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91An. Sist. Sanit. Navar. 2008 Vol. 31, Suplemento 2

El laboratorio en el diagnóstico de las enfermedades rarasLaboratory diagnosis of rare diseases

R. Artuch, J. Moreno, R. M. Puig, M. Quintana, R. Montero, A. Ormazábal, M. A. Vilaseca

RESUMENLos errores congénitos del metabolismo (ECM),

constituyen un grupo de enfermedades cuyo diagnósti-co se realiza habitualmente por medio de la cuantifica-ción de metabolitos en fluidos biológicos. El objetivode la presente revisión es describir el papel del labora-torio en el diagnóstico de los ECM haciendo especialénfasis en los procedimientos analíticos disponibles enla actualidad, revisando sus ventajas y también suslimitaciones. En conclusión, el número tan elevado deECM que se está identificando hace necesaria la imple-mentación progresiva de nuevas tecnologías en loslaboratorios dedicados al estudio de estas enfermeda-des. Si bien es cierto que estas nuevas herramientashan dotado a los laboratorios de una mayor capacidaddiagnóstica, no hay que olvidar pruebas convenciona-les que siguen siendo necesarias para este diagnóstico,así como toda una serie de variables que influyen en larecogida de las muestras y en la expresión de la enfer-medad, que pueden conducir a fallos diagnósticos.

Palabras clave. Enfermedades raras. Errores con-génitos del metabolismo. Análisis de metabolitos. Estu-dios genéticos. Pruebas funcionales.

ABSTRACTInborn errors of metabolism (IEM) are a group of

diseases whose diagnosis is usually performed byquantification of several metabolites in biologicalfluids. The aim of this review is to report the role of thelaboratory in IEM diagnosis, highlighting the methodsavailable at present and their advantages andlimitations. In conclusion, the huge number ofrecognized IEMs strongly advises the implementationof new high- output technologies in the laboratoriesdevoted to IEM diagnosis. Although these technologiesoffer a high diagnostic ability, routine analyses are stillvery important, as well as consideration of severalvariables involved in biological sample collection anddisease expression that may lead to misdiagnosis ofIEMs.

KKeeyy wwoorrddss.. Rare diseases. Inborn errors ofmetabolism. Metabolite analysis. Genetic studies.Challenge test.

Correspondencia: Rafael Artuch IriberriHospital Sant Joan de DéuDepartamento de Bioquímica ClínicaPasseig Sant Joan de Déu, 208950 Esplugues (Barcelona)Tfno. +34932806169Fax. +34932803626E-mail: [email protected]

Servicio de Bioquímica. Departamento deerrores congénitos del metabolismo. CIBE-RER. Hospital Sant Joan de Déu. Esplugues.Barcelona.

An. Sist. Sanit. Navar. 2008; 31 (Supl. 2): 91-103.

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92 An. Sist. Sanit. Navar. 2008 Vol. 31, Suplemento 2

INTRODUCCIÓNLas enfermedades raras son un conjun-

to muy heterogéneo de trastornos que obe-decen a causas genéticas y no genéticas.Dentro de las enfermedades raras de basegenética existe un subgrupo de alteracio-nes que son los errores congénitos delmetabolismo (ECM), que constituyen ungrupo de enfermedades cuyo diagnósticose realiza habitualmente por medio de lacuantificación de metabolitos en fluidosbiológicos en pacientes previamente selec-cionados en base a la sospecha clínica1.Las alteraciones bioquímicas comprendendesde anomalías leves de la analítica bási-ca que sugieren la existencia de un ECM ya veces permiten orientar el diagnóstico,hasta alteraciones muy importantes de losmarcadores bioquímicos específicos (prin-cipalmente metabolitos) de cada una deestas enfermedades. El paso final en todoproceso diagnóstico de estas enfermeda-des es la identificación de las mutacionescausantes de la enfermedad en genesdeterminados2.

Dada la heterogeneidad del conjunto delos ECM hemos considerado tres grandesgrupos3,4, ya que esta clasificación tieneuna cierta relación con el diagnóstico bio-químico de los ECM:

1. Errores congénitos del metabolismode moléculas complejas.

2. Errores congénitos del metabolismointermediario o de las moléculassimples.

3. Errores congénitos del metabolismoenergético.

En el primer grupo se incluyen ECMque implican las moléculas complejas loca-lizadas en el lisosoma, peroxisoma, retícu-lo endoplásmico o aparato de Golgi. Lossíntomas clínicos que muestran acostum-bran a orientar sobre el origen de dichosECM3, que en algunos casos serán directa-mente confirmados enzimática y/o genéti-camente. No obstante, existen algunosestudios específicos como el análisis de losácidos grasos de cadena muy larga para eldiagnóstico de enfermedades peroxisoma-les y el isoelectroenfoque de la transferrinapara los defectos congénitos de la glicosi-lación, que permiten seleccionar los

pacientes e incluso distinguir los diferen-tes tipos dentro de estas enfermedades4.

El segundo grupo incluye principalmen-te ECM intermediario, o de las moléculassimples, que dan lugar a un síndrome deintoxicación o a síntomas neurológicospuros, como aminoacidopatías, aciduriasorgánicas, defectos del ciclo de la urea ydel metabolismo de los carbohidratos5-7. Enellos, la alteración del metabolismo se tra-duce generalmente en anomalías de losperfiles bioquímicos en líquidos biológicos(sangre, orina y/o LCR), que orientan sobrelas vías metabólicas afectadas y los puntosconcretos de bloqueo, lo que permite con-firmar los defectos por análisis enzimáti-cos o de caracterización de las proteínasmutadas y estudios genéticos.

El tercer grupo incluye los errores con-génitos del metabolismo energético, queimplican defectos de la cadena respiratoriamitocondrial, metabolismo del piruvato,glucogenosis hepáticas (I y III) y defectosde la β-oxidación de los ácidos grasos. Lasalteraciones bioquímicas en algunos casosson específicas (β-oxidación) pero enmuchos son inespecíficas del origen delECM, aunque sí sugestivas del tipo deenfermedad8.

El objetivo de la presente revisión esdescribir el papel del laboratorio en eldiagnóstico de los ECM, haciendo especialénfasis en los procedimientos analíticosdisponibles en la actualidad, revisando susventajas y también sus limitaciones.

MUESTRAS BIOLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE LOS ECM

Los especímenes utilizados para elestudio inicial de pacientes con sospechade ECM son básicamente líquidos biológi-cos, como sangre, orina y, si es necesario,líquido cefalorraquídeo1. En la tabla 1 sedetallan los análisis más habituales practi-cados en estas muestras para el diagnósti-co de ECM.

El primer aspecto que debemos teneren cuenta para el diagnóstico de laborato-rio de un ECM es qué tipo de muestra bio-lógica vamos a estudiar, ya que debería-mos conocer hasta qué punto la enferme-dad que buscamos se expresa en dichomaterial. No es raro que ciertos ECM no se


EL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS ENFERMEDADES RARAS

Tabla 1. Estudios bioquímicos básicos y específicos para el diagnóstico de ECM.

SANGRE Parámetros de Laboratorio Defectos metabólicos

Análisis básicos Hemograma completo Defectos de cobalamina/folato

Coagulación Defectos de glicosilación

Equilibrio ácido-base, anión-gap Acidurias orgánicas

Glucosa β-oxidación, hiperinsulinismo

Calcio, fosfatos, magnesio Glucogenosis

Transaminasas Ciclo de la urea

Colesterol, triglicéridos Glucogenosis, hipobetalipoproteinemias

Urato Sulfito oxidasa

Amonio Ciclo de la urea, acidurias orgánicas.

Lactato, piruvato, L/P Metabolismo energético, acidurias orgánicas

Cuerpos cetónicos β-oxidación, hiperinsulinismo.

Análisis específicos Aminoácidos Aminoacidopatías, ciclo de la urea, acidurias orgánicas, enfermedades mitocondriales.

Carnitina total y libre, acilcarnitinas. Acidurias orgánicas, β-oxidación, deficiencias primarias de carnitina.

Ácidos grasos libres β-oxidación

Homocisteína total Homocistinurias, defectos del metabolismo del folato/B12

Ácidos grasos de cadena muy larga Enfermermedades peroxisomales

Isoelectroenfoque de transferrina N-glicosilación (CDG)

Esteroles � Metabolismo del colesterol

Otros Según el defecto metabólico

ORINA Parámetro bioquímico Defecto metabólico

Análisis básicos Glucosa, cuerpos reductores Galactosemia, fructosuria

Cuerpos cetónicos β-oxidación

Cetoácidos Acidurias orgánicas, Jarabe arce.

Sulfitest Sulfito oxidasa, cofactor del molibdeno.

Análisis específicos Aminoácidos Defectos de transporte renal (cistinuria-lisinuria), ciclo de la urea

Acidos orgánicos Acidurias orgánicas, β-oxidación.

Acido orótico Ciclo de la urea

Tiosulfato Sulfito oxidasa, cofactor del molibdeno.

Homocisteína total Homocistinurias

Mono, di y oligosacáridos Oligosacaridosis,

Mucopolisacáridos (GAGS) Mucopolisacaridosis

Purinas y pirimidinas Purinas y pirimidinas Guanidinoacetato, relación creatina/creatinina.

Cerebral de creatina

Pterinas Metabolismo de las pterinas

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puedan diagnosticar por medio del estudiobioquímico en sangre (por ejemplo, defec-tos del transporte tubular renal de aminoá-cidos, algunas acidurias orgánicas), o enorina (enfermedades mitocondriales, glu-cogenosis). En este apartado adquiereespecial relevancia el líquido cefalorraquí-deo, ya que su adecuada obtención esesencial para el diagnóstico de al menos 10enfermedades que no se expresan en san-gre y orina, como son defectos del trans-porte de glucosa al cerebro (Glut-1), defi-ciencias de la síntesis de dopamina y sero-tonina, defectos del metabolismo de laspterinas que cursan sin hiperfenilalanine-mia, defectos del metabolismo de la vita-mina B6, ciertas aminoacidopatías (hiper-glicinemia no cetósica y defectos de seri-na), defectos del transporte de folato yalgunos trastornos mitocondriales deexpresión central (Tabla 1)9-11.

Un segundo aspecto muy importantepara el diagnóstico de laboratorio de losECM es que las muestras deben tomarse, aser posible, en el momento de la descom-pensación metabólica (si la hay) y antes deiniciar cualquier tipo de tratamiento1, sibien esto no sería necesario en pacientescon ECM de moléculas complejas, porejemplo. Para el laboratorio es muy útilque la petición de análisis se acompañe deinformación clínica sobre la edad, sexo,antecedentes familiares y personales deinterés, breve resumen de la historia clíni-ca, dietas especiales y medicación, ya queesto facilitará la interpretación del resulta-do12. Estos datos son indispensables ya que

el diagnóstico definitivo no deriva en gene-ral de un dato bioquímico aislado, sino dela interpretación del conjunto de datos bio-químicos y clínicos del paciente, en espe-cial en el contexto del momento de la reco-gida de la muestra cuando se trata de erro-res del metabolismo que cursan con des-compensaciones. Por ello, la colaboraciónclínico-bioquímico es indispensable paramejorar la eficacia del diagnóstico de estasenfermedades13.

El tercer aspecto que es importantetener en cuenta respecto a las muestras esel tipo de análisis que es necesario solici-tar. Es útil disponer de perfiles de pruebasbioquímicas a solicitar en sangre, orina yLCR, que incluyan las determinaciones queconsideremos útiles en el diagnóstico deun ECM, para que los especímenes (que aveces son muestra única con muy pocovolumen) se recojan de la forma adecuaday sean aprovechados al máximo, ya que setrata con frecuencia de neonatos o pacien-tes en una situación clínica grave14-15. Esimportante además incluir analíticas ruti-narias básicas, ya que muchas veces sonlas que pueden orientar mejor la enferme-dad. En la tabla 1 se clasifican los análisisen básicos (o rutinarios) y específicos aso-ciando la información que pueden aportarrespecto al diagnóstico de los ECM. Lostejidos y muestras de ADN necesarios parala confirmación diagnóstica pueden reco-gerse en una segunda etapa, cuando laorientación del origen del ECM se hayaalcanzado mediante el análisis de líquidosbiológicos2.

Tabla 1. Continuación

LCR Parámetro bioquímico Defecto metabólico

Análisis básicos Glucosa Defectos del GLUT-1

Lactato, piruvato, L/P Enfermedades mitocondriales, defectos GLUT-1.

Análisis específicos Aminoácidos Hiperglicinemia no cetósica, defectos de serina.

Neurotransmisores y pterinas Defectos de dopamina y serotonina, Segawa.

Folato Deficiencia cerebral de folato

Piridoxal fosfato (PLP). Convulsiones PLP sensibles.



PROCEDIMIENTOS BIOQUÍMICOSPARA EL DIAGNÓSTICO DE LOS ECM

Entre los análisis bioquímicos (y delaboratorio en general) aplicados para eldiagnóstico de un ECM, distinguimos unosprocedimientos simples que constituyen elanálisis básico de alteraciones metabóli-cas, que aporta una primera orientaciónsobre la vía afectada. Estos procedimien-tos están disponibles en todos los labora-torios de análisis clínicos, y la mayoría deellos están automatizados, por lo queobtendremos un respuesta rápida y fiabledel resultado.

El segundo paso consiste en realizarotros análisis específicos más indicativosde la enfermedad en concreto, pero porello también más sofisticados o sin posibi-lidad de momento de automatización y rea-lización rutinaria1. Idealmente, estos estu-dios deberían ser practicados en las mis-mas muestras de sangre y orina recogidasen descompensación (y en las que se prac-ticaron ya las determinaciones más rutina-rias) y dependiendo de la sospecha clínicay de los datos aportados en los análisisbásicos, elegir los más adecuados.

Se revisan los diferentes procedimien-tos de análisis disponibles en laboratoriosque se dedican al diagnóstico de los ECM,sin especificar sus aspectos técnicos.

Análisis de metabolitos

Métodos espectrofotométricos

Esta metodología está disponible desdehace varias décadas en todo tipo de labo-ratorios, y en los últimos años se han idoautomatizando para el análisis de los pará-metros más rutinarios. Se basan en medirla concentración de un sustrato (o la acti-vidad de una enzima) aplicando la res-puesta diferente que tienen las moléculasante una longitud de onda de luz determi-nada. Este procedimiento sigue siendomuy útil para la determinación de molécu-las concretas (por ejemplo, carnitina, tio-sulfato, etc), pero especialmente para ladeterminación de actividades enzimáticasen plasma o tejidos (por ejemplo, determi-nación de la actividad biotinidasa en sueroo de enzimas de la cadena respiratoria

mitocondrial en biopsia de músculo). Habi-tualmente, los procedimientos espectrofo-tométricos no son útiles cuando hay quedeterminar varios metabolitos con unascaracterísticas químicas similares (porejemplo, aminoácidos o ácidos orgánicos),y hay que recurrir a métodos de separa-ción e identificación más especiales.

Métodos de separación e identificaciónde metabolitos

Cromatografía líquida

Esta metodología también ha sido apli-cada en diferentes laboratorios desde hacedécadas, y especialmente en los que se handedicado al diagnóstico de los ECM16. Sebasa en separar moléculas según sus dife-rentes propiedades físico-químicas, utili-zando un solvente (líquido o fase móvil) yun soporte (habitualmente una columna decromatografía). Las moléculas se separangracias a las interacciones que ejercen conla fase móvil y la columna de cromatogra-fía, y después se detectan y cuantifican uti-lizando diferentes sistemas (ver más ade-lante). Existen diferentes tipos de cromato-grafía líquida. Únicamente citar, por sugrandísima versatilidad, la cromatografíalíquida de alta presión (HPLC), que estábasada en aplicar una elevada presión alsistema para conseguir unos análisis rápi-dos y reproducibles. Una vez que se hanseparado los diferentes metabolitos, existela posibilidad de detectarlos y cuantificar-los por diferentes detectores como porejemplo, espectrofotométricos16, de fluo-rescencia17 (aprovechando la fluorescencianatural de algunas moléculas, o de reacti-vos fluorescentes que se ligan a dichasmoléculas), electroquímicos18 (aplicandopotenciales de oxidación y reducción) o deespectrometría de masas17. Este último sis-tema ha cambiado sustancialmente la acti-vidad diagnóstica en el campo de los ECM.La cromatografía líquida sigue siendo muyútil para la determinación de múltiplesmetabolitos, como por ejemplo aminoáci-dos, vitaminas, neurotransmisores y otrostipos de moléculas.

En la figura 1 se presentan diferentescromatogramas obtenidos por cromatogra-fía líquida en controles sanos y pacientescon diferentes ECM. Dentro del laboratorio

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Figura 1. Dos ejemplos de cromatografía líquida. A) Cromatograma de un paciente (parte inferior) conuna deficiencia de tirosina hidroxilasa (defecto de dopamina) respecto a un control sano(parte superior). El análisis se basa en la determinación de ácido homovanílico (HVA) enlíquido cefalorraquídeo, que está claramente disminuido. B) Cromatograma de aminoácidosde un paciente con un citrulinemia (parte superior) comparado con un control sano (parteinferior). La acumulación de citrulina es muy evidente. Con este sistema de análisis se pue-den diagnosticar prácticamente todas las aminoacidopatías.



de diagnóstico de los ECM, el análisis deaminoácidos por cromatografía líquidatiene una gran importancia, ya que con unasola determinación cromatográfica se pue-den diagnosticar muchas enfermedades1.La única limitación de estos procedimien-tos es que suelen ser costosos de realizaren tiempo, la preparación de la muestraantes del análisis requiere procedimientoslaboriosos, son difícilmente automatiza-bles y, por tanto, no son idóneos para res-puestas inmediatas en un elevado númerode muestras.

Cromatografía de gases

Esta metodología también ha sido apli-cada en laboratorios dedicados al diagnós-tico de los ECM desde hace décadas19. Sebasa en separar moléculas volátiles, utili-zando una fase móvil gaseosa (el gas trans-porta los metabolitos volátiles) y un sopor-te (habitualmente son columnas capilaresde 30 metros de longitud). Las moléculasse separan y se detectan y cuantifican utili-zando diferentes sistemas, entre los quedestaca, por su enorme utilidad en el diag-nóstico de los ECM, la espectrometría demasas19. Este procedimiento se basa enidentificar la molécula, que previamentehemos separado por cromatografía degases, gracias a diferentes iones en los quese descompone cada molécula de formaúnica, con lo cual se identifican de manerainequívoca. Este procedimiento es espe-cialmente útil para la determinación de losácidos orgánicos en orina, pero también deotros componentes. Con este procedimien-to se pueden diagnosticar unos 130 ECMdistintos, aunque esto requiere la estanda-rización de diferentes métodos que habi-tualmente son complejos de realizar einterpretar19. A pesar de que este procedi-miento tiene una capacidad diagnósticaelevada en manos expertas, puede arrojarresultados falsos negativos, especialmentesi la muestra no se ha recogido en elmomento de la descompensación, porejemplo. Por ello es importante dar el men-saje de que éste y otros procedimientosmás sofisticados pueden estar sujetos a lasvariaciones en las concentraciones de losmetabolitos debido a la evolución episódi-ca de una enfermedad concreta.

Espectrometría de masas en tándemacoplada a cromatografía líquida (LC-MS/MS)

Este procedimiento de análisis ha expe-rimentado un extraordinario avance en laúltima década, y está plenamente relacio-nado con el concepto de metabolómica20. Adiferencia de los procedimientos anterior-mente descritos, la preparación de lamuestra antes del análisis y la detección ycuantificación de los diferentes metaboli-tos se realizan de forma más rápida17,20 . Elsistema consiste en un cromatógrafo líqui-do que introduce las muestras en el detec-tor de masas (cuadrupolo en tándem). Portanto, es idóneo para análisis de múltiplesmetabolitos no volátiles de forma simultá-nea en muestras biológicas (principalmen-te sangre seca y orina). La posibilidad dedeterminar todos estos metabolitos ensangre seca hace que este método sea idó-neo para los programas de detección pre-coz de ECM. De hecho, en varios países deEuropa y en algunas comunidades de Espa-ña ya se está aplicando para el diagnósticoprecoz de más de 30 ECM, en contraposi-ción con los sistemas actuales de detec-ción de la fenilcetonuria, hipotiroidismo yfibrosis quística21. Además, permite el diag-nóstico dirigido de otras muchas enferme-dades metabólicas, por lo que hoy en díaconstituye una herramienta esencial parael diagnóstico de los ECM20. No obstante,todavía es un procedimiento complejo (enespecial la interpretación de los resulta-dos), y costoso, por lo que de momentosólo se está implantando en centros dereferencia para diagnóstico de los ECM,pero no en los laboratorios clínicos de lamayoría de los hospitales. Por otro lado,conviene recordar que no son procedi-mientos infalibles, ya que en el caso dealgunos ECM del metabolismo intermedia-rio que se manifiestan principalmentedurante la descompensación del paciente,el análisis de una muestra no adecuadapuede llevar también a resultados falsosnegativos. En la tabla 2 figuran algunas delas enfermedades que se pueden diagnosti-car por medio de LC-MS/MS.

Si la combinación de los datos clínicosy bioquímicos obtenidos mediante losmétodos de laboratorio básicos y los espe-cíficos anteriormente citados ha permitido

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una orientación definitiva del defecto, seprocede a la realización de estudios deconfirmación de la proteína afectada por lamutación del ADN que constituye el origende la enfermedad. Estos estudios de confir-mación enzimática o de caracterización dela proteína alterada, pueden realizarse ensuero, leucocitos, eritrocitos, fibroblastoscultivados procedentes de biopsia de pielo en tejidos (músculo, hígado, riñón, cora-zón, etc). Los estudios genéticos de lasmutaciones implicadas en el defecto com-pletaran el estudio.

Análisis de proteínas

El paso final en todo proceso diagnósti-co de los ECM es la identificación de lasmutaciones causantes de la enfermedad engenes determinados2. Estos genes codifi-can proteínas con diversas funciones (enzi-mas, transportadores, etc.) por lo que elanálisis de proteínas muchas veces tam-bién es esencial en el proceso diagnósticoespecialmente cuando tras el análisis demetabolitos no se puede discernir qué gen

está implicado en la enfermedad (por ejem-plo, la determinación del perfil de sialo-transferrina como paso inicial en los defec-tos congénitos de la glicosilación). Otrasveces, se desconoce el marcador molecu-lar de la enfermedad, y sólo es posibleidentificar un fallo en la expresión o fun-ción de la proteína como diagnóstico delECM. Esto ocurre habitualmente en gruposde enfermedades complejas, como en elcaso de las encefalomiopatías mitocondria-les22.

El análisis de proteínas ha experimen-tado un gran avance en la última década,especialmente gracias a los estudios deproteómica que permiten analizar la expre-sión de muchas proteínas de forma simul-tánea20. No obstante, estos sistemas deanálisis no suelen estar disponibles en ellaboratorio clínico, por lo que revisaremosaquellos procedimientos que permiten elestudio de proteínas específicas implica-das en los ECM. Hay múltiples métodosautomatizados de cuantificación de proteí-nas (nefelometría, quimioinmunoluminis-

Tabla 2. A) Recomendaciones del Comité Nacional de Cribado Neonatal de Alemania para la identifi-cación de ECM por espectrometría de masas en tándem. La categoría 1 corresponde a enfer-medades recomendadas, y la 2 a enfermedades con una recomendación condicionada. B)Otras enfermedades potencialmente diagnosticables por este procedimiento.

A/ Categoría 1 Categoría 2

Defectos del metabolismo de ami-noácidos.

Hiperfenilalaninemia Jarabe deArce.

Hipertirosinemia 1 y 2.Citrulinemia

Defectos del metabolismo de áci-dos grasos

Deshidrogenasas de cadenamedia, larga y muy larga.

Defectos del ciclo de la carnitina Carnitina-palmitoil transf. 1 y 2,translocasa de carnitina

Acidurias orgánicas Aciduria glutárica tipo IAciduria isovalérica

Acidemias metilmalónica y propiónica.

B/

Defectos del metabolismo de aminoácidos

Homocistinurias, defectos de prolina y serina, defectos del ciclo de la urea y del metabolismo de la creatina.

Enfermedades peroxisomales Síndrome de Zellweger, adrenoleucodistrofia neonatal y ligada al cromosoma X y otras.

Defectos del metabolismo del colesterol Smith-Lemly-Opitz.

Enfermedades lisosomales Enfermedad de Gaucher, Krabbe, Fabry, leucodistrofia metacromática.

Defectos del metabolismo de purinas y pirimidinas.

Deficiencias de adenilosuccinato liasa, dihidropirimidina deshidrogenasa, y otras.



cencia) disponibles en los laboratoriosautomatizados que no serán objeto de estetrabajo.

Cuando se va a realizar un análisis deproteínas, tenemos que discernir entre dosposibilidades fundamentalmente. Estudiarla función de la proteína y la expresión dela misma. Los procedimientos aplicadosson diferentes, y la información que apor-tan también. Conviene remarcar que lamayor parte de las veces necesitaremoscélulas para dicha determinación, por loque habrá que plantear la realización deuna biopsia cuando proceda.

Estudios de función proteica

Se basan en medir la función de deter-minada proteína. Si esta proteína es unenzima, se medirá la actividad enzimáticahabitualmente por espectrofotometría,incubando la proteína con los sustratosadecuados22. También es posible medir laactividad de una o varias proteínas de unavía metabólica completa incubando lascélulas con sustratos marcados radiactiva-mente, y medir la formación de productosespecíficos de esa vía metabólica por pro-cedimientos radiométricos22. Este tipo deestudios de oxidación de sustratos marca-dos son muy útiles para determinar la fun-ción de una vía metabólica completa (porejemplo oxidación de piruvato para eva-luar la función energética mitocondrial) ymuchas veces aportan datos no observa-dos anteriormente sobre el diagnóstico deun ECM. Si se pretende estudiar la funciónde un transportador (por ejemplo Glut-1 otransportador de creatina), se analizará enlas células en las que se exprese esta pro-teína la incorporación del sustrato (gluco-sa y creatina marcadas) al interior de lasmismas.

Estudios de expresión proteica

En ocasiones, es más útil evaluar laexpresión de la proteína (cantidad, pesomolecular, isoformas) que la propia fun-ción23. No obstante, conviene recordar eneste punto que muchas de las mutacionescausantes de ECM no producen un descen-so en la cantidad total de la proteína, nialteran su peso molecular, por lo que la uti-lidad de estas pruebas es más limitada en

estos casos. Estas pruebas se recomiendancuando las mutaciones causantes songrandes deleciones que reducen el tamañode la proteína o, cuando la mutación causainestabilidad de la proteína y se reduce lacantidad total. También son muy útiles,como en el caso de los defectos congénitosde la glicosilación, cuando una mutaciónen uno de los cientos de genes que regulaneste complejo proceso altera la glicosila-ción de una proteína en concreto (sialo-transferrina)23,24. Las pruebas más habitua-les para el estudio de la expresión de laproteína son los sistemas de separación deproteínas. Existen varias metodologías dis-ponibles para este fin (electroforesis, cro-matografía, etc.). Algunas de ellas como laelectroforesis son métodos tradicionales,desarrollados ya hace varias décadas, peroque siguen siendo muy útiles para el diag-nóstico de los ECM. Se basan en general enestudiar la proteína sometida a un campoeléctrico, que hará migrar diferencialmen-te a las proteínas según la carga neta de lamisma (ioelectroenfoque, electroforesiscapilar) o de acuerdo a su peso molecular(Western-blot)23. En la figura 2 se detalla unanálisis de sialotransferrina por Western-blot y por isoelectroenfoque de un pacien-te con defecto congénitos de la glicosila-ción.

Por último, se han implantado en losúltimos años sistemas de análisis de prote-ínas de alto rendimiento (Maldi-TOF). Exis-ten excelentes revisiones de esta materiaen la bibliografía24.

ESTUDIOS GENÉTICOSHace unos años sólo unos pocos cen-

tros tenían la tecnología necesaria paraafrontar este tipo de estudios. Con losavances tecnológicos, muchos de estosmétodos están ya disponibles en el labora-torio clínico de diagnóstico de ECM. Hayque destacar que el diagnóstico genéticoes el paso final en el estudio de los ECM2,8.Cada vez es más frecuente que no sea nece-sario estudiar la función o expresión deuna proteína, y se puede pasar al diagnós-tico genético directo incluso en ADN obte-nido de sangre periférica2. Esto ocurrecuando el perfil de metabolitos es suficien-temente claro, o bien cuando no es posiblebiopsiar el tejido donde se expresa la pro-

teína (por ejemplo, en las deficiencias de lasíntesis de dopamina causadas por defec-tos genéticos de la enzima tirosina hidroxi-lasa, que sólo se expresa en neuronasdopaminérgicas y en la médula adrenal)10.En la tabla 3 se citan algunas de las prue-

bas genéticas más frecuentemente utiliza-das con una breve explicación de sus fun-damentos.

Merece una descripción un poco másdetallada la secuenciación. Consiste en laseparación de fragmentos del gen que se

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Figura 2. A) Análisis por Western-Blot de la sialotransferrina en un paciente con defecto de la glicosi-lación tipo 1a (indicado por la flecha) en comparación con controles sanos (indicado con fle-cha discontínua). Las bandas inferiores indican isoformas de transferrina de un peso mole-cular inferior al normal. En el panel B) se aprecia la sialotransferrina del mismo paciente ana-lizada por isoelectroenfoque. En este caso las bandas se han separado por su punto isoeléc-trico ante un gradiente de pH. Se observa un número mayor de bandas en la parte inferior encomparación con los controles, y que corresponden a las diferentes isoformas de la sialo-transferrina (tetra, tri, di, mono y asiaolotransferrina).



va a estudiar (previamente amplificado porPCR) por electroforesis capilar y detecciónde fluorescencia inducida por láser. Exis-ten sistemas automatizados que permitenel estudio de un gran número de mutacio-nes en pacientes con sospecha de ECM2, yestos estudios se pueden realizar en ADNobtenido de sangre periférica. A pesar deestos avances, hay que remarcar que estaprueba también tiene sus limitaciones, yun resultado negativo nunca se debe con-siderar como definitivo si hay una sospe-cha clínica y bioquímica razonable. Esdecir, a pesar de ser probablemente laherramienta diagnóstica de mutacionesmás potente, no identifica determinadasalteraciones (como deleciones por ejem-plo), por lo que habrá que recurrir a pro-cedimientos alternativos.

PRUEBAS FUNCIONALESNo es raro que en el proceso diagnósti-

co de los ECM no se disponga de la infor-mación clínica y bioquímica suficientecomo para sospechar la causa genética dela enfermedad8,25. Esto ocurre esencialmen-te en aquellos ECM que cursan de formaepisódica, con brotes de descompensaciónmetabólica (hipoglucemias por defectosde la beta-oxidación o por glucogenosis,hiperamoniemias secundarias a defectosleves del ciclo de la urea, etc). El funda-mento de las pruebas funcionales consisteen causar una descompensación metabóli-ca leve en el paciente, que debe estar

estrictamente monitorizada y obtener lasmuestras (sangre y orina) para análisis bio-químicos siguiendo unos protocolos8,25. Deesta forma, podemos revelar la acumula-ción de ciertos metabolitos claves para eldiagnóstico que en condiciones basales noha podido ser demostrada. Las pruebasfuncionales más frecuentemente aplicadasson:

– Prueba del alopurinol y de la sobre-carga proteica. Indicada para diag-nóstico de defectos del ciclo de laurea.

– Sobrecarga de glucosa, para el diag-nóstico de encefalomiopatías mito-condriales.

– Prueba del ejercicio y de la isque-mia para el diagnóstico de encefalo-miopatías mitocondriales y de glu-cogenosis musculares

– Prueba del ayuno, para diagnósticodiferencial de las hipoglucemias.

– Sobrecarga de galactosa y fructosa,para el diagnóstico de galactose-mias y fructosemias.

Algunas de estas pruebas no estánexentas de cierto riesgo para el paciente,por lo que sólo se deberán realizar cuandosea necesario, de forma protocolizada ybajo un estricto control médico durantetoda la duración de la prueba8,25.

Tabla 3. Diferentes procedimientos para el estudio de pacientes con enfermedades genéticas.

Método Fundamento

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)Amplificación de regiones específicas del ADN quepermite tener cantidades adecuadas de muestrapara los otros estudios genéticos.

Detección de mutaciones

Single Starn Conformation Polimorphism (SSCP). Movilidad electroforética del ADN anómala en pre-sencia de mutaciones.

Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Movilidad electroforética del ADN anómala en con-diciones desnaturalizantes.

Secuenciación Separación e identificación de las bases del ADNpor electroforesis capilar.

Chips de DNA (microarrays)Hibridación entre el cDNA o los oligonucleótidosdel chip con la muestra de ADN del paciente. Lec-tura de fluorescencia.

R. Artuch y otros


PROTOCOLO DE EXITUS ENPACIENTES CON SOSPECHA DE ECM

Conviene también disponer de un pro-tocolo de exitus ante la sospecha de ECM,que permita alcanzar el diagnóstico post-mortem y dar el adecuado consejo genéti-co a las familias (Tabla 4)25. Es útil acompa-ñarlo de un kit de exitus que incluya el pro-tocolo, los tubos adecuados, el papel de fil-tro para impregnar con sangre, un punch(aguja para obtención de biopsia de piel) yel medio de cultivo para la biopsia de piel.Esta muestra es especialmente importantepara muchos diagnósticos de ECM, ya quepermite cultivar y almacenar fibroblastospara estudios posteriores. Se puede con-servar en un refrigerador en las unidadesde Neonatos, UCI y Urgencias para facilitarla recogida correcta de las muestras encaso de exitus.

CONCLUSIONES

Durante la última década se ha produ-cido un avance espectacular en los proce-dimientos diagnósticos de los ECM. Elnúmero tan elevado de ECM que se estáidentificando hace necesaria la implemen-tación progresiva de nuevas tecnologías dealto rendimiento diagnóstico en los labora-torios dedicados al estudio de estas enfer-medades. Si bien es cierto que estas nue-vas herramientas han dotado a los labora-

torios de una mayor capacidad diagnósti-ca, no hay que olvidar pruebas convencio-nales que siguen siendo necesarias paraeste diagnóstico, así como controlar todauna serie de variables que influyen en larecogida de las muestras y en la expresiónde la enfermedad que pueden conducir afallos diagnósticos.

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1. Sangre en tubo de hemograma (plasma; EDTA potásico) (punción cardíaca si es necesa-rio): 2-5ml. Centrifugar y separar el plasma. Congelar a -20ºC.

2. Sangre en tubo de gel (suero): 2 ml. Centrifugar y separar el suero. Congelar a -20ºC.3. Sangre en tubo de hemograma (EDTA potásico): 5-10 ml. Guardar en refrigerador a 4ºC

(extracción de DNA).4. Sangre seca en papel de filtro (del diagnóstico precoz neonatal). Conservar a temperatu-

ra ambiente. 5. Orina (si no se dispone de muestra, punción suprapúbica o sondaje): 10-15 ml. Congelar a

-20ºC.6. Humor vítreo, si no puede obtenerse orina (punción globo ocular). Congelar a -20ºC. 7. Biopsia de piel estéril (área de 0,5 cm de diámetro). Lavado previo de la piel con alcohol.

Se sumergirá en medio de cultivo o suero salino estéril y se mantendrá a temperaturaambiente.

8. Biopsia de hígado (3 cc) y músculo (2 cc). Envolver en papel de aluminio y rotular. Con-gelar, a ser posible, en nitrógeno líquido o nieve carbónica y guardar a -80ºC.

9. Otros tejidos: según criterio clínico, si es necesario.

Tabla 4. Protocolo de recogida de muestras en caso de exitus con sospecha de enfermedad metabó-lica. La recogida de las muestras debe ser inmediata, inferior a una hora post-mortem.



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