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Einfluss eines kontrollierten Zinkmangels

auf die Proteinexpression im Heilungsprozess

intestinaler Anastomosen der Ratte

Marion Franken

Einfluss eines kontrollierten Zinkmangels

auf die Proteinexpression im Heilungsprozess

intestinaler Anastomosen der Ratte

Von der Medizinischen Fakultät

der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades

einer Doktorin der Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Marion Franken

aus

Erkelenz

Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr.med. Dr.E.h.(GUS) Volker Schumpelick

Herr Professor Dr.med. Andreas Prescher

Tag der mündlichen Prüfung: 17. Mai 2010

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Für Onkel Hans

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis....................................................................................III

Tabellenverzeichnis.........................................................................................IV

Abkürzungsverzeichnis............................................. ......................................V

1 Einleitung .................................................................................... 1

1.1 Wundheilung ............................................................................................3

1.1.1 Physiologie der allgemeinen Wundheilung ........................................ 3 1.1.2 Bedeutung der extrazellulären Matrix in der Wundheilung ............... 4 1.1.3 Wundheilung im Gastrointestinaltrakt ................................................ 5

1.6 Notch-3................................................................................................... 16

1.7 Zink ......................................................................................................... 19

1.7.1 Allgemeine Bedeutung ..................................................................... 19 1.7.2 Zink in der Wundheilung................................................................... 21

2 Zielsetzung.............................................................................. 23

3 Material und Methoden ............................................................ 24

3.1 Tiermodell .............................................................................................. 24

3.2 Histologie............................................................................................... 25

3.4 Färbungen.............................................................................................. 27

3.4.1 TIMP-1.............................................................................................. 27 3.4.2 ß-Catenin.......................................................................................... 28 3.4.3 c-myc ................................................................................................ 29 3.4.4 Notch-3 ............................................................................................. 30

3.5 Auswertung ........................................................................................... 31

3.5.1 Remmele-Score ............................................................................... 32 3.5.2 Statistik ............................................................................................. 33

Inhaltsverzeichnis

II

4 Ergebnisse ............................................................................... 34

4.1 TIMP-1..................................................................................................... 35

4.2 ß-Catenin............................................................................................ 38

4.3 c-myc .................................................................................................. 44

4.4 Notch-3 ............................................................................................... 50

5 Diskussion .............................................................................. 55

5.1 TIMP-1..................................................................................................... 56

5.2 ß-Catenin................................................................................................ 58

5.3 c-myc...................................................................................................... 59

5.4 Notch-3................................................................................................... 61

6 Zusammenfassung................................................................. 63

7 Literaturverzeichnis ............................................................... 65

8 Danksagung............................................................................ 74

9 Datenaufbewahrung............................................................... 75

10 Lebenslauf ........................................................................... 76

Abbildungsverzeichnis

III


Abbildung 1: Schematische Darstellung der extrazellulären Matrix ................... 4

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Struktur von TIMP-1 ..................... 9

Abbildung 3: ß-Catenin in seiner Funktion als Strukturprotein ......................... 11

Abbildung 4: Funktion von ß-Catenin im Wnt-Signalweg ................................. 12

Abbildung 5: Abbildung des Zellzyklus und der physiologischen Zellhomöostase

........................................................................................................................... 14

Abbildung 6: Notch-Kaskade a) inaktiv; b) aktiv ............................................... 16

Abbildung 7: Notch-3 in der intestinalen Zellerneuerung ................................. 17

Abbildung 8: Beispielpräparat TIMP-1; Kontrolle, Kolotomie, schnittnah ......... 27

Abbildung 9: Beispielpräparat ß-Catenin; Kontrolle, Anastomose, schnittfern 28

Abbildung 10: Beispielpräparat c-myc; Kontrolle, Anastomose, schnittnah ..... 29

Abbildung 11: Notch-3 Präparat; Zinkmangel, Anastomose, schnittfern ......... 30

Abbildung 12: Schaubild der Untersuchungsebenen ....................................... 31

Abbildung 13: TIMP-1-Expression im Vergleich der Nahttechniken für

schnittnahe Mukosa (Kontrollgruppe)................................................................ 36

Abbildung 14: TIMP-1-Expression im Vergleich der Nahttechnik für schnittnahe

Mukosa (Zinkmangelgruppe)............................................................................. 37

Abbildung 15: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Gruppen für schnittferne

Submukosa (Kolotomie) .................................................................................... 39

Abbildung 16: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Gruppen für schnittferne

Submukosa (Kolotomie) .................................................................................... 39

Abbildung 17: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Nahttechnik für

schnittnahe Mukosa (Kontrollgruppe)................................................................ 40


schnittnahe Mukosa (Zinkmangelgruppe) ......................................................... 41


schnittferne Submukosa (Zinkmangelgruppe)................................................... 42

Abbildung 20: ß-Catenin-Präparat der Kontrollgruppe; anastomosennah ....... 43

Abbildung 21: ß-Catenin-Präparat der Kontrollgruppe; anastomosenfern ....... 43


IV

Abbildung 22: c-myc-Expression im Gruppenvergleich für schnittnahe Mukosa

(Anastomose)..................................................................................................... 45

Abbildung 23: c-myc-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Mukosa

(Anastomose)..................................................................................................... 45

Abbildung 24: c-myc-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne

Submukosa (Anastomose) ................................................................................ 46

Abbildung 25: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne

Mukosa (Kontrolle)............................................................................................. 47


Submukosa (Kontrolle) ...................................................................................... 48

Abbildung 27: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittnahe

Mukosa (Zinkmangel) ........................................................................................ 48


Mukosa (Zinkmangel) ........................................................................................ 49


Submukosa (Zinkmangel).................................................................................. 49

Abbildung 30: Notch-3-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Mukosa

(Anastomose)..................................................................................................... 51

Abbildung 31: Notch-3-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne

Submukosa (Anastomose) ................................................................................ 51

Abbildung 32: Notch-3-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Mukosa

(Kolotomie)......................................................................................................... 52

Abbildung 33: Notch-3-Expression im Vergleich der Nahttechniken für

schnittferne Mukosa (Zinkmangel) .................................................................... 53

Abbildung 34: Notch-3-Expression im Vergleich der Nahttechniken für

schnittferne Submukosa (Zinkmangel) .............................................................. 54

Tabellenverzeichnis

V

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: p-Werte der TIMP-1-Scores im Vergleich der Gruppen .................. 35

Tabelle 2: p-Werte der TIMP-1-Scores im Vergleich der Nahttechniken ......... 36

Tabelle 3: p-Werte der ß-Catenin-Scores im Vergleich der Gruppen ............... 38

Tabelle 4: p-Werte der ß-Catenin-Scores im Vergleich der Nahttechniken...... 40

Tabelle 5: p-Werte der c-myc-Scores im Vergleich der Gruppen ..................... 44

Tabelle 6: p-Werte der c-myc-Scores im Vergleich der Nahttechniken ........... 47

Tabelle 7: p-Werte der Notch-3-Scores im Vergleich der Gruppen ................. 50

Tabelle 8: p-Werte der Notch-3-Scores im Vergleich der Nahttechniken ........ 53

Abkürzungsverzeichnis

VI

Abkürzungsverzeichnis

ADAM Adamalysin-ähnliche Proteasen

CADASIL Autosomal dominant erbliche zerebrale

Arteriopathie, die zu subkortikalen Infarkten und

Leukoenzephalopathien führt

CSL Genregulatorprotein im Notch-Pathway

DNA Desoxyribonukleinsäure

DAB 3,3 Diaminobenzidine tablets

ECM Extrazellulärmatrix

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EGF Epidermal growth factor

FGF Fibroblast growth factor

HES-1 Zielgen des Notch-Pathway

IL-1 beta Interleukin-1 beta

JK Janus Kinase

Lef Lymphoid-enhancer-binding-factor

MMP Matrixmetalloproteinase

Notch-IC Notch-intrazelluläre Domäne

PBS Phosphate Buffered Saline

PDGF Platelet-derived growth factor

ppPDGF partially purified Platelet-derived growth factor

RBP Regulatorprotein im Zellzyklus (RBP/JK)

RNA Ribonukleinsäure

rTGF-ß Rekombinator tissue growth factor

TCF T cell factor

TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinases

TNF-alpha Tumor-Nekrose-Faktor-alpha

Wnt Signalproteine, welche als lokale Mediatoren

agieren

1 Einleitung

1

1 Einleitung

“Anastomotic leakage remains the most important cause of morbidity and

mortality in digestive surgery.” (Kostic, 1994)

Operationen am Kolon gehören vor allem wegen der Bedeutung des

Kolonkarzinoms als zweithäufigstes Malignom bei Männern und Frauen zu den

häufigsten Eingriffen in der Viszeralchirurgie (Willis und Schumpelick, 2005).

Obwohl Operationen am eröffneten Darm heutzutage Routineoperationen

darstellen, bleibt die Nahtinsuffizienz auf der Basis einer Wundheilungsstörung

noch heute die gefährlichste Komplikation in der kolorektalen Chirurgie

(Hendriks und Mastboom, 1990). Daher bleiben Untersuchungen ihres

Heilungsprozesses von großem Interesse.

Die schnelle und komplikationsarme Wundheilung hat bei jedem invasiven

Eingriff einen großen Stellenwert. Neben Operationstechnik, Erfahrung sowie

handwerklichem Geschick des Operateurs nehmen viele, unterschiedliche

Faktoren Einfluss auf die molekularen Prozesse der Wundheilung (Willis und

Schumpelick, 2005; Stumpf et al., 2004; Burch et al., 2000). Man unterscheidet

hierbei zwischen patienteneigenen und externen Risikofaktoren sowie zwischen

systemischen und lokalen Einflüssen. Zu den letzteren beiden sind unter

anderem Veränderungen der extrazellulären Matrix (ECM) und als deren

Effektoren auch Veränderungen der Zellmigration, Zellproliferation sowie

Zelldifferenzierung zu zählen. Diese werden durch dynamische Prozesse auf

molekularer Ebene gesteuert. Die Prävention von Wundheilungsstörungen setzt

daher ein grundlegendes Verständnis der einzelnen, an der Wundheilung

beteiligten Faktoren voraus.

Das Forschungsinteresse an diesen Faktoren besitzt eine lange Tradition.

Bereits 1922 publizierte Ishido eine Studie, deren Versuchsaufbau mit dem

dieser Arbeit vergleichbar ist. Unter der Annahme, dass sich Mangelzustände

negativ auf den Zellstoffwechsel und in dessen Folge auch auf die Wundheilung

auswirken, untersuchte Ishido in unterschiedlich ernährten Versuchstiergruppen

mikroskopisch die postoperative Beschaffenheit von künstlich induzierten

Wunden im Bereich der Rückenhaut und Rückenmuskulatur von Ratten (Ishido,

1922). Unter einem allgemeinen Ernährungsmangels bzw. einer Avitaminose

1 Einleitung

2

konnte er eine verzögerte Wundheilung sowie eine Beeinträchtigung des

Immunsystems mit erhöhtem Bakteriennachweis in den Schnitten (Ishido,

1922).

Die Anastomosenheilung am Darm entspricht den drei Phasen der

Wundheilung. Dem initialen Trauma der Anastomose bzw. Kolotomie folgt

zunächst die Substratphase, welche neben Exsudation und Resorption eine

Entzündungsreaktion beinhaltet. Die unterschiedlichen Schichten der

Darmwand (Mukosa, Basalmembran und Tela submucosa) fördern über eine

Modulation der Extrazellulärmatrix (ECM) den Heilungsprozess. Zur ECM

zählen Kollagen Typ I und Typ III, Fibronektin und verschiedene Proteoglycane,

wie zum Beispiel die Tissue inhibitors of Matrixproteinasen (TIMPs). Die

primäre Naht ist in der Tunica serosa verankert. Hierdurch wird die

Vorraussetzung zur Akkumulation von Kollagenfasern in der Tela submucosa

geschaffen (Dietz und Debus 2002). Der Kollagen I/III Ratio ist ein wichtiges

mechanisches Qualitätsmerkmal für die Stabilität der Narbe (Klinge et al. 2000).

Ist dieses Verhältnis durch externe oder interne Einflüsse gestört, kommt es zu

einer Dysregulation des Kollagenstoffwechsels wodurch die Wundheilung

empfindlich gestört wird. Wichtig ist bei der Regulierung vor allem das

Gleichgewicht zwischen Synthese und Degradierung von Proteinen in der ECM.

Dieses wird durch eine fein gesteuerte Interaktion zwischen Matrix-

Metalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren TIMPs (Tissue Inhibitors of

Metalloproteinases) gewährleistet (Gomez et al., 1997; McKaig et al., 2003,

Visse und Nagase 2003). Die MMPs besitzen ein zentrales Zink-Atom, welches

als Bindungsstelle für TIMPs dient.

Das transmembranäre Protein Notch-3 sowie die Onkogene ß-Catenin und c-

myc besitzen wegen ihrer physiologischen Funktionen ebenfalls eine besondere

Bedeutung. Notch-3 besitzt als membrangebundener Transkriptionsfaktor

sowohl Verbindungen zur ECM als auch zum Intrazellulärraum (Alberts et al.,

2004). ß-Catenin und c-myc sind Protagonisten des Zellzyklus und ihr

Vorhandensein ist für die Zellerneuerung eine notwendige Vorraussetzung

(Lodish et al., 2008; Alberts et al., 2004; Knippers, 2001). Da das Prinzip der

Wundheilung neben einer Umstrukturierung der ECM auch auf Zellerneuerung

und Proliferation beruht, ist eine Beteiligung der genannten Faktoren

1 Einleitung

3

naheliegend und soll in dieser Arbeit untersucht werden. Dass eine Störung des

fragilen Gleichgewichtes der Reparaturvorgänge in der ECM bei negativer

Zinkbilanz über eine eingeschränkte Funktion der MMPs die Wundheilung

supprimieren kann, ist bekannt (Binnebösel et al., 2009). Der Einfluss von Zink

bzw. eines Zinkmangels auf die physiologische Funktion der anderen oben

angegebenen Regulatoren ist dagegen noch unbekannt.

1.1 Wundheilung

1.1.1 Physiologie der allgemeinen Wundheilung

Die Wundheilung stellt eine Untergruppe allgemeiner regeneratorischer

Prozesse dar und wird in Substratphase (Exsudationsphase und

Resorptionsphase), Proliferationsphase und Differenzierungsphase unterteilt

(Schumpelick et al., 2004). In jeder Phase sind typische Signalpeptide aktiv und

induzieren spezifische Veränderungen und Reaktionen der extrazellulären

Matrix. Eine entzündliche, exsudative und katabole Sofortreaktion führt zur

Bildung einer provisorischen Wundmatrix welche die Proliferation, die

Differenzierung und die Synthese neuer Matrixmoleküle stimuliert (Schultz et al,

1995). Durch die Sezernierung chemotaktisch wirksamer Zytokine (PDGF, r-

TGF-ß, TNF-alpha, etc.) werden Fibroblasten, Granulozyten und Monozyten zur

Einwanderung in den Wundbereich angeregt (Hofstädter, 1995; Lawrence,

1998). Neben dem zentralen Defekt ist oft auch das umgebende Gewebe

betroffen. Dort entsteht durch Hypoxie, anaerobe Glykolyse und Azidose ein für

katabole Enzyme optimales, niedrigeres pH-Niveau. Nach primärem

Substanzverlust kommt es durch Proliferation zu einer Zunahme des DNA- und

Gesamtzellgehaltes im Wundsegment (Lindner, 1995). Parallel sprossen

Kapillaren in das Wundgebiet ein. Dadurch wird der pH-Wert in den neutralen

Bereich verschoben und der Sauerstoffmangel aufgehoben (Haase und Rink,

2006). In der Differenzierungsphase sinkt die Anzahl der Bindegewebszellen im

Wundbereich und es wird vermehrt Interzellularsubstanz gebildet. Durch

Kontakt mit ECM-Proteinen und verschiedenen Wachstumsfaktoren

transformieren Fibroblasten zu Myofibroblasten, welche für die Wundkontraktion

1 Einleitung

4

verantwortlich sind (Clark, 1993; Arora et al., 1999). Je geringer der primäre

Substanzabbau in der Wundheilung war, desto besser und stabiler ist die

resultierende Narbe bezüglich ihrer Struktur und Funktion (Lindner, 1995).

1.1.2 Bedeutung der extrazellulären Matrix in der Wundheilung

Die extrazelluläre Matrix besteht aus einem dreidimensionalen Netz

verschiedener Kollagentypen sowie Elastin, Fibronektin, Glykosaminoglykanen

und Proteoglykanen. Sie umfasst alle unlöslichen Faktoren des interstitiellen

Raumes und Bestandteile der Basalmembran. Sie dient als Strukturelement

und beeinflusst außerdem die Zellentwicklung und -physiologie.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der extrazellulären Matrix (UB, 2005)

Zu ihren Aufgaben zählen die Regulation zellulärer Funktionen, wie die der

Zelladhäsion und die der Organisation eines Transportsystems für Nähr- sowie

Abfallstoffe. Defekte der extrazellulären Matrix werden mit pathologischen

Prozessen, wie Entzündungen, chronisch-degenerativen Erkrankungen und

Tumorinvasion, in Verbindung gebracht (Gomez et al, 1997). Außerdem nimmt

die ECM an entscheidenden Prozessen der Wundheilung teil (Rhagow, 1994).

Stumpf et al wiesen in einer prospektiven Studie an Kolonkarzinom-Patienten

nach, dass sich Milieuveränderungen in der ECM störend auf die

Anastomosenheilung auswirken (Stumpf et al., 2004; Charrier, L, 2004).

1 Einleitung

5

Die Bestandteile der extrazellulären Matrix verändern sich parallel zu den

Phasen der Wundheilung. Unmittelbar nach einer Verletzung bildet sich eine

provisorische Wundmatrix, die hauptsächlich aus Fibrin und Fibronektin

besteht. Nach Ablauf einiger Tage sind von Fibroblasten synthetisierte

Kollagene und Proteoglykane die Hauptelemente der Matrix (Gailit und Clark,

1994). Pathologisch erhöhte Proteasenkonzentrationen können das Wundmilieu

in Richtung destruktiver Prozesse verschieben. Dabei werden Bestandteile der

ECM inklusive der Wachstumsfaktoren in erhöhtem Maße abgebaut. Die

Abbauvorgänge werden überwiegend durch die Matrix-Metalloproteinasen

(MMPs) vorgenommen. Die MMPs sind proteolytische Enzyme, die maßgeblich

an der Umstrukturierung der Extrazellulärmatrix im Rahmen physiologischer

und auch pathologischer Prozesse beteiligt sind. Sie sind auch in der

Umbauphase der Wundheilung aktiv. Dieser Prozess wird von den TIMPs, den

speziellen Inhibitoren der MMPs, kontrolliert. Sie verhindern, dass Teile der

funktionellen Matrix abgebaut werden. In chronischen Wunden kommt es durch

eine entzündliche Reaktion zu einer erhöhten Proteasenkonzentration und

damit zu einem Ungleichgewicht zwischen MMPs und TIMPs. Dies kann einen

pathologisch gesteigerten Matrix-Abbau zur Folge haben. Außerdem agiert die

ECM eng mit intrazellulären Prozessen zusammen. Viele Abläufe werden über

transmembranäre Rezeptoren und über die Interaktion mit Bestandteilen der

ECM vermittelt und ausgelöst (Lodish et al., 2008).

1.1.3 Wundheilung im Gastrointestinaltrakt

Grundsätzlich ist der Prozess der Wundheilung im Intestinum vergleichbar zur

Wundheilung in anderen Geweben. Aus morphologischen, funktionellen und

technischen Merkmalen ergeben sich jedoch auch Besonderheiten. Sowohl der

mehrschichtige Aufbau der Darmwand, als auch seine teilweise intraperitoneale

Lage müssen eine besondere Berücksichtigung in der Darmchirurgie finden.

Die intestinale Mukosa unterhält einen spezifischen physiologischen

Zellumsatz, der durch eine ständige Proliferation von Stammzellen in den

basalen Zellschichten der Krypten aufrecht erhalten wird und eine stetige

Selbsterneuerung innerhalb von 2-7 Tagen bewirkt (Alberts et al., 2004).

1 Einleitung

6

Auch Art, Größe und Lokalisation der Wunde nehmen Einfluss auf den

Heilungsverlauf. Durch die Keimbesiedlung im Dickdarm treten hier im Fall von

Insuffizienzen infektiöse Komplikationen häufiger auf, als im Dünndarm (Betzler

und Schmidt, 2005; Willis und Stumpf, 2004). Ein kontrovers diskutierter

Einflussfaktor einer Darm-Operation ist die postoperative Durchblutung der

Wundränder. Einige Studien dokumentieren Nahtinsuffizienzen als Folge einer

lokalen Minderperfusion (Stumpf et al, 2004; Betzler und Schmidt, 2005;

Hansen und Stelzner, 1975), andere Autoren postulieren, dass eine evtl.

entstandene ischämische Läsion klinisch zu vernachlässigen sei (Harder und

Kuhl, 1987). Die darmdurchblutenden Gefäße und ihre Verzweigungen

verlaufen größtenteils zirkulär und parallel zu den Fasern des Bindegewebes.

Manchen Autoren zufolge sollte die Schnittführung, um eine bessere

postoperative Durchblutung zu gewährleisten, senkrecht zur Darmlängsachse

erfolgen (Hansen und Stelzner, 1975). Dies ist bei der Kolotomie der Fall.

1 Einleitung

7

1.2 Nahttechniken

Anastomoseninsuffizienzen im unteren Gastrointestinaltrakt treten in ein bis

zwölf Prozent der Operationen auf und können für einen letalen

Krankheitsverlauf verantwortlich sein (Willis und Stumpf, 2004). Dies ist der

wichtigste Grund dafür, dass die intestinale Anastomose im Hinblick auf

Verbesserungen ihrer Durchführung in verschiedenen Studien immer wieder

von Interesse ist und bleibt. Die Kolonanastomose ist eine Nahtvereinigung von

zwei Organlumina nach querer Durchtrennung. Man unterscheidet zwischen

End-zu-End, End-zu-Seit, Seit-zu-Seit und Seit-zu-End Anastomosen

(Schumpelick et al., 2004).

Eine weitere Option für eine darmeröffnende Operationstechnik stellt die

Kolotomie dar. Die Kolotomie ist ein fast ausschließlich bei benignen

Grunderkrankungen verwendetes Operationsverfahren, welches beispielsweise

zur Polypentfernung eingesetzt wird (Willis und Schumpelick, 2005). Es handelt

sich hierbei, im Gegensatz zur Anastomose, um einen Längsschnitt durch alle

drei Schichten der Darmwand.

Operationsmethoden und Nahttechniken am Darm unterliegen einer stetigen

Entwicklung und spiegeln dabei den jeweiligen Kenntnisstand in Anatomie,

Physiologie, Antiseptik und Aseptik wieder (Schumacher und Lorenz, 1991;

Takeyama et al., 2007). Große Bedeutung besitzt auch die Auswahl von

Operationstechnik, Nahttechnik und Nahtmaterial. Aufgrund kontroverser

Studien bezüglich der Effizienz der unterschiedlichen Techniken gilt jedoch

auch, dass der Operateur diejenigen Methoden anwendet, welche er am besten

beherrscht (Stumpf et al., 2004).

Heutzutage werden bevorzugt einreihige Nahttechniken verwendet

(Schumacher und Lorenz, 1991). Die fortlaufende einreihige Nahttechnik mit

monophilem Nahtmaterial gilt zunehmend als Standardmethode bei intestinalen

Anastomosen. Diese wird unter Aussparung der Mukosa durchstochen und

ermöglicht eine lockere, primär dichte Adaption der Resektionsränder (Stumpf

et al., 2004). Dabei wird die Spannung über der Anastomose gleichmäßig

verteilt. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, dass sie weniger zeitaufwendig

und kostengünstiger ist als die allschichtige, einreihige Einzelknopfnaht.

1 Einleitung

8

Zusätzlich wird die Menge des eingebrachten Nahtmaterials minimiert (Harder

und Kull, 1987). Die allschichtige, einreihige Einzelknopfnaht wird aber noch

alternativ verwendet. Die Submukosa, die zum großen Teil aus Kollagenfibrillen

besteht, spielt in ihrer Funktion als „Darmskelett“ die tragende Rolle in der

Darmchirurgie (Hendriks und Mastboom, 1990). Dies ist auch der Grund dafür,

dass es noch heute üblich ist, die Darmnähte in der Submukosa zu plazieren.

Das vorhandene Kollagen in der Submukosa ist somit für die Stabilität in der

frühen Phase der Wundheilung verantwortlich, während später das neu

aufgebaute Kollagen diese Funktion übernimmt (Hendriks und Mastboom,

1990; Stumpf et al., 2005; Binnebösel et al., 2009)

Dem Operateur stehen sowohl resorbierbare als auch nichtresorbierbare

Nahtmaterialien zur Verfügung. Das optimale Nahtmaterial sollte stabil sein und

durch minimales Gewebetrauma und geringe Umgebungs- und

Entzündungsreaktion eine gute Wundheilung ermöglichen. Nahtmaterialien gibt

es in der monophilen oder multiphilen Variante. Bei monophilem Material wird

ein atraumatischer Gewebedurchzug erreicht und eine Bakterienverschleppung

vermindert (Betzler und Schmidt, 2005). Die synthetische, resorbierbare,

monophile Naht ist nach Thornton und Barbul diejenige, die nach heutigen

Vorstellungen, der idealen Naht im intestinalen Wundmanagement am nächsten

kommt (Thornton und Barbul, 1997; Betzler und Schmidt, 2005; Harder und

Kuhl, 1987).

Maschinelle Klammernähte stellen eine weitere Möglichkeit zur

Anastomosierung im Intestinaltrakt dar. Häufige Verwendung findet diese

Technik sowohl bei laparoskopischen Operationen als auch bei Operationen am

rektosigmoidalen Übergang (Betzler und Schmidt, 2005; Takeyama et al.,

2007). In der Literatur ist die Rate der Insuffizienzen zwischen Klammernähten

und Handnähten vergleichbar. Für die Klammernaht wird jedoch ein größeres

Risiko von frühpostoperativen Blutungen und späten Anastomosenstenosen

beschrieben Takeyama et al., 2007; Thornton und Barbul, 1997).

1 Einleitung

9

1.3 Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1 (TIMP-1)

Bis heute sind vier Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMP-1 bis TIMP-4)

für Wirbeltiere beschrieben und charakterisiert worden. Sie sind als

Komponenten der extrazellulären Matrix ubiquitär als freie Moleküle in

menschlichen Geweben aber auch in Körperflüssigkeiten vorhanden (Alberts et

al., 2004; McKaig et al., 2003; Brew et al., 2000). TIMPs sind aus sechs

Schleifen aufgebaute Proteine mit sechs Disulfid-Bindungen, die aus zwei

Untereinheiten bestehen. Mit ihrem N-terminalen Ende, welches aus drei

Schleifen besteht, hemmen sie spezifisch die katalytische Domäne von Matrix-

Metalloproteinasen (MMPs) durch eine nicht-kovalente Bindung im Verhältnis

1:1 und inhibieren auf diese Weise deren Funktion (Gomez et al., 1997; Lee

und Murphy, 2004; Visse und Nagase, 2003).

Abbildung 2: Schematische Darstellung der Struktur von TIMP-1 (Cao und Zucker, 2004)

Alle vier TIMPs haben zwar fundamentale Ähnlichkeiten, weisen aber jeweils

auch markante strukturelle Eigenschaften, biochemische Wirksamkeiten und

spezifische Expressionsmuster auf (Baker et al., 2002; Brew et al., 2000).

TIMP-1 und TIMP-2 sind in der Lage, alle bisher bekannten Matrix-

Metalloproteinasen (MMPs) zu inhibieren (Gomez et al., 1997; McKaig et al.,

2003). MMPs sind eine multigene Familie von Enzymen, die zahlreiche

perizelluläre Substrate wie Kollagen, Wachstumsfaktoren, Zell-Oberflächen-

Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, andere Proteasen und viele mehr, bearbeiten

beziehungsweise abbauen (Thorgeirsson et al., 1996). Die MMPs enthalten

1 Einleitung

10

jeweils ein Zn²+-Molekül in ihrem aktiven Zentrum welches bei einer Inhibition

durch TIMPs als Bindungsstelle fungiert (van Waart und Birkedal-Hansen,

1990). Es besteht ein in der Regel gut organisiertes Wechselspiel zwischen

MMPs und TIMPs, welches sich wie oben beschrieben direkt auf den

Kollagenstoffwechsel auswirkt und dessen Endprodukt ein funktionierendes

Gerüst an strukturbildenden Proteinen bildet. Die negative Rückkopplung ist

eine wichtige Vorraussetzung für eine funktionierende Wundheilung. Ein

Zusammenhang zwischen der Aktivität von MMPs und dem Zink-Angebot im

Gewebe konnte von Krones bereits nachgewiesen werden (Krones, 2006).

Über ihre Kontrollfunktion auf die MMPs haben die TIMPs weitere wichtige

Funktionen in der Steuerung der Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen inne.

Sie greifen ebenso in den Ablauf intrazellulärer Prozesse ein (Alberts et al.,

2004). Auf diese Weise beeinflussen sie den Abbau und die Freisetzung von

Zellzyklus-steuernden Mediatoren, und damit die Zelldifferenzierung, die

Zellmigration, die Proliferation und das Zellüberleben. Außerdem schützen sie

Zelloberflächenrezeptoren, die für die Zelladhäsion notwendig sind, und

verhindern damit eine Zellmigration (Alberts et al., 2004). TIMPs werden vor

allem in Grenzbereichen des aktiven Proteinabbaus exprimiert, um die nicht

betroffene Matrix zu schützen (Alberts et al., 2004). Dies führt dazu, dass in

einem „nicht-physiologischen“ Gleichgewicht zwischen MMPs und TIMPs

fibrosierende Prozesse begünstigt werden; eine überhöhte TIMP-Expression ist

nachgewiesenermaßen mit gesteigerten Fibrosierungsraten vergesellschaftet

(McKaig et al., 2003; Roeb et al, 2000). Ungeklärt sind noch die Mechanismen,

durch die TIMPs einerseits das Zellwachstum fördern und andererseits Zelltod

bewirken und Proliferationssignale unterdrücken können (Sternlicht und Werb,

2001; Brew et al., 2000). Die Expression von TIMPs kann sowohl konstitutionell

als auch induzierbar sein (McKaig et al., 2003). Eine Induktion von TIMP-1 kann

zum Beispiel durch die Entzündungsmediatoren TNF-alpha und IL-1-beta

herbeigeführt werden (Borden und Heller, 1997; Voung et al, 2005; Kralisch et

al, 2006). Knittel et al. zeigten, dass das TIMP-Level direkt nach einer

Verletzung konstant bleibt, in der Entzündungsphase jedoch stark ansteigt und

während der Heilungsphase hoch bleibt (Knittel et al., 2000).

1 Einleitung

11

1.4 ß-Catenin

ß-Catenin wird zu den Proto-Onkogenen gezählt (Alberts et al., 2004). Primär

besitzt ß-Catenin eine Funktion als Strukturprotein, wobei es eine Verbindung

zwischen den E-Cadherinen, die als Adhäsionsmoleküle in der

Plasmamembran liegen, und den Aktinfasern des Zytoskelettes herstellt.

Zusätzlich befindet sich ß-Catenin im Zytoplasma und fungiert als Effektor des

Wnt-Pathways (Lodish et al., 2008; Alberts et al., 2004; Knippers, 2001).

Abbildung 3: ß-Catenin in seiner Funktion als Strukturprotein (Alberts et al., 2004)

Der Wnt/ß-Catenin-Signalweg gehört zu den Schlüsselsignalen der intestinalen

Zellerneuerung indem er den Abbau wachstumsfördernder Proteine verhindert

und Proto-Onkogene wie zum Beispiel c-myc induziert (Alberts et al., 2004; van

Es und Clevers, 2005). Experimente an Mausembryonen zeigten bei

Ausbleiben von Wnt-Signalen zwar die Bildung von Zotten mit differenzierten

Zellen, jedoch blieb die Bildung von Krypten mit Stammzellen aus. Somit war

die intestinale Zellhomöostase empfindlich gestört und die Mäuse starben kurz

nach der Geburt (Alberts et al., 2004).

Ohne Wnt-Signale wird ß-Catenin in einem zytoplasmatischen Komplex aus

Proteinen rasch phosphoryliert und nach Ubiquitinierung im Proteasom

abgebaut (Alberts et al., 2004). Durch die Aktivierung eines Wnt-Signals wird

die Phosphorylierung gestoppt und ß-Catenin wird aus dem zytoplasmatischen

1 Einleitung

12

Proteinkomplex freigesetzt. Das freigesetzte ß-Catenin transloziert in den

Zellkern wo es mit Transkriptionsfaktoren, einem Proteinkomplex aus T-cell

factors (TCFs) sowie den lymphocyte enhancer binding factors (LEFs),

assoziiert (Alberts et al., 2004). Dabei verdrängt ß-Catenin das Co-

Repressorprotein Groucho und wirkt jetzt als Co-Aktivator. Diese aktive

Verbindung LEF-1/TCF/ß-Catenin induziert die Expression bestimmter

Zielgene, indem der LEF-1/TCF als sequenzspezifisch bindende Domäne

fungiert (Lodish et al., 2008; Ouko et al., 2004; Ishizuya-Oka, 2005;

Waltenberger et al., 2001; Zhurinsky et al, 2000). Die Inhibition von ß-Catenin

als Transkriptionsfaktor erfolgt wiederum kinasenabhängig. Es wird nach

Phosphorylierung in Proteasomen aufgenommen und dort abgebaut (Lodish et

al., 2008).

Abbildung 4: Funktion von ß-Catenin im Wnt-Signalweg (Alberts et al., 2004)

Die Rekrutierung von ß-Catenin ist von seiner Verfügbarkeit sowie von seiner

Konstitution (Phosphorylierung) und anderen intrazellulären Prozessen

(Konkurrenz zwischen den unterschiedlichen Bindungspartnern) abhängig. So

verursacht eine vermehrte Präsenz von Cadherinen eine verminderte

1 Einleitung

13

Verfügbarkeit von ß-Catenin in seiner Funktion als Transkriptionsfaktor

(Zhurinsky et al., 2000).

ß-Catenin kann aber auch eine Eskalation oben genannter Kaskaden im Sinne

einer unkontrollierten Transkriptionsaktivität auslösen und sich damit auch

negativ auf die physiologische Zellerneuerung, z.B. in chronischen Wunden,

auswirken. Die physiologische Funktion wechselt je nach Konzentration, Milieu

und Lokalisation. Punktmutationen an den beim Abbau phosphorylierten Enden

führen zu einer Stabilisierung von ß-Catenin. Auf diese Weise kann ß-Catenin,

neben seiner essentiellen Bedeutung für die Zellhomöostase des

Gastrointestinaltraktes und Zellerneuerungsvorgängen, im Falle eines

Kontrolldefizites zu diversen pathologischen Veränderungen wie z.B. Störung

der Zelldifferenzierung und -integrität. Auch in einigen Tumorarten hat man die

Akkumulation von ß-Catenin in den Zellkernen gefunden (Zhurinsky et al.,

2000). Bei einer übermäßigen Aktivierung des ß-Catenin/c-myc-Pathways

kommt es zu einer Aktivierung des Zellzyklus und zur Erschöpfung der Zellen

im Wundgebiet. In einem solchen Fall sind z.B. die Keratinozyten in einem

Zyklus von Aktivierung und Differenzierung blockiert: sie proliferieren, können

aber aufgrund eines inkompletten Aktivierungs-Pathways nicht migrieren

(Stojadinovic et al., 2005). Dies kann zur Konversion einer akuten Wunde in

eine chronische durch übermäßige ß-Catenin-Aktivierung führen (Stojadinovic

et al., 2005).

Versuche von Cheon et al. zeigen, dass Wunden mit einer hohen ß-Catenin-

Konzentration eine gesteigerte mesenchymale Proliferation mit einer größeren

Narbe aufweisen (Cheon et al., 2006). Ferner wurden persistierende

Entzündung, verminderte Aktivität von Wachstumsfaktoren und eine

beeinträchtigte Angiogenese als Folge einer übermäßigen ß-Catenin/c-myc-

Aktivierung beschrieben (Stojadinovic et al., 2005).

1 Einleitung

14

1.5 c-myc

Das Proto-Onkogen c-myc wird u.a. von ß-Catenin als Effektor des Wnt-

Signalweges aktiviert (Alberts et al., 2004; Bernhard und Eilers, 2006). Neben

dem Wnt-Signalweg können aber auch andere Onkogene und Zytokine seine

Expression beeinflussen (Chiariello et al., 2001; Xie et al., 2002). C-myc kodiert

die Translation von Myc-Proteinen, welche wiederum eine erhebliche Anzahl an

Genen regulieren (Alberts et al., 2004). Nach Transkription von c-myc und

Translation von C-Myc-Protein wandert dieses aus dem Zytoplasma in den

Zellkern. Nach Dimerisierung mit einem Partnerprotein bindet es zunächst

unspezifisch an die DNA. Diese Verbindung übernimmt eine Promotorfunktion

und vermittelt die Suche nach einer bestimmten Sequenz. Da die

Partnerproteine teilweise eigenständig als Transkriptionsfaktoren fungieren,

wird angenommen, dass C-Myc-Proteine als Kontrollinstanz dienen (Kato und

Dang, 1992). Niedrige C-Myc-Level werden durch die Partnerproteine

kompetitiv an ihrer Wirkung gehindert. In einigen Tumorarten konnte man

dagegen eine gesteigerte, deregulierte Protein-Aktivität von c-myc feststellen,

die von äußeren Signalen entkoppelt ist (Bernhard und Eilers, 2006).

C-myc hat Einfluss auf Transformation, Mitogenese, Apoptose und Förderung

der Differenzierung. C-myc wird im Zellzyklus für den Übergang von der G1 in

die S-Phase benötigt, es verstärkt die Proliferation von Übergangszellen

(„transitional cells“) (Wang et al., 2002).

Abbildung 5: Abbildung des Zellzyklus und der physiologischen Zellhomöostase (Alberts et al., 2004)

1 Einleitung

15

In gesundem Gewebe und bei unbeeinträchtigter Wundheilung ist c-myc

während der frühen Phase nicht detektierbar (Stojadinovic et al., 2005; Wang et

al., 2002), in aktiv proliferierenden Zellen ist c-myc jedoch in höherem Maße zu

finden als in ausdifferenzierten Geweben ohne Proliferationskapazität (Wang et

al., 2002). C-myc kann analog zu ß-Catenin den Heilungsprozess stören

(Stojadinovic et al., 2005). So ist in chronischen epidermalen Wunden eine

erhöhte Konzentration der beiden Modulatoren vorzufinden. Über eine

Aktivierung des Zellzyklus kommt es hier, wie schon für ß-Catenin beschrieben,

zu einer Erschöpfung der Zellen im Wundgebiet.

Repressionen der c-myc-Expression resultierten in profunden Änderungen der

Zelladhäsion und der Zellmotilität in Verbindung mit einer geringeren

Expression von ECM- und Adhäsionsmolekülen (Frye et al., 2003). Dies wirkt

sich sowohl auf das Apoptoseverhalten von Zellen als auch auf die

Wundheilung aus. Auch für c-myc sind in der Literatur kontroverse Effekte

dokumentiert, so daß Expression und Auswirkung jeweils situativ zu bewerten

sind.

1 Einleitung

16

1.6 Notch-3

Notch-Proteine sind evolutionär hochkonservierte Transmembranrezeptoren.

Sie haben sowohl eine direkte Verbindung zur extrazellulären Matrix als auch

zum Intrazellulärraum (Alberts et al., 2004). Bei Säugetieren sind bislang 4

verschiedene Notch-Proteine bekannt (van Es und Clevers, 2005). Der Notch-

Signalweg besteht aus einem Ligand-Rezeptor-Transkriptionsfaktor-Trio. Notch-

3 fungiert als membrangebundener Transkriptionsfaktor, der nach Aktivierung

durch seine ebenfalls transmembranären Liganden Delta bzw. Jagged/Serrate

von ADAM Proteasen (a disintegrin and a metalloproteinase) und

Presenilin/Sekretase gespalten wird, wodurch seine intrazelluläre Domäne

(Notch-IC) freigesetzt wird. Diese transloziert in den Zellkern und induziert dort

durch Assoziation mit einem sequenzspezifischen DNA-bindenden Protein CSL

(im GI-Trakt RBP/Jk) die Transkription bestimmter Zielgene (Kopan, 2002).

Abbildung 6: Notch-Kaskade a) inaktiv; b) aktiv (van Es und Clevers, 2005)

In Abwesenheit von Notch-3 assoziieren die CSL dagegen mit

Transkripitonssuppressoren und fungieren dann als sogenannte Co-

1 Einleitung

17

Suppressoren (Lai, 2004). Der Notch-Signalweg gehört zu den

Schlüsselsignalen der intestinalen Zellerneuerung (Ishizuya-Oka, 2005). Die

muköse Homöostase beinhaltet eine ständige zelluläre Proliferation,

Differenzierung und Migration von der Basalmembran zur Oberfläche. In

proliferierenden Zellen findet man das nukleäre Notch stark hochreguliert

(Noggle et al., 2006).

Im Intestinum erfüllt der Notch-Signalweg über seinen Liganden Delta

außerdem die Aufgabe der lateralen Inhibition (Alberts et al., 2004). Der

Mechanismus der lateralen Hemmung ist für die Bildung von Grenzen zwischen

zwei Geweben oder Zelltypen notwendig (Lodish et al., 2008). Ein Signal von

Delta wirkt hemmend auf eine Empfängerzelle. Diese kann sich nicht

weiterentwickeln und ist nicht mehr dazu in der Lage, selbst das hemmende

Delta-Signal zu erzeugen. Diese kompetitive Situation führt schließlich zu einer

„Mutterzelle“, die selber keine inhibierenden Signale mehr erhält (Alberts et al.,

2004). So beeinflussen Notch-3 und Delta mit ihrer Interaktion die Entwicklung

endokriner Darmzellen. Tierversuche an Mäusen haben ergeben, dass

Mutationen, die eine Notch-Signalisierung hemmen, die Bildung endokriner

Darmzellen steigern (Alberts et al., 2004).

Abbildung 7: Notch-3 in der intestinalen Zellerneuerung (Alberts et al., 2004)

1 Einleitung

18

Notch-3 ist hauptsächlich an Gefäßen lokalisiert. Es ist in differenziertem

Gewebe nicht aktiv und kann erst durch kationische Chelatoren (z.B. EDTA)

aktiviert werden (Noggle et al, 2006; Mitsiadis et al, 2001). Bekannt ist die

Bedeutung von Notch-3 vor allem aus seiner Rolle in der Pathogenese der

Gefäßerkrankung CADASIL (autosomal dominant erbliche zerebrale

Arteriopathie, die zu subkortikalen Infarkten und Leukoenzephalopathien führt).

Mutationen von Rezeptoren und Liganden lösen bei Säugetieren bereits

während der Embryogenese durch Hämorrhagien den Tod aus.

Für verschiedene Karzinome konnte gezeigt werden, dass sie vermehrt Notch

sowie seine Liganden exprimieren und dass Notch hier über eine

Differenzierungsblockade sowie über die Inhibition von Apoptose das

Tumorwachstum fördert (Gray et al., 1999). Notch-3 führt ohne seinen Liganden

Delta zu exzessiven Mitosen der Zellen (Lodish et al., 2008).

Experimentell konnte nachgewiesen werden, dass Notch-3 mit dem Wnt-

Signalweg interagiert. Unter bestimmten Bedingungen kann Notch-3 diesen

sowohl supprimieren als auch aktivieren (Wang et al., 2007). Einerseits

stimuliert Notch-3-IC (intrazelluläre Domäne) in Verbindung mit einer

gesteigerten Phosphorylierung von ß-Catenin einen Wnt-unabhängigen TCF

(Wang et al., 2007). Hohe Notch-3-IC-Level können außerdem zur vermehrten

Expression von N-Cadherin führen und stabilisieren damit die Zellmembran

(Wang et al., 2007). Auf der anderen Seite ist Notch-3-IC dazu in der Lage,

TCFs zu supprimieren und damit den Wnt-Signalweg zu indirekt zu fördern.

ß-Catenin und Notch-3 dienen durch sich überlagernde und ergänzende Effekte

der Zellhomöostase.

1 Einleitung

19

1.7 Zink

1.7.1 Allgemeine Bedeutung

Zink ist als divalentes Kation ein essentielles Spurenelement und erfüllt im

Stoffwechsel spezifische Funktionen als Bestandteil oder Aktivator von mehr als

300 Enzymen des Protein-, Kohlenhydrat-, Fett- und

Nukleinsäurestoffwechsels, sowie als Bestandteil von Hormonen und

Rezeptoren, in der Insulinspeicherung und im Immunsystem (Rink und Gabriel,

2000; Haase und Rink, 2006). Nach Eisen ist Zink das häufigste Metallion des

Körpers (Coleman, 1992). 1932 konnte erstmals nachgewiesen werden, dass

die Carboanhydrase gebundenes Zink enthält, welches mit der katalytischen

Aktivität zusammenhängt. Damit war die Carboanhydrase das erste entdeckte

zinkhaltige Enzym. Auch bei den Matrix-Metalloproteinasen ist ein Zinkion im

aktiven Zentrum nachgewiesen und somit für den Um- und Abbau von

Geweben essentiell (Haase und Rink, 2006; Berg et al., 2003). Zink greift durch

die Beeinflussung dieser Enzyme steuernd in Differenzierung, Proliferation und

Zelltod ein.

Zink kann protektiv wirken, indem es die Zelle als Chelatbildner vor

chemischen, physikalischen oder immunologischen Einflüssen schützt.

Zinkmangel kann durch eine Aktivierung von Endonukleasen Apoptose

induzieren (Sunderman, 1995). Schon 1974 konnten Prasad und Oberleas

belegen, dass Zinkmangel die Aktivität der Thymidinkinase und der DNA-

Synthese in schnell regenerierendem Bindegewebe nachteilig beeinflusst

(Prasad und Oberleas, 1974). Später konnte von Prasad et al. eine signifikante

Beeinträchtigung des Zellzyklus beobachtet werden, welche sich im

Besonderen durch eine verminderte Progression in die S-Phase des Zellzyklus

ausdrückte (Prasad, 1996). Vor allem in stärker proliferierenden Geweben, und

insbesondere dem Immunsystem, ist Zink ein äußerst wichtiger Faktor (Krones

et al., 2005; Ibs und Rink, 2003; Rink und Gabriel, 2000). Die intestinale

Schleimhaut gehört zu den wachstumsaktiven Geweben, so dass Vermutungen

über eine besondere Bedeutung von Zink nahe liegen. Die Hauptspeicher des

Körpers für Zink sind das Skelett, sowie Muskel- und Fettgewebe. Diese

können einen Mangel für einige Wochen ohne Plasmaspiegelschwankungen

1 Einleitung

20

kompensieren (Windisch, 2003). Die Resorption findet hauptsächlich im

Dünndarm statt, wobei das Ileum die weitaus größte Kompetenz aufweist

(Antonson et al., 1979). Aber auch das Kolon spielt bei der Resorption von Zink

eine nicht unerhebliche Rolle. Es ist als zinksensitives Organ anzusehen,

welches dazu in der Lage ist, auf Zinkmangel mit der Expression von Zink-

Transporterproteinen zu reagieren (Pfaffl und Windisch, 2003). Auch bei der

Ausscheidung von Zink übernimmt der Darm die tragende Rolle. So enthalten

Pankreas- und Gallensaft sowie gastroduodenale Sekrete einen

vergleichsweise hohen Zinkgehalt, welcher bei einer Mangelsituation vollständig

rückresorbiert werden kann. Um diese physiologischen Abläufe der Resorption

experimentell zu verhindern, und um die körpereigenen Zinkvorräte zu leeren,

kann einer zinklosen Diät der Absorptionshemmer Phytat zugesetzt werden.

Phytat hemmt die Resorbierbarkeit von Zink durch die Bildung eines

schwerlöslichen Komplexes (Windisch und Kirchgessner, 1999). Weitere

Faktoren, welche die Zinkverwertung beeinflussen können, sind unter anderem

die Zusammensetzung der Nahrung (insbesondere Wechselwirkungen mit

anderen Nahrungsbestandteilen wie z.B. Calcium und Phytat),

Stresssituationen, chirurgische Eingriffe, parasitäre Erkrankungen und

Infektionen.

Ein akuter Zinkmangel ist selten. Begünstigende Situationen findet man

beispielsweise bei Malabsorptionssyndromen, parenteraler Ernährung,

Behandlung mit Chelatbildnern und großflächigen Verbrennungen vor. Ein

latenter, chronischer Zinkmangel ist allerdings auch in den westlichen Ländern,

gerade bei älteren Menschen, häufig anzutreffen (Prasad, 1996; Sandstead und

Smith, 1996).

Bei schwerem Zinkmangel treten Verminderungen der

Geschmacksempfindung, Appetitlosigkeit, Dermatitis, Haarausfall, Durchfall und

neuropsychische Störungen auf. Darüber hinaus sind Wachstumsstörungen,

Störungen der männlichen Sexualentwicklung und Reproduktionsfunktion, eine

erhöhte Infektanfälligkeit und Störungen der Wundheilung beschrieben. Ein

bekanntes Beispiel für Zinkmangel ist die autosomal rezessiv erbliche Krankheit

Acrodermatitis enteropathica. Hier handelt es sich um einen Defekt der

enteralen Zinkaufnahme, der sich in einer Thymusatrophie und einem für

1 Einleitung

21

diverse Infektionen sehr anfälligen Phänotyp manifestiert. Die Symptomatik und

die ohne Behandlung sehr kurze Lebenserwartung von wenigen Jahren kann

durch die pharmakologische Supplementierung von Zink komplett revidiert

werden (Haase und Rink, 2006).

1.7.2 Zink in der Wundheilung

Die Eigenschaften von Zink können sich auf die komplexe Regulation der

Wundheilung auswirken. Eine Dysregulation des Zinkhaushaltes kann

theoretisch positive oder negative Effekte auf die Regeneration haben. Zink

akkumuliert in experimentellen Wunden. Diese Anreicherung tritt direkt nach

einer Verletzung auf und erreicht zwischen dem 5. und 7. Tag ein Maximum.

Der Zinkgehalt normalisiert sich bis zum 15. postoperativen Tag, zu diesem

Zeitpunkt hat auch die Zugfestigkeit des heilenden Gewebes ihren Höhepunkt

erreicht. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass der Heilungsprozess

in den ersten sieben Tagen ein erhöhtes Zinkniveau benötigt (Kaplan et al.,

2004; Oberleas et al, 1971). Dass in stark proliferierenden Geweben eine

höhere Zinkkonzentration vorzufinden ist, impliziert, dass Zink auch in der

Wundheilung intestinaler Gewebe eine besondere Stellung einnimmt (Haase

und Rink, 2006; Ibs und Rink, 2003). Diese Annahme wird durch Ergebnisse

von Vaxman et al. unterstützt, die den Zinkgehalt im Blut sowie im Kolon von

Kaninchen nach Anastomosierung untersuchten. Es ließ sich ein

Konzentrationsabfall im Blut und ein –anstieg in der Darmwand darstellen

(Vaxman et al., 1992). Andere Studien sprechen Zink eine besondere Stellung

während der Reifungsphase, also in späteren Phasen der Wundheilung, zu.

Hier wird Zink eine Funktion als Effektor der Proteinsynthese und somit eine

notwendige Heilungsvoraussetzung zugesprochen (Senapati und Thompson,

1985).

Die Effizienz einer Behandlung zinkhaltigen Zusätzen (in der lokalen

Applikation) konnte mit einer geringeren Entzündungsreaktion sowie einer

gesteigerten Mitoserate und einem verminderten Bakterienwachstum auch bei

nicht zinkdefizitären Patienten belegt werden (Agren, 1990). In der topischen

1 Einleitung

22

Anwendung bei oberflächlichen Wunden und Ulzera sind zinkhaltige Salben

bereits etabliert.

Zink ist Bestandteil jeder Matrixmetalloproteinase und damit auch notwendiger

Bestandteil der ECM, deren Stoffwechsel wichtige Einflussgröße auf die

Qualität der Wundheilung ist.

2 Zielsetzung

23

2 Zielsetzung

Trotz weitreichender Fortschritte in Technik und Durchführung der

Darmchirurgie ist die intestinale Wundheilung weiterhin ein zentrales Thema

chirurgischer Forschung. Anastomoseninsuffizienzen stellen immer noch den

größten Teil der lebensbedrohlichen Komplikationen bei diesen Eingriffen dar.

Verschiedene Arbeiten diskutieren bereits prädisponierende Faktoren. Zu

diesen zählt auch der Einfluss von Zink bzw. einem Zinkmangel. Insgesamt gibt

es derzeit jedoch erst einzelne Untersuchungen zu dem komplexen

Themengebiet der intestinalen Wundheilung, welche die Problematik noch nicht

in ihrer Gesamtheit klären.

Im Focus dieser Arbeit steht deshalb das Verhalten der ECM bzw. ihrer

Wechselspieler während der frühen postoperativen Phase. esonders

betrachtet werden dabei die vier Komponenten TIMP-1, ß-Catenin, c-myc und

Notch-3 und ihr Verhalten unter einem kontrollierten Zinkmangel. Unter diesen

Bedingungen werden auch die Einflüsse von Nahttechnik und Lokalisation

geprüft.

Das Ziel der Arbeit ist die Klärung folgender Fragen:

1) Verändert sich das Expressionsmuster der untersuchten Variablen

während der Wundheilung im Zinkmangel?

2) Wie greift Zink in die Funktionalität der untersuchten Faktoren ein?

3) Beeinflusst die Schnittführung – Kolotomie versus zirkuläre

Kolonanastomose – dabei die Wundheilung?

3 Material und Methoden

24


3.1 Tiermodell

Die Tierversuche zu dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den

nationalen Vorgaben des Tierschutzgesetzes und den internationalen

Richtlinien der Versuchstierhaltung durchgeführt.

Als Versuchstiere wurden 40 männliche Wistar Ratten mit einem

Ausgangsgewicht von 220 – 240 g eingesetzt. Von den 40 eingesetzten

Versuchstieren starben zwei bereits präoperativ im Zinkmangel an einer

Pneumonie. Bei drei weiteren Tieren kam es perioperativ zum Exitus. Nach

Randomisierung wurden die Tiere 4 Gruppen zugeteilt. Die Gruppen 1 (n = 7)

und 2 (n = 12) bildeten die Kontrollgruppen, während bei den Tieren aus

Gruppe 3 (n = 8) und Gruppe 4 (n = 8) ein kontrollierter Zinkmangel induziert

wurde. Alle Tiere wurden hierzu über 21 Tage in Einzelhaltung kontrolliert

ernährt. Das Futter wurde für alle Gruppen vom gleichen Hersteller bezogen

und unterschied sich in der Zusammensetzung nur im Zinkgehalt. Jedes Tier

erhielt in den ersten 14 Tagen 8 g Futter pro Tag. Diese Ration wurde in den

folgenden 7 Tagen auf 12 g pro Tag erhöht.

Vorarbeiten von Windisch zur Induktion von Zinkmangel in der adulten Ratte

entsprechend (Windisch, 2003), lag der Zinkgehalt der zinkarmen Diät bei 5,9

mg/KG (C1040 zinkarm, Altromin, Lage, Deutschland) und in der

Kontrollgruppe bei 58,4 mg/KG (C1040 mod, Altromin, Lage, Deutschland).

Nach 21 Tagen kontrollierter Ernährung wurde der in den Gruppen 3 (n = 8)

und 4 (n = 8) induzierte Zinkmangel durch Haaranalysen mittels

Atomabsorptionsspektralphotometrie (AAS) geprüft (Spectrophotometer

Quantum-2, Cortec, Moskau, Russland). Der Zinkgehalt in den Proben der

Gruppen 3 und 4 lag dabei signifikant (p < 0,05) unterhalb der Werte aus den

Kontroll-Gruppen 1 (n = 7) und 2 (n = 12).

Nach der Bestimmung des Zinkgehaltes wurden die Versuchstiere

unterschiedlichen Operationen am Kolon unterzogen. Bei den Gruppen 1

(Kontrolle) und 3 (Zinkmangel) wurden zirkuläre Kolonanastomosen und bei

den Gruppen 2 (Kontrolle) und 4 (Zinkmangel) Kolotomien mit anschließendem


25

Nahtverschluss durchgeführt. Alle Maßnahmen erfolgten unter sterilen

Bedingungen. Die Einleitung der Narkose erfolgte mit Isofluran und wurde über

eine subkutane Injektion von 0,3 ml/kg Medetomidin und 100 mg/kg

Ketaminhydrochlorid aufrechterhalten. Nach medianer Laparotomie wurde das

Kolon zirkulär oder antimesenterial längs eröffnet und in direktem Anschluss in

allschichtiger, einreihiger Einzelknopfnaht mit 5-0 multifilen Polyclagtin 910-

Fäden (Vicryl, Ethicon Products, Norderstedt, Deutschland) wieder

verschlossen. Postoperativ wurde die gewohnte Fütterung beibehalten. Am 7.

postoperativen Tag wurden die Tiere getötet, gewogen und die operierten

Darmschlingen explantiert.

Nach Kolonanastomose kam es sowohl in der Kontroll- und der

Zinkmangelgruppe zu je einer Insuffizienz. In der Kontrollgruppe kam es auch

nach Kolotomie zu einer Nahtundichtigkeit. Alle Insuffizienzen führten über

Peritonitis und/oder Ileus zum Tod. Bei numerischer Übereinstimmung wurde

auf eine Signifikanzprüfung verzichtet.

3.2 Histologie

Die histologische Aufarbeitung aller explantierten Anastomosen und Darmnähte

erfolgte primär über eine 24-stündige Fixation in 10 % Formalin. Darauf folgte

die Dehydrierung und Paraffineinbettung. Anschließend wurden die Proben in

10-15, 3-5 m dicke Stufenschnitte unterteilt. Zur histologischen Auswertung

wurden die Stufenschnitte mit Hämatoxylin & Eosin (H&E) gefärbt. Prinzipiell

wurden für alle weiteren Untersuchungen pro Tier Blöcke von je zwei

Lokalisationen angefertigt:

1. Anastomose, Kolotomie

2. anastomosen-/Kolotomiefern


26

3.3 Immunhistochemische Aufarbeitung

Bei den durchgeführten immunhistologischen Färbungen kamen käuflich

erwerbbare Antikörper unterschiedlicher Firmen zum Einsatz. Das in zehn

prozentig gepuffertem Formalin fixierte Gewebe wurde zunächst

zurechtgeschnitten, im Gewebeentwässerungsautomat (V.I.P E 150, Firma

Vogel, Gießen, Deutschland) entwässert und nachfolgend in Paraffin

eingebettet (Histoembedder, Firma Jung, Heidelberg, Deutschland). Mit Hilfe

eines Schlittenmikrotoms (Firma Jung, Heidelberg, Deutschland) erfolgte die

Herstellung von etwa 3 µm dicken Schnitten. Diese wurden anschließend bei

37°C im Brutschrank über Nacht entparaffiniert. Danach erfolgten die

unterschiedlichen immunhistologischen Färbungen.

Die Aufbereitung der Proben erfolgte nach der Avidin-Biotin Methode. Zunächst

wurde ein Primärantikörper verwendet, der jeweils gegen das zu detektierende

Antigen gerichtet war. Anschließend diente ein biotinylierter Sekundärantikörper

dazu, die gebundenen Primärantikörper zu markieren. Danach erfolgte die

Zugabe des Avidin-Biotin-Enzymkomplexes, welcher mit dem biotinylierten

Sekundärantikörper reagiert. Als Substrat zur Farbentwicklung diente DAB (3,3

Diaminobenzidine tablets, Firma Sigma, Steinheim, Deutschland). Das

Verfahren ist im Folgenden genauer beschrieben.

Nach einer Inkubation von 60 min mit einem in zwei prozentigem Milchpulver

verdünnten Normalserum wurde der jeweilige Primärantikörper hinzu pipettiert

und über Nacht bei 4°C im Kühlschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden die

Proben auf Raumtemperatur gebracht, mit PBS (Phosphate Buffered Saline)

gespült und dann mit dem Sekundärantikörper versehen. Nach 30-minütiger

Inkubation bei Raumtemperatur wurde nach erneuter Spülung der ABC-

Komplex hinzugefügt und eine halbe Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach einer weiteren Spülung mit PBS erfolgte die Zugabe von aktiviertem DAB.

Eine mehrfache Waschung mit Wasser entfernte die Reste der Lösung. Zum

Abschluss wurden die Schnitte nun noch für 18 sec in Hämalaunlösung (Firma

Merck, Darmstadt, Deutschland) eingestellt, erneut gespült und durch eine

aufsteigende Alkoholreihe gezogen.


27

3.4 Färbungen

3.4.1 TIMP-1

Bei der TIMP-1 Färbung (Firma ABR, CO, USA) wurde der polyklonale

Kaninchen Antikörper 1:500 verdünnt. Der biotinylierte Ziege-Anti-Kaninchen

Sekundärantikörper (Firma Dako, Dänemark) wurde in einer Verdünnung von

1:500 verwendet. Abbildung 8 zeigt ein schnittnahes Kolotomiepräparat der

Kontrollgruppe. Entsprechend des zur Farbentwicklung verwendeten Substrates

(DAB) ist die TIMP-1-Konzentration jeweils durch die rotbraune Färbung

gekennzeichnet. In der folgenden Abbildung zeigt sich die Expression verstärkt

in den Zellen der Mukosa.

Abbildung 8: Beispielpräparat TIMP-1; Kontrolle, Kolotomie, schnittnah (eig. Abbildung)

Anmerkung: TIMP-1 ist rotbraun dargestellt


28

3.4.2 ß-Catenin

Bei der ß-Catenin Färbung (Firma Abcam, Cambridge, UK) wurde der

monoklonale Maus Antikörper 1:500 verdünnt. Die Vorbehandlung erfolgte in

der Mikrowelle bei 600 Watt mit Citratpuffer (pH 6) für zwei mal zehn Minuten.

Der biotinylierte Kaninchen-Anti-Maus Sekundärantikörper (Firma Dako,

Dänemark) wurde in einer Verdünnung von 1:300 verwendet. Abbildung 9 zeigt

ein schnittfernes Anastomosenpräparat der Kontrollgruppe. Entsprechend des

zur Farbentwicklung verwendeten Substrates (DAB) ist die ß-Catenin-

Konzentration jeweils durch die rotbraune Färbung gekennzeichnet. Diese zeigt

sich in dem hier dargestellten Präparat am deutlichsten in den junktionalen

Abschnitten der Mukosa.

Abbildung 9: Beispielpräparat ß-Catenin; Kontrolle, Anastomose, schnittfern (eig. Abbildung)

Anmerkung: ß-Catenin ist rotbraun dargestellt


29

3.4.3 c-myc

Bei der c-myc Färbung (Firma Santa Cruz, CA, USA) wurde der polyklonale

Kaninchen Antikörper 1:100 verdünnt. Der biotinylierte Ziege-Anti-Kaninchen

Sekundärantikörper (Firma Dako, Dänemark) wurde in einer Verdünnung von

1:500 verwendet. Abbildung 10 zeigt ein schnittnahes Anastomosenpräparat

der Kontrollgruppe. Entsprechend des zur Farbentwicklung verwendeten

Substrates (DAB) ist die c-myc-Konzentration jeweils durch die rotbraune

Färbung gekennzeichnet. In dem hier abgebildeten Präparat zeigt sich diese

verstärkt im Zytoplasma der Mukosazellen.

Abbildung 10: Beispielpräparat c-myc; Kontrolle, Anastomose, schnittnah (eig. Abbildung)

Anmerkung: c-myc ist rotbraun dargestellt


30

3.4.4 Notch-3

Der Notch-3-Antikörper (Firma Santa Cruz, CA, USA) ist ein polyklonaler

Kaninchen-Antikörper. Der Primärantikörper wurde in einer Verdünnung 1: 100

verwendet. Die Vorbehandlung erfolgte in der Mikrowelle bei 600 Watt mit

Citratpuffer (pH 6). Als Sekundärantikörper diente ein biotinylierter Ziege- Anti-

Kaninchen Antikörper (Firma Dako, Dänemark), der in einer Verdünnung von

1:500 verwendet wurde. Abbildung 11 zeigt ein schnittfernes

Anastomosenpräparat der Zinkmangelgruppe. Entsprechend des zur

Farbentwicklung verwendeten Substrates (DAB) ist die Notch-3-Konzentration

jeweils durch die rotbraune Färbung gekennzeichnet. Das abgebildete Präparat

zeigt eine relativ homogene Expression in Mukosa und Submukosa mit

Betonung der Zellkerne.

Abbildung 11: Notch-3 Präparat; Zinkmangel, Anastomose, schnittfern (eig. Abbildung)

Anmerkung: Notch-3 ist rotbraun dargestellt


31

3.5 Auswertung

Alle Schnittpräparate wurden über eine auf dem Mikroskop installierte

Digitalkamera (Olympus C-3030, Olympus, Hamburg, Deutschland) erfasst.

Jedes Bild wurde in 400facher Vergrößerung angefertigt und mittels der

Software Olympus DP-Soft 3.1 (Olympus, Hamburg, Deutschland) archiviert.

Es wurden für alle untersuchten Variablen (TIMP-1, c-myc, ß-Catenin und

Notch-3) zwölf Bilder der Mukosa (je sechs von Zotten und Krypten) und sechs

Bilder der Submukosa anastomosenfern bzw. schnittfern sowie zwölf Bilder der

Mukosa (je sechs von Zotten und Krypten) und sechs Bilder der Submukosa

anastomosen-/schnittnah mit Hilfe des Remmele-Scores bewertet. So konnten

insgesamt Unterschiede der Faktorexpression in Abhängigkeit vom

Zinkhaushalt und der Operationstechnik beurteilt werden. Die folgende Grafik

zeigt die Beziehungen zwischen den einzelnen gestesteten Regionen dar.

Abbildung 12: Schaubild der Untersuchungsebenen (eigene Darstellung)


32

3.5.1 Remmele-Score

Beurteilt wurden die Präparate nach dem Vorbild des semi-quantitativen

Remmele-Scores, der folgendermaßen modifiziert wurde (Remmele und

Stegner, 1987).

Der Bewertung der Färbeintensität liegt ein vierstufiger Score zugrunde:

1= keine Färbereaktion

2= schwache Färbereaktion

3= mäßige Färbereaktion

4= starke Färbereaktion

Die Auswertung der Anzahl der positiven Zellen erfolgte mittels eines

fünfstufigen Scores:

1= keine positive Zelle

2= <10% positive Zellen

3= 10-50% positive Zellen

4= 51-80% positive Zellen

5= >80% positive Zellen

Die Multiplikation beider Scores ergab den Gesamtscore auf einer Skala von 1-

20. Eine zehnprozentige Rate von Zellen mit erkennbarer

immunhistochemischer Reaktion wurde dabei als Schwellenwert einer

relevanten Reaktion definiert.


33

3.5.2 Statistik

Die statistische Analyse wurde mit dem Statistical Package for Social Sciences

Version 10.0 (SPSS®) durchgeführt. Die Insuffizienzraten der verschiedenen

Gruppen (Kolotomie vs. Kolonanastomose, Zinkmangel-Gruppe vs.

Kontrollgruppe) wurden aufgrund der numerischen Übereinstimmung nicht mit

dem Chi-Quadrat-Test auf ihre Unabhängigkeit geprüft.

Die Auswertung der Expression der einzelnen Faktoren – TIMP-1, ß-Catenin, c-

myc und Notch-3 – erfolgte mittels der zugeordneten Scores Die Expression

wurde bezüglich ihrer Beeinflussbarkeit durch die Untersuchungsgruppe

(Kontrolle vs. Zinkmangel) analysiert. Zur Überprüfung der

Gruppenunterschiede auf ihre Signifikanz kam der Mann-Whitney-Wilcoxon-

Test (U-Test) zum Einsatz. Dieser Test wurde gewählt, da ordinalskalierte

Variablen (Scores) zur Beurteilung der Merkmale vergeben wurden. Aufgrund

der mehrfachen Aufteilung des Versuchsaufbaus wurden paarweise Vergleiche

für nicht parametrische Daten durchgeführt. Im Sinne einer explorativen

Analyse wurde ein p-Wert kleiner oder gleich 0,05 als Indikator einer lokalen

statistischen Signifikanz betrachtet. Die Boxplots stellen die Ergebnisse

graphisch dar. Der Boxplot dient der Darstellung der Merkmalsverteilung

beruhend auf Quartilen. Der Kasten stellt dabei den Interquartilsabstand dar,

die davon ausgehenden Linien führen zum Minimum und zum Maximum

(maximal das 1,5-fache des Interquartilsabstandes), die waagerechte Linie gibt

den Median wieder, Ausreißer sind in Punktform dargestellt.

4 Ergebnisse

34

4 Ergebnisse

Zwei Tiere starben präoperativ im Rahmen des Zinkmangels an einer

Pneumonie. Postoperativ traten insgesamt drei Nahtinsuffizienzen auf. In der

Kontrollgruppe trat bei Anastomosen und Kolotomien jeweils eine Insuffizienz

auf, in der Zinkmangelgruppe kam es zu einer Anastomoseninsuffizienz. Alle

Insuffizienzen führten zum Tod. Aufgrund der geringen Zahl wurde auf eine

Signifikanzprüfung verzichtet. Abbildung 12 stellt den allgemeinen

Versuchsaufbau dar und zeigt die untersuchten Einflussfaktoren im

Zusammenhang. Wie abgebildet, erfolgt innerhalb der Gruppen eine

Aufspaltung unter Berücksichtigung der untersuchten Variablen. Variabel ist

jeweils die Gruppe (Kontrolle – Zinkmangel), die Nahttechnik (Anastomose –

Kolotomie), die Lokalisation (Schnittnah – Schnittfern) und die Region (Mukosa

– Submukosa). Die vier untersuchten Faktoren werden nacheinander in

separaten Kapiteln abgehandelt.

Signifikante Ergebnisse sind in den nachfolgenden Tabellen mit Sternchen

gekennzeichnet. Es werden ausschließlich die signifikanten Ergebnisse in

Boxplots dargestellt.

4 Ergebnisse

35

4.1 TIMP-1

Die Gruppenvergleiche (Kontrolle vs. Zinkmangel) für TIMP-1 sind in Tabelle 1

dargestellt. Sie zeigen keine statistische Signifikanz.

Tabelle 1: p-Werte der TIMP-1-Scores im Vergleich der Gruppen (Kontrolle vs. Zinkmangel)

Kontrolle vs. Zinkmangel

p-Wert

Mukosa 0.898

Submukosa 0.823

Mukosa 0.194

Submukosa 0.942

Mukosa 0.484

Submukosa 0.898

Mukosa 0.315

Submukosa 0.835

Region

Anastomose

Kolotomie

Schnittnah

Schnittfern

Nahttechnik Lokalisation

Schnittnah

Schnittfern

Tabelle 2 stellt die Vergleiche der Nahttechniken (Anastomose vs. Kolotomie)

dar. Signifikanz zeigen die Vergleiche der schnittnahen Mukosa zwischen

Anastomose und Kolotomie sowohl innerhalb der Kontrollgruppe als auch

innerhalb der Zinkmangelgruppe. Beide Regionen weisen ein vergleichbares

Expressionsmuster bezogen auf die Höhe der Scores bei deutlich stärkerer

Expression in den Anastomosenpräparaten auf (Abbildung 13 und Abbildung

14)

4 Ergebnisse

36

Tabelle 2: p-Werte der TIMP-1-Scores im Vergleich der Nahttechniken (Anastomose vs. Kolotomie)

Anastomose vs. Kolotomie

p-Wert

Mukosa 0,000*

Submukosa 0,378

Mukosa 0,317

Submukosa 0,389

Mukosa 0,001*

Submukosa 0,435

Mukosa 0,169

Submukosa 0,725

Region

Kontrolle

Zinkmangel

Schnittnah

Schnittfern

Gruppe Lokalisation

Schnittnah

Schnittfern

Abbildung 13: TIMP-1-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittnahe Mukosa (Kontrollgruppe)

4 Ergebnisse

37

Abbildung 14: TIMP-1-Expression im Vergleich der Nahttechnik für schnittnahe Mukosa (Zinkmangelgruppe)

4 Ergebnisse

38

4.2 ß-Catenin

Die Auswertung von ß-Catenin zeigt im Vergleich der Zinkgruppen

(Kontrolle/Mangel) signifikante Ergebnisse (Tabelle 3) allerdings nur in der

submukösen Lokalisation nach Kolotomie. Abbildung 15 und Abbildung 16

zeigen die signifikant stärkere Expression in den Präparaten der Kontrollgruppe.

Keine signifikanten Unterschiede erbrachte der Vergleich der

Anastomosenpräparate.

Tabelle 3: p-Werte der ß-Catenin-Scores im Vergleich der Gruppen (Kontrolle vs. Zinkmangel)


p-Wert

Mukosa 0,757

Submukosa 0,562

Mukosa 0,094

Submukosa 0,593

Mukosa 0,343

Submukosa 0,007*

Mukosa 0,390

Submukosa 0,003*

Region

Anastomose

Kolotomie

Schnittnah

Schnittfern


Schnittnah

Schnittfern

4 Ergebnisse

39

Abbildung 15: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Gruppen für schnittferne Submukosa (Kolotomie)

Abbildung 16: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Gruppen für schnittferne Submukosa (Kolotomie)

4 Ergebnisse

40

Im Vergleich der Nahttechniken bot die ß-Catenin-Expression in den

Kolotomiepräparaten vereinzelt eine signifikante Erhöhung im Vergleich zur

Anastomosentechnik. (Tabelle 4). In allen Gruppen zeigen sich die Werte der

Scores auf vergleichbarem Niveau (Abbildung 17 und Abbildung 18).

Tabelle 4: p-Werte der ß-Catenin-Scores im Vergleich der Nahttechniken (Anastomose vs. Kolotomie)


p-Wert

Mukosa 0,000*

Submukosa 0,224

Mukosa 0,914

Submukosa 0,415

Mukosa 0,025*

Submukosa 0,177

Mukosa 0,298

Submukosa 0,025*

Region

Kontrolle

Zinkmangel

Schnittnah

Schnittfern

Gruppe Lokalisation

Schnittnah

Schnittfern

Abbildung 17: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Nahttechnik für schnittnahe Mukosa (Kontrollgruppe)

4 Ergebnisse

41

Abbildung 18: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Nahttechnik für schnittnahe Mukosa (Zinkmangelgruppe)

Gegenteilig stellt sich das signifikante Ergebnis der schnittfernen Submukosa

der Kolotomien im Vergleich mit der schnittfernen Submukosa der

Anastomosen innerhalb der Zinkmangelgruppe dar. Die graphische

Gegenüberstellung der Scores ist in Abbildung 19 dargestellt. Hier ist die

Expression in den Präparaten der Anastomosen deutlich höher als in denen der

Kolotomien. Für den gleichen Vergleich ergeben sich in der Kontrollgruppe

keine signifikanten Abweichungen.

4 Ergebnisse

42

Abbildung 19: ß-Catenin-Expression im Vergleich der Nahttechnik für schnittferne Submukosa (Zinkmangelgruppe)

In Abbildung 20 und Abbildung 21 sind zwei Beispielpräparate für ß-Catenin

dargestellt. Man erkennt im Vergleich deutlich eine stärkere zytoplasmatische

Anfärbung im anastomosennahen Schnittbild. Anastomosenfern konzentriert

sich die rotbraune Färbung mehr auf die junktionalen Abschnitte.

4 Ergebnisse

43

Abbildung 20: ß-Catenin-Präparat der Kontrollgruppe; anastomosennah (eigene Abbildung); ß-Catenin ist entsprechend des Farbsubstrates (DAB) rotbraun angefärbt.

Abbildung 21: ß-Catenin-Präparat der Kontrollgruppe; anastomosenfern (eigene Abbildung); ß-Catenin ist entsprechend des Farbsubstrates (DAB) rotbraun angefärbt, hier v.a. junktional.

4 Ergebnisse

44

4.3 c-myc

Die Auswertung der c-myc-Spiegel bot die meisten signifikanten Unterschiede.

In den Anastomosenpräparaten konnte eine höhere c-myc-Expression für die

Kontrollgruppe (vs. Zinkmangel) dokumentiert werden. Dies gilt sowohl für

schnittnahe und schnittferne Präparate als auch für Mukosa und Submukosa

(Tabelle 5). Auffällig ist, dass die Scores der schnittnahen Mukosa denen der

schnittfernen Submukosa in etwa gleich sind, wobei die schnittferne Mukosa

eine deutlich geringere c-myc-Expression zeigt (Abbildung 22, Abbildung 23

und Abbildung 24)

Tabelle 5: p-Werte der c-myc-Scores im Vergleich der Gruppen (Kontrolle vs. Zinkmangel)


p-Wert

Mukosa 0,007*

Submukosa 0,194

Mukosa 0,008*

Submukosa 0,002*

Mukosa 0,160

Submukosa 0,531

Mukosa 0,706

Submukosa 0,833

Region

Anastomose

Kolotomie

Schnittnah

Schnittfern


Schnittnah

Schnittfern

4 Ergebnisse

45

Abbildung 22: c-myc-Expression im Gruppenvergleich für schnittnahe Mukosa (Anastomose)

Abbildung 23: c-myc-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Mukosa (Anastomose)

4 Ergebnisse

46

Abbildung 24: c-myc-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Submukosa (Anastomose)

In Tabelle 6 werden die Vergleiche von Anastomosen und Kolotomien

dargestellt. Die Gegenüberstellung der Mediane für die kolotomieferne

Submukosa bzw. Mukosa mit der anastomosenfernen Submukosa bzw.

Mukosa zeigen in der Kontrollgruppe signifikante Unterschiede zwischen

Anastomose und Kolotomie. Diese stellen sich im Sinne einer deutlich höheren

Expression in den Kolotomiepräparaten dar. Zusätzlich zeigt sich, dass die

schnittferne Submukosa deutlich mehr c-myc exprimiert als die schnittferne

Mukosa (Abbildung 25 und Abbildung 26). Gleiches Expressionsmuster zeigt

sich für die Zinkmangelgruppe. Hier sind die für die Kontrollgruppe genannten

Vergleiche auch in den schnittnahen Präparaten signifikant. Analog zur

Kontrollgruppe präsentieren sich die Kolotomiepräparate der Zinkmangelgruppe

mit einer deutlich höheren c-myc-Expression. Vergleicht man die Höhe der

Scores, exprimiert die Submukosa ebenfalls deutlich mehr c-myc als die

Mukosa (Abbildung 27, Abbildung 28 und Abbildung 29)

4 Ergebnisse

47

Tabelle 6: p-Werte der c-myc-Scores im Vergleich der Nahttechniken (Anastomose vs. Kolotomie)


p-Wert

Mukosa 0,175

Submukosa 0,722

Mukosa 0,000*

Submukosa 0,001*

Mukosa 0,001*

Submukosa 0,448

Mukosa 0,000*

Submukosa 0,001*

Region

Kontrolle

Zinkmangel

Schnittnah

Schnittfern

Gruppe Lokalisation

Schnittnah

Schnittfern

Abbildung 25: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne Mukosa (Kontrolle)

4 Ergebnisse

48

Abbildung 26: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne Submukosa (Kontrolle)

Abbildung 27: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittnahe Mukosa (Zinkmangel)

4 Ergebnisse

49

Abbildung 28: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne Mukosa (Zinkmangel)

Abbildung 29: c-myc-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne Submukosa (Zinkmangel)

4 Ergebnisse

50

4.4 Notch-3

Signifikante Ergebnisse ergeben sich für Notch-3 aus den Vergleichen

zwischen den anastomosen- und den kolotomiefernen Präparaten im

Gruppenvergleich (Tabelle 7). Dies gilt sowohl für die Mukosa als auch für

Submukosa. Wobei auch bei Notch-3 die Submukosa eine deutlich höhere

Notch-3-Expression zeigt (Abbildung 31). Die Scores für die schnittnahe

Mukosa sind in den Anastomosen und Kolotomien vergleichbar, wie Abbildung

30 und Abbildung 32 zeigen. Übereinstimmend für alle signifikanten Ergebnisse

von Notch-3 ist eine deutlich höhere Notch-3-Expression in den Präparaten der

Zinkmangelgruppe.

Tabelle 7: p-Werte der Notch-3-Scores im Vergleich der Gruppen (Kontrolle vs. Zinkmangel)


p-Wert

Mukosa 0.502

Submukosa 0.309

Mukosa 0.005*

Submukosa 0.022*

Mukosa 0.687

Submukosa 0.647

Mukosa 0.006*

Submukosa 0.481

Region

Anastomose

Kolotomie

Schnittnah

Schnittfern


Schnittnah

Schnittfern

4 Ergebnisse

51

Abbildung 30: Notch-3-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Mukosa (Anastomose)

Abbildung 31: Notch-3-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Submukosa (Anastomose)

4 Ergebnisse

52

Abbildung 32: Notch-3-Expression im Gruppenvergleich für schnittferne Mukosa (Kolotomie)

Tabelle 8 zeigt die Vergleiche der Nahttechniken innerhalb der Gruppen. Es

ergeben sich nur für Zinkmangelgruppe signifikante Ergebnisse. Sowohl für die

Mukosa als auch für die Submukosa zeigt sich auf einem Signifikanzniveau von

p = 0,035 bzw. p = 0,024 eine höhere Expression in den Schnitten der

Anastomosen. Bei in der Tendenz gleichem Ergebnis liegen die für die

Submukosa errechneten Scores deutlich höher (Abbildung 33 und Abbildung

34)

4 Ergebnisse

53

Tabelle 8: p-Werte der Notch-3-Scores im Vergleich der Nahttechniken (Anastomose vs. Kolotomie)


p-Wert

Mukosa 0,786

Submukosa 0,649

Mukosa 0,230

Submukosa 0,840

Mukosa 0,631

Submukosa 0,197

Mukosa 0,035*

Submukosa 0,024*

Region

Kontrolle

Zinkmangel

Schnittnah

Schnittfern

Gruppe Lokalisation

Schnittnah

Schnittfern

Abbildung 33: Notch-3-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne Mukosa (Zinkmangel)

4 Ergebnisse

54

Abbildung 34: Notch-3-Expression im Vergleich der Nahttechniken für schnittferne Submukosa (Zinkmangel)

5 Diskussion

55

5 Diskussion

Wundheilungsstörungen können erhebliche Auswirkungen auf den Erfolg

operativer Eingriffe haben. Aufgrund der lebensbedrohlichen Komplikationen gilt

dies im Besonderen für die Abdominalchirurgie. Dass der Zinkhaushalt im

Rahmen der Wundheilung verschiedene zelluläre und extrazelluläre

Reparations- und Regenerationsabläufe beeinflusst, wurde in einigen

Publikationen bereits dokumentiert. Die Arbeitsgruppen von Fraser und

Lansdown wiesen nach, dass humane Wunden in der Heilungsphase Zink

anreichern (Fraser et al., 1989; Lansdown 1996). Pfaffl und Windisch

beschrieben insbesondere das Kolon als zinksensibles Organsystem (Pfaffl und

Windisch, 2003). Vaxman et al. konnten nachweisen, dass auch heilende

Kolonanastomosen im Kaninchenmodell vermehrt Zink anreichern, was

zeitgleich zu einem Absinken des Zinkspiegels im Serum führt (Vaxman et al.,

1992). Bei akut erniedrigtem Zinkangebot werden zunächst die Zinkspeicher

z.B. im Skelettsystem entleert, um den Mangel zu kompensieren (Windisch,

2003).

Neben der Wundheilung benötigt auch das Immunsystem eine stabile

Zinkhömostase (Agren et al., 1990, Krones et al. 2004-2005). In

Übereinstimmung kam es in unserer Untersuchung in der Zinkmangelgruppe

präoperativ zu zwei Todesfällen durch Pneumonie.

Einzelne Bestandteile der ECM und verschiedene Faktoren des Zellzyklus

wurden bereits auf ihre Funktion in der Wundheilung untersucht. Besonders

sensibel auf ein Zinkdefizit reagieren dabei die MMPs und daraus resultierend,

der Kollagenstoffwechsel (Krones, 2006, Binneboesel et al., 2009). Die in

dieser Studie untersuchten Parameter – TIMP-1, ß-Catenin, c-myc, Notch-3 –

wurden bereits als relevante Einflussgrößen der Zellregeneration definiert

(Alberts et al., 2004; Ishizuya-Oka, 2005; Stojadinovic et al., 2005; Wang et al.,

2002). Wie sich eine gestörte Hömöostase des Zinkstoffwechsels auf die

untersuchten Komponenten auswirkt, ist dagegen bisher nicht bekannt. Zink ist

zwar nicht direkter Bestandteil der hier untersuchten Faktoren. Es kann aber

über seine Funktion als Antioxidant die Modulation verschiedenster

5 Diskussion

56

Signalkaskaden beeinflussen. Zudem greift Zink über den MMP- und

Kollagenstoffwechsel zumindest indirekt in den TIMP-Haushalt ein.

Alle in dieser Arbeit untersuchten Faktoren – TIMP-1, ß-Catenin, c-myc, Notch-

3 – wurden zusammenfassend nur sehr eingeschränkt durch die experimentell

gestörte Zinkhomöostase beeinflusst. Überraschend erwies sich dabei selbst

TIMP-1, als einer der physiologischen Regulatoren des MMP-Stoffwechsels als

zinkunabhängig. Auch die Technikvergleiche zeigen keine einheitlichen

Unterschiede, die auf einen systemischen Einfluss rückschließen ließen. Die

verglichenen Nahttechniken spielen offensichtlich in den Heilungsvorgängen auf

molekularer Ebene keine relevante Rolle. Als grundsätzlicher Nachteil des hier

verwendeten Studienmodells muss dabei die einzeitige Beurteilung der

Expressionsmuster angesehen werden. Möglicherweise wäre retrospektiv eine

mehrzeitige Testung in Analogie zu den verschiedenen Phasen der

Wundheilung aufschlussreicher gewesen. Diese würde eine Veränderung des

Expressionsmusters einzelner Faktoren im Verlauf darstellen, womit sich die

Relevanz der Einflussnahme eines Zinkmangels besser einschätzen ließe.

.

5.1 TIMP-1

In unserem experimentellen Ansatz ließ sich keine signifikante Korrelation

zwischen der TIMP-1-Expression und dem kontrolliert induzierten Zinkmangel

nachweisen. Die gemessenen Scores erwiesen sich in beiden

Untersuchungsgruppen als weitgehend unabhängig vom Zinkangebot.

TIMPs besitzen als Proteaseninhibitoren eine Schutzfunktion für das Gewebe.

Sie hemmen vor allem die proteolytische Aktivität der MMP´s. Ergebnisse von

Knittel et al. zeigen, dass TIMPs im Wundgebiet eine höhere Konzentration

aufweisen als in gesundem Gewebe (Knittel et al., 2000). Auch Lodish et al.

konnten zeigen, dass TIMP-1 im Grenzbereich zwischen gesundem und

krankem bzw. verletztem Gewebe vermehrt exprimiert wird (Lodish et al.,

2008).

Voruntersuchungen unserer Arbeitsgruppe ergaben unter einem Zinkmangel

eine höhere MMP-Expression, was zu einer verstärkten Kollagendegradation

5 Diskussion

57

führte (Krones 2006; Binnebösel et al., 2009). Nach den Ergebnissen der

vorliegenden Arbeit resultiert der verstärkte Kollagenabbau aus einer

Verschiebung des lokalen Verhältnisses von MMP´s zu TIMP-1. Hier besteht

ein erhöhtes Substratangebot (MMPs) ohne eine konkordante up-Regulation

des entsprechenden Inhibitors (TIMPs). Diese Annahme korreliert mit einem

ungehemmten Kollagenabbau durch die MMPs bei Zinkmangel, wie es Bullen

et al. als Pendant für eine schlechtere Wundheilung für chronische Wunden

belegen konnten (Bullen et al., 1995). Ein fehlender Einfluss von Zink auf TIMP-

1 ergibt einen erhöhten Kollagenabbau bei verstärkter MMP-Expression durch

ein pathologisches Verhältnis bzw. Ungleichgewicht der beiden Gegenspieler.

In der Gegenüberstellung der beiden untersuchten Nahttechniken fanden sich

dagegen zumindest vereinzelt signifikante Unterschiede. In zwei Fällen

exprimierte die schnittnahe Mukosa der Anastomosenpräparate in beiden

Gruppen (Kontrolle und Zinkmangel) mehr TIMP-1 als die schnittnahe Mukosa

der Kolotomiepräparate. Dass die beiden konkordanten Vergleiche beider

Gruppen signifikante Ergebnisse mit gleichartigem Expressionsmuster zeigen,

bestätigt zunächst nochmals die Unabhängigkeit der TIMPs vom Zinkhaushalt

in unserem Arbeitsansatz. Die höhere Expression in der schnittnahen Mukosa

von Anastomosen im Vergleich mit den Kolotomien lässt beim größeren

Gewebetrauma der Anastomosen auf einen konsekutiv verminderten

Kollagenabbau schließen.

Zusammenfassend präsentiert sich TIMP-1 in der vorliegenden Untersuchung

als stabiler Parameter, und als von den hier untersuchten Einflussgrößen im

Wesentlichen unabhängig. Eine mehrfach vordokumentierte, generelle

Induzierbarkeit von TIMP-1 ist demnach nicht von den hier untersuchten

Variablen abhängig (Lodish et al., 2008, Senapati et al., 1985).

5 Diskussion

58

5.2 ß-Catenin

Auch das Proto-Onkogen ß-Catenin erwies sich in unserem Ansatz als

weitgehend zinkunabhängig. ß-Catenin kann auf zellulärer Ebene zwei

unterschiedliche Funktionen ausüben. Es fungiert sowohl als Strukturprotein im

Zytoskelett als auch als wichtiger Effektor des Wnt-Pathways und damit als

Schlüsselsignal in der intestinalen Zellerneuerung (Lodish et al., 2008; Alberts

et al., 2004; Knippers, 2001). Neben den beschriebenen Funktionen kann eine

unkontrollierte ß-Catenin-Exprimierung zu zellulären Fehlfunktionen im

Zusammenhang mit der Kanzerogenese führen.

Die jeweilige Funktion von ß-Catenin kann durch die in diesem Versuch

durchgeführten Färbungen nicht eindeutig unterschieden werden, das

Färbemuster lässt aber Schlussfolgerungen auf die Wirkungsweise zu. Viele

Studien haben sich bisher mit der Funktion von ß-Catenin in der

Kanzerogenese beschäftigt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine

verminderte junktionale ß-Catenin-Expression zu einer vermehrten

Tumorinvasion führt. Des Weiteren wurde festgestellt, dass eine vermehrte ß-

Catenin Aktivität im Wnt-Signalweg ebenfalls zu einem schnelleren

Tumorprogress führte (Alberts et al., 2004, Ouko et al., 2004; Zhurinsky et al.,

2000). Übertragen auf die zelluläre Regulation in der Wundheilung wird deshalb

eine Hochregulierung der Aktivität des Proteins erwartet. Zink moduliert

verschiedenste Signalkaskaden auch innerhalb der Wundheilung. Zudem

verändert die anti-oxidative Potenz des Atoms das lokale Milieu (Zalewski et al.,

1994; Truong-Tran et al., 2001). Obwohl Zink nicht Bestandteil von ß-Catenin

ist, ist es so grundsätzlich denkbar, dass es in seiner Funktion als Antioxidant

auch zinkunabhängige Faktoren des Zellzyklus beeinflusst.

Der Gruppenvergleich der Kolotomien zeigt ß-Catenin in der Zinkmangelgruppe

sporadisch erniedrigt. Dieses Ergebnis impliziert, dass der Wnt-Pathway in der

frühen postoperativen Phase der Kolotomie-Heilung negativ beeinflusst wird,

was auf eine verminderte Zellerneuerung schließen lässt. Ebenso kann eine

niedrigere ß-Catenin-Exprimierung aber auch eine verminderte Stabilität der

einzelnen Zellen sowie des Zellverbandes anzeigen. Betrachtet man unter

diesen Gesichtspunkten die Färbemuster der beiden Gruppen im Vergleich, so

5 Diskussion

59

sieht man in den zugehörigen Präparaten der Kontrollgruppe eine intensivere

zytoplasmatische Färbung.

Auffällig ist in allen Präparaten, dass sich die zytoplasmatische ß-Catenin-

Expression schnittfern vor allem auf die Zellen der Mukosa bezieht. In

Übereinstimmung mit Ergebnissen von Pinto et al. lässt dies auf eine höhere

proliferative Aktivität dieser Gewebe schließen. Pinto et al. beschreiben eine ß-

Catenin-Anreicherung vor allem in den regenerativ aktiven Krypten des

Dünndarmes von Mäusen (Pinto et al., 2003). Ein abweichendes

Expressionsmuster zeigen im Vergleich hierzu die Zellen der Submukosa, die

ß-Catenin deutlich stärker zellwandnah exprimieren. Nach der Färbung sind die

junktionalen Abschnitte hier mehr betont als das Zytoplasma. Eine mögliche

Erklärung wäre, dass die Submukosa als „Darmskelett“ in erster Linie der

Stabilität dient, der Zellumsatz jedoch geringer ist.

Vergleiche der schnittnahen Mukosa zeigen eine höhere ß-Catenin-Expression

in den Kolotomiepräparaten. Hierzu widersprüchlich bleiben jedoch die

Untersuchungen der schnittfernen Submukosa. Dort zeigen die Anastomosen

eine höhere Expression von ß-Catenin. Dieses Ergebnis unterstreicht nochmals

den fehlenden Einfluss der Nahttechniken auf die ß-Catenin-Expression.

5.3 c-myc

C-myc ließ sich in unseren Untersuchungen ebenfalls durch den Zinkmangel

nicht beeinflussen. C-myc ist als Protoonkogen Effektor des Wnt-Signalweges

und dabei an die Induktion durch ß-Catenin und andere Wachstumsfaktoren

gebunden (Albertz et al., 2004; Cheng et al., 1999; Chiariello et al., 2001). Eine

verminderte c-myc-Expression stört die Zelladhäsion und Zellmotilität sowie die

Zusammensetzung von ECM- und Adhäsionsmolekülen (Frye et al., 2003).

Andererseits kann c-myc analog zu ß-Catenin bei Überaktivierung zu einer

funktionellen Erschöpfung der Zellen im Wundgebiet führen (Stojadinovic et al.,

2005).

Die bekannte Interdependenz zwischen ß-Catenin und c-myc (Ouko et al.,

2004; Waltenberger et al., 2001; Zhurinsky et al., 2000) bestätigte sich in

5 Diskussion

60

unseren Experimenten erwartungsgemäß mit analogen Expressionsmustern in

den Gruppenvergleichen. Für c-myc wurde wie für ß-Catenin unabhängig von

der Lokalisation eine sporadisch niedrigere Expression unter Zinkmangel

beobachtet. Dies deckt sich zumindest tendentiell mit Ergebnissen von Prasad,

der im Zinkmangel eine verminderte DNA-Synthese nachwies (Prasad, 1996).

Übereinstimmend zeigten die Präparate der Kontrollgruppe tendentiell höhere

Proliferationsraten. Diese Beobachtung korreliert mit einer verminderten

Proliferationsrate bei kontrolliertem Zinkmangels in der Arbeit von Binnebösel et

al. (Binnebösel et al., 2009).

Im Vergleich der Nahttechniken weichen die Messdaten von c-myc

überraschend von den Ergebnissen der ß-Catenin-Spiegel ab. Die

Kolotomiepräparate zeigten vereinzelt eine signifikant höhere c-myc-

Konzentration als die Anastomosen. Dies könnte auf günstigere Bedingungen

der Zellerneuerung unter dem geringeren Trauma der Kolotomie schließen

lassen. Ursächlich käme hier die postoperativ bessere Durchblutung der

Kolotomien im Vergleich zu den Anastomosen in Frage.

Alternativ könnten die Abweichungen aber auch durch die Doppelfunktion von

ß-Catenin verursacht sein. Schließlich kann auch eine Wnt-unabhängige (und

damit auch ß-Catenin-unabhängige) c-myc Induktion über Wachstumsfaktoren

wie PDGF zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Xie et al. 2002; Chariello

et al., 2001). Lynch et al. konnten bereits 1987 in vitro eine gesteigerte

Zellproliferation sowohl von Bindegewebe als auch der Epidermis nach Zugabe

von ppPDGF nachweisen. Ebenso stiegen der zelluläre Proteingehalt und die

ECM-Produktion. Geht man also von einer postoperativ besseren Durchblutung

der Kolotomien aus, kann mehr PDGF über die Thrombozyten in die Wunde

gelangen. Dann erklärt sich ein gesteigerter Zellzyklus mit höherem c-myc-

Nachweis durch eine gesteigerte proliferative Kapazität mit hohem Zell-

Turnover.

Wie genau sich die Expression in der späteren postoperativen Phase darstellt

und wie sich erhöhte c-myc-Level auf chronische Wundheilungsstörungen im

Sinne einer Zellerschöpfung (Stojadinovic et al., 2005) auswirken, muss wegen

der uneindeutigen Ergebnisse jedoch Gegenstand weiterer Untersuchungen

sein.

5 Diskussion

61

5.4 Notch-3

In der vorliegenden Arbeit ergeben sich für die Notch-3-Expression in den

Präparaten der Zinkmangelgruppe signifikant höhere Scores als in der

Kontrollgruppe, was eine Zinksensibilität von Notch-3 impliziert. Diese Tendenz

gilt einheitlich für beide Nahttechniken in den schnittfernen Präparaten. Damit

ist dieses Ergebnis reziprok zu den beiden vorher getesteten Faktoren ß-

Catenin und c-myc. Alle drei gehören zu wichtigen Bestandteilen des Zellzyklus

mit sowohl kon- als auch diskordanten Einflüssen. Aus vorherigen Studien ist

eine hohe Notch-3-Expression in intestinalen Stammzellen bekannt (Ishizuya-

Oka, 2005). Aufgrund der Tatsache, dass Notch-3 kontextspezifisch nicht nur

dazu in der Lage ist, Proliferation zu stimulieren, sondern auch die

Zelldifferenzierung und sogar die Apoptose zu induzieren, müssen die

Ergebnisse jedoch situativ interpretiert werden. Im vorliegenden Fall muss

angenommen werden, dass die Funktion von Notch-3 in der Apoptoseinduktion

besteht. Dies wird unterstützt durch die Tatsache, dass Zinkmangel oxidativen

Stress im Gewebe induziert, wodurch die Apoptose-Rate ebenfalls ansteigt

(Zalewski et al., 1994; Truong-Tran et al., 2001). Es wird angenommen, dass

Notch-3 den Wnt-Signalweg sowohl analog als auch kontrovers beeinflussen

kann (Lodish et al., 2008; Alberts et al., 2004). Deregowski et al. zeigen, dass

Notch-3-Proteine mit dem Wnt-Signalweg umgekehrt proportional interagieren

(Deregowski et al., 2006). In diesem Fall scheint es wahrscheinlich, dass die

geringere Expression von Notch-3 in der Kontrollgruppe über den Wnt-

Signalweg die Proliferation stimuliert und in der Zinkmangelgruppe diese

blockiert bzw. Apoptose induziert.

Die negative Korrelation von Notch-3 mit c-myc zeigt sich sowohl im Vergleich

der beiden Zink-Gruppen als auch der Nahttechniken. Hier ergeben sich für

Notch-3 im Gegensatz zu c-myc höhere Werte in den Anastomosen. Auch hier

spricht die reziproke Darstellung im Vergleich mit c-myc für eine umgekehrt

proportionale Interaktion mit dem Wnt-Signalweg. Als ursächlich kommt im

Vergleich der Nahttechniken auch ein größeres Gewebetrauma mit

kompromittierter Durchblutung und konsekutiv verändertem Stoffwechsel in

Frage. Da Zink ebenfalls kein molekularer Bestandteil von Notch-3 ist, scheint

5 Diskussion

62

Notch-3 am ehesten sensibel auf die durch den Zinkmangel veränderten

Umgebungsreaktionen (z.B. oxidativen Stress) zu reagieren.

6 Zusammenfassung

63

6 Zusammenfassung

Obwohl Darmoperationen Routineeingriffe sind, bleibt die Nahtinsuffizienz auch

heute noch die gefährlichste Komplikation. Daher behalten Untersuchungen zur

Wundheilung am Darm zentrale Bedeutung. Neben Operationstechnik und

Erfahrung nehmen auch molekulare Faktoren Einfluss auf die Wundheilung.

Dazu gehören auch Veränderungen der Zusammensetzung der

Extrazellulärmatrix (ECM). Die Prävention von Wundheilungsstörungen setzt

daher ein grundlegendes Verständnis der einzelnen, an der Wundheilung

beteiligten Faktoren voraus.

Voraussetzung der Wundheilung ist auch am Darm ein intakter

Kollagenstoffwechsel. Dieser bildet im Wechselspiel zwischen Synthese und

Degradation abschließend eine stabile Narbe. Die Regulation erfolgt dabei

primär über zinkabhängige Proteasen (MMP), die jedoch von weiteren Faktoren

der Wundheilungskaskade unterstützt oder reguliert werden. Eine negative

Zinkbilanz kann über eine Funktionsstörung der MMPs die Wundheilung

unterdrücken. Der Einfluss von Zink bzw. eines Zinkmangels auf die

physiologische Funktion der anderen oben angegebenen Regulatoren ist

dagegen noch unbekannt. Diese Arbeit untersucht deshalb unter einem

kontrollierten Zinkmangel die Expressionsmuster der primär nicht zink-

abhängigen ECM-Faktoren TIMP-1, ß-Catenin, c-myc und Notch-3 in der

Wundheilung des Ratten-Kolons. In einem zweiten Ansatz wurden zudem der

Einfluss unterschiedlicher Nahttechniken auf die Proteinexpression beurteilt.

Zusammenfassend ließ sich die Expression der meisten Zielparameter durch

den Zinkmangel und die Nahttechniken nur gering beeinflussen. TIMP-1, ß-

Catenin und c-myc erwiesen sich als weitgehend zinkunabhängig. Lediglich die

Notch-3-Expression bot in der Zinkmangelgruppe zumindest vereinzelt

signifikant erhöhte Werte auf. Die Nahttechnik (Anastomose versus Kolotomie)

hatte dagegen bei allen Zielgrößen keinen einheitlichen Einfluss.

Die Versuchsreihe schließt damit einen relevanten Einfluss von Zinkmangel und

OP-Technik auf die untersuchten Zielparameter aus. Die einzeitige Beurteilung

der Expressionsmuster muss dabei aber als Einschränkung angesehen werden,

da sie die Phasen der Wundheilung nicht abbilden kann.

6 Zusammenfassung

64

Summary

Although intestinal operations are routine surgery, insufficiency is still the most

life-threatening complication. That is why research on intestinal wound healing

is still of particular importance. Besides operation technique and experience of

the surgeon influences of molecular factors are considered to be important for a

successful wound healing. The change of the extracellular matrix is one of

these factors. Prevention of disturbances of wound healing requires a

fundamental knowledge of molecular processes.

Precondition for intestinal wound healing is an intact collagen metabolism. This

kind of interplay between synthesis and degradation constitutes a functional

scar. Its regulation is ruled by zinc-dependent proteases (MMPs), which

themselves are regulated by other factors such as TIMPs. A negative zinc

balance can disturb the function of MMPs and suppress wound healing. The

influence of zinc on physiologic function of the factors, tested in this work, is not

known so far. In this study, the expression of TIMP-1, ß-Catenin, c-myc and

Notch-3 are checked concerning changes when zinc deficiency is induced in

adult rats. Another examination evaluates the influence of different operation

method (anastomosis and colotomy) on protein expression.

In summary, the expression of the reviewed factors is influenced little by zinc or

the operation method. TIMP-1 is totally zinc-independent, ß-Catenin and c-myc

are to a large extent zinc-independent. Notch-3 is influenced to some extent

due to significant higher scores in zinc deficiency. The operation method is most

important for c-myc, which has a higher expression in colotomies.

This series of experiments excludes a relevant influence of zinc deficiency and

operation method on the here examined factors. The one-phase evaluation of

the expression cluster should be considered as a limitation, because it cannot

display the different phases of wound healing.

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8 Danksagung

74

8 Danksagung

Mein erster und besonderer Dank gilt Herrn Professor Dr. med. Dr. h.c. Volker

Schumpelick, Direktor der chirurgischen Klinik der RWTH Aachen, für die

freundliche Überlassung des Dissertationsthemas.

Ganz herzlich bedanke ich mich bei Dr. med. Marcel Binnebösel und PD Dr.

med. Carsten J. Krones für die Betreuung dieser Arbeit, für Ihre Anregungen

und Korrekturen. Sie standen mir stets mit Rat und Tat zur Seite.

Mein weiterer Dank gilt den Mitarbeitern des Joint Institute For Surgical

Research Aachen-Moskau unter der Leitung von Professor Alexander Öttinger

und Dr. med. Jochen Grommes, die maßgeblich am Gelingen dieses Projekts

beteiligt waren.

Großer Dank gilt Frau Ellen Krott für die fachkundige Anleitung in der

Laborarbeit und ihre Hilfe bei der Anfertigung der histologischen Präparate und

Färbungen.

Schließlich möchte ich mich bei meinem Freund und meiner Familie für ihre

Unterstützung und ihr Verständnis bedanken. Mein Dank gilt außerdem Frau

Dr. rer. nat. Maritta Jacobs, die durch ihre Anregungen gute Impulse für das

Gelingen dieser Arbeit gegeben hat.

9 Datenaufbewahrung

75

9 Datenaufbewahrung

Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung

Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden

Originaldaten

bei mir,

Marion Franken, Thingstraße 12, 41812 Erkelenz

hinterlegt sind.

10 Lebenslauf

76

10 Lebenslauf

PERSÖNLICHES

Name Marion Franken

Geburtsdatum 07.07.1981

Geburtsort Erkelenz

Eltern Karin Franken, geb. Wirth, Lehrerin

Hans-Ludwig Franken, Diplom-Agraringenieur

Familienstand ledig

SCHULISCHE AUSBILDUNG

1988 -1992 Katholische Grundschule Kückhoven

1992 -2001 Cornelius-Burgh-Gymnasium, Erkelenz

07/2000 Praktikum bei Caterpillar in Bury St. Edmunds/ UK

2001 Abitur

BERUFLICHE AUSBILDUNG

10/2001 Beginn des Studiums der Humanmedizin an der

RWTH Aachen

09/2003 Physikum

03/2004 - 04/2004 Famulatur Innere Medizin, St.Theresien-

Krankenhaus Nürnberg

08/2004 - 09/2004 Famulatur Psychiatrie, Uniklinikum der RWTH

Aachen

02/2005 - 02/2005 Famulatur Gynäkologie, Weyertaler Krankenhaus in

Köln

03/2005 - 04/2005 Famulatur Radiologie, Gemeinschaftspraxis Drs.

Bruners, Esser, Kick, Mauer in Erkelenz

10 Lebenslauf

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08/2005 - 08/2005 Famulatur Augenheilkunde, Gemeinschaftspraxis

Drs. Neuhann, Remky, Frei in München

07/2007 - 08/2007 Famulatur im Rhein-Valley-Hospital, Nakuru, Kenia

12/2006 PJ-Tertial Innere Medizin, Krankenhaus Bethesda,

Mönchengladbach

04/2007 PJ-Tertial Chirurgie, Krankenhaus Bethesda,

Mönchengladbach

07/2007 PJ-Wahlfach Anästhesie, Universiteit St.Radboud,

Nijmegen, Niederlande

01/2008 Amerikanisches Examen, USMLE Step 1,

Amsterdam, Niederlande

04/2008 Schriftliches Hammerexamen, Aachen

05/2008 Amerikanisches Examen, USMLE Step 2, München

06/2008 Mündliche Prüfung im Krankenhaus Bethesda,

Mönchengladbach, Erlangung der Approbation

07/2008 - heute Assistenzärztin im Hermann-Josef-Krankenhaus

Erkelenz, Innere Medizin

einfluss eines kontrollierten zinkmangels auf die...

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