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Embrapa- Meio ambiente Junho 2013 Jaguariúna
Dr. Marcelo Asprea
Jefe de Bioterio y Cirugía Experimental
Hospital de Pediatría “Prof Dr. Juan P. Garrahan”
Métodos alternativos
de substituição do animal de
laboratorio
Aprendizagem sem matar: um guia
para a consciência
Usar animais de laboratório........ sem animais de laboratório ???
Alternativas no uso da a.l.
Provas de eficácia e segurança Politica-legislacion As Three Rs na educação e formação Bem-estar dos animal e refinamento Substituição e redução de pesquisa básica
VíDEOS
O rato dePVC no treinamento
microcirúrgico
O número de animais utilizados em programas de formação educacional pode ser reduzida por meio de dispositivos artificiais, como a anastomose e a MD PVC-RAT
Assim, como técnicas in vitro, permitem desenvolver habilidades, tornando mais fácil a transição de modelos vivos
MD PVC-Rat
PLASTINAÇÃO
Processamento de tecido
Obtenção das amostras para trabalhar
Passamos a realizar a dissecação dos corpos São fixados com formol neutralizado a 4% por três dias
Dois dias de lavado
Como corpos preparados passa a transmiti-los através de uma passagem de álcool
isopropílico, para, em seguida, imersão em acetona para um mês
Passar de resina-acetona, provandose 3 diferentes tipos de resinas: MF-100, MC-40 e MF-300 polimorfos de plástico para cada tipo de preparação
Uma vez impregnados vai combinar com o uso de calor e catalisadores
Desenvolvimento de alternativas aceitáveis regulamentares testes in vitro in vivo
Nos últimos quinze anos houve grandes mudanças nos protocolos de avaliação de segurança, desde a introdução e a aceitação de um número crescente de métodos in vitro para esta finalidade, substituição ou complementar testes in vivo
Na busca constante de progressos científicos e considerações éticas
Dentro de EU, em particular, isso levou a mudanças na legislação regulatória relacionados a produtos químicos (REACH) e produtos de consumo (Alteração da Directiva 7º de cosméticos)
O maior desafio para o desenvolvimento de métodos é a necessidade de validar contra um ponto final do conhecimento humano, usando animais vivos
Irritação ocular The skin Ethic Human Corneal Epitheliun(HCE)
O modelo tem sido pre-validado por ECVAM
e foi projetado para identificar as substâncias que podem causar irritação nos olhos
Qualquer substância que provoca uma viabilidade▼50 % após a exposição e a incubação pós-tratamento, é considerado irritante para os olhos
HET CAM
HET CAM
Irritação e corrosão da pele OECD 439 and OECD 41 In Vitro Irritation: Reconstituted Human Epidermis
Test Method and In Vitro Skin Corrosion: Human Skin Model Test.
Episkin é um modelo totalmente validado para avaliação de compostos irritantes
corrosivo em conformidade com a disposição das NU GHS Cat 2
sendo irritante se a viabilidade do tecido após a exposição e pós-tratamento▼ 50%, ou não-irritante se a viabilidade do tecido é ▲ 50 %
e corrosivo para a pele se a viabilidade após exposição de 3 minutos é▼ 50%
ou, se a viabilidade éou, se a viabilidade é▲ 50 % Após a exposição de 3 minutos, mas▼ 15% após 1 h de exposição.
EPI SKIN
• Skin Corrosion • Skin irritation of chemicals • Percutaneous absorption
Uso de artérias criopreservadas de rato
para treinamento em microcirurgia Introdução
Tubos silastic são usados como material de treinamento para anastomose microvascular. No entanto, a textura do
silastic difere do original
Objetivo
No presente trabalho, avalia o uso dos segmentos arteriais preservados de rato para treinamento de anastomose
arterial
Treinamento de microanastomoses com tubos sintéticos. Vários tipos de anastomoses incluindo termo terminal A, a termo lateral B, la lado lateral interrompido C e sutura contínua D, pode ser testado em tubos de silastic.
Resultados
O material de criopreservado tinha em todos os casos, a consistência e a textura dos vasos normais, sendo um método mais confiável para a formação microcirúrgica com materiais sintéticos.
Foi eleito pedículos das artérias congelados aos tubos de silastic
Conclusão
Segmentos criopreservados são um material biológico apropriado para treinamento microcirúrgico. Elas podem ser obtidas de outras experiências, e esta é uma forma eficaz de reduzir o número de animais criados e mortos para fins educacionais
SIMULAÇÃO
“É o processo de criação de um modelo de sistema real para fazer experiências com ele, a fim de compreender seu comportamento ou avaliar novas estratégias, dentro dos limite impostos por um determinado critério ou uma combinação deles, para o seu funcionamento”
R.E. Shannon
Winter Simulation Conference
(WSC)
The Winter Simulation Conference (WSC) é o principal fórum para divulgar os últimos desenvolvimentos no campo da simulação Além de uma qualidade técnica e programa de extensão incomparável, WSC Ele fornece um local proeminente em simulação para médicos, pesquisadores, disciplinas da indústria, serviços, governo, militares e setores acadêmicos. En 2011 WSC fue " Simulação para um mundo sustentável "
Utilidade na avaliação
O fornecimento de tecnologias de simulação nos dá possibilidades emocionantes para avaliação de competências e a melhoria da prática clínica
Quando usado de forma criativa e adequada, eles formam um instrumento útil para os educadores que fazem a seguinte pergunta:
‘’Esse profissional é competente? ‘’
Perguntas e respostas...
“Aprendizagem com simuladores se baseiam nos objetivos. Podemos aprender com base em erros e refletir sobre eles ’’
‘' Só aprendemos quando temos uma pergunta e buscamos a resposta e não quando a resposta
nos aparece sem que procuremos por ela ”
Simulação-objetivos
Fornecem elementos para a formação inicial e contínua de alunos e profissionais, evitando riscos aos pacientes
Desenvolver programas de estudo contendo experiências educacionais controladas, podem ser reproduzidos com simuladores de alta tecnologia
Simulação-objetivos
Contribuir para as certificações das faculdades e instituições pertencentes ao sistema de saúde
Reduzir os custos diretos e indiretos a eventos adversos em institutos de saúde
Estabelecer acordos para desenvolver programas de formação contínua para a Comunidade e para o pessoal de saúde relacionadas com instituições
Aplicação
Educação Treinamento Avaliação Pesquisa Testes com equipe médicos
Formação de habilidades
microcirúrgicas com modelo in silico
Introdução: Embora a exposição direita dos procedimentos no ambiente da sala de cirurgia, juntamente com a prática em animais de laboratório, ainda é visto como o padrão de ouro do ensino em cirurgia, prática em simuladores atualmente está sendo validada como uma importante ferramenta educacional Há uma enorme quantidade de modelos inanimados de formação, juntamente com as inovações atualmente aceitas que fazem parte dos currículos de cursos de treinamento em cirurgia
Material e métodos:
Usando a experiência acumulada em programas de simulação de centros de formação e treinamento em cirurgia, identificadas as competências específicas que eram de confiança tendo em conta por meio de exercícios com tecidos inanimados Através de revisões foram encontrados cinco modelos de treinamento inanimado: manipulação básica, princípios básicos em nós, para a realização de anastomose, experiência com tecido real e treinamento de realidade virtual
Alternativas em testes
de toxicidade com peixes
Previsão da toxicidade de produtos químicos com linhas de células e embriões de peixe
OCDE 203 (Teste agudo de peixe)
OCDE 210 (Teste de toxicidade de fase de vida antes do tempo)
OCDE 305 (Ensaio de bioconcentração)
A OCDE TG 203
Este teste requer um número considerável de peixe, 42−60, necessita-se de cinco
dias úteis, produz litros de resíduos tóxicos
3 milhões de peixes são utilizados anualmente na América do Norte para
pesquisas (SE. Belanger, Procter & Gamble, comunicação pessoal)
Na Europa, apenas 140 mil peixes foram usados em 2008 para requisitos
normativos apenas para cumprir a exigências do REACH
Portanto, há muito tempo vem se
buscando uma abordagem alternativa,
nonanimal
BIOMARCADORES
TESTES IN VITRO (linhas celulares)
MODELOS MATEMÁTICOS DE PREVISÃO
Disponibilidade de troca de informações,Flexibilidade, Estratégias integradas
Tests
Relación Cuantitativa Estructura-Actividad
(QSAR)
Evitar a repetição desnecessária de experimentos in vivo e in vitro:
protocolos e estudos ambientais cinéticos da droga química-toxicocinética
Desenvolvimento uma linha celular
Derivam de órgãos e tecidos de diferentes espécies de peixes
Cultiva as células primária, obtendo sucesso: linha celular
Estas linhas de célula são permanentes ou imortalizadas
Biodisponibilidade não é influenciada pelo componente do soro
Animais são apenas necessários para a geração (uma única criatura)
Uma vez estabelecida a linha celular, mais animais não são necessários
Citotoxicidade basal se correlacionam bem com as linhas de mamíferos
Esta diferença de sensibilidade de in vitro-in vivo parece ser verdadeira para as
linhas de duas células de peixes e linhas de células de mamíferos
Tendo uma boa correlação entre in vitro e in vivo, nível de toxicidade, juntamente
com as diferenças de sensibilidade, o papel dos ensaios... É FUNDAMENTAL!!!!!
Desenvolvimento de uma linha celular
Desvantagem
O problema: são menos sensíveis que o peixe vivo em testes de toxicidade
Apesar do considerável potencial, o uso de células de peixe, no entanto, não está
incluído nos ensaios prescritos pela lei
...mais vantagem
São geralmente mais fáceis de manter e mais tolerantes a condições de
crescimento simples
Amostras de água ou produtos químicos podem ser aplicadas às células com
temperaturas mais típicas das temperaturas a que o é peixe expostos
Estudos têm demonstrado que existe uma boa correlação entre a toxicidade
celular e toxicidade aguda em peixes, sobre tudo a sensibilidade relativa (exceção
dos compostos que exercem um modo específico de ação tóxica)
Subestima a toxicidade in vivo, portanto.......
Rotas para avançar a superar o obstáculo mencionado:
1. Linhas especificas de célula derivadas de tecidos que refletem a ação de
forma específica de um produto químico particular
2. Aumentam a sensibilidade da resposta celular por modificação de cultivo que
mais se assemelham a exposição in vivo
3. Pela fração química disponível que representa as células
Linha celular de branquiais de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss)
Linha de celular branquiais de truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss), epitélio de
brânquia de RTgill-W1) é o local principal de absorção de poluentes da água nos
peixes
Também um objetivo primordial das muitas substâncias tóxicas que reflete a
deterioração do organismo inteiro e possivelmente morte
Deve ser capaz de detectar este dano e dano ser mensuráveis por vários
indicadores de viabilidade celular, tais como os danos da membrana citoplasmática
(célula) ou degradação da atividade metabólica ou integridade dos lisossomos
As Investigações........
Preparação de soluções químicas
Exposição das células para testar produtos químicos
Análises de viabilidade celular/ Três corantes fluorescentes
Alamar Blue (AB, Invitrogen, Basilea, Suiza) como uma medida para a atividade
metabólica celular
5-carboxyfluorescein diacetato acetoxi-etanolamina éster como uma medida
para a integridade da membrana celular
Vermelho neutro (NR, Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza) como medida de
integridade de membrana dos lisossomos
Análise química
.
RESULTADOS
Relações concentração- resposta completa para 34 de 35 produtos químicos
Lindano, este produto químico não afetam a integridade da membrana celular
As três medidas de viabilidade celular foram bastante semelhantes valores CE50
aproximadamente um terço dos produtos químicos
Diferenças observadas parece ser independente das propriedades físico-químicas
Comparação de valores Vivo−In Vitro 10 vezes mais sensível do que o teste in vivo
2, 4-dinitrofenol (DNP-17-vezes)
pentachlor-ophenol-(PCP-14-vezes)
Poder preditivo da linhagem de células in vitro com base, a CE50
obtidos foram comparados com os peixes de dados de toxicidade aguda
Desenvolvimento de um modelo QSAR onde valores in vivo para todos
os fathead minnow (Pimephales promelas) testados
DISCUSSÃO
A linha celular contribuir para os esforços atuais para substituir ou reduzir o
uso de peixe para testes de toxicidade aguda de substâncias químicas
Estudos anteriores, linhas celulares parecia consistentemente menos
sensível que o peixe e este foi nenhuma diferença na concentração eficaz e
letal para menos de cinco vezes a 73% de produtos químicos
Por outro lado, maior sensibilidade aparente de exposições in vivo e a
dependência das propriedades físico-químicas das substâncias químicas de
teste dados in vitro não influenciam os resultados
A linha celular, RTgill-W1 parece ser capaz de predizer mortalidade aguda de
compostos com um suposto modo específico de ação
Também obteve resultados semelhantes para o embrião do peixe-zebra,
capazes de realizar alguns processos metabólicos
Em resumo,
Valores in vivo e in vitro, com a maioria dos produtos químicos se desvia menos
do que um fator de 5
Determinação das concentrações de exposição a produtos químicos é altamente
recomendada para ter em conta as perdas devido à absorção e evaporação
Uma modificação do teste OECD foi concluído recentemente para o teste de
toxicidade (FET) de embriões de peixe-zebra, como um meio para prever a
mortalidade aguda para peixes adultos
O mesmo nível de reconhecimento internacional poderia ser alcançado com o
ensaio da linha celular RTgill-W1, que compreende uma alternativa real para um
teste para animais
Além de regulação química e potencial aplicação em design de produto e teste
de toxicidade, análise da célula em sua atual linha fornece informações básicas
que serão necessárias para qualquer teste com linha de celular
Além de ser mais ético e econômico, também podem oferecer melhor
conhecimento sobre os modos de acção subjacente a toxicidade de produtos
Bibliografia
[1] Schirmer, K., Tanneberger, K., Kramer, NI, Völker, D., Scholz, S. Hafner, C.,
Lee, LEJ, Bols, NC, Hermens, JLM (2008). El desarrollo de una lista de
sustancias de referencia para las pruebas de las alternativas a los ensayos de
toxicidad de peces enteros. Aquatic Toxicology 90, 128-137
[2] Schirmer, K. (2006). Propuesta para mejorar los cultivos de células de
vertebrados para establecerlos como sustitutos para el análisis reglamentario
de los productos químicos y efluentes utilizando peces.Toxicología 224, 163-
183
[3] Grimm, V., Ashauer R., Forbes, V., Holman, U., Preuss, TG, Schmidt, A.,
van den Brink, PJ, Wogram, J., Thorbek, P. (2009). CREAM: un proyecto
europeo sobre Modelos de Efectos mecanicistas de Evaluación de Riesgos
Ecoloigcal de Productos Químicos. ESPR, en prensa
Neste momento, há poucas opções de tratamento disponíveis
(Nordmann et al., 2009; Pournaras et al., 2009).
BACTÉRIAS MULTIRRESISTENTES
Seminario de Investigación del laboratorio Hospital de Pediatría Prof. Dr Juan P. Garrahan. 15 de Octubre 2012
Grudman et al., 2006.
"Investigação da eficácia antibiótica de compostos bioativos de plantas para o
tratamento do impetigo e descolonização contra Staphylococcus aureus resistentes a
antibióticos em modelo animal". Hospital de Pediatría Prof Dr. Juan P. Garrahan-
Buenos Aires. 2012.
Bioativos plantas mostrou efeitos atb in vivo contra SARM
Fig. 4. Antibacterial effect of the rosemary compound in the skin infection model in mice infected with MRSA 1977 strain. The number of bacteria (CFU) extracted from each mouse is represented by the symbol. The median value of the data for each group is shown as a horizontal bar. The number of mice in each experimental group was as follow: untreated, n = 7; mupirocin, n = 9; Treatment 1, n = 9 ; Treatment 2 , n = 9. The untreated group was treated with vehicle as control of the bacterial growth.
Seminario de Investigación del laboratorio Hospital de Pediatría Prof. Dr Juan P. Garrahan. 15 de Octubre 2012
Table CFU recovered from the skin after the treatment
RESULTADOS: ATIVIDADE ATB IN VIVO CONTRA SARM
“ Irritação primária de pele em coelhos
vs
#Queratinócitos em uma matriz de colágeno e
fibroblastos humano
para bioativas de plantas com potencial de uso
na clínica contra bactérias multirresistentes”
# Banco de tecidos, Hospital Garrahan
www.alttox.org
http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/
http://iccvam.niehs.nih.gov/
http://www.oecd.org/
http://altweb.jhsph.edu/
http://bioinformatics.istge.it/hypercldb/indexes.html
http://oslovet.norecopa.no/
http://www.interniche.org/
http://www.animalearn.org/
http://www.humanesociety.org/
http://www.bio-sim.com/
http://www.hpacultures.org.uk/
•
•INMETRO
•RENAMA
•BRACVAM
RAMA
• I Congresso Latino-americano de Métodos alternativos. 25 al 29 Novembro 2012. Niteroi
• LATINFARMA 2013- 21 al 25 Outubro 2013. La Habana
II Congresso Latino-Americano de Métodos Alternativos
• 9º WC em Métodos Alternativos 24 al 28 de Agosto 2014. Praga
• III Congresso Latino-Americano de Métodos Alternativos. 10/2014.Aacytal. Buenos Aires
Muito obrigado!!!!