Ensayo FRAP

ENSAYO DE FRAP

(Ferric Reducing Antioxidant Power)

REACTIVOS

Reactivo Nombre Marca No. Cat.TPTZ 2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,

minimum 98%Sigma T1253-1g

Cloruro Férrico Hexahidratado

Iron (III) chloride hexahydrate, minimum 98%

Sigma-Aldrich F2877-100g

Sulfato Férrico Heptahidratado

Iron (III) sulfate heptahydrate, 99+% A.C.S. reagent

Sigma-Aldrich 215422-250g

Ácido Clorhídrico Ácido Clorhídrico 36.5-38.0% J.T. Baker 9535-02Ácido Acético Glacial

Acetic Acid Glacial J.T. Baker 9507-02

Acetato de Sodio Sodium acetate trhydrate, A.C. S. reagent

Aldrich 236500-500g

Metanol Alcohol metílico J.T. Baker 9093-03Agua Destilada

MATERIAL

- Matraces aforados de 5 mL con tapa - Matraces aforados de 10 mL con tapa- Matraz aforado de 50 mL- Matraz aforado de 250 mL- Viales de 20 mL con tapa - Viales ámbar de 4.5 mL con tapa - Micropipetas de 20, 100, 200, 1000 y 5000 L y puntas- Pipeta multi-canal y puntas- Placas para lector de Elisa- Termómetro - Papel aluminio - Parafilm  

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Solución estándar de Sulfato ferroso FeSO4 7H2O

PM de Sulfato ferroso FeSO4 7H2O: 278.01g/mol.

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Se pesan 10 mg de FeSO4 7H2O, y se disuelven con metanol en un matraz volumétrico de 5ml (Solución A).

A partir de la solución A se obtienen las siguientes diluciones (Cuadro 1).

Cuadro1. Preparación de diluciones de FeSO4 7H2O

No. Conc.

[M] Vol. de Solución A (L)

Vol. de Metanol (L)

1 72 10 9902 360 50 9503 540 75 9254 895 125 8755 1079.5 150 8 506 1259 175 8 257 1439 200 800

Solución de Ácido clorhídrico 40 mM (HCl)

PM de HCl: 36.45 g/mol

Para preparar 50 mL de esta solución, se colocan aproximadamente 10 mL de agua destilada en un matraz volumétrico de 50 mL y se añaden cuidadosamente 170.214 L de HCl, llenando finalmente al volumen del aforo.

Solución amortiguadora de acetato 300 mM a pH de 3.6

PM de CH3COONa. 3H2O: 136.08 g/molPM de CH3COOH: 60.08 g/mol

Para preparar la solución amortiguadora de acetato se pesan 683.802 mg de acetato de sodio (CH3COONa) disolviendo con agua destilada en un matraz aforado de 250 mL. Se agregan 4 mL de ácido acético glacial (CH3COOH) y se lleva al volumen del aforo. Se valora el pH de la solución. Si es necesario el pH se puede ajustar con ácido acético glacial.

Solución de Cloruro Férrico Hexahidratado 20 mM (FeCl3 6H2O) PM de FeCl3 6H2O: 270.3 g/mol

Para preparar 10 mL de esta solución se pesan 54.06 mg de FeCl3 6H2O y se afora con agua destilada. Para evitar la oxidación de la solución se envuelve con aluminio el recipiente que la contenga.

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Solución de 2, 4, 6, tris (2-priridil)-s-triazina 10 mM (TPTZ)

PM de TPTZ: 312.34 g/mol

Para preparar 5 mL de este reactivo se pesan 15.6 mg de TPTZ y se utiliza como disolvente la solución 40 mM de HCl. Para evitar la oxidación del reactivo se envuelve con aluminio el recipiente que lo contenga.

NOTA IMPORTANTE: Tanto el cloruro férrico y el TPTZ deben de disolverse cuando los pozos ya hayan sido llenados con las diluciones de sulfato ferroso, control, blanco y solución amortiguadora.

Solución FRAP

Para preparar la solución FRAP se mezclan 10 mL de la solución amortiguadora de acetato, 1 mL de la solución de FeCl3 6H2O (20 mM) y 1 mL del reactivo TPTZ 10 mM.

NOTA: Los reactivos en solución empleados para preparar la solución FRAP deben de estar previamente calentados en baño seco a 37° C antes de adicionarse a la solución amortiguadora. MUY IMPORTANTE.

 PROCEDIMIENTO

1. Diseño de la placa 

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A Bco1 Bco1 Bco1 F7 F7 F7 F7 + Buffer

B Control Control Control Control+Buffer

C F1 F1 F1 F1 + Buffer

D F2 F2 F2 F2 + Buffer

E F3 F3 F3 F3 + Buffer

F F4 F4 F4 F4 + Buffer

G F5 F5 F5 F5 + Buffer

H F6 F6 F6 F6 + Buffer

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# Pocillos = 96

2. Encender el equipo (SpectraMax 190) para que el lámpara se vaya calentando.

3. Se prende la computadora y se introducen las condiciones en las que se va a trabajar:

a) Se abre el programa SoftMax Pro v5

b) En la barra del programa localizar la opción de Control y seleccionarla.

c) Dentro de esta opción seleccionar “Incubator…”

d) Determinar la temperatura de 37°C.

e) Se abrirá un cuadro con el nombre: “Basic End Point”

f) Seleccionar la opción “Settings” haciendo clic sobre el icono

g) En el cuadro “SpectraMax 190 settings” se muestran tres opciones:

     Endpoint: si se quiere hacer una lectura en un solo tiempo (Punto Final)

     Kinetic: si se requieren hacer lecturas a través del tiempo.

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     Spectrum.  

Para esta técnica se elige la opción “Endpoint” y se ingresan los siguientes parámetros haciendo clic sobre cada opción: 

Wavelengths:

Wavelengths: 1

Lm1 (Longitud de onda): 595 nm 

Path Check :

Of

Automix & Blanking:

Before First Read: 5 secs    

Pre-Read Plate: off 

Autocalibrate:

 On

Strips:

Con el mouse se seleccionan las columnas que serán utilizadas, basándose en el llenado de la placa con el fin de que el equipo sólo lea los pocillos en donde haya muestra y no se gaste energía en leer pozos que no contengan nada. 

Column Wavelength Priority:

Column Priority 

Autoread:

Off 

Para finalizar dar clic en OK para guardar las condiciones de trabajo. 

h) El siguiente paso es asignar a cada pocillo un nombre para identificar que muestra contiene en específico. Se selecciona la opción “Template” dando clic sobre el icono

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Se abrirá el cuadro “Exp01: Plate01”

Sobre la cuadricula con el mouse se selecciona el (los) pocillo(s) a nombrar, en el recuadro “Groups” se elige la opción “Blank” del menú desplegable; después se da un clic en “Assign” para que se nombren los pocillos seleccionados como “blanco”. 

Los cuadros correspondientes a cada pocillo seleccionado cambian de color. Para los pocillos con la muestra control se elige la opción “Control” y “Assign”. Si se trabaja con estándares, se elige la opción “Standards” La opción “Clear” nos permite corregir en caso de error. 

Para nombrar el resto de los pocillos se elige la opción “New…+”del menú desplegable. Se abrirá el cuadro “Group Settings” Del menú desplegable “column format” se elige la opción “unknows”. Se escribe el nombre de nuestro grupo en la opción “Name” y se da clic en “OK” para que guardar los cambios. Se repite la operación para cada grupo nuevo. 

Al terminar de nombrar los pocillos, se elige la opción “OK” para guardar los cambios en las condiciones de trabajo. 

4. Llenado de la placa

Se recomienda que la línea A sea para el Blanco 1, para esto se agregan 200 L del disolvente en el que estén las muestras. 

Empezar a llenar de izquierda a derecha con las distintas concentraciones del estándar que es el FeSO4 7H2O, con su respectivo Blanco (dilución + buffer) y las muestras (agregar solamente 25 L y en el caso del Blanco de la muestra agregar 175 L de la solución amortiguadora). Cada muestra debe agregarse en la placa por triplicado.  Los pocillos o líneas que se vayan llenando deben ir tapándose con parafilm, para evitar que se volatilice el disolvente, al término del llenado la placa se debe cubrir con el parafilm y con papel aluminio para protegerlo de la luz y evitar la degradación de la sustancias, se guarda de este modo hasta la adición de la solución FRAP. 

Agua destilada(μl)

FeSO4

(l)Muestra

(l)Buffer

(μl)Sol. FRAP (μl)

Bco1 200Bco2 25 175

Fn 25 175M 25 175

BcoMn 25 175Bco1 = Blanco.  Bco2 = Solución Sin FRAP.F= Solución de FeSO4 7H2O con FRAP a las diferentes concentraciones.M= Muestra.

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BcoMn = Blanco dela muestra.

* Si las muestras se solubizaron en otro disolvente diferente al metanol, se debe incluir en los pocillos, por ejemplo agua destilada. 

Se coloca la solución FRAP en el dispensador y con la pipeta multicanal agregar a cada pocillo que contenga FeSO4 7H2O y muestra (a excepción del Blanco2), 175 L de FRAP para completar a 200 L con los 25 L que se agregaron previamente, al finalizar se cubre con papel aluminio para evitar la reducción del radical y su posterior pérdida de actividad. 

5. Lectura

La placa se coloca en el porta placas del equipo, para esto es importante que las columnas y filas coincidan con el diseño que se ingreso al programa.

Cerrar el porta placas pulsando el botón “Drawer” que se encuentra en el equipo. En el programa, seleccionar la opción “Read” dando clic sobre el ícono de color verde para que el equipo de inicio a las lecturas. 

6. Una vez que el equipo haya terminado de leer, aparecerá en la pantalla una tabla con los resultados de las lecturas, y el equipo sacara la placa, inmediatamente se volverá a introducir la placa al equipo para que continúe la reacción y la operación se repetirá en los tiempo de 0, 4, 10, 30, 60 y 90 minutos.

Los datos de la lectura se pueden guardan como archivo *.pad o bien los datos se pueden exportar a un “bloc de notas”; en el menú “Archivo” se elige la opción “Export”, el programa guarda el archivo en la carpeta de “Mis documentos” solo es necesario asignarle un nombre, una vez teniendo los datos en el bloc de notas se pueden copiar a Excel para realizar cálculos y/o gráficas de cada placa o muestra. 

CALCULOS 

El valor de FRAP para los compuestos puros para cada intervalo de tiempo se calcula de acuerdo a la Ecuación 1, mientras que para determinar el valor de FRAP de los extractos se utiliza la curva de calibración con FeSO4 7H2O:

Ecuación 1. Ecuación para determinar el valor de FRAP

FRAP (M )=¿

∆ at FI=Es el cambio de absorbancia después del intervalo de tiempo del compuesto a evaluar.

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∆ at Fe2+¿ ¿= Es el cambio de absorbancia al mismo intervalo de tiempo para el

sulfato de fierro a la misma concentración.

Se llevarán acabo lecturas de cada una de las muestras y de la curva estándar por triplicado; de los datos colectados se reportará la media y desviación estándar.

Ejemplo:

Valores de absorbancia para cada dilución, control y blanco a cada tiempo de lectura. El valor de absorbancia final se calcula restando el valor del buffer (dilución + buffer) a la absorbancia 1.

MINUTO 0 Abs final

Abs 1BUFFE

R = Abs 1 – buffer PROMEDIO DESV EST

BLANCO 0.0000.00

0 0.000 0.000

CONTROL 0.0480.04

6 0.044 0.012 0.036 0.034 0.032 0.034 0.002

72 0.0480.04

5 0.049 0.068 -0.021-

0.023 -0.020 -0.021 0.002

360 0.1650.18

0 0.228 0.040 0.125 0.140 0.188 0.151 0.033

540 0.4810.32

2 0.362 0.023 0.458 0.299 0.339 0.365 0.083

895 0.7140.52

6 0.730 0.028 0.686 0.498 0.702 0.629 0.113

1079.5 1.0020.95

1 0.973 0.014 0.989 0.937 0.959 0.962 0.026

1259 1.2791.39

2 1.146 0.026 1.253 1.366 1.120 1.246 0.123

1439 1.4731.70

0 1.558 0.034 1.440 1.667 1.524 1.544 0.115

MIN 4Abs 1 BUFFER Abs final PROMEDIO DES EST

BLANCO 0.002-

0.001 0.000 0.000CONTROL 0.048 0.046 0.044 0.011 0.037 0.036 0.034 0.036 0.002

72 0.050 0.048 0.051 0.071-

0.021 -0.023 -0.020 -0.021 0.001360 0.178 0.306 0.240 0.035 0.143 0.271 0.205 0.206 0.064540 0.488 0.338 0.367 0.023 0.465 0.315 0.344 0.374 0.080895 0.735 0.545 0.746 0.029 0.706 0.517 0.718 0.647 0.113

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1079.5 1.022 0.996 0.993 0.014 1.008 0.982 0.979 0.990 0.0161259 1.321 1.426 1.167 0.025 1.296 1.401 1.143 1.280 0.1301439 1.489 1.719 1.570 0.035 1.454 1.684 1.534 1.557 0.117

MIN 10

Abs 1BUFFE

R Abs final PROMEDIO DES ESBLANCO 0.004 -0.001 -0.001 0.000CONTRO

L 0.049 0.047 0.044 0.010 0.039 0.037 0.034 0.037 0.003

72 0.052 0.050 0.052 0.071 -0.019 -0.021-

0.019 -0.020 0.001360 0.184 0.367 0.244 0.037 0.147 0.330 0.207 0.228 0.093540 0.488 0.342 0.368 0.024 0.464 0.318 0.343 0.375 0.078895 0.735 0.549 0.746 0.029 0.706 0.519 0.717 0.647 0.111

1079.5 1.021 1.002 0.991 0.014 1.007 0.989 0.977 0.991 0.0151259 1.316 1.422 1.166 0.024 1.292 1.398 1.142 1.277 0.1291439 1.484 1.715 1.562 0.036 1.449 1.679 1.527 1.551 0.117

MIN 30

Abs 1BUFFE

R Abs final PROMEDIO DES ESBLANCO 0.003 -0.001 -0.001 0.000CONTRO

L 0.051 0.048 0.046 0.010 0.041 0.038 0.036 0.038 0.003

72 0.065 0.055 0.056 0.072 -0.007 -0.017-

0.016 -0.013 0.005360 0.192 0.348 0.250 0.045 0.147 0.303 0.205 0.219 0.079540 0.486 0.346 0.367 0.025 0.461 0.321 0.342 0.375 0.076895 0.736 0.556 0.743 0.029 0.706 0.526 0.714 0.649 0.106

1079.5 1.020 1.005 0.991 0.014 1.006 0.991 0.977 0.991 0.0151259 1.304 1.409 1.160 0.024 1.280 1.385 1.136 1.267 0.1251439 1.470 1.697 1.547 0.040 1.431 1.657 1.507 1.532 0.115

MIN 60

Abs 1BUFFE

R Abs final PROMEDIO DES ESTBLANCO 0.002 0.000 -0.001 -0.001 0.000

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CONTROL 0.052 0.050 0.047 0.011 0.042 0.040 0.036 0.039 0.003

72 0.060 0.059 0.060 0.073 -0.013-

0.014 -0.013 -0.013 0.001360 0.196 0.348 0.251 0.049 0.147 0.298 0.202 0.216 0.077540 0.480 0.347 0.364 0.025 0.454 0.322 0.339 0.372 0.072895 0.732 0.564 0.739 0.030 0.702 0.534 0.709 0.648 0.099

1079.5 1.016 1.005 0.974 0.014 1.001 0.991 0.960 0.984 0.0221259 1.290 1.393 1.151 0.025 1.265 1.367 1.126 1.253 0.1211439 1.455 1.671 1.530 0.041 1.415 1.630 1.490 1.512 0.110

MIN 90

Abs 1BUFFE

R Abs final PROMEDIODESV

ES

BLANCO 0.0010.00

1 -0.002 -0.001 0.000

CONTROL 0.0540.05

1 0.048 0.010 0.043 0.040 0.037 0.040 0.003

72 0.0620.06

2 0.061 0.073 -0.011-

0.011 -0.012 -0.011 0.001

360 0.1960.31

0 0.249 0.051 0.145 0.259 0.198 0.201 0.057

540 0.4740.34

6 0.361 0.025 0.449 0.321 0.336 0.369 0.070

895 0.7280.56

6 0.736 0.030 0.698 0.536 0.706 0.647 0.096

1079.5 1.0140.99

9 0.962 0.015 1.000 0.984 0.947 0.977 0.027

1259 1.2751.37

9 1.142 0.025 1.251 1.355 1.118 1.241 0.119

1439 1.4441.65

6 1.518 0.041 1.404 1.616 1.477 1.499 0.108

Tomando el valor promedio de cada dilución a cada tiempo de lectura:

0 4 10 30 60 90CONTROL 0.034 0.036 0.037 0.0381 0.0393 0.0401

uM 72 -0.021 -0.021 -0.020 -0.0134 -0.0134 -0.0111

10

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360 0.151 0.206 0.228 0.2186 0.2156 0.2006540 0.365 0.374 0.375 0.3750 0.3719 0.3686895 0.629 0.647 0.647 0.6488 0.6481 0.6469

1079.5 0.962 0.990 0.991 0.9914 0.9841 0.97701259 1.246 1.280 1.277 1.2670 1.2525 1.24081439 1.544 1.557 1.551 1.5317 1.5116 1.4990

Graficando lo anterior (absorbancia vs tiempo):

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

CONTROL723605408951079.512591439

t (min)

Abso

rban

cia

Como se observa en la gráfica la reacción se vuelve estable con el tiempo, por lo tanto, si quisiéramos calcular los valores equivalentes de sulfato de hierro, a un tiempo determinado, por ejemplo minuto 30, tomamos los datos de absorbancia y concentración para graficar y obtener la ecuación de la recta:

FeSO4 MIN 30uM Absorbancias72 -0.0134

360 0.2186540 0.3750895 0.6488

1079.5 0.99141259 1.26701439 1.5317

11

Ensayo FRAP

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

f(x) = 0.00112435800853906 x − 0.189624587504577R² = 0.972992715194169

uM FeSO4

Abso

rban

cia

control 25 metanol 175 de frap

0 4 10 30 60 90

12