ELECTROFORESIS DE ADN GEL DE AGAROSA

INSTITUTO TECNOLOGICO METROPOLITANOELECTROFORESIS DE ADN GEL DE AGAROSAINFORME DE LABORATORIO

SINDY PAOLA RAMIREZ CUESTA

10/11/2014

DANIEL AGUDELO RIVERA

INFORME

5.1. QU DIFERENCIAS EXISTEN ENTRE UNA ELECTROFORESIS EN GEL Y UNA CAPILAR? MENCIONE VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE CADA UNA? UTILIDAD?R/ diferencia de electroforesis de capilar: Es una poderosa tcnica para la separacin eficiente de pequeas y grandes molculas Tiempo rpido de anlisis Utiliza pequeas cantidades de muestra incluye una familia de tcnicas que involucran una gradiente diferencial o de equilibrio, que estn basadas principalmente en los siguientes modos: Electroforesis Capilar de Zona Isotacoforesis Capilar Enfoque Isolctrico Capilar Electroforesis capilar en gel (CGE) Cromatografa electrocintica capilar micelar (MEKC)VENTAJAS electroforesis en capilar la eficacia y la velocidad de la separacin se pueden mejorar mediante la optimizacin de diferentes factores como son la temperatura, el voltaje aplicado, el medio de separacin, el disolvente en el que se encuentra disuelta la muestra Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales,en un mbito capilar, que adems ofrece ms facilidad y velocidad que la cromatografa lquida de alta performance la electroforesis capilar se puede apuntar que da lugar a separaciones con volmenes de muestra extraordinariamente pequeos (de 0,1 a 10 nL), en contraste con la electroforesis convencional en la cual se emplean volmenes de muestra en el orden de los L, con una elevada resolucin y rapidez

DESVENTAJAS: Se obtienen tiempos de anlisis bajos y si lo comparamos con otras tcnicas como la cromatografa de gases y lquidos Depende de la aplicacin o de la muestra. Vulnerabilidad en el cambio de sus componentes.UTILIDAD: La electroforesis de capilar es de gran utilidad en el rea biomdica, en el campo de las protenas, pptidos, ADN, anlisis de lquidos de perfusin, monitoreo de drogas, marcadores genticos tumorales y neurobioqumicos, drogasxenobiticas, de abuso, y pericias forenses. En el rea biofarmacutica, para el control de calidad de productos farmacuticos y biotecnolgicos, quimioterpicos y de estructura quiral. En el rea de alimentos, se le aplica al fraccionamiento y cuantificacin de aminocidos, hidratos de carbono, cidos orgnicos, aditivos y contaminantes. En el rea de control ambiental, permite la identificacin de contaminantes y sus metabolitos, pesticidas, metales pesados e hidrocarburos. Como todo desarrollo de un rea analtica nueva, la incorporacin de tcnicas acopladas como la espectroscopia de masa, fluorescencia inducida por lser y otras variantes permiten augurar un promisorio futuro.DIFERENCIA DE ELECTROFORESIS DE UN GEL: Es un proceso para separar cepas de ADN empujndolas a travs de un gel colocado en una mesa que es calentada (y cubierta).Es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico La distancia se mide como la va ms corta entre los electrodos, no es simplemente la longitud misma del gel. Separar especies complejas de elevado peso molecular de inters biolgico y bioqumico.Las separaciones se llevan a cabo sobre una capa delgada y plana o placa de un gel semislido y poroso que contiene un tampn acuoso en el interior de sus poros. Esta ser la sustancia encargada de ofrecer resistencia al movimiento de las molculas, controlando as su migracin uniforme.Mediante esta tcnica se pueden separar varias muestras simultneamenteVENTAJAS La porosidad del gel ocasiona que los fragmentos ms grandes se separen primero mientras que los fragmentos ms pequeos continan a travs del gel. la electroforesis en gel ha sido refinada a travs del uso de diferentes tipos de gel. Comenzando con la sacarosa y luego con los geles de almidn, la separacin de ADN mediante la electroforesis increment enormemente con el uso moderno de los geles de agarosa y acrilamida. DESVENTAJAS Los geles pueden fundirse durante la electroforesis, el buffer puede agotarse, y diferentes formas del material gentico puede tratarse cuando su forma no es predecible.UTILIDAD: LaElectroforesis en gel se usa en es la identificacin de molculas ADN particulares por los patrones de banda que ellos producen en la electroforesis en gel despus se der cortado con varias enzimas de restriccin. ADN viral, plasmdico y segmentos particulares de ADN cromosomal puede ser identificados por esta tcnica.Uso es la separacin y purificacin de fragmentos individuales conteniendo genes interesantes, los cuales pueden ser recuperados del gel con actividad biolgica completa.Usando esta tecnologa es posible separara e identificar las protenas que difieren en por lo menos en un solo aminocido.5.2) REALICE UN COMPARATIVO ENTRE LA ELECTROFORESIS Y LA CROMATOGRAFA DE CAPA FINA A NIVEL DE LA METODOLOGA Y LA UTILIDAD.R/ A nivel metodolgico:LA ELECTROFORESIS:es unatcnicapara la separacin demolculassegn la movilidad de estas en un campo elctrico. La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido o bien a travs de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre). Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la carga elctrica de las molculas y a su masa.CROMATOGRAFIA: Es un Mtodo de anlisis que permite la separacin de gases o lquidos de una mezcla por adsorcin selectiva, produciendo manchas diferentemente coloreadas en el medio adsorbente; est basado en la diferente velocidad con la que se mueve cada fluido a travs de una sustancia porosaA NIVEL DE UTILIDAD: LA ELECTROFORESIS: Se usa para el DNA recombinante y permite saber la carga que poseen los poli pptidos y separar los diferentes poli pptidos resultantes de las variaciones del experimento del DNA recombinante.CROMATOGRAFA EN CAPA FINA: Se utiliza una capa de cromatografa inmersa verticalmente en un eluyente a polar, la placa cromatografa consiste en una fase estacionaria polar (comnmente se utiliza en silica gel) adherida a una superficie solida con algn agente cementante.5.3) CUAL ES EL TAMAO DEL DNA?R/ el DNA tiene aproximadamente 6.4 mil millones pares de bases en eucariotas. el marcador molecular que utilizamos en la actividad de electroforesis iba de 100 en 100 hasta 1000bp. Si comparamos el peso molecular del DNA humano, con el marcador molecular, sera imposible poder determinar el DNA humano, porque es este en grandsimo, por lo cual no es probable que se logre observa una franja en el gel de agarosa de est.El ADN est formado por dos cadenas muy largas de polinucletidos unidas entre s por puentes de hidrgeno especficos entre las bases de las dos cadenas. Las dos cadenas se encuentran arregladas en una estructura helicoidal alrededor de un eje comn por lo que recibe el nombre de doble hlice. Las bases se encuentran acomodadas hacia el eje de la doble hlice, mientras que el azcar y los fosfatos se encuentran orientados hacia el exterior de la molcula. Alrededor de la doble hlice se forman dos surcos de diferente tamao, denominados "surco mayor" y "surco menor"5.5) EN ESTA PRCTICA SE US COMO BUFFER ELECTROFORTICO TBE 5X SOLUCIN MADRE Y TBE 0.5X COMO BUFFER DE TRABAJO, REALICE LOS CLCULOS RESPECTIVOS SI SE QUISIERA TRABAJAR A PARTIR DE UNA SOLUCIN MADRE TBE 10X Y LA RESPECTIVA DILUCIN PARA UNA SOLUCIN DE TRABAJO TBE 1X. R/Solucin madre TBE 10x y la respectiva dilucin para una solucin de trabajo TBE 1x C1=10X (CONCENTRACION SOLUCION MADRE)V1=?C2=1X (CONCENTRACION SOLUCION DE TRABAJO)V2=50 mlLUEGOC1V1=C2V210X.V1=1X.50mlV1= (1X50ml) V1=5ml 10X5.6. EXPLIQUE QU BENEFICIOS TRAE USAR BUFFER TRIS ACETATO Y EDTA (TAE), TRIS-BORATO (TBE), O TRIS-FOSFATO (TPE) COMO BUFFERS ELECTROFORTICOS Y CULES SON LAS DIFERENCIAS EN UTILIDAD DE ESTOS BUFFERS. R/ BUFFER TRIS ACETATO Y EDTA (TAE),En la biologa molecular que se utiliza en la electroforesis de agarosa tpicamente para la separacin de cidos nucleicos tales como ADN y ARN. Tambin se puede decir que el TAEes eltampnms comnmenteutilizadopara la electroforesisen gel de agarosade ADN, perotambin se utiliza parano desnaturalizanteARNelectrophoresis.1gel de agarosade ADNde doble cadenatiende acorrer ms rpidoen TAEque enotros tamponesperotambinpuede llegar a seragotadodurante la electroforesisextendida. Tampn decirculacino tampnde reemplazodurante la electroforesisextendidapuedenremediar lainferiorde taponamientocapacity.2La dilucin de latampn TAEconcentradoproducetampn A1TAEcon40mM deTris-acetatoy EDTA1mM, pH8,3. El1tampn TAEse utilizatantoen el gelde agarosay comotampn de ejecucin. Se recomiendantensiones aplicadasdemenos de5V / cm(distanciaentre los electrodosdela unidad) para obtener la mximaresolucin. Unasolucin de EDTA(cido etilendiaminotetraactico) se preparaantes de tiempo. EDTAnose quedar completamenteen la solucinhasta que el pHse ajusta a aproximadamente8,0.TRIS-BORATO (TBE), O TRIS-FOSFATO (TPE): Listo para su usoen la electroforesisen geldespus de la dilucinaconcentraciones de trabajo. TBEtampn de ejecucines eltampnms comnmenteutilizadopara el ADNy electroforesis en gelde poliacrilamidaARN. TBEse utilizacon los no-desnaturalizacin o la desnaturalizacin(7 Murea)geles.Tambin se utilizarutinariamentepara el ADNautomatizadogel de secuenciacin. TBEtambinse puede utilizar parageles de agarosa, pero no se recomienda paragelespreparativospara la recuperacindecidosnucleicos. La dilucin dela poblacin deTBEse concentraa un1TBEcorriendoresultadosde tampnenun tampn que contiene89mM de Tris-borato y EDTA2mM, pH8,3. Los510oacciones tambinpueden ser aadidos auna solucinde stockde acrilamida /bis-acrilamida para hacerelgel dePAGE.Se recomiendantensiones aplicadasdemenos de5V / cm(distanciaentre los electrodosdela unidad) para obtener la mximaresolucin.DIFERENCIA DE TAE Y TBE TBEes eficazpara obtener una altaresolucinde los fragmentosde ADN ms pequeos, ytampn TAEestil parafragmentos de ADNms grandes. En elsistema decmara de mini (MupidTM-21). Eltampnconvencional, TAE, no siempre esla mejor opcin parala electroforesis en gel. Teniendo en cuenta eltamao de los fragmentosdeADN, una condicinelectroforticaadecuadatiene que ser elegido, es decir, tampn TAEes paralos ADNms grandes, yTBEparalos ADNms pequeos. Cualquiera debuffer,TBEoTAE, es aplicable parael tamaomediode losfragmentos de ADN. Lamovilidad relativavariar de acuerdo conel tamaode fragmentos de ADN, la concentracin deagarosa, yla composicin deltampn de electroforesis.5.7. EXPLIQUE POR QU ES NECESARIO USAR UN BUFFER DE CARGA EN LA ELECTROFORESIS Y CUL ES LA FINALIDAD DE CADA UNO DE SUS COMPONENTES. R/ Los buffers de carga facilitan la visualizacin y sedimentacin del producto de PCR o de cidos nucleicos en los pozos para lo cual emplean distintos tipos de colorantes, cada uno de ellos exhibe un patrn de migracin diferente.Componentes GLICEROL SUCROSA: es lo que le da peso a la muestra para que el ADN se precipite al fondo de los pozos de siembraCOLORANTES azul de bromofenol xylene cyanol, etc. permiten identificar el frente de corrido.MARCADORES DE PESO MOLECULAR = se utilizan para tener una referencia del tamao de los fragmentos por separar e identificar.

5.8. EN GENERAL PARA ENSAYOS ELECTROFORTICOS DE ADN, SE USA BUFFER DE CARGA 6X CON LOS COMPONENTES DESCRITOS EN LA TABLA 1, PERO DURANTE LA PRCTICA SE UTILIZ EL BUFFER DE CARGA 5X GREEN GOTAQ-FLEXI BUFFER USADO PARA ENSAYOS DE PCR, INDIQUE LOS COMPONENTES DE ESTE Y QUE IMPLICACIONES TRAE EL REMPLAZO POR BUFFER DE CARGA 6X. R/ Buffer de corrida TBE 5X 1000 ml Tris 54 g cido Brico 27.5 g EDTA (0.5M; pH 8) 20 ml Agua destilada llevar a 1000 ml

ComponentesCaractersticaUtilidad

Sacarosa o GlicerolOtorgan densidadIncrementan la densidad de la muestra y aseguran que el ADN baje en forma pareja dentro del pocillo.

Azul de bromofenol Migra en una corrida electrofortica a una velocidad similar a un ADN helicoidal sper enrollada (300 pb Aprox.) Permite evidenciar a simple vista la corrida electrofortica de los Fragmentos de ADN compactos.

Xylen cyanol Migra en una corrida electrofortica a una velocidad similar a un ADN doble de cadena lineal (4.000 pb aprox.)Permite evidenciar a simple vista la corrida electrofortica de los Fragmentos de ADN laxos.

1. cuando las soluciones concentradas se guardan por perodos prolongados suelen observarse precipitados. Para evitar problemas, preservar la solucin 5X en botellas de vidrio a T ambiente y descartarla cuando se observen precipitados. Originalmente el TBE se utilizaba al 1X para electroforesis de geles de agarosa. Aunque una solucin al 0.5X provee suficiente poder de buffer. TBE al 1X generalmente se utiliza para geles de poliacrilamida, pues los reservorios para el buffer son pequeos y la cantidad de corriente es considerable, por tanto se requiere un poder de buffer adecuado. 2. el buffer para electroforesis alcalina debe prepararse fresco.Los buffers tienen tres propsitos: a) Incrementan la densidad de la muestra, b) Aseguran que el ADN caiga directamente dentro de la muesca del gel, c) Otorgan color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo elctrico migran hacia el nodo a tasas predecibles. El azul de Bromofenol migra a travs de geles de agarosa aproximadamente 2.2 veces ms rpido que el xylencyanolff, independientemente de la concentracin de la agarosa.

5.9 . Dibuje un gel con su respectivo marcador de peso molecular, luego de que hiciera la digestin de una muestra con la enzima EcoRI. El amplificado digerido tena una longitud de 738 pares de base, con punto de corte en la posicin 100 y 200.

738pb 600pb 500pb 400pb 300pb 200pb 100pb

5.10. CUL ES LA SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO DE LA ENZIMA ECORI. CORTA UNA SOLA DE LAS CADENAS? CUL ES EL ENLACE QUE DIGIERE? QU TIPO DE REACCIN QUMICA EFECTA? QU DIFERENCIA HAY ENTRE ENDONUCLEASA Y EXONUCLEASA? R/ Secuencia de reconocimiento EcoRl5 GAATTC3 CTTAAGLa enzima EcoRl o enzima de restriccin corta las 2 cadenas de diferentes formas 1. Forma escalonada: da lugar a la formacin de fragmentos de ADN cuyos extremos tienen una corta regin monocateriana que resultan complementaria a las de los otros fragmentos ,produciendo entonces segmentos independientes que se relacionan muy fcilmente ,por lo que tales extremos reciben el nombre de extremos cohesivos o pegajosos.2. Forma abrupta: es cuando corta la cadena en un solo punto. Diferencias entre endonucleasa y exonucleasa: Endonucleasa de restriccin son enzimas que hidrolizan los cidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotidos del interior de la cadena, las endonucleasa de tipo 2 son las ms usadas en mtodos de DNA, mientras que las exonucleasas son las que hidrolizan el ADN por su extremos, esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra simple.5.11. CUL ES LA UTILIDAD DE LA TCNICA RFLP Y COMO RELACIONA CON LA ELECTROFORESIS?R/ La tcnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genticas, en ciencia forense, en pruebas de paternidad y en otros campos, ya que puede mostrar la relacin gentica entre individuos.se relaciona con la electroforesis mediante huella gentica(tambin llamada prueba de ADN o anlisis de ADN) es una tcnica que se utiliza para distinguir entre los individuos de una misma especie utilizando muestras de suADN.Esta tcnica es til porque podemos utilizar esta caracterstica de la secuencia de ADN donde se une la enzima de restriccin o no para observar las diferencias de otras personas, es decir si tienen ese sitio o no, las diferencias producen el cambio de una sola base entre dos personas podran resultar en la presencia o ausencia de este sitio de corte, entonces si se asla este pedazo de ADN que rodea la enzima cortada y en la otra no, esto refleja un polimorfismo o diferencia entre estas dos personas, podemos observar esto asilando el ADN cortndolo con una enzima de restriccin bacteriana y corriendo con electroforesis en gel.5.12. A CUL GRUPO QUMICO PERTENECE LA AGAROSA Y CUL ES EL ENLACE QUE PERMITE SU POLIMERIZACIN.

R/ La agarosa es un polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de los gneros Gellidium y Gracillaria.

La estructura de un polmero de agarosa es la siguiente:

Se observa que un enlace covalente formado entre dos monmeros me forman un polmero de agarosa, este sera el enlace que permite la polimerizacin de la agarosa.5.13. ES PLAUSIBLE EL USO DE ESTE TIPO DE POLMEROS EN LA ENTREGA CONTROLADA DE FRMACOS? EXPLIQUE SU RESPUESTA. R/ S, porque la agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no toxica que supone una herramienta indispensable en gran cantidad de tcnicas de biologa molecular, bioqumica y biologa celular. Su uso ms extendido es para construir geles que permitan separar molculas de ADN mediante electroforesis, adems de ser utilizada para fijar molculas a su estructura como anticuerpos, antgenos y enzimas. Igualmente se utiliza para el cultivo celular y microbiologa. Otros usos menos extendidos son la utilizacin de estos geles como matrices en la reparacin de tejidos daados.5.14. CULES SON LAS DIFERENCIAS A NIVEL MOLECULAR ENTRE LA POLIACRILAMIDA Y LA AGAROSA? CON BASE EN ESTAS DIFERENCIAS QU RELACIN HAY ENTRE LA ESTRUCTURA MOLECULAR DEL TAMIZ Y LA RESOLUCIN DE UN CORRIDO ELECTROFORTICO? R/ LA Poliacrilamida: es un homopolmero de acrilamida, el gel es el resultado de la polimerizacin qumica de una mezcla de acrilamida y bis acrilamida. Regulando la concentracin de ambas y su proporcin se consiguen distintas porosidades siempre menores que la de los geles de agarosa. La poliacrilamida no es txica, Sin embargo, la acrilamida que no ha polimerizado, que es una neurotxica, puede estar presente en muy pequeas cantidades en la acrilamida polimerizada, de ah que sea recomendable su manipulacin con precaucin.

Son ms efectivos para separar fragmentos ms pequeos aumentando la resolucin de corrido, por lo que se pueden separar molculas de ADN que difieren en tan solo un par de nucletidos. Los geles de poliacrilamida son ms complicados de preparar, pues se necesita la polimerizacin de dos molculas diferentes (acrilamida y bis acrilamida) y ms complejos de manipular pues presenta alta neurotoxicidad. La Agarosa: es un polisacrido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de las algas de los gneros Gellidium y Gracillaria. Su polimerizacin se debe al enlace covalente formado entre dos monmeros que la conforman.La agarosa es un producto natural que forma una matriz inerte y no txica.

Los geles de agarosa poseen menos poder de resolucin del corrido en comparacin con la poliacrilamida, ya que son ms efectivos para separar fragmentos ms grandes, por tener una malla o un tamiz ms abierto. No presentan neurotoxicidad.Relacin entre estructura molecular del tamiz y la resolucin de un corrido electrofortico:La agarosa como maneja un tamiz muy grande se pueden utilizar molculas muy grandes, debido a esto debemos esperar ms cantidad de tiempo para el corrido (menos poder de resolucin de corrido); en cambio la poliacrilamida como maneja un tamiz muy pequeo es ms efectivo para separar fragmentos pequeos, y debido a esto no se va a demorar mucho el corrido (aumenta la resolucin de corrido).5.15. QU DIFERENCIA METODOLGICA HAY ENTRE LA ELECTROFORESIS DE ADN Y DE PROTENAS? R/La electroforesis es una carrera entre molculas, ya sea fragmentos de ADN o protenas. Es una carrera de obstculos, ya que los fragmentos han de atravesar un laberinto en forma de gel. En el caso del ADN la cosa es sencilla, ya que el ADN es una molcula que en condiciones fisiolgicas est cargada negativamente. As, en un campo elctrico lineal a pH fisiolgico, cualquier molcula de ADN se mover hacia el polo positivo del campo, mientras que para las protenas la cosa se complica un poco ms, ya que una protena cualquiera puede estar formada por aminocidos cidos y bsicos en nmero variable, habr protenas ms positivas y otras ms negativas para un determinado pH. Entonces, en un campo elctrico lineal, puede ocurrir que unas protenas vayan hacia el polo positivo, otras hacia el negativo y otras no se muevan en absoluto (aquellas que al pH de la carrera no estn cargadas, o lo que es lo mismo, estn en su punto isoelctrico). Adems, las protenas tiene estructuras complejas: pueden ser globulares, lineales, o estar formadas por varias cadenas.5.16. CULES SON LOS PASOS DE UN WESTERNBLOT Y PARA QU SIRVE?R/ los pasos de WesternblotPASO 1: Inmovilizacin de protenas sobre la membrana, generalmente mediante electrotrasnferencia. PASO 2: Saturacin de todos los lugares de unin de protenas de la membrana no ocupados para evitar la unin no especifica de anticuerpos. Bloqueo de la membrana.PASO 3: Incubacin del blot con anticuerpos primarios contra la(s) protena (s) de inters: La eleccin del anticuerpo primario para un Western Blot depender del antgeno que se desee detectar y de los anticuerpos disponibles para ese antgeno en concreto. PASO 4: Incubacin del blot con anticuerpos secundarios, o reactivos que actan de ligando para el anticuerpo primario unido a enzimas u otros marcadores: Como anticuerpos secundarios se suelen emplear anticuerpos que reconocen la inmunoglobulinas (o sea, el anticuerpo primario) PASO 5: Sistema de revelado de las bandas de protenas marcadas con el complejo de anticuerpos. La tcnica de Inmunotransferencia (Immunoblotting o Western Blot) es un sistema rpido y muy sensible que sirve para le deteccin y caracterizacin de protenas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antgeno y anticuerpo. Implica la separacin por electroforesis en geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana de las protenas de una mezcla compleja (lisado total celular).5.17. CULES SON LOS SISTEMAS DE MARCAJE UTILIZADOS PARA LA DETECCIN DEL ANALITO EN EL WESTERNBLOT?R/ nitzipperr es una tecnologa de bioconjugacin innovadora que permite el marcaje directo de anticuerpos, protenas, pptidos u otras biomolculas para su uso en diversas aplicaciones, el desarrollo de kits de diagnstico, descubrimiento de nuevos medicamentos y cualquier otra aplicacin que te puedas imaginar. Anticuerpo unido a una enzima: mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble, de esta forma en el posterior anlisis quedar una mancha en donde est la protena de inters. Marcaje fluorescente: emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo cercano. Furanona o el rojo nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante cuando se excitan de manera constante permite una deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta. Deteccin con oro: esta tcnica es conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos primarios con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas causadas por el oro en donde est la protena.5.18. CMO SE ASEGURA LA ESPECIFICIDAD DE LA DETECCIN EN EL WESTERNBLOT? R/ La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de inters. La especificidad de Western Blot se logra mediante la utilizacin de un anticuerpo que reconoce y se une a un eptopo nico de la protena de inters

En este ejemplo, el anticuerpo purificado est funcionalizado con el Linker U de nitzipper y el marcador est funcionalizado con el Linker T, linkers complementarios. El protocolo de un solo paso es tan rpido y fcil de usar, que permite marcar los anticuerpos en menos de 30 segundos. El investigador simplemente pipetea los anticuerpos funcionalizados con el Linker U con el marcador de inters funcionalizado con el Linker T complementario y se incuba unos 15 minutos .Obtienes finalmente tu anticuerpo marcado listo para usar en tus tcnicas dewestern bloten menos de 17 minutos y con una alta pureza (hasta ~ 100% de conjugado anticuerpo-marcador sin necesidad de purificacin adicional).5.19. QU DIFERENCIA HAY ENTRE WESTERNBLOT, SOUTHERNBLOT Y NORTHERNBLOT? R/ La diferencia entre ellos: Westernblot: Es una tcnica analtica muy utilizada para identificar una protena en una mezcla de protenas complejas gracias a la especificidad de la interaccin anticuerpo-antgeno. Southernblot: Es unatcnica que permite la identificacin de secuencias especficas de DNA, mediante el uso de electroforesis en gel yde hibridacin utilizando sondas especficas. Northernblot: Es una tcnica de deteccin de molculas de cido Ribonucleico (ARN) de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja. 5.20. SI DESEARA DETECTAR UNA MOLCULA ESPECFICA DE ADN DESPUS DE UN CORRIDO ELECTROFORTICO COMO LO HARA? MENCIONES LOS PASOS QUE REALIZARA, EL TIPO DE MARCAJE Y LA INTERPRETACIN DEL RESULTADO.

R/ La extraccin de cierta molcula de ADN se hara mediante Southern blotPASOS: Extraccin de ADN: se puede extraer de cualquier tejido humano. Digestin del ADN: el ADN extrado de la muestra se trata con una endonucleasa de restriccin, que es una enzima que corta el ADN bicatenario en donde tenga una secuencia caracterstica. Electroforesis en gel de agarosa: tras la digestin de ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan segn su tamao mediante electroforesis en geles de agarosa. Al avanzar las molculas de ADN su velocidad de migracin se ve reducida por la matriz de gel de agarosa. Preparacin de un ensayo Southern blot: las molculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa. Tras la neutralizacin de esta, el DNA monocateriano resultante se transfiere a la superficie de la membrana realizando una copia. Hibridacin con sonda radioactiva: una sonda de locus nica es una molcula pequea de ADN o ARN capaz de hibridar con el ADN de un fragmento de restriccin concreta en el ensayo de Southern blot. Las sondas de locus se marcan con un istopo radioactivo para facilitar su deteccin Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa: las posiciones de hibridacin de la sonda radioactivasobre la membrana del ensayo de Suthern blot se detectan mediante autorradiografa. En esta tcnica la membrana de Nailon se coloca una vez lavada junto a una pelcula de rayos X dentro de una caja aislante de luz. La pelcula registra las posiciones donde hay desintegracin radioactiva. Reensayar el resultado de Southern blot con sondas adicionales: en un anlisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografa, se puede lavar la radioactividad con una disolucin a elevada temperatura que deja el ADN en su sitio e hibridarlo con una segunda radioactiva.

BIBLIOGRAFIAhttp://agarosabiotecnologia.blogspot.com/p/electroforesis-origen-uso-y-aplicacion.htmlhttp://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/plataformas_de_proteomica.pdfhttp://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.htmlhttp://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdfhttp://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/16%20ELECTROFORESIS%20GELES%20PAA.pdf5:125:95:3