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Entwicklung und Anwendung Raman-spektroskopischer
Methoden zur Untersuchung von Antimalaria-Wirkstoffen,
biologischen Zielstrukturen und deren molekularen
Wechselwirkungen.
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
vorgelegt dem Rat der Chemisch-Geowissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Schiller-Universität Jena
von Diplom-Physiker Torsten Frosch
geboren am 14.12.1974 in Neuhaus/Rwg.
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Gutachter:
1.
2.
3.
Tag der öffentlichen Verteidigung:
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Wagenden hilft das Glück. Vergil, Äneis
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Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 1
1.1 Motivation und Stand der Forschung . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Eigene Forschungsergebnisse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.1 Raman-spektroskopische Untersuchungen von Antimalaria-
Wirkstoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2.2 UV-Raman-mikrospektroskopische Untersuchungen von
Marsmeteoriten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.2.3 Resonanz-Raman-spektroskopische Untersuchungen biologi-
scher Zielstrukturen und ihrer Wechselwirkungen mit den
Antimalaria-Wirkstoffen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2.4 Schlussfolgerungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Literaturverzeichnis 21
2 Veröffentlichungen 31
2.1 Structural Analysis of the Anti-Malaria Active Agent Chloroquine
under Physiological Conditions. [TF1] . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.2 Raman spectroscopic investigation of the antimalarial agent meflo-
quine. [TF2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
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ii INHALTSVERZEICHNIS
2.3 In situ UV Resonance Raman Micro-spectroscopic Localization of
the Antimalarial Quinine in Chinchona Bark. [TF3] . . . . . . . . . 51
2.4 In Vivo Localization and Identification of the Antiplasmodial Alka-
loid Dioncophylline A in the Tropical Liana Triphyophyllum pelta-
tum by a Combination of Fluorescence, Near Infrared Fourier Trans-
form Raman Microscopy, and Density Functional Theory Calcula-
tions. [TF4] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
2.5 Ultrasensitive in situ Tracing of the Alkaloid Dioncophylline A in
the Tropical Liana Triphyophyllum peltatum by Applying Deep-UV
Resonance Raman Microscopy. [TF5] . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
2.6 UV Raman Imaging - A Promising Tool for Astrobiology: Com-
parative Raman Studies with Different Excitation Wavelengths on
Martian Meteorites. [TF6] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
2.7 In vitro polarization-resolved resonance Raman studies of the inter-
action of hematin with the antimalarial drug chloroquine. [TF7] . . 84
2.8 Device for Raman Difference Spectroscopy. [TF8] . . . . . . . . . . 88
2.9 In situ Localization and Structural Analysis of the Malaria Pigment
Hemozoin. [TF9] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
2.10 Raman acoustic levitation spectroscopy of red blood cells and Plas-
modium falciparum trophozoites. [TF10] . . . . . . . . . . . . . . . 114
Autorschaft der Publikationen 122
Konferenzbeiträge 127
Danksagung 132
Lebenslauf 135
Selbstständigkeitserklärung 136
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Kapitel 1
Zusammenfassung
1.1 Motivation und Stand der Forschung
Die gegenseitige Befruchtung der Entwicklung optischer Techniken und der
Erforschung biologischer Vorgänge hat eine lange Tradition. Dies manifestiert
sich beispielsweise in der Konstruktion des Lichtmikroskops, welches heutzutage
ein unverzichtbares Arbeitsgerät für die Zellbiologie darstellt. Neue optische
Methoden erlauben immer kontrollierter die Erzeugung, Formung und Detektion
von Licht. Licht-Materie-Wechselwirkungen werden in den Lebenswissenschaften
zur Manipulation oder als Sonde eingesetzt [1–3]. Bei der Verwendung von Licht
als Sonde in der optischen Spektroskopie werden die Struktur und Dynamik der
an biologischen Prozessen beteiligten Moleküle erforscht [4–7].
Die Raman-Schwingungsspektroskopie [8–13] ist hierfür eine besonders geeignete
Methode, da sie die Untersuchung der Moleküle in ihrer physiologischen Umge-
bung erlaubt und somit lebende Organismen erforscht werden können [14–19].
Dies ist möglich, da die Raman-Streuung nichtinvasiv ist und die wässrige
Umgebung nur ein schwaches Signal im Spektrum verursacht. Wichtige, biologisch
relevante Moleküle weisen oft eine chromophore, hochsymmetrische Struktur
auf. Viele ihrer Schwingungen verursachen deshalb eine große Änderung der
Polarisierbarkeit, und das eingestrahlte elektromagnetische Feld kann starke,
zeitlich veränderliche Dipole induzieren. Diese Schwingungen führen demzufolge
1
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2 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
zu intensiven, charakteristischen Banden im Raman-Spektrum.
Besonders geeignet für die Biospektroskopie ist die Resonanz-Raman-
Spektroskopie, bei der die Anregungswellenlänge energetisch mit den
Übergängen zwischen den elektronischen Eigenzuständen der Moleküle über-
einstimmt [12, 14, 20, 21]. In diesem Fall werden die sonst schwachen Raman-
Streuquerschnitte um bis zu einen Faktor 106 spezifisch verstärkt. Mit genauer
Einstellung der eingestrahlten Laserwellenlänge ist es so möglich, charakteristische
Molekülfragmente mittels Schwingungen, die an die resonanten elektronischen
Übergänge gekoppelt sind, gezielt anzuregen. Dies erlaubt es z.B. Chromophore
sensitiv und selektiv in einer komplexen biologischen Umgebung zu detektie-
ren. Die detaillierte Interpretation der Molekülschwingungen kann z.B. durch
dichtefunktionaltheoretische (DFT) Berechnungen [22–25] unterstützt werden,
welche effizient angemessene Näherungen für Geometrien und Schwingungsspek-
tren kleiner bis mittelgroßer organischer Moleküle ergeben [26–28]. Sehr kleine
Verschiebungen der Raman-Banden (bis zu 1/100 der Linienbreite), die z.B.
aufgrund schwacher Wechselwirkungen der Moleküle hervorgerufen werden, kann
man experimentell mit der Raman-Differenzspektroskopie nachweisen [29, 30].
Auch eine ortsaufgelöste Analyse der Proben ist mithilfe der Kombination
von Raman-Spektrometern mit optischen Mikroskopen und Objektiven hoher
numerischer Apertur möglich [31, 32]. Hierbei wird eine beugungsbegrenzte
laterale Auflösung im Bereich der Laserwellenlänge erreicht und das Streuvolumen
kann durch zusätzliche konfokale Blenden eingeschränkt werden. Die Raman-
Mikrospektroskopie wird mit großem Erfolg bei der ortsaufgelösten Untersuchung
lebender Organismen eingesetzt [33,34].
Aufgrund all dieser Fortschritte in der Raman-Spektroskopie können heut-
zutage sogar Krankheitsverläufe und Wirkprinzipien von Medikamenten auf
molekularer Ebene untersucht werden. Genau hier setzt die vorliegende Arbeit
an, deren Zielstellungen die schwingungsspektroskopische Charakterisierung
von Antimalaria-Wirkstoffen, die Lokalisation und strukturelle Untersuchung der
biologischen Zielstrukturen und das Studium ihrer molekularen Wechselwirkungen
sind.
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ZUSAMMENFASSUNG 3
Malaria1 ist eine der verheerendsten parasitären Infektionskrankheiten. Möglicher-
weise ist Malaria humanpathogen seit Beginn der Menschheit. Die gravierenden
Einflüsse von Malariaepidemien auf Hochkulturen in Ägypten, Rom, Indien und
China sind geschichtlich nachgewiesen und viele prägende Personen, wie z.B.
Alexander der Große, starben wahrscheinlich aufgrund von Malariainfektionen.
Wie würde die Welt ohne den Einfluß von Malaria aussehen? Angaben der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) zufolge werden heutzutage in tropischen
Regionen der Erde jährlich etwa 300 - 500 Millionen Menschen neu infiziert [35,36].
Vor allem die hohe Sterblichkeit von über 1 Million Kindern pro Jahr (alle 30 s
stirbt ein Kind in Afrika an Malaria) ist ein humanitäres Drama und hemmt die
wirtschaftliche Entwicklung vieler afrikanischer Länder [36–39]. Demgegenüber
steht die weltweite Ausbildung von Resistenzen gegen etablierte Wirkstoffe, insbe-
sondere gegen das häufig verwendete Chloroquin. Die zielgerichtete Entwicklung
neuer, effektiver Wirkstoffe ist daher von großer Bedeutung [40,41]. Hierfür ist die
eingangs erwähnte Identifikation und Aufklärung der biologischen Zielstrukturen
sowie deren molekularen Wechselwirkungen mit den Wirkstoffen grundlegend.
Die Malariaparasiten der Gattung Plasmodium2 werden beim Stich einer infizier-
ten, weiblichen Anophelesmücke in den menschlichen Körper übertragen. Hier
findet der ungeschlechtliche Lebenszyklus (Schizogonie) in der Leber und in den
roten Blutkörperchen statt. Von den vier für den Menschen gefährlichen Erregern
Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale und Plasmodium
malariae ist Plasmodium falciparum der klinisch bedeutsamste und bedrohlichste
Erreger (Malaria tropica), während die anderen - aufgrund der langen Ruhephase
der Leberschizonten (Hypnozoiten) - zu Rückfällen der Erkrankung führen können.
Von besonderem klinischen Interesse ist der 48-stündige intraerythrozytäre Zyklus
aus Ring-, Trophozoiten- und Schizontenstadium. Während dieser Phase baut
der Parasit in seiner sauren Nahrungsvakuole ca. 80 % des Hämoglobins des
Wirtserythrozyten ab. Bei der Proteolyse des Hämoglobins wird neben Ami-
nosäuren auch die Häm-Einheit freigesetzt. Dieses Häm/Hämatin-Nebenprodukt
ist toxisch für den Erreger und wird in einer einzigartigen Biokristallisation in
1Malaria: italienisch: mala aria: schlechte Luft2Für die Entdeckung des Plasmodium, welches ein Protozoon (Protozoe: griechisch: protos zoa:
Urtierchen) darstellt, als auch für die Erforschung seiner Übertragung durch die Anophelesmückewurden jeweils der Nobelpreis für Medizin verliehen.
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4 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
der Nahrungsvakuole des Parasiten zu unreaktiven Mikrokristallen, dem inerten
Malariapigment Hämozoin, entgiftet [42]. Der genaue Ablauf der Hämozoin-
bildung und die Struktur des Malariapigmentes sind Gegenstand der aktuellen
Forschung [43–53] und werden auch in dieser Arbeit untersucht.
Es ist nachgewiesen, dass Aminochinoline in diesen Entgiftungsmechanismus ein-
greifen [54–58]. Chinin, die Leitstruktur der Aminochinolin-Antimalariawirkstoffe,
wurde im 19. Jh. aus Chinarinde isoliert und war der erste Wirkstoff, der im
industriellen Maßstab produziert wurde. Das synthetische Chloroquin wur-
de 1934 erforscht (Hans Andersag, Bayer) und ersetzte Chinin wegen seiner
außergewöhnlichen Eigenschaften. Chloroquin - der”Wunderwirkstoff“ - ist
preiswert, verträglich, war jahrzehntelang effektiv und ist eines der erfolgreichs-
ten Antiinfektiva aller Zeiten [59, 60]. Als vielversprechende, neue Wirkstoffe
werden die Naphthylisochinolin-Alkaloide (NIQ) angesehen. Diese Naturstoffe
können aus einer Medizinpflanze, der tropischen Liane Triphyophyllum peltatum,
extrahiert werden und finden an der Elfenbeinküste traditionell Einsatz zur
Fieberbekämpfung. Die NIQ-Wirkstoffe [61, 62] zeigen hohe Aktivitäten gegen
Plasmodium falciparum. Die Aminochinoline werden aufgrund ihrer schwach
basischen Eigenschaften beim Eindringen in die Nahrungsvakuole von Plasmodien
protoniert und dort stark akkumuliert [41, 63]. Untersuchungen der Vakuole
zeigen, dass ein pH-Wert von etwa 5 vorliegt und dieser möglicherweise aufgrund
von Resistenzentwicklungen leicht erhöht wird [41, 64–66]. Der genaue pH-Wert
könnte erheblichen Einfluss auf die Wirkstoffakkumulation in der Vakuole und
das Bindungsverhalten zu den biologischen Zielstrukturen, beispielsweise dem
Malariapigment Hämozoin, haben.
Es wurde gezeigt, dass das Malariapigment in einem chemischen Prozess aus
reinem Hämatin gebildet werden kann [54]. Die in vitro synthetisierbare Mo-
dellverbindung ß-Hämatin stellt das chemische [44, 46], spektroskopische [46, 67]
und kristallographische [49, 68] Analogon des natürlichen Hämozoins dar. Nach
jahrzehntelanger Forschung ist akzeptiert, dass Hämozoin bzw. ß-Hämatin
aus triklinen Kristalliten reinen Hämatins aufgebaut sind. Die Elementarzelle
der Mikrokristalle besteht aus einem Dimer zweier Hämatineinheiten, welche
durch gegenseitige, unidentate Fe-Carboxylat-Bindungen zwischen dem zentralen
Fe(III) und den Propionsäureseitenketten verbunden sind [46, 49]. Über die freien
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ZUSAMMENFASSUNG 5
Propionsäureseitenketten sind die Dimere mittels Wasserstoffbrücken miteinander
verknüpft und bilden ein geordnetes, dreidimensionales Gitter aus [49]. Sowohl
die Bildung von Hämozoin als auch von ß-Hämatin wird von Chloroquin unter-
bunden [54, 58, 69]. In-vitro-NMR-spektroskopische Untersuchungen legen nahe,
dass in Lösung ππ-Wechselwirkungen zwischen Chloroquin und Hämatin (als
Monomer oder µ-oxo-Dimer) auftreten [70–73]. Neuerdings wird vorgeschlagen,
das Wirkprinzip damit zu erklären, dass sich die Inhibitoren (ggf. unter Vor-
handensein freien Hämatins) direkt an die kleinen, aktiven Wachstumsflächen
der Hämozoinkristallite anlagern [49, 74]. In diesem Modell stellen die Wirkstoffe
maßgeschneiderte Kristallwachstumsinhibitoren dar. Der genaue Mechanismus
der Wirkstoffanlagerung ist jedoch unbekannt. Die Erforschung des Wirkprinzips
der Inhibitoren kann in die Untersuchung der Affinität der Bindung zu Hämatin
und der Aktivität der Unterdrückung der Hämozoinbildung unterteilt werden.
Viele komplexe Vorgänge in der Nahrungsvakuole der Plasmodien sind noch
nicht genau erforscht. Daher ist es notwendig, Techniken voranzutreiben, welche
die aufgestellten Hypothesen mit weiteren experimentellen Ergebnissen belegen.
Konkret ist es hierbei interessant zu untersuchen, wie die Antimalaria-Wirkstoffe
sich in vitro an Hämatin-Monomere/Dimere binden und/oder an das Mala-
riapigment anlagern, und zu überprüfen, ob sich mit diesen Erkenntnissen die
in-vivo-Wirkstoffwechselwirkungen in Plasmodien interpretieren lassen. Diese
Wechselwirkungen sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit mithilfe von
Änderungen in den Raman-Spektren nachgewiesen werden.
Im ersten Schritt werden hierfür die Spektren der Wirkstoffe schwingungs-
spektroskopisch charakterisiert und insbesondere Resonanzverstärkungen von
Schwingungsmoden erforscht, welche sensitiv für die Wechselwirkungen mit den
Zielstrukturen sind. Für die Untersuchungen kommen die besonders wichtigen,
etablierten Wirkstoffe Chloroquin, Mefloquin und Chinin sowie die neuartigen
Naphthylisochinoline Dioncophyllin A, Dioncophyllin C und Dioncopeltin A zum
Einsatz. Es wird ebenfalls studiert, wie sich physiologische Umgebungseinflüsse
- wie z.B. Wasserumgebung und Unterschiede im pH-Wert von Blut (pH =
7,4) und der sauren Nahrungsvakuole (pH = 5) - im Spektrum widerspiegeln
und ob die Methode geeignet ist, geringe Wirkstoffmengen in biologischem
Material zu lokalisieren. Für die spektroskopische Erforschung der Zielstrukturen
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6 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
sollen das Malariapigment nach [75–79] aus infizierten Zellen extrahiert und die
Modellverbindung ß-Hämatin entsprechend [67,80–82] synthetisiert werden.
Nach diesen Charakterisierungen der Wirkstoffe und Zielstrukturen werden
ihre Wechselwirkungen in vitro untersucht. Bekannte Messprinzipien müssen
dafür auf ausreichende Sensitivität überprüft und ggf. weiterentwickelt werden.
Mittels in-vivo-Messungen an infizierten Erythrozyten wird erforscht, ob Raman-
Mikrospektroskopie geeignet ist, das Malariapigment in der Nahrungsvakuole
von Plasmodium falciparum zu lokalisieren, und inwieweit diese Ergebnisse von
den in-vitro-Resultaten an den synthetischen Verbindungen bestätigt werden.
Die Anwendung von Levitationstechniken erlaubt es, einzelne Zellen (z.B.
Erythrozyten und infizierte Erythrozyten) oder Zellpopulationen zu fangen,
eventuelle Umgebungseinflüsse zu prüfen und somit technische Lösungen für
spätere Feldanwendungen voranzutreiben.
Die Interpretation der resonant verstärkten Schwingungsmoden erfolgt mit Hilfe
von DFT-Rechnungen in Kombination mit nichtresonanten, experimentellen
Raman-Spektren. Die DFT-Berechnungen werden mit Gaussian 03 [28, 83] mit
den Funktionalen B3PW91 [84–88], B3LYP [84,85,89,90] und BP86 [91] in Kombi-
nation mit verschiedenen Basissätzen (z.B. 6-31+G(d,p), 6-311++G(d,p) [92–94],
TZVP [95], SDD) durchgeführt, da sich mit diesen gute Näherungen experimen-
teller Wellenzahlen bei geringer Fehlertoleranz [26, 27, 96–101] erzielen lassen.
Literaturwerte für transferierbare Skalierungsfaktoren der - in harmonischer
Näherung berechneten - Schwingungswellenzahlen [26, 27, 96, 98, 100, 102–104]
werden bestätigt und ergänzt [TF1-TF5]. Die quantitativen Beiträge zu den
Normalmoden in internen Koordinaten werden durch PED-Berechnungen3
nach der Wilson-GF-Matrix-Methode [7, 105–107] bestimmt. Aus den Raman-
Aktivitäten werden Raman-Intensitäten berechnet und die Strichspektren mit
Gauß-Lorentz-Profilen gefaltet, um experimentelle Spektren endlicher Auflösung
zu simulieren [8].
3PED: engl.: potential energy distribution
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ZUSAMMENFASSUNG 7
1.2 Eigene Forschungsergebnisse
1.2.1 Raman-spektroskopische Untersuchungen von
Antimalaria-Wirkstoffen
Um die Aminochinoline sensitiv und selektiv in ihrer biologischen Umgebung zu
lokalisieren und zu erforschen, wird die UV-Resonanz-Raman-Mikrospektroskopie
angewendet. Die dafür genutzten Wellenlängen des frequenzverdoppelten Ar-
Ionenlasers bei 244 nm und 257 nm liegen im Bereich der starken, elektro-
nischen Absorptionsbanden der untersuchten Moleküle [TF1-TF5]. Diese UV-
Anregungswellenlängen führen neben der Resonanzverstärkung auch zu einer er-
heblichen intrinsischen Verstärkung des Streuprozesses.
Während Raman-spektroskopische Untersuchungen physiologischer Chloro-
quinlösungen (1mmoll
) im sichtbaren Spektralbereich aufgrund der niedrigen Streu-
effizienz keine verwertbaren Signale liefern, werden Schwingungen, die am Chi-
nolinring lokalisiert sind, mit Anregungen im UV-Bereich (244 nm und 257 nm)
resonant verstärkt und führen dadurch zu intensiven Raman-Banden im Bereich
zwischen 1500 cm−1 und 1650 cm−1 (Abb. 2 in [TF1]). Die Möglichkeit, diese C=C-
Streckschwingungen des Chinolinringes selektiv zu verstärken (Tab. 1 in [TF1]),
ist wichtig, da sie sensitiv auf mögliche ππ-Wechselwirkungen zwischen Chloroquin
(Abb. 1 in [TF1]) und den Fe-Protoporphyrin-Zielstrukturen reagieren. Auch die
Resonanz-Raman-Spektren der Chloroquinlösungen mit pH-Werten von Blut (pH
= 7,4) und der sauren Nahrungsvakuole (pH = 5) sind signifikant anhand einer
Bande bei 721 cm−1 zu unterscheiden, welche in den Spektren der Lösung mit pH 5
wesentlich intensiver auftritt (Abb. 2 in [TF1]). Bei Messungen an mit Chloroquin
behandelten Plasmodien könnte demzufolge identifiziert werden, ob Chloroquin in
der sauren Nahrungsvakuole vorliegt.
Die Protonierung des Wirkstoffes, welche die Akkumulation von Chloroquin
[41, 63–65] verursacht, hat wesentlichen Einfluss auf das Bindungsverhalten ge-
genüber den biologischen Zielstrukturen und soll mit Hilfe dichtefunktionaltheo-
retischer Berechnungen genauer analysiert werden. Hierfür wird das nichtresonan-
te Raman-Spektrum von Chloroquindiphosphat (zweifach protoniert [108]) mit
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8 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
DFT-Berechnungen von Chloroquin in unterschiedlichen Protonierungsgraden ver-
glichen (Abb. 3 in [TF1]). Das berechnete Spektrum von zweifach protoniertem
Chloroquin zeigt eine sehr gute Übereinstimmung mit dem experimentellen Spek-
trum, wohingegen die Berechnungen von Chloroquin in anderen Protonierungs-
stufen wesentliche Strukturen des experimentellen Spektrums nicht widerspiegeln
(Abb. 3 in [TF1]). Der Protonierungsgrad von Chloroquin wird demzufolge durch
die DFT-Berechnung eindeutig wiedergegeben und äußert sich besonders stark im
Bereich der oben erwähnten C=C-Moden im Chinolinring (1500 cm−1 bis 1650
cm−1) (Abb. 2 in [TF1]), welche mithilfe der Berechnung exakt analysiert werden
können (Abb. 4 in [TF1]).
Aus der Protonierung resultieren ebenfalls deutliche Veränderungen der Geometrie
von Chloroquin (z.B. Bindungslängen und -winkel) (Tab. 3 in [TF1]), die wieder-
um entscheidend für das Bindungsverhalten zu den biologischen Zielstrukturen
sind. Die DFT-Berechnungen erweisen sich somit als wertvolles Hilfsmittel zur In-
terpretation der Schwingungsspektren und ermöglichen darüber hinausgehend die
Analyse weiterer Strukturparameter (Tab. 2 und Tab. 3 in [TF1]). Insbesondere
die Berechnung und graphische Darstellung der - mit den Molekülschwingungen
verbundenen - atomaren Auslenkungen lassen ein tiefergehendes Verständnis der
zu den Raman-Banden gehörenden Normalmoden zu und sind damit wertvoll für
die schwingungsspektroskopische Interpretation von Wechselwirkungen zwischen
Chloroquin und dessen Zielstrukturen (Abb. 4 in [TF1]).
Der Einfluss von Mefloquin (Abb. 1 in [TF2]) auf chloroquinresistente Plasmodien-
Stämme soll Raman-spektroskopisch aufgeklärt werden. Deshalb wird diese Sub-
stanz ebenfalls schwingungsspektroskopisch charakterisiert. Das nichtresonante
Raman-Spektrum wird von einer starken C=C-Streckschwingung im mittleren Teil
des Chinolinringes bei 1363 cm−1 dominiert (Abb. 2 in [TF2]). Im UV-Raman-
Spektrum wird insbesondere eine C=C-Streckschwingung bei 1620 cm−1 verstärkt
(Abb. 4 in [TF2]), welche im Chinolinring lokalisiert ist (Abb. 5 in [TF2]) und sen-
sitiv für die Ausbildung von ππ-Wechselwirkungen zum Tetrapyrrolring des Por-
phyrins sein sollte. Die Hypothese möglicher ππ-Wechselwirkungen von Mefloquin
zu Porphyrin wird mit einer relativ homogenen Verteilung der Elektronendich-
te im Chinolinring unterlegt (Abb. 7 in [TF2]). Auch Mefloquin kann durch die
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ZUSAMMENFASSUNG 9
UV-Resonanzverstärkung in physiologischen Konzentrationen nachgewiesen wer-
den (Abb. 2 in [TF2]).
Mit dem Übergang zu einer realen, biologischen Umgebung soll das Potenzial der
Raman-Mikrospektroskopie weiter überprüft werden, indem versucht wird, den
Naturstoff Chinin (Abb. 1 in [TF3]) in situ in Chinarinde zu lokalisieren. Raman-
spektroskopische Untersuchungen mit Anregungswellenlängen im sichtbaren Spek-
tralbereich erweisen sich aufgrund starker Fluoreszenzsignale (Abb. 2 in [TF3]),
welche die Spektren vollkommen überdeckten, als erfolglos. Diese Fluoreszenzan-
regung kann mit der NIR-Raman-Spektroskopie vermieden werden. Allerdings ist
in diesem Spektralbereich die Streueffizienz gering, und die Signale von Chinarin-
de zeigen entweder ein sehr schlechtes Signal-zu-Rausch-Verhältnis oder die Probe
wird bei Anwendung höherer Laserleistungen zerstört. Während die Proben ei-
ner Raman-spektroskopischen Analyse im Vis/NIR-Bereich deshalb vollkommen
unzugänglich sind, zeigen die UV-Resonanz-Raman-Spektren von Chinarinde kon-
trastreiche Signale (Abb. 3 in [TF3]). Die Spektren des Pflanzenmaterials stimmen
sehr gut mit den Raman-Spektren von Chinin überein (Abb. 3 in [TF3]).
Die UV-Resonanz-Raman-Spektren können - mittels nichtresonanter Raman-
Spektren von Chinin und DFT-Berechnungen der Raman-Spektren von Chinin
- eindeutig interpretiert werden (Abb. 4 in [TF3]). Eine Verschiebung der Raman-
Bande von Chinin (wasserfrei) von 1371 cm−1 zu 1363 cm−1 für eine physiolo-
gische Lösung von Chinin (1mmoll
, pH 5) kann theoretisch [109] verifiziert wer-
den (Abb. 4 in [TF3]). Die zugrunde liegende Normalmode wird vor allem mit
einer intensiven C=C-Streckschwingung beschrieben, welche den Chinolinring pe-
riodisch einschnürt (Abb. 5 in [TF3]). Einflüsse der physiologischen Wasserumge-
bung können demzufolge eindeutig experimentell im Raman-Spektrum nachgewie-
sen und theoretisch verstanden werden (Abb. 4 in [TF3]). Das Raman-Spektrum
von Chinin kann deutlich - mittels einer Verschiebung der resonanzverstärkten
Bande bei 831 cm−1 zu 843 cm−1 - vom Spektrum von Chinidin (Abb. 1 in
[TF3]) unterschieden werden (Abb. 2 in [TF3]). Mit Hilfe der DFT-Berechnung
des Raman-Spektrums von Chinin wird der sehr intensiven Bande bei 1618 cm−1
im UV-Resonanz-Raman-Spektrum von Chinin größtenteils eine hochsymmetri-
sche C=C-Streckschwingung im Chinolinring zugeordnet (Abb. 5 in [TF3]). Es ist
zu erwarten, dass diese Schwingung sehr sensitiv auf ππ-Wechselwirkungen des
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10 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
Chinolinringes von Chinin mit dem Tetrapyrrolring des Protoporphyrins reagiert.
Um in die Experimente auch neuartige Wirkstoffe einzubeziehen, werden die Naph-
thylisochinoline Dioncophyllin A, Dioncophyllin C und Dioncopeltin A untersucht
(Abb. 1 in [TF5]). Diese vielversprechenden Naturstoffe werden aus der tropischen
Liane Triphyophyllum peltatum extrahiert. Es zeigt sich, dass das Pflanzenma-
terial einer Vis-Raman-spektroskopischen Analyse aufgrund starker Fluoreszenz-
signale nicht zugänglich ist. Allerdings können mittels NIR-Raman-Mikroskopie
kleine Einschlüsse im Randbereich des Pflanzenstängels lokalisiert werden (Abb.
2 in [TF4]). Während das - diese Einlagerungen umgebende - Pflanzenmaterial
sehr leicht aufgrund der Laserstrahlung geschädigt wird, können die Einschlüsse
mit bis zu 500 mW bei 1064 nm angeregt werden. Dies erlaubt die Aufnahme si-
gnalstarker Spektren trotz der geringen Streueffizienz im NIR-Bereich (Abb. 2 in
[TF4]). Aufgrund einer sehr guten Übereinstimmung dieses in-situ-Spektrums mit
dem Raman-Spektrum der Reinsubstanz Dioncophyllin A und einer Unterschei-
dung von den Raman-Spektren von Dioncophyllin C und Dioncopeltin A kann die
Raman-Aktivität der Einschlüsse zweifelsfrei Dioncophyllin A zugeordnet werden.
Am deutlichsten wird diese Zuordnung durch eine Bande bei 1355 cm−1, welche
für Dioncophyllin C und Dioncopeltin A zu 1367 cm−1 bzw. 1371 cm−1 verscho-
ben ist (Abb. 2 in [TF4]). Diese Mode kann mittels der mit den experimentellen
Resultaten übereinstimmenden DFT-Berechnungen als Kombination aus dominie-
renden C=C- und C=O-Streckschwingungen im Naphthylring sowie Kipp- und
Biegeschwingungen beschrieben werden (Tab. 1 in [TF4]).
Die Lokalisation geringer Mengen (60 ppm) von Dioncophyllin A im Wurzel-
material von Triphyophyllum peltatum wird mit Hilfe der UV-Resonanz-Raman-
Spektroskopie erreicht (Abb. 3 und Abb. 4 in [TF5]). Ein großer Vorteil dieser
Technik liegt darin begründet, dass unter Anregung in UV-Absorptionsbanden
die Aufnahme von Raman-Spektren gelingt, welche nicht von Fluoreszenzsignalen
überlagert sind (Abb. 2 in [TF5]). Im Vergleich zur experimentell aufwendigen
NIR-Raman-Studie [TF4], bei welcher die Fluoreszenzanregung vermieden wird,
können hier kontrastreiche Signale mithilfe der Resonanzverstärkung und der in-
trinsischen Verstärkung der Streueffizienz bei sehr geringer Laserleistung erzielt
werden. Somit wird die Lokalisation geringer Mengen Dioncophyllin A in sonst un-
zugänglichem Pflanzenmaterial ermöglicht (Abb.en 3, 4 in [TF5]). In diesen unter
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ZUSAMMENFASSUNG 11
UV-Resonanzanregung gemessenen Raman-Spektren gestattet auch die verstärkte
Bande von Dioncophyllin A bei 1613 cm−1 eine Unterscheidung von den beiden
anderen Naphthylisochinolinen. Diese Bande ist für Dioncophyllin C und Dionco-
peltin A zu 1624 cm−1 verschoben (Abb. 3 und Abb. 4 in [TF5]) und stellt eine
Kombination aus einer C=C-Streckschwingung im Isochinolin-Teil, einer Streck-
schwingung der Biarylachse sowie verschiedener Biegeschwingungen dar (Abb. 6
in [TF5]).
Die Möglichkeit, kleine Konzentrationen pharmazeutisch relevanter Wirkstoffe in
situ in Pflanzenmaterial zu lokalisieren [TF3 und TF5], macht die UV-Resonanz-
Raman-Mikroskopie zu einer interessanten Methode im Vergleich zur etablierten
NIR-Raman-Mikroskopie [TF4].
1.2.2 UV-Raman-mikrospektroskopische Untersuchungen
von Marsmeteoriten
Eine weitere Anwendung der UV-Raman-Mikrospektroskopie könnte in der Astro-
biologie liegen. Sicherlich ist die Suche nach extraterrestrischem Leben (oder nach
extraterrestrischen Ursprüngen des Lebens auf der Erde) von großem Allgemein-
interesse. Die ESA (Europäische Raumfahrtbehörde) plant im Rahmen ihrer auf
Astrobiologie fokussierten EXOMARS-Mission, die multifunktionelle PASTEUR-
Einheit auf einem Marsrover zu platzieren. Diese Forschungsstation soll auch ein
Raman-Spektrometer beinhalten. Derartige Missionen verstärken das weltweite
Interesse an den Möglichkeiten der Raman-Spektroskopie. Im Rahmen der un-
abhängigen, von der DLR (Deutsche Luft- und Raumfahrtbehörde) finanzierten
MIRAS-Studie (Mineral Investigation by in situ Raman Spectroscopy) werden
in dieser Arbeit Beiträge zur Untersuchung geleistet, inwieweit die UV-Raman-
Mikrospektroskopie eine geeignete Methode für die Untersuchung von Marsmeteo-
riten darstellt [TF6].
Forschungsgeräte für Weltraummissionen sind strengen Vorgaben an Größe, Masse,
Energieverbrauch und Stabilität unterworfen. Sie müssen zuverlässig und schnell
zweifelsfreie Ergebnisse liefern. Raman-Spektroskopie wird hierfür als zweckmäßige
Technik angesehen [110–119]. Sie kann zerstörungsfrei die chemisch-mineralogische
-
12 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
Zusammensetzung und Textur von unpräparierten Proben analysieren und mit
diesen experimentellen Daten dazu beitragen, deren Entstehungsgeschichte auf-
zuklären. UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie kann weiterhin sensitiv und selek-
tiv Biomarker, wie Aminosäuren, Nukleinsäuren, fossile Überreste von Schutzmo-
lekülen von Cyanobakterien etc. aufspüren und den Genotyp von Mikroorganismen
innerhalb von 1 s aufklären.
In [TF6] wird am Beispiel der Marsmeteoriten Sayh al Uhaymir 060, 008, Dar
al Gani 735 und Zagami die Leistungsfähigkeit von UV-Anregungswellenlängen
(244 nm und 257 nm) im Vergleich zu Wellenlängen im Vis- (532 nm und 633 nm)
und NIR- (830 nm) Bereich dahingehend untersucht, wie gut und wie zuverlässig
die chemisch-mineralogische Zusammensetzung der Meteoritenoberflächen analy-
siert werden kann. Für systematisch vergleichende, ortsaufgelöste Messungen der
gleichen Probenstellen an verschiedenen Raman-Mikroskopen werden dafür maß-
geschneiderte Mikroraster an den Meteoritenproben befestigt. Die (200 · 200) µm2großen Probenbereiche werden mit Schrittweiten von 10 µm abgerastert, und aus
den Sätzen von jeweils 441 Raman-Spektren können mit Hilfe charakteristischer
Schwingungsbanden ortsaufgelöste Abbilder der Verteilungen einzelner minerali-
scher Bestandteile erstellt werden (Abb. 1 und Abb. 2 in [TF6]).
Während die UV-Messungen der Meteoritenproben Sätze von Spektren reichhalti-
ger spektraler Information mit vorher ungekannter Signalintensität ergeben (Abb.
4 in [TF6]), sind viele Messpunkte für Untersuchungen unter Anregung im Vis-
und im NIR-Bereich wegen starker Fluoreszenz vollkommen unzugänglich (Abb.
5 in [TF6]). Die UV-Raman-Messungen erlauben die Erstellung ortsaufgelöster
Abbilder der einzelnen mineralogischen Bestandteile (Pyroxen, Whitlockit, Calcit,
Olivin etc.) der untersuchten Meteoritenproben (Abb. 1 und Abb. 2 in [TF6]). Im
Unterschied dazu sättigen die starken Fluoreszenzsignale der Vis/NIR-Messungen
nach Messzeiten von weniger als 1 s den CCD-Detektor, während die Raman-
Spektren der Probenstellen ohne Fluoreszenz bei diesen Messzeiten sehr schwach
sind (Abb. 5 in [TF6]). Die verrauschten Signale der Vis/NIR-Experimente (Abb.
5 in [TF6]) ermöglichen somit keine sichere Zuordnung der Spektren, während die
unter UV-Anregung erhaltenen, intensiven Signale (Abb. 4 in [TF6]) eine sehr zu-
verlässige Bestimmung der mineralischen Bestandteile erlauben. Die quantitative
Auswertung zeigt beispielsweise für die Untersuchung von Zagami, dass für die
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ZUSAMMENFASSUNG 13
verschiedenen Anregungen mit (244 nm, 257 nm, 532 nm, 633 nm und 830 nm)
jeweils für (0, 4, 185, 232 und 237) der 441 analysierten Probenstellen keine spek-
trale Zuordnung möglich ist, während je (0, 1, 177, 344 und 340) Probenstellen
eine starke Fluoreszenz aufzeigen (Abb. 6 in [TF6]). Dieses Ergebnis spiegelt wi-
der, dass Zagami stark fluoreszierende, glasartige Adern besitzt [120,121]. Zusam-
menfassend lassen UV-Raman-spektroskopische Untersuchungen eine sehr schnelle
und zuverlässige chemisch-mineralogische Analyse der untersuchten Marsmeteori-
ten zu, während dies mit Raman-spektroskopischen Untersuchungen im Vis- und
im NIR-Bereich nicht gut möglich ist.
Unter Berücksichtigung des Potenzials der UV-Resonanz-Raman-Spektroskopie
für die Untersuchung von Biomarkern ist zu erwarten, dass das Anwendungsge-
biet der Astrobiologie die technische Entwicklung kleiner, kompakter UV-Raman-
Spektrometer vorantreibt.
1.2.3 Resonanz-Raman-spektroskopische Untersuchungen
biologischer Zielstrukturen und ihrer Wechselwir-
kungen mit den Antimalaria-Wirkstoffen
Die Zielstrukturen Hämatin (Fe(III)-ProtoporphyrinIX-OH), Hämin (Fe(III)-
ProtoporphyrinIX-Cl) sowie das Malariapigment Hämozoin gehören als Metallo-
porphyrine4 zu den wichtigen tetrapyrrolischen Makrozyklen, welche für bioche-
mische Prozesse von elementarer Bedeutung sind5. Ihr ausgedehntes aromatisches
Elektronensystem gibt Anlass zu niedrigenergetischen π − π∗-Übergängen in denVis- und nahen UV-Spektralbereichen. Konfigurationswechselwirkung und vibro-
nische Mischung erzeugen eine Vielfalt interessanter Resonanzeffekte im Raman-
Spektrum [122, 123]. Planare Metalloporphyrinsysteme (mit zu Massenpunkten
angenäherten Seitensubstituenten) können mittels D4h-Symmetrie beschrieben
4Porphyrin: griechisch: porphyra: Purpur5Chlorophyll, Bakteriochlorophyll, Coenzym B12, Häm etc.
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14 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
werden. Elektronische Anregung in die intensive B-Bande des Absorptionsspek-
trums [124], verursacht Albrecht-A-Term-Verstärkung [125,126] von Schwingungs-
moden mit a1g-Symmetrie, während bei Anregung in die Q-Banden [124] Albrecht-
B-Term-Verstärkung [125, 126] b1g−, a2g− und b2g− symmetrischer Schwingun-gen auftritt. Die Analyse dieser reichhaltigen Spektren wird mithilfe der Bestim-
mung der Depolarisationsgrade der Raman-Banden erleichtert (%(a1g) = 0, 125;
0, 125 < %(b1g), %(b2g) < 0, 75 und %(a2g) > 0, 756). Diese Kriterien können auch
als wertvolle Approximationen für Systeme verwendet werden deren Symmetrie
leicht gestört ist.
Resonanz-Raman-spektroskopische Untersuchungen der Bindungsaffinitäten von
Chloroquin, Mefloquin und Chinin zu Hämatin in Lösung zeigen, sowohl bei An-
regung in die B-Bande als auch bei Anregung in die Q-Bande, deutliche Änderun-
gen im Intensitätsmuster der Hämatinspektren. In den polarisationsaufgelösten
Spektren ist zu beobachten, dass die Intensitäten der invers polarisierten a2g-
Moden bei 1569 cm−1, 1401 cm−1 und 1305 cm−1 im senkrecht polarisierten
Spektrum nach Chloroquinzugabe deutlich abnehmen. Um die Depolarisations-
grade im Wellenzahlbereich von 1475 cm−1 bis 1700 cm−1 quantitativ zu bestim-
men, werden Pseudo-Voigt-Profile für die Entfaltung der acht bekannten Raman-
Banden [127–129] unter der Prämisse jeweils gleicher Wellenzahlposition für al-
le senkrecht und parallel polarisierten Spektren bei allen Anregungswellenlängen
(364 nm, 458 nm, 488 nm und 514 nm) verwendet [TF7]. Aufgrund der großen
Verstärkungsunterschiede unter B- und Q-Band-Anregung für Moden verschiede-
ner Symmetrie ist es mithilfe dieser Analyse möglich, auch stark überlappende
Raman-Banden zu trennen.
Während die Wellenzahlpositionen der Raman-Banden von reinem Hämatin die
Literaturwerte [128–130] bestätigen (Tab. 1 in [TF7]), sind innerhalb der Messge-
nauigkeit von ca. 2 cm−1 keine Bandenverschiebungen der Spektren von Hämatin
unter Zugabe von Chloroquin (molares Verhältnis Hämatin/Chloroquin = 21
) ge-
sichert zu beobachten (Tab. 1 in [TF7]). Dieses Ergebnis bestätigt die Hypothese,
dass Chloroquin keine kovalenten Bindungen zu Hämatin ausbildet. Die gravieren-
de Veränderung des Depolarisationsgrades der invers polarisierten ν19(a2g)-Mode
nach Zugabe von Chloroquin (von νH19 = 2,6 zu νH:CQ=2:119 = 1,0) (Tab. 1 und
6der antisymmetrische Streutensor wird nahe der Resonanz 6= 0
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ZUSAMMENFASSUNG 15
Abb. 2 in [TF7]) zeigt eine Änderung in der Polarisation der Streuung und da-
mit in der Symmetrie des Porphyrin-Streuzentrums auf. Invers polarisierte Moden
sind sensitiv für Symmetrieerniedrigungen, hier z.B. aufgrund der Wechselwirkung
von Chloroquin mit Hämatin. Während diese Ergebnisse die Hypothese einer ππ-
Wechselwirkung von Hämatin und Chloroquin bestätigen, ist die Messgenauigkeit
der verwendeten Apparatur nicht präzise genug, um die damit einhergehenden
kleinen Bandenverschiebungen zuverlässig zu detektieren.
Aus diesem Grund müssen die vorhandenen Messprinzipien weiterentwickelt wer-
den. Raman-Differenzspektroskopie (RDS) kann als vergleichende Technik irre-
levante und störende Bestandteile des Spektrums durch Gegenüberstellung mit
dem Referenzsystem ausblenden, wodurch die entscheidenden Informationen bes-
ser aufgelöst werden [29,30,131–140]. Die Methode kann z.B. mittels Auslöschung
der Lösungsmittelbanden kleinste Mengen gelöster Substanzen aufspüren und ver-
bessert die apparative Auflösung für die Detektion minimaler Verschiebungen zwi-
schen zwei Systemen aus dem Bereich der Reproduzierbarkeit (1-3 cm−1) in den
Bereich der Spektrometerauflösung (≤ 1 cm−1). Durch die Analyse des Differenz-spektrums der aufgenommenen Einzelspektren kann die spektrale Auflösung (bei
üblicher Bandenbreite) auch über die Genauigkeit des Spektrometers hinaus gestei-
gert werden. Die Separation von Maximum und Minimum im Differenzspektrum
nimmt bei Wellenzahlverschiebungen von kleiner als ca. 1/5 der Linienbreite kaum
mehr ab, wohingegen sich der Betrag der Intensitätsunterschiede in diesem Be-
reich linear verkleinert [141]. Die Präzision der Technik wird demzufolge durch
das Signal-zu-Rausch-Verhältnis der gemessenen Intensitätswerte bestimmt. RDS
ist die genaueste Methode, um kleinste Bandenverschiebungen (bis zu 1/100 der
Linienbreite) nachzuweisen, die aufgrund geringer struktureller Unterschiede und
damit einhergehender Veränderungen der Kraftkonstanten hervorgerufen werden.
Ältere RDS-Aufbauten arbeiten mit einem Sekundärelektronenvervielfacher als
Einzelelementdetektor, was die Messungen zeitaufwendig macht und dadurch sen-
sitive Proben stark belastet. Heutzutage sind diese Detektoren in vielen Anwen-
dungen von CCD7-Detektoren abgelöst worden, welche herausragende Eigenschaf-
ten besitzen (Detektionslimit: ca. 5 Elektronen / minimaler Dunkelstrom: ca. 1
7CCD: engl.: Charge-Coupled-Devices
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16 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
Elektron pro Element pro s / zweidimensionale (2D) Detektorfläche / hohe, konti-
nuierliche Quanteneffizienz vom UV bis NIR mit Werten > 90 % zw. 500 und 650
nm). CCD-Detektoren erlauben die schnelle Aufnahme von Signalen mit hohem
Signal-zu-Rausch-Verhältnis und stellen perfekte Multikanaldetektoren für licht-
schwache Anwendungen wie die Raman-Spektroskopie dar [142].
Deshalb wird ein RDS-Aufbau entworfen, der diese erheblichen technischen Ver-
besserungen ausnutzt. Da die Methode des Vergleichs eines Spektrums mit einem
Referenzspektrum nur dann präzise Resultate liefert, wenn keines der beiden Spek-
tren durch Umgebungseinflüsse (wie Schwankungen der Anregungsquelle, tempera-
turbedingte Änderungen der opto-mechanischen Komponenten des Aufbaus etc.)
verfälscht wird, sollen beide Signale zeitgleich aufgenommen werden. Dementspre-
chend wird ein Zweistrahlaufbau entworfen, bei dem der anregende Laserstrahl
mit einem Strahlteiler aufgespalten wird, die beiden Proben gemeinsam angeregt
werden und das jeweils gestreute Licht mit einer Y-Faser gesammelt und kombi-
niert auf den Eintrittsspalt des Spektrographen abgebildet wird (Abb. 1 in [TF8]).
Der Spektrograph - mit optimierten Abbildungseigenschaften - dispergiert die bei-
den Signale und bildet sie gemeinsam auf zwei Bereiche des 2D-CCD-Detektors
ab (Abb. 1 in [TF8]). Die Y-Faser ist passend zu den Abbildungseigenschaften des
Spektrographen und den Abmessungen des CCD-Detektors entworfen und exis-
tiert in zwei modifizierten Formen, welche den Streugeometrien der Lösungen (li-
nienförmig) und der Feststoffproben (elliptisch) entsprechen (Abb. 2 in [TF8]). Der
Aufbau ist vielseitig geplant (Abb. 1 in [TF8]), so dass neben der Untersuchung
verschiedener Probenarten auch die Anwendung unterschiedlicher Anregungswel-
lenlängen, die Aufnahme kleiner Wellenzahlen (Abb. S1 in [TF8]) und polarisierte
Messungen (Abb. S2 in [TF8]) möglich sind. Die Technik der rotierenden Pro-
ben [143, 144] erlaubt zudem die resonante Untersuchung sensitiver Substanzen
(Abb. 2 in [TF8]).
Die Testuntersuchungen an dem binären Gemisch aus CCl4 und CHCl3 zeigen,
dass es z.B. möglich ist, CHCl3 in einem molaren Verhältnis von nur 0,005:1 in
CCl4 aufzuspüren (Abb. 3 und Abb. 4 in [TF8]), und dass Wellenzahlverschie-
bungen bis zu 0,02 cm−1 sicher detektiert werden können (Abb. 5 in [TF8]).
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ZUSAMMENFASSUNG 17
Die Messungen demonstrieren auch, dass Umgebungseinflüsse bei nicht zeitglei-
cher Aufnahme beider Spektren die Ergebnisse in der Größenordnung der Si-
gnale verfälschen können (Abb. 6 und Abb. 7 in [TF8]). Die Messungen an ei-
nem Gemisch von Hämatin und Chloroquin lassen eine Verschiebung der ν10(b1g)-
Bande von Hämatin mit steigender Zugabe des Wirkstoffes erkennen (Abb. 8 in
[TF8]). Die ν10(b1g)-Bande stellt eine kombinierte, asymmetrische Schwingung des
Porphyrin-Makrozyklus dar und ist somit sensitiv für ππ-Wechselwirkungen zu
Chloroquin. Aufgrund der Verschiebung dieser Raman-Bande (Abb. 8 in [TF8])
kann hiermit eine schwache Wechselwirkung zwischen Hämatin und Chloroquin
mit hoher Genauigkeit aufgezeigt werden.
Neben dem Nachweis einer Bindungsaffinität von Chloroquin zu Hämatin in
Lösung ([TF7, TF8]) soll auch das Malariapigment Raman-spektroskopisch auf-
geklärt und in - mit Plasmodium falciparum infizierten - Erythrozyten lokalisiert
werden. Hämozoin wird hierfür aus Trophozyten extrahiert [79] und mit synthe-
tisiertem ß-Hämatin sowie Hämatin und Hämin verglichen. Die säurekatalysierte
Synthese von ß-Hämatin im wässrigen Milieu (Dehydrierung von Hämatin) [67,82]
ist seit ca. 1940 bekannt und führt zu amorphen Reaktionsprodukten, während die
1993 von Bohle vorgeschlagene basekatalysierte, wasserfreie Synthese (Dehydroha-
logenierung von Hämin [Fe(III)-ProtoporphyrinIX-Cl]) [80, 81] Kristallgrößen von
ca. 10 - 30 µm ergibt.
Die nichtresonanten Raman-spektroskopischen Untersuchungen (λL = 1064 nm)
von extrahiertem Hämozoin und synthetisiertem ß-Hämatin in mikrokristalliner
und amorpher Morphologie zeigen eine Übereinstimmung der Spektren in ihrer
Intensitätsstruktur und in den Bandenlagen (Abb. 4 in [TF9]). Die intensiven
Banden bei 1622 cm−1, 1585 cm−1, 1568 cm−1, 1550 cm−1, 1372 cm−1 und 755
cm−1 treten in allen Spektren auf (Abb. 4 und Tab. 1 in [TF9]). Abweichun-
gen in den Ausprägungen der Banden im niedrigen Wellenzahlbereich (z.B. 368
cm−1 und 264 cm−1) von Hämozoin und mikrokristallinem ß-Hämatin im Vergleich
zu amorphem ß-Hämatin ermöglichen eine Differenzierung ihrer unterschiedlichen
Morphologie anhand der nichtresonanten Raman-Spektren (Abb. 4 in [TF9]). Die-
se Erklärung wird durch die Ergebnisse der DFT-Berechnung des Schwingungs-
spektrums unterstützt, mit deren Hilfe diesen Moden kombinierte, nichtebene
C-C-Streckschwingungen und Biegeschwingungen zugeordnet werden (Abb. S2 in
-
18 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[TF9]). Die DFT-Berechnung der Elementarzelle des Malariapigmentes Hämozoin
erweist sich damit als extrem hilfreich für die Interpretation der experimentel-
len Spektren. Diese wichtigen Unterscheidungsmerkmale zwischen den Proben von
Hämozoin und ß-Hämatin amorpher Struktur können auch durch die Ausprägun-
gen der Banden im Bereich kleiner Wellenzahlen in den Raman-Spektren von
Hämatin und Hämin bestätigt werden. Die Sensitivität dieser Schwingungsbanden
auf die Probenmorphologie wird hier deutlich, da diese Banden bei Hämin sehr
stark (ausgeprägt kristalline Struktur, Teichmannsche Kristalle) und bei Hämatin
sehr schwach (keine kristalline Probe) hervortreten.
Der Resonanz-Raman-spektroskopische Vergleich von Hämozoin und mikrokris-
tallinem ß-Hämatin unter den verschiedenen Anregungswellenlängen (532 nm, 568
nm, 633 nm, und 830 nm) zeigt ebenfalls eine Übereinstimmung in allen Spektren
(Abb. 5 in [TF9]), was insgesamt die Hypothese belegt, dass mikrokristallines ß-
Hämatin das Raman-spektroskopische Analogon von Hämozoin darstellt und die
beiden Substanzen tatsächlich identisch sind.
Bei der Anregung von Hämozoin mit den verschiedenen, elektronisch resonanten
Wellenlängen (532 nm, 568 nm, 633 nm und 830 nm) sowie 1064 nm ergeben sich
Raman-Spektren reichhaltiger, spektraler Information. Deutlich sind die selektive
Verstärkung der Mode bei 755 cm−1 für Anregung mit 633 nm und das komple-
xe Verstärkungsmuster der Mode bei 1372 cm−1 (Abb. 3 in [TF9]) zu erkennen.
Letztere ist bekannt für ihre Sensitivität zur π-Elektronendichte und wird unter
D4h-Symmetrie als ν4-Mode klassifiziert. Diese Bande wird bei Anregung mit 532
nm im Spektrum verstärkt, ist noch intensiver bei 568 nm, jedoch viel schwächer
bei 633 nm, dominierend bei 830 nm und wiederum schwächer im nichtresonanten
Spektrum bei Anregung mit 1064 nm (Abb. 3 in [TF9]). Insbesondere die intensive
Verstärkung der Bande bei Anregung mit 830 nm legt die Vermutung nahe, dass
diese Schwingung eine Aggregationsverstärkung aufgrund der ausgedehnten, drei-
dimensionalen Struktur von Hämozoin erfährt [52,145,146]. Die DFT-Berechnung
des Raman-Spektrums bestätigt diese Hypothese und zeigt, dass diese Schwingung
im Überlappungsbereich der vier Pyrrolringe und der Fe-Carboxylat-Verbindungen
lokalisiert ist (Abb. 6 in [TF9]). Es handelt sich um eine Kombination aus domi-
nierenden C=C-Streckschwingungen sowie CH-, CH2-, CH3- Biege-, Kipp- und
Scherschwingungen.
-
ZUSAMMENFASSUNG 19
Unter Resonanzanregung mit 568 nm zeigen sich dagegen gravierende Unterschie-
de im Intensitätsmuster zwischen den Spektren von Hämozoin und von Hämatin
sowie von Hämin (Abb. 5 in [TF9]). Während das Hämozoinspektrum von ei-
ner starken Bande bei 1373 cm−1 dominiert wird, weist das Häminspektrum die
intensivste Bande bei 1622 cm−1 auf, und das Hämatinspektrum zeigt ähnlich
intensive Banden bei 1622 cm−1, 1565 cm−1 und 1372 cm−1 (Abb. 5 in [TF9]).
Besonders deutlich wird die Unterscheidung zwischen Hämozoin und ß-Hämatin
im Vergleich zu Hämatin und Hämin durch die Raman-Bande bei 1655 cm−1, wel-
che nur in den Spektren von Hämozoin und ß-Hämatin auftritt (Abb. 5 in [TF9]).
Diese Bande wird mit Hilfe der DFT-Berechnung einer kombinierten Schwingung
an der freien Propionsäureseitenkette zugeordnet (Abb. 6 in [TF9]). Die exklu-
sive Resonanzverstärkung dieser Schwingungsmode in Hämozoin/ß-Hämatin wird
dadurch erklärt, dass an diesen Propionsäureseitenketten Wasserstoffbrückenbin-
dungen zwischen den benachbarten Elementarzellen im Hämozoinkristall ausgebil-
det werden [49]. Zusammenfassend kann Hämozoin signifikant von den Substanzen
Hämatin und Hämin unterschieden werden.
Dies erlaubt es, das Malariapigment Hämozoin eindeutig mikrospektroskopisch
in mit Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten zu lokalisieren und zu er-
forschen. Die ortsaufgelösten Untersuchungen der infizierten Erythrozyten mit den
Anregungswellenlängen 532 nm und 633 nm ergeben jeweils einen Satz von Raman-
Spektren. Mit Hilfe starker Signale des Malariapigmentes, welche sich von den Si-
gnalen des umgebenden Erythrozyten (vor allem Hämoglobin) unterscheiden, wer-
den aus den Sätzen von Raman-Spektren Abbilder der Hämozoinverteilung erstellt
(Abb. 1 und Abb. 2 in [TF9]). Die Raman-Bande bei 755 cm−1 ist aufgrund ihrer
großen Verstärkung bei Anregung mit 633 nm (Abb. 3 in [TF9]) besonders geeignet,
um mit ihrer Hilfe ortsaufgelöste Abbilder mit hohem Kontrast zu erstellen (Abb.
2 in [TF9]). Die erfolgreiche Lokalisation des Malariapigmentes in Plasmodium fal-
ciparum eröffnet die Möglichkeit, Wechselwirkungen von Antimalaria-Wirkstoffen
mit Hämozoin in vivo zu erforschen.
Um verfälschende Umgebungseinflüsse, wie z.B. die Adhäsion der Erythrozyten an
Gefäßwände, zu vermeiden, werden Levitationstechniken eingesetzt. Die akustische
Falle kann in ihren inneren Druckknoten stabil lebende Organismen isolieren und
erweist sich somit als robuste Methode für den Feldeinsatz (Abb. 1 und Abb. 2 in
-
20 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[TF10]). Die Detektion von Hämozoinsignalen einer Population von Plasmodium-
falciparum-Trophozyten gelingt mit Hilfe eines an eine akustische Falle gekoppel-
ten Raman-Spektrometers (Abb. 5 in [TF10]).
1.2.4 Schlussfolgerungen
Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Wirkstoffe mittels UV-Raman-
Mikrospektroskopie markierungsfrei, unter physiologischen Bedingungen detek-
tiert und in situ in Pflanzenmaterial aufgespürt werden können [TF1-TF3, TF5].
Schwingungen des Chinolinringes, die sensitiv für ππ-Wechselwirkungen zum Por-
phyrinring sind, werden unter UV-Anregung selektiv verstärkt [TF1-TF3, TF5].
Die Raman-Spektren reagieren sensitiv auf Einflüsse - wie z.B. Wasserumge-
bung [TF3] und pH-Wert [TF1] - und sind mit Hilfe von DFT-Berechnungen
detailliert interpretierbar [TF1-TF5]. Das aufgezeigte Potenzial der UV-Raman-
Mikrospektroskopie erweist sich als relevant für die Untersuchung von Pflanzen
[TF5] und die Astrobiologie [TF6]. Bindungsaffinitäten von Chloroquin und Häma-
tin konnten anhand schwacher Wechselwirkungen von Chloroquin und dem Por-
phyrinmakrozyklus in Lösung nachgewiesen werden [TF7, TF8]. Hierfür wurde
ein neuartiger, vielseitiger Differenzaufbau entworfen [TF8]. Das Malariapigment
Hämozoin wurde in Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten lokalisiert
und durch den Vergleich mit extrahiertem Hämozoin, synthetisiertem ß-Hämatin
sowie Hämatin und Hämin analysiert [TF9]. DFT-Berechnungen erweisen sich als
hilfreich bei der Interpretation der experimentellen Ergebnisse [TF1-TF5, TF9]. In
akustisch levitierten Populationen von Plasmodium-falciparum-Trophozyten wur-
den Hämozoinsignale detektiert [TF10]. Mit den Beiträgen dieser Arbeit [TF1-
TF10] wurden wesentliche Bausteine zur Aufklärung molekularer Wechselwirkun-
gen von Antimalaria-Wirkstoffen mit ihren biologischen Zielstrukturen Hämatin
und Hämozoin erbracht.
-
Literaturverzeichnis
[1] Prasad, Paras N.: Introduction to Biophotonics. Wiley & Sons Inc.: Hoboken, New Jersey,2003
[2] Vo-Dinh, Tuan (Hrsg.): Handbook - Biomedical Photonics. CRC Press: Washington, D.C.,2003
[3] Popp, Juergen (Hrsg.) ; Strehle, Marion (Hrsg.): Biophotonics - Vision for a BetterHealth Care. Wiley-VCH: Weinheim, 2006
[4] Chalmers, J. M. (Hrsg.) ; Griffiths, P. R. (Hrsg.): Handbook of Vibrational Spectros-copy, Vol.1-5. Wiley & Sons.: Chichester, 2002
[5] Schrader, Bernhard (Hrsg.): Infrared and Raman Spectroscopy. Wiley-VCH: Weinheim,1994
[6] Demtröder, Wolfgang: Laserspektroskopie. Springer: Berlin, 2000
[7] Wilson, E. B. J. ; Decius, J. C. ; Cross, P. C.: Molecular Vibrations. McGraw-Hill:New York, 1955
[8] Long, Derek A.: The Raman Effect - A unified Treatment of the Theory of Raman Scat-tering by Molecules. Wiley & Sons.: New York, 2002
[9] Raman, C. V. ; Krishnan, K. S.: A new type of secondary radiation. In: Nature (London,United Kingdom) 121 (1928), S. 501–502
[10] Raman, C. V. ; Krishnan, K. S.: The optical analog of the Compton effect. In: Nature(London, United Kingdom) 121 (1928), S. 711
[11] Landsberg, G. ; Mandelstam, L.: A novel effect of light scattering in crystals. In:Naturwissenschaften 16 (1928), S. 557–558
[12] Placzek, G.: Rayleigh-Streuung and Raman-Effekt: in Handbuch der Radiologie, Vol. 6.Akademische Verlagsgesellschaft: Leipzig, 1934
[13] Popp, Juergen ; Kiefer, Wolfgang: Raman Scattering, Fundamentals: in Encylopedia ofAnalytical Chemistry. Wiley & Sons: Chichester, 2000
[14] Spiro, Thomas G. (Hrsg.): Biological Applications of Raman Spectroscopy, Vol.1-3. Wiley& Sons: New York, 1988
[15] Clark, R. J. H. (Hrsg.) ; Hester, R. E. (Hrsg.): Spectroscopy of Biological Systems: inAdvances in Spectroscopy, Vol. 13. Wiley & Sons: Chichester, 1986
21
-
22 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[16] Clark, R. J. H. (Hrsg.) ; Hester, R. E. (Hrsg.): Biomedical Application of Spectroscopy:in Advances in Spectroscopy, Vol. 21. Wiley & Sons: Chichester, 1993
[17] Clark, R. J. H. (Hrsg.) ; Hester, R. E. (Hrsg.): Biomolecular Spectroscopy: in Advancesin Spectroscopy, Vol. 25. Wiley & Sons: Chichester, 1996
[18] Schmitt, M. ; Popp, J..: Raman spectroscopy at the beginning of the twenty-first century.In: Journal of Raman Spectroscopy 37 (2006), S. 20–28
[19] Petry, Renate ; Schmitt, Michael ; Popp, Juergen.: Raman spectroscopy-a prospectivetool in the life sciences. In: ChemPhysChem 4 (2003), S. 14–30
[20] McHale, J. L.: Resonance Raman Spectroscopy: in Handbook of Vibrational Spectroscopy,Vol.1. Wiley & Sons: Chichester, 2002
[21] Kiefer, Wolfgang: Applications of non-classical Raman spectroscopy: resonance Raman,surface enhanced Raman, and nonlinear coherent Raman spectroscopy in: Infrared andRaman Spectroscopy. Wiley-VCH: Weinheim, 1994
[22] Parr, Robert G. ; Yang, Weitao: Density-Functional Theory of Atoms and Molecules.Oxford University Press: New York, 1988
[23] Springborg, Michael (Hrsg.): Density-Functional Methods in Chemistry and MaterialScience. Wiley-VCH: Weinheim, 1997
[24] Koch, Wolfram ; Holthausen, Max C.: A Chemits Guide to Density Functional Theory.Wiley-VCH: Weinheim, 2000
[25] Jensen, Frank: Introduction to Computational Chemistry. Wiley & Sons.: Chichester,1997
[26] Neugebauer, Johannes ; Hess, Bernd A.: Fundamental vibrational frequencies of smallpolyatomic molecules from density-functional calculations and vibrational perturbationtheory. In: Journal of Chemical Physics 118 (2003), S. 7215–7225
[27] El-Azhary, A. A. ; Suter, H. U.: Comparison between Optimized Geometries and Vi-brational Frequencies Calculated by the DFT Methods. In: Journal of Physical Chemistry100 (1996), S. 15056–15063
[28] Foresman, James B. ; Frisch, Aeleen: Exloring Chemistry with Electronic StructureMethods. Gaussian Inc.: Pittsburgh, 1996
[29] Bodenheimer, J. S. ; Berenblut, B. J. ; Wilkinson, G. R.: Raman difference spec-troscopy. In: Chemical Physics Letters 14 (1972), S. 533–535
[30] Kiefer, W.: Raman difference spectroscopy with the rotating cell. In: Applied Spectroscopy27 (1973), S. 253–257
[31] Delhaye, M. ; Dhamelincourt, P.: Raman microprobe and microscope with laser exci-tation. In: Journal of Raman Spectroscopy 3 (1975), S. 33–43
[32] Turell, George (Hrsg.) ; Corset, Jacues (Hrsg.): Raman Microscopy - Developmentsand Applications. Elsevier: San Diego, 1996
[33] Puppels, G. J. ; De Mul, F. F. M. ; Otto, C. ; Greve, J. ; Robert-Nicoud, M. ;Arndt-Jovin, D. J. ; Jovin, T. M.: Studying single living cells and chromosomes byconfocal Raman microspectroscopy. In: Nature (London, United Kingdom) 347 (1990), S.301–303
-
ZUSAMMENFASSUNG 23
[34] Wood, Bayden R. ; McNaughton, Don.: Raman excitation wavelength investigation ofsingle red blood cells in vivo. In: Journal of Raman Spectroscopy 33 (2002), S. 517–523
[35] Snow, Robert A. ; Carlos, Guerra ; Noor, Abdisalan M. ; Myint, Hla Y. ; Hay,Simon I.: The global distribution of clinical episodes of Plasmodium falciparum malaria.In: Nature 434 (2002), S. 214–217
[36] World Health Organization: World Malaria Report. http://rbm.who.int/wmr2005.Version: 2005
[37] Sachs, Jeffrey ; Malaney, Pia.: The economic and social burden of malaria. In: Nature(London, United Kingdom) 415 (2002), S. 680–685
[38] Weiss, Ursuda.: Nature insight: Malaria. In: Nature (London, United Kingdom) 415(2002), S. 669
[39] Greenwood, Brian ; Mutabingwa, Theonest.: Malaria in 2002. In: Nature (London,United Kingdom) 415 (2002), S. 670–672
[40] Ridley, Robert G.: Medical need, scientific opportunity and the drive for antimalarialdrugs. In: Nature (London, United Kingdom) 415 (2002), S. 686–693
[41] Ginsburg, Hagai ; Geary, Timothy G.: Current concepts and new ideas on the mechanismof action of quinoline-containing antimalarials. In: Biochemical Pharmacology 36 (1987),S. 1567–1576
[42] Francis, Susan E. ; Sullivan, Jr. David J. David J. ; Goldberg, Daniel E.: Hemo-globin metabolism in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In: Annual Review ofMicrobiology 51 (1997), S. 97–123
[43] Chou, Albert C. ; Chevli, Rekha ; Fitch, Coy D.: Ferriprotoporphyrin IX fulfills thecriteria for identification as the chloroquine receptor of malaria parasites. In: Biochemistry400 (1980), S. 1543–1549
[44] Fitch, Coy D. ; Kanjananggulpan, Phitsamai.: The state of ferriprotoporphyrin IX inmalaria pigment. In: Journal of Biological Chemistry 262 (1987), S. 15552–15555
[45] Fitch, Coy D.: Ferriprotoporphyrin IX, phospholipids, and the antimalarial actions ofquinoline drugs. In: Life Sciences 74 (2004), S. 1957–1972
[46] Slater, Andrew F. G. ; Swiggard, William J. ; Orton, Brian R. ; Flitter, William D. ;Goldberg, Daniel E. ; Cerami, Anthony ; Henderson, Graeme B.: An iron-carboxylatebond links the heme units of malaria pigment. In: Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 88 (1991), S. 325–329
[47] Ridley, Robert G. ; Dorn, Arnulf ; Matile, Hugues ; Kansy, Manfred.: Haem polyme-rization in malaria. In: Nature (London) 378 (1995), S. 138–139
[48] Senge, Mathias O. ; Hatscher, Sabine.: The malaria pigment haemozoin-a focal pointof action for antimalarial drugs. In: ChemBioChem 1 (2000), S. 247–249
[49] Pagola, Silvina ; Stephens, Peter W. ; Bohle, D. S. ; Kosar, Andrew D. ; Madsen,Sara K.: The structure of malaria pigment ß-haematin. In: Nature (London) 404 (2000),S. 307–310
[50] Egan, Timothy J.: Physico-chemical aspects of hemozoin (malaria pigment) structure andformation. In: Journal of Inorganic Biochemistry 91 (2002), S. 19–26
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24 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[51] Wood, Bayden R. ; Langford, Steven J. ; Cooke, Brian M. ; Glenister, Fiona K. ;Lim, Janelle ; McNaughton, Don.: Raman imaging of hemozoin within the food vacuoleof Plasmodium falciparum trophozoites. In: FEBS Letters 554 (2003), S. 247–252
[52] Wood, Bayden R. ; Langford, Steven J. ; Cooke, Brian M. ; Lim, Janelle ; Glenister,Fiona K. ; Duriska, Martin ; Unthank, Jessica K. ; McNaughton, Don.: ResonanceRaman Spectroscopy Reveals New Insight into the Electronic Structure of ß-Hematin andMalaria Pigment. In: Journal of the American Chemical Society 126 (2004), S. 9233–9239
[53] Wood, Bayden R. ; McNaughton, Don.: Resonance Raman spectroscopy in malariaresearch. In: Expert Review of Proteomics 3 (2006), S. 525–544
[54] Dorn, Arnulf ; Stoffel, Ruedi ; Matile, Hugues ; Bubendorf, Andre ; Ridley, Ro-bert G.: Malarial hemozoin/ß-hematin supports heme polymerization in the absence ofprotein. In: Nature (London) 374 (1995), S. 269–271
[55] Foley, Michael ; Tilley, Leann.: Quinoline antimalarials: mechanisms of action andresistance and prospects for new agents. In: Pharmacology & Therapeutics 79 (1998), S.55–87
[56] Sullivan, Jr. David J. David J. ; Gluzman, Ilya Y. ; Russell, David G. ; Goldberg,Daniel E.: On the molecular mechanism of chloroquine’s antimalarial action. In: Procee-dings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93 (1996), S.11865–11870
[57] Egan, Timothy J.: Haemozoin (malaria pigment): a unique crystalline drug target. In:Targets 2 (2003), S. 115–124
[58] Egan, Timothy J. ; Ross, David C. ; Adams, Paul A.: Quinoline antimalarial drugsinhibit spontaneous formation of b-haematin (malaria pigment). In: FEBS Letters 352(1994), S. 54–57
[59] Hastings, I. M. ; Bray, P. G. ; Ward, S. A.: Parasitology: A requiem for chloroquine.In: Science (Washington, DC, United States) 298 (2002), S. 74–75
[60] Wellems, Thomas E.: Plasmodium chloroquine resistance and the search for a repla-cement antimalarial drug. In: Science (Washington, DC, United States) 298 (2002), S.124–126
[61] Bringmann, Gerhard ; Ruebenacker, Martin ; Weirich, Ralf ; Assi, Laurent A.: Ace-togenic isoquinoline alkaloids. Part 36. Dioncophylline C from the roots of Triphyophyllumpeltatum, the first 5,1’-coupled Dioncophyllaceae alkaloid. In: Phytochemistry 31 (1992),S. 4019–4024
[62] Francois, Guido ; Timperman, Georges ; Eling, Wijnand ; Assi, laurent A. ; Holenz,Jorg ; Bringmann, Gerhard.: Naphthylisoquinoline alkaloids against malaria: evaluationof the curative potentials of dioncophylline C and dioncopeltine A against Plasmodiumberghei in vivo. In: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 41 (1997), S. 2533–2539
[63] Warhurst, C. D. ; Craig, John C. ; Adagu, S. I. ; Meyer, David J. ; Lee, Sylvia Y.: Therelationship of physico-chemical properties and structure to the differential antiplasmodialactivity of the cinchona alkaloids. In: Malaria Journal 2 (2003), S. 1–14
[64] Hawley, Shaun R. ; Bray, Patrick G. ; O’Neill, Paul M. ; Park, B. K. ; Ward,Stephen A.: The role of drug accumulation in 4-aminoquinoline antimalarial potency.The influence of structural substitution and physicochemical properties. In: BiochemicalPharmacology 52 (1996), S. 723–733
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ZUSAMMENFASSUNG 25
[65] Yayon, A. ; Cabantchik, Z. I. ; Ginsburg, H.: Identification of the acidic compartmentof Plasmodium falciparum-infected human erythrozytes as the target of the antimalarialdrug chloroquine. In: The EMBO Journal 3 (1984), S. 2695–2700
[66] Olliaro, L. P. ; Goldberg, E. D.: The plasmodium digestive vacuole: metabolic head-quarters and choice drug target. In: Parasitol Today 11 (1995), S. 294–297
[67] Bohle, D. S. ; Conklin, Brenda J. ; Cox, David ; Madsen, Sara K. ; Paulson, Scott ;Stephens, Peter W. ; Yee, Gordon T.: Structural and spectroscopic studies of ß-hematin(the heme coordination polymer in malaria pigment). In: ACS Symposium Series 572(1994), S. 497–515
[68] Bohle, D. S. ; Dinnebier, Robert E. ; Madsen, Sara K. ; Stephens, Peter W.: Charac-terization of the products of the heme detoxification pathway in malarial late trophozoitesby x-ray diffraction. In: Journal of Biological Chemistry 272 (1997), S. 713–716
[69] Egan, Timothy J. ; Ncokazi, Kanyile K.: Quinoline antimalarials decrease the rate ofb-hematin formation. In: Journal of Inorganic Biochemistry 99 (2005), S. 1532–1539
[70] Leed, Alison ; DuBay, Kateri ; Ursos, Lyann M. B. ; Sears, Devin ; Dios, Angel C. ;Roepe, Paul D.: Solution Structures of Antimalarial Drug-Heme Complexes. In: Bioche-mistry 41 (2002), S. 10245–10255
[71] De Dios, Angel C. ; Tycko, Robert ; Ursos, Lyann M. B. ; Roepe, Paul D.: NMRstudies of chloroquine-ferriprotoporphyrin IX complex. In: Journal of Physical ChemistryA 107 (2003), S. 5821–5825
[72] Constantinidis, I. ; Satterlee, James D.: UV-visible and carbon NMR studies ofquinine binding to urohemin I chloride and uroporphyrin I in aqueous solution. In: Journalof the American Chemical Society 110 (1988), S. 927–932
[73] Constantinidis, I. ; Satterlee, James D.: UV-visible and carbon NMR studies ofchloroquine binding to urohemin I chloride and uroporphyrin I in aqueous solutions. In:Journal of the American Chemical Society 110 (1988), S. 4391–4395
[74] Buller, Ronit ; Peterson, Matthew L. ; Almarsson, Oern ; Leiserowitz, Leslie.:Quinoline Binding Site on Malaria Pigment Crystal: A Rational Pathway for AntimalariaDrug Design. In: Crystal Growth & Design 2 (2002), S. 553–562
[75] Trager, W. ; Jensen, B. J.: Human malaria parasites in continuous culture. In: Science193 (1976), S. 673–675
[76] Lambros, C. ; Vanderberg, P. J.: Synchronization of Plasmodium falciparum erythro-cytic stages in culture. In: J Parasitol 65 (1976), S. 418–420
[77] Pasvol, G. ; Wilson, J. R. ; Smalley, E. M. ; Brown, J.: Separation of viable schizont-infected red cells of Plasmodium falciparum from human blood. In: Ann Trop Med Parasitol72 (1978), S. 87–88
[78] Cranmer, S. L. ; Magowan, C. ; Liang, J. ; Coppel, R. L. ; Cooke, B. M.: Analternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. In: Trans R SocTrop Med Hyg 91 (1997), S. 363–365
[79] Jaramillo, Maritza ; Gowda, D. C. ; Radzioch, Danuta ; Olivier, Martin.: Hemo-zoin Increases IFN-g-Inducible Macrophage Nitric Oxide Generation Through Extracellu-lar Signal-Regulated Kinase- and NF-kB-Dependent Pathways. In: Journal of Immunology171 (2003), S. 4243–4253
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26 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[80] Bohle, D. S. ; Helms, Jeffrey B.: Synthesis of ß-hematin by dehydrohalogenation ofhemin. In: Biochemical and Biophysical Research Communications 193 (1993), S. 504–508
[81] Bohle, D. S. ; Kosar, Andrew D. ; Stephens, Peter W.: Phase homogeneity and crystalmorphology of the malaria pigment ß-hematin. In: Acta Crystallographica, Section D:Biological Crystallography D58 (2002), S. 1752–1756
[82] Egan, Timothy J. ; Mavuso, Winile W. ; Ncokazi, Kanyile K.: The mechanism ofb-hematin formation in acetate solution. Parallels between hemozoin formation and bio-mineralization processes. In: Biochemistry 40 (2001), S. 204–213
[83] Frisch, G. W.; Schlegel H. B.; Scuseria G. E.; Robb M. A.; Cheeseman J. R.; MontgomeryJr. J. A.; Vreven T.; Kudin K. N.; Burant J. C.; Millam J. M.; Iyengar S. S.; Tomasi J.;Barone V.; Mennucci B.; Cossi M.; Scalmani G.; Rega N.; Petersson G. A.; Nakatsuji H.;Hada M.; Ehara M.; Toyota K.; Fukuda R.; Hasegawa J.; Ishida M.; Nakajima T.; HondaY.; Kitao O.; Nakai H.; Klene M.; Li X.; Knox J. E.; Hratchian H. P.; Cross J. B.; BakkenV.; Adamo C.; Jaramillo J.; Gomperts R.; Stratmann R. E.; Yazyev O.; Austin A. J.;Cammi R.; Pomelli C.; Ochterski J. W.; Ayala P. Y.; Morokuma K.; Voth G. A.; SalvadorP.; Dannenberg J. J.; Zakrzewski V. G.; Dapprich S.; Daniels A. D.; Strain M. C.; FarkasO.; Malick D. K.; Rabuck A. D.; Raghavachari K.; Foresman J. B.; Ortiz J. V.; Cui Q.;Baboul A. G.; Clifford S.; Cioslowski J.; Stefanov B. B.; Liu G.; Liashenko A.; Piskorz P.;Komaromi I.; Martin R. L.; Fox D. J.; Keith T.; Al-Laham M. A.; Peng C. Y.; NanayakkaraA.; Challacombe M.; Gill P. M. W.; Johnson B.; Chen W.; Wong M. W.; Gonzalez C. M.J.; Trucks T. M. J.; Trucks ; Pople, J. A.: Gaussian 03, Revision C.02. Gaussian, Inc.:Wallingford, CT, 2004
[84] Becke, Axel D.: Density-functional thermochemistry. II. The effect of the Perdew-Wanggeneralized-gradient correlation correction. In: Journal of Chemical Physics 97 (1992), S.9173–9177. – B mit PW91 getested
[85] Becke, Axel D.: Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange.In: Journal of Chemical Physics 98 (1993), S. 5648–5652. – B3: zus. mit PW91 gefittet,getestet
[86] Perdew, John P. ; Chevary, J. A. ; Vosko, S. H. ; Jackson, Koblar A. ; Pederson,Mark R. ; Singh, D. J. ; Fiolhais, Carlos.: Atoms, molecules, solids, and surfaces: applica-tions of the generalized gradient approximation for exchange and correlation. In: PhysicalReview B: Condensed Matter and Materials Physics 46 (1992), S. 6671–6187
[87] Perdew, John P. ; Wang, Yue: Accurate and simple analytic representation of the elctron-gas correlation. In: Physical Review B: Condensed Matter and Materials Physics 45 (1992),S. 13244–13249
[88] Perdew, John P. ; Burke, Kieron ; Wang, Yue: Generalized gradient approximation forthe exchange-correlation hole of a many-electron system. In: Physical Review B: CondensedMatter and Materials Physics 54 (1996), S. 16533–16539
[89] Stephens, P. J. ; Devlin, F. J. ; Chabalowski, C. F. ; Frisch, M. J.: Ab Initio Calcu-lation of Vibrational Absorption and Circular Dichroism Spectra Using Density FunctionalForce Fields. In: Journal of Physical Chemistry 98 (1994), S. 11623–11627
[90] Lee, Chengteh ; Yang, Weitao ; Parr, Robert G.: Development of the Colle-Salvetticorrelation-energy formula into a functional of the electron density. In: Physical Review B:Condensed Matter and Materials Physics 37 (1988), S. 785–789
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ZUSAMMENFASSUNG 27
[91] Becke, A. D.: Density-functional exchange-energy approximation with correct asymptoticbehavior. In: Physical Review A: Atomic, Molecular, and Optical Physics 38 (1988), S.3098–3100. – Becke exchange functional (B)
[92] Pople, J. A. ; Schlegel, H. B. ; Krishnan, R. ; Defrees, D. J. ; Binkley, J. S. ;Frisch, M. J. ; Whiteside, R. A. ; Hout, R. F. ; Hehre, W. J.: Molecular orbital studiesof vibrational frequencies. In: International Journal of Quantum Chemistry, QuantumChemistry Symposium 15 (1981), S. 269–278
[93] Frisch, Michael J. ; Pople, John A. ; Binkley, J. S.: Self-consistent molecular orbitalmethods. 25. Supplementary functions for Gaussian basis sets. In: Journal of ChemicalPhysics 80 (1984), S. 3265–3269
[94] Hehre, W. J. ; Stewart, Robert F. ; Pople, John A.: Self-consistent molecular-orbitalmethods. I. Use of Gaussian expansions of Slater-type atomic orbitals. In: Journal ofChemical Physics 51 (1969), S. 2657–2664
[95] Schaefer, Ansgar ; Huber, Christian ; Ahlrichs, Reinhart.: Fully optimized contractedGaussian basis sets of triple zeta valence quality for atoms Li to Kr. In: Journal of ChemicalPhysics 100 (1994), S. 5829–5835
[96] Scott, Anthony P. ; Radom, Leo.: Harmonic Vibrational Frequencies: An Evaluationof Hartree-Fock, Moeller-Plesset, Quadratic Configuration Interaction, Density FunctionalTheory, and Semiempirical Scale Factors. In: Journal of Physical Chemistry 100 (1996),S. 16502–16513
[97] Baker, Jon ; Jarzecki, Andrzej A. ; Pulay, Peter.: Direct Scaling of Primitive ValenceForce Constants: An Alternative Approach to Scaled Quantum Mechanical Force Fields.In: Journal of Physical Chemistry A 102 (1998), S. 1412–1424
[98] Rauhut, Guntram ; Pulay, Peter.: Transferable Scaling Factors for Density FunctionalDerived Vibrational Force Fields. In: Journal of Physical Chemistry 99 (1995), S. 3093–3100
[99] Halls, Mathew D. ; Schlegel, H. B.: Comparison of the performance of local, gradient-corrected, and hybrid density functional models in predicting infrared intensities. In: Jour-nal of Chemical Physics 109 (1998), S. 10587–10593
[100] Andersson, M. P. ; Uvdal, P.: New Scale Factors for Harmonic Vibrational FrequenciesUsing the B3LYP Density Functional Method with the Triple-z Basis Set 6-311+G(d,p).In: Journal of Physical Chemistry A 109 (2005), S. 2937–2941
[101] Wiberg, Kenneth B.: Basis set effects on calculated geometries: 6-311++G** vs. aug-cc-pVDZ. In: Journal of Computational Chemistry 25 (2004), S. 1342–1346
[102] Bauschlicher, Charles W. ; Langhoff, Stephen R.: The calculation of accurate har-monic frequencies of large molecules: the polycyclic aromatic hydrocarbons, a case study.In: Spectrochimica Acta, Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 53A (1997), S.1225–1240
[103] Sinha, Pankaj ; Boesch, Scott E. ; Gu, Changming ; Wheeler, Ralph A. ; Wilson,Angela K.: Harmonic Vibrational Frequencies: Scaling Factors for HF, B3LYP, and MP2Methods in Combination with Correlation Consistent Basis Sets. In: Journal of PhysicalChemistry A 108 (2004), S. 9213–9217
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28 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[104] Halls, Mathew D. ; Velkovski, Julia ; Schlegel, H. B.: Harmonic frequency scalingfactors for Hartree-Fock, S-VWN, B-LYP, B3-LYP, B3-PW91 and MP2 with the SadlejpVTZ electric property basis set. In: Theoretical Chemistry Accounts 105 (2001), S. 413–421
[105] Wilson, Jr. E. B. E. Bright: A method of obtaining the expanded secular equation for thevibration frequencies of a molecule. In: Journal of Chemical Physics 7 (1939), S. 1047–1052
[106] Wilson, Jr. E. B. E. Bright: Some mathematical methods for the study of molecularvibrations. In: Journal of Chemical Physics 9 (1941), S. 76–84
[107] Martin, J. M. L. ; Van Alsenoy, C.: GAR2PED
[108] Karle, Jean M. ; Karle, Isabella L.: Redetermination of the crystal and molecularstructure of the antimalarial chloroquine bis(dihydrogenphosphate) dihydrate. In: ActaCrystallographica, Section C: Crystal Structure Communications C44 (1988), S. 1605–1608
[109] Tomasi, Jacopo ; Mennucci, Benedetta ; Cammi, Roberto.: Quantum Mechanical Con-tinuum Solvation Models. In: Chemical Reviews (Washington, DC, United States) 105(2005), S. 2999–3093
[110] Popp, J. ; Schmitt, M.: Raman spectroscopy breaking terrestrial barriers! In: Journal ofRaman Spectroscopy 35 (2004), S. 429–432
[111] Popp, J. ; Tarcea, N. ; Kiefer, W. ; Hilchenbach, M. ; Thomas, N. ; Hofer, S. ;Stuffler, T.: Investigations on Mars model minerals by in situ laser Raman spectroscopy.In: European Space Agency, [Special Publication] SP SP-496 (2001), S. 193–196
[112] Wang, Alian ; Haskin, Larry A. ; Cortez, Enriqueta.: Prototype Raman spectroscopicsensor for in situ mineral characterization on planetary surfaces. In: Applied Spectroscopy52 (1998), S. 477–487
[113] Wang, Alian ; Jolliff, Bradley L. ; Haskin, Larry A.: Raman spectroscopic charac-terization of a highly weathered basalt: igneous mineralogy, alteration products, and amicroorganism. In: Journal of Geophysical Research, [Planets] 104 (1999), S. 27067–27077
[114] Wang, Alian ; Haskin, Larry A. ; Lane, Arthur L. ; Wdowiak, Thomas J. ; Squyres,Steven W. ; Wilson, Robert J. ; Hovland, Larry E. ; Manatt, Ken S. ; Raouf, Nas-rat ; Smith, Christopher D.: Development of the Mars microbeam Raman spectrometer(MMRS). In: Journal of Geophysical Research, [Planets] 108 (2003), S. 5/1–5/18
[115] Edwards, H. G. M. ; Farwell, D. W. ; Grady, M. M. ; Wynn-Williams, D. D. ;Wright, I. P.: Comparative Raman microscopy of a Martian meteorite and Antarcticlithic analogues. In: Planetary and Space Science 47 (1999), S. 353–362
[116] Ellery, Alex ; Wynn-Williams, David ; Parnell, John ; Edwards, Howell G. M. ;Dickensheets, David.: The role of Raman spectroscopy as an astrobiological tool in theexploration of Mars. In: Journal of Raman Spectroscopy 35 (2004), S. 441–457
[117] Rull, F. ; Martinez-Frias, J. ; Sansano, A. ; Medina, J. ; Edwards, H. G. M.:Comparative micro-Raman study of the Nakhla and Vaca Muerta meteorites. In: Journalof Raman Spectroscopy 35 (2004), S. 497–503
[118] Haskin, Larry A. ; Wang, Alian ; Rockow, Kaylynn M. ; Jolliff, Bradley L. ; Koro-tev, Randy L. ; Viskupic, Karen M.: Raman spectroscopy for mineral identification andquantification for in situ planetary surface analysis: a point count method. In: Journal ofGeophysical Research, [Planets] 102 (1997), S. 19293–19306
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ZUSAMMENFASSUNG 29
[119] Dickensheets, David L. ; Wynn-Williams, David D. ; Edwards, Howell G. M. ;Schoen, Christian ; Crowder, Chelle ; Newton, Emma M.: A novel miniature con-focal microscope/Raman spectrometer system for biomolecular analysis on future Marsmissions after Antarctic trials. In: Journal of Raman Spectroscopy 31 (2000), S. 633–635
[120] Langenhorst, F. ; Poirier, J.-P.: ’Eclogitic’ minerals in a shocked basaltic meteorite.In: Earth and Planetary Science Letters 176 (2000), S. 259–265
[121] Langenhorst, F. ; Poirier, J.-P.: Anatomy of black veins in Zagami: clues to theformation of high-pressure phases. In: Earth and Planetary Science Letters 184 (2000), S.37–55
[122] Spiro, Thomas G. ; Li, Xiao-Yuan: Resonance Raman Spectroscopy of Metalloporphyrins:in Biological Applications of Raman Spectroscopy, Vol.1. Wiley & Sons Inc.: New York,1988
[123] Perrin, Marilyn H. ; Gouterman, Martin ; Perrin, Charles L.: Vibronic coupling. VI.Vibronic borrowing in cyclic polyenes and porphyrin. In: Journal of Chemical Physics 50(1969), S. 4137–4150
[124] Gouterman, Martin.: Spectra of porphyrins. In: Journal of Molecular Spectroscopy 6(1961), S. 138–163
[125] Albrecht, Andreas C.: The theory of Raman intensities. In: Journal of Chemical Physics34 (1961), S. 1476–1484
[126] Tang, J. ; Albrecht, A. C.: Developments in The Theories of Vibrational Raman In-tensities: in Raman Spectroscopy Theory and Practice, Vol. 2. Plenum Press: New York,1970
[127] Abe, M. ; Kitagawa, T. ; Kyogoku, Y.: Resonance Raman spectra of octaethylporphy-rinatonickel(II) and meso-deuterated and nitrogen-15 substituted derivatives. II. A normalcoordinate analysis. In: Journal of Chemical Physics 69 (1978), S. 4526–4534
[128] Choi, S. ; Spiro, T. G. ; Langry, K. C. ; Smith, K. M.: Vinyl influences on protohemeresonance Raman spectra: nickel(II) protoporphyrin IX with deuterated vinyl groups. In:Journal of the American Chemical Society 104 (1982), S. 4337–4344
[129] Choi, S. ; Spiro, T. G. ; Langry, K. C. ; Smith, K. M. ; Budd, D. L. ; La Mar, G. N.:Structural correlations and vinyl influences in resonance Raman spectra of protohemecomplexes and proteins. In: Journal of the American Chemical Society 104 (1982), S.4345–4351
[130] Hu, Songzhou ; Smith, Kevin M. ; Spiro, Thomas G.: Assignment of protoheme resonanceRaman spectrum by heme labeling in myoglobin. In: Journal of the American ChemicalSociety 118 (1996), S. 12638–12646
[131] Gardiner, D. J. ; Girling, R. B. ; Hester, R. E.: Raman difference spectra of solutionsof electrolytes in formamide. In: Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions 2:Molecular and Chemical Physics 71 (1975), S. 709–713
[132] Laane, Jaan.: Determination of bandwidth and frequency changes by Raman differencespectroscopy. In: Journal of Chemical Physics 75 (1981), S. 2539–2545
[133] Laane, J. ; Eichele, H. ; Hohenberger, H. P. ; Kiefer, W.: Precise measurementof small isotopic shifts with Raman difference spectroscopy. In: Journal of MolecularSpectroscopy 86 (1981), S. 262–265
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30 KAPITEL 1. ZUSAMMENFASSUNG
[134] Laane, Jaan ; Kiefer, Wolfgang.: Measurement of solvent shifts by Raman differencespectroscopy. In: Applied Spectroscopy 35 (1981), S. 267–271
[135] Laane, Jaan ; Kiefer, Wolfgang.: Applications of four-channel Raman difference spec-troscopy. In: Applied Spectroscopy 35 (1981), S. 428–432
[136] Rousseau, D. L.: Raman difference spectroscopy as a probe of biological molecules. In:Journal of Raman Spectroscopy 10 (1981), S. 94–99
[137] Moskovits, Martin ; Michaelian, Kirk.: Double-beam Raman difference spectroscopy.In: Applied Optics 16 (1977), S. 2044–2045
[138] Martin, J. C.: Rotating mirror device for nonresonant laser Raman difference spectros-copy. In: Review of Scientific Instruments 56 (1985), S. 2217–2221
[139] Kamogawa, Keiji ; Kitagawa, Teizo.: A new device for Raman difference spectroscopyand its application to observe frequency shifts due to isotope mixing. In: Journal of PhysicalChemistry 94 (1990), S. 3916–3921
[140] Deckert, V. ; Liebler, W. ; Eck, R. ; Kiefer, W.: New device for Raman differencespectroscopy with multichannel and scanning multichannel detection. In: Applied Spec-troscopy 51 (1997), S. 939–943
[141] Laane, Jaan ; Kiefer, Wolfgang.: Determination of frequency shifts by Raman differencespectroscopy. In: Journal of Chemical Physics 72 (1980), S. 5305–5311
[142] Murray, C. A. ; Dierker, S. B.: Use of an unintensified charge-coupled device detectorfor low-light-level Raman spectroscopy. In: Journal of the Optical Society of America A:Optics, Image Science, and Vision 3 (1986), S. 2151–2159
[143] Kiefer, W. ; Bernstein, H. J.: Cell for resonance Raman excitation with lasers in liquids.In: Applied Spectroscopy 25 (1971), S. 500–501
[144] Kiefer, W. ; Bernstein, H. J.: Rotating Raman sample technique for colored crystalpowders. Resonance Raman effect in solid potassium permanganate. In: Applied Spectros-copy 25 (1971), S. 609–613
[145] Akins, Daniel L. ; Oezcelik, Serdar ; Zhu, Han-Ru ; Guo, Chu.: Aggregation-EnhancedRaman Scattering of a Cyanine Dye in Homogeneous Solution. In: Journal of PhysicalChemistry A 101 (1997), S. 3251–3259
[146] Oezcelik, Serdar ; Akins, Daniel L.: Nature of Exciton-Exciton Annihilation in anAggregated Cyanine Dye. In: Journal of Physical Chemistry B 101 (1997), S. 3021–3024
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Kapitel 2
Veröffentlichungen
Im Folgenden sind die Nachdrucke der im Rahmen der Dissertation erschienenen
Publikationen aufgeführt. Die Urheberrechte sind jeweils auf dem Deckblatt ange-
geben.
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32 KAPITEL 2. VERÖFFENTLICHUNGEN
2.1 Structural Analysis of the Anti-Malaria
Active Agent Chloroquine under Physiolo-
gical Conditions. [TF1]
Torsten Frosch, Michael Schmitt, GerhardBringmann, Wolfgang Kiefer, and Jürgen Popp
J. Phys. Chem. B 2007, 111, 7, 1815-1822
Der Nachdruck der folgenden Publikation erscheint mit freundlicher
Genehmigung der American Chemical Society. Reprinted with kind
permission of American Chemical Society.
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VERÖFFENTLICHUNGEN 33
Structural Analysis of the Anti-Malaria Active Agent Chloroquine under Physiological
Conditions
Torsten Frosch,† Michael Schmitt,† Gerhard Bringmann,‡ Wolfgang Kiefer,§ andJu1rgen Popp*,†,⊥
Institut für Physikalische Chemie, Friedrich-Schiller-UniVersität Jena, Helmholtzweg 4, D-07743 Jena,Germany, Institut für Organische Chemie, UniVersität Würzburg, Am Hubland, D-97074 Würzburg, Germany,Institut für Physikalische Chemie, UniVersität Würzburg, Am Hubland, D-97074 Würzburg, Germany, andInstitut für Physikalische Hochtechnologie e.V., Albert-Einstein-Strasse 9, D-07745 Jena, Germany
ReceiVed: August 9, 2006; In Final Form: October 25, 2006
UV resonance Raman spectroscopy was applied for a selective enhancement of molecular vibrations of theimportant antimalarial chloroquine under physiological conditions. The resonance Raman spectra of chloroquineat pH values resembling the pH value of blood and the pH value of the acid food vacuole of plasmodium canunambiguously be distinguished via Raman resonantly enhanced mode at 721 cm-1. These vibrations areassigned to -(CH2)n- rocking mode of the chloroquine side chain and are expected to be influenced byprotonation of chloroquine. Furthermore, vibrations belonging to the quinoline ring (important for π-π-interactions to hemozoin) are resonantly enhanced and can be studied selectively. A convincing modeassignment was performed by means of DFT calculations. These calculations proved that the differentprotonation states of chloroquine remarkably influence various vibrational modes, the molecular geometry,and molecular orbitals. The presented results are of significant relevance for a Raman spectroscopicallocalization of chloroquine inside the acid food vacuole of plasmodium, the study of π-π-interactions ofchloroquine to the biological target molecules hematin and hemozoin and the protonation state of chloroquineduring this docking process. The protonation of the weak base chloroquine is considered to be crucial for anaccumulation inside the acid food vacuole of plasmodium and an object for resistances against this drug.
Introduction
Malaria has existed for approximately thirty million yearsand antimalarials have been known for hundreds of years.Chloroquine (Figure 1), related to quinine, was discovered byHans Andersag from Bayer Company in 1934 and was the firstsynthetic antimalarial produced on an industrial scale. Chloro-quine became the leading antimalarial attributed to its outstand-ing properties and caused one the most important healthadvances ever achieved by a drug against an infectious disease.1,2
Despite this public health impact and arising resistances againstchloroquine on a global scale, is its mode of action on amolecular level is still not fully understood.Chloroquine is believed to act by interfering the detoxification
process of the hemoglobin digestion byproducts in the red bloodcell state of plasmodium asexual life cycle.3-9 It has beensuggested that both, the quinoline ring system (via π-π-interaction to the porphyrin aromatic system in hemozoin) andthe aliphatic side chain are crucial for the mode of action ofchloroquine.10-13 It was demonstrated that the weak basicity ofthe quinoline nitrogen and the tertiary amine nitrogen withinthe