EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE EL ANALISIS MOLECULAR DEL DNA HA SIDO POSIBLE MEDIANTE EL CLONADO DE DNAMEDIANTE EL CLONADO DE DNA

TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES

mRNA DNAmRNA DNA

cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido

((doble cadena metilado)doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE

INTRDUCCION EN CELULA HUESPEDINTRDUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARY (Screening-subclonado)LIBRARY (Screening-subclonado)

VECTORESVECTORES

Construidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturalesConstruidos a partir de plásmidos y bacteriófagos naturales

CaracteristicasCaracteristicas

1) REPLICON ESTABLE 1) REPLICON ESTABLE : : Posee secuencias que permiten su Posee secuencias que permiten su propagaciónpropagación

2) MCS: (multiple cloning site) 2) MCS: (multiple cloning site) sitio para insertar el DNA a sitio para insertar el DNA a clonar- Posee sitios únicos para varias ERclonar- Posee sitios únicos para varias ER

3) MARCADORES DE SELECCIÓN: 3) MARCADORES DE SELECCIÓN: Confieren propiedades Confieren propiedades fenótípicas a la célula huesped.fenótípicas a la célula huesped.

TIPOS DE TIPOS DE VECTORESVECTORES

1) VECTORES DE CLONADO- 1) VECTORES DE CLONADO- Aislamiento de fragmentos de Aislamiento de fragmentos de DNADNA

2) VECTORES DE EXPRESION- 2) VECTORES DE EXPRESION- Expresión de genes clonadosExpresión de genes clonados

3) VECTORES ESPECIALES- 3) VECTORES ESPECIALES- Permiten estudio de promotores y Permiten estudio de promotores y secuencias regulatorias de la expresión génicasecuencias regulatorias de la expresión génica

TIPOS DE VECTORES DE CLONADOTIPOS DE VECTORES DE CLONADO

PLASMIDOSPLASMIDOS: : Límite clonado 0.1- 10 KbLímite clonado 0.1- 10 Kb

FAGOSFAGOS: : Derivados del bacteriófago Lambda, 8-25 KbDerivados del bacteriófago Lambda, 8-25 Kb

COSMIDOSCOSMIDOS: : Combinación fago Combinación fago y plásmido, 35-50 Kby plásmido, 35-50 Kb

BACBAC (Bacterial Artificial Chromosomes) (Bacterial Artificial Chromosomes) Derivados plásmido F, 75-300 Kb Derivados plásmido F, 75-300 Kb

Vectores derivados de Vectores derivados de Bacteriofago P1Bacteriofago P1 , 100 Kb , 100 Kb

YACYAC (Yeast artificial Chromosome) (Yeast artificial Chromosome) cromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kbcromosoma de levaduras artificial, 100-1000 Kb

PLASMIDOSPLASMIDOS

Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que Molécula DNA doble cadena circular extracromosomal que replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb) replica en forma autónoma dentro de la bacteria (1.6-300 Kb)

FUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOSFUNCIONES CODIFICADAS POR LOS PLASMIDOS

Resistencia a antibióticos Resistencia a antibióticos

Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)Degradación de compuestos orgánicos (Pseudomonas)

Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas)Producción de toxinas (ej E.coli enterotoxinas)

Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)Producción de bacteriocinas (colicinas, subtilicinas)

Inducción de tumores (plantas)Inducción de tumores (plantas)

Sistemas de Restricción-modificaciónSistemas de Restricción-modificación

Producción de antibióticos (ej Streptomyces)Producción de antibióticos (ej Streptomyces)

Resistencia a metales pesadosResistencia a metales pesados

CLASIFICACÓN DE PLASMIDOSCLASIFICACÓN DE PLASMIDOS

Nº DE COPIAS: Nº DE COPIAS: Alto o bajo Nº de copias.Alto o bajo Nº de copias.

El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación El Nº de copias depende del tipo de ori de replicación

30 Replicones diferentes30 Replicones diferentes

Bajo Nº de copias:1-5 copias Bajo Nº de copias:1-5 copias

Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)Alto Nº de copias : 20-40 copias (hasta 300 copias)

CONJUGATIVOS O NOCONJUGATIVOS O NO

GRUPO DE COMPATIBILIDADGRUPO DE COMPATIBILIDAD

REPLICACION ColE1REPLICACION ColE1

REPLICACION pMB1 o ColE1 : REPLICACION pMB1 o ColE1 :

plásmidos multicopia 30 copias plásmidos multicopia 30 copias

-500 -400 -300 -200 -100 ori 100 200 300 400 500 600

rop rop gengen

RNAIRNAI

Rop proteina (63 aminoácidos)Rop proteina (63 aminoácidos)

RNAasa HRNAasa H

RNAII

Dirección de Dirección de DNA replicaciónDNA replicación

RNA I

RNAII primer

ori

Clivaje por RNAasa H

RNAII primer

ori

Clivaje por RNAasa H

-555 -265 -20REPLICACION

Rop

NO REPLICACION

Grupos de compatibilidadGrupos de compatibilidad

Grupo de compatibilidadGrupo de compatibilidad: set de plásmidos cuyos miembros son : set de plásmidos cuyos miembros son capaces de coexistir en la misma bacteriacapaces de coexistir en la misma bacteria

Plásmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados uno Plásmidos incompatibles: cuando NO pueden ser diferenciados uno del otro en algún aspecto que es esencial para su mantenimiento: ori del otro en algún aspecto que es esencial para su mantenimiento: ori de replicación y/o sistema de segregaciónde replicación y/o sistema de segregación

Sistema de segregación: proteínas que permiten la segregación de Sistema de segregación: proteínas que permiten la segregación de los plásmidos en las células hijaslos plásmidos en las células hijas

PLASMIDOS -VECTORES DE CLONADOPLASMIDOS -VECTORES DE CLONADO

CARACTERISTICASCARACTERISTICAS

1) ORI (derivados de ColE1)1) ORI (derivados de ColE1)

2) POLILINKER (MCS)2) POLILINKER (MCS)

3) MARCADORES DE SELECCIÓN3) MARCADORES DE SELECCIÓN

4) SECUENCIAS PARA SCREENING: 4) SECUENCIAS PARA SCREENING: GalactosidasaGalactosidasa

MARCADORES DE SELECCIONMARCADORES DE SELECCION

Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :Permiten la selección de aquellas células que poseen el vector :

- Marcadores de resistencia a antibioticos- Marcadores de resistencia a antibioticos

- Marcadores de auxotrofía (permiten S! de un componente - Marcadores de auxotrofía (permiten S! de un componente esencial ej aminoácidos)esencial ej aminoácidos)

Antibioticos, ej: Antibioticos, ej:

Ampicilina , Tetraciclina , Kanamicina, ZeocinaAmpicilina , Tetraciclina , Kanamicina, Zeocina

Ampicilina: Ampicilina: Interfiere con síntesis de pared bacterianaInterfiere con síntesis de pared bacterianaResistencia:Resistencia: gen gen bla bla lactamasalactamasa

Tetraciclina: Tetraciclina: Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad Inhibe síntesis de proteínas por unión a subunidad ribosomal 30sribosomal 30sResistencia:Resistencia: gen gen tet tet proteína proteína que se une a membrana que se une a membrana bacteriana y impide transporte del antibióticobacteriana y impide transporte del antibiótico

Kanamicina: Kanamicina: Se une a ribosomas 70s , produce misreading del Se une a ribosomas 70s , produce misreading del mRNAmRNAResistencia:Resistencia: gen gen kan kan aminoglicosido fosfo transferasa aminoglicosido fosfo transferasa modifica el antibiotico modifica el antibiotico

Zeocina: Zeocina: Se intercala al DNA gen Se intercala al DNA gen zeo zeo proteína que proteína que se une a antibiotico y evita su unión al DNA se une a antibiotico y evita su unión al DNA

pBR322

pUC19

FAGOS FILAMENTOSOSFAGOS FILAMENTOSOS

Trasformación

CLONADO EN PLASMIDOSCLONADO EN PLASMIDOS

DIGESTION ER : DIGESTION ER : Plásmido y DNA a clonarPlásmido y DNA a clonar

LIGACION LIGACION (in vitro, ligasa)(in vitro, ligasa)

TRANSFORMACION TRANSFORMACION ( bacterias competentes)( bacterias competentes)

SELECCIÓNSELECCIÓN

SCREENINGSCREENING

TRANSFORMACION Y SELECCIONTRANSFORMACION Y SELECCION

TRANSFORMACION

Bacterias competentes:

Métodos químicos: Cl2Ca, DMSO, etc

Eficiencia:107 cel/g DNA

Métodos físicos: Electroporación (pulsos electricos )

Ef: 108cel/g DNA

SELECCIÓN

Presión de selección : crecimiento en presencia de antibiótico

SCREENINGSCREENING

ScreeningScreening :

para detectar la mólecula de plásmido que posee insertopara detectar la mólecula de plásmido que posee inserto

galactodiasa (no es concluyente)galactodiasa (no es concluyente)

Mapeo de restricción Mapeo de restricción

PCR (colony PCR)PCR (colony PCR)

Hibridización in situ en la colonia con sonda Hibridización in situ en la colonia con sonda específicaespecífica

LIBRARYLIBRARY

TEJIDOTEJIDO VECTORESVECTORES

mRNA DNAmRNA DNA

cDNA DNA digeridocDNA DNA digerido

((doble cadena metilado)doble cadena metilado)

DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA CLONABLE LIGACION DNA-VECTOR DNA RECOMBINANTEDNA RECOMBINANTE

INTRDUCCION EN CELULA HUESPEDINTRDUCCION EN CELULA HUESPED

LIBRARYLIBRARY cDNA o genómicacDNA o genómica

Screening y subclonado

Fago

Formación de placa de lisis

http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/phage/phage-lambda-plaque.gif

Selección

1) CI lisogenia

CI lisis

Cepas hfl - No proteasa degrada CII S! CI

lisogenia . Fagos CI forman placas de lisis en cepas hfl-

2) red gam (genes involucrados en recombinación )

fenotipo Spi+ (sensible a interferencia P2)

red-gam- fenotipo Spi- ,

replican en cepas lisogenas P2(rec+).

Preparación de flibrary en fago

1

2

Screening library en fago

Library de expresion

Screening

VECTOR ZAP

SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ER CADENA

5´cap

mRNA

Transcriptasa reversa

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

AAAAAA(A)nA 3´

oligodT (12-18) primer

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA

cDNA:mRNA

SINTESIS DE cDNA SINTESIS 1ER CADENA

5´cap

mRNA

Transcriptasa reversa

dATP

dTTP

dGTP

dCTP

AAAAAA(A)nA 3´

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA

AAAAAA(A)nA

cDNA:mRNA

Random primers

SINTESIS DE cDNA SINTESIS 2ª CADENA

AAAAAA(A)nA

cDNA:mRNA

RNAasa H + DNA pol

dNTPs

cDNA doble cadena

1)

AAAA mRNA

RToligodT

TTTTT AAAA

degrad. RNA

TTTTT

Transferasa TerminaldCTP TTTT

Klenow poldNTPs- oligoG

AAAAA

TTTTTT

CCCC

GGGGGCCCCC

cDNA Sintesis Transferasa terminal

2)

En este caso el clonado permitido es NO direccionado.

Si en síntesis de la primera cadena de cDNA se usa un oligo T con secuencia para ER1 y luego al cDNA se unen los adaptadores con sitio para ER2 , al cortar con las dos enzimas se podrá clonar direccionalmente.