Proteasom-Inhibitoren

Eine verh�ngnisvolle Aff�re: die Ubiquitinylierung vonProteinenMarkus Biel, Veit Wascholowski und Athanassios Giannis*

Stichw�rter:Inhibitoren · Proteasom · Ubiquitin · Wirkstoff-Design

Aktivit�t, Stabilit�t und subzellul�reVerteilung von Proteinen k�nnen durchverschiedene posttranslationale Modifi-kationen moduliert werden. Sp�testensmit der Vergabe des Chemie-Nobelprei-ses 2004 an Ciechanover, Hershko undRose r'ckte die Ubiquitinylierung inden Blickpunkt des wissenschaftlichenInteresses, da sie mehr als nur ein Signalf'r den Abbau 'berfl'ssig gewordenerProteine ist und eine wichtige Rolle beiso komplexen Vorg�ngen wie der Zell-zykluskontrolle, der DNA-Reparatur,der Apoptose und der Immunantwortspielt.[1]

Ubiquitin (Ub) ist ein aus 76 Ami-nos�uren aufgebautes 8-kDa-Protein,das durch seinen C-Terminus isopep-tidisch an Lysinseitenketten andererProteine gebunden werden kann (Ab-bildung 1).[2] Das Ubiquitin-aktivieren-de Enzym E1 adenyliert hierzu dieCarboxyfunktion des C-terminalen Gly-cins von Ubiquitin und 'bertr�gt dieseaktivierte Spezies unter Bildung einesThioesters auf ein internes Cystein desEnzyms. In einem zweiten Schritt wirdUb von E1 auf das Ubiquitin-konjugie-rende Enzym E2 umgeestert, von woaus es anschließend durch eine Ubiqui-tin-Ligase E3 auf das Zielprotein 'ber-tragen werden kann. Da Ubiquitinselbst 'ber interne Lysinreste (z.B. Ly-sin 48, Lysin 63) verf'gt, kann sich dieEnzymkaskade wiederholen, sodass

mehrere Ub-Einheiten hintereinandergebunden werden.

Substratmolek'le, auf die nur eineeinzelne Ub-Einheit 'bertragen wird,k�nnen m�glicherweise durch Proteinemit einer speziellen Ubiquitin-Bin-dungsdom�ne erkannt werden. So dientdie Monoubiquitinylierung des HistonsH2B im Rahmen des postulierten His-ton-Codes als Signal zur Aktivierungder Transkription,[3] w�hrend sie beiRezeptor-Tyrosin-Kinasen (RTKs) zuderen Endocytose und dem nachfolgen-den Transport zum Lysosom dient. Po-lyubiquitinylierte Spezies mit 'ber Ly-sin 63 verkn'pften Ub-Einheiten, sindf'r die Vermittlung von nichtproteolyti-schen, reversiblen Ereignissen verant-wortlich.[4] Hierzu geh�rt die Modulati-on von Proteineigenschaften wie Akti-vit�t, subzellul�re Verteilung und Pro-tein-Protein-Interaktion. Erfolgt die Po-

lyubiquitinylierung hingegen 'ber durchLysin 48 verkn'pfte Ub-Einheiten, sowerden die gebildeten Ketten durch das26S-Proteasom erkannt und die mar-kierten Proteine durch dieses 2.4 MDagroße Multiuntereinheiten-Enzym ab-gebaut.[5]

Das Proteasom kommt sowohl imKern als auch im Cytoplasma der Zellevor und hat die Form eines Zylinders. Esbesteht aus einer katalytischen 20S-Komponente, die an beiden Seitendurch eine regulatorische 19S-Kompo-nente abgeschlossen wird. Die 19S-Ein-heit erkennt und bindet polyubiquitiny-lierte Proteine, deren Ub-Einheiten'ber Lysin 48 miteinander verkn'pftsind, und leitet diese nach Entfernungder Ubiquitinkette und Entfaltung derStruktur unter ATP-Verbrauch an diekatalytische 20S-Einheit weiter. DerenKatalysemechanismus[6] geht allerdings

Abbildung 1. Mechanismus der E1/E2/E3-katalysierten Ankn#pfung von Ubiquitin-Resten anProteine; die Ubiquitinylierung kennzeichnet das jeweilige Protein f#r den Abbau durch das 26S-Proteasom.

[*] M. Biel, V. Wascholowski,Prof. Dr. A. GiannisInstitut f#r Organische ChemieUniverst7t LeipzigJohannisallee 2904103 Leipzig (Deutschland)Fax: (+49) 341-973-6599E-mail: giannis@chemie.uni-leipzig.de

Highlights

6574 � 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim DOI: 10.1002/ange.200462346 Angew. Chem. 2004, 116, 6574 –6576

nicht auf die sonst 'bliche katalytischeTriade zur'ck, sondern st'tzt sich aufein einziges hochkonserviertes, N-ter-minales Threonin als Nucleophil. DieAbbauprodukte des Proteasoms sindletztlich Peptide mit einer Restl�ngevon 3 bis 25 Aminos�uren.

Inzwischen ist das Proteasom zuminteressanten Target f'r die Entwick-lung von Medikamenten geworden, daes neben der Expressionskontrolle ei-nen weiteren Mechanismus zur Regu-lation der Konzentration bestimmterProteine repr�sentiert.[7] So sind Cy-clin-abh�ngige Kinasen (CDKs) Regu-latoren der Zellzyklus-Progression,[8]

deren Aktivit�t von Cyclinen, Phospha-tasen wie CDC25 und zelleigenen Inhi-bitoren (WAF1, KIP1) abh�ngt. DasProteasom ist f'r den gezielten Abbauder Cycline und CDK-Inhibitoren ver-antwortlich und wird mit der Stabilisie-rung von CDC25 w�hrend der Zellzy-klus-Progression in Zusammenhang ge-bracht.[9] Die Inhibierung des im Pro-teasom vermittelten Abbaus dieser Re-gulatoren ist eine wichtige M�glichkeitzur Induktion eines Zellzyklusstoppsund damit von klinischer Relevanz z.B.bei der Behandlung maligner Tumore.

Weiterhin werden auch die Signal-wege von p53,[10,11] das als Signal f'rzahlreiche zellul�re Antworten wie dieDNA-Reparatur, den Zellzyklusstopp,die Differenzierung oder die Apoptose

dient, und die Transkriptionsfaktorender NF-kB-Familie[12,13] mit dem Ubi-

quitin-Proteasom-Abbau in Verbindunggebracht (Abbildung 2).

Abbildung 2. Zellul7re Signalwege, die mit dem Proteasom verkn#pft sind. Stress, z. B. Strah-lung oder Chemikalien, induziert DNA-Sch7den und f#hrt zur Akkumulierung des Tumorsup-pressors p53 und nach aktivierter Genexpression zur Induktion von Apoptose. Die Ubiquitin-Li-gase MDM2 inhibiert die Wirkung von p53 durch Ubiquitinylierung und Abbau im Proteasom.Proteasom-Inhibitoren kHnnten bei Tumorzellen mit MDM2-Iberexpression den sch7dlichen Ab-bau von p53 unterbinden. Ebenso f#hren Chemotherapie, Strahlung, Viren und Cytokine zurPhosphorylierung des Inhibitors von NF-kB (IkB) und damit zu dessen Abbau. Nachfolgendwird NF-kB freigesetzt und verst7rkt verschiedene Signalwege, die das Iberleben der Zelle si-chern. Dadurch wird NF-kB zum wichtigen Target f#r antineoplastische Wirkstoffe.

Schema 1. Ausgew7hlte Strukturen von Inhibitoren des Proteasom-Abbaus.

AngewandteChemie

6575Angew. Chem. 2004, 116, 6574 –6576 www.angewandte.de � 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Proteasom-Inhibitoren werden bis-her in f'nf Klassen unterteilt: Peptid-Aldehyde (MG132), Peptid-Vinyl-Sul-fone (NLVS), Peptid-Boronate (Borte-zomib), Peptid-Epoxyketone (Epoxo-mycin) und b-Lactone (PS-519) (Sche-ma 1).[5a, 6] Sie enthalten alle eine elek-trophile Gruppe, die mit dem Thr-Restim aktiven Zentrum des Proteasomsreagiert. Wegen der metabolischen In-stabilit�t und fehlender Enzymspezifit�tgelangten allerdings nur zwei Protea-som-Inhibitoren in die klinische Pr'-fung: PS-519 (auch bekannt alsMLN519) beeinflusst antiinflammatori-sche Prozesse; Bortezomib (PS-341,Velcade) – inzwischen als Medikamentzugelassen – zeigt signifikante antineo-plastische Effekte bei einer Vielzahl vonTumorzelllinien. Der exakte Wirkungs-mechanismus und die Spezifit�t der ein-zelnen Proteasom-Inhibitoren sind im-mer noch nicht vollst�ndig erforscht,jedoch ist viel 'ber die Rolle der Inhi-bitoren in der Tumorentwicklung, derAngiogenese und der Metastasierungbekannt. Infolge der Proteasom-Inhi-bierung kann es zu Apoptose, erh�hterEmpfindlichkeit gegen'ber Chemo-und Strahlentherapie und einer ernied-rigten Resistenz gegen'ber diesen The-rapieformen kommen.[5a, 6,7]

K'rzlich konnten durch einen che-misch-genetischen Ansatz in Xenopus-Extrakten mit Ubistatin A und B zweiInhibitoren des Proteasom-abh�ngigenProteinabbaus identifiziert werden(Schema 1), denen ein v�llig neuartigerWirkungsmechanismus zugrundeliegt.[14] So binden die Ubistatine nichtan das aktive Zentrum des Proteasoms,sondern interagieren mit den einzelnen,'ber Lysin 48 verkn'pften Ub-Einhei-ten und verhindern die Erkennung deszum Abbau markierten Proteins durchdie regulatorische 19S-Einheit des Pro-teasoms. Die Ubistatine bilden damiteine neue Klasse von Proteasom-Inhibi-toren und geh�ren zu den wenigenModulatoren, deren Wirkprinzip aufder St�rung von Protein-Protein-Wech-selwirkungen beruht.[15]

Experimentelle Grundlage dieserArbeit ist das in Abbildung 3 dargestell-te Screeningsystem. Der Abbau vonCyclin B infolge der Ubiquitinylierungdurch die E3-Ligase APC/C (anaphase-

promoting complex/cyclosome) ist dieVoraussetzung f'r die Beendigung derMitose und den Ibergang in die n�chsteZellzyklus-Phase. Durch den Einsatzeines Cyclin-B-Luciferase-Fusionspro-teins konnten so Substanzen identifi-ziert werden, die den Abbau von CyclinB hemmen und als Folge den Fortschrittdes Zellzyklus beeinflussen. Die poten-testen Verbindungen wurden im weite-ren Verlauf durch zahlreiche Kontroll-experimente auf ihren genauen Wir-kungsmechanismus hin untersucht. Eszeigte sich, dass die Ubistatine spezifi-sche Protein-Protein-Wechselwirkun-gen mit 'ber Lysin 48 verkn'pften Ub-Ketten eingehen und deren Erkennungam Proteasom verhindern. NMR-Un-tersuchungen an 'ber Lysin 48 ver-kn'pften Ubiquitin-Dimeren belegen,dass sich bei der Titration mit denInhibitoren definierte, spezifische Ver-�nderungen an der hydrophoben Sei-tenfl�che der Ubiquitin-Einheiten erge-ben. F'r die weitere Verwendung dieserInhibitoren in zellul�ren Assays d'rfteihre �ußerst hohe Polarit�t und somitniedrige Membranpermeabilit�t hinder-lich sein. Gleichwohl unterstreichen die-se Ergebnisse die Bedeutung von che-misch-genetischen Ans�tzen zur Auffin-dung neuartiger Leitstrukturen, die mitMethoden des strukturbasierten Wirk-stoff-Designs und Computer-Modelingskaum erschlossen worden w�ren.

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Abbildung 3. Schematische Darstellung des chemisch-genetischen Ansatzes zur Identifizierungder Ubistatine A und B. Als Indikator f#r das Vorhandensein von Cyclin B dient hierbei die Lumi-neszenz der Luciferase: Verbindungen, die den Abbau von Cyclin B inhibieren, f#hren im Test-system weiterhin zur Lumineszenz.

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