elektroninio mikroskopo veikimo … tem.pdfmanoma, kad pirmąjį mikroskopą galėjo sukurti jo...
TRANSCRIPT
ELEKTRONINIO MIKROSKOPO VEIKIMO PRINCIPAI IR PRINCIPINĖ PREPARATŲ PARUOŠIMO SCHEMA
Šioje santraukoje pateikiama bendra mikroskopo charakteristika, elektroninio mikroskopo sandaros
schema, teikiamos galimybės, preparatų paruošimo eiga ir vaizdų interpretavimo problemos. Tiriant
mažus objektus, tokius kaip bakterijos ir virusai, tenka ieškoti papildomų tyrimo būdų, kurie
remiasi šiame referate aprašytais.
MIKROSKOPAS (iš graikų mikrós: mažas; skopein: stebėti) yra optinis prietaisas skirtas stipriai
padidintam, plika akim neįžiūrimų objektų (arba jų struktūros detalių), vaizdui gauti. Mažų objektų
tyrimo mokslas vadinamas mikroskopija.
Žmogaus akis sudaro tam tikrą optinę sistemą, kuri turi atitinkamą skiriamąją gebą, t.y. mažiausią
atstumą tarp stebimo objekto elementų, kur tie elementai dar gali būti atskiriami vienas nuo kito.
Normali akis per optimaliausią atstumą atitraukta nuo objekto turi apie 0,08 mm skiriamąją gebą (o
daugelio žmonių - apie 0,20 mm). Mikroorganizmų, daugelio augalų ir gyvūnų ląstelių, smulkių
kristalų, metalų ir lydinių mikrostruktūros detalės ir kt. yra žymiai mažesnio dydžio. Tokių objektų
stebėjimui ir tyrimui pritaikyti įvairių tipų mikroskopai. Mikroskopo pagalba nustatoma forma,
dydis, sandara ir daugelis kitų mikroobjektų charakteristikų. Mikroskopas leidžia skirti struktūras su
atstumais tarp jų elementų iki 0,20 mkm.
Mikroskopai skirstomi į tokias grupes:
• optiniai mikroskopai • stereoskopiniai mikroskopai • lazeriniai (lazeriu apšviečiami) mikroskopai • elektroniniai mikroskopai (apšviečiami elektronų srautu)
Istorija
Pirmojo mikroskopo išradimas paprastai priskiriamas Zacharijui Jansenui, kuris pirmąjį mikroskopą
sukonstravo apie 1595 metus Nyderlanduose. Kadangi Zacharijus tuo metu buvo labai jaunas
manoma, kad pirmąjį mikroskopą galėjo sukurti jo tėvas Hansas. Šis pirmasis Jansenų sukurtas
sudėtinis mikroskopas buvo paprastas vamzdelis su lęšiais abiejuose galuose. Prie pirmųjų
mikroskopų tobulinimo prisidėjo ir anglų išradėjas Robertas Hukas (Robert Hooke, 1635-1703).
Tokie pirmieji mikroskopai didino nuo 3 iki 9 kartų. Šiuolaikiniai tokio tipo mikroskopai didina virš
1000 kartų. Optinio mikroskopo didinimo galimybes riboja difrakcijos fenomenas.
Šviesinio mikroskopo veikimo schema
MIKROSKOPŲ RŪŠYS A. Optinis mikroskopas.B. Elektroninis mikroskopas.
1. Apšvietimo linzė. 2. Stalelis su
preparatu. 3. Objektyvas. 4. Okuliaras.
ŠVIESINIO IR ELEKTRONINIO MIKROSKOPŲ SKIRIAMOSIOS GEBOS PALYGINIMAS
Skiriamoji geba
TRANSMISINIS ELEKTRONINIS MIKROSKOPAS
Figure 1–8. Photograph of the JEM-1230 transmission electron microscope. (Courtesy of JEOL USA, Inc., Peabody, MA.)
Figure 1–9. Schematic view of a transmission electron microscope with its lenses and the pathway of the electrons. CCD, charged coupled device.
TRANSMISINIS IR SKENUOJANTIS ELEKTRONINIAI MIKROSKOPAI
Figure 1–10. Schematic view of a scanning electron microscope.
Figure 1–9. Schematic view of a transmission electron microscope with its lenses and the pathway of the electrons. CCD, charged coupled device.
FOTOGRAFAVIMAS SKENUOJANČIU MIKROSKOPU
PREPARATŲ ELEKTRONINEI MIKROSKOPIJAI PARUOŠIMAS
Iš pradžių laboratoriniam gyvūnui dėl širdies optimalios perfuzijos intraperitoniškai
įšvirkščiama 10000 VV heparino. Praėjus 10-20 min. po heparino injekcijos, gyvūnai eutanizuojami
intraperitonine arba intravenine natrio tiopentalio letalios dozės (50-60 mg/kg) injekcija. Po
torakotomijos, širdis sustabdoma diastolėje, įšvirkščiant į apatinę tuščiąją veną 20 ml šilto
fiziologinio tirpalo su 1 ml 3 M KCl. Į sustabdytą širdies kairiojo skilvelio ertmę transmiokardialiai
įvesdamas metalinis kateteris ir širdis perfuzuojama gazifikuotu (95% O2 ir 5% CO2) 35oC
fiziologiniu tirpalu. Vidutiniškai širdies perfuzija trunka 5-15 min. Perfuzato perteklius išleidžiamas
perkirpus apatinę tuščiąją veną.
Išplovus širdies kraujagysles bei kameras, širdis išimama iš krūtinės ląstos ir patalpinama
specialioje kameroje su atšaldytu iki 4oC fiziologiniu tirpalu. Šioje kameroje nuo širdies pamato
pašalinamos perikardo, stambių kraujagyslių ir kitų tarpuplaučio organų liekanos. Pro viršutinę
tuščiąją ir kairiąją viršutinę plautines venas į prieširdžių ertmes įvedami specialūs su išsipučiančiais
galais kateteriai. Įšvirkščiant į tokių kateterių išsipučiančius galus fiziologinį tirpalą, atstatomos
suglebusios prieširdžių sienos. Tamponuojant vata, ištiesinamos prieširdžių venos. Dėl endokardo
nervų vizualizacijos bei patogesnio jų paėmimo mikroskopiniams tyrimams, daromi įvairių širdies
vietų transmuraliniai pjūviai arba ekstirpuojamos jos dalys. Tam, kad butų geriau matomi
mikroskopiniams tyrimams paimami intrakardiniai nervai, jie vizualizuojami supravitaliniu
metileno mėlio metodu.
Supravitalinis intrakardinių nervinių struktūrų dažymas metileno mėliu. Šiuo metodu buvo
sėkmingai išryškintas eksperimentinių gyvūnų širdies nervinis aparatas. Kadangi metileno mėliu
nudažyti nervai matomi išlieka trumpai, stengiamasi juos paimti per 10-15 min. Metileno mėliu
išryškintas nervinis audinys lieka intaktiškas ir dėl to supravitalinis metileno mėlio metodas
praktiškai yra nepakeičiamas, paimant precizinius mėginius elektronomikroskopiniams tyrimams.
A. Dogelio aprobuotas supravitalinis metileno mėlio metodas (Догель, 1902) turi daug
modifikacijų. Mūsų laboratorijoje paruoštos širdys patalpinamos į 37oC termostatinę kamerą su
aukščiau paminėtos sudėties fiziologiniu tirpalu. Palaipsniui fiziologinis tirpalas pakeičiamas tokiu
pačiu gazifikuotu fiziologiniu tirpalu (pH – 7,0-7,3) su 0,01 – 0,02% metileno mėliu. Dažniausiai
metileno mėlis per 5-10 min. nudažo nervines terminales, per 10-20 min. nervinius pluoštus ir
galiausiai, po 20-60 min. – neuronų kūnus ir nervus. Išryškėjus nerviniams elementams,
mikrochirurginiais instrumentais buvo iškerpami reikiami nervai ar ganglijai ir specialiuose
kiekvienai rūšiai protokoluose pažymima tiksli jų lokalizacija širdyje. Iškirptus gabalėlius
fiksuojame atšaldytame iki 4oC 2,5% glutaraldehide 0,1 M kakodilatiniame buferyje (pH – 7,3).
Iškirpti mėginiai fiksuoti 12 valandų. Po fiksacijos mėginiai buvo praplaunami du kartus po 1 min.
kakodilatiniame buferyje ir papildomai fiksuojami 1% osmio tetraoksidu kakodilatiniame buferyje 1
val. 4oC temperatūroje. Toliau buvo atliekama dehidratacija didėjančios koncentracijos etanolio
tirpalais ir acetonu. Po dehidratacijos mėginiai buvo įliejami į epoksidinių dervų Epon 812 (Serva)
ir Araldit 502 (Serva) mišinį. Polimerizuojama 60oC temperatūroje 48 val.
Pusiau ploni pjūviai pjaustomi ultramikrotomu Tesla BS 490A. Darant pjūvius, svarbu
parinkti tinkamo kietumo ir aštrumo peilius, kad būtų gaunami kokybiški pjūviai. Pjauti epoksidinės
dervos blokams naudojami stikliniai arba deimantiniai peiliai. Šiam tyrimui paimta medžiaga
pjaustoma stikliniais peiliais. Šie peiliai yra gaminami iš specialaus stiklo lakštų, kurie yra laužomi
tam skirtu prietaisu „Knife maker“. Atpjautas pjūvis patenka į prie peilio pritaisytą nedidelę
vandens vonelę. Baigus pjaustymą, pjūviai išimami su blakstiena ir padedami ant objektinio
stiklelio į vandens lašą ir išdžiovinami termostate. Pjūviai dažomi metileno mėliu pagal R.L.
Ridgway (1986).
Ultramikrotomas LKB,
Pusiau plonų pjūvių dažymas pagal Ridgway.
2% kalio permanganato vandenyje ir 1,3% metileno mėlio vandeninio tirpalo sumaišoma
lygiom dalim ir kaitinama 90-95oC temperatūros vandens vonelėje 30 min. Dažas atšaldomas
kambario temperatūroje ir prafiltruojamas. Dar kartą prafiltruojamas 0,22 µm miliporiniu filtru.
Dažoma 10 min. prie 70oC temperatūros. Nudažius preparatas nuplaunamas šaltu tekančiu
vandeniu. Po dažymo, užlašinus lašą epoksidinės dervos ir uždengus dengiamuoju stikleliu, pjūviai
polimerizuojami 60oC temperatūroje per naktį.
Taip paruošti preparatai naudojami šviesinės mikroskopijos analizei.
Nudažyti pusiau ploni pjūviai mikroskopuojami ir analizuojami iš pradžių apžvalginiu x50 ir
x250 didinimu, šviesiniu mikroskopu ZEISS AXIOMAT. Pjūviuose be nervų matomos įvairios
audinio struktūros (kraujagyslės, riebalinės ląstelės, purusis jungiamasis audinys. Nervai, naudojant
aliejinę imersiją, buvo padidinti padidinimu x1000 bei nufotografuoti fotoaparatu NIKON
COOLPIX 4500.
Ruošiant plonus pjūvius pirmiausia išpjaunamos piramidės. Tam reikia du mikroskopus -
peršviečiantį ir stereoskopinį mikroskopus sustatyti greta. Peršviečiančiu mikroskopus stebimas
pusiau plonas pjūvis, o stereoskopiniu – piramidė. Stebint pusiau ploną pjūvį, jame matomos
struktūros surandamos piramidėje. Tai labai subtili procedūra, kurios metu kreipiamas dėmesys į
netiesioginius požymius – rėželius, skirtingų audinių skirtingą blizgesį, tamsumą, didelių ląstelių
kontūrus, audinio gabaliuko formą. Tinkamai suorientavus piramidę, ji sumažinama iki tinkamo
ploniems pjūviams pjauti dydžio. Reikia atkreipti dėmesį į piramidės kraštinių nuožulnumo kampą,
kuris turi būti 90o. Paruoštos ploniesiems pjūviams pjauti piramidės kraštinės ilgis neturėtų būti
didesnis už skutimosi peiliuko briaunos plotį.
Medžiagos, įlietos į epoksidinę dervą, blokai.
Stiklinis peilis, skirtas epoksidinės dervos blokams pjauti.
Piramidės pjovimo schema
Sekantis darbo etapas – plonų pjūvių pjovimas. Ploni pjūviai pjaunami aukštos kokybės
stikliniu arba deimantiniu peiliu. Mūsų laboratorijoje ploniems pjūviams pjauti naudojamas
deimantinis peilis. Pjaunama ultramikrotomu LKB. Naudojant deimantinį peilį reikia būti labai
atsargiam artinant peilį prie piramidės, nes neatsargus priartinimas gali sugadinti brangų peilį.
Ultraplonų pjūvių storis turi būti 60-70 nm ir tai atitinka pilką ir sidabrinę pjūvių spalvą. Auksinės,
geltonos ir kitų spalvų pjūviai yra netinkami stebėjimui elektroniniu mikroskopu, dėl per didelio jų
storio. Atpjauti pjūviai surenkami ant tinkliukų.
Teisingo pjovimo schema.
Sekantis darbo etapas – kontrastavimas arba dažymas. Elektroninei mikroskopijai
ultraplonus pjūvius dažome sunkiųjų metalų druskomis, nes tik sunkiųjų metalų atomai, sudarę
junginius su audinio struktūromis užtikrina gerą elektronų išsklaidymą.
DAŽNIAUSIAI NAUDOJAMŲ MEDŽIAGŲ, SKIRTŲ ULTRAPLONŲ PJŪVIŲ DAŽYMUI-KONTRASTAVIMUI LENTELĖ
OSMIS - 190 - osmio tetraoksidas - proteinus
- lipidus (fosfolipidines membranas,
lipidinius intarpus, sekretus)
URANAS - 238 - uranilacetatas - nukleinines rūgštis (chromatiną, ribosomas)
- proteinus
ŠVINAS - 207 - švino citratas - lipoproteidinės membranos
- proteinai
- glikogenas
- ribonukleoproteinai
VOLFRAMAS - 184 - fosforovolframinė
rūgštis, kai ph≥3
- polisacharidus ir glikoproteinus
- fosforovolframinė
rūgštis, kai ph≤3
- proteinus ir ypač kolageną
FOTOGRAFAVIMAS ELEKTRONINIU MIKROSKOPU
Intrakardinio neurono elektronograma
VAIZDŲ INTERPRETAVIMO PROBLEMOS
Viena iš problemų, su kuriomis susiduriama, yra skersinio nervo pjūvio gavimas. Gavus
įstrižinį nervo pjūvį, išmatuotas nervo plotas bus didesnis negu yra. Išmatavus nervą, pasvirusį 20o
kampu, paklaida bus ne didesnė kaip 6% (Karim et al., 2004). Taip pat labai sunku įvertinti, ar
matomų mielininių skaidulų pjūviai yra skirtingų mielininių skaidulų ar tai tos pačios mielininės
skaidulos kitos vietos pjūvis. Dėl šių priežasčių labai atidžiai buvo parenkami pjūviai
morfometriniams matavimas, nes nervinės skaidulos nervo viduje yra vingiuotos (Ushiki, Ide,
1990) ir pats nervas vingiuoja, todėl ne visi pjūviai buvo gauti skersiniai. Įstrižinių pjūvių
morfometrinio matavimo buvo atsisakyta dėl sunkiai įvertinamo nervo ploto ir mielininių skaidulų
skaičiaus.
Interpretuojant gautus vaizdus reikia būti labai atidiems, vertinant trimates struktūras,
elektronogramose, kurios jau yra tik dvimatis struktūros vaizdas. Iliustracijoje vaizduojama kelių
labai paprastų ir gerai žinomų objektų vaizdas pjūviuose.
Figure 1–30. How different 3-dimensional structures may appear when thin-sectioned. A: Different sections through a hollow ball and a hollow tube. B:A section through a single coiled tube may appear as sections of many separate tubes. C: Sections through a solid ball (above) and sections through a solid cylinder (below).