 Diskussion 63

Serum bzw. Gewebskonzentrationen der entsprechenden Stoffe (Gossypol

bzw. Schwermetallsalze) gemessen wurden.

Gossypol wurde als Referenzsubstanz ausgewählt, da ausführliche Studien

zur In-vivo- und In-vitro-Toxizität vorliegen, aus denen hervorgeht, daß die

Sertoli-Zelle einen wesentlichen Angriffspunkt für die schädigende Wir-

kung auf zellulärer Ebene darstellt.

Zur Untersuchung der doch relativ selektiven Schädigung des männlichen

Reproduktionssystems wurden zahlreiche Studien initiiert. Die Chance, die

sich hier bot, war – möglicherweise exemplarisch für viele andere Stoffe –

genaue Erkenntnisse über den zugrundeliegenden Schädigungsmechanis-

mus einer Substanz zu erzielen, deren In-vivo-Wirkung beim Menschen

zweifelsfrei belegt ist.

Ob der Schädigung durch Gossypol ein direkter zytotoxischer Effekt oder

eine indirekte Einflußnahme via Hormonhaushalt zugrunde liegt, kann fol-

gendermaßen beantwortet werden. Die weitaus größte Anzahl der Studien

findet keinen Hinweis für eine Veränderung des Hormonstatus, weder bei

In-vivo-Tests am Menschen (Coutinho et al., 1984; National Coordinating

Group on Male Antifertility Agents, 1980), noch beim Versuchstier in vivo

(Weinbauer et al., 1983; Xue et al., 1980) oder in vitro (Zhuang et al.,

1983). Eine einzelne Studie weist die signifikante Abnahme der Testoste-

ronsynthese bei Ratten nach, die über eine Woche mit 1-10 mg/kg KG/d s.c.

behandelt wurden. Die gleiche Studie zeigt an isolierten Leydig-Zellen die

Reduktion der Steroidgenese durch die Blockierung des LH-Rezeptors

durch Gossypol (Lin, 1981). Die Autoren sind sich dabei nicht sicher, wie

der Unterschied der Ergebnisse im Vergleich zu den oben angeführten Stu-

dien zu erklären ist.

Eine eher unspezifische Wirkung des Gossypols liegt in der Reduktion des

Gewichtes von Hoden und Nebenhoden nach längerer Anwendung bei

Ratten (Srivastava, 1987). Die hervorgerufene Oligozoospermie wird be-

5 Diskussion 64

gleitet von einer erhöhten Anzahl an mißgebildeten Spermatozyten, so daß

vermutet werden kann, daß auch eine Direktwirkung auf die Spermatogene-

se besteht (Kainz et al., 1988). Die histologische Untersuchung des Hoden-

gewebes von mit Gossypol behandelten Tieren zeigt bei geringer Dosis und

kurzer Applikationsdauer keine Auffälligkeiten (Weinbauer et al., 1982).

Mit steigender Dosis kommt es dann zur Schädigung, die im Bereich des

Tubulusepithels selektiv die Sertoli-Zellen betrifft. Leydig-Zellen sind

weitaus weniger sensitiv, sowohl was deren zelluläre Struktur als auch ihre

biochemischen Leistungen betrifft. Während der Testosteronspiegel nahezu

unverändert bleibt, zeigt sich ein signifikanter Abfall der ABP-Sekretion

der Sertoli-Zellen (Zhuang et al., 1983). Dieses Ergebnis wird, wie auch

alle anderen biochemischen Wirkungen, der unspezifischen Eigenschaft des

Gossypols zugeschrieben, kovalente Bindungen mit Proteinen einzugehen

(Strom-Hansen, 1989). Daraus resultiert die Hauptwirkung des Gossypol

auf zellulärer Ebene, die Inhibition verschiedener Enzyme.

Es zeigt sich dies an der Hemmung der Mg-ATPase, Ca-ATPase (Lee et al.,

1982; Tso et al., 1982; Breitbart et al., 1984), Na+-K+-ATPase (Whaley and

Bishop, 1982; Tso et al., 1982), Pyruvat-Dehydrogenase (Adeyemo et al.,

1982) und Laktat-Dehydrogenase-X (Lee and Malling, 1981; Eliasson and

Virji, 1983).

LDH-X (LDH, EC 1.1.1.27), ein Isoenzym der Laktatdehydrogenase mit

ausschließlichem Vorkommen in reifem Hodengewebe einiger Säugetier-

spezies (Blanco and Zinkham, 1963; Goldberg, 1963), ist spezifisch für

Spermatozyten und Spermatiden und wird weder in Sertoli- noch in Leydig-

Zellen gefunden (Blackshaw and Elkington, 1970; Sarkar et al., 1978).

Gossypol besitzt eine Hemmwirkung auf dieses Enzym. Gossypol ist ein

Racemat aus einem (+) und einem (–) optischen Isomer, wobei das Ge-

misch in der Lage ist, bei Ratten, Hamstern (Chang et al., 1980; Dai et al.,

1978; Shi and Zhuang, 1980) und Mäusen (Coulson et al., 1980), nicht aber

bei Kaninchen (Chang et al., 1980), Infertilität auszulösen. Der wirksame

5 Diskussion 65

Bestandteil dabei ist das (–)-Gossypol (Wang and Lei, 1979; Waller et

al.,1983). (+)-Gossypol erwies sich als unwirksam.

Obwohl (+)-Gossypol nachweislich nicht für die In-vivo-Wirkungen des

Racemates verantwortlich ist, hat es in vitro den gleichen Effekt auf die

LDH-X-Aktivität wie sein Isomer. Es führt zur deutlichen Inhibition der

Enzymaktivität (Kim et al., 1985). Dies und die dazu in Widerspruch ste-

hende Aktivitätszunahme in vivo lassen den Schluß zu, daß die Keimzellen

nicht der wesentliche Angriffspunkt für die Gossypol-Wirkung sind.

Beim vorliegenden Versuchsmodell trat eine Steigerung der Laktatproduk-

tion ohne Abnahme der Vitalität schon bei 3 µM Gossypol auf (s. Dia-

gramm 4.1 und 4.6), was in etwa der Plasmakonzentration entspricht, die

bei Ratte und Mensch nach mehrmonatiger oraler Applikation auftritt. Hier

wurde beim Menschen nach oraler Gabe von Gossypol in einer Dosis von

20 mg/d (etwa 0,28 mg/kg KG) über 3-4 Monate gefolgt von 50-60

mg/Woche (bei Ratten nach einer Dosis von 15 mg/kg KG) eine Serumkon-

zentration von 1,7-2 µM erreicht. Bei diesen Konzentrationen kam es bei

90% aller Patienten zu Azoospermie bzw. Oligozoospermie (Coutinho et

al., 1984; Liu et al., 1987; Wang et al., 1988; Xie et al., 1990).

Einen entscheidenden Einfluß auf zellulärer Ebene scheint dabei die Beein-

flussung der Mitochondrienfunktion der Sertoli-Zellen zu haben. Gossypol

kann die oxidative Phosphorylierung im Zell-Homogenat des Hodens (Kim

and Waller, 1984) entkoppeln und somit zu einer Störung der Funktion der

Atmungskette führen (Abou-Donia and Dieckert, 1974). Die Hemmung der

Atmungskette durch Gossypol, die nicht automatisch mit der Entkopplung

der oxidativen Phosphorylierung gleichzusetzen ist, scheint relativ spezi-

fisch im Mitochondrienhomogenat des Hodens abzulaufen, ohne daß sich

eine ähnliche Wirkung in Mitochondrien der Leber darstellen läßt (Kim and

Waller, 1984). Möglicherweise ist dieser unabhängige Prozeß durch eine

Störung des Elektronentransportes an der Mitochondrienmembran verur-

5 Diskussion 66

sacht (Hansen and Jaroszewski, 1996). Der durch die Blockierung der At-

mungskette erreichte Abfall des zytoplasmatischen ATP-Spiegels kann die

Glykolyse und die Aktivität der Laktatdehydrogenase stimulieren und so

die Laktatproduktion der Zellen steigern. Damit einher geht ein Effektivi-

tätsverlust der ATP-Synthese mit Abnahme des Quotienten aus gewonnener

ATP-Menge pro Glucosemolekül. Dies wird deutlich anhand der Untersu-

chung des Glukose-Metabolismus und ATP-Gehaltes in TM4 Sertoli- und

TM3 Leydig-Zellen.

Gossypol führt hier zu einer Abnahme des intrazellulären ATP-Spiegels

(Hansen und Jaroszewski, 1996). Die nachgewiesene Steigerung der LDH-

Aktivität durch Gossypol-Applikation in vivo läßt einen ähnlichen Schluß

zu (Olgiati et al., 1984; Srivastava et al., 1988). Die Steigerung der LDH-

Aktivität läßt sich jedoch in vitro am Beispiel des LDH-X nicht bestätigen.

Auch hier scheint der Mechanismus also abhängig von der untersuchten

Zellpopulation zu sein (s.o.).

In bezug auf die Sertoli-Zellen zeigen neueste Studien eine Beeinflussung

der Ausbildung der gap-junctions unter Gossypoleinfluß, wodurch es mög-

licherweise zu weitreichenden Veränderungen der Zell-zu-Zell-

Kommunikation kommt (Herve et al., 1996). Unabhängig davon gelangt

Gossypol erst im Bereich des Nebenhodens in serumäquivalenten Konzent-

rationen in das Tubulussystem (Wang et al., 1988).

Der Schluß liegt also nahe, daß sich die Hauptwirkung nicht an Spermati-

den, sondern an den Sertoli-Zellen selbst vollzieht, zumal man an diesen

schon vor Auftreten von Schäden an anderen Zellen morphologische Ver-

änderungen beobachten konnte (Zhuang et al., 1983).

Wie schon erwähnt scheint die Beeinflussung des Glucose-Metabolismus

dabei eine große Rolle zu spielen. Die Aufnahme von Glukose in die Serto-

li-Zelle ist direkt proportional zu dessen Konzentration in der Umgebung,

wobei für den Transport durch die Zellmembran vermutlich aktive Carrier-

5 Diskussion 67

systeme verantwortlich sind (Reyes et al., 1986). Die Produktion von Laktat

mittels Glykolyse führt zur Freisetzung von Protonen, die wiederum mit

Hilfe aktiver Vorgänge aus der Zelle transportiert werden müssen. Dieser

Prozeß benötigt Energie und führt zum Absinken des extrazellulären pH-

Wertes. Somit ist er möglicherweise verantwortlich für den Rückgang der

Spermatogenese unter Gossypoleinfluß (Reyes et al., 1986). Das Anspre-

chen der Sertoli-Zellen auf Gossypol ist in dieser Studie weitaus geringer

ausgeprägt als in der vorgelegten Arbeit. Es kommt dort zu einer dosisab-

hängigen Stimulation der Laktatproduktion, die bis zur untersuchten Maxi-

malkonzentration von 40 µM etwa linear verläuft. Die Steigerung beträgt

maximal etwa 150%, während wir bei der weitaus geringeren Konzentrati-

on von 3 µM Steigerungsraten auf das 10fache nachweisen konnten (s. Dia-

gramm 4.6). Erklärt werden könnte dieser Unterschied zum einen durch die

Verwendung von transformierten Zellen (TM4 Zellen) gegenüber primären

Sertoli-Zellen (s. Kpt. 3.3) in der vorliegenden Arbeit und zum anderen

durch die geringere Inkubationszeit von nur zwei Stunden. Nach dieser Zeit

ist der Energiehaushalt der Zelle möglicherweise noch intakt, während sich

nach 24 Stunden die zytotoxische Wirkung des Gossypol bemerkbar macht.

Die Ausführungen haben gezeigt, daß die Sertoli-Zelle in Hinblick auf ihren

Energiemetabolismus eine äußerst aktive Zellart darstellt. Die weitreichen-

de Beeinflussung dieses Metabolismus ist wahrscheinlich der entscheidende

Mechanismus bei der Schädigung der Sertoli-Zellen durch Gossypol. Wa-

rum die Schädigung jedoch spezifisch bei diesen Zellen auftritt, bleibt un-

klar.

Es ist auffallend, daß eine Steigerung der Laktatproduktion durch eine Viel-

zahl verschiedener, auch physiologischerweise zirkulierender Stoffe aus-

gelöst werden kann (s. Kpt. 1). Dabei ist sehr unwahrscheinlich, daß all

diese Stoffe in gleicher Weise wie Gossypol wirksam werden. Ein mögli-

cher Erklärungsansatz ist, daß die Steigerung der Laktatproduktion eine

5 Diskussion 68

mehr oder weniger unspezifische Reaktion der hochdifferenzierten Zelle

auf eine Stressituation darstellt. Anders ausgedrückt: Die unterschiedlichen

Angriffspunkte der Stoffe auf zellulärer Ebene münden alle in einer ge-

meinsamen Endstrecke, der Steigerung der Sekretion von Laktat. Dafür

spricht, daß die Größe der Laktatproduktion ein wesentlicher Marker für die

Differenzierung der Sertoli-Zelle zu sein scheint. Bei der Untersuchung der

basalen Laktatproduktion zeigte sich bei 42 Tage alten Ratten im Vergleich

zu 18 Tage alten Ratten ein 4facher Anstieg (Jutte et al., 1983). Parallel da-

zu kommt es zu einer Abnahme der Hormonsensitivität (FSH) mit zuneh-

mendem Alter der Versuchstiere (Anthony et al., 1991). Die Steigerung

ihrer spezifischen Leistung, der Laktatproduktion für die davon abhängigen

Keimzellen, darf also nicht gleichgesetzt werden mit dem sogenannten oxi-

dativen „burn-out“ wie er z.B. bei Myozyten unter Hypoxie auftritt, und der

ebenfalls mit der Anhäufung von Laktat und damit von Protonen einhergeht

(Pfeifer und Gulotta, 1992). Mit zunehmender Dauer der Stimulation

kommt es auch bei der Sertoli-Zelle zur Erschöpfung der Energiereserven

mit Versagen der Na+-K+-ATPase und Anstieg des intrazellulären Natrium-

gehaltes (Hansen und Jaroszewski, 1996). Damit werden alle zellulären

Abläufe eingeleitet, die eine irreversible Schädigung nach sich ziehen. Dies

zeigt sich hier im MTT-Assay ab Gossypolkonzentrationen von 6 µM (s.

Diagramm 4.1).

Die untersuchten Metallionen Kobalt und Platin weisen einen vergleichba-

ren Effekt in bezug auf die Laktatsekretion auf, wenn dieser auch weit we-

niger ausgeprägt ist. Die Stimulation der Laktatproduktion erreicht dabei

allerdings kein Maximum, sondern zeigt bei diesen Substanzen einen konti-

nuierlichen Anstieg bis zu 100 µM (s. Diagramm 4.9 und 4.10).

Zur Konzentration von Kobalt in Hodengewebe und Serum der damit be-

handelten Tieren liegen keine Daten vor. Für die in vivo beobachteten Ver-

änderungen durch Kobalt – Rückgang der Spermatogenese und testikuläre

5 Diskussion 69

Atrophie – wurden anfangs Durchblutungsstörungen des Hodengewebes

durch Verursachung einer Polyzytämie und eine damit verbundene mikro-

vaskuläre Schädigung (Thrombosierung) verantwortlich gemacht (Mollen-

hauer et al., 1985). Die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse legen jedoch

nahe, daß es zusätzlich einen direkten zytotoxischen Effekt auf die Sertoli-

Zellen gibt. Dies wird bestätigt durch die histopathologischen Veränderun-

gen im Hodengewebe, die sich nach oraler Kobaltgabe bei Mäusen zeigen.

Es kommt zu Vakuolisierung der Sertoli-Zellen sowie zu Veränderungen in

peritubulären Zellen und Endothelzellen. Die Sertoli-Zellen erwiesen sich

hier zwar resistenter als andere Populationen, der schädigende Einfluß auf

sie durch Kobalt ist jedoch evident (Andersson et al., 1992). Auch bei Rat-

ten wurden morphologische Veränderungen an Sertoli-Zellen nach oraler

Kobaltzufuhr gesehen (Corrier, 1985). Die dosisabhängige Steigerung der

Laktatproduktion in der hier vorgelegten Arbeit (s. Diagramm 4.9) bestätigt

diese Beobachtungen.

Ein negativer Einfluß auf Leydig-Zellen durch Kobaltchlorid konnte eben-

falls gezeigt werden. Isolierte Zellen wurden mit verschiedenen Schwer-

metallen in einer Konzentration bis zu 100 µM inkubiert. Parallel zu einem

Absinken der Zellvitalität wurde ein Rückgang der LH-induzierten Testos-

teronproduktion durch Kobalt beobachtet. Nickel hatte dagegen keinen

Einfluß auf diese Parameter (Ng and Liu, 1990). Eine In-vivo-Studie zeigte

dagegen einen drastischen Anstieg des Testosteronspiegels bei erwachsenen

Ratten nach oraler Gabe von Kobalt ohne Veränderung des FSH- oder LH-

Spiegels. Diese Beobachtung spricht für eine Beeinflussung der lokalen

Regulation der Testosteronsynthese (Pedigo, 1988).

Die biochemische Bedeutung von Kobalt liegt in der Bildung des mit ver-

schiedenen Apoenzymen gekoppelten Coenzyms „Adenosyl-Cobalamin“.

Adenosyl-Cobalamin ist beteiligt an Umlagerungsreaktionen, bei denen

Wasserstoff und organische Gruppen (Transmethylierung) ihren Platz

wechseln (Karlson, 1988; Kpt. 5). Ob die exogene Zufuhr von Kobalt je-

5 Diskussion 70

doch Veränderungen dieser Reaktionen bzw. der Bildung des Coenzyms

mit sich bringt und auf diesem Wege den Stoffwechsel der Sertoli-Zelle

beeinflussen kann, ist spekulativ.

Einen möglichen Erklärungsansatz für die von Kobalt ausgelösten Effekte

bietet die Eigenschaft des Metalls, membranständige Kalzium-Kanäle zu

blockieren. Bei einer In-vitro-Untersuchung an Leydig-Zellen zeigte sich,

daß Kobalt eine Reduktion der LH-stimulierten und cAMP-vermittelten

Testosteronsynthese über Blockade der Kalzium-Kanäle verursacht. Dies

wird unterstützt durch die Tatsache, daß ein Abfall des extrazellulären Kal-

ziumspiegels im Hodeninterstitium ebenfalls zu einem Rückgang der Tes-

tosteronproduktion führt (Moger, 1984). Kalzium-Kanäle sind in

Zellmembranen nahezu aller somatischen Zellen lokalisiert u.a. auch Serto-

li-Zellen (Lalevee et al., 1997) und in der Mitochondrienmembran. Kalzium

spielt eine wichtige Rolle als Vermittler der Hormonwirkung in Second-

Messenger-Systemen.

Beim IP3-System kommt es durch die Vermittlung von Inositoltriphosphat,

einem weiteren „second messenger“, zur Freisetzung von Kalzium aus in-

trazellulären Speichern (Karlson, 1988; Kpt. 18). Wie oben angedeutet ist

das cAMP-System von besonderer Bedeutung für die Beeinflussung des

Kalziumtransportes durch Kobalt. Über die Vermittlung von cAMP kommt

es zur Aktivierung der Proteinkinase A, die zur Phosphorylierung des Kal-

ziumkanals und damit zu vermehrtem Einstrom von Kalzium in die Zelle

führt. Dies setzt wiederum verschiedene Zellreaktionen in Gang, so z.B. die

Steigerung der Steroidsynthese in der Leydig-Zelle (s.o.). Hohe Kalzium-

spiegel wiederum führen zu einer Aktivierung der Phosphodiesterase, die

das entstandene cAMP abbaut.

Eine Untersuchung des Kalziumflusses an den Zellmembranen von isolier-

ten Sertoli-Zellen zeigt auch hier das Vorhandensein von Kalziumkanälen,

die sich sowohl durch Kobalt- als auch durch Nickelionen hemmen lassen.

Diese Kanäle scheinen allerdings nicht direkt unter dem Einfluß von FSH

5 Diskussion 71

zu stehen (Lalevee et al., 1997). Der initial beobachtete Anstieg der Inhi-

binproduktion durch Kobaltchlorid (s. Diagramm 4.13) ist damit nicht über

eine Beeinflussung der FSH-Wirkung auf die Sertoli-Zelle zu erklären, die

im Sinne einer Inhibition eher zu einer Abnahme der Inhibin-Sekretion

hätte führen müssen.

Die Vielschichtigkeit der Aufgaben des Kalziums bei der intrazellulären

Signalübertragung läßt annehmen, daß die Blockade der Kalzium-Kanäle

durch Kobaltchlorid dennoch gerade bei hormonsensitiven Zellen wie den

Sertoli-Zellen Auswirkungen haben könnte. Eine Direktwirkung von Kobalt

konnte allerdings auch auf humane Spermatozoen nachgewiesen werden.

Kobalt bindet an die Sulfhydryl-Gruppen der Zellmembranen von Sperma-

tozoen und führt damit zur Inhibition verschiedener Enzyme (Nivsarkar,

1998).

Für Platinverbindungen, insbesondere für cis-Platin, wurde die In-vivo- und

In-vitro-Wirksamkeit mit spezieller Schädigung der Sertoli-Zellen schon

belegt. Nach vierwöchiger cis-Platin-Gabe an Ratten kommt es zum Rück-

gang der Spermienzahl und zu histopathologischen Veränderungen in Form

von Vakuolisation von Spermatozyten, Spermatiden und Sertoli-Zellen

(Mizoguchi et al., 1995). Weiterhin kommt es zum Abfall des Testosteron-

spiegels im Serum, wahrscheinlich bedingt durch eine Verringerung der

Anzahl testikulärer LH-Rezeptoren, die vornehmlich an Leydig-Zellen lo-

kalisiert sind. LH- und FSH-Spiegel bleiben allerdings unverändert (Maines

et al., 1990). Die elektronenmikroskopische Untersuchung des Tubuluse-

pithels zeigt vor allem Schäden an den Sertoli-Zellen mit Auflösung der

tight junctions. Der ebenfalls verzeichnete Anstieg des Natrium- und Abfall

des Kaliumgehaltes der Tubulusflüssigkeit unter Einfluß von cis-Platin wird

von den Autoren als Hinweis für die gestörte biochemische Leistung der

Sertoli-Zellen angesehen (Pogach et al., 1989). Außerdem beobachtet wird

eine strukturelle Störung der Sertoli-Zelle mit Desintegration des Zyto-

5 Diskussion 72

plasmas und Pyknosis. Damit kommt es zur Zerstörung der Blut-Hoden-

Schranke und zur Beeinflussung von Spermatogenese und Spermiohistoge-

nese durch cis-Platin (Kopf-Maier, 1992). Dies wird bestätigt durch den

nachgewiesenen Anstieg der FSH-Ausschüttung bei entsprechend lange und

hochdosiert behandelten Tieren (Fuse et al., 1996). Eine einzelne In-vitro-

Studie mit Hexachloroplatinsäure an humanen Spermatozoen zeigt eine In-

duktion der Akrosomenreaktion noch vor Auftreten zytotoxischer Effekte

(Köhn et al., 1995), so daß es Anhaltspunkte für eine reproduktionsbiologi-

sche Bedeutung dieser Substanz gibt. Die Feststellung, daß Platin toxikolo-

gisch unbedenklich sei (Hollemann, 1995; Kpt. XXXI) kann daher nicht auf

die hier verwendete Hexachloroplatinsäure übertragen werden. In-vitro-

Studien an Sertoli-Zellkulturen mit Hexachloroplatinsäure liegen bisher

nicht vor. Ebenso gibt es keine Daten über Serumspiegel oder Gewebskon-

zentrationen dieser Substanz.

Die fehlende Abnahme der Zellvitalität bei gleichzeitigem Anstieg der

Laktatproduktion sowohl bei Kobalt als auch bei Platin lassen den Schluß

zu, daß die hier verwendeten Konzentrationen noch nicht ausreichen, um

einen unspezifischen zytotoxischen Effekt zu erzielen, wohl aber, um mit

biochemischen Prozessen der Zelle zu interagieren (s. Diagramm 4.4 und

4.5). Inwieweit dafür ein ähnlicher Mechanismus verantwortlich ist, wie er

für Gossypol postuliert wird, ist unklar, zumal beide Substanzen zu einer

Steigerung der mitochondrialen Aktivität führen, während es bei Gossypol

zu einer Abnahme derselben gekommen war. Aufschlußreich ist in diesem

Zusammenhang eine Studie, bei der die Wirkung verschiedener Substanzen

auf ein LDH-Isoenzym aus dem Hoden getestet wurde. Unter anderem

wurden hier auch Platinverbindungen und Gossypol untersucht. Es zeigte

sich, daß Platin die Hinreaktion (Pyruvat-Laktat) hemmte, während Gossy-

pol sowohl Hin- als auch Rückreaktion negativ beeinflusste (Javed and

Waqar, 1996). Dies ist zwar für die Wirkung von Gossypol nicht der ent-

5 Diskussion 73

scheidende Faktor, gibt aber einen Hinweis auf ähnliche Mechanismen der

Wirkungsweise von Gossypol und Platin. Eine Erklärung für den beobach-

teten Anstieg der Laktatproduktion (s. Diagramm 4.10) bietet dies nicht, es

ist jedoch ein Beleg für die mögliche Interaktion mit dem Glucosestoff-

wechsel.

Der Rückgang der Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen im MTT-

Assay durch Gossypol wird bestätigt durch die Arbeiten von Kim and

Waller (1984), die eine selektive Aktivitätsminderung von Enzymen der

Atmungskette in vivo zeigen. Die Mitochondrien werden, wie schon darge-

stellt, als subzelluläres Ziel der Gossypolwirkung angesehen. Die Steige-

rung der Aktivität der Dehydrogenasen durch Kobalt und Platin wirft die

Frage auf, ob diese Substanzen möglicherweise auch durch eine Beeinflus-

sung der Mitochondrienfunktion ihre Wirkung entfalten, oder ob ein eher

unspezifischer Effekt im Sinne einer generellen Stimulation der Zellfunkti-

on vorliegt.

Der komplexe Sachverhalt ist mit Hilfe der vorhanden Daten nicht zu ent-

scheiden. Zu diesem Zweck wäre es nötig, weitere Parameter der Zellfunk-

tion unter Einfluß dieser Metalle zu untersuchen.

Der negative Einfluß von Blei auf die Spermatogenese ist unstrittig (Ale-

xander et al., 1996; Lancranjan et al., 1975). Der Mechanismus der Schädi-

gung bleibt jedoch nach wie vor unklar. Histologische Untersuchungen

kommen zu unterschiedlichen Ergebnissen. Bei Affen führt die orale Zu-

fuhr von Bleiazetat in einer Dosis von 1500 µg/kgKG/d für 400 Tage zu

deutlichen morphologischen Veränderungen der Sertoli-Zellen mit ver-

mehrtem Auftreten von Lipideinschlüssen, lysosomalen Elementen und

Störung der Struktur der Basalmembran (Singh et al., 1993). Zu vergleich-

baren Ergebnissen kommen Murthy et al. (1991) bei Ratten nach Gabe von

Bleiazetat mit dem Trinkwasser in einer Dosis von 250 ppm/d für 70 Tage.

5 Diskussion 74

Ebenfalls bei Ratten (60 µg/d Bleiazetat für 18 Monate p.o.) zeigen sich

strukturelle Veränderungen der Sertoli-Zellen, ohne daß weitere Zellpopu-

lationen, z.B. Leydig-Zellen, betroffen sind (Boscolo et al., 1988). Eine

ähnliche Studie mit neunmonatiger oraler Gabe von Bleiazetat in 1%iger

wässriger Lösung führt dagegen weder zu elektronenmikroskopisch nach-

weisbaren ultrastrukturellen Veränderungen des Tubulusepithels, noch zur

Schädigung von Sertoli- oder Leydig-Zellen (Wenda-Rozewicka et al.,

1996).

Zur In-vitro-Toxizität liegen bisher nur wenige Daten vor. Wiebe et al.

(1983) weisen die Reduktion der FSH-Rezeptor-Bindung und den damit

verbundenen Abfall von cAMP sowie den Rückgang des Steroidmetabo-

lismus (Konversion von Progesteron zu Steroid-Metaboliten) bei Sertoli-

Zellen in vitro nach Bleiinkubation nach.

Es liegen mehrere Studien vor, in denen auf die Konzentration von Blei in

Serum und Sperma und die möglicherweise dosisabhängigen Effekte auf

das männliche Reproduktionssystem eingegangen wird. Bei Arbeitern einer

Bleischmelze zeigten sich beispielsweise signifikante Auswirkungen ab

einem Bleispiegel von 40 µg/dl im Serum (Alexander et al., 1996). Dies

entspricht etwa 1 µM.

Die Inkubation mit Bleiazetat führte in keiner der bei der vorliegenden Ar-

beit verwendeten Konzentrationen (5-100 µM) zu einer signifikanten Ände-

rung der Laktatproduktion (s. Diagramm 4.7). Dies steht im Widerspruch zu

den Ergebnissen von Bartaseh et al. (1986), die ebenfalls in vitro eine do-

sisabhängige Zunahme der Laktatproduktion ab 50 µM Bleiazetat nachwei-

sen konnten. In dieser Studie wird außerdem kein Einfluß auf die

Zellvitalität gefunden, während in der vorliegenden Arbeit ein Rückgang

um bis zu etwa 60% (100 µM) nachgewiesen werden kann (s. Diagramm

4.2). Verantwortlich für die Diskrepanz der Ergebnisse könnten methodi-

sche Unterschiede sein. Zum einen wurde die Vitalitätsbestimmung mit der

Trypan-Blau-Färbung durchgeführt, zum anderen betrug die Inkubationszeit

5 Diskussion 75

maximal 12 Std., so daß später auftretende Effekte nicht berücksichtigt we-

den konnten. Die Autoren geben in der Diskussion ihrer Arbeit an, daß In-

kubation für 24 Std. durchaus zu einer Abnahme der Vitalität geführt hätte.

Das spricht dafür, daß der wesentliche Einfluß auf die Vitalität erst nach

Inkubationszeiten >12 Std. zum tragen kommt. Die Kontamination mit

Keimzellen könnte ein weiterer Faktor für die unterschiedlichen Ergebnisse

sein. Eine hypotone Behandlung der Zellen wurde in dieser Studie nicht

durchgeführt. Es ist jedoch bekannt, daß die Sertoli-Zellfunktion durch die

Anwesenheit von Keimzellen in der Zellkultur moduliert wird. Unter ande-

rem wird die Inhibinsekretion dadurch um etwa 40% gesteigert (Carreau et

al., 1996).

Der fehlende Einfluß auf die Laktatproduktion und der mit der Vitalitätsab-

nahme verbundene Rückgang der Inhibinsekretion nach Inkubation mit

Bleiazetat führt zu keiner weiteren Klärung der Frage nach dem Schädi-

gungsmechanismus durch Blei. Möglicherweise kann die Konstanz der

Laktatwerte bei abnehmender Vitalität der Zellen als relative Steigerung der

Produktion angesehen werden. Zur weiteren Klärung wäre es sinnvol,l die

Laktatproduktion und die Vitalität in verschiedenen Zeitintervallen zu ü-

berprüfen.

Unter Berücksichtigung der Ergebnisse der angeführten Studien und der in

der vorliegenden Arbeit dargestellten Resultate ist es also nach wie vor un-

klar, ob die Sertoli-Zelle die Zielzelle für den schädigenden Einfluß von

Blei auf die Spermatogenese ist.

Mikrovaskuläre Veränderungen, wie sie für die neurogenen Schäden nach

chronischer Bleiexposition verantwortlich gemacht werden, sind bisher an

den männlichen Reproduktionsorganen nicht untersucht worden.

Die Inhibinproduktion als spezifischer Parameter für die Sertoli-Zelle rea-

giert unterschiedlich auf die eingesetzten Noxen. Die Abnahme der Sekreti-

on unter Gossypoleinfluß korelliert, ähnlich wie schon bei Bleiazetat

5 Diskussion 76

erwähnt, mit der parallel dazu verzeichneten Reduktion der Zellvitalität. Bei

einer Konzentration von 3 µM (bei der kein Einfluß auf die Vitalität der

Zellen zu sehen ist) zeigt sich tendenziell eine Abnahme der Inhibinpro-

duktion ohne statistische Relevanz (s. Diagramm 4.11). Eine Aussage über

die selektive Wirkung auf die Inhibinproduktion ist daher nicht möglich.

Die einzig vorliegende Arbeit zu diesem Thema kommt zu einem ähnlichen

Ergebnis. Das dort verwendete Cadmiumchlorid führt in vitro bei Sertoli-

Zell-Kulturen dosisabhängig zu einer Abnahme der Inhibinsekretion paral-

lel zum Vitalitätsverlust (Janecki et al., 1992), ebenfalls bestimmt mit dem

MTT-Assay. Über einen mit dem Inhibinabfall verbundenen Anstieg der

hypophysären FSH-Sekretion unter Gossypol-Einfluß kann nur spekuliert

werden, da In-vivo-Studien abhängig von der jeweiligen Versuchsanord-

nung zu unterschiedlichen Ergebnissen kommen. Die orale Gabe von 15

mg/kg KG über 16 Wochen führt zu signifikanter Zunahme des FSH-

Spiegels bei Ratten (Kainz et al., 1988). Baba (1988) beobachtet dagegen

bei einer Dosis von 20 mg/kg KG über zwei Wochen einen erniedrigten

FSH-Spiegel. Unverändert zeigt sich die FSH-Produktion nach 10-

20wöchiger Gabe einer Dosis von 2,5-30 mg/kg/d (Weinbauer et al., 1983).

Ähnlich widersprüchliche Ergebnisse liegen für Bleiazetat vor. Assenato et

al (1987) berichten über unveränderte Spiegel an FSH, Testosteron, LH und

Prolaktin bei einer Gruppe von 18 Arbeitern einer Batteriefabrik in Italien

mit signifikant erniedrigten Spermienzahlen (45 versus 73x106 per ml in der

Kontrollgruppe). Auch Alexander et al. (1996) sehen keine Korrelation

zwischen bleiinduziertem Fertilitätsrückgang und Veränderungen der Sexu-

alhormone.

Die Annahme, eine Störung der hypophysär-gonadalen Achse sei verant-

wortlich für die durch Blei hervorgerufenen Effekte wird dagegen unter-

stützt durch den Nachweis des Anstiegs der mRNA für GnRH und LH unter

steigenden Bleiserumkonzentration bei Ratten (Klein et al, 1994). Thoreux-

Manlay et al. (1995) detektierten einen Rückgang der Testosteronprodukti-

5 Diskussion 77

on um etwa 80% und einen Abfall der LH-Freisetzung um 32% nach oraler

Gabe von Blei in einer Dosis von 8 mg/kg/d für 35 Tage. Sie postulieren

eine Störung der Leydig-Zellfunktion als verantwortlich für die Schädigung

durch Blei.

Nathan et al. (1992) konnten in einer In-vivo-Studie (Bleiazetat, 1%ige

Lsg., 10 Wochen, erwachsene Tiere) keine Veränderung der Sertoli-Zell-

Marker-Proteine ABP (Androgen-Binding-Protein) und Inhibin in der Tu-

bulusflüssigkeit und der interstitiellen Flüssigkeit feststellen. Die Autoren

selbst führen ihre Ergebnisse auf die unterschiedliche Sensibilität der Ser-

toli-Zellen auf Blei bei Erwachsenen und Jungtieren zurück.

Ein Schlüssel zum Verständnis dieser widersprüchlichen Ergebnisse könnte

die Annahme unterschiedlicher Wirkungsmechanismen in Abhängigkeit

von Dosis und vor allem Expositionsdauer bei den einzelnen Individuen

und Gattungen sein. Es ist kaum anzunehmen, daß beruflich exponierte

Menschen Blei in einer Größenordnung inkorporieren, wie dies im Tierver-

such der Fall ist. Versuche, bei denen dieser Sachverhalt ausreichend be-

rücksichtigt werden kann, sind jedoch zeit- und kostenintensiv.

Die Schwermetallsalze Hexachloroplatinsäure und Kobaltchlorid zeigen

einen zweiphasigen Einfluß auf die Inhibinsekretion der Zellen ohne nach-

weisbaren Vitalitätsverlust im MTT-Assay. Nach Anstieg im niedrigen

Konzentrationsbereich (Hexachloroplatinsäure, 5 µM; Kobaltchlorid,

5-25 µM) kommt es bei höherer Dosierung zu einem Abfall der Inhibinpro-

duktion (s. Diagramm 4.13 und 4.14). Bei Kobalt werden bei 50 und

100 µM basale Werte erreicht, während bei Hexachloroplatinsäure schon

bei 10 µM die Werte der Kontrollgruppe erreicht werden und bei 25 bis

100 µM signifikant niedrigere Werte zu verzeichnen sind.

Damit wird zum ersten Mal eine Steigerung der Inhibinproduktion durch

ein schädigendes Agens in vitro an Sertoli-Zellen nachgewiesen. Bei der In-

vitro-Testung der bekannten testikulären Noxen meta-Dinitrobenzol

5 Diskussion 78

(mDNB) und Nitrobenzol (NB) zeigte sich eine nur geringe oder gar keine

Beeinflussung der Inhibinsekretion, wobei die Ergebnisse stark von den In-

vivo-Ergebnissen abwichen (Allenby et al., 1989; Allenby et al., 1991;

Maddocks et al., 1992). Nicht zuletzt deshalb ist die Relevanz der Steige-

rung der Inhibinproduktion durch Kobalt und Platin für das In-vivo-System

fraglich. Eine Schädigung des Reproduktionsapparates durch Supression

der FSH-Sekretion und damit verbundener Abnahme der Sertoli-

Zellaktivität erscheint jedoch möglich. Die wenigen vorliegenden Daten

über den Einfluß dieser Salze auf die Sertoli-Zellfunktion erlauben es an

dieser Stelle nicht, ein abschließendes Urteil abzugeben. Der für Platinver-

bindungen (insbesondere cis-Platin) sicher nachgewiesene reproduktionsto-

xische Effekt aber ist damit möglicherweise auf seine Beeinflussung der

Sertoli-Zelle zurückzuführen. Ob Kobalt in gleicher Weise wirksam wird

oder, wie oben angedeutet, über die Blockade von Kalziumkanälen Einfluß

nimmt, kann nicht eindeutig beantwortet werden. Die Reduktion der Tes-

tosteronsynthese der Leydig-Zellen über diesen Mechanismus scheint aller-

dings gesichert (Moger, 1983), so daß eine indirekte Beeinflussung der

Sertoli-Zellen wahrscheinlich ist. Kobalt ist außerdem in der Lage, selektiv

das im Hoden vorkommende Isoenzym des Angiotensin-Converting-

Enzyms zu hemmen (Velletri et al., 1985). Die Rolle von Kobalt als Enzy-

minhibitor und die biochemische Grundlage, auf welcher sich diese Wir-

kung vollzieht, ist noch nicht abschließend untersucht.

Nickelazetat hatte trotz seiner großen toxischen Potenz auf andere Organ-

systeme (s. Kpt. 1.1.2) kaum einen nennenswerten Einfluß auf die hier un-

tersuchten Parameter. Lediglich bei hohen Konzentrationen zeigte sich eine

geringe Steigerung der Laktatproduktion. Nickelazetat blieb ohne Einfluß

auf Vitalität oder Inhibinproduktion der Zellen (s. Diagramm 4.3 und 4.15).

Neueste Untersuchungen zeigen allerdings durchaus eine reproduktionsto-

xikologische Bedeutung von Nickel. Bei Ratten führte die orale Zufuhr von

5 Diskussion 79

Nickelsulfat in 10 Dosen zu 2 mg pro g Körpergewicht zu einer Abnahme

des Hodengewichtes und der Aktivität der LDH im Hodengewebe. Es kam

außerdem zur Kumulation von Glykogen und Cholesterin, was eine Beein-

flussung des Metabolismus der Zellen wahrscheinlich macht (Das and Das-

gupta, 1997). Nach Gabe von Nickelsulfat kommt es außerdem zu einem

Rückgang der Spermienmotilität und der Spermienzahl. Die Akkumulation

von Nickel im Testis und histopathologische Veränderungen des Hodenge-

webes konnten ebenfalls nachgewiesen werden (Pandey et al., 1999). Zu

ähnlichen Ergebnissen kommt eine andere Arbeit, bei der Nickelchlorid p.o.

bei Ratten zur Abnahme der Fertilität, zur Atrophie der Hodentubuli und

zum Rückgang der Zahl der basalen Spermatogonien führte (Kakela et al.,

1999). Auf diesem Hintergrund und in Anbetracht der oben schon erwähn-

ten Studie, in der eine Blockade von Kalzium-Kanälen an der Sertoli-Zelle

auch durch Nickel (Lalevee et al., 1997) nachgewiesen wurde, kann die

Steigerung der Laktatproduktion bei hohen Nickelkonzentrationen (s. Dia-

gramm 4.8) als erster Hinweis für eine Beeinflussung der Sertoli-Zelle gel-

ten.

6 Zusammenfassung 80

6 Zusammenfassung

In den letzten Jahren ist es gerade in den entwickelten Industrienationen zu

einem Anstieg der Zahl infertiler Paare gekommen. Der Grund dafür ist in

etwa 40% der Fälle bei den Männern zu suchen. Die Ursachen für Infertili-

tät allerdings sind vielfältig. Umweltschadstoffe die vor allem bei der in-

dustriellen Fertigung, durch Verbrennungsmotoren, in der Landwirtschaft

etc. entstehen bzw. freigesetzt werden, scheinen dabei eine besondere Rolle

zu spielen. Zur Gruppe der Umweltschadstoffe, die schon lange bekannt

sind, zählen die Schwermetalle.

Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Evaluierung eines Testmodells,

das die Auswirkungen von Schwermetallsalzen und der Substanz Gossypol

auf die biochemischen Leistungen und die Vitalität von Sertoli-Zellen un-

tersucht. Die Integrität dieser Zellen stellt eine wesentliche Voraussetzung

für den ungestörten Ablauf der Spermatogenese dar.

Die Versuche wurden an Sertoli-Zellmonokulturen durchgeführt, die vorher

aus dem Hoden 18 Tage alter Spraque-Dawley-Ratten isoliert worden wa-

ren. Die Substanzen wurden dazu in fünf Konzentrationen (Metallionen 5-

100 µM; Gossypol 3-15 µM) in Medium gelöst und die Zellen dann für 24

Stunden damit inkubiert. Danach wurde der Proteingehalt mit der Methode

nach Lowry und die Vitalität der Zellen mit dem MTT-Assay untersucht.

Desweiteren wurde die Laktatproduktion als metabolischer und die Inhi-

binproduktion als endokriner Parameter bestimmt. Dazu wurde zum einen

ein gekoppelter Enzym-Assay, zum anderen ein RIA verwendet.

Gossypol, ein Bestandteil des Baumwollsamens, diente dabei als Positiv-

kontrolle, da seine reproduktionstoxische Wirksamkeit insbesondere in

Hinblick auf die Sertoli-Zelle schon lange bekannt und in vielen Studien

nachgewiesen ist. Die Ergebnisse der Untersuchungen stellen sich folgen-

dermaßen dar:


Gossypol führte in hohen Konzentrationen zu einem deutlichen Rückgang

der Zellvitalität um maximal 70%. Bei den Schwermetallsalzen konnte nur

Bleiazetat die Vitalität (maximal um etwa 50%) negativ beeinflussen, wäh-

rend Hexachloroplatinsäure und Kobaltchlorid sogar zu einer Steigerung

der im MTT-Assay gemessenen Aktivität der mitochondrialen Dehydroge-

nasen führten. Nickelazetat beeinflußte die Vitalität nicht.

Bis auf Bleiazetat waren alle Stoffe in der Lage, die Laktatproduktion der

Zellen zu steigern. Gossypol hatte dabei mit einer Steigerung auf das ma-

ximal 15fache den stärksten Einfluß. Der Anstieg der Laktatproduktion, der

durch Metalle erreichet wurde, war etwa um den Faktor 10 geringer. Er lag

zwischen dem 1,5- und 2,5fachen der Kontrolle. Die Inhibinproduktion

ging unter dem Einfluß von Gossypol und Bleiazetat parallel zum be-

obachteten Vitalitätsabfall zurück. Bei Hexachloroplatinsäure und Kobalt-

chlorid zeigt sich ein zweigipfliger Verlauf. Nach einer initialen Steigerung

kommt es bei höheren Konzentrationen wieder zum Rückgang der Inhi-

binproduktion. Damit wurde zum ersten Mal die Steigerung der Inhibin-

sekretion der Sertoli-Zellen unter Einfluß eines schädigenden Agens in vitro

detektiert. Die Untersuchungsergebnisse für die Referenzsubstanz Gossypol

entsprechen weitestgehend dem Forschungsstand, der in der Literatur be-

schrieben ist.

Die Interpretation der Daten vor allem in Hinblick auf den zellulären An-

griffspunkt der unterschiedlichen Substanzen ist schwierig. Von Gossypol

ist bekannt, daß ein wesentlicher Wirkmechanismus die Hemmung der At-

mungskette darstellt und daß die exorbitante Steigerung der Laktatproduk-

tion im wesentlichen darauf zurückzuführen ist. Ob dies auch bei den

Metallen der Fall ist, oder ob sie über andere Mechanismen wie z.B. die

Blockade von membranständigen Kalzium-Kanälen ihre Wirkung entfalten,

kann nicht abschließend geklärt werden.

Festzuhalten bleibt, daß die Laktat- und Inhibinbestimmung in Zusammen-

hang mit den Vitalitätswerten eine valide Aussage über die toxische Potenz


einer Substanz in bezug auf die Sertoli-Zelle zuläßt. Die Inhibinsekretion

scheint dabei der noch sensitivere Parameter zu sein.

Durch die ergänzende Messung weiterer Parameter und die zusätzliche

Verwendung des aktuellen Inhibin-ELISA (s. Kpt. 1.2.2) steht damit ein

effizientes Testmodell zur Verfügung. Die Etablierung des Testsystems

konnte also erfolgreich durchgeführt werden. Praxistauglichkeit und Zeit-

aufwand hielten sich dabei im Rahmen der anfänglichen Zielformulierung.

7 Veröffentlichungen 83

7 Veröffentlichungen

Folgende Teile der Dissertation sind bereits veröffentlicht bzw. zum Druck

eingereicht:

7.1 Publikationen

7.1.1 Monsees TK, Winterstein U, Hayatpour J, Miska W, Schill WB

(1998) Einfluß von Umweltnoxen auf die Funktion testikulärer Zellen.

Fertilität 13, 75-78.

7.1.2 Monsees TK, Winterstein U, Schill WB, Miska W (1998) Influence

of gossypol on the secretory function of cultured Sertoli cells. Toxi-

con 36, 813-816.

7.1.3 Monsees TK, Winterstein U, Hayatpour J, Schill WB, Miska W

(1998) Effects of heavy metals on the secretory function of testicular

cells in culture. J Trace Microprobe Techn 16, 427-435.

7.1.4 Monsees TK, Franz M, Gebhardt S, Winterstein U, Schill WB, Ha-

yatpour J (2000) Sertoli cells as target for reproductive hazards. An-

drologia, in press.

7.2 Publizierte Abstracts

7.2.1 Monsees TK, Winterstein U, Schill WB, Miska W (1996) Effects of

gossypol on rat Sertoli cells secretory function. Human Reprod 11,

111.

7.2.2 Monsees TK, Winterstein UM, Miska W, Schill WB (1998)

Influence of metal ions on the secretory function of cultured Sertoli

cells. Andrologia 30, 171.

8 Literaturverzeichnis 84

8 Literaturverzeichnis

1. Abou-Donia MB, Othman MA, Obih P (1989) Interspecies comparison

of pharmacocinetic profile and biovailability of (±) gossypol in male

Fisher-344 rats and male B6C3F mice. Toxicol 55, 33-38.

2. ACGIH (1996) Threshold Limit Values (TLVs[R]) for Chemical Sub-

stances and Physical Agents and Biological Exposure indices

(BEI[R]). Am conference Govt Ind Hyg, Inc, Cincinnati, OH.

3. Alexander BH, Checkoway H, van Netten C, Muller CH, Ewers TG,

Kaufman JD, Mueller BA, Vaughan TL, Faustman EM (1996) Se-

men quality of men employed at a lead smelter. Occupat Environm

Med 53, 411-416.

4. Allenby G, Foster PM, Sharpe RM (1991) Evaluation of changes in the

secretion of immunoactive inhibin by adult rat seminiferous tubules

in vitro as an indicator of early toxicant action on spermatogenesis.

Fundam Appl Toxicol 16 (4), 710-724.

5. Allenby G, Sharpe RM, Foster PMD (1990) Changes in Sertoli cell

function in vitro induced by nitrobenzene. Fundam Appl Toxicol 14,

364-375.

6. Anderson MB, Pedigo NG, Katz RP, George WJ (1992) Histopathology

of testes from mice chronically treated with cobalt. Reprod Toxicol

6 (1), 41-50.

7. Anthony CT, Rosselli M, Skinner MK (1991) Actions of the testicular

paracrine factor (P-Mod-S) on Sertoli cell transferrin secretion

throughout pubertal development. Endocrinology 129 (1), 353-360.

8. Assennato G, Claudio P, Molinini R, Candela RG, Baser ME, Altamura

BM, Giorgino R (1986) Sperm count suppression without endocrine

dysfunction in lead-exposed men. Arch Environ Health 41, 387-390.


9. Baba Y (1988) Effect of HCG administration in the gossypol treated

male rats. Hinyokika-Kiyo 34, 643-647.

10. Batarseh LI, Welsh MJ, Brabec MJ (1986) Effect of lead acetate on

Sertoli cell lactate production and protein synthesis in vitro. Cell Biol

Toxicol 2, 283-292.

11. Blackshaw AW, Elkington JSH (1970) Developmental changes in LDH

isoenzymes in the testis of the immature rat. J Reprod Fertil 22, 69-75.

12. Blanco A, Zinkham WH (1963) Lactate dehydrogenase in the human

testis. Science 139, 601-602.

13. Boekelheide K (1993) Sertoli cell toxicants. In: The Sertoli cell, eds.

LD Russel and MD Griswold, 551-575. Cace River Press, Clearwa-

ter.

14. Boscolo P, Carmignani M, Sacchettoni-Logroscino G, Rannelletti FO,

Artese L, Preziosi P (1988) Ultrastructure of the testis in rats with

blood hypertension induced by long-term lead exposure. Toxicol Lett

41 (2), 129-137.

15. Braunstein CG, Dahlgren J, Loriaux DL (1978) Hypogonadism in chro-

nically lead poisened men. Infertility 1, 33-51.

16. Breitbart H, Rubinstein S, Nass-Arden L (1984) Effect of gossypol ace-

tic acid on calcium transport and ATPase activity in plasma

membrans from ram and bull spermatozoa. Int J Andro 7, 439-447.

17. Burton K (1956) A study of the conditions and mechanism of the

diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of desoxyribo-

nucleicacid. Biochem J 62, 315-321.

18. Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek N (1992) Evidence

for decreasing quality of semen during past 50 years. B Med J 305,

609-613.

19. Carreau S (1995) Human Sertoli cells produce inhibin in vitro: an addi-

tional marker to assess the seminiferous epithelium development.

Hum Reprod 10, 1947-1949.


20. Carreau S, Drosdowsky MA, Foucault P (1996) Enzymatic properties of

adult human Sertoli cells in vitro. Andrologia 28, 91-97.

21. Chang MC, Gu Z, Saksena SK (1981) Effects of Gossypol on the fertili-

ty of male rats, hamsters and rabbits. Contraception 21, 461-470.

22. Chapin RE, Gray TJB, Phelps JL, Dutton SL (1988) The Effects of mo-

no-(2-ethylhexyl)-phthalate on rat Sertoli cell-enriched primary cultu-

res Toxicol Appl Pharmacol 92, 467-479.

23. Chapin RE, Phelps JL, Somkuti SG, Heindel JJ, Burka LT (1990) The

interaction of Sertoli and Leydig Cells in the testicular toxicity of Tri-

o-crescyl phosphate. Toxicol Appl Pharmacol 104, 483-495.

24. Clayton DG, Kaldor JM (1987) Diagnostic plots for departures from

proportional hazards in cohort study data. J Chronic Dis 40 (2), 125-

132.

25. Corrier DE, Mollenhauer HH, Clark DE, Hare MF, Elissalde MH

(1985) Testicular degeneration and necrosis induced by dietary

cobalt. Vet Pathol 22 (6), 610-616.

26. Coulson PB, Snell RL, Parise C (1980) Short term metabolic effects of

the antifertility agent gossypol on various reproductive organs of

male mice. Int J Androl 3, 507-518.

27. Coutinho EM, Melo JF, Barbosa I, Segal SJ (1984) Antispermatogenic

action of Gossypol in men. Fertil Steril 42, 424-430.

28. Cullen MR, Kayne RD, Robins JM (1984) Endocrine and reproductive

dysfunction in men associated with occupational inorganic lead in-

toxication. Arch Environ Health 39, 431-440.

29. Dai R, Pang S, Lin X, Ke Y, Liu Z, Dong R (1978) A study of antiferti-

lity of cottonseed. Acta Biol Exp Sinica 11, 8-11.

30. Dass KK, Dasgupta S (1997) Alteration of testicular biochemistry du-

ring protein restriction in nickel treated rats. Biol Trace Elem Res

60 (3), 243-249.


31. De Kretser DM, McFarlane JR (1996) Inhibin in the Male. Journal of

Andrology 17 (3), 179-182.

32. Drummond GS, Smith TJ, Kappas A (1996) Effects of a series of metal-

loporphyrins on adrenal, testicular and thyroid function in rats. Phar-

macology 52 (3), 178-186.

33. Dym M, Fawcett DW, (1970) The blood-testis barrier in the rat and the

physiological compartmentation of the seminiferous epithelium. Biol

Reprod 3 (3), 308-326.

34. Eaton M, Schenker M, Whorton MD, Samuels S, Perkins C, Overstreet

J (1986) Seven-years follow-up of workers exposed to 1,2-dibromo-3-

chloropropane. J Occupat Med 28 (11), 1145-1150.

35. Eramaa M, Heikinheimo K, Voutilainen R (1992) Developmental and

cyclic adenosine 3´,5´monophosphate-dependent regulation of inhi-

bin subunit messenger ribonucleic acids in human fetal testis. J Clin

Endocrinol Metab 75 (3), 806-811.

36. Fakunding JL, Tindall DJ, Dedman JR, Mena CR, Means AR (1976)

Biochemical actions of follicle stimulating hormone in the Sertoli cell

of the rat testis. Endocrinology 98, 392-402.

37. Farrow S (1994) Falling sperm quality: fact or fiction? Brit Med J 309,

1-2.

38. Foster WG, Mc Mahon A, Young Lai EV, Hughes EG, Rice DC (1993)

Reproductive endocrine effects of chronic lead exposure in the male

cynomolgus monkey. Reprod Toxicol 7 (3), 203-209.

39. Foucault P, Drosdowsky MA, Carreau S (1994) Germ cell and Sertoli

cell interactions in human testis: evidence for stimulatory and inhibi-

tory effects. Human Reproduction 9 (11), 2062-2068.

40. Fritz IB, Kopec B, Lam K, Vernon RG (1974) Effects of FSH on levels

of androgen binding proteins in the testis. In: Hormone Binding and

Target Cell Activation in the Testis, eds. ML Dufau and AR Means,

311-327. Plenum, New York.


41. Fuse H, Fujiuchi Y, Junicho A, Iwasaki M, Katayama T (1996) Effect

of carboplatin on rat spermatogenesis. Urol Int 56, 219-223.

42. Galdieri M, Ziparo E, Palombi F, Russo MA, Stefani M (1981) Pure

Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell

interactions. J Androl 5, 249-254.

43. Goldberg E (1963) Lactate and malic dehodrogenase in human spertma-

tozoa. Science 139, 602-603.

44. Gui-Yuan Z, Meng-Chun J, Jin-Lai C, Wen-Qing Y (1989) The effect

of long-term treatment with crude cotton seed oil on pituitary and te-

sticular function in men. Intern J Androl 12, 404-410.

45. Hadley MA, Byers SW, Suarez-Quian CA, Kleinmann HK, Dym MC

(1985) Extracellular matrix regulates Sertoli cell differentiation, te-

sticular cord formation, and germ cell development in vitro. J Cell

Biol 101, 1511-1522.

46. Hansen LL, Jaroszewski JW (1996) Effect of gossypol on cultured TM3

Leyding and TM4 Sertoli cells: P31 and 23Na NMR study. NMR Bio-

med 9, 72-78.

47. Hansen PV, Hansen SW (1993) Gonadal function in men with testicular

germ cell cancer: the influence of cisplatin based chemotherapy. Eur

Urol 23, 153-156.

48. Herve JC, Pluciennik F, Bastide B, Cronier L, Verrecchia F, Malassine

A, Joffre M, Deleze J (1996) Contraceptive gossypol blocks cell to

cell communication in human and rat cells. Eur J Pharmacol 313, 243-

255.

49. Hoey MG (1966) The effect of metallic salts on the histology and

functioning of the rat testis. J Reprod Fertil 12, 461-472.

50. Hollemann AF (1995) Kapitel XXXI: Die Nickelgruppe. In: Lehrbuch

der anorganischen Chemie / Hollemann-Wiberg, N Wiberg, 1575-

1604. De Gruyter Verlag, Berlin; New York.


51. Illingworth PJ, Groome NP, Byrd W, Rainey WE, McNeilly AS,

Mather JP, Bremner WJ (1996) Inhibin-B: A likely candidate for the

physiologically important form of inhibin in men. Journal of Clinical

Endocrinology and Metabolism 81 (4), 1321-1325.

52. Jakubowiak A, Janecki A, Steinberger A (1990) Kinetics of inhibin se-

cretion in static and superfused Sertoli cell cultures in response to fo-

licle-stimulating hormone. Biol Reprod 43, 939-945.

53. Janecki AJ, Jakubowiak A, Steinberger A (1992) Effect of cadmium

chloride on transepithelial electrical resistance of Sertoli cell mono-

layers in two-compartment cultures – A new model for toxilogical in-

vestigations of the „blood-testis“ barrier in vitro. Toxicol Appl Phar-

macol 112, 51-57.

54. Javed MU, Waqar MA (1996) Inhibition studies on LDH isoenzyme

purified from Uromastix testes. J Enzyme Inhib 10 (3), 187-193.

55. Jones LA (1991) Definition of gossypol and its prevalence in cotton-

seed products. In: Cattle research with gossypol-containing feeds,

eds. LA Jones, DH Kinard and R Mills, 1-18. National Cottonseed Pro

ducts Association, Memphis, TN.

56. Jutte NH, Jansen R, Grootegoed JA, Rommerts FFG, Van der Molen HJ

(1983) FSH stimulation of the production of pyruvate and lactate by

rat Sertoli cells may be involved in hormonal regulation of spermato-

genesis. J Reprod Fertil 68(1), 219-226.

57. Jutte NH, Grootegoed JA, Rommerts FFG, Van der Molen HJ (1981)

Exogenous lactate is essential for metabolic activities in isolated rat

spermatocytes and spermatids. J Reprod Fertil 62, 399-405.

58. Kainz V, Frick J, Kainz P, Kalla NR (1988) The effect of gossypol ace-

tic acid on the different stages of spermatogenic cycle in the rat. In-

tern J Androl 11, 533-546.


59. Kakela R, Kakela A, Hyvarinen H (1999) Effects of nickel chloride on

reproduction of the rat and possible antagonistic role of selenium.

Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol Endocrinol 123 (1),

27-34.

60. Karlson P (1988) Kapitel 5: Coenzyme. In: Kurzes Lehrbuch der Bio-

chemie für Mediziner und Naturwissenschaftler, P Karlson. Thieme

Verlag, Stuttgart.

61. Karlson P (1988) Kapitel 18: Hormone. In: Kurzes Lehrbuch der Bio-

chemie für Mediziner und Naturwissenschaftler, P Karlson. Thieme

Verlag, Stuttgart.

62. Kasseru E, Leon F (1974) Effect of different solid metals and metallic

pairs on human sperm motility. Int J Fertil 19, 81-84.

63. Kelly CW, Janecki A, Steinberger A, Russel LD (1991) Structural cha-

racteristics of immature rat Sertoli cells in vivo and in vitro. Am J

Anat 192, 183-193.

64. Kim IC, Waller DP (1984) Specific inhibition of the testicular mito-

chondrial respiratory chain in vitro by gossypol. J Androl 5, 424-430.

65. Kim IC, Waller DP, Fong HHS (1985) Inhibition of LDH-X by Gossy-

pol optical isomers. J Androl 6, 344-347.

66. Klein D, Wan YJY, Kamjab S, Okuda H, Sokol RZ (1994) Effects of

toxic levels of lead on gene regulation in the male axis: increase in

messenger ribonucleid acids andintracellular stores of gonadotrophs

within the central nervous system. Biol Reprod 50, 802-811.

67. Köhn FM, Schuppe HC, Schill WB, Jeyendran RS (1995) Hydrogen

hexachloroplatinate induces the acrosome reaction in human sperma-

tozoa. Int J Androl 18 (6), 321-325.

68. Kolpakov FI, Kolpakova AF (1978) Peripheral blood cellular reactions

to intravenous platinum in an experiment on animals. Gig Tr Prof Za-

bol Jun (6), 52-53.


69. Kopf-Maier P (1992) Effects of carboplatin on the testis. A histological

study. Cancer Chemother Pharmacol 29 (3), 227-235.

70. Kreuser ED (1986) Chronic gonadal toxicity in patients with testicular

cancer after chemotherapy. Eur J Cancer Clin Oncol 22, 289-294.

71. Labarca C, Paigen K (1980) A simple, rapid, and sensitive DNA assay

procedure. Anal Biochem 102, 344-352.

72. Lalevee N, Pluciennik F, Joffre M (1997) Voltage-dependent calcium

current with properties of T-type current in Sertoli cells from imma-

ture rat testis in primary cultures. Biol Reprod 56 (3), 680-687.

73. Lacroix M, Smith FE, Fritz IB (1977) Secretion of plasminogen activa-

tor by Sertoli cell enriched cultures. Mol Cell Endocrinol 9, 227-236.

74. Lancranjan I, Popescu HI, Gavenesu O, Klapsh I, Serbanescu M (1975)

Reproductive ability of workmen exposed to lead. Arch Environ

Health 30, 396-401.

75. Lee CYG, Moon YS, Yuan JH, Chen AF (1982) Enzyme inactivation

and inhibition by gossypol. Mol Cell Biochem 47, 65-70.

76. Lin YC, Rikihisia Y (1987) Anti-androgenic activity of gossypol meta-

bolites in young male rats. In: Cell biology of the testis and epididy-

mis, eds. MC Orgebin-Crist and J Danzo, pp 532-534. New York aca-

demy of science, New York.

77. Lin TU, Murono EP, Osterman J, Nankin HR, Coulson PB (1981) Gos-

sypol inhibits testicular steroidogenesis. Fertil Steril 35, 563.

78. Ling N, Ying SY, Ueno N, Shimasaki S, Esch F, Hotta M, Guillemin R

(1986) Pituitary FSH is released by a heterodimer of the beta-subunits

from the two forms of inhibin. Nature 321 (6072), 779-782

79. Liu BS (1957) A tentative idea for the use of cottonseed oil for fertility

control. Shanghai J Chinese Med 6, 43.

80. Liu G, Lyle KC, Cao L (1987) Clinical trial of gossypol as a male con-

traceptive drug. Part I. Efficacy study. Fertil Steril 48 (3), 459-461.


81. Liu G, Lyle KC (1987) Clinical trial of gossypol as a male contraceptive

drug. Part II. Hypokalemia study. Fertil Steril 48 (3), 462-465.

82. Liu G, Lyle KC, Cao L (1987) Experiences with gossypol as a male pill.

Am J Obstet Gynecol 157, 1079-1081.

83. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951) Protein measu-

rement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 193, 265-267.

84. McLachlan RI, Dahl KD, Bremner WJ, Schwall R, Schmelzer CH,

Mason AJ, Steiner RA (1989) Recombinant human activin-A stimula-

tes basal FSH and GnRH-stimulated FSH and LH release in the adult

male macaque, Macaca fascicularis. Endocrinology 125 (5), 2787-

2789.

85. Maddocks S, Kerr JB, Allenby G, Sharpe RM (1992) Evaluation of the

role of germ cells in regulating the route of secretion of immunoactive

inhibin from the rat testis. J Endocrinol 132 (3), 439-448.

86. Mather JP, Woodruff TK, Krummen LA (1992) Paracrine regulation of

reproductive function by inhibin and activin. Proc Soc Exp Biol Med

201 (1), 1-15.

87. Maines MD, Sluss PM, Iscan M (1990) Cis Platinum mediated decrease

in serum testosterone is associated with depression of luteinizing

hormone receptors and cytochrome P-450scc in rat testis. Endocri-

nology 126 (5), 2398-2406.

88. Miller GE, Welsh MJ, Brabec MJ (1985) Alteration in lactate metabo-

lism in Sertoli cells and spermatocytes by 1,2-dibromo-3-

chloropropane. Toxicologist 5, 120.

89. Mizoguchi K, Tsuno T, Hara H, Tanaka N, Igarashi S (1995) Effects of

a new platinum complex on male fertility in rats – collaborative work

to determine the optimal period and optimal parameters to detect ef-

fects on male fertility in rats. J Toxicol Sci 20 (3), 207-216.


90. Moger WH (1983) Effects of the calcium-channel blockers cobalt, vera-

pamil, and D600 on Leydig cell steroidogenesis. Biol Reprod 28 (3),

528-535.

91. Mollenhauer HH, Corrier DE, Clark DE, Hare MF, Elissalde MH

(1985) Effects of dietary cobalt on testicular structure. Virchows Arch

Cell Pathol 49 (3), 241-248.

92. Monsees TK, Miska W, Schill WB (1996) Enzymic digestion of brady-

kinin by rat Sertoli cell cultures. J Androl 17, 375-381.

93. Moss EJ, Cook MW, Thomas LV, Gray TJB (1988) The effect of mo-

no-(2-ethylhexyl) phthalate and other phtalate esters on lactate pro-

duction by Sertoli cells in vitro. Toxicol Lett 40, 77-84.

94. Moore A, Lynne A, Krummen Mather J (1993) Inhibins, activins, their

binding proteins and receptors: interactions underlying paracrine

activity in the testis. Molecular and Cellular Endocrinology 100, 81-

86.

95. Mullaney BP, Rosselli M, Skinner MK (1994) Developmental regulati-

on of Sertoli cell lactate production by hormones and the testicular

paracrine factor, PModS. Molecular and Cellular Endocrinology 104,

67-73.

96. Murthy RC, Saxena DK, Gupta SK, Chandra SV (1991) Lead induced

ultrastructural changes in the testis of rats. Exp Pathol 42 (2), 95-100.

97. Nathan E, Huang HF, Pogach L, Giglio W, Bogden JD, Seebode J

(1992) Lead acetate does not impair secretion of Sertoli cell function

marker proteins in the adult Spraque Dawley rat. Arch Environ Health

47 (5), 370-375.

98. National Coordinating Group on Male Antifertility Agents (1978) Gos-

sypol, a new antifertility agent. National Medical Journal of China 91,

417-428.

99. Ng TB, Liu WK (1990) Toxic effect of heavy metals on cells isolated

from the rat adrenal and testis. In Vitro Cell Dev Biol 26 (1), 24-28.


100. Nieschlag E (1998) Kritische Bemerkungen zur Diskussion über Ver-

änderungen der Spermienqualität. Fertilität 13, 2-5.

101. Nivsarkar M, Cherian B, Patel S (1998) A regulatory role of sufhydryl

groups in modulation of sperm membrane conformation by heavy

metals: sulfhydryl groups as markers for infertility assessment. Bio-

chem Biophys Res Commun 247 (3), 716-718.

102. Noll F (1984) L-(+)-Lactate. In: Methods of Enzymatic Analysis, Vol

III, ed. HU Bergemeyer, pp 582-588. Academic Press, New York.

103. Nolte T, Harleman JH, Jahn W (1994) Histopathology of chemically

induced testicular atrophy in rats. Exp Toxic Pathol 47, 267-286.

104. Onoda M, Suarez-Quian CA, Dym M (1990) Characterization of Ser-

toli cells cultured in the bicameral chamber system: relationship be-

tween formation of permeability barriers and polarized secretion of

transferrin. Biol Reprod 43, 672-683.

105. Olgiati KL, Hoffer AP, Toscano WA (1984) Gossypol modulation of

nucleotide metabolizing enzymes in the reproductive tract of male

rats. Biol Reprod 31, 759-770.

106. Pandey R, Kumar R, Singh SP, Saxena DK, Srivastava SP (1999)

Male

reproductive effect of nickel sulphate in mice. Biometals 12 (4),

339-346.

107. Pedigo NG, George WJ, Anderson MB (1988) Effect of acute and

chronic exposure to cobalt on male reproduction in mice. Reprod

Toxicol 2(1), 45-53.

108. Pedigo NG, Vernon MW (1993) Embryonic losses after 10-week ad-

ministration of cobalt to male mice. Reprod Toxicol 7, 111-116.

109. Pinon-Lataillade G, Thoreux-Manlay A, Coffigny H, Monchaux G,

Masse R, Soufir JC (1993) Effect of ingestion and inhalation of lead

on the reproductive system and fertility of adult male rats and their

progeny. Hum Exp Toxicol 12 (2), 165-172.


110. Pfeifer U, Gulotta F (1992) Reversible Schäden und Regeneration. In:

Einführung in die allgemeine Pathologie, Hrsg. E Grundmann, 21.

Gustav Fischer Verlag, Stuttgart.

111. Pogach LM, Lee Y, Gould S, Giglio W, Meyenhofer M, Huang HF

(1989) Characterization of cis-platinum-induced Sertoli cell

dysfunction in rodents. Toxicol Appl Pharmacol 98 (2), 350-361.

112. Qiang SZ, Jing GW, Wu XY, Xu Y, Li YG, Zhou ZH (1980) Gossypol

related to hypokalemia: clinicopharmacological studies. Chin Med J

93, 477.

113. Rabinovici J, Goldsmith PC, Roberts VJ, Vaughan J, Vale W, Jaffe

RB (1991) Localization and secretion of inhibin/activin subunits in

the human and subhuman primate fetal gonads. J Clin Endocrinol

Metab 73 (5), 1141-1149.

114. Reader SCJ, Foster PMD (1990) The in vitro effects of four isomers of

dinitotoluene on rat Sertoli and Sertoli-germ cell cocultures: germ cell

detachement and lactate and pyruvate production. Toxicol Appl

Pharmacol 106, 287-294.

115. Reyes J, Borriero L, Tanpaichitr N, Bellve AR, Benos DJ (1986) Ener-

gy metabolism of cultured TM4 cells and the action of gossypol. Biol

Reprod 34, 809-819.

116. Rivier C, Cajander S, Vaughan J, Hsueh AJW, Vale W (1988) Age de-

pendent changes in physiological action, content and immunostai-

ning of inhibin in male rats. Endocrinology 123, 120-126.

117. Robins TG, Bornman MS, Ehrlich RI, Cantrell AC, Pienaar E, Vallabh

J, Miller S (1997) Semen quality of men employed in a South African

lead acid battery plant. American Journal of Industrial Medicine 32,

369-376.

118. Sarkar S, Dubey AK, Banerji AP, Shah PN (1978) Patterns of lactate

dehydrogenase isoenzymes during gonadogenesis in the rat. J Re-

prod Fertil 53, 285-288.


119. Scanlon JW (1975) Dangers to the human fetus from certain heavy

metals in the enviroment. Rev Environ Health 2, 39-64.

120. Seibert H (1996) Störungen der Entwicklung und Funktion des männli-

chen Reproduktionssystems. UWSF Z Umweltchem Ökotox 8 (5),

275-284.

121. Seidel HJ (1991) Blei und seine Verbindungen. In: Ökologisches

Stoffgebiet, Hrsg. G Reinhardt, H-J Seidel, H-G Sonntag, W Gaus, V

Hingst, R Mattern, 29-30. Hippokrates Verlag, Stuttgart.

122. Shi Q, Zhuang Y (1980) Studies on antifertility effect of gossypol I.

Effects of Gossypol on androgen-dependent organs in mice and rats.

Acta Biol Exp Sinica 26, 311-316.

123. Shi Q, Zhuang Y, Yuan Y (1981) Studies on antifertility effect of gos-

sypol II. The effcts of Gossypol acetic acid on the spermatogenesis

in rats. Acta Biol Exp Sinica 27, 22-23.

124. Singh A, Cullen C, Dykeman A, Rice D, Foster W (1993) Chronic

lead exposure induces ultrastructural alterations in the monkey testis. J

Submicrosc Cytol Pathol 25 (4), 479-486.

125. Skinner MK (1987) Cell-cell interactions in the testis. Ann N Y Acad

Sci 513, 158-171.

126. Skinner MK (1993) Secretion of growth factors and other regulatory

factors. In: The Sertoli cell, eds. LD Russel and MD Griswold, 237-

247. Cache River Press, Clearwater.

127. Skinner MK, Griswold MD (1980) Sertoli cell synthesize and secrete

transferrin-like protein. J Biol Chem 255, 9523-9525.

128. Srivastava A, Gupta G, Setty BS (1988) Studies on mechanisms of an-

tifertility action of gossypol in rat and hamster. Contraception 39,

337-355.

129. Stachel B, Dougherty RC, Lahl U, Schlösser M, Zeschmar B (1989)

Toxic enviromental chemicals in human semen: Analytical method

and case studies. Andrologia 21 (3), 282-291.


130. Steinberger A, Hintz M, Heindel JJ (1978) Changes in cyclic AMP re-

sponses to FSH in isolated rat Sertoli cells during sexual maturation.

Biol Reprod 19, 566-572.

131. Steinberger A, Jakubowiak A (1993) Sertoli cell culture: Historical

perspective and review of methods. In: The Sertoli cell, eds. LD

Russel and MD Griswold, 155-194. Cache River Press, Clearwater.

132. Strom-Hansen T, Cornett C, Jaroszewski JW (1989) Interaction of gos-

sypol with amino acids and peptides as a model of enzyme inhibition.

Int J Peptide Protein Res 34, 306-310.

133. Thoreux-Manlay A, Velez de la Calle JF, Olivier MF, Soufir JC, Mas-

se R, Pinon Lataillade G (1995) Impairment of testicular endocrine

function after lead intoxication in the adult rat. Toxicology 100, 101-

109.

134. Tso WW, Lee CS, Tso MYW (1982) Sensitivity of various spermato-

zoal enzymes to gossypol inhibitor. Arch Androl 9, 31-32.

135. Velletri PA, Billingsley ML, Lovenberg (1985) Thermal denaturation

of rat pulmonary and testicular angiotensin-converting enzyme iso-

zyms. Effects of chelators and CoCl2. Biochem Biophys Acta 839 (1),

71-82.

136. Wallace WH, Shalet SM, Crowne EC, Morris-Jones PH, Gattamaneni

HR, Price DA (1989) Gonadal dysfunction due to cis-platinum. Med

Pediatr Oncol 17, 409-413.

137. Waller DP, Bunyapraphatsara N, Martin A, Vournazos CJ, Ahmed

MS, Soejarto DD, Cordell GA, Fong HHS, Russell LD, Malone JP

(1983) Effects of (+)-gossypol on fertility in male hamsters. J Androl

4, 276-279.

138. Wang NG, Lei HP (1979) Antifertility effect of gossypol acetic acid

on male rats. Chung-hua I Hseuh Tso Chih 59, 402-405.

139. Wang DX, You MM, Xue SP (1982) Ultrastructural observation of

gossypol effect on the Sertoli cells in rat. Acta Anat Sin 13, 211-214.


140. Wang J, Qiu J, Wu X, Zhang Z, Shao Y, Cao R (1988) The correlation

between the gossypol contents in blood plasma, rete testis fluid, and

cauda epididymal fluid following chronic treatment with gossypol in

rats. J Andrology 9, 397-402.

141. Weinbauer GF, Rovan E, Frick J, Adam H (1983) The endocrine status

of gossypol-treated male rats. Andrologia 15, 565-570.

142. Welsh MJ, Wiebe JP (1975) Rat Sertoli cells: a rapid method for ob-

taining viable cells. Endocrin 96, 618-624.

143. Wenda-Rozewicka L, Marchlewicz M, Barcew-Wiszniewska B,

Piasecka M (1996) The ultrastructure of the testis in rats after long-

term treatment with lead acetate. Andrologia 28, 97-102.

144. Wiebe JP, Salhanick AI, Myers KI (1983) On the mechanism of action

of lead in the testis: in vitro supression of FSH receptors, cyclic AMP

and steroidogenesis. Life Sci 32(17), 1997-2005.

145. Williams J, Foster PMD (1988) The production of lactate and pyruvate

as sensitive indices of altered rat Sertoli cell function in vitro follo-

wing the addition of various testicular toxicants. Toxicol Appl Phar-

macol 94, 160-170.

146. Wrobel KH, Bickel D, Kujat R, Schimmel M (1995) Configuration

and distribution of bovine spermatogonia. Cell Tissue Res 279, 277-

289.

147. Xie F, Wang J, Wu X, Gu Z (1990) Blood gossypol concentration in

men receiving low dose of gossypol. Adv Contracept Deliv Syst 6,

81-87.

148. Xie JM, Funakoshi T, Shimada H (1995) Effects of chelating agents on

testicular toxicity in mice caused by acute exposure to nickel. Toxico-

logy 103, 147-155.

149. Xue S, Zong S, Su S, Wu Y, Liu Y, Zhou Z, Ma X (1980) Antisperma-

togenic effect of gossypol on the germinal epithelium of the rat te-

stes. Scientia Sinica 23, 642.


150. Zhuang GY, Meng-Chung J, Jin LC, Qing YW (1989) The effect of

long-term treatment with crude cottonseed oil on pituitary and testi-

cular function in men. Int J Androl 12, 404-410.

9 Lebenslauf 100

9 Lebenslauf

Name: Udo Winterstein

Geburtsdatum: 13.01.1968

Geburtsort: Kassel

Wohnort: Römerplatz 6, 53179 Bonn

Familienstand: ledig

Schulausbildung: 1974-78 Grundschule Baunatal

1978-84 Gesamtschule Baunatal

1984-87 Oberstufengymnasium Kassel

21.5.1987 Abitur, Note 1,5

Ziviler Ersatzdienst: 1987-89 Individuelle Schwerstbehinderten

Betreuung, Hessisch-Lichtenau und

Kassel

Studium: 1989-91 Studium der Musikwissenschaft an

der Justus-Liebig-Universität Gießen

1991 Beginn des Medizinstudiums an der

JLU Gießen

1996-97 Praktisches Jahr an der Neurologischen

Klinik der JLU Gießen und am Evan-

gelischen Krankenhaus Gießen

28.10.97 Abschluß des Medizinstudiums

Gesamtnote: sehr gut

9 Lebenslauf 101

Berufliche Tätigkeit: 1/1998-6/99 AiP in der Neurologischen Abteilung

des Johanna-Etienne-Krankenhauses

in Neuss

7/1999-12/99 Assistenzarzt in der gleichen

Abteilung

seit 1/2000 Assistenzarzt im Neurologischen

Rehabilitationszentrum „Godeshöhe“

in Bad Godesberg

10 Danksagung 102

10 Danksagung

Die vorliegende Arbeit entstand in der andrologischen Forschungsabteilung

des Zentrums für Dermatologie und Andrologie der Justus-Liebig-

Universität, Gießen.

Ich danke besonders Herrn Prof. Dr. Dr. W.-B. Schill, Direktor des Zent-

rums für Dermatologie und Andrologie der Justus-Liebig-Universität, Gie-

ßen, für die Überlassung des Themas, die Betreuung sowie die

Bereitstellung der Arbeitsmaterialien und Geräte. Für die intensive Betreu-

ung während der Experimente sowie für kritische Anregungen und Ratsch-

läge beim Verfassen dieser Arbeit bin ich Herrn Dr. rer. nat. Th. Monsees

zu großem Dank verpflichtet.

Desweiteren geht mein Dank an Dr. W. Miska für die Unterstützung wäh-

rend meiner praktischen Tätigkeit.

Für die Einarbeitung und die Unterstützung bei der Betreuung der Zellkul-

tur danke ich ganz herzlich Fr. G. Thiele.

Allen Mitarbeitern der andrologischen Forschungsabteilung gilt mein be-

sonderer Dank für ihre Geduld und die angenehme und kollegiale Arbeits-

atmosphäre.

entwicklung und evaluierung eines in-vitro-testsystems zur...

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