Electroforesis Electroforesis Bidimensional Bidimensional

de proteínasde proteínas

Lucía Monteoliva Díaz

Separación de proteínas

• ELECTROFORESIS: 1D, 2D

• ALTERNATIVAS A LA 2D: CROMATOGRAFÍAMULTIDIMENSIONAL Y ELECTROFORESIS CAPILAR

Análisis proteico

Electroforesis (transporte bajo la acción de un campo eléctrico)

-Herramienta analítica indispensable, útil para:

separar y comparar mezclas proteicas evaluar pureza de una proteínaestimar cantidad de una proteínadetectar proteolisisdetectar modificaciones proteicasestimar características físicas de una proteína

- Geles de muy diversos tamaños y naturaleza

ELECTROFORESIS MONODIMENSIONAL EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES

(SDS-PAGE)

• Fácil de realizar

• Reproducible

• Resuelve proteínas de 10-300 kDa de masa molecular

• CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS DESPUÉS DE UNA PURIFICACIÓN. COMPLEJOS PROTEICOS

Electroforesis bidimensional en la separación de proteínas

• Klose, 1975. Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik 26(3), 231-243.

• O´Farrell, 1975. High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of proteins. The Journal of Biological Chemistry 250, 4007-4021

• Anderson and Anderson, 1982. The human protein index. Clinical Chemistry, 28, 739–748.

Electroforesis Bidimensional

pI

PM

1ª D: Isoelectroenfoque (pI)

2ª D: SDS-PAGE (PM)

pI

PM

Fundamentos bioquímicosde la primera dimensión

LAS PROTEÍNAS SON MOLÉCULAS ANFOTÉRICAS:

carga neta suma de las cargas de los AA de las cadenas

laterales y de los extremos –NH2 y –COOH

La carga de los aa de las cadenas laterales cambia dependiendo del pH del medio

PH ÁCIDO PH BÁSICO

GRUPOS CARBOXILOGRUPOS AMINO (+)

GRUPOS CARBOXILO (-)GRUPOS AMINO

• En un gradiente de pH y bajo la influencia de un campo eléctrico las proteínas se mueven hasta la zona donde la carga neta es 0

pI

Fundamentos bioquímicosde la primera dimensión

Gradiente de pH

La capacidad de resolución depende de: -formación de un gradiente de pH adecuado-fuerza del campo eléctrico

Gradientes de pH inmovilizados:

Inmovilinas “Tiras de IPG”

Campo eléctrico:

Voltajes muy elevados (8000)

Voltios-hora (Vh)

2.5 4 5 6 7 11109 128

Immobilized pH Gradients (IPGs)

3

wide gradients

‚standard‘ gradients

basic extremeacidic extreme

zoom-in gradients

3-10L, NL

AGENTES REDUCTORES: DTT, TBPAGENTES CAOTRÓPICOS: UREA,TIOUREADETERGENTES: no iónicos o zwiteriónicos: CHAPS, NP-40ANFOLITOS: aumentan conductividad de la muestra

Solubilización de la muestra

Las muestras son desnaturalizadas y completamente solubilizadas para una óptima separación.

Primera Dimensión:

“cup loading”

Primera Dimensión: Rehidratación en gel

Gran capacidad de carga

IPGTMphor IEF unit

1. Step 300 V 3 h

3. Gradient 1 000 V 3 h

4. Gradient 8 000 V 3 h

5. Step 8 000 V 4 h

6. Step 500 V

Voltios hora

EQUILIBRADO DE LA TIRA

Tris, pH adecuado para electroforesis

urea: desnaturaliza

SDS: desnaturaliza y carga negativamente

1 REDUCCIÓN DE PUENTES DISULFURO

DTT

2. ALQILACIÓN

Iodoacetamida: (alquila los –SH para evitar reoxidaciones)

Colocación de la tira sobre la segunda dimensión

Segunda Dimensión

Fundamentos bioquímicos de la segunda dimensión:

SDS-PAGEProteínas + SDS+ Ag. REDUCTOR

SEPARACIÓN EN FUNCIÓN DE SU PM

Aplicación de un campo eléctrico

TODAS LAS PROTEÍNAS IGUAL

CARGA

1 Muestra2 Separación y detección 3 Análisis de imagen4 Escisión y digestión 5 Identificación

4

2

5

3

1

1000 1500 2000

Mass (m/z)

Proteómica Clásica: Diseño Experimental

1 Muestra2 Separación y detección 3 Análisis de imagen4 Escisión y digestión 5 Identificación

4

2

5

3

1

1000 1500 2000

Mass (m/z)

Proteómica Clásica: Diseño Experimental

Preparación de la muestra

ELECCIÓN

Tipo de muestra

Extracto totalFracción o compartimiento celular

Condiciones a estudiar

Condiciones “estándar”:Mapa de referencia

Distintasvariaciones

Complejosproteicos

Elección de muestra adecuada

Condiciones de crecimiento

Genotipo Tipo de célula

FármacosEnfermedadMedio de cultivo

Edad

Interacciones

FENOTIPO PROTEÓMICO: • fenotipo que puede ser observado con métodos proteómicos• Determinado por: GENOTIPO+AMBIENTE

1 ORGANISMO= INFINITOS PROTEOMAS

Preparación de la muestra

• Rotura celular• Precipitación de proteínas• Solubilización• Protección frente a proteasas• Eliminación de :

–Ácidos nucleicos–Lípidos–Sales–Material insoluble

• Fraccionamiento. Proteomas y subproteomas

AGENTES REDUCTORES: DTT, TBPAGENTES CAOTRÓPICOS: UREA,TIOUREADETERGENTES: no iónicos o zwiteriónicos: CHAPS, NP-40ANFOLITOS: aumentan conductividad de la muestra

Solubilización de la muestra

Las muestras son desnaturalizadas y completamente solubilizadas para una óptima separación.

Extracción: Comparación Urea vs. Urea/Tiourea

7 M urea / 2 M thiourea

Rat liver

8 M urea

Eliminación de componentesno proteicos

Digestión con nucleasasSonicación

POLISACÁRIDOS, Ac. Nucleicos, Lípidos:VISCOSIDAD DE LA MUESTRA

Efecto de las sales

Extracto de E. coli pH 4-7

no salt 30 mM NaCl

Precipitación de la muestra

Lisado de E. coliExtracto de E. coli precipitado con

TCA/acetone y resuspendido

Efecto de la diálisis

Dializado

pH 3-10 NL pH 3-10 NL

Sin dializar

Anderson, N. L. (2003) Mol. Cell. Proteomics 2: 50

Reference intervals for 70 protein analytes in plasma

Complejidad de la célula eucariota

Rangos muy variables de concentraciones de las distintas proteínas en

una muestra compleja

Fraccionamiento:1. Subproteomas2. Distintos rangos de pH

2.5 4 5 6 7 11109 128

Immobilized pH Gradients (IPGs)

3

wide gradients

‚standard‘ gradients

basic extremeacidic extreme

zoom-in gradients

3-10L, NL

∑ 1491

∑ 1564

∑ 218 ∑ 1429

IPG 4 - 5

IPG 4 - 7

IPG 5 - 6 IPG 5,5 - 6,7

ResoluciónResoluciónYeast

Wildgruber et al., 2000. Electrophoresis

Visualización de las proteínas

• Tinción con Azul de Coomassie (100ng-1µg)

• Tinción con plata (1-10ng)

• Compuestos fluorescentes:

– SYPRO-RED,

– SYPRO-RUBY (1-10ng)

• Autorradiografía de proteínas marcadas

• Fluorocromos: DIGE

• Transferencia a membrana:

– Ab

– Tinciones

•Tinción de Plata amoniacal

•Sypro Ruby

Detección de ProteínasVENTAJAS DESVENTAJAS

NITRATO DE PLATA

Muy sensibleMétodo de elección

Proteínas no se tiñenImpurezas impiden tinciónPoco rango dinámico lineal (fácil saturación)

AZUL DE COOMASIE Fácil de realizar No es muy sensible

SYPRO-RUBY RápidoMuy sensible

Muy caro

ISÓTOPOS RADIACTIVOS Muy sensible Trabajar con

radiactivos

DIGE: aumenta rango dinámico

Densitómetroreflectancia y transmitancia

“Fluor-S / Fluor-S MaxMultiImager”

CCD Based UV / Visible, Fluorescence& Chemiluminescence

Sistemas de adquisición de imágenes

Melanie, PDQuest, ImageMaster Platinium software programs

ANÁLISIS DE IMAGEN

Proteómica de expresión: Cuantificación y comparación

Análisis de imagen

Adquisición

Gel: transmitanciaMembrana: reflectancia

SOFTWAREAnálisis de imagen

Etiquetado de las proteínas (mapas de referencia)

Detección y cuantificación de manchas

Comparaciones de geles (entre si, con bases de datos)

•Almacenamiento•Selección de proteínas:

identificación

CUANTIFICACIÓN Y COMPARACIÓN

EttanTM

Spot Picker

EttanTM Digester

pI 4.5

2

7 811

1314 15

16

171819 23

25 26 27293031 32

3344

4652

5354

5643

5067 69

80

81

88

87 9192

9382

83

62 63

667576

36 3734 40

2824

59

7164

22

41

21

5.5

MW

Resultados obtenidos

Ventajas de la 2D-PAGE

• REPRODUCIBILIDAD

Establecer mapas de referencia

Detección de cambios de proteoma

Bases de datos de mapas

• MAXIMA CAPACIDAD DE CARGA

Procesos de identificación

En electroforesis preparativa

• RESOLUCIÓN

Detección máximo número de manchas

Diferenciación y visualización de distintas

formas de una misma proteínas

Limitaciones de la 2D-PAGE

• Técnica laboriosa, difícil de automatizar• Proteínas muy grandes o muy hidrofóbicas no entran en

el gel• Proteínas poco abundantes no se visualizan• Proteínas muy ácidas o muy básicas no se resuelven

bien