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UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
FACULTAD DE CIENCIASBIOLOGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGíA
/UIDlEUDEN* 5309558754*UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
EL VIRUS DEL MOSAICO COMUN DE LA JUDIA.
CARACTERIZACION BIOLOGICA, SEROLOGICA
MOLECULAR DE AISLADOS ESPAÑOLES.
Memoria presentada
Y
porMargarita Sáiz Zalabardopara
optar a! grado de Doctor enCiencias Biológicas
¿
1N
Madrid, diciembre de 1993
UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
FACULTAD DE CIENCIASBIOLOGICAS
DEPARTAMENTODE MICROBIOLOGíA
El virus del mosaico común de la judía. Caracterizaciónbiológica,
serológica y molecular de aisladosespañoles.
Directores AutoraDra. Serafina Castro Robleda Margarita Sáiz Zalabardo
(7 -1
Dr. Javier RomeroCano
/4J(¿Y.
.3
Memoria presentadapor
Margarita Sáiz Zalabardo
para optar al grado deDoctor en Ciencias
BiológicasInvestigadores del CIT-INIA
Madrid, diciembre de 1993
!Rssulta ¿unu recoger en unaspocaspáginasa toáis aquellos que fian contribuido, de
maneradirecta o indirecta, a que este trabajo saliera adelante.‘Empezarépor los agradecimientos
de carácter más puramentecientífico, aunque me resulte dificil en algunoscasossepararlosde
los personales,en los que entraré másadelante.
£n primer fugan quiero agraifeceral J9VjL~4 la concesionde una becapredoctoral que me
permitió subsistirdurante Li mayorparte & la duraciónde este trabajo.
A mis directores de ‘Tésis, Javier Rpmero y Serafina Castro, por asesorarmey
soportarmetofo este tiempo. Muy especialmente,le agradezcoa fina sus constantesdesvelosy
su apoyo incondicionalen (os momentosmás Juros.
Quiero mencionar a continuacióna los distintos investigadoresque nos cedieron
desinteresadamentematerial científico, en algunos casosfundamentalen el desarrollo de esta
‘Tesis:
Al ‘Dr. si-II. Vetten por los anticuerposfrente a 3C2~~tVy sus secuenciasantes de
publicación.Al Vr. Q. MinIQ por sus anticuerposcontra ~BC9JV241 Vr. J4. iMorales por los
aisladosde ~BCMVy las semillas libres de virus. A la Vra. V. Lisapor los aisladosde ‘SCM’V,
‘14431V 2, q~Y~JVyC19V1¿541Vr V. ‘Berra por los lotes de semillasdelq’aís Vasco.Al Vr. 5~¿
Ortíz, que nos proporcionósemillas de los cultivares indicadoresen cantidadessuficientespara
realizar nuestrosensayos,y nos acompañó,inagotable, en mucñosmuestreos.
Quiero recordar tambiéna Javierf4fonsol’onga, que nosguióen el muestreode León,y
con elque mi desconocimientoacercade tP/iaseolus vulgaris disminuyóconsiderablemente,i’ a
9v1.i4. 9vtárcotegui.que me ayudóen mispinitosen microscopiaelectrónica.
‘Dedico un agradecimientomuy especiala Li Vra. llora Sánchez,de cuya mano eaperta
me introduje en el mundode 14 biología molecular
tEl análisis lilogenéticode ‘SC3IVse realizó en colaboraciónconelVr. 5. Vopazo,cuya
competentey objetiva visión del temacontribuyóengranmedidaa enriquecereste trabajo.
Agradiezcotambién al ‘Dr 1. fresno su gran ayuda con fasfotografías. A Qerardo
Carazo, su apoyomoral. Z Li Vra. (1 Ve lilas, cuya‘Tesis me sirvió de inspiracióny fuentede
algunasfiguras. AlVr fi. fPonz por suapoyoimplícito y sus constructivascríticasy sugerencias.
Al Vr. ‘1-’. ‘Torres, porquefui su ‘becaria favorita’. Al Vr J.$11. 9Jalpica, sin cuya afectuosay
férreapresión esta ‘Tesis habría empezadoa escribirse muchomás tarde.
9k de nombrar, por supuestoal Vr. J.9J. 9diart-ínez-Zapater,a pesar delcual conseguí
escribir esta Tesis, Jada su irracional obsesiónpor el ordenador, y que disfrutó mucho
metiéndoseconmz~o,aunquecon susbromas me hizo másllevaderaLi escritura.
A Adela ~‘sdondole agradezcotoda su ayuda, especialmenteen el procesamientode
muestras,para e1 quesiempreestuvodispuesta,rodillo en ma-no.
Muy personales:
Incluyo aquí a todos mis compañerosdel Area de Virología Vegetaly ‘Biología
Molecular, a los que seria interminable nombrar, y hago mención a los que no me perdonaría
omitir:
54 M~ JoséSoto. que durante mucho tiempofue mi compañera,a la que no perdonaré
sí no escribe la ‘Tesis. Con ella compartíinfinidad& divertidísimosy desastrososexj.’erimentos,y
muchosbuenosy malos ratos que no olvidaré.
24 Vavid !Qartínez, para el que me sería muy dificil encontrar calficativos, sin
incrementarsu desarrolladafacetanarcisista. Qgsiero agradecerleelser un ¿¿¿celentecompañero,y
estar allí para echar una mano siempre quefuera necesario,y fuera la hora quefuese.Los
estupendosmomentosque compartimos, son algo que nos ha unido inevitablemente.Vavid
siempreserá mi azafatofavorito.
24 IsabelAguilar, la hsujridora’ más entrañabledel laboratorio, que para mí, siempre
será ‘la pegue
24 ÚVjjevesSánchez,cuyaparticular visión de La Ciencia, nos hizo pasar buenosratos
juntas.
24 JoséAntonioJarillo, quesembrarála alegría con su encantopersonalallí dondevaya.
24 S?vtarta1?glzlán, que me escuchay animécon su chispeantepersonalidad
A Ximo, al quefustiguésin piedadcon ini ignorancia, y quesiempreestuvodispuestoa
dedicarme un rato cuandofuepreciso, haciendode nuestro trabajo en comúw con supeculiar
manerade ser, una eapertenciamuy agradablea todoslos niveles.
tPor último, le agradezcoa Julio, al que dedico también esta <Tesis, el haber sabido
aguantar estáicamentetodoslos ¿fictos secundadosque ‘ella’ me originó a nivelpersonaCy por
elapoyoque supusosaberque, a pesarde todo, élsiempreestabaahí.
54 mi padre, por habersabido llevar con afecto todos mis momentosde cansancioy mal
humoren casa.
INDICE
1. INTRODUCCION
1. Phaseolus vulgaris 11 .1. Característicasgenerales 11.2. Descripción botánica 21.3. Plántula 21.4. Semilla 41.5. Variabilidad 4
2. Problemáticaactual del cultivo en España 52.1. Ausencia de variedadescomerciales 62.2. Enfermedades 6
3. Los virus vegetales 7
4. Enfermedadesvirales en judía 1 14.1. Potyvirus 12
4.1.1. Característicasgenerales 124.1.2. Organización y expresión
del genoma 134.1.3. Taxonomía de potyvirus 16
4.1.3.1. Parámetrosclásicos 174.1.3.2. Parámetros moleculares 19
5. El virus del mosaico común de la judía (BCMV) 205. 1. Propiedadesbiológicas 205.2. Fuentesde resistenciaa BCMV 235.3. Clasificación de cepasde BCMV 245.4. Serología 245.5. Situación taxonómica actual dentro del
grupo de los potyvirus 2 6
6. Resistenciaa virus en plantas 276.1. Control de BCMV 29
II. JUSTIFICACION Y OBJETIVOS 30
III. MATERIALES Y METODOS
1. Material vegetal1.1. Recogida de muestras1 .2. Conservaciónde aislados1.3. Inoculación del virus1.4. Cultivares de
Phaseolus vulgaris1.4.1. Transmisión y1 .4.2. Caracterización
2. Microscopia electrónica2.1. Tinción negativa2.2. Seccionesultrafinas
utilizadospurificaciónde cepasde BCMV
3. Ensayos inmunológicos3.1. Anticuerpos utilizados
3.1.1. Monoclonales3.1.2. Policlonales
3.2. ELISA3.2.1. Extractos vegetales3.2.2. Conjugados3.2.3. Sustrato
3.3. Inmunomicroscopíaelectrónica
4. Purificación de BCMV y extraccióndel RNA viral
4.1. Purificación del virus4.2. Extracción del RNA viral
5. Síntesisde c-DNA viral
con CIPde ligaciónde células competentes
6. Clonación y manipulaciónde DNA6.1. Vectores6.2. Tratamiento6.3. Reacciones6.4. Preparación
de E. cvii6.5. Transformacióny selección de clones
recombinantes6.6. Preparaciónde DNA plasmídico
31313131
323232
323233
333333343434353535
353536
36
37373838
39
3939
7. Hibridaciones de ácidos nucleicos 40
7.1. Transferencia a membranas 407.1.1. Transferencia tipo ‘Southern’ 407.1.2. Transferenciaa partir de colonias 407.1.3. “Dot bid” de extractos vegetales 4 1
7.2. Marcaje de las sondas 417.2.1. Marcaje con I~—32P]dCTP 417.2.2 Marcaje con digoxigenina 41
7.3. Condiciones de hibridación 4 17.3.1. Hibridación con sondas radiactivas 417.3.2. Hibridación con sondas marcadascon
digoxigenina 42
8. Secuenciación 428.1. Reaccionesy estrategia 428.2. Geles de secuenciación 43
9. Técnicas electroforéticas 439.1. Electroforesis en geles de agarosa 43
9.1.1. Extracción de fragmentosde DNAa partir de geles de agarosa 44
9.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida 449.2.1. Extracción de fragmentosde DNA a
partir de geles de poliacrilamida 44
10. Análisis filogenético 4510.1. Aplicación del test de tasa de
evolución desigual 4510.2. Derivación de árboles filogenéticos 45
11. Amplificación enzimática de BCMV 461 1 .1. RT-PCR a partir de extracto vegetal 4 711.2. RT-PCR previa adsorcióndel virus a
placas de microtitulación medianteanticuerposespecíficos (PCR-INIA) 47
11.3. Detección de los productosde amplificación 48
11.4. Aislados utilizados 48
IV. RESULTADOS
1. Estimación de las virosis en el cultivo de judía 50
2. Caracterizaciónde aisladosde BCMV 5 32.1. Caracterizaciónserológica 53
2. 1. 1. Perfiles serológicos de los aislados 5 62.2. Caracterizaciónbiológica de aislados 6 1
3. Clonación y secuenciaciónde los genesde laproteína de la cápsiday región 3’ no codificantede dos aisladosde BCMV 61
3.1. Estrategia de donación 623.2. Secuenciacióndel gen de la proteína de
la cápsidadel aislado J-8 de serotipo B 623.3. Secuenciacióndel gen de la proteína de
la cápsida del aisladoJ-56 de serotipo A 6 5
4. Análisis de las proteínasde la cápsida deducidaspara los aislados de BCMV secuenciados 6 8
5. Análisis de las regiones 3’ no codificantesdelos aisladosde BCMV secuenciados 7 2
6. Comparacióncon las proteínasde la cápsidade otros potyvirus estrechamenterelacionados 72
7. Comparacióncon las regiones 3’ no codificantesde otros potyvirus estrechamenterelacionados 7 2
8. Análisis filogenético de BCMV 798. 1 Aplicación del test de tasa de evolución
desigual 798.2. Derivación de árboles filogenéticos 8 1
9. Detección de BCMV mediante transcripcióninversa y amplificación enzimática 8 6
9.1. Diseño de cebadoresespecíficos 879.2. Amplificación de aislados de serotipo
AyBdeBCMV 909.3. Especificidad de los productos
de amplificación 939.4. Sensibilidad de los ensayos 96
y. DISCUSION
1. Estudio epidemiológicode BCMV 104
3’ no codificante de dos aislados de distinto
serotipo de BCMV
3. Análisis filogenético de BCMV
4. Detección de BCMV mediante transcripción
inversa y amplificación enzimática
ANEXO A LA DISCUSION
VI. RESUMEN Y CONCLUSIONES
VII. BIBLIOGRAFIA
2. Secuenciacióndel gen de la cápsiday región
107
‘lo
113
117
121
124
ANEXO 1 142
ABREVIATURAS
AzMV: “azuki bean mosaic xirus’, virus del Phaseolus radiatus.
BCMV: “bean common mosaic virus’, virus del mosaico común de la
judía.BGMV: “bean golden mosaic virus”, virus del mosaico dorado de la
judía.BICMV: “blackeye cowpeamosaic virus”, virus del mosaico de la
semilla del chícharo.BrEt: bromuro de etidio.BYMV: “bean yellow mosaic virus”, virus del mosaico amarillo de la
judía.CABMV: “cowpea aphid-bornemosaic virus’, virus del mosaico del
chícharo transmitido por áfidos.
CIAT: Centro Internacional de Agricultura Tropical.CIP: fosfatasa alcalina de ternera.CIYVV: “dover yellow vein virus”, virus del amarilleo de las venas
del trébol.CMV: “cucumber mosaic virus”, virus del mosaico del pepino.
cv: cultivarDEPC: dietil pirocarbonato.dig-UTP: desoxi-uridín trifosfato-il-digoxigenína.
dNTP: desoxi-nucleótido trifosfato.EDTA: ácido etilendiamino tetraacético.
ELISA: “enzyme-linked immunosorbentassay”.GFLV: “grapevine fanleaf virus”, virus del entrenudocorto
infeccioso de la vid.HPLC: cromatografíalíquida de alta resolución.
HPRI: inhibidor de ribonucleasasde placenta humana.M-MLV: transcriptasainversa del virus Moloney de la leucemia
murina.MDMV: “maize dwarf mosaic virus”, virus del mosaico enanizante
del maíz.MOPS: ácido 3-[N-morfolino] propano sulfónico.NCR: “non-coding region”, región no codificante.nt: nucleátido.
plv: peso/volumen.
pb: pares de bases.PCR: reacción en cadenade la polimerasa.PEG: polietilenglicol.PLRV: “potato leaf rol! virus”, virus del enrollado de la patata.
PSbMV: “pea seed-bornemosaic virus”, virus del mosaico delguisante transmitido por la semilla.
PStV: “peanul stripe virus”, virus del estriado del cacahuete.PVP: polivinil pirrolidona.PVX: “potato virus X”, virus X de la patata.
PVY: “potato virus Y”, virus Y de la patata.
PWV: “passionfruit woodinessvirus”, virus del amaderamientode lapasionaria.
RT-PCR: reacción en cadenade la poiimerasacon un paso previo detranscripción inversa.
SAPV: “South African passiflora virus”, virus de la pasionariasudafricana.
SbMV: “soybean mosaic virus”, virus del mosaico de la soja.SCMV: “sugarcanemosaic virus”, virus del mosaico de la caña de
azúcar.SDS: dodecilsulfatosódico.TGMV: “[ornato golden mosaic virus”, virus del mosaico dorado del
tomate.TN4V: “tobacco mosaic virus”, virus del mosaico del tabaco.TRV: ‘tobacco rattle virus”, virus del cascabeleodel tabaco.
TSWV: “tomato spotted wilt virus”, virus del bronceadodel tomate,TVMV: “tobacco vein mott]ing virus”, virus de] moteadode los
nervios del tabaco.u: unidad.y: volumen.WMV-2: “watermelon mosaic virus’, virus del mosaico de la sandía,
estirpe 2.ZYMV: “zucchini yellow mosaic virus”, virus del mosaico amarillo del
calabacín.
fU
1. INTRODUCCION
1. PHASEOLUS VULGARIS
Dentro del grupo de las leguminosasde consumo humano, lajudía (Phaseolus vulgaris L.) se puede considerar una de las másimportantes, debido a su amplia distribución en los cinco
continentes, y por ser un complemento nutricional indispensablecomo aporte de proteínas(alrededordel 22% de su peso seco comosemilla) en la dieta alimenticia de muchos pueblos.
El cultivo de judía es considerado de los más antiguos,habiéndoseencontrado en Perú restos arqueológicosde 8000 añosde antigUedad (Voysest, 1983). Su origen americano es aceptado
actualmente sin ninguna controversia, siendo evidencia del mismola enorme diversidad genética que presentaen dicho continente. La
diseminación al resto del mundo se produjo tras el descubrimientode América, y se ha demostrado que proviene de una plantasilvestre conocida como “frijol ratón”, que produce unas semillasgrises muy pequeñas, y que todavía crece espontáneamenteenalgunas regiones de Perú (Debouck, 1987). Actualmente se acepta
Méjico como posible centro de diversificación primaria (Debouck eHidalgo. 1987).
La superficie a nivel mundial dedicada al cultivo de judía
grano en 1990 fue de 26,4 x 106 Ha, de las cuales un 91% selocalizan en paísesen vía de desarrollo, con una producción de 16,3x 106 Tm. En cuanto a judía de verdeo, la superficie y producción
totales en 1990 fueron de 5 x 106 Ha y 3,1 x 106 Tmrespectivamente (FAO, 1990), correspondiendo el 50% de la
producción a los países desarrollados,especialmente,europeos.
11. Características generales
La judía es una planta anual, herbácea y termófila, que nosoporta las heladas. Debido a estas caraterísticas, se cultivaprincipalmente en el trópico y también en la zona templada de loshemisferios norte y sur. Es una especiediploide con 22 cromosomas,
Introducción 1
que normalmente se autopoliniza, con sólo un pequeño porcentajede polinización externa dependiendo de la población de abejasdurante la época de floración.
1.2. Descripción botánica
Desde el punto de vista taxonómico, esta especie es elprototipo del género Phaseolus,y su nombre científico fue asignadopor Linneo en 1753. Pertenecea la tribu Phaseolae,de la subfamiliaPapilionoideae y familia Leguminoseae,dentro del Orden Rosales.
Este género agrupa, aproximadamente,35 especiesde las que
sólo cuatro se cultivan, P. vulgaris L., P. lunatus L., P. coccineusL. yP. acutifolius A. Gray var. latifolius Freenman, y de éstas, la más
importante y parece que la más evolucionada,es P. vulgaris L.Muchas de las restantes especies son silvestres y han sido
recolectadas y mantenidas en bancos de germoplasma por suinterés como posibles fuentes de resistencia a plagas y
enfermedades.
1.3. Píántula
En orden ascendente,el primer nudo es el de los cotiledones,
en dos inserciones opuestas. El hipocótilo (primera parte del tallocomprendidaentre la inserción de las raíces y el primer nudo) tieneuna longitud apreciable porque la judía es de germinación epigea.Los cotiledones permanecenadheridos al tallo durante las primeras
etapas de desarrollo, cayendo después de unas dos semanas. Elsiguiente nudo es el de las hojas primarias, que son unifoliadas y
opuestas. Entre el nudo de los cotiledones y el de las hojasprimarias se encuentraun entrenudoreal llamado epicótilo. Los dosprimeros nudos, el de los cotiledones y el de las hojas primarias sonformados durante la embriogénesis,por lo que existen ya en la
semilla. En el tallo, a nivel de cada nudo se encuentran los demásórganos, como las hojas trifoliadas, las ramas, las vainas, los racimosy las flores y una estípula (figura 1).
La flor es una típica flor papillonácea, y su morfología
favorece el mecanismo de autopolinización: las anteras están al
Introducción 2
Hojas prima‘tas
Figura 1. Plántula de judía. (Tomado de “Frijol: Investigación yProducción” CIAT, 1985).
Hojasprimarias
Cotiledón
Hipocótilo
Radícula
Hilum
Figura 2. Composición interna de la semilla de judía. (Tomado de
Primera hola
tr¡f ofiada
ler nudo
Est~p~i8
R a ces
Hipocót,Io
Plúmula
Rafe
‘Frijol: Investigación y Producción” CIAT, 1985).
mismo nivel que el estigma, y ambos órganos están envueltoscompletamentepor la quilla. Cuando se produce la dehiscenciaenlas anteras (antesis) el polen cae directamente sobre el estigma.(Debouck e Hidalgo, 1985).
1.4. Semilla
La semilla de judía es exalbuminosa,y sus reservasnutritivas
se concentran en los cotiledones. Se origina de un óvulocampilÑropo, dispuesto transversalmenterespecto al funículo.
Las partes externas principales de la semilla son: O la testao
cubierta seminal, que correspondea la capa secundinadel óvulo; u)el hilum, que conecta la semilla con la placenta, y es la cicatrizdejada por el funículo; iii) el micrópilo, que es una hendidura en la
corteza, cerca del hilum, a través de la cual se realizaprincipalmente la absorción de agua, y, iv) el rafe, que procede dela soldadura del funículo con los tegumentosexternos del óvulocampilótropo.
Internamente La semilla está compuestaexclusivamentepor el
embrion, que, a su vez está formado por la plúmula, las dos hojasprimarias, el hipocótilo, los dos cotiledonesy la radícula. El complejoplúmula-radícula está situado entre los cotiledones, en la parteventral del grano de maneraque la radícula está en contacto con el
micropilo. (Debouck e Hidalgo, 1985) (figura 2).
1.5. Variabilidad
El polimorfismo en judía es enorme. La semilla tiene una
amplia variación de forma (cilíndrica, esférica, arriñonada, etc.), decolor (blanco, rojo, negro, amarillo, café, etc.) y de brillo. La
combinación de colores también es muy frecuente. Esta granvariabilidad de los caracteresexternos de la semilla se tiene en
cuenta para la clasificación de variedadescomo consecuenciade lagran diversidad genética existente en esta especie.
Las variedadesde judía se clasifican según diversos criterios.Si se considera el tipo de consumo, existen variedades para
consumo como grano seco (alubia), y como vaina (judía verde).
Introducción 4
Desde un punto de vista agronómico, se habla de variedadesprecoces y tardías, según la duración del período vegetativo. Lareacción a ciertos factores limitantes de la producción. tantoabióticos (heladas, estrés hídrico, etc.) como bióticos (plagas yenfermedades),divide a las variedades en al menos dos grandes
categorías, resistentes y susceptibles. Una de las característicasagronómicasmás importantes para clasificar variedadeses el hábitode crecimiento, determinado(variedadesenanas en las que cesa elcrecimiento con la floración) o indeterminado (variedades concrecimiento continuo).
2. PROBLEMATICA ACTUAL DEL CULTIVO EN ESPAÑA
En Españaactualmente,la judía es la leguminosade grano de
mayor producción y valor de cosecha. Durante 1988 la superficiededicada al cultivo de la judía grano fue de 95169 Ha, y laproducción de 61212 Tm (MAPA, 1988), concentradaen el noroestede España, siendo León (15952 Tm), La Coruña (12064 Tm) yPontevedra (6244 Tm) las provincias de mayor producción. El
cultivo se extiende además por la mayor parte de las zonasagrícolas del país, con un interés preferentemente local. Sin
embargo, la superficie de cultivo en las últimas décadas hadescendido notablemente junto con la producción, aunque elrendimiento ha experimentado un pequeño ascenso, todavíainsuficiente para rentabilizar su explotación (Asensio et al., 1990).
La judía verde es e] cultivo más importante entre lasleguminosashortícolas, y supone en la actualidad una superficie de
27.000 Ha y una producción de 258.000 Tm (M.A.P.A., 1988), de lasque 28.000 Tm se destinaii a la industria, estandoprincipalmente elcultivo protegido bajo invernadero. Las principales zonasproductoras se encuentran en Andalucía Oriental, ComunidadValenciana y Cataluña.
[ntrc’di4ccíón5
2.1. Ausencia de variedades comerciales
En España, en cada región, provincia, e incluso en cada
término, se pueden encontrar diversas “variedades”, muchas deellas parecidas, mezcladas la mayoría, y sin garantía alguna depureza.
La primera limitación técnica para su producción viene dadapor la falta de variedades comerciales, ya que el Registro deVariedades Comercialesde judía seca en el Instituto Nacional de
Semillas y Plantas de Vivero no se abrió hasta 1986, lo que implica
la ausencia de semilla con las características adecuadasparaasegurar una producción de calidad. La selección del grano serealiza por caracteresfenotípicos (color, tamaño, forma), que noaseguran la homogeneidad genética, haciéndose necesaria la
tipificación de las “variedades” en uso mediante descripción varietalde caracteresbotánicos, agronómicos,etc.
Actualmente la semilla que utilizan los agricultores procede,en su mayoría, del autoconsumo, del intercambio con otros
agricultores de la zona o de otras zonas tradicionalmenteproductoras,o bien de los envasadoresde judía. En el caso de la
judía verde, la mayor parte del material vegetal utilizado esextranjero, y en las zonas de cultivo intensivo se aprecia un clarodesplazamientode los cultivares tradicionales como Garrafal Oro
por otros mas productivos (Maroto, 1991).
2.2. Enfermedades
Una de las grandes limitaciones que tiene el cultivo de judía,no sólo en España, sino en todo el mundo, es la gran cantidad deenfermedadesy plagas a las que se muestra susceptible. Se hanestimado en un 10% las pérdidas a nivel mundial en la cosechadebidas a enfermedades(Hall, 1991). Se han descrito cientos deagentes causantesde enfermedad en judía, pero no todos tienenuna distribución geográfica, prevalencia o importancia económica
equivalente. Las enfermedadesmás importantes son las causadaspor hongos, bacterias y virus.
Introducción 6
En Españano se ha realizado de forma sistemáticaun estudiodel espectro fitopatológico de los cultivos. En el caso de las
infecciones virajes que afectan a leguminosas,sólo se encontró unareferenciade Vela (1971), haciendo mención a un aislado del virusdel mosaico amarillo de la judía (BYMV), procedentede Málaga.
3. LOS VIRUS VEGETALES
Entre los agentes causantesde enfermedad en plantas, seconsidera a los virus los segundosen importancia, después de loshongos, como responsablesde pérdidas económicas en los cultivosagrícolas.
La primera cita acerca de virus asociadosa plantas data de1886, y supuso el descubrimiento de una nueva forma de vida,cuando Mayer describió la enfermedaddel mosaico del tabaco, queera transmitida mediante inoculación de extractos de plantas
enfermas. Actualmente, se conocen unos 700 virus vegetales, lamayoría de los cuales tienen un genoma constituido por RNA decadena sencilla y sentido positivo (77%), aunque también puede serRNA de sentido negativo (13%), de doble cadena(4%), o bien DNA
monocatenario(4%) o bicatenario(2%) (Zaitlin y HuJí, 1987).
La partícula viral consta del ácido nucleico y de una cápsida,compuesta generalmente de una sola especie proteica. Algunosvirus más complejos presentan además una envuelta lipoproteica
externa a la cápsida.
En cuanto a tamaño y forma de las partículas virales, existeuna gran variabilidad, que queda reflejada en la figura 3(Matthews, 1991). Actualmente hay definidos 35 grupos de virusde plantas, establecidos por el ICTV (International Committe on
Taxonomy of Viruses), (Brown, 1989). Entre los productos deexpresión de los genomas virales hay proteínas estructurales,comola proteína de la cápsida, y no estructurales, como proteasas,
replicasas (RNA polimerasas RNA dependientes), helicasas, yproteínasimplicadas en el movimiento y en la transmisión.
La primera limitación para un virus cuyo genoma ha deexpresarseen un sistema de traducción eucariota, es la adaptacióna
Introducción 7
TOGRAVIRUS
TOQAJvCVIRUS
npo~
k-CRD4EWflUS
POTEXVIRUS
RSA-n,c ~+> sin envuelta
oLUTEOVAUSVYLC VIRUSTOM3USVRUSS~hOV RUSNsmgrlJSCAaCVRUSMARAFNIRUSPa¡sriip VotIow Rock Vstus
00~e~CWbJsFAJ3AVIRUSNrpa~’nJSPca Enalion Masaje VirusDLAHTHCVIRUS
000CUcU?nVlnUSBFC*.CVflUSILAJ3VIRUS
DNA-kw ~.ínt ItN A.j~
o oCAULILCVIRUS GrMJNTVIRUS REOVIRIOAE CPVPTOVIFbJS
CARL&VIRUS
CAPlitO y IRUS
POTNV RUS
con envueltaRNA nl’ ./
)
oTorralo SpoIlod WdI Virus
Figura 3. Característicasgenerales de los principales grupos de
Maiz, Chlorotic Dwarl Viaia
Alfalfa Mosaic Virus
RNA-mc
o~ADOOVlRtDAE
1 COn,,,
virus vegetales (Matthews, 1991).
la expresión de RNAs mensajerosmonocistrónicos, lo que supondríapara el virus la traducción de exclusivamentelas fases de lecturaabiertas Copen reading frames”, ORFs) situadasen el extremo 5’ del
genoma. Los virus han adoptado distintas estrategias,esquematizadasen la figura 4, para asegurar la expresión de todos
sus genes (Matthews, 1991):
1. Síntesis de RNAs subgenómicos,que permite la traducciónde la ORE de su extremo 5’.
2. Genomas multipartitos. Se traduce el gen situado en elextremo 5’ de cada segmentode RNA.
3. Poliproteinas. Un RNA codifica para más de una proteína,incluso para todos los productos genómicos a través de una única
ORE. que es traducida y procesada posteriormente en puntosespecíficos por proteasascodificadas por el virus, para rendir los
productos finales.4. Codonesde terminación del gen en el extremo 5’ que en una
determinada proporción permiten a los ribosomas continuar latraducción hasta el siguiente codón de terminación, rindiendo unsegundo polipéptido de mayor tamaño.
5. Un cambio en la fase de lectura cerca del codón determinación del gen en el extremo 5’ permite la síntesis de unasegunda proteína mayor, parcialmente solapada a la primera.
La interacción virus-planta comienza con la penetración del
virus en la célula vegetal, a través de la barrera que supone la
presenciade la pared celular, para lo cual el virus se sirve de otrosorganismos, generalmente insectos o nernátodos, que producenlesiones en los tejidos vegetales como consecuenciade sus hábitos
alimenticios, y los introducen en las células. La transmisión porvectores invertebradoses, en general, un fenómenocomplejo en el
que juegan un papel el virus, el vector, la planta, y las condicionesambientales. Algunos virus son transmitidos también a través del
polen y/o de la semilla.En cuanto a la reacción de la planta ante la infección viral,
existen varios tipos de respuesta(Zaitlin y Hulí, 1987), (Dawson yHilL 1992>: i) la inmunidad total, en la que el virus no se replica enabsoluto, ni siquiera en las células de entrada; u) infecciónsubliminal, en la que el virus se replica sólo en las células
Introducción 9
1. RNAs subgenómicos
RNAgenómico 5•
4¡ ORFa
RNAsubgcriémico s~ OJ1F2
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2. Genoma dividido en varios segmentos
RNA 1genómico 5• ORF i
1RNA2genómico 5’ ORF2
3. Poliproteina 5. ORFI
RNAgenónijeo
Prí’cc.v,n,kni,, prwcoI(tico poslrnduccional
4. Presencia de un codon de terminación interior en ORF1 que puedeser leído o no
RNAgenómico 5’
ORN ORF2
16. Genes solapadosen fasesde lectura distintas.
RNAgenómico 5’
ALiO mA
1 ORN 1
RF1
Figura 4. Estrategias utilizadas por los virus vegetales para lasíntesis de sus proteínas en un sistema de traducción eucariótico.
inicialmente infectadas, pero no se dispersa; iii) respuesta
hipersensible. en la que la susceptibilidad limitada del huéspedrestringe al virus a unas pocas células próximas al punto deinfección, dando lugar a lesiones localizadas, generalmentenecróticas; esta respuestapuede manifestarse de forma sistémica,
produciendo necrosis vascular; iv) susceptibilidad total, en la que elvirus invade toda la planta; se habla entonces de infecciónsistémica.
La replicación del virus puede afectar a la planta huésped,aunque no parece ser la principal causa de la sintomatologíaviral.Se conoce que una de las principales consecuenciases un efecto de
supresiónde la síntesisde RNA ribosómico y de proteínasa nivel decloroplastos (Hirai y Wildman, 1969), (Mohamed y Randíes, 1972).
La sintomatologíaviral es muy variada, y ha sido revisada porBos (1970) y Goodman et al.. (1986). Entre las alteraciones máscomunes se encuentran las de color de hojas, tales como mosaico,clorosis, bandeo de venas, o las deformaciones foliares, enaciones
(abullonamientos),así como una apariencia de mal estado general,
enanismo y decaimiento.Los nombres de los virus vegetales, generalmente, hacen
referencia a los síntomas producidos en el huésped donde sedescribió por primera vez la enfermedad.
4. ENFERMEDADES VIRALES EN JUDíA
Las pérdidas en el cultivo de judía debidas a infeccionesvirales fueron descritas ya en 1917 por Stewart y Reddick, y se
conocen al menos 34 virus distintos capaces de infectar judía deforma natural (Lana a al., 1988).
Entre las enfermedadesde origen viral más importantes anivel mundial destacantres: el mosaico común, el mosaico amarillo,
y el mosaico dorado de la judía.Las dos primeras son producidas por virus pertenecientesal
grupo de los potyvirus: virus del mosaico común de la judía (BCMV)y virus del mosaico amarillo de la judía (BYMV) respectivamente.
La tercera es debida a la infección por un virus del grupo de los
Introducción 11
geminivirus, el virus del mosaico dorado de la judía (BGMV), y estámuy extendida en las zonas tropicales y subtropicales de America,Africa y Asia, no habiendo sido descrita en España hasta la
actualidad.
4.1. Potyvirus
4.1.1. Características generales
Este grupo de virus vegetales debe su nombre al miembrotipo. “potato virus Y” (virus Y de la patata, PVY), y es el primero enimportancia numérica, ya que comprendecasi al 40% de los virus
de plantas, y económica, pues las pérdidas de cosecha atribuidas apotyvirus son muy importantes en todo el mundo (Hollings y Brunt,1981; Milne. 1988). Edwarson (1974) describió que eran capacesdeinfectar 1112 especiesde 369 géneros entre 53 familias de plantas.
El grupo de los potyvirus fue uno de los seis grupos de virusvegetales inicialmente establecidossegún la forma y dimensionesde las partículas (Brandes y Wetter, 1959), y contenía 16 virus
interrelacionados serológicamente,con partículas filamentosas de
unos 750 nm. Durante las tres décadas transcurridas desde elestablecimiento del grupo, el número de miembros ha idoaumentandoprogresivamente,aunque el tamaño actual es incierto,ya que nuevos miembros son descritos frecuentemente; otros,
tradicionalmente consideradoscomo virus distintos son reconocidoscomo cepas del mismo virus, o a la inversa, y la clasificación de
algunos virus está siendo muy debatida.En 1991 el total de miembros ascendía a 157, entre posibles
(72) y definitivos (73) (Francki eí al., 1991).
Sus miembros comparten característicascomunes: son virusde partícula única, alargada y flexuosa, de unos 680-900 nm consimetría helicoidal y cuyas partículas contienen aproximadamenteun 5% de ácido nucleico y un 95% de proteína. El ácido nucleico,
generalmente,es una única molécula de RNA de cadena sencilla ysentido positivo de unas 10 Kb. La cápsida viral está formada pormás de 2000 subunidadesde una única proteína de peso molecular
32-36xío~ Da.
Introducción 12
Se transmiten en la naturaleza generalmente mediante áfidosde manera no persistente(Murant u aL, 1988), algunos de ellos porácaros, mosca blanca u hongos (Barnett, 1993), y
experimentalmente por inoculación mecánica de savia. Algunos
potyvirus, especialmente los que infectan leguminosas, sontransmitidos en proporción variable por semilla.
En su mayoría tienen una gama de huéspedesrestringida; estaespecificidad de huéspedevita la competencia interespecíficaentre
potyvirus, y ha generado un elevado número de variantesespecializadas,difíciles de distinguir bioquímica o serológicamente,pero que existen como patotipos reconocibles.
Una de las principales características del grupo es la
formación de cuerpos de inclusión citoplásmicos (“pinwheels” oinclusiones cilíndricas) en las plantas infectadas. Estas formacionesaparecena las 48 h posteriores a la infección y tienen un aspecto
característico cuando se observan al microscopio óptico oelectrónico, habiéndoseestablecido cuatro subdivisiones en relaciónal tipo de inclusiones inducidas (Christie y Edwardson, 1977;Edwardson y Christie, 1984; Edwardson, 1992). La infección poralgunos potyvirus induce la formación de otros tipos de cuerpos de
inclusión, como inclusiones nucleares y/o inclusiones citoplásmicasamorfas (Dougherty u al.. 1988).
4.1.2. Organización y expresión del genoma
El genoma potyviral es una única molécula de RNA de cadenasencilla de unos 10000 nucledtidos y sentido mensajero, cuyoextremo 5’ está unido covalentementea una proteína (VPg, “viral
genome-linked protein”) (Siaw u al., 1985) y su extremo 3’ está
poliadenilado (Han a aL, 1979). Contiene una única fase de lecturaabierta que se traduce como una poliproteina (entre 340 y 368KDa), que es procesadamediante la actividad de tres proteasas
virales. La estructura genómica y la dinámica de procesamientosemuestranen la figura 5.
Los diferentes productos génicos obtenidos tras el
procesamientode la poliproteina potyviral son, desde el extremo Nal C-terminal los siguientes: la proteína Pl (proteasa), el
Introducción 1 3
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Figura 5. Representaciónesquemática del procesamiento de lapoliproteina potyviral (Riechmann cf al.,1992). Pro: proteasa;helicasa; Rep: replicasa. En la parte superior se muestra un mapa
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componente helper”/proteasa(NC-Pro), la proteína P3. un péptidode 6KDa (6K1). la proteína del cuerpo de inclusión citoplásmico (CI,
con actividad helicasa>. un segundo péptido de 6KDa (6K2), laproteína de inclusión nuclear “a’ (Nia, VPg y proteasal. la proteínade inclusión nuclear “b (NIb, la presunta RNA polimerasa), y laproteína de la cápsida. Las funciones demostradaso hipotéticas deestos productos génicos se resumeen la tabla 1.
El procesamiento co- y post-traduccional de la poliproteinaestá mediado por dos proteasascodificadas por el virus. Nía (García
u al., 1989) y HC-Pro (Carrington et al. 1989), y, recientementeseha identificado una tercera actividad proteolítica requerida para el
procesamientocompleto. que reside en la proteína PI (Verchot et
al., 1991>.
La proteasa Nia es responsablede los cortes en las dosterceraspartes del extremo C-terminal de la poliproteina (sitios A-Fy y), mientras que NC-Pro y Pl actúan sobre sus extremos C-terminales respectivamente(Riechmann et al., 1992).
La maduración proteolítica mediada por NIa es un proceso
regulado que implica cortes en cts (intramolecularmente, la
proteasase autoescindepor cortes en los sitios D y E (figura 5) enun suceso temprano, quizá cotraduccional), y en ira ns,intermolecularmente,en sitios que son reconocidos y cortados condiferentes eficiencias. Los sitios A-F están definidos por secuencias
de siete aminoácidos(Dougherty y Parks, 1989; García ci al., 1989).El sitio A es probablemente un punto de corte subóptimo, sólo
parcialmente procesado. El sitio y difiere considerablementeen
secuenciade los otros seis sitios de corte, y parece ser un sitiosubóptimo de corte con implicación en el proceso de replicaciónviral <Dougherty y Parks. 1991>.
4.1.3. Taxonomía de potyvirus
La identificación y clasificación de potyvirus ha sido
tradicionalmente problemática e insatisfactoria, debido al gran
tamaño del grupo, la enorme variación existente entre susmiembros y la falta de parámetros taxonómicos satisfactorios paradistinguir entre virus distintos y cepas del mismo virus. En el
Introducción 1 6
pasado, el uso de criterios clásicos como gama de huéspedes,sintomatología, protección cruzada, morfología de las inclusionescitoplásmicas y serología, permitió la distinción entre potyvirus.Actualmente, la imposibilidad de compatibilizar todos estos criteriosha llevado al grupo a una situación de caos taxonómico (Bos, 1992)
en el que la aplicación de parámetros moleculares está abriendonuevas y sólidas posibilidadesde clasificación.
4.1.3.1. Parámetros clásicos
La sintomatología y la gama de huéspedestodavía hoy juegan
un importante papel en la clasificación de potyvirus, siendo loscriterios principales para el reconocimientode cepas. Dado que lamayoría de los potyvirus tienen una gama de huéspedesrestringida, pueden ser a menudo distinguidos en función de lossíntomas característicosque producen en ciertos huéspedes.Sin
embargo.el apoyo en estos criterios ha creado mucha confusión en
la identificación de potyvirus que infectan leguminosas(Lana et al.,1988; Tsuchizaki y Omura, 1987) y gramíneas(Shukla, et al., 1989),ya que distintos virus producen síntomas similares en los mismoshuéspedes dependiendo de las condiciones climáticas, y que
distintos cultivares o líneas genéticas de la misma especie vegetalpueden tener distintas reaccionesen cuanto a la susceptibilidad a lainfección y síntomas.
En general, se acepta que entre cepasdel mismo virus existe
un fenómeno de protección cruzada, es decir, la infección por unacepa previene de la infección por otras cepas relacionadas,mientrasque este fenómeno no se produce entre virus distintos. Este tipo deanálisis tuvo bastantepeso inicialmente para discernir entre cepasrelacionadaso no, en éste y en otros grupos de virus, pero, en elcaso de los potyvirus, posteriormente surgió el conflicto sobre elvalor de estos datos cuando no existía correlación con otros
parámetrostaxonómicos. De hecho, existen fenómenosde protección
cruzadaentre virus distintos, como BCMV y BYMV (Quaniz. 1961), ycasos donde falla la protección cruzada entre cepas estrechamenterelacionadasde otros virus (Wilkins y Catherall, 1974).
Introducción 1 7
La morfología de los cuerpos de inclusión citoplásmicos
(‘pinwheels’) puede ayudar en la identificación de algunospotyvirus. En base a ello, Edwardson (1974) dividió a los potyvirusen cuatro subgrupos: los virus del subgrupo 1 producen inclusionestubulares y en roseta (“scrolls”); las del subgrupo II son agregadoslaminares; los virus del subgrupo III producen inclusiones en rosetay agregadoslaminares, y los del IV rosetas y agregadoslaminarescurvos. Ya que en ocasionesdistintas cepas del mismo virus caen en
distintos subgrupos, y virus distintos producen exactamente el
mismo tipo de inclusiones, este criterio ha sido también muydiscutido (Francki ci’ al., 1985), aunque para algunos potyvirus estáen perfecta correlación con su clasificación taxonómica.
Las relaciones serológicas entre potyvirus sonextremadamentecomplejas, y a menudo no correlacionan con laspropiedades biológicas. Los principales problemas asociados a la
serología de potyvirus son tres: las reacciones cruzadas entreantisueros, relaciones inconsistentese inesperadasentre distintos
potyvirus, y la falta de reaccionescruzadas entre cepas (Shukla etal., 1992). Estas dificultades parecen no estar asociadas a lastécnicas serológicas,sino a la complejidad estructural de la proteínade la cápsida y de la partícula potyviral.
Shukla cf al. (1988b) demostraron que la mayoría de losepítopos específicos de virus mapeanen el extremo N-terminal dela proteína de la cápsida (30-69 aminoácidos), que, junto con el
extremo C-terminal son las regiones de la proteína mas expuestasen la superficie de las partículas virales, mientras que los epítopos
específicos de grupo se encuentran en el núcleo central de laproteína (“core”) (216-218 aminoácidos). Los epítopos másexpuestos son, por tanto los más susceptiblesa degradaciónen losprocesos de purificación de virus, por lo que hay que extremar lasprecaucionesen las preparacionespara inmunización.
La tecnología de los anticuerposmonoclonales ha supuestoungran avance al delimitar la especificidad en las reacciones
serológicas.Se han generadoasí anticuerposque sólo reconocen losvirus homólogos y sus cepas, y otros que reaccionan con dos, tres,cuatro, y hasta con la mayoría de los potyvirus (Jordan y Hammond,1991).
Jntroducci¿n 1 8
Los datos serológícos requieren, por tanto, una interpretaciónminuciosa para no incurrir en errores al trazar relaciones entrepotyvirus.
4.1.3.2. Parámetros moleculares
La aplicación de nuevas técnicas de biología molecular haproporcionado criterios más objetivos para la identificación yclasificación de potyvirus, frente a consideraciones meramentebiológicas y fenotípicas. Entre ellas, destacan dos: los perfiles decromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y la secuenciaciónde ácidos nucleicos.
El establecimientoy comparación de perfiles de los péptidos
derivados de la digestión de la proteína de la cápsida con tripsina (uotra proteasa)ha sido de gran utilidad para asignar diferencias yparentescosentre un buen número de cepas y aislados de muchos
potyvirus (Mckern ct aL, 1989, 1990). El grado de similitudexistente entre estos perfiles es una indicación fiable de su relacióna nivel de secuencia(Shukla eit aL, 1988a). Actualmente, está siendoaplicado a potyvirus que infectan leguminosas (McKern u al.,
1992).
La secuenciaciónde genomas potyvirales ha confirmado quesus miembros comparten una organización genómica común, y quelas distancias genéticas existentes entre sus proteínas de la cápsida
están de acuerdo con propiedades observadas previamente(protección cruzada, relaciones serológicas), pudiéndose diferenciar
de forma bastanteclara potyvirus y sus cepas.Shukla y Ward (1988). comparando las secuencias de
aminoácidos de las proteínas de la cápsida de 17 cepas de 8potyvirus distintos, observaron que la homología de secuencia se
ajustaba a una distribución bimodal, en la que distintos potyvirusmostraban una homología de secuencia comprendida entre el 38-.71%, con la mayor variabilidad en la longitud y secuenciade susextremos N-terminales, y alta homología en la mitad C—terminal dela proteína, y cepasdistintas del mismo potyvirus presentanun 90-
99% de homología, con extremos N-termina]es muy similares. Estosresultados, así como estudios posteriores (Ward y Shukla, 1991;
Jntroducciún 1 9
Ward er al.. 1992) mostraron que la homología de secuencia deaminoácidos de la proteína de la cápsida puede servir como una
base sólida para la identificación y clasificación de potyvirus.La filogenia de la proteína de la cápsida y su aplicación en la
taxonomía de los potyvirus ha sido recientementeanalizada porRybicki y Shukla (1992).
Otra zona del genoma potyviral que ha sido consideradaparaestablecerrelaciones taxonómicases la región 3’ no codificante (3’NCR>; Frenkel ej al., (1989) comparando las secuenciasde 13 cepasde 7 potyvirus observaronque existía una homología del 83-99%
entre cepas y de un 39-53% entre virus distintos a nivel de sus 3’NCRs. Esta región ha sido utilizada como sonda en experimentosdehibridación para la diferenciación de cepas (Frenkel ci’ al., 1991), yse han establecido subgrupos por la presencia de secuencias
consenso(liveda, 1992>. Sin embargo, se ha consideradoesta regiónde escasa utilidad para revelar parentescos entre potyvirusdistintos (Frenkel et aL, 1991; Rybicki y Shukla, 1992).
5. EL VIRUS DEL MOSAICO COMUN DE LA JUDíA (BCMV)
5.1. Propiedades biológicas
El mosaico común de la judía fue descrito por primera vezcomo enfermedad viral por Stewart y Reddick (1917) en Estados
Unidos, y al agentecausal se le denominó virus del mosaico de lajudía. El epíteto “común” fue añadido más tarde para diferenciarlodel virus dei mosaico amarillo de la judía (BYMV).
La distribución del virus abarca los cinco continentes, y esconsiderado como uno de los patógenosmás comunes e importanteseconómicamentede judía, habiéndosecitado como el segundo enimportancia económica en cultivos hortícolas de climas templados,en Italia y Portugal, el tercero en Suecia y el cuarto en China(Tomlinson. 1987). Las pérdidas económicasse deben a la reducción
del rendimiento (hasta de un 80%) y a la baja calidad del productocosechado.
Introducción 20
Su gama de huéspedes es limitada. En la naturaleza seencuentra principalmente en especies del género Phaseolus, sobretodo P. vulgaris, y, ocasionalmente,en Lupinus luteus y enleguminosas silvestres como Rhynchosia minirna. Se mencionan
también en la literatura otros huéspedes experimentales,incluyendo algunas no leguminosas(Morales y Bos, 1988).
La naturaleza y gravedad de los síntomas producidosdependen de la cepa del virus, del genotipo del huésped, delmomento de infección, y de las condiciones ambientales. En judía
puede producir principalmente dos tipos de síntomas (figura 6): elmosaico común, acompañadogeneralmente de deformación foliar,enrollamiento y abullonamientode hojas y bandeo de venas, y la
necrosis sistémicao “raíz negra”, que es el resultadode una reacciónde hipersensibilidad con la que los cultivares con el tipo deresistencia dominante (gen !), derivada inicialmente del cv CorbettRefugee (Zaumeyer, 1969), responden a la infección por algunascepasdel virus. La necrosis sistémica se caracterizapor el deteriororápido del sistema vascular de las hojas trifoliadas más jóvenes,extendiéndose luego al sistema vascular de toda la planta,
produciendo generalmentela muerte cuando la necrosis alcanza el
ápice.Como miembro del grupo de los potyvirus, BCMV es
transmitido por áfidos de forma no persistente.Entre las especiestransmisorasdel virus destacanAcyrthosiphon pisum,Aphis fabaey Myzus pei-sicae. Se transmite además por polen, por inoculación
mecánica, y. en un elevado porcentajepor semilla, lo que constituye
una de sus principales características epidemiológicas, siendoprobablemente un factor primordial en la infección inicial delcultivo y en su amplia distribución geográfica.
El porcentaje de transmisión por semilla varía en función delgenotipo de judía y de la cepa del virus (Morales y Castaño, 1987),siendo en algunos casos superior al 83% (Morales y Bos, 1988). Elporcentaje de semilla infectada en la mayoría de los cultivares
analizadosen el CIAT, Colombia (Morales, 1983) oscila entre el 15 yel 50%. Se ha descrito su permanenciaen semilla durante períodosde almacenamientode más de 30 años (Pierce y Hungerford, 1929).
fntrodi¿cci¿n 2 1
La distribución del antígeno viral en la semilla es errática, nosiendo clara la relación entre antígeno detectable en semilla e
infección de la plántula resultante (Wang e; al., 1985). El antígenoes detectable en testa, cotiledones y embrión, pudiendo estarpresente sólo en una de las tres partes, en dos o en todas. Lainfección exclusivamente del eje primario no ha sido observadahasta ahora en otro sistema virus-huésped(Klein a al., 1992). Lacapacidad de transmisión al embrión parece residir en la habilidaddel virus para invadir tejido embrionario, penetrando en los
gametos en fases tempranas del desarrollo (Rubies-Autonelí yFaccioli, 1985>.
5.2. Fuentes de resistencia a BCMV
La resistencia a BCMV en Phaseolus vulgaris estádeterminada,por: i) el gen 1, inespecífico de cepa, que determina larespuestade necrosis sistémica a ciertas cepas del virus; u) unsistema de resistenciarecesivo, que ha sido calificado como uno de
los más complejos elucidados para interacciones virus-planta
(Fraser, 1986 y 1990), en el que la resistencia, medida comoinhibición de síntomasde mosaico, depende de la cooperaciónde ungen, ti--u, con uno o más genes de un grupo denominadobc-x. Losgenes bc-x se localizan en tres loci, denominadosbc-J, bc-2, y bc-3,
existiendo series alélicas en los lod be-] y bc-2.
El gen be-u es inespecífico de cepa y sólo es efectivo encombinación con uno de los genes bc-x, siendo necesario para la
total expresión de estos últimos, excepto en los cultivares de
genotipo II.Según la teoría de Person (1959) de una relación huésped—
parásito “gen a gen”, se han definido cuatro genes de patogenicidado virulencia, de modo que un gen de resistencia en el huéspedconfiere resistencia a todas las cepas que carecen del gencorrespondientede patogenicidad(tabla 2). Hasta ahora no se ha
encontradoun gen de virulencia correspondientea bc-3.
Introducción 23
5.3. Clasificación de cepas de BCMV
La clasificación de cepasde BCMV se establecióen función desu patogenicidad sobre II grupos de cultivares de judía condistintos genotipos de resistencia (Drijfhout, 1978), y se handefinido 10 cepas distintas, cuyas interacciones con los cultivaresdiferenciales se muestranen la tabla 2.
Según los síntomas producidos en dichos cultivares de judía,las cepas de BCMV se dividen en tres grupos: i) cepas que inducenmosaico y nunca necrosis:NLI/USl, NL7, US5 (Fía), US2 (NY15), y
NL4/US6: ib cepas que inducen necrosis sistémica en algunoscultivares de genotipo II dependiendo de la temperatura (cepasnecróticas dependientesde temperatura): NL2 y NL6/US3/U54; iii)cepas que inducen necrosis sistémica a cualquier temperatura enlos genotipos JI susceptiblesa la cepa en cuestión (cepas necróticas
independientesde temperatura): NL3, NL5 y NL8. Algunos autores(Mink y Silbernagel, 1992) consideran al aislado tanzano TN-1(Silbernagel el al., 1986), que induce síntomas muy similares a NL5
en los cultivares indicadores, como una cepa más de este tercergrupo.
5.4. Serología
Las cepas de BCMV pueden dividirse en dos grupos
serológicos distintos (Wang, 1983): el serotipo A, que incluye a lascepas NL3, NL5 y NL8, es decir, las cepas necróticas independientesde temperatura. y el serotipo B, que engloba al resto de las cepas(no necróticas y necróticas dependientes de temperatura). Los
miembros de cada serotipo presentan estrechas relacionesserológicas entre ellos, y ninguna o muy distante con los miembros
del otro serotipo.
Se han descrito relaciones serológicas entre BCMV y otros 17potyvirus (Morales, 1988); muchas de estas relaciones son distantesy no correlacionan con las propiedadesbiológicas. Un parentescoserológico más relevante existe entre BCMV y otros potyvirus queinfectan leguminosas,como BYMV, el virus del mosaico de la semilladel chícharo (BICMV), el virus del mosaico de la soja (SbMV), el
Introducción 24
virus del mosaico del chícharo transmitido por áfidos (CABMV), elvirus del mosaico del Phaseolus radiatus (AzMV), y el virus del
estriado del cacahuete(PStV). El virus del mosaico de la sandía,
estirpe 2 (WMV-2), pese a tener una gama de huéspedesmuydistinta a BCMV. está serológicamente relacionado con muchas
cepas del virus. Se han descrito también relaciones entre ciertosaislados potyvirales de leguminosasbrasileños,BCMV y el virus delamaderamientode la pasionaria(PWV) (Lovisolo y Kitajima, 1992>.
Recientemente,Mink y Silbernagel (1992) han realizado unestudio serológicocomparando18 aislados de BCMV, 5 de BJCMV, 4
de CABMV, uno de AzMV y uno de PStV medianteELISA indirectocon una batería de 13 anticuerpos monoclonales distintosproducidos contra BCMV, BICMV, CABMV y PStV.
Sorprendentemente,4 de los monoclonales detectaban todos losaislados virales, uno detectaba todos excepto los de CABMV, 3resultaron específicosde los aislados de serotipo A de BCMV. y 4detectabantodos los aislados de serotipo B más todos los de BICMV,
AzMV y PStV, no siendo ninguno de los 4 monoclonalescapaz de
reaccionar individualmente de forma diferencial entre ellos.Los aislados del serotipo A parecen tener, por tanto, una
entidad serológica muy diferenciada, mientras que los del serotipoB presentan múltiples reacciones cruzadas con otros aisladospotyvirales relacionados,siendo precisa su diferenciación medianteensayos biológicos.
5.5. Situación taxonómica actual dentro del grupo de lospotyvirus
Estudios recientes han revelado una gran complejidad en lasrelaciones entre las cepas de BCMV y otros potyvirus deleguminosas. Vetten et al. (1992), comparando las secuenciasaminoacídicasde las proteínasde la cápsida de dos aislados de lascepas NL4 y NL8, de distinto serotipo de BCMV, encontraron unahomología del 78%, y de un 62% a nivel de nucleótido entre sus 3’
NCRs. Estos valores, intermedios entre los propuestos para la
clasificación como cepas o como virus distintos, fueron suficientes
Introducción 26
para proponer la consideraciónde los dos serotipos como dos virus
distintos.Dijkstra y Khan (1992), comparando3 cepasde BCMV (NLl,
NYI5 y NL3). 4 de BICMV y un aislado de CABMV en base a su
gama de huéspedes,propiedades antigénicas y perfiles de HPLCobservaronuna semejanzaimportante entre las cepas de serotipo Ede BCMV y 3 de BICMV, mientrasque NL3, una cepa de BíCMV y elaislado de CABMV mostraban una entidad propia, pudiendo serconsiderados como tres virus diferentes. Sin embargo, ya quecomparten propiedades biológicas, serológicas y físico-químicascomunes, propusieron la creación de un subgrupo de BCMVincluvéndolos a todos.
Por otro lado, McKern e; al. (1992) compararonlos perfiles deHPLC de las di2estionesde las proteínasde la cápsidade las cepasNL3 y NYl5 de BCMV con los de dos cepasde BICMV y una de PStV.
Sus resultados sugieren que BCMV NL3 y NY15 son ditintos
potyvirus, y no cepas del mismo virus, y que NY15 es una cepa delmismo potyvirus que incluye BICMV, PStV, AzMV y tres aislados
potyvirales de soja (PM, PN, 74).La posición taxonómica de BCMV está, por tanto, actualmente
en discusión, y la aplicación de parámetros moleculares para elestablecimiento de parentescosestá aportando nuevos datos querevelan relaciones que no eran claras usando exclusivamente
criterios biológicos y serológicos; por el contrario, determinadosagrupamientosclásicos de cepas parecen guardar escasa relación a
nivel molecular.
6. RESISTENCIA A VIRUS EN PLANTAS
La manera clásica de producir plantas resistentesa patógenosha sido mediante la introducción de genes de resistencia naturales
en los cultivos mediante programasde mejora, que conllevan unlargo proceso de cruzamientosy selección de las líneas resultantes.
En los últimos diez años el creciente desarrollo de la
Biotecnología Vegetal ha brindado la posibiidad de transformarplantas genéticamente de manera estable. El tema de plantas
Introducción 27
transgénicas resistentes a virus ha sido recientemente revisado
(Ponz, 1993: Wilson, 1993).Uno de los métodos para conseguir protección frente a virus
es la resistenciamediada por la proteína de la cápsida, debido a laexpresión de dicho gen en plantas transgénicas.Para un númerocreciente de virus vegetales de importancia económica, la
acumulación de la proteína de la cápsida en plantas transgénicasconfiere resistencia a la infección y/o al desarrollo de enfermedad
por el virus del que deriva el gen y virus relacionados(Beachy u
al., 1990; Nejidat er al., 1990). En el caso de los potyvirus, este tipo
de resistencia también ha sido desarrollada,dando lugar al conceptode “protección de amplio espectro” (Stark y Beachy, 1989; Lawsonet al.. 1990: Ling ci’ al., 1991). Se ha conseguido incluso protecciónfrente a potyv¡rus en plantas transformadascon cápsidas de virusno patogenospara ellas (Stark y Beachy, 1989).
Recientemente,se ha descrito que la protección frente a PVYNen plantas transgénicastransformadascon el cistrón de la proteína
de la cápsida viral está mediada por el RNA de sentido positivo más
que por la acumulaciónde la proteína (Van der Vlugt ci’ al., 1992).En otros sistemas se ha conseguido generar también
resistenciamediante la expresión de genes virales no estructurales,
como es el caso de componentesde la replicasa viral. Algunosejemplos de este tipo de estrategiason la expresión de la secuenciacodificante para la presunta proteína de 54KDa de TMV,
produciéndoseuna reducción drástica de la replicación viral en los
tabacos transgénicos inoculados (Golemboski ci’ al., 1990; Can yZaitlin, 1991> y la resistenciafrente al virus X de la patata (PVX>expresando la proteína de 160 KDa o versiones truncadas de lamisma (Brawn y Hemenway, 1992).
La resistencia a virus mediada por RNA de sentido negativodel gen de la proteína de la cápsidaha sido descrita para el virus Xde la patata (PVX) (Hemenway ci’ aL, 1988) y el virus del mosaicodei pepino <CMV) (Cuozzo e; al., 1988), pero sólo se observóprotección a bajos niveles de inóculo viral. En el caso del virus del
enrollado de la patata (PLRV) (Kawchuk el al., 1991) se vió queconstruccionesde sentido positivo y negativo del gen de la proteínade la cápsida eran igualmente efectivas mediando la resistencia al
Introducción 28
virus. Los mejores resultados con este tipo de estrategiahan sidoobtenidos para el grupo de los geminivirus: la expresión en
antisentido de la proteína AII (imprescindible para la replicación)del virus del mosaico dorado del tomate (TGMV) produce un altonivel de resistencia(Day et al., 1991).
6.1. Control de BCMV
Entre los métodos de control de BCMV, ademásdel ejercidosobre los áfidos transmisores,están el uso semilla libre de virus y
de cultivares resistentes.Mediante proyectos de mejora es posible conseguir
combinacionesde genes efectivas. El gen be-u más alguno de losgenes be-], be-]2, be-2 o bc-22 confiere resistencia recesivaespecíficade cepa. pero, como bc-1 y bc-12 o bc-2 y bc-22 son paresalélicos, no es posible con estos genes conseguir resistenciaa todaslas cepasdel virus en un único genotipo de planta.
La combinación de be-u y be-3 confiere resistenciarecesiva a
todas las cepasconocidasde BCMV. Asimismo, el gen dominante ¡inhibe a todas las cepas del virus, pero puede ser vencido por
ciertas cepas inductoras de necrosis a menos que la planta estéprotegida con los genes be-u y bc-22, en cuyo caso sólo se producenlesiones locales necróticas restringidas. Otro problema con el gen 1
es su efecto de oscurecimientoen las semillas rojas y amarillas, queafecta negativamentea la calidad del grano (Temple y Morales,
1986). Estas últimas combinacionespueden perder su efectividad sien el futuro surgen mutantescapacesde vencer a be-3 o be-Y. Lacombinación de los genes be-u,be-22,be-3 e ¡ confiere una dobleresistencia a todas las cepas, posiblementeestable durante largosperíodos de tiempo, aunque supondría un trabajo largo y arduo demejora.
La generación de resistencia a BCMV mediante judíastransgénicas que expresaran secuenciasvirales es una posibilidad
cada vez mas cercana, gracias al creciente avance en lacaracterizaciónmolecular de aislados, donación y secuenciacióndegenes de la proteína de la cápsida, y de la mejora en la eficiencia delos sistemas de transformación y regeneracióndisponibles.
Introducción 29
rtzscsicio~tNL x Vos
II. JUSTIFICACION Y OBJETIVOS
El virus del mosaico común de la judía ha demostradoser uno
de los patógenosmás universales y destructivos de judía, y a suvez, un gran desconocido a nivel molecular, en un marco deconfusas relaciones entre sus aislados, cepas y otros potyvirusrelacionados.
En estudios preliminares de detección de virus de leguminosasen España, BCMV fue uno de los virus más frecuentemente
encontradosinfectando judía. Dada la falta de información existentesobre la incidencia del virus en nuestro país, así como de lascaracterísticastanto biológicas como moleculares de los aisladospresentes,se plantearon los siguientes objetivos para este trabajo:
1. Estudio epidemiológicode BCMV en España.
2. Caracterizaciónbiológica y serológica de las cepas presentes.
3. Caracterizaciónmolecular de un aislado reprcada serotipo mediante:
3.1. Clonación y secuenciaciónde la regiónviral.
3.2. Análisis filogenético.
esentativode
3’ del RNA
Justificacióny Objetivos 30
ALES
III. MATERIALES Y METODOS
1. MATERIAL VEGETAL
1.1. Recogida de muestras
Durante los años 1989, 90, 91, 92 y 93 se recogieron muestrasde hojas de judía (Phaseolus vulgaris L) de diferentes variedades,cultivares y sistemasde cultivo en zonas productoras españolas.
La toma de muestras se realizó de forma individual, eligiendoplantas que presentaban síntomas de mosaico, enaciones o
bandeamientode venas y una muestra asintomática, usando bolsasde plástico y guantes para evitar contaminaciones, y
transportándolasen una nevera portátil con hielo hasta su análisis.
1.2. Conservación de aislados
Los aislados virales se conservaron desecados,en cajas deplásticocon gel de sílice a 40C.
La desecacióndel material infectado se realizó troceándoloen
finas tiras (aproximadamente2 mm) que eran introducidas enbolsas de papel de filtro, y éstas a su vez en gel de sílice,manteniéndolasen ambiente seco y fresco; el gel hidratado erareemplazadopor otro nuevo.
1.3. Inoculación del virus
La transmisión del virus a partir de muestras infectadas se
realizó mediante inoculación mecánica de las hojas primarias deplantas de judía sanas, previamente analizadas por ELISA, paradescartar infecciones procedentesde semilla, usando como abrasivocarborundo de 600 mesh. A continuación, se frotaron las hojas con
un homogeneizadode planta infectada (hoja fresca o desecada)entampón fosfato 0,01 M, pH 7,5 a una dilución 1/10 (plv). Lasplantas fueron mantenidas en invernadero con luz natural entre25-350C, o bien en cámara de cultivo con una intensidad lumínica
¡Materiales y94étodos 31
de 25 IImol/mr¡s y un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de
oscuridad.
1.4. Cultivares de Phaseolus vulgaris utilizados
1.4.1. Transmisión y purificación
La transmisión de los aislados se realizó sobre el cultivarBountiful, homozigótico recesivo para el gen 1 de necrosis, ysusceptiblea la infección por todas las cepas descritasdel virus. Las
semillas libres de virus de este cultivar fueron cedidaspor el Dr. F.
Morales (CIAT, Colombia).
Como fuente de material infectado para la purificación delvirus, se utilizaron plantas inoculadasdel cv Garrafal Oro en el casodel aislado caracterizadodel serogrupoB, y del cv Bountiful en elcaso del aislado del serogrupoA.
1.4.2. Caracterización de cepas de BCMV
La caracterizaciónde cepas de BCMV presentesen los aislados
de campo españoles se realizó inoculando todos los cultivaresindicadores propuestospor Drijfhout (1978) (tabla 2).
2. MICROSCOPIA ELECTRONICA
2.1. Tinción negativa
La observación de las partículas virales presentes en losextractos de plantas infectadas y en las suspensionesprocedentes
de las purificaciones se realizó por microscopia electrónica mediantetinción negativa (Hitchborn y Hilís, 1965), usando ácidofosfotúngstico (PTA) al 2% y pH 7,0 como agentede tincion.
Las preparaciones se observaron en un microscopioelectrónico Jeol l00-B.
¡Materialesy ¡Métodos 32
2.2. Secciones ultrafinas
El tejido vegetal infectado fue embebido en Durcupan ACM(Fluka) (Rubio-Huertos e; al., 1968), sometiéndolo previamente afijación con glutaraldehído al 5%, postfijación con tetraóxido deosmio al 2%, y deshidrataciónen soluciones de acetonadel 30 al100%. Tras el pase por acetonaal 70%, se hizo otro en una soluciónal 2% de acetato de uranilo en acetonadel 70% para dar un mayorcontraste. Se realizaron dos pases por acetona saturada en CuSO4despuésde la acetonaal 100%. Con un ultramicrotomo LKB 8800 se
realizaron seccionesde 40-60 nm de grosor, y se tiñeron con citrato
de plomo.
3. ENSAYOS INMUNOLOGICOS
3.1. Anticuerpos utilizados
En los ensayos inmunológicos de detección de BCMV se
emplearon los siguientes anticuerpos:
3.1.1. Monoclonales
- Anti-PTY (Agdia Inc.). Reaccionafrente a un epítopo comúna todos los potyvirus.
- bc-197 (Wang ci’ al., 1984). Cedido por el Dr. Mink(Washington, USA). Detecta todas las cepasconocidasde BCMV.
- 1-2. Cedido por el Dr. Mink (Washington, USA). Reaccionaespecíficamentecon aislados del serogrupoA de BCMV.
- 15E5 (Vetten et aL, 1992). Donado por el Dr. Vetten(Braunschweig, Alemania). Líquido ascítico conteniendo anticuerpos
específicosfrente a los aisladosde BCMV de serogrupoB.- 1-3 (Wang, 1985). Donado por el Dr. Vetten (Braunschweig,
Alemania). Reacciona específicamentefrente a los aislados del
serogrupo A.
¡Matcriaks y ¡Métodos 33
3.1.2. Policlonales
- Anti-BYMV (ATCC, PV368). Reconocelos aisladosdel virusdel mosaico amarillo de la judía (BYMV).
- Anti-BCMV NYl5 (Vetten, 1992). Donado por el Dr. Vetten(Braunschweig, Alemania). Antisuero obtenido de animalesinmunizadoscon la cepa NY15 de BCMV, y que presentareactividad
específicafrente al serogrupoB.- Anti-BCMV NL5 (Vetten, 1992). Donado por el Dr. Vetten
(Braunschweig, Alemania). Antisuero obtenido de animalesinmunizados con la cepa NL5 de BCMV, y que presentareactividad
específicafrente al serogrupoA.
3.2. ELISA
El protocolo seguido para el análisis de las muestrasfue el deELiSA indirecto (Koenig, ¡981). El volumen de trabajo utilizado entodos los pasos fue de 100 1.11. Los anticuerpos se usaron a unaconcentraciónde 0,1 gg/ml. Entre las distintas etapas de incubación,
se realizaron tres lavados de tres mm cada uno con PBS-Tween
(tampón fosfato 20 mM pH 7,4, NaCí 150 mM, KCI 3 mM, NaN3 3mM, Tween-20al 0,05%).
3.2.1. Extractos vegetales
Como tampón de extracción para las muestras de hoja, se usóun tampón carbonato0,05 M, 1% de PVP-40, pH 9,6, a una diluciónfinal de 1/10 (p/v).
Las muestras de semilla se trituraron en seco en mortero, y laharina resultante se resuspendióen tampón carbonato 0,05 M, 2%de PVP-40. 0,2% de seroalbúminaen una relación 1/50 (plv).
¡Materialesy ¡Métodos 34
3.2.2. Conjugados
Con los anticuerposmonoclonales,el conjugado utilizado fueun anti-lgG de ratón conjugado con fosfatasa alcalina (SigmaChemical Co.). La dilución de trabajo fue 1/2000.
En los ensayos con antisuerospoliclonales se empleó proteína-
A conjugadacon fosfatasaalcalina (Sigma Chemical Co.>, (Yolken yLeister, 1981). La dilución empleadafue 1/2000.
3.2.3. Sustrato
Como sustrato de la fosfatasa alcalina se utilizó el p-nitrofenilfosfato (Sigma Chemical Co.) a la concentraciónde 1 mg/ml. Las
lecturas se realizarona los 30 mm, 1 h, 2 h, 3 h y 4 h tras la adicióndel sustrato en un espectrofotómetrode placas (Titertek Multiskan
plus MK II) a 405 nm. Las reaccionesfueron consideradaspositivascuando las lecturas superaron el doble del valor de los controles
sanos.
3.3. Inmunomicroscopía electrónica
Se siguió el método descrito para ISEM (“immunosorbent
electron microscopy”> por Roberts, (1986). El agente de tinción fueácido fosfotúngstico (PTA) al 2% y pH 7,0. La dilución de anticuerpo
empleadapara el ensayo fue de 1/1000.
4. PURIFICACION DE BCMV Y EXTRACCION DEL RNA VIRAL
4.1. Purificación del virus
El virus fue purificado a partir de 100-200 g de hojas de judíasistémicamente infectadas, procedentes de plantas inoculadas
cuatro semanas antes y que reaccionaron positivamente en ELISAcon anticuerpos específicos a las tres semanas después de la
inoculacion.
Atateriafesy ¡Métodos 35
El protocolo de purificación seguido fue el descrito por Moghaly Francki (1976> para BCMV y SCMV (virus del mosaico de la cañade azúcar), que consiste en una extracción inicial con dos volúmenes(p/v> de tampón borato 0,5 M, pH 8,0 y 0,15% de ácido tioglicólico,más 0,5 y de tetracloruro de carbono y 0,5 y de cloroformo. Se
clarifica por centrifugación a 8000 g durante 10 mm, se añadeTriton X—l00 hasta una concentración final del 5%, y después seagita durante 30 mm a 40C. Tras otra clarificación, el virus se aislamediante tres ciclos de centrifugación diferencial seguidos decentrifugación en un gradiente de sacarosadel 10-40%. La zona delgradiente correspondientea la de bandeo del virus se determinó
midiendo A9$4 ~. El virus se recuperódializando las fracciones
seleccionadasdurante una noche a 4< frente a tampón borato 0,05M pH 8,0, y centrifugando a 78000 g durante 90 mm. Laconcentración de la suspensión viral se determinó porespectrofotometríausando un coeficiente de extinción E34~tmz2,4, y
teniendo en cuenta que la relación A2601280 de la suspensiónviraldebe aproximarse a 1,25 (Bravo, 1984).
4.2. Extracción del RNA viral
El RNA viral se purificó a partir de una suspensiónde virusmediante extracción con fenol/cloroformo (Sambrook e; al., 1989),previa incubación durante 1 h a 37< con SDS al 1%.
Los ácidos nucleicos contenidos en la fase acuosa seprecipitaron con 2,5 y de etanol y 0,1 y de acetatosódico 3 M, pH5,2. El precipitado se resuspendióen TE (Tris-l-ICI 10 mM , EDTA 1
mM) pH 8,0.El RNA extraído se analizó por electroforesis en un gel
desnaturalizantede agarosaal 1,3% (Sambrook a al., 1989).
5. SíNTESIS DE o-DNA VIRAL
La síntesis de DNA complementarioal RNA viral se realizó
usando el kit “c-DNA Synthesis Plus” (Amersham), partiendoaproximadamentede 1 ~.igde RNA, y utilizando como cebador para
¡Materialesy Métodos 36
la transcripción inversa oligo (dT), a fin de elongar a partir del
extremo 3’ deI RNA viral.Para la síntesis de la segunda cadena. y siguiendo las
instrucciones del fabricante, se utilizaron Las actividades
combinadasde la RNasa H y la DNA polimerasa1. La RNasa H generafragmentosde RNA en el híbrido RNA-DNA, que son usados como
cebadorespor la DNA polimerasa 1 para elongar la segundacadenade c-DNA.
Finalmente, un tratamiento con la T4 DNA polimerasa,
mediante su actividad 3-5’ exonucleasaasegura la existencia deextremos romos en las moléculas de c-DNA sintetizadas.Se realizóuna extracción con fenol/cloroformo y una precipitación con acetatoamónico 4 M y etanol, resuspendiéndoseel precipitado final en 10pi de TE.
Para medir la eficiencia en la síntesis, tanto de la primera
como de la segunda cadena, se añadieron en ambas reacciones20gCi de fcu32P]dCTP (Amersham, actividad específica 3000 Ci/mmol).
Se analizó el c-DNA resultante mediante electroforesis en gel deagarosaal 0,8%, que se secó en un secadorde geles (Slab dryer 483
Bio Rad’>, y expuso con una película autorradiográfica (Kodak X-OMAT AR) con pantalla intensificadoraa -700C.
6. CLONACION Y MANIPULACION DE DNA
6.1. Vectores
El plásmido utilizado como vector fue Bluescript KS
(Stratagene). Este vector permite la selección de los clonesrecombinantespor ausenciade color azul en las colonias derivadasde células transformadas al añadir IPTG (isopropiltio-~ - D -
galactósido) como inductor, y X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-¡3-D-
galactósido) como sustrato cromogénico (Sambrook e; al., 1989). Elplásmido es portador, además, del gen de resistenciaa ampicilina.
Para la donación del c-DNA se utilizó el vector digerido con laendonucleasade restricción Sma 1, que produceextremos romos.
Materialesy Métodos 37
En las subclonacionesrealizadas se empleó el mismo vectordigerido con Eco Rl y con CIa 1, generando ambas extremos 5’protuberantes.Las condiciones de reacción en todas las digestiones
fueron las recomendadas por los proveedores (Boehringer yAmersham). Tras la digestión con la enzima correspondiente,serealizó una extracción con fenol/cloroformo y una precipitación con
etanol (Sambrook e; al., 1989).
6.2. Tratamiento con CIP
Con el fin de evitar la recircularización del plásmido en lasreacciones de ligación, se realizó un tratamiento con fosfatasa
alcalina de ternera (CIP) (Boehringer). Para los vectores conextremos~5’ protuberantes(50 pmoles), el plásmido linearizado yprecipitado se resuspendióen 180 ~xl de Tris-HCI 50 mM, pH 8,0 y
se añadieron2 u de CIP, incubandoa 30 mm a 370C. La inactivaciónde la enzima se realizó incubando a 65< durante 1 h en presencia
de 5 mM EDTA, pH 8,0.Para el vector digerido con Sma 1 (50 pmoles de DNA con
extremos romos), el vector linearizado, y resuspendidoen 180 1.11 de
Tris-HCI 50 mM. pl-! 8,0 se incubó durante lO mm a 65<, pasándolodespuésa hielo y añadiendo1,5 u de CIP; a continuación, se incubó
15 mm a 37t>C y 15 mm a 560C. Se repitió e] tratamiento con CIPañadiendo 1,5 u e incubando de igual forma. Se inactivó la enzimaincubando 1 Fi a 650C en presenciade 5 mM EDTA pH 8,0.
Tras la desfosforilación del DNA plasmídico linearizado se
realizó una extracción con fenol/cloroformo y precipitación conetanol.
6.3. Reacciones de ligación
Se realizaron a 150C durante una noche, en un volumen finalde 10 pl, con 200 ng de vector linearizado desfosforilado, en una
proporción molar vector/inserto aproximada de 10:1 para extremos
romos, con 5 u de T4 DNA ligasa (Boehringer), y de 1:1 paracohesivoscon 1 u de ligasa.
Materialesy ¡Métodos 38
6.4. Preparación de células competentes de E. coil
La cepa utilizada fue DH5ct, y el protocolo seguido fue el de
Hanahan (1983) con algunas modificaciones.Se creció un preinóculo en 10-15 ml de medio 4> broth
(bactotriptona al 2%, extracto de levadura al 0,5%, KCI 10 mM yMgSO4 al 0,4%, pH 7,6) a 37
0C con agitación hasta alcanzar una A550
de 0,3. Con 5 ml del preinóculo se inocularon 100 ml de 4> broth, que
se incubó a 370C con agitación orbital hasta alcanzar una A
55o d e0,48. Las células se enfriaron rápidamente en hielo y secentrifugaron a 6000 g a 4
0C, resuspendiéndolasseguidamente en
30 ml de TFBL (RbCI lOO mM, MnCI 50 mM, acetato potásico 30mM, CaCI
2 10 mM y 15% de glicerol) y volviendo a centrifugar enlas mismas condiciones.El precipitado se resuspendiófinalmente en4 ml de TFB2 (RbCI 10 mM, CaCl2 75 mM, MOPS pH 7,0 10 mM y15% de glicerol>. y se hicieron alícuotas de 200 111, que se
conservarona -80< hasta su utilización.
6.5. Transformación y selección de clones recombinantes
A una alícuotade 200 jl de células competentes,descongeladay mantenida en hielo 10 mm se añadieron 5 pl de mezcla de
ligación y se dejó en hielo durante 20 mm. A continuación, serealizó un choque térmico de 37
0C durante 3 mm. pasandode nuevoa hielo. A fin de reactivar el metabolismo celular, las células seincubaron durante 1 h a 37< en agitación en 800 pl de medio 4>broth. Seguidamentese procedió a extender las células sobre medio
LB sólido (bactotriptonaal 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCí al1%, pH 7,0 y 1,5% de agar) suplementadocon ampicilina (50 pg/ml).
6.6. Preparación de DNA plasmídico
Las preparaciones de DNA plasmidico se realizaron
generalmente a pequeña escala, siguiendo el protocolo de lisisalcalina (Sambrook es al., 1989) a partir de cultivos de 3 ml en LBcon ampicilina (50 gg/ml) durante una noche. El DNA obtenido se
utilizó, bien directamente en digestiones con endonucleasasde
Materialesy Métodos 39
restricción, o bien para secuenciación,en cuyo caso se sometía a un
tratamiento con RNasa A (Sambrook u al., 1989) y posteriorextracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.
Las preparacionesde plásmido a gran escala se hicieron a
partir de 250 ml de cultivo en LB (bactotriptona al 1%, extracto delevaduraal 0,5%, NaCí al 1%, pH 7,0) con ampicilina (50 vg/mi) por
el protocolo de lisis alcalina (Sambrook cf al., 1989), y lapreparación de DNA obtenida se sometió a centrifugación en
gradiente de CsCI-BrEt, extrayendo el BrEt con 2—propanol saturadoen agua saturadacon NaCí (Sambrook a al., 1989). Finalmente seprecipitó con etanol.
7. HIBRIDACIONES DE ACIDOS NUCLEICOS
7.1. Transferencia a membranas
7.1.1. Transferencia tipo “Souttiern”
Los ácidos nucleicos a transferir se sometierona electroforesisen geles de a2arosa.Se realizó una transferenciaalcalina con NaOH
0,4 M durante 1 Fi segt~n Sambrook ci al. (1989) a membranasdenylon (Hybond N±, Amersham). Las membranasse guardaron en
bolsas de plástico a 4<’C tras enjuagaríasen SSC 2 X (NaCí 0,3 M,citrato sódico 0,03 M).
7.1.2. Transferencia a partir de colonias
Las membranasde nylon (Hybond N, Amersham) se dejaron
caer sobre la placa con las colonias a analizar. Tras 1 mm, setrataron con una solución de desnaturalización(NaCí 1,5 M, NaOH
0,5 M) durante 7 mm, y a continuación, se íes dió dos pases de 3mm cada uno en una solución de neutralización (NaCí 1,5 M, Tris—
MCI 0,5 M pH 7,2, EDIA 0,001 M). Se lavaron las membranasen SSC2 X 1 mm y se escurrieron en papel 3MM, horneándoseacontinuacióndurante 2 h a 80<.
Materialesy Métodos 40
7.1.3. “Dat blot” de extractos vegetales
Se realizó básicamente según Frenkel ci’ al., (1992) Lasmuestras, trituradas en 10 X SSC:formaldehído (1:1), en una
proporción 1:5 (p/v) se fenolizaron con un volumen defenol:cloroformo (1:1), depositándose 10 ¡il del sobrenadante
obtenido (y sus posteriores diluciones) sobre una membrana denitrocelulosa (l-lxbond C, Amersham) previamente empapada enagua destilada y saturadaen 20 X SSC. Se dejó secar brevementeyse horneó la membranaa 800C durante2 h.
7.2. Marcaje de las sondas
7.2.1. Marcaje con (a-32P]dCTP
Los fragmentos de DNA se marcaron mediante síntesisiniciada por oligonucleótidos al azar en presencia del radioisótopo(kit Megaprime DNA labelling system, Amersham). La sonda sepurificó eliminando los nucleótidos no incorporados mediante
cromatografía en columna de SephadexG-50. La incorporación enlas sondas se determinó haciendo lecturas en un contador de
centelleo-
7.2.2. Marcaje con digoxigenina
Se realizó mediante el kit “DNA labelling and detectionnonradioactive” (Boehringer), con hexanucleótidos al azar enpresenciade dNTPs y dig-dUTP. La sonda se precipitó con LICI 4 M
y etanol.
7.3. Condiciones de hibridación
7.3.1. Hibridación con sondas radiactivas
Las membranas se prehibridaron a 650C durante 2 h en 50gl/cm2 de membranaen una solución SSC 5 X, solución de Denhardt
5 X (ficolí 0,1%, PVP-40 0,1%, BSA 0,1%), SDS al 0,5%, y 20 gg/ml de
Matcriaksy2Jétodos41
DNA de esperma de salmón desnaturalizado(Sambrook et al.,
1989). A continuación se añadió la sonda marcada desnaturalizada
por calor a la solución de prehibridación, y se hibridó durante todala noche a 65~~C. Tras la hibridación, se realizaron los siguientes
lavados: dos veces en SSC 2 X, SDS al 0,1% durante 15 mm atemperaturaambiente, y dos veces en SSC 0,5 X, SDS al 0,1%durante 15 mm a 650C. Las membranasse expusieron a -700C conpantalla intensificadora con películas autorradiográficas.
7.3.2. Hibridación con sondas marcadas con digoxigenina
Se prehibridaron las membranasen 200 ¡A/cm2de soluciónSSC 5 X con agentede bloqueo al 0,5%, N-laurilsarcosinaal 0,1% ySDS al 0.02% durante 2 h a 65<. A continuación, se añadió la sondamarcada desnaturalizadapor calor a la solución de prehibridación, yse realizó la hibridación y los posteriores lavados en las mismascondiciones que en el apartado anterior. Se detectó la digoxigeninamediante anticuerpos anti-digoxigenina conjugados con fosfatasa
alcalina que, en presenciade NBT (sal azul de nitrotetrazolio) y X-
fosfato (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato de toluidinio) producenuna reacción colorimétrica.
8. SECUENCIACION
8.1. Reacciones y estrategia
Las reaccionesde secuenciaciónse realizaron sobre moldes deDNA de doble cadena según el método de terminadoresde cadena
(Sanger et al., 1977), siguiendo el procedimiento descrito por Zhang(1988), con el kit de sequenasaversion 2.0 (USB), y usando comoisótopo radiactivo [cz-35S]-dATP.Las reaccionesse efectuaron en lascondiciones aconsejadaspor el fabricantepara 3 ¡ig de DNA molde.
Para completar la secuenciade los clones de c-DNA se recurrióa una estrategiade delecionessolapantes,que se llevó a cabo con el
kit “double-strandednested deletion” (Pharmacia). Por este métodose generan deleciones unidireccionalesen doble banda mediante la
Materialesy Métodos 42
acción de la exonucleasa 111 sobre extremos romos y 5’protuberantes. La digestión con una endonucleasade restricción
que genere extremos~ 3’ protuberantes,cercana al gen de interés,
produce un extremo resistente a la acción de la exo III. Lasdeleciones solapantes se consiguen tomando alícuotas a distintosintervalos de tiempo durante la digestión con la exonucleasa.Lasregiones de cadena sencilla producidas por la enzima se eliminanusandola nucleasaSí. La religación del DNA se efectúa mediante la
actividad de la T4 DNA ligasa.Para cubrir la secuenciade algunas regiones fue preciso e] uso
de oligonucleótidos específicos(Bio-synthesis S.L.) en las reacciones
de secuencía.
8.2. Geles de secuenciación
Los productos de secuenciaciónse sometieron a electroforesis
en geles de poliacrilamida (5,7% de acrilamida, 0,3% debisacrilamida) con urea 8 M como agente desnaturalizante.
Los tampones utilizados fueron TBE 0,5 X como tampón
superior y como tampón inferior 1/3 de acetatosódico 3 M, 2/3 deTBE 1 X, para producir un efecto de apilamiento de bandasen el gel(R. Kettmann (Gembloux, Bélgica), comunicación personal).
La cubeta utilizada para secuenciaciónfue el modelo “poker
face” SE 1500 sequencer(Hoefer Scientific Instruments).Tras la electroforesis, los geles se sometieron a una fijación
con una solución de metanol al 10% y acético al 10% en aguadurante 20 mm y secado a 800C en un secadorde geles (TDI) para
su posterior exposición con películas autorradiográficas(Kodak X-OMAT AR).
9. TEONICAS ELECTROFORETICAS
9.1. Electroforesis en geles de agarosa
Se realizó siguiendo las indicaciones de Sambrook ei’ al.,
(1989), utilizando TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0)
¡Materialesy Métodos 43
como tampón x concentracionesde agarosa comprendidas entre0,8-1,3%. Los geles se tiñeron con BrEt (1 .tg/ml) y el DNA se
visualizó en un transiluminador con luz ultravioleta.
9.1.1. Extracción de fragmentos de DNA a partir de geles deagarosa
Se realizó utilizando agarosa de bajo punto de fusión (SeaPlaque, FMC), (Sambrookei’ al., 1989).
9.2. Electroforesis en geles de poliacrilamida
Los geles analíticos y preparativos se realizaron segúnSambrook ci’ al.. (1989). utilizando IBE (Tris-borato 89 mM, EDTA 2mM, pH 8,0), y concentracionescomprendidasentre 3,5-5%, segúnel tamaño de fragmento a analizar. Los geles se tiñeron con BrEt (1
ng/ml), o bien con una solución de azul de metileno en agua al 0,2%.
9.2.1. Extracción de fragmentos de DNA a partir de geles depoliacrilamida
Se realizó cortando la banda de interés con un bisturí estéril, yse colocó dentro de una punta desechablede pipeta automática de 1mí, sellada previamente en su extremo por calor, y taponadacon
lana de vidrio siliconizada. A continuación, se maceró la acrilamidacon una varilla de vidrio y 200 ¡A de tampón de elución (acetato
amónico 0.5 M, EDTA 10 mM, pH 8,0), transfiriendo todo el conjuntoa un tubo de ensayo, que se incubó durante una noche a 370C enagitación. Después se cortó la parte inferior de la punta, pasándolaaun tubo Eppendorf agujereado en su tapa, centrifugándolo a 1500 gdurante 5 mm; se añadieron otros 200 ¡.tl de tampón de elución y se
centrifugó de nuevo. Los ácidos nucleicos eluidos en los 400 ¡1 se
precipitaron con etanol, acetatosódico y 0,01 y de MgCI2.
¡Materiales y Métodos 44
10. ANALISIS FILOGENETICO
Para determinar la metodología más apropiada a aplicar en elanálisis filogenético de las secuenciasmanejadas, se necesita saberqué propiedades tienen las distancias genéticas observadasentrelos aislados virales analizados.En el mejor de los casos, se cumplirá
que cada antecesor sea equidistante de todos sus descendientes(distancias ultramétricas),con lo que se podrían aplicar métodos de
la familia del UPGMA (Sokal y Ro¡fh, 1981); si no, hay que aplicar
métodos que tengan en cuenta la falta de ultrametricidad (Swoffordy Olsen, 1990). Para esto, se aplica el test de tasa de evolucióndesigual.
10.1. Aplicación del test de tasa de evolución desigual
Para la aplicación del test de tasa de evolución desigual,“inequality rate test” (Felsenstein, 1984), se utiliza el método de
reconstrucción filogenética por mínimos cuadrados (Fitch yMargoliash, 1967) bajo dos supuestos: a) las distancias son
ultramétricas, y b) no lo son. Este análisis se realizó con losprogramas KITSCH y FITCH (PHYLIP package, Felsenstein,1990)
respectivamente. De ellos se obtienen las sumas residuales decuadrados(SS), sin restricción, o asumiendo que las distancias son
ultramétricas. El cociente [SS(reloj)-SS(sin restricción)]/SS(sinrestricción) debería, para las distancias ultramétricas, tener unadistribución F con n-2 y N-(2n-3) grados de libertadrespectivamente.
10.2. Derivación de árboles filogenéticos
El método utilizado fue el de “neighbour-joining” (Saitou y Nei,1987), y las distancias genéticas se obtuvieron mediante el
estimador de Jukes y Cantor (1969) en el caso de las secuenciasnucleotídicas, y por el método de Kimura (1983) en el caso desecuenciasaminoacídicas.
Para evaluar la fiabilidad de los árboles inferidos, se aplicó elmétodo “bootstrap” (Efron, 1982). Los intervalos de confianza para
Materiales» ¡Métodos 45
los nodos del árbol se obtuvieron según Felsenstein(1985). y parala longitud de las ramas según Dopazo (1993).
Siguiendo este procedimiento, se derivaron árbolesfilogenéticos para nueve secuenciasnucleotídicasde las regiones 3’no codificantes (3’ NCR), así como para catorce secuencias
aminoacídicasde los genesde la proteína de la cápsidade BCMV y
otros potyvirus relacionados.La raíz u origen evolutivo de los árboles fue obtenida en base
al árbol inferido por Rybicki et al. (1992) debido a su topologíasimi lar.
11. AMPLIFICACION ENZIMATICA DE BCMV
El ensayo de amplificación enzimática mediante la reacción encadena de la polimerasa está basado en la replicación específica deun segmento determinado de DNA mediante dos oligonucleótidoscebadores que flanquean dicho segmento, a través de sucesivosciclos de desnaturalización,hibridación o anillamiento y extensión apartir de ellos mediante la actividad de una DNA polimerasa
termoestable (Innis et al., 1990). En el caso de los virus cuyogenoma está constituido por RNA, es preciso realizar una reacción
previa de transcripción inversa, aplicándose entonces métodos que
combinan transcripción inversa y PCR (RT-PCR) (Langeveld et al.,1991; Jones et al., 1991; Robertsonet al., 1991).
Los ensayosde RT—PCR realizadospara la detecciónde BCMVse han realizado siguiendo dos procedimientos distintos. Por unlado, realizando el ensayo directamentea partir de extracto vegetal(planta o semilla) crudo, sin un proceso previo de purificación de
ácidos nucleicos, y, por otro lado, en otro tipo de ensayoen el que serealiza la inmunocapturadel virus en una placa de microtitulación,
donde se realiza la transcripción inversa, y, posteriomente, elproducto de ésta se somete a la amplificación enzimáticapor PCR.
¡Materialesy 94étodos 46
11.1. RT-PCR a partir de extracto vegetal
La reaccion se realizó según el método descrito por Borja yPonz (1992). con variacionesen las concentracionesde los reactivos.
El tejido foliar y las semillas trituradas en seco de judía fueron
homogeneizadosen tampón Tris-HCI 100 mM, pH 8,3, MgCl2 15 mM,Tween 20 0.5%, gelatina 0,1% y KCl 500 mM. A 10 ¡A del extractovegetal se añadieron 10 ¡A de la mezcla de transcripción inversa,
siendo las condiciones finales de reacción dNTPs 1 mM, 48 u deinhibidor de ribonucleasas (UPRI, Amersham), 20 pmoles de
cebador 3’, MgCI2 3 mM, y 200 u de transcriptasainversa (M-MLV,Gibco BRL). El volumen final de 20 ~±lse completó con H20 tratada
con DEPC (Sambrook et al., 1989). Se incubó a 37-42<. Una vezsintetizadoel c-DNA de cadena sencilla se incubó a 94
0C 5 mm paradesnaturalizar el híbrido RNA-cDNA e inactivar la transcriptasainversa. A continuación, se procedió a la amplificación en unvolumen de 80 ó 100 ¡A, añadiendo a la reacción de transcripción
inversa 20 pmoles de cebador 5’, tampón 10 X de la amplilaqpolimerasa (Tris-HCI 100 mM, pH 8,3, KCI 500 mM), 2,5 u deampliTaq DNA polimerasa (Perkin Elmer Cetus), y MgCI
2 hasta una
concentraciónfinal de 1,8 mM.La reacción se sometió finalmente a 35 ciclos de
desnaturalizacióna 940C 45 s, anillamiento a 520C 1 mm y extensión
a 720C 1 mm en un termocíclador (Gene Amp PCR System 9600Perkin Elmer). Un ciclo final de 720C 5 mm permite completar la
síntesisde DNA en las cadenasiniciadas.
1t2. RT-PCR previa adsorción del virus a placas demicrotitulación mediante anticuerpos específicos (PCR-INIA)
Este ensayo está basadoen el método descrito por Nolasco ei’
al., (1993) denominadoPCR-INIA.Placas de microtitulación de fondo cóncavo (Nunc) se
tapizaron con 50 ití del anticuerpo específico en tampón carbonato0,05 M, pH 9,6, a la dilución habitual para ELISA, incubando entre1-4 h a 37<. Se lavaron los pocillos cuidadosamentetres veces conPBS-Tween, pH 7,4, y se añadieron 50 ~tl de muestra vegetal en
Materialesy Métodos 47
tampón de extracción (Tris-HCl 0,5M, pH 8,3, NaCí 150 mM, Tween20 al 0,05%, PVP-40 al 2%, PEG-6000al 1%, y azida sódica 3 mM) adistintas diluciones desde 1/JO <p/v) para planta y 1/50 (p/v) parasemilla (harina). Después de una incubación a 40C durante unanoche, o bien 1-4 h a 370C y de tres lavados con PBS-Tween, pH 7,4se procedió a la transcripción inversa; para ello, se añadieron 20 ¡Ade mezcla de transcripción inversa (dNTPs 1 mM, cebador 3’ 1 ixM,
tampón 5 X de la transcriptasainversa (Tris-HCI 250 mM, pH 8,3,
KCI 375 mM, MgCl2 15 mM), y 30 u de UPRI, y 200 u de
transcriptasa inversa por reaccion. Los pocillos se taparon con
plástico adhesivo, y las placas se incubaron a 37-420C 1 h en
agitación, a fin de cubrir toda la superficie tapizada del pocillo.Transcurrido este tiempo, el volumen de reacción se transfirió a untubo eppendorfdonde se sometió a 940C 5 mm y a la amplificaciónen un volumen de 60, 80 ó 100 ¡A, previa adición de 20 pmoles de
cebador 5’. tampón 10 X de la ampliTaq polimerasa (Tris-HCI 100
mM, pH 8.3, KCI 500 mM), 2,5 u de ampliTaq DNA polimerasa,yMgCI
2 hasta una concentraciónfinal de 1,8 mM. El número y tipo de
ciclos fue igual que en el caso anterior.
11.3. Detección de los productos de amplificación
Se realizó mediante electroforesis en geles de agarosa, ytinción con BrEt. El volumen sometido al análisis osciló entre el 15 yel 25% del volumen final de reacción.
En los ensayos de determinación del límite máximo dedilución del extracto vegetal para la detección de BCMV, en lasdiluciones no detectablesen las condiciones anteriores, se realizóuna precipitación con etanol (Sambrook e; al., 1989) y se analizó
por electroforesis el volumen total de resuspensión.
11.4. Aislados utilizados
En las reaccionesde PCR se ensayaronmuestras infectadasconBCMV recogidas en distintas zonas españolas,además de otros
aislados del virus y de potyvirus relacionados que fueron cedidos
Materialesy Métodos 48
por distintos investigadores, o bien adquiridos de algunasinstituciones. La relación de estos últimos es la siguiente:
BCMV cepaNL8 (Dr. F. J. Morales, CIAT, Colombia)BCMV cepaNL4 (Dr. F. J. Morales, CIAT, Colombia)
BCMV cepaFía (Dr. F. J. Morales,CIAT. Colombia)BCMV cepaNY15 (Dr. F. J. Morales, CIAT, Colombia)
BCMV. aislado italiano (Lisa, 1977)BYMV. aislado 1 y italiano (Lisa, 1977)WMV 2. aislado italiano (Lisa y Dellavalle, 1981)
CIYVV. aislado italiano (Lisa y Dellavalle, 1983)PWV, PV-0292, DSM BraunschweigPStV, PV-0338, DSM Braunschweig
Los lotes de semillas empleados en los ensayos de
amplificación proceden todos del País Vasco, y fueronproporcionadospor el Dr. D. Berra de la Unidad de Sanidad Vegetal,Gobierno Vasco. Cada lote está compuesto por semillas recogidasde
una única planta, de cultivares autóctonos,con síntomas de mosaicoy deformación foliar. La infección por uno u otro serotipo de BCMV
fue determinada previamente por ELISA con los anticuerposmonoclonales específicos.
Materialesy ¡Métodos 49
Z~S!1LrA~OS
III. RESULTADOS
1. ESTIMACION DE LAS VIROSIS EN EL CULTIVO DE JUDíA
Con el fin de obtener una primera estimación de lasinfecciones virales en judía, se recogieron 24 muestrascon síntomasde posibles virosis (mosaico, bandeo de venas, deformación foliar,
etc.) en las provincias de León, Valladolid y Madrid. Dada laimportancia descrita en la literatura de las infecciones producidas
por potyvirus en este cultivo, se analizaron por ELISA todas lasmuestras frente al monoclonal anti-potyvirus, resultando el 75% deellas positivas. La etiología potyviral de estas infecciones seconfirmó por análisis de microscopia electrónica mediante tinciónnegativa y secciones ultrafinas, observándose la presencia de
partículas anisométricasflexuosas de unos 750 nm, y de inclusionescitoplásmicas en roseta (“pinwheels”) (figura 7), ambas típicas de
los potyvirus.Paralelamente,se realizó un estudio de gama de huéspedesy
ensayo frente a otros anticuerpos antivirales disponibles en ellaboratorio, encontrándoseque 3 muestras estaban infectadas porCMV. Dentro de las infecciones potyvirales, un 70% de los aisladosresulté ser sólo transmisible a judía, y reaccionó positivamente en
ensayos de inmunomicroscopíaelectrónica con el anticuerpo bc-197, de amplio espectro para BCMV (figura 7). Además, se detectó
la infección por BYMV en una muestra.
A partir de 1991 se emprendió un muestreo más amplio,
abarcando las principales zonas productoras españolas (figura 8).Los resultados globales de las muestras recogidas durante estoscinco años (1989-1993) se resumen en la tabla 3. Del total de 253
muestras resultaron positivas 189 frente al monoclonal anti-PTY, lo
que representaun 75% de infecciones producidas por potyvirus.Las muestras recogidas a partir de 1991, junto con dos
muestras desecadasdel muestreo previo, se analizaron frente al
monoclonal bc-197, de amplio espectro para BCMV, resultando
positivas el 71% (tabla 3).
Rssultadios 50
Figura 8. Distribución geográfica de serotipos de BCMVregiones muestreadas.N= n~ de muestrasrecogidas. NR= ensayo
e
U a Serotipo A uSerotipo B e
Soria 1991/92 6/41 1/4] 0/0 1/36 0/0Pajencia 1993/92 4/31 2/31 1/0 1/30 0/0Sevilla 1992 4 4 0 4 0Cádiz i992 2 2 0 2 0Jaén 1992 5 5 0 5 0Alava 1992 18 12 0 9 0Almería 1993 21 10 0 5 1
en lasno
realizado
Algunos de los síntomas observadosen campo en muestrasinfectadaspor BCMV se muestranen la figura 9.
2. CARACTERIZACION DE AISLADOS DE BCMV
Debido a la importante presenciade BCMV en el cultivo dejudía, y a la falta de datos acerca de su incidencia, así como la de
sus cepas y serotipos, se abordó la caracterizaciónde los aislados deeste virus presentesen los campos españoles.
El hecho de pertenecer a uno u otro serotipo lleva implícitauna serie de característicasbiológicas, serológicas y moleculares
diferenciables,englobando el serotipo A a las cepas inductoras denecrosis y el B a las inductorasde mosaicoen general. Con el fin de
evaluar la representatividadde estos dos grupos en los aislados de
campo españoles, se procedió a su caracterización serológicamediante ELISA, y a la determinación de algunas de las cepaspresentesmediante ensayos biológicos (Drijfhout, 1978).
2.1. Caracterización serológica
Para la determinación serológica de los aislados se ensayaronlas muestras recogidas frente a los anticuerpos específicos de
serotipo del virus: los monoclonales1-2 e 1-3 y el policlonal NL-5,específicosdel serotipo A, y el monoclonal ISES y el policlonal NY-15 específicosdel serotipo B.
En el anexo 1 se refleja la procedencia, fecha de recogida,variedad o tipo de judía, síntomas y reacción frente a los
anticuerposde todas las muestras recogidas, así como información
adicional en algunas de ellas sobre la presencia de otros virusdetectados con anticuerpos específicos o ensayo de gama dehuéspedes.
Los resultados obtenidos frente a los anticuerposmonoclonalesespecíficosse muestranen la tabla 4, y frente a lospoliclonales en la tabla 5.
Las muestrasrecogidasen el año 91 se ensayaroncon toda la
batería de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los
Resultados53
Tabla 3. Resultados globales de las muestras recogidas en los años1989-1993 frente a los anticuerpos monoclonales anti-potyvirus(anti-PTY) y de amplio espectro para BCMV (bc—197).
Tabla 4. Resultados de las muestras analizadas frente a los
monoclonalesespecíficosde serotipo de BCMV.
anttueipo n2 muestrasanalizadas n2 muestras positivas % sobre el total
anti-PTV 253 189 75
bc197 231 164 71
SEROTIPOA SEROTIPO B
ant¡cuerpo 1-2 1-3 ISES
n2muestras 231 231 231analizadas
n9muestras 24 24 141positivas
%sobreeltotal 10 10 61
monoclonales ISES, 1-2 e 1-3 no presentaron reacciones cruzadasentre serotipos, mientras que los policlonales sí; sin tener en cuentalas infecciones mixtas, un 29% de las muestras B positivas fueron
reconocidaspor el policlonal NL-5 (A-específico), y un 58% de lasmuestras A positivas fueron reconocidas por el policlonal B-específico NY-ls, por lo que la asignación de serotipos se realizóconsiderando exclusivamente la reacción frente a los anticuerposmonoclonales específicos. Las muestras recogidas durante los años
sucesivos no se analizaron frente a los policlonales, debido a susnumerosas reacciones cruzadas.
Los resultados obtenidos en los ensayos serológicos sesumarizan en la tabla 6. Las muestras infectadas por aislados de
serotipo A representaronun 5% del total de muestras analizadas,aligual que las infecciones mixtas con aislados de ambos serotipos
(tabla 6). Las infecciones por aislados de serotipo B representaronun 56% del total. Un 6% de las muestras,no reconocibles por losmonoclonalesespecíficosde serotipo, pero sí por el monoclonal de
amplio espectro de BCMV, podrían estar infectadas por potyvirusestrechamenterelacionados con BCMV (perfiles 1 y Ii, tabla 9). En
resumen, las muestrasinfectadaspor BCMV suponen un 89% de lasinfectadas por potyvirus. Las infecciones por aislados de serotipo A
representaronun 8% de las infecciones producidas por BCMV, aligual que las infeciones mixtas, mientras que el 84% de las muestrasinfectadas con el virus, lo fueron por aislados del serotipo B (tabla
6).En la figura 8 se muestra la distribución de los aislados de
BCMV en las distintas regiones muestreadas.
2.1.1. Perfiles serológicos de los aislados
Debido a la complejidad de las reacciones de los aisladosfrente a los distintos anticuerpos, se realizó un estudio de los
diferentes perfiles serológicos. Las muestras con perfiles atípicosfueron analizadasal menos dos veces para confirmar los resultados,sin presentar variación en su reacción frente a los anticuerpos.
Los perfiles serológicos de los aislados de serotipo A semuestran en la tabla 7. Los monoclonales 1-2 e 1-3 no mostraron
J«suitados 56
Tabla 5. Resultados de las muestras analizadas frente a lospoliclonales específicosde serotipo de BCMV.
Asignación por serotipos de BCMV referida al total de
muestras analizadas y al total de
perfiles 1 y II (tablamuestras BCMV
9). Las 12 muestras A±Bpositivas. ( *)
no han sidocontabilizadasen los perfiles A y B por
SEROTIPO A SEROTIPO R
antisuera NL-! NY-ls
n2muestras 112 112analizadas
n2 muestras 3 2 5 5positivas
%sobreeltotal 28,5 49
Tabla 6.
separado.
A B A+B potyvirusrelacionados
rÑnuest-asanali~das 231 231 231 231
n~muestrasBCMV+ 154 154 154 154
n~nuestmsasIgnadasa 12 130 12 13cada grupo
% que representa cadagrupo frente al total de 8 8 4 8
muestras BCMV+
ninguna diferencia en cuanto a su capacidadde reconocimientodelos aislados de serotipo A, reaccionandosiempre de igual formapara todas las muestras ensayadas. El policlonal NY-lS (E—específico) reconoció cinco muestras A positivas (perfil A2), y, sinembargo, el policlonal NL5 (A-especifico) no reconoció dos muestraspositivas para los monoclonalesA-específicos (perfil A3).
Los perfiles serológicos de los aislados de serotipo B semuestranen la tabla 8. El policlonal NL-5 reconoció 11 muestrasB
positivas (perfil B3), mientras que una muestra positiva para elmonoclonal B-específicono fue reconocidapor NYI5 (perfil B2).
De las 231 muestras analizadas con los monoclonales, 10reaccionaron positivamente frente a los tres anticuerpos A y Bespecíficos, considerándosecomo posibles infecciones mixtas poraislados de ambos serotipos. El perfil de las muestras A+B y otros
perfiles atípicos de algunas muestras se reflejan en la tabla 9. Deestas 10 muestras, 6 fueron reconocidas también por lospoliclonales específicos y por el monoclonal de amplio espectrobc-
197 [perfil (A+Bflj, mientras que 2 de ellas no fueron reconocidaspor los policlonales [perfiles (A+B)2 y (A+B>3], y una, además,
tampoco por el monoclonal de amplio espectro (A4-B>3. Las dos
muestras de perfil (A+R~4 fueron reconocidas por todos los
anticuerposmonoclonalesy policlonales excepto por bc-197. Estas 4últimas muestras podrían considerarsecomo infecciones mixtas por
aislados A y B no reconociblespor alguno de los anticuerpos.Entre las muestras ensayadas, hubo 11 que resultaron
positivas para el monoclonal anti-PTY, y no fueron reconocidaspor
ninguno de los anticuerpos monoclonales específicos de serotipo,pero sí por el monoclonal de amplio espectro bc-197 (II), y 2muestras igualmente potyvirus positivas que fueron reconocidaspor los dos policlonales, y no por los monoclonales (1). Estas 13
últimas muestras podrían estar infectadas por otros potyvirusestrechamente relacionados con BCMV, reconocibles por los
policlonales y el monoclonal de amplio espectro (Mink y Silbernagel,
1992), pero no por los monoclonalesespecíficosde serotipo.
5~gsutttLtos 58
Tabla 7. Perfiles serológicos de losmonoclonal; P: policlonal; A: serotipoespecífico: ae: amplio espectro.
aislados de serotipo A.A-específico; B: serotipo
M-ae M-A M-A P-A M-E P-B
PERFIL 1 anti- 197
IPTY
1-3 1-2 NL-5 15E5 NY-15
muestmsE E E E E - 2
Tabla 8. Perfiles serológícos de los aislados de serotipo B. NR:ensayo no realizado. M: monoclonal; P: policlonal; A: serotipo A
específico; B: serotipo B-especifico; ae: amplio espectro.
M-ae
P!~NEi antí- 197PTY
M-B M—A M—A P-B P-A
t5E5 1-3 1-2 NY-lS NL—5
musmsB + + + — - NR NR 90
+ + + - - + - 28
+ + + - - - - 1
133 + + + - - + +1± 11
Tabla 9 Perfiles serológicos de las muestras A+B, y otros perfilesatípicos.NR: ensayo no realizado.M: monoclonal; P: policlonal; A: serotipo A—específico; B: serotipo B-específico; ae: amplio espectro.
Tabla 10. Datos de los aislados caracterizadoscomo cepas deBCMV.
N2 DE AISLADO ¡ PROCEDENCIA ¡ SEROTIPO ¡ CEPA
J-31 León B Fla/US5
J-51 León A NL3
J-53 León A NL3
J-56 León A NL3
J-63 León B Fla/US5
J-73 Pontevedra B Fla/U55
J-77 Pontevedra B NL4
J-84 Pontevedra A NL3
J-90 Pontevedra A NL3
2.2. Caracterizaciónbiológica de aislados
Según las reacciones diferenciales de los cultivaresindicadores propuestos por (Drijfhout, 1978) frente a los distintosaislados de BCMV, interpretadasmediante observaciónde síntomasy ELISA, se realizó la caracterizaciónde las cepas presentesennueve aislados de BCMV procedentesde dos de las zonas españolasmuestreadas.El número de aislado, la procedenciay el serotipo, así
como la cepa determinadaen cada caso se muestra en la tabla 10.Los 5 aislados de serotipo A caracterizadospresentaron un
comportamiento biológico idéntico al descrito para la cepa NL3,mientras que uno de los aislados de serotipo B fue identificadocomo cepa NL4. y 3 de ellos como Fla/U55.
3. CLONACION Y SECUENCIACION DE LOS GENES DE LAPROTEíNA DE LA CAPSIDA Y REGION 3’ NO CODIFICANTE DEDOS AISLADOS DE BCMV
Una vez identificada la presenciade aislados pertenecientesalos dos serotipos de BCMV en España, se abordó la donación ysecuenciación de] gen de la proteína de la cápsidade un aislado de
cada serotipo. con el fin de disponer de información molecular quepermitiese el diseño de estrategiasde control, y de poder realizaranálisis comparativos con otros potyvírus.
Los aislados escogidospara este estudio fueron: i) el aislado J-56 de serotipo A, procedentede León, y caracterizadocomo la cepa
NL3 del virus, y u) el aislado J-8 de serotipo B, procedente deValladolid. Ambos aislados se multiplicaron en los cultivaresBountiful y Garrafal Oro respectivamente.La purificación del virus
se realizó según Moghal y Francki (1976), y el rendimiento,determinado por espectrofotometría, osciló entre 1-5 ¡g de
partículas virales por g de material vegetal. A partir desuspensionesde virus purificado se extrajo el RNA viral mediantefenolización. con un tratamiento previo con SDS (Materiales yMétodos), s se analizó en geles desnaturalizantesde agarosa,observándose una banda de aproximadamente 10 Kb. El RNA
R~su(tados 61
extraído se empleó como molde para la síntesis de DNA
complementario (c-DNA>.
3.1. Estrategia de donación
Dos característicasimplícitas a la estructura genómica de lospotyvirus fueron consideradasventajosas a la hora de diseñar laestrategiade donación de los genes de la proteína de la cápsida. En
primer lugar, dicho cistrón se encuentrasituado próximo al extremo3’ del RNA viral, y en segundo lugar, la presenciade una región
poliadenilada en el extremo 3’ permite el uso de oligo (dt comocebador para la síntesisde la primera cadenade c-DNA. La segunda
cadena se sintetizó mediante las actividades combinadas de laRNasa H y la DNA polimerasa1. La existenciade extremos romos se
asegurócon un tratamiento con la T4 DNA polimerasa.
Una vez sintetizado el c-DNA con extremosromos, se clonó enel sitio único Srna 1 del vector bluescript. La selección de los clonesrecombinantesse realizó mediante el análisis de su longitud y mapa
de restricción, y por secuenciaciónparcial. El tamaño medio deinserto obtenido fue de 1500 nt, oscilandoentre 1200 y 2800 nt.
3.2. Secuenciación del gen de la proteína de la cápsida delaislado J-8 de serotipo B
Se seleccionóun clon de un tamaño estimado de inserto de 2,5Kpb (clon 46), que, por longitud, mapa de restricción ysecuenciaciónparcial parecía contener el gen de la proteína de lacápsida. La estrategiade secuenciaciónintegrada se muestra en lafigura 10. Con el fin de delimitar lo más posible la extensión del
clon a dicho gen, se realizó una primera subclonacióndel fragmentoEco Rl, de aproximadamente1 Kpb, en el sitio único Eco Rl de
bluescript, generándoseel clon El. El inserto de El, utilizado comosonda en experimentosde hibridación tipo “dot blot” hibridó con el
extracto vegetal del aislado J—8.
Paralelamente se efectuó la religación del clon originalconteniendo el fragmento restantede 1,5 Kpb (clon E2).
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Sobre el subclón El se aplicó una estrategiade delecionessolapantes de 200 ph. Para delecionar desde el extremocorrespondiente al 5’ del RNA viral, se procedió a la digestión
previa del clon con las endonucleasasde restricción Sac 1 y Bam Hl.
Las delecionesdesdeel extremo contrario, equivalente al Y del RNA
viral, se realizaron sobre el clon El digerido con Apa ¡ y Cía L
Desde el extremo 3’ se cubrió la secuenciadel subclon El con
cuatro clones delecionados,mientras que desde el extremo 5’ los
cuatro clones delecionadosobtenidos no bastaron para completar lasecuencia. siendo preciso delecionar el fragmento Nco I/Xba 1,generar extremos romos con la actividad del fragmento Klenow de
la DNA polimerasa 1, y religar el clon resultante (clon X/N); para
completar la secuenciahasta la cola de poli (A), se precisó ademásla síntesis de un oligonucleótído específico de la zona 3’ terminal
(figura 10).Por otra parte, el clon El no resultó suficiente en longitud
para cubrir el gen de la proteína de la cápsida en toda su extensión,
por lo que se subclonó el fragmento Taq 1/Cia 1 (clon T/C) de 1,2Kpb a partir del clon original de 2,5 Kpb, cubriéndosela secuencia
de esa zona en sentido inverso con el clon E2.Siguiendo la estrategia anteriormente descrita, se determinó
la secuenciade los 1160 nt 3-terminales,excluyendo la cola de poíi(A) (figura 11), y su análisis con los programas“DNA strider” y“Microgenie” mostró la existencia de una única fase de lectura
abierta, seguida de una región 3’ no codificante de 256 residuos.
3.3. Secuenciacion del gen de la proteína de la cápsida delaislado J—56 de serotipo A
Los clones recombinantesse identificaron por hibridación tipo
“colony hibridization”, utilizando como sonda el fragmento Eco Rl de
1 Kpb del aisladoJ-8 de BCMV (figura 10).Se seleccionó un clon con un tamaño de inserto de
aproximadamente1,4 Kpb (clon 54), y se efectuaron deleciones de
200 pb en los dos sentidos, previa digestión con las endonucleasas
de restricción Kpn 1 y Xho 1 para delecionar desde el extremo
equivalente al 5’ del RNA viral. Para delecionar desde el extremo 3’,
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Figura 13. Secuencianucleotídicade los 1084 residuos 3’ terminalesdel RNA del
aisJado1-56 de BCMV. El codón de STOP que marca el comienzo de la región 3’ nocodificante se ha resaltadoen negrita.
el clon 54 fue previamente digerido con Sac 1 y Ram Hl. La
estrategiade secuenciaciónse muestra en la figura 12.Con cuatro clones delecionadosdesde el extremo 3’ se cubrió
toda la secuenciadel gen de la proteína de la cápsida, y desde elextremo 5’ se secuenciaroncinco clones, pero fue precisa la síntesisde un oligonucleótido sintético para completar la secuenciade todoel gen en los dos sentidos(figura 12). De esta forma, se determinó lasecuencia de los 1084 nt 3’-terminales, excluyendo la cola de
poli(A) (figura 13). El análisis de dicha secuencia reveló laexistencia de una única fase de lectura abierta, seguida de una zona3’ no codificante de 245 residuos.
4. ANALISIS DE LAS PROTEíNAS DE LA CAPSIDA DEDUCIDASPARA LOS AISLADOS DE BCMV SECUENCIADOS
Por analogía con otros potyvirus (Dougherty et al., 1988) sedeterminó el sitio de corte predicho para la proteasa vira] Nia,
situado entre la proteína Nlb (replicasa) y la proteína de la cápsida(figura 14>.
Las proteínas deducidas para ambos aislados serian de 261
aminoácidospara el aislado J-56 (cepa NL3), y de 287 para J-8, y elgrado de identidad entre ellas es de un 75,8%, lo que supone unvalor intermedio entre los establecidospara virus distintos y paracepas, similar al 74% obtenido para aislados de las cepasNL4 y NL8(Vetten et al., 1992>. El alineamiento de las dos proteínas se
muestra en la figura 14. Se han realizado también los alineamientosde las cápsidasde J-8 y NL3 con las de NL4 y NL8 (Vetten et al.,
1992), y de dicho análisis se deduceque las cápsidas de los aislados
del serotipo A analizadas presentanun grado de identidad muchomayor que el que presentanlos aislados de serotipo B. La similitudentre NL3 y NL8 es del 98,6% (figura 15), con sólo dos sustitucionesa lo largo de toda la proteína, mientras que entre J-8 y NL4 es del90,7% (figura 16), valor que supone el límite inferior propuestopara cepasdel mismo potyvirus (Shukla y Ward, 1988), con el 71%de las sustituciones en la región N-terminal de la proteína (figura16).
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5. ANALISIS DE LAS REGIONES 3 NO CODIFICANTES DE LOSAISLADOS DE BCMV SECUENCIADOS
La región 3’ no codificante (3’ NCR) del aislado de serotipo A
(J—56, cepa NL3) tiene una extensiónde 245 nt, frente a los 256 ntdel aislado de serotipo B (J-8), y el grado de identidad entre ellos es
del 70,1% (figura 17), similar al 70,9% obtenido para NL4 y NL8(Vetten el al., 1992). El alineamiento de las 3’ NCRs de NL3 y NLS
(Vetten ci’ al., 1992) se muestraen la figura 18, y la identidad entreellas es del 96,3%. La similitud existente entre las 3’ NCRs de J—8 y
NL4 es del 98,4% (figura 19).
6. COMPARACION CON LAS PROTEINAS DE LA CAPSIDA DEOTROS POTYVIRUS ESTRECHAMENTE RELACIONADOS
Dadas las confusas relaciones descritas para BCMV y otros
potyvirus que infectan leguminosas,a nivel de gama de huéspedes,serología y mapa de péptidos por HPLC (Dijkstra y Khan, 1992;
Mink y Silbernagel, 1992; McKern ci’ al., 1992), se planteó unestudio comparativo a nivel de proteína, de las cápsidas de los dos
aislados de distinto serotipo secuenciados(J—8 y J—56) con lospotyvirus relacionados de secuencia disponible, a fin de dilucidar
posibles parentescos correlacionables con sus propiedadesbiológicas, serológicas y moleculares. La relación de los virusutilizados en la comparación,así como la fuente de sus secuenciasse
muestranen la tabla 11, y las similitudes obtenidasse recogenen latabla 12.
7. COMPARACION CON LAS REGIONES 3’ NO CODIFICANTESDE OTROS POTYVIRUS ESTRECHAMENTE RELACIONADOS
La región 3’ no codificante de los potyvirus ha sido utilizada
en comparacionesentre cepas del mismo virus, mostrandoun gradode identidad comprendido entre el 83-99%, y existiendo entrepotyvirus distintos sólo un 39-53% de similitud (Frenkel cí al.,
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1989). Se realizó una comparación,a nivel de nucleótido. entre las3’ NCRs de los dos aislados de BCMV secuenciadosy las de lospotyvirus relacionados que infectan leguminosas disponibles (tabla11), con el fin de comprobar si los valores obtenidos se manteníanen el rango de lo descrito para otros potyvirus. Los resultados,enforma de similitudes se recogen en la tabla 13.
8. ANALISIS FILOGENETICO DE BCMV
Los datos de secuenciadisponibles, tanto de BCMV como depotyvirus estrechamente relacionados que infectan leguminosas,fueron utilizados para la derivación de árboles filogenéticos, con elfin de discernir posibles relaciones evolutivas entre ellos, y aclararen lo posible la controvertida posición de los aislados de BCMV en
dicho grupo.Los nombres de los virus empleadosen este análisis, así como
el origen de las secuenciasutilizadas se recogen en la tabla 11.
Se utilizaron para este estudio dos regiones distintas perocontiguas en el genoma potyviral, la región 3’ no codificante (3’NCR), y el gen de la proteínade la cápsida.
8.1. Aplicación del test de tasa de evolución desigual
Para valorar si es adecuado asumir que las distanciasgenéticas entre las secuencias analizadas son ultramétricas (cada
antecesor común es equidistante de todos sus descendientes),supuesto asumido en estudios filogenéticos previos (Rybicki y
ShukLa. 1992), y plantear así la metodología de análisis másapropiada, se aplicó el test de tasa de evolución desigual
(Felsenstein, 1984). Se reconstruyó un árbol mediante el método demínimos cuadrados (Fitch y Margoliash, 1967) bajo dos supuestos:a) las distanciasson ultramétricas,y b) no lo son.
A continuación, se rea]izaron las sumas residuales de loscuadrados(SS). sin restricción (tabla 14, 1) columna), o asumiendoque las distancias son ultramétricas (2~ columna). El cociente[SS(reloj)-SS(sin restricción)]¡SS(sin restricción) fue computado (3~
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ultramétricas para describir la evolución de este grupo de virus.Esto puede ser debido a que los virus no han evolucionado a una
tasa constante, aunque la aplicación del test en virus RNA noimplica necesariamenteque no exista un reloj molecular, ya que,debido a sus elevadas tasas de evolución, pueden, simplemente, noser contemporáneos(o ambas cosas). En cualquier caso, estosresultados sugieren que los métodos filogenéticos utilizados para
reconstruir la evolución de estos virus no deberían asumir que lasdistancias son ultramétricas (ver Felsenstein, 1988 para discusión).
8.2. Derivación de arboles filogenéticos
El método utilizado para la derivación de árboles filogenéticos
fue el de neighbour-joining” (Saitou y Nei, 1987), que no exige quelas distancias sean ultramétricas,y es de los más eficientes (Sourdis
y Nei, 1988).Las comparaciones, en forma de distancias genéticas,
obtenidas mediante el estimador de Jukes y Cantor (1969) en elcaso de las secuenciasnucleotídicas, y por el método de Kimura(1983) para las secuenciasaminoacídicas,se muestran en las tablas15 (3’ NCRs), y 16 (cápsidas).
Algunos de los virus cuyas cápsidas se utilizan en la
comparación,no son incluidos en el árbol de 3’ NCRs, debido a lafalta de disponibilidad de dichas secuencias.
El árbol inferido para catorce secuenciasde proteínas de la
cápsida de BCMV y potyvirus relacionadosse muestra en la figura20, y el árbol derivado para ocho secuenciasdisponibles de la
región 3’ no codificante, en la figura 21.En los árboles inferidos, los nodos que no fueron significativos
por el método clásico de Felsenstein (1985), tampoco lo fueroncuando se aplicó el análisis de error de la longitud de las ramas
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proteína de la cápsida de BCMV y de potyvirus relacionados(tabla
II). Las distancias verticales son arbitrarias. Las distanciashorizontales representanel número de sustitucionespor sitio a laescala indicada en la figura. La doble línea en los puntos debifurcación representala desviación estándarde la longitud de la
rama correspondiente.‘~‘~ indica que el punto de ramificación essignificativo para a’c0,OOl y ** para acO,O1. Los puntos de
ramificación restantesno son significativos para cxcO,05.
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Figura 21. Arbol filogenético derivado de las secuenciasnucleotídicas de las 3 NCRs de BCMV y de potyvirus relacionados(tabla 11). Las distancias verticales son arbitrarias. Las distanciashorizontales representanel número de sustituciones nucleotídicas
por sitio a la escala indicada en la figura. La doble línea en lospuntos de bifurcación representa la desviación estándar de lalongitud de la rama correspondiente.*** indica que el punto deramificación es significativo para «<0,001 y * para «<0,05.
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(Dopazo, 1993), es decir, en las ramas con errores de magnitud
comparablesa sus longitudes, el punto de ramificación localizado asu derechaen el árbol no fue significativo estadisticamente.
En el árbol que describe la evolución de las proteínas de lacápsida, se separandos ramas principales, una de ellas incluyendo aBYMV y CIYVV, y la otra a los virus restantes(figura 20). El análisisestadístico permite dividir la otra rama en seis subgrupos bien
definidos (ver figura 20): el primero, constituido exclusivamente
por ZYMV-F, el segundo grupo englobando a SbMV—N y a losaisiados de WMV2, en el que se aprecia una ramificación interna
significativa para dar lugar a WMV2 Aus y US. El tercer grupo estáconstituido por los aisladosde serotipo E de BCMV (NL4 y J-8) y porPStV. Un cuarto subgrupo engloba a las dos cepas de PWV. Las
cepas de serotipo A de BCMV constituirían un quinto subgrupoindependiente, y. por último, el recientemente descrito SAPV
formaría otra rama independiente.La información contenida en laproteína de la cápsida no permitió resolver significativamente lasramas internas de esta segundarama principal del árbol.
En el árbol inferido para las 3’ NCRs (figura 21) se observa
una topología similar a la obtenida para las proteínasde la cápsida,confirmando la identidad de los subgrupos.El análisis de esta regiónreveló además la existencia de dos parentescosestadísticamentesignificativos, no apreciables en el árbol inferido para las cápsidas:i) el existente entre WMV2. SbMV y los aislados de serotipo E de
BCMV, y u) la relación significativa entre los aislados de serotipo Ade BCMV y SAPV. por lo que, al menos en el rango de distanciasgenéticasque caracteriza al grupo analizado, la 3’ NCR mostró unmayor contenido informativo que la proteína de la cápsida.
9. DETECCION DE BCMV MEDIANTE TRANSCRIPCION INVERSAY AMPLIFICACION ENZIMATICA
Dada la falta de disponibilidad de anticuerpos comerciales
específicos frente a BCMV y sus serotipos, y la complejidad dealgunos perfiles serológicos obtenidos por ELISA, difícilmente
interpretables, se desarrolló un método de detección diferencial de
I~jsuItados 86
los aislados de serotipo A y B mediante transcripción inversa y
amplificación enzimática, utilizando la información de secuenciadelos genes de la proteína de la cápsida y región 5’ adyacente(genNlb) de los aisladosJ-56 y J-8 de BCMV, y la información disponible
a nivel de proteína de las cepas NL4 y NLS de BCMV (Vetten a al.,
1992).
9.1. Diseño de cebadores específicos
El sistema de amplificación diseñadoconstó de tres cebadores:
El cebadorC de 22 mer 5’ AAATTCCGAAGAAGTCCATACC 3’,utilizado como cebador 3’ antisentido, común en las reacciones deamplificación, tanto de aislados de serotipo A como B, que se
correspondecon los nucleótidos 528-549 del gen de la proteína dela cápsida del aislado J-56, y los nucleótidos 541—562 del gen de la
cápsidadel aislado J—8, a excepciónde dos nucleótidos desapareados(545 y 551) (figura 22). En el producto de la traducción del RNAviral, la secuenciacomplementariaal cebador C mapea en el “core”de la proteína (figura 23).
El cebadorA de 21 mer, 5’ GCCCAGCGGATAAAGACGTTG 3’diseñado para actuar como cebador 5’ en la amplificación específicade aislados del serotipo A de BCMV, de secuencia idéntica alfragmento comprendido entre los residuos 65—85 del gen de la
cápsida del aislado de serotipo A J-56 (figura 22). La secuenciacorrespondienteal cebador A en el producto de traducción mapeaen la región N-terminal de la proteína de la cápsida, en la zona de
mayor diferencia a nivel de secuenciaentre las cápsidas de aisladosde distinto serotipo (figura 23).
El cebador B, de 19 mer, de secuencia 5’GATGCGGAGAATCTGTGCA 3’, correspondiente a la región
comprendida entre los nucleótidos -26 y -8 respecto al gen de laproteína de la cápsidadel aislado de serotipo B J-8 (figura 22). Esteoligonucleótido se concibió como cebador 5’ para la amplificaciónespecífica de los aislados de serotipo B. La secuencia
correspondiente a este cebador, en el producto de traducción,mapea fuera de la cápsida. en la zona C-terminal de la proteína NIb,adyacente a la región de reconocimientode la proteasa viral, con
Resultados 87
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Figura 22. (A) Cebadores A y C sobre la secuencia de los 1084 nt3’ terminales del clon 54 del aislado J-56.CebadorA: 5’ GCC GAG CGG ATA MG ACG UG3’CebadorC: 5’ AAA VEO CGA AGA AGT CCA TAO 03’(B) CebadoresB y C sobre la secuenciade los 1160 nt 3’ terminalesdel clon 46 del aislado J-8.Cebador13: 5’ GAT GCGGAG MT CTG TGC A 3’CebadorC: 5’ AM TTC CGA AGA AGT CCA TAO 03’
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EN
grandes diferencias a nivel de secuenciaentre aislados de distintoserotipo (figura 23).
Los oligonucleótidos A, B y C fueron analizadoscon la ayuda
del programa OLIGO TM, siendo el producto de amplificaciónesperadocon los cebadoresA y C de 484 ph, y de 652 pb con B y C.
9.2. Amplificación de aislados de serotipo A y 8 de BCMV
El análisis por electroforesis en geles de agarosa,del 15-25%
del volumen de las reaccionesde amplificación de los ensayos deRT-PCR y de PCR-INIA, realizadossegún se describe en Materiales yMétodos, con la pareja de cebadoresAIC mostró la presenciade una
banda del tamaño esperado(484 pb) en las muestras de hoja dejudías infectadaspor aislados del serotipo A de BCMV (figura 24).
No se obtuvo banda alguna en los controles de planta sana ni en lasmuestras de plantas infectadas por aislados de serotipo 13 (figura24). Con los cebadoresA/C se amplificó, igualmente, un aislado de la
cepa NLS (CIAB, así como diversos aisladosde serotipo A recogidosen distintas zonas de España(figura 24).
En algunos ensayos de RT-PCR, directamente en el extractovegetal, con el par de cebadores A/C, a partir de muestras
infectadas con BCMV de serotipo A, se observaronalgunas bandasadicionales a la esperada,siempre mayoritaria, también de origenviral (figuras 29Ay29B).
Con el par de cebadoresB¡C se realizaron ensayosde PCR en
las mismas condiciones, con muestras de hoja de judías infectadascon aislados de serotipo B de BCMV. El único producto deamplificación observable fue una banda de migración equivalente altamaño de DNA esperado(652 pb). No se produjo amplificación enningún caso a partir de muestras infectadaspor aislados de serotipoA ni de los controles sanos(figura 25).
Entre las muestras amplificadas con los cebadores B¡C seencuentran diferentes aislados recogidos en distintas zonas de
España(figura 25 A), aislados de las cepas NL4, Fía y NY15 y unaislado italiano de BCMV (ver Materiales y Métodos). En el caso deNYI5 se observó una banda adicional de tamaño inferior al
esperado (figura 25 B).
R~suÑaJos 90
Algunos potyvirus estrechamente relacionados con los
aisladosde serotipo B de BCMV (Rybicki y Shukla, 1992: Sáiz et al.,
1993) se incluyeron en las reaccionesde PCR (ver Materiales yMétodos), en las mismas condiciones, no obteniéndose ningún
producto de amplificación con BYMV, PWV, WMV 2, ni CIYVV. En elcaso de PStV se observó la banda esperadade 652 pb, así como una
serie de bandas adicionales. La amplificación en este últimoconfirma el alto grado de parentescoentre PStV y los aislados deserotipo B de BCMV (Rybicki y Shukla, 1992: Sáiz e¿~ al., 1993).
Mediante el grupo de cebadores descrito anteriormente, se
consiguió la amplificación de aislados de serotipo A y B de BCMV apartir de lotes de semillas infectados procedentesdel País Vasco(ver Materiales y Métodos). Para estos ensayos, la harina de las
semillas (en grupos de 5 a 10), trituradas en seco, fue resuspendida
y diluida en el tampón apropiado(según se tratasede RT-PCR o dePCR-INIA), siguiéndoseel mismo protocolo de transcripción inversay amplificación que para las muestras de hoja. En la figura 26 seobservan las bandas obtenidas, equivalentes a las observadasconmuestras de hoja.
Para simplificar la determinación de los serotipos de BCMVpresentesen una muestra, se realizaron reaccionesmixtas con los
cebadoresA!B/C para conseguir la amplificación de aislados de losserotipos A y 8 en un único ensayo, utilizando una mezcla demuestras de distinto serotipo, tanto de hoja como de semilla. Cadamuestra, por separado,fue sometida, como control, a la reacción de
amplificación con los cebadores específicos de su serotipo. Lasbandas observadascomo producto de amplificación se correspondencon los tamaños esperados(652 y 484 pb), y su migración esequivalente a la de las bandas obtenidas en las reaciones de
amplificación independientede cada una de las muestras con loscebadoresA/C y B/C (figuras 26 y 27).
9.3. Especificidad de los productos de amplificación
La especificidad de los productos de amplificación se
comprobó mediante hibridación tipo “Southern”, usando comosonda, en el caso de los aislados de serotipo A el fragmento KX54
Resultados 93
(figura 28) marcado con digoxigenina. En la figura 29 se observa
que la sonda hibridó con las bandas cuya movilidad correspondíaala del tamaño esperado (484 pb), e incluso con las bandasadicionales obtenidas en algunos ensayos de RT-PCR, sin apreciarseseñal alguna en los caniles correspondientesa las muestrassanas.
Usando como sonda el fragmeto BS46 (figura 30) marcado con
digoxigenina se comprobó la especificidad de los productos de
amplificación de los cebadoresBIC (aislados de serotípo B) (figura31). En este caso tampoco se observó señal en ¡os controles sanos,pero sí en las bandasde tamaño esperado(652 pb).
9.4. Sensibilidad de los ensayos
Para determinar el límite de detección en los ensayos de
amplificación enzimática, se realizaron diluciones seriadas delextracto vegetal de hoja o de semillas de judía infectadascon BCMV.Se escogieronpara ello muestrasde distinto serotipo con valores de
absorvanciasimilares en ELISA.En el sistema diseñado, las diluciones mínimas de los extractos
vegetales para conseguir amplificación mediante RT-PCR, que
coníleva la presencia de elementos inhibidores de la hibridaciónpresentes en estos durante todo el proceso (Maule a a/., 1983; Borja
y Ponz, 1992), fueron 1/100 para hoja y 1/1000 para semilla.
Los resultados de las comparaciones obtenidos para las
parejas de cebadores A/C y BIC mediante RT-PCR y PCR-INIA semuestran en la tabla 17. Con el par de cebadoresA/C se llegó adetectar el virus a la dilución 1010 (p/v) de hoja infectada,obteniéndoseel mismo resultado en PCR-INIA y RT-PCR, lo queequivale a 10 pg de material infectado en el primer caso, y a 1 pgen el segundo. Con muestrasde semilla se llegó a detectar lng dematerial infectado mediante RT-PCR y 100 pg por PCR-INIA (figura
32).Con la pareja de cebadoresB/C se llegó a amplificar aislados
de serotipo B a partir de hoja hasta la dilución 108(p/v) por PCR-INIA y 10-” mediante RT~PCR (figura 33), valor este últimoequivalente a 0,1 pg de material infectado. A partir de semilla la
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cantidad mínima de material infectado detectable fue de 10 ng enambos casos.
En experimentos de ELISA paralelos con el monoclonal anti-
potyvirus (anti-PTYi. utilizado a igual concentraciónque en la fasede inmunocaptura de PCR-INIA, el límite de dilución de los
extractos de hoja y de semilla infectados por BCMV (ambosserotipos), fue de l0~5(p/v) y 10-~ respectivamente,lo que equivalea 1 ag de hoja y a 10 gg de harina.
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y. DISCUSION
1. Estudio epidemiológico de BCMV
El virus del mosaico común de la judía (BCMV) es considerado
como uno de los patógenos más comunes e importantes que afectan
al cultivo de judía a nivel mundial, ya que su distribución abarcaloscinco continentes, y su dispersión se ve favorecida por su elevadoporcentaje de transmisión por semilla (Morales y Bos, 1988).
Tomlinson (1987) lo consideró, en cuanto a importancia por
pérdidas económicas, como el segundo en Italia y Portugal, eltercero en Suecia, y el cuarto en China, en un estudio en cultivos
hortícolas en 28 paíseso regiones con clima templado.En España, a pesar de la constante presencia en campo de
síntomas similares a los descritos para BCMV, así como las
importantes disminuciones de rendimiento en la cosecha atribuidaspor los agricultores a estos síndromes, no se había realizado demanera sistemáticaun estudio de diagnóstico viral en muestras de
judía, que confirmara la presenciade BCMV en campo.Los resultados del estudio epidemiológico realizado en
diversas zonas productoras de once provincias españolas, revela la
elevada incidencia de infecciones producidas por potyvirus (75% delas muestras analizadas’) en el cultivo de judía, siendo BCMV el
potyvirus más frecuente, ya que el 81,5% de las muestrasinfectadaspor potyvirus lo fueron por BCMV. La presenciade otrosvirus, como CMV fue detectada en algunas de las muestras
analizadas, y en ocasiones, produciendo infecciones mixtas con
BCMV (ver anexo 1), mientras que sólo se identificó un aislado deBYMV en un cultivar de judía de verdeo en la provincia de Madrid.
En algunas muestras procedentes de Almería se detectaron
infecciones por el virus del bronceadodel tomate (TSWV).Los aislados de BCMV han sido tradicionalmenteagrupadosen
dos serotipos, que engloban, por un lado, a las cepas inductoras denecrosis en cultivares con el gen 1 de necrosis (serotipo A), y por
otro, a las cepas inductoras de mosaico (serotipo B). En este trabajo,
se ha realizado la caracterizaciónserológicade los aisladosde BCMV
tVL<¿usión 104
identificados en las muestras de campo, y es importante destacarlapresencia de aislados de serotipo A, descrita por primera vez enEspaña, en cuatro de las once provincias en las que se tomaron
muestras. La incidencia de este tipo de cepas parece ser muyinferior a la de los aislados serotipo B. Sin considerar las posiblesinfecciones mixtas, un 8% de los aislados de BCMV identificados
pertenecieron al serotipo A, frente al 84% de los aislados deserotipo B. El 8% restante estuvo constituido por muestras quereacionaron frente a los dos monoclonales A y 13 específicos,pudiendo tratarse de infecciones mixtas por aislados de los dos
serotipos.La diversidad de los perfiles serológicos obtenidos pone de
manifiesto la complejidad intrínseca a los hasta ahora denominadosaislados de serotipo A y B de BCMV. En función de sucomportamientoen ELISA. un 6% de las muestras analizadaspuedeconsiderarse formado por infecciones producidas por potyvirusrelacionados en mayor o menor grado con BCMV, ya quereaccionaron positivamente frente a los anticuerpos políclonales y/oal monoclonal de amplio espectrode BCMV. Por otra parte, están
descritas reacciones de] anticuerpo monoclonal de amplio espectropara BCMV bc-197 frente a PStV, AzMV, BICMV y CABMV, y delmonoclonal serotipo B-específico 15E5 frente a los tres primeros(Mink v Silbernagel, 1992), lo que dificulta la identificaciónespecífica mediante ensayos serológicos,de los aislados de serotipo13 en sentido estricto, ya que estos potyvirus estrechamenterelacionadosestán entre los miembros del propuesto subgrupo de
BCMV (Dijkstra y Khan, 1992; McKern et al., 1992), que en un
futuro próximo quizá englobe a todos estos potyvirus bajo ladenominacióncomún de un único virus o subgrupo de virus.
La problemática interpretación de los análisis serológicosutilizando exclusivamenteanticuerpospoliclonales en el caso de lospotyvirus (Shukla et al., 1988b) se hace patente en los resultadosde este trabajo: el 58% de las muestras de serotipo A fueronreconocidasen ELISA por el policlonal 13-específico,y el 29% de lasmuestras de serotipo E por el policlonal A-específico. Aunque no sedescarta que, asignando los serotipos a las muestras exclusivameteen función de las reaccionesfrente a los monoclonales específicos,
tfliscusión 105
se esté perdiendo alguna muestra con epítopos no reconocibles porel monoclonal específico, la diferenciación de serotipos basada enlas reacciones frente a policlonales se excluye claramente,así comola ya de por si compleja diferenciación de aislados de serotipo B
frente a potyvirus relacionados.La caracterizaciónbiológica de aislados de BCMV puede tener
un interés práctico en programas de mejora genética clásica, quefacilite la elección, entre los genes de resistencia descritos, deaquellos a introducir en las líneas de interés, en función de lascepas del virus presentesen cada zona. Un estudio epidemiológico
amplio debería ser una labor previa al abordaje de líneas deselección y mejora, ya que de otra forma, la resistenciaconseguidapodría verse vencida en poco tiempo por las cepas presentesen laregión, sin tener en cuenta la posible introducción de nuevos
aislados.El sistema propuesto por Drijfhout (1978), aceptado
internacionalmente(Drijfhout u al., 1978), diferencia cepas segúnsu comportamientofrente a once grupos de cultivares de Phaseolus
vulgaris con distintos genotipos de resistenciapara BCMV. Estesistema puede presentar un gran número de indeterminacionesen
el caso de infecciones mixtas por más de una cepa, llegándose a
situacionesdifícilmente interpretables, o simplemente, escapes porenmascaramientode unas cepas con otras (ver tabla 2). Por otraparte, no es extraño encontrar en la literatura referencias acerca deaislados de BCMV con comportamientosatípicos al ser inoculadossobre el grupo de cultivares indicadores (Silbernagel u al, 1986;Mattos y Fernández,1987>, difícilmente asignables a alguna de lascepas, o bien produciendo síntomas distintos a los descritos en
algunos grupos. Sólo ha de considerarse,por tanto, como un sistema
indicativo, y en ningún caso cerrado, para la clasificación de cepasdel virus.
Los datos de caracterizaciónbiológica de aislados de BCMVobtenidos en este trabajo muestran que NL3 podría ser la cepa de
serotipo A prevalente en las regiones muestreadas,ya que los cincoaislados caracterizados, procedentes de dos provincias distintas,
mostraron un comportamiento idéntico al descrito para esta cepa(Drijfhout u al., 1978). En cuanto al serotipo B, los cuatro aislados
flkc~Ñ¿n 106
analizadosfueron identificados como cepas NL4 y U55 (Fía). Dada lalimitación numérica de este ensayo biológico, no se descarta enabsoluto la presencia de otras cepas del virus en los aislados decampo españoles,aunque sí sorprende la baja representaciónde las
al menos diez cepas distintas descritas para el virus. Cabe pensar enun fenómeno de competenciao colonización de una o un pequeñonúmero de cepas del virus en una zona concreta, aunque laconfirmación de esta hipótesis requeriría la caracterizaciónde un
número más elevado de aislados procedentesde cada una de laszonas estudiadas.
En resumen, la elevada presencia de los dos grandes grupos
de cepasde BCMV en los camposde judía españoles,hace necesarioel planteamiento de unas normas estrictas de circulación dematerial vegetal libre de virus, especialmentesemillas, ya que es
sabido que la infección por BCMV de lotes de semilla constituye uninóculo primario en los campos, que posteriormete es dispersadopor los áfidos vectores de manerano persistente(Klein et al., 1989),siendo también frecuente la introducción, a través de semillasinfectadas, de nuevas cepas del virus en zonas donde se habíanintroducido por mejora genes de resistencia frente a las cepas“domésticas” del virus, produciéndose pérdidas económicasimportantes (Providenti et al., 1984).
La aplicación de los métodos de diagnóstico disponibles, asícomo el desarrollo de nuevas técnicas más sensibles, han de ser
objetivos importantes en el control de este potyvirus, así como elabordaje biotecnológico que permita la generación de nuevas
formas de resistencia.
2. Secuenciación del gen de la cáps¡da y región 3’ no codificantede dos aislados de distinto serotipo de BCMV
La falta de información molecular suficiente para aportar
nueva luz en la aparentecomplejidad existente entre los aislados deserotipo A y 13 de BCMV, así como el abrir nuevas vías quepermitieran el desarrollo de estrategias de control, hizoespecialmenteinteresante el proyecto de secuenciaciónparcial de
tfliscusit$n 107
un aislado perteneciente a cada serotipo. Se secuenciaron los
extremos3’ de los RNAs genómicosde los aisladosJ-8 de serotipo B,de Valladolid, y del aislado J-56 (cepa NL3), de León, abarcandoel
gen de la proteína de la cápsida y la región 3’ no codificante (3’NCR).
El gen de la proteína de la cápsidaha sido hasta el momento el
de mayor peso en la clasificación taxonómica de potyvirus (Ward yShukla, 1991; Ward et aL. 1992). Shukla y Ward (1988) observaron,comparando las secuencias aminoacídicas de las cápsidas de 17cepas de 8 potyvirus distintos, que la similitud de secuencia seajustaba a una ditribución bimodal, con similitudes comprendidas
entre 38-71% para distintos potyvirus, con la mayor variabilidadconcentradaen el extremo N-terminal de la proteína, y de un 90-99% para cepasdel mismo potyvirus.
El grado de similitud encontrado entre las proteínas de lacápsida de J-8 y NL3 fue de un 76%, similar al 74% obtenido para
las cepas NL4 (serotipo 13) y NL8 (serotipo A) secuenciadasporVetten ¿a al. (1992), lo que representa unos valores intermedios
entre los propuestospara cepas y para virus distintos. Estos últimosautores lanzaron la primera propuesta para considerar a las cepasenglobadasen los dos serotipos como dos potyvirus indepedientes.
En cuanto al grado de identidad existente entre cápsidas de
aisladosdel mismo serotipo, se obtuvo un 90,7% para los aisladosdeserotipo B, J-8 y NL4, y un 98,6% para los de serotipo A de las cepasNL3 y NL8. Estos valores parecen indicar que la proteína de la
cápsida de los aislados de BCMV-A está muy conservada,produciéndose sólo dos sustituciones aminoacídicas a lo ¡argo de
toda la proteína. Este último dato fue también observado porMcKern er al. (1992), mediante el estudio de perfiles de HPLC.
Los valores de similitud existentes entre las cápsidas de losdos aislados de serotipo B, J-8 y NL4 (90,7%), plantean el problemade estar en el límite de los valores propuestos,ya que se consideraun 90% de identidad como el mínimo para ser consideradoscepasdel mismo potyvirus. La cápsida en estos aislados no parece estar
muy conservada, especialmenteobservando el extremo N-terminalde la proteína, donde mapeael 71% de las sustituciones.
‘L7ISCUSÍÓi-I 108
Es de destacar el elevado grado de identidad observadoentreJ-8 y PStV (91,3%), similar, e incluso ligeramente superior al
existente entre J-8 y NL4 (90,7%), y entre NL4 y PStV (89,5%),sugiriendo la reconsideraciónde PStV como una cepa de BCMV. Unavez mas, se pone de manifiesto la complejidad implícita a lostradicionalmente considerados como aislados de serotipo B de
BCMV.
Con respecto a la región 3’ NCR, Frenkel a al. (1989),
comparando las secuenciasde 13 cepas de 7 potyvirus distintos,observaron similitudes comprendidasentre 83-99% para cepas delmismo virus, y entre 39-53% para virus distintos. Los valoresobtenidos en este trabajo para los aislados de distinto serotipo
secuenciados(J-8 y NL3) fue de un 70%, similar al 71% encontradopara los aislados de las cepas NL4 y NLS (Vetten a al., 1992).Nuevamente,estos valores caen en una zona intermedia entre lospropuestos para cepas y para virus distintos, mientras que
analizando las 3’ NCRs de aislados del mismo serotipo, se obtienenvalores mucho más altos, tanto en el caso de J-8 x NL4, con un98.4% de identidad, como en el de NL3 y NLS, con un 96,3%. Esteúltimo resultado parece indicar que la 3’ NCR está bastante
conservadaentre aislados del mismo serotipo, incluso en los deserotipo B, a diferencia de Jo observadopara la cápsida.
La información molecular de este grupo de virus, pone demanifiesto que el sistema y criterios de clasificación de potyvirus ysus cepas no son aplicables en muchos casos de manera directa,atendiendoa los valores de similitudes de la proteína de la cápsiday 3’ NCR. Frenkel ci al. (1991) encontraron una inesperadadiversidad en la secuenciadel extremo N-terminal de la cápsida de
dos cepasdei virus del mosaicode la caña de azúcar, SCMV (SCMV-SC y MDMV-B). de maneraque, considerandola proteína completa,la identidad de secuencia entre ellos era del 77%, situándolasclaramente como virus distintos, mientras que si se prescindíade la
zona altamente variable, de 44 y 59 residuos respectivamente,elvalor obtenido era del 92%, asignable a cepas del mismo potyvirus.No parece acertado, por tanto, considerar estos valores de similitud
de una manera absoluta para la asignación de parentescos,siendopreciso un análisis más detallado de la distribución de las
‘Discusión 109
diferencias, y no descartándose,a medida que vaya siendodisponible la información de secuencia de un mayor número deporyvirus, como se pone de manifiesto en los resultados de estetrabajo, la existencia de valores claramente intermedios entre lospropuestos, no ajustables directamente a la distribución bimodal(Shukla y Ward, 1988).
En resumen, la compleja interpretación de los valores
obtenidos, indica que la clasificación de aislados de este virusrequiere un estudio comparativo más amplio, como el que se
propone a continuación, introduciendo en el análisis otros pot~virusestrechamente relacionados, e intentando establecer un marcoevolutivo y taxonómico en el que las relaciones de los aislados de
BCMV queden mejor definidas.
3. Análisis filogenético de BCMV
La inferencia de relaciones filogenéticas a partir de datosmoleculares requiere la aplicación de una metodología apropiada de
entre todas las técnicas descritas. La extrapolación directa de losmétodos aplicados a organismos eucarióticos al caso de los virus
cuyo genoma es RNA ha conducido a una serie de erroresconceptuales,implícitos a los planteamientosdel análisis, como es el
caso de asumir la existenciadel equivalentea un reloj molecular enla evolución de los virus (Rybicki y Shukla, 1992). El supuesto
anterior implica que la tasa de evolución de los individuosanalizados ha sido constante, y las diferencias en las fechas deaislamiento despreciables,y que, por tanto, las distancias genéticasexistentes entre ellos tienen propiedades ultramétricas, es decir,
que cada antecesor común es equidistante de todos sus
descendientes.En el caso de los virus RNA, a diferencia de los organismos
eucariotas, dadas sus elevadas tasas de evolución (Domingo yHolland, 1988), incluso en caso de existir un reloj molecular, lasdistancias podrían no ser ultramétricas por el mero hecho de quelos aislados no fueran contemporáneos.
V&usio~ 110
El considerar que la distancias genéticas son ultramétricas, ono, conlíeva grandes diferencias en la metodología a aplicar en elanálisis filogenético, por lo que, en el caso de las secuenciasde laproteína de la cápsida y 3’ NCRs de BCMV y los potyvirus queinfectan leguminosas más relacionados, se realizó previamente eltest de tasa de evolución desigual (“inequality rate test”)
(Felsenstein, 1984), cuyo resultado indica claramente que no sepuede asumir que las distancias genéticas existentes entre lassecuenciasanalizadassean ultramétricas. Este resultado descarta laaplicación de métodos de reconstrucción filogenética de la familiadel UPGMA (Sokal y Rolfh, 1981). escogiéndosepara la derivaciónde árboles filogenéticos el método de “neighbour-joining” (Saitou yNei, 1987> por su eficiencia (Sourdis y Nei, 1988).
Otro punto de discusión es la aplicación del análisis estadísticoen la reconstrucción filogenética, que permite evaluar la fiabilidadde los árboles inferidos y la significación de cada uno de los nodos
de éste, estableciéndoseasí un entorno de parentescosestable, en elque se puede situar un nuevo aislado de manera rápida y fiable(Felsenstein, 1988).
En el estudio filogenético realizado en este trabajo, se
incluyeron las secuenciasde los dos aislados españolesde BCMVsecuenciados,los dos secuenciadospor Vetten el al. (1992), y 10aislados de potyvirus que infectan leguminosas,consideradoscomorelacionadoscon BCMV.
En el árbol inferido para las proteínas de la cápsida seaprecian dos grandes líneas: una de ellas constituida por BYMV yCIYVV, y otra, que comprendeal resto de los aislados. Dentro deesta segundalínea, los aisladosde serotipo B de BCMV formarían ungrupo aparte, junto con PStV, e independientedel grupo constituido
por las cepas de serotipo A. La información contenidaen la cápsidano permitió, si embargo, resolver significativamente el orden deramificación de las sublíneas.
En el árbol inferido para las 3’ NCRs disponibles se observóuna topología similar al de las cápsidas, confirmándose así laidentidad de los grupos, y revelando la existencia de dos relaciones
de parentesco,no apreciables en el árbol de las proteínas de lacápsida, que eran estadísticamentesignificativas: la existente entre
‘Discusión 111
WMV2, SbMV y los aislados de serotipo 13, por un lado, y, por otro,la de las cepas del serotipo A con el recientementedescrito SAPV,
con el que constituyen una línea independiente.La región 3’ NCR de los potyvirus ha sido consideradade
utilidad para resolver parentescosentre cepas del mismo potyvirus(Frenkel ¿a al., 1991), e incluso se han establecido subgruposen
base a la presencia de secuenciasconsenso en esta zona (liyeda1992). Rodríguez Cerezo el al. (1991) describieron que unainserción de 58 nt en una estructura tipo tallo-bucle (“stem-loop”)en la 3’ NCR del virus del moteadode los nervios del tabaco (TVMV)atenuaba la expresión de síntomas, localizando de este modo undeterminante de gravedad de síntomas en esta región del genoma.
Por otra parte, Van Der Vlugt ci’ al- (1993), realizando un análisis deestructura secundariade RNA de las 3’ NCRs de 12 aisladosde PVY,
encontraron cuatro estructuras tipo tallo-bucle en las que lassecuenciasde los bucles daban un agrupamientosimilar al obtenidocomparando sus cápsidas y sus 3’ NCRs completas, sugiriendo unasiznificación biológica para estos elementos estructurales.A pesar
de su todavía muy desconocido,pero claramente importante papel
en el ciclo biológico del virus, esta zona ha sido consideradairrelevante para establecer parentescos entre potyvirus distintos(Frenkel ci’ al., 1991: Rybicki y Shukla, 1992). Los resultados
obtenidos en el análisis de las 3’ NCRs de BCMV y pot~virusrelacionados pone de manifiesto una situación muy distinta: almenos en el rango de las distancias genéticas que caracterizan algrupo analizado, la región 3’ no codificante mostró un contenidoinformativo mayor que la proteína de la cápsida, sugiriendo para
esta zona del genoma un papel de mayor relevancia en los estudiosfilogenéticos y, por tanto, de mayor utilidad en los criterios
taxonómicos aplicables a potyvirus.La complejidad evidente en las interrelacionesde los aislados
y cepas de BCMV con los potyvirus de leguminosasanalizados, y elhecho de que filogenéticamente los aislados de distinto serotipo
estén más próximos a otros virus que entre sí. hace necesaria unarevisión en profundidad de la posición taxonómica de dichos
aislados. Parece razonable la propuestade considerarlosen conjuntocomo un subgrupo (Dijkstra y Khan, 1992) en el que habría que
qhscusict 1 1 2
definir las entidades consideradas como virus independientes, ydonde claramente coexistirían al menos dos potyvirus distintos,incluyendo a los aislados de serotipo A y 13 de BCMVrespectivamente.
4. Detección de BCMV mediante transcripción inversa yamplificac¡ón enzimática
La tecnología asociada a la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (Saiki u al., 1985) ha sido extensivamente
aplicada como método de amplificación “in vitro” de genomasvirales, tanto constituidos por DNA (Rybicki y Hughes, 1990;Pasamontesu al., 1991; Soler u aL. 1991), como por RNA, en cuyocaso se introduce un paso previo de transcripción inversa (RT-PCR)(Vunsh 1990; Jones 1991; Korschineck ci al., 1991; Nicolas y
Laliberté. 1991; Robertson ci al., 1991). Un método de amplificaciónde amplio espectro de potyvirus mediante cebadoresdegenerados
fue descrito por Langeveld ci’ al. (1991).Kohnen ci al. (1992) desarrollaron el primer sistema de
detección específicapor PCR de un virus transmisible por semilla,
en concreto del patotipo Pl del virus del mosaico del guisantetransmitido por semilla (PSbMV), a partir de extractos de hojas,raíces. pétalos, polen y distintas partes de la semilla. En estetrabajo. un resultado sorprendente fue la amplificación a partir deextractos de ejes embrionarios de semillas procedentesde plantasinfectadas, pero no de las testas o cubiertas seminales, que eran
positivos en ELISA.En un sistema tan complejo y heterogéneocomo es el de los
aislados virales clásicamenteconsideradoscomo serotipos A y B deBCMV. resultaba especialmente sugerente el desarrollo de un
sistema específico de amplificación diferencial de ambos grupos,teniendo en cuenta, además, la difícil interpretación del
comportamientoserológico de los aisladosde serotipo B debido a lasnumerosas reacciones cruzadas en ELISA con otros aislados
potyvirales estrechamenterelacionados.
rfliscusión 11 3
Por otro lado, el disponer de un método sensible de detección
de este virus, que permitiese la identificación específicaen lotes desemilla, proporcionaría una herramienta eficaz en su controlepidemiológico.
En este trabajo, mediante un sistema constituido por trescebadores(A, B y C), se ha conseguido la amplificación diferencialde los dos grupos de aislados, a partir de muestras de hoja y
semilla, así como la amplificación simultánea de aislados de ambosserotipos en un único ensayo.
La metodología aplicada a los ensayos de amplificaciónenhimática no conileva ningún tipo de extracción de ácidos nucleicosprevia, y está basadaen a) realización de la transcripción inversa
y PCR directamente en el extracto vegetal de hoja o semilla
(referido en este trabajo como RT-PCR), siguiendo básicamenteelprotocolo descrito por Borja y Ponz (1992); b) la inmunocapturaprevia de las partículas virales por adsorción a un soporte sólidomediante anticuerposespecíficos(PCR—INIA, Nolasco ¿a al., 1993).
La comparación de las técnicas de detección utilizadas es untema delicado, ya que, en el caso de ELISA frente a PCR, se trata de
la detección de proteínas virales, y de ácidos nucleicos en el
segundo caso. Incluso entre los dos protocolos de PCR utilizadosexiste una diferencia importante, que es la introducción de un
anticuerpo en uno de ellos, cuyas característicasy concentración
pueden ser variables adicionales. Resulta indicativo, no obstante,realizar una visión global e integradade los resultados,con el fin devalorar la “aplicabilidad” de cada una de las técnicas, partiendo dela premisa de que todas ellas tienen validez por sí mismas, y
pueden ser utilizadas de manera reproducible y fiable en eldiagnóstico de virus.
La cantidad mínima de material infectado detectable varió en
función del protocolo seguido, de la combinación de cebadores, y del
tipo de extracto (tabla 17). Con la parejade cebadoresA/C se llegó adetectar 1 pg de material vegetal infectado procedente de hoja, sinapreciarse diferencias en cuanto al protocolo de amplificaciónseguido. Sin embargo, tratándose de extractos de semillasinfectadas, se observó una diferencia de dos órdenes de magnitud afavor del método que conlíeva inmunocaptura (PCR-INIA). Este
tDiscusi¿in 114
resultado se repitió en el caso de los cebadores BIC, aunque la
diferencia fue algo menor, de un orden de magnitud. Sin embargo.
los ensayos de RT-PCR con los cebadoresB/C a partir de muestrasde hoja, resultaron ser tres órdenes de magnitud más sensibles que
los paralelos de PCR-IN1A, lo que supone el límite máximo dedetección alcanzado, una dilución 1011, equivalente a 0,1 pg dematerial vegetal, valor muy inferior a los 60 gg de material
infectado por el virus del cascabeleodel tabaco (TRV) detectados
por Robinson (1992), o a los 4 mg de tejido de vid infectada con elvirus del entrenudocorto infeccioso de la vid (GFLV) detectadospor
Rowhani ci’ al, (1993).
Los niveles de detección obtenidos por ELISA fueron siempremuy inferiores a los alcanzadosmediante PCR, siendo de 1 ig y de10 ~tg de material infectado, según se tratara de hoja o semilla
respectivamente.Estos valores suponen dos órdenes de magnitudde diferencia para semilla, con respecto al límite más bajo obtenido
por PCR, y de cinco con respectoal más alto. En el caso de muestrasde hoja, las diferencias oscilan entre tres y seis órdenes demagnitud.
El hecho de que los niveles de detecciónde BCMV en semillafueran siempre considerablementeinferiores a los conseguidos enplanta es compatible, por un lado, con la posible presencia depolifenoles en estos extractos, y por otro, con el bajo título viral
generalmente existente en semilla. Wang ci’ al. (1985) encontraronque la distribución del antígeno viral de BCMV era muy erráticadentro de las distintas partes de la semilla, y podría no estarasociadaen alguna de ellas, como en el caso de PSbMV (Kohnen et
al., 1992), a la presencia de RNA amplificable por PCR. Puedetratarse, por tanto, de un efecto conjunto, ya que la detectabilidad
en semilla mediante PCR-INIA, es decir, con inmunocaptura previadel virus, siempre fue mayor que en los ensayos directos en el
extracto vegetal íntegro.
La amplificación de PStV mediante los cebadores 13 y C,combinación diseñada para la amplificación de los aislados deBCMV-B, confirma el alto grado de parentescoexistente entre ellos,
puesto de manifiesto también en estudios serológicos (Mink ySilbernagel, 1992) y filogenéticos (Rybicki y Shukla, 1992; Sáiz ci’
V,scus~n 115
al.. 1993). La zona 5’ adyacentea la región de reconocimientode laproteasa Nía de PStV no pudo ser analizada durante el diseño del
cebador B al no ser disponible dicha secuencia,siendo predecibleuna similitud de secuencia elevada entre ellos en esta zona,
conservadaentre los aislados de serotipo E de BCMV, pero congrandes diferencias respecto a otros potyvirus.
úOis¿us¿on 116
si~~ao SI £11
ANEXO A LA DISCUSION
En el ejemplar del mes de octubre del volumen 74 de Journal
of General Virology, Khan ci’ al. (1993) publicaron la secuenciadelgen de la proteína de la cápsiday 3’ NCR de tres aisladosde BCMV yuno de BICMV. Los aislados de BCMV pertenecena las cepasNLI,NL3 y NYI5, y el de BlCMV a la cepa W. En este trabajo, lacomparación de dichas secuencias revela una similitud en la
proteína de la cápsida comprendidaentre 94-97%, y de un 93-96%entre sus 3’ NCRs. Por el contrario, la cápsida de NL3 mostrósimilitudes del 87-89% con NLI, NYI5 y W, y su 3’ NCR de 56-63%.Estos valores les conducena concluir que NL1, NYI5 y W han de serconsideradoscepas del mismo virus, mientras que NL3 es una cepa
de un pot~virus distinto.El aislado secuenciadopor nosotros de la cepa NL3 muestra
una similitud del 97,7% a nivel de aminoácido con el secuenciado
por Khan ci’ al. (1993), con tres sustituciones en el extremo N-terminal de la proteína. Se confirma de nuevo el alto grado de
conservación de la cápsida en los aislados consideradosclásicamentede serotipo A de BCMV.
Respectoa los aislados de serotipo B, el nivel de identidad esdel 95% entre J-8 y NL1, y también entre J-8 y NY15, ligeramente
superior al 91% de similitud entre J-8 y la cepa NL4 secuenciadapor Vetten ci’ al. (1992). La similitud entre J-8 y la cepa W deBíCMV es del 94,7%. Los valores entre aislados de distinto grupofueron similares a los descritos, oscilando entre el 76-85%.
En cuanto a la 3’ NCR, la identidad entre los dos aislados deNL3 es del 97,5%, y la existente entre el aisladoJ-8 y NLl, NY15 y
W oscila entre 96,5-98%. Entre los aislados de distinto grupo, la
similitud fue del 70,5-72%.La posición filogenética que ocuparían los nuevos aislados
secuenciadospor Khan et al. (1993) respecto a los analizadoseneste estudio se muestra en las figuras 34 y 35.
El análisis de las zonas correspondientesa las secuenciasdelos cebadoresA, B y C indica que no existen diferencias a nivel desecuencia en dichas zonas, que pudieran dificultar la hibridación de
i4nn¿o tt9iscusión 117
alguno de los cebadoresen las reaccionesde amplificación de NLI,NYI5 y NL3, así como de BICMV-W. Este hecho se confirma
empíricamente por el amplio espectro, en cuanto a capacidad deamplificación. mostrado por los tres cebadores.
Los valores obtenidos en el trabajo citado, y las conclusiones
que de él se desprenden,apoyan los datos presentadosy discutidosen esta Tesis, confirmando, por otro lado, la necesariareclasificación
taxonómica de los aislados de BCMV y potyvirus relacionados.
$ine{o SLJi,scusión 118
BYMV
ci yvv
cw)
(J8)
Figura 34. Arbol filogenético derivado de las secuencias de la
proteína de la cápsidade BCMV, potyvirus relacionados(tabla 11) yde BCMV NL3 (NL3 II), NLl, NYl5 y BICMV-W (Khan ci’ aL, 1993).Las distancias verticales son arbitrarias. Las distancias horizontales
representanel número de sustitucionespor sitio a la escala indicadaen la figura. La doble línea en los puntos de bifurcación representala desviación estándar de la longitud de la rama correspondiente.*** indica que el punto de ramificación es significativo para a<0,O0l
y ** para ~c0,01. Los puntos de ramificación restantes no sonsignificativos para a<0,05.
0,1 sust.afliiflo,/SitlO
~‘1
BYMV
SbMV-N
NL 1
0,1 sust.nt/sitioII
Figura 35. Arbol filogenético derivado de las secuencias
nucleotídicas de las 3’ NCRs de BCMV, potyvirus relacionados (tabla11) y de BCMV NL3 (NL3 II), NLl, NYL5 y BICMV-W (Khan et al.,
1993). Las distancias verticales son arbitrarias. Las distancias
horizontales representanel número de sustituciones por sitio a laescala indicada en la fisura. La doble línea en los puntos debifurcación representala desviación estándarde la longitud de la
rama correspondiente.*** indica que el punto de ramificación essignificativo para «<0,001 y * para «<0,05. Los puntos deramificación restantesno son significativos para «<0,05.
*
WMV2-Aus
BCMV-B (JS)
BCMV (NY15)
ci yvv
NL4
1
II
SAFV
BICMX’ (W)
y co~~ivsw~tss
VI. RESUMEN Y CONCLUSIONES
En la presente Tesis, se ha abordado la caracterizaciónbiológica, serológica y molecular de aislados del virus del mosaicocomún de la judía (BCMV). procedentesde muestras de campo de
distintas regiones españolas.En un estudio epidemiológico realizado mediante
prospecciones de campo en once provincias, BCMV ha sido elpotyvirus más frecuentementeencontrado infectando judía, y sehan caracterizado por ELISA, con una serie de anticuerposmonoclonales y policlonales, sus aislados, pertenecientesa dosgrupos de cepas: los serotiposA y B.
Mediante ensayos biológicos utilizando cultivares diferencialesde Phascolus vulgaris.se ha determinado la presenciade tres cepasde BCMV.
Se ha realizado paralelamenteun estudio molecular mediantela secuenciaciónde la región 3’ termina] del genoma x-ira] (gen de la
proteína de la cápsida y región 3’ no codificante) de dos aislados dedistinto serotipo, que ha permitido realizar un estudio comparativo
con aislados secuenciados previamente, así como con otrospotyvirus.
Mediante el análisis filogenético basado en los datosmolecularesobtenidos en este trabajo, y los disponibles sobre BCMV
y otros potyvirus relacionados que infectan leguminosas, se haestablecido un marco taxonómico en el que las relaciones de
parentescoentre estos virus aparecen mejor definidas.Utilizando la información de secuencia disponible, se ha
desarrollado un método molecular de diagnóstico de los dos grupos
de aislados, consideradoscomo serotipos de BCMV a partir deextractos de hoja y de semilla mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Las conclusionesde este trabajo son las siguientes:
En el cultivo de judía destaca la elevada incidencia deinfecciones producidas por potyvirus: el 75% de las muestras
íRjsumen Conclusiones 121
analizadas. De entre ellos, el virus del mosaico común de la judía(BCMV) es el más importante, ya que fue el responsable del 81% de
las infecciones potvvirales.
Se ha detectado la presencia de cepas necróticas del virus,
pertenecientesal serotipo A en el 8% de las muestras BCMVpositivas, lo que supone una incidencia mucho menor a la de lascepas del serotipo B, que constituyeron el 84% de las infeccionesproducidas por BCMV. En el 8% restantese ha detectadopor ELISA
la presencia simultáneade los dos tipos de aislados.
Las reacciones cruzadas entre los anticuerpos policlonalesespecíficos de seroripo utilizados, excluye su aplicación en ladiferenciación de aislados de BCMV. Los anticuerpos monoclonalesespecíficos distinguieron eficazmente entre los aislados de los dosserotipos, aunque se han descrito reacciones cruzadas entre el
monoclonal ISES 13-específicoy otros potyvirus relacionados.Un 6%de las muestrasreaccionó con alguno de los anticuerpospoliclonales
y/o el monoclonal de amplio espectro para BCMV, pero no frente alos monoclonalesespecíficosde serotipo, por lo que podrían estar
infectadas por potyvirus relacionados en mayor o menor grado a
BCMV.
Los aislados de serotipo A caracterizados biológicamente
mostraron un comportamientoidéntico al descrito para la cepa NL3de BCMV, mientras que los aislados de serotipo B fueron asignados
a dos cepas:NL4 y US5/Fla.
El estudio comparativo de secuenciasy el análisis filogenético
realizados ponen de manifiesto la complejidad implícita a lasrelaciones entre los aislados de BCMV y con otros potyvirusrelacionados que infectan leguminosas. Los aislados de distinto
serotipo parecen estar más próximos a otros virus que entre sí, loque apoya su reclasificación como potyvirus distintos. Los aisladosde serotipo A constituyen una línea independiente en la que elSAPV es el virus más cercano a ellos, mientras que los aislados de
t~esumetí £1 Conc&swnes 1 22
serotipo B podrían ser consideradosjunto con, al menos PStV yBICMV-W, como otro potyvirus distinto.
En el rango de las distanciasgenéticasque caracterizaal grupode virus analizado, la 3’ NCR mostró un contenido informativomayor que la proteína de la cápsida, revelando parentescos
significativos, como los existentes entre las cepas de serotipo A ySAPV, o el de WMV 2, SbMV y los aisladosde serotipo B de BCMV,su2iriendo para esta zona del genoma un papel de mayor relevanciaen los estudios filogenéticos y, por tanto, en los criterios
taxonómicos aplicables a pot~virus.
Se ha desarrollado un sistema de detección diferencial de los
clásicamenteconsideradoscomo aislados de serotipo A y 13 de BCMVen semilla. La sensibilidad del ensayo permite detectar hasta 100pg de harina procedentede lotes infectados.
%esumeny conclusiones 123
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