ekspresja białek –inżynieria - pg.gda.pl · definicja inżynieria metabolizmu (me) została...
TRANSCRIPT
Definicja
Inżynieria metabolizmu (ME) została
zdefiniowana jako "poprawa komórkowej
aktywności komórki poprzez zmianę
aktywności enzymu/ów, transportu, oraz
funkcji regulacyjnych komórek z
wykorzystaniem technologii rekombinacji
DNA”- Bailey, J. E. (1991). Science, 252:
1668-1674
Inżynieria metabolizmu
• ME jest udowodnioną, skuteczną
metodyką do studiowania i optymalizacji
procesów fermentacji
• Składowe procesu
1. Konstrukcja rekombinantów o
poprawionych własnościach przez
wprowadzenie specyficznych genów
(genotype engineering)
2. Kompleksowa charakterystyka szczepu
dzikiego oraz szczepów rekombinowanych
(Phenotype characterization)
3. Analiza wyników charakterystyki
fenotypowej i zaprojektowanie nowych
targetów do kolejnego cyklu ME
Inżynieria metabolizmu
Inżynieria metabolizmu
Inżynieria
genotypu
Charakterystyka
fenotypu
Analiza
Wybór nowych
targetów
Skrining zasobów
naturalnych
Szczep
produkcyjny
Odwrócona inżynieria
metabolizmu (inverse ME)• W toku procesu Inverse ME naturalny
proces ewolucji podpowiada nam
rozwiązania oraz kierunek zmian, które
muszą być dokonane w celu poprawy
szczepu
• Dlatego ważne jest dokładne rozeznanie
zmian – dobre metody analiz
Inżynieria metabolizmu
Analizy
• Fluksomika
• Genomika
• Transkryptomika
• Proteomika
• Metabolomika
Inżynieria metabolizmu
Analizy• Fluksomika – badania zmian w szlakach metabolicznych
– badanie obecności i aktywności enzymów, stężeń
kofaktorów, wzajemne zależności szlaków
metabolicznych i systemu przekazywania sygnałów
komórkowych. Badania systemu transportu.
Rozpoznawanie nowych produktów metabolizmu.
• Genomika - dziedzina biologii molekularnej i biologii
teoretycznej (pokrewna genetyce i ściśle związana z
bioinformatyką) zajmująca się analizą genomu
organizmów. Głównym celem genomiki jest poznanie
sekwencji materiału genetycznego oraz mapowanie
genomu, ale również określenie wszelkich zależności i
interakcji wewnątrz genomu.
Inżynieria metabolizmu
Analizy
• Transkryptomika - dziedzina nauk biologicznych (głównie biologii
molekularnej i genetyki), pokrewna proteomice, genomice i metabolomice.
Zajmuje się określeniem miejsca i czasu aktywności genów poprzez
badanie transkryptomu. Nazwa została utworzona poprzez analogię do
słowa "genomika" i podobnie wskazuje na całościowe ujęcie danego
problemu. Transkryptomika teoretyczna stanowi jeden z fundamentów
bioinformatyki.
Inżynieria metabolizmu
Analizy
Inżynieria metabolizmu
Analizy• Proteomika – gałąź nauki zajmująca się badaniem białek -
ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności
między nimi
• Metabolomika - dziedzina nauki
zajmująca się badaniem zestawu
wszystkich metabolitów obecnych w
organizmie, tkance czy komórce -
metabolomu. Jest zaliczana obok
genomiki, transkryptomiki i proteomiki
do biologii systemowej
Inżynieria metabolizmu
Analizy
BIOinformatyka
• Bioinformatyka to dyscyplina zajmująca
się stosowaniem narzędzi
matematycznych i informatycznych do
rozwiązywania problemów z nauk
biologicznych
BioInformatyka
Zadania dla ME
• katalogowanie informacji biologicznych
• analiza sekwencji DNA / analiza sekwencji
genomów, porównywanie genomów
• ustalanie ewolucyjnych relacji pomiędzy
zbiorami sekwencji / organizmów
• genotypowane
BioInformatyka
• analiza ekspresji genów (głównie analiza danych
z mikromacierzy)
• analiza sekwencji białek, nazywana też
proteomiką (porównywanie sekwencji,
wyszukiwanie domen i motywów, przewidywanie
własności fizyko-chemicznych, drugo- i trzecio-
rzędowej struktury białka, lokalizacji w obrębie
komórki, analiza danych z eksperymentow
spektroskopwych)
BioInformatyka
• katagolowanie funkcji genów/białek,
analiza dróg metabolicznych (np
metabolizm lipidów) oraz dróg
sygnałowych (np od receptora na
powierzchni komórki poprzez kaskadę
kinaz do czynników transkrypcyjnych)
• modelowanie układów biologicznych (np
kinetyka szeregu reakcji enzymatycznych
w komórce)
BioInformatyka
• wirtualne dokowanie (ang. virtual docking)
- np. używajac trójwymiarowej struktury
aktywnego centrum enzymu ("zamek" albo
"kieszonka" ang. pocket) przeszukuje się
w komputerze tysiace małych cząsteczek
z których kilka-kilkanaście ('kluczy') będzie
miało kształt mieszczacy się w centrum
aktywnym. Pierwszy krok w kierunku
odkrywania nowych leków.
BioInformatyka
• komputery DNA - W komputerze DNA informacja jest
zakodowana w postaci łańcuchów DNA. Podobnie jak
zwykłe komputery, składa się z bramek logicznych, te
jednak są oparte na enzymach. Enzymy te powodują
reakcje chemiczne między łańcuchami, a ich wynik
stanowi nową informację. Komputer taki jest
probabilistyczny - wynik każdego działania otrzymujemy
jedynie z pewnym prawdopodobieństwem.
Komputer DNA może być stosowany do identyfikacji wirusów lub znajdowania
mutacji w kodzie genetycznym. Można go używać w roztworach
chemicznych i w żywych organizmach, co może umożliwiać diagnozę i
leczenie nawet na poziomie pojedynczych komórek.
BioInformatyka
• morfometria / analiza obrazu
Inżynieria metabolizmu
• Komórki optymalnie wykorzystują swoje możliwości metaboliczne. Szlaki metaboliczne są siecią regulowanych ścieżek dla uzyskania optymalnego wykorzystania dostepnych warunków.
• Inżynieria metabolizmu ma na celu zmianę metabolizmu komórek w celu uzyskania zwiększonej produkcji danego związku lub w celu uzyskania całkowicie nowego produktu, który w normalnych warunkach nie mógłby być produkowany przez poszczególne komórki
„Schemat postępowania”
1. Identyfikacja targetowego fenotypu (wykazującego określoną cechę)
2. Wzrost częstości występowania genu związanego z dana cechą fenotypową1. wzrost częstości mutacji (UV, X/ray, mutageny chemiczne)
2. wprowadzenie dodatkowych genów (występujących w komórce lub całkowicie nowych)
3. wprowadzenie genetycznych elementów w celu aktywacji/dezaktywacji szlaków poprzez przypadkową integrację. Identyfikacja mutantów wykazujących określoną cechę („poszukiwanie i selekcja”)
„Poszukiwanie i selekcja”
• Poszukiwanie:
– automatyzacja procesu
– proces oparty na różnego rodzaju testach
(związanych z własnościami produktu)
• Selekcja:
– stosowanie markerów (ograniczenia!!!)
http://hugroup.cems.umn.edu/Education/Courses/3701/Lecture/Metabolic%20Engineering_no%20audio.pdf
Markery selekcyjne akceptowane przez FAD/
United States Food and Drug Administration
Markery drożdżowe:
• gen oporności na antybiotyk – Phleomycynę – wyłączenie genu i eliminacja przez komplementarny plazmid
• markery auksotroficzne takie jak ura3, trp2, ade2, leu2 itd.
• markery unikalne
- gen acetamidazy (amdS) z A. nidulans – szczep rekombinantowy może rosnąć na podłożach z acetamidem jako jedymyn źródłem azotu
- gen oporności na analogi aminokwasów np. na o-fluoro-fenyloalaniny: syntaza 3-deoxy-d-arabino-heptolusonate-7-phosphate
- gen oporności na siarczki: FZF1 aktywator genu SSU1 opowiedzialnego za wyrzucanie siarczków z komórki
Narzędzia wykorzystywane w inżynierii
komórkowej i metabolizmu
• Systemy pozwalające na transformację mikroorganizmów używanych w przemysłowej produkcji lub w bioprocesach (np. Corynobacterium – produkcja aminokwasów, Pseudomonas – degradacja ksenobiotyków)
• Odpowiednie wektory (promotory!!!), które pozwolą na przeprowadzanie transformacji (drożdżowy retrotranspozon Ty3 zaangażowany w specyficzną integrację genów heterologicznych – stabilizacja, duża ilość fragmentów ulegających transformacji)
Narzędzia wykorzystywane w inżynierii
komórkowej i metabolizmu
• Multicistronowe wektory ekspresyjne
• Metody zwiększające stabilizację klonowanych
genów (integracja z chromosomem)
• Odpowiednie markery do badań i analizy
ścieżek metabolicznych
Narzędzia wykorzystywane do oceny
wprowadzonych zmian metabolicznych
• Hodowla modyfikowanych organizmów
• Optymalizacja stosowanych w hodowli podłóż (wykazano, że Serratia niosąca bakteryjny gen vgb – co miało umożliwić szybszy wzrost oraz uniknąć produktów ubocznych – aktywuje różne szlaki metaboliczne w zależności od składu podłoża)
• Zachowanie równowagi masowej (ilość substratów = ilość produktów – wydajność 100%. Obliczenie faktycznej wydajności pozwala na ocenę postępu zmian w metabolizmie)
• Znakowanie izotopami i analiza mutantów, w których chcemy zablokować poszczególne szlaki – sprawdzenie działania enzymów wchodzących w skład tych szlaków (poprzez sprawdzanie ubytku charakterystycznego substratu i/lub powstawania produktu)
Narzędzia wykorzystywane do oceny
wprowadzonych zmian metabolicznych
– o czym trzeba pamiętać!!!
• Bazy danych sekwencji DNA (oraz odpowiednie oprogramowanie)
• Bazy danych szlaków metabolicznych (włącznie z własnościami kinetycznymi i termodynamicznymi enzymów)
• Narzędzia pozwalające na wyznaczenie teoretycznych wydajności (ze stechiometrii szlaków metabolicznych)
• Narzędzia pozwalające na przewidywanie i analizę ilości powstających produktów w zmodyfikowanych komórkach
Cele inżynierii metabolizmu
• Polepszenie produkcji (ilościowe lub wybiórcze) związków naturalnie produkowanych przez dany organizm
• Zwiększenie zakresu możliwych do wykorzystania substratów i tworzenie nowych produktów
• Dodanie nowych aktywność w celu umożliwienia degradacji związków toksycznych
• Synteza nowych produktów
• Modyfikacje własności komórek
Przykłady poprawionej produkcji
związków i białek (homogenicznych)
• Ksylanaza – Streptomyces lividans – peptyd sygnalny ksylanazy A zostal zastapiony petydem sygnalnym mannanazy A (podniesienie ekspresji 1,5-2,5x)
Przykłady poprawionej produkcji
związków i białek (homogenicznych)• Kwasy organiczne – S. cerevisiae – nadekspresja
dehydrogenazy malonianowej prowadząca do gromadzenia kwasu malonowego, cytrynowego i fumarowego (przy okazji stwierdzono, że karboksylaza pirogronianowa hamuje wytwarzanie kwasu malonowego)
Przykłady poprawionej produkcji
związków i białek
(homogenicznych)• Akumulacja celulozy i zmniejszenie syntezy
ligniny – Aspen (Populus tremuloides – topola osikowa) – supresja szlaku biosyntezy ligniny z użyciem antysensownego mRNA (specyficznej ligazy) – drzewa zawierały 45% mniej ligniny, a w zamian 15% więcej celulozy
Przykłady poprawionej produkcji
związków i białek (homogenicznych)
• Kwas mlekowy – E. coli – nadekspresja
homologicznej fosfofruktokinazy i
kinazy pirogronianowej (zmniejszona
produkcja etanolu, zwiększona
produkcja kwasu mlekowego)
Przykłady poprawionej produkcji
związków i białek (homogenicznych)
• Cefalosporyna – S. cerevisiae – dzięki analizie
kinetycznej wykazano, że nadekspresja jednej z
aminotransferaz prowadzi do zwiększonego
poziomu syntezy tego antybiotyku
Przykłady produkcji związków i białek
nowych dla gospodarza
• karotenoidy – Candida utilis –komórki drożdży transformowane operonem ctr Erwinia (synteza karotenoidów)
Przykłady produkcji związków i białek
nowych dla gospodarza
• pregnenolon i progesteron – drożdże – wprowadzenie reduktazy ADR oraz specyficznej dehydrogenazo-izomerazy, oraz zniszczenie dwóch innych enzymów szlaku przemian ergosterolu
Ergosterol
Pregnenolon
progesteron
Przykłady produkcji związków i białek
nowych dla gospodarza
• kwas gamma linoleinowy – tytoń – transformacja rośliny delta 6 dezaturazą cyjanobakterii
Przykłady produkcji związków i białek
nowych dla gospodarza
• globotrioza i UDP-galaktoza - E. coli – ekspresja genów biosyntezy UDP-Gal z Corynobacterium ammoniagenes
Globotrioza
UDP-galaktoza
Przykłady produkcji związków i białek
nowych dla gospodarza
• L-alanina – Lactobacillus lactis – gen dehydrogenazy alaninowej z Bacillus sphaericus
L-alanine + H2O + NAD+ = pyruvate + NH3 + NADH + H+
Bioetanol z odpadów
lignocelulozowych
Dlaczego lignocelluloza?
- Zawiera głównie cukry
- Jest „wszechobecna” /produkcja roczna to 150 miliardów ton rocznie
- Jest produktem odpadowym
Skład:
Heksozy 45%
Pentozy 30%
Inne 25%
Bioetanol
Lignoceluloza (słoma, drewno)
CukryDepolimeryzacja
Fermentacja
Etanol
Enzymy rekombinowane
glukozydazy
Enzymy szlaków metabolicznych
(Fermentacja pentoz)
Bioetanol – Paliwo II generacji
(z celulozy)
Proces jest wciąż nieopłacalny ze względu na:
-Koszty enzymów celulaz i ksylanaz
- Brak szczepów odpornych na hydrolizaty
- Mała wydajność fermentacji
To problemy do rozwiązania dla ME
Do tej pory wykorzystano do produkcji
etanolu z lignocellulozy
• Rekombinantowy szczep E. coli (pdc, adh z Zymomonas
mobilis)
• Rekombinantowy szczep S. cerevisiae (Xyl1, Xyl2 z
Pichia striptilis)
• Rekombinantowy szczep Z. mobilis (tal, tktA, xylA, xylB z
E. coli)
• Rekombinantowy szczep Kliebsiella oxytoca (pdc, adh z
Zymomonas mobilis)
Enzymy cellulolityczneS. cerevisiae może wykorzystać wyłącznie glukozę do produkcji
etanolu
Celuloza
Celobioza
Glukoza
Hemiceluloza
ksylobioza
ksyloza Etanol
Celobiohydrolazy
Endoglukanazy
Trichoderma reseii
Beta-glukozydazy
AspergillusXylanazy
Aspergillus
Beta-xylobiozydazy
Aspergillus
Zestawienie organizmów rekombinowanych produkujących heterologiczne enzymy w celu
degradacji związków zawierających wiązanie glikozydowym
Substrate and
host Enzymes (genes) Substrate Growth or fermentationa
K. oxytoca Endoglucanases (celY and celZ) Avicel Anaerobic SSF with added
cellulase, ethanol yields up
to 22% more than control
Amorphous
cellulos
e
Cellulose fermentation without
added cellulase, ethanol
yields 58-76% theoretical
S.
cerevi
siae
CMCase, ß-glucosidase from Aspergillus aculeatus Cellobiose
(10
g/liter)
Aerobic growth, final optical
density >1.5
CMCase, ß-glucosidase from Aspergillus aculeatus Cellodextrin
s
Aerobic growth, cell number >
control
Amylopullulanase (LKA1), pectate lyase (PEL5),
polygalacturonase (PEH1), endo-ß-1,4-glucanase
(END1), cellobiohydrolase (CBH1), exo-ß-1,3-D-
glucanase (EXG1), cellobiase (BGL1), and endo-ß-D-
xylanase (XYN4)
Cellobiose Aerobic growth, cell number >
control
Endo/exoglucanse from Bacillus sp. strain DO4, ß-
glucosidase genes from Bacillus circulans
Cellodextrin
s
Growth, 2-fold higher cell mass
and greater ethanol
production compared to
control
Endo/exoglucanse from Bacillus sp. strain DO4, ß-
glucosidase genes from Bacillus circulans
Avicel Anaerobic SSF, showed
substantial enzyme
production under aerobic
and anaerobic conditions
Enzymy celulolityczne
Cellulazy z Trichoderma reseii
(tylko nadekspresja homogeniczna)
bo:
• złożoność preparatu
- CBHI, CBHII, EG1, EG2, EGV i inne w tym xylanazy
• wydajność do 50-60 g/litr
Bioetanol, S. cerevisiae i ksyloza
Ksyloza (rośliny)Ksylitol
Ksyluloza
Fosforan ksylulozy Etanol
Izomeraza xylozowa
/Piromyces sp./
Reduktaza xylozowa
/Pichia stripsilis/
Dehydrogenaza xylitolu
/Pichia stripsilis/
Kinaza xylulozy
/S. cerevisiae/
S. cerevisiae nie potrafi utylizować pentoz - ksylozy
Uzyskanie szczepu S.
cerevisiae wydajnie
wykorzystującego ksylozę
wymaga wprowadzenia w/w
genów oraz spontanicznych
zmian /mutacji lub
adaptacji/ w regulacji
ekspresji około 380 innych
genów obecnych w S.
cerevisiae.
Skrobia, bioetanol i S. cerevisiae
1,4-beta-O- glikozydowe wiązanie
cellulozy decyduje o jej krystalicznej
strukturze, co sprawia, że jest oporna
na działanie enzymów (brak dostępu)
wiązanie 1,4-alfa-O-glikozydowe
obecne w skrobii czyni ją substancją
rozpuszczalną w wodzie i
podatną na działanie enzymów
(dostępność dla działanai enzymów)
Skrobia, bioetanol i S. cerevisiae
Skrobia
Glukoza
Etanol
Fermentacja
Kwaśna hydroliza / Metoda nieekologiczna
Hydroliza enzymatyczna
alfa-amylaza
/Bacillus licheniformis/
Glukoamylaza
/Aspergillus/
Nadprodukcja w drożdżach i jednoczesna producja etanolu
Zestawienie organizmów rekombinowanych produkujących
heterologiczne enzymy w celu degradacji związków zawierających
wiązanie glikozydowym
Substrate and
host Enzymes (genes) Substrate Growth or fermentationa
K. oxytoca -Amylase from Bacillus stearothermophilus,
pullulanase from Thermoanaerobium brockii
Starch (40
g/liter)
Anaerobic fermentation, 15
g of ethanol per liter and 1.4
g of cells per liter
S. cerevisiae Glucoamylase (GA1) Soluble
starch
CO2 release comparable to
control with added amylase
-Amylase (amyE), glucoamylase (glaA) Corn starch
(10 g/liter)
Final optical density of 2.0
-Amylase (LKA1) Soluble
starch (20
g/liter)
Aerobic growth, final
optical density >1.5
Glucoamylase from Rhizopus oryzae Soluble
starch (10
g/liter)
Aerobic growth with some
ethanol production, final
optical density >0.9
Amylopullulanase (LKA1), pectate lyase (PEL5),
polygalacturonase (PEH1), endo-ß-1,4-glucanase
(END1), cellobiohydrolase (CBH1), exo-ß-1,3-D-
glucanase (EXG1), cellobiase (BGL1), and endo-
ß-D-xylanase (XYN4)
Starch Aerobic growth, cell
number > control
-Amylase (amyE), glucoamylase (glaA) Soluble
starch (100
g/liter)
Anaerobic growth, 44 g of
ethanol per liter and 8 g of
cells per liter
Bioetanol i serwatka
• Serwatka zawiera około 5% laktozy
• S. cerevisiae utylizuje jedynie produkty
hydrolizy laktozy
Laktoza Glukoza + Galaktoza
Etanol
Bioetanol, serwatka i S. cerevisiae
Laktoza Glukoza + Galaktoza
Etanol
Heterologiczna ekspresja
Beta-galaktozydazy
/E. coli/
Produkcja etanolu przez bakterie
E. coli
• E. coli fermentuje wszystkie pentozy i heksozy
występujące w lignocellulozie: glukozę, ksylozę i
arabinozę
• Ale w wyniku fermentacji powstają metabolity: octany,
etanol, mleczan, wodór, szczawian, CO2
• Podniesienie wydajności produkcji etanolu przez
wprowadzenie genów i ekspresję enzymów
bakteryjnych z Zymomonas mobilis: dehydrogenazy
pirogronianowej (PDC) i dehydrogenazy alkoholowej
(ADH)
• Eliminacja niepotrzebnych metabolitów na drodze
mutagenezy
Produkcja ksylitolu
Ksylitol
• alkohol pochodzący z ksylozy
• słodkość zbliżona do sacharozy
• niska kaloryczność
• wysoka wartość 10-12 USD/ 1kg (etanol
0.28 USD / litr)
Rynek:Guma do życia, produkty dla
cukrzyków, zapobiega infekcji uszu
Rekombinowany S. cerevisiae i
ksylitolKsyloza KsylitolReduktaza xylozowa
/Pichia stipitis/
Ale brak energii na wzrost biomasy
Wymagany dodatek glukozy
Glukoza Biomasa+energiaGlikoliza
20g ksylozy + 18g glukozy = 20.1g ksylitolu + 9.52g suchej biomasy
Nowe cechy organizmów umożliwiające
detoksyfikację, degradację i mineralizację
toksycznych związków
• toluen, trichloroetylen – dehydrogenazy wklonowane do
Deinococcus radiodurans umożliwiają rozkład związków
organicznych na terenach radioaktywnych
• materiały wybuchowe – tytoń – transgeniczny tytoń
produkujący pentaerytriolową tetraazotową reduktazę z
Enterobacter cloacae może degradować trinitroglicerynę
(i trinitrotoluen), która stanowi powszechne
zanieczyszczenie poligonów
Zmiana własności komórek
• zmniejszenie inhibicji fotosyntezy – ryż –
wprowadzenie karboksydazy
fofoenlopirogronianowej z kukrydzy zwiększa
poziom fotosyntezy
• odporność na herbicydy – wprowadzenie genu
EPSPS z petunii do tytoniu
• odporność na niskie temperatury – tytoń – delta
9 dezaturaza z cyjanobakterii wpływa na zmianę
składu lipidów w błonach lipidowych
Wino i GM S. cerevisiae
Recombinantowe szczepy S. cerevisiae w produkcji wina stosuje się w celu polepszenia własności smakowych i zapachowych przez wprowadzenie obcych genów odpowiedzialnych za:
• dekarboksylację kwasu malonowego
• wzrost ilości garbnika-resveratrol, kwasu mlekowego i glicerolu
• oraz w celu podniesienia wytrzymałości szczepu na warunki procesu technologicznego
Przykłady:
Wprowadzane do S. cerevisiae geny uszlachetniające wino:
• Enzym odpowiedzialny za produkcję malmleczanu Oenococcus oeni i permeaza malonianowa z Schizosaccharomyces pombe – obniżenie kwasowości wina
• Podniesienie wydajności fermentacji przez wprowadzenia genu xylanazy z Aspergillus nidulans
• Ubogacenie zapachu wina przez nadekspresję genu alkoholowej acetylotransferazy
• i wiele innych modyfikacji
Wino i GM S. cerevisiae